CN107693786B

CN107693786B - 特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗

Info

Publication number: CN107693786B
Application number: CN201711085202.0A
Authority: CN
Inventors: 刘文强; 王仁虎; 姜桂苗; 高维平; 秦绪岭; 刘桂芹; 夏楠
Original assignee: Liaocheng University
Current assignee: Liaocheng University
Priority date: 2017-11-07
Filing date: 2017-11-07
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2037-11-07
Also published as: CN107693786A

Abstract

本发明公开了一种特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗。本发明将驴体分离到的特异性大肠杆菌菌株和菌毛亚单位制成菌体‑菌毛亚单位复合疫苗，提供了一种特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗，建立一种特异性全面防治驴驹大肠杆菌性腹泻的微生态防控体系。本发明的复合疫苗可以有效的提高抗原的免疫原性，激发黏膜免疫应答，增强对大肠杆菌性腹泻的预防效果，具有防控驴驹大肠杆菌性腹泻的功能。本发明与现有技术相比，不仅能减少动物抗菌药物的使用、降低动物产品抗菌药物残留、减缓动物源性耐药菌的产生，还避免了耐药性细菌在动物间或动物与人之间传播的优点。有望成为临床预防大肠杆菌的优秀特异性疫苗。

Description

特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗。

背景技术

规模化养驴场新出生的驴驹腹泻发病率在30％-50％之间，高发日龄为15-45d，大部分驴驹的腹泻病例经抗生素治疗效果不佳，约有15％的病例在发病48h-72h内死亡，给规模化养殖场带来了巨大的经济损失。引起驴驹腹泻的原因很多，但是最主要的病原性因素是致病性大肠杆菌。目前针对该病通常使用抗生素药物进行治疗，并配合支持疗法。但是由于驴驹各系统发育不全、抵抗力差而病程发生迅速，往往来不及治疗就会发生脱水、微循环衰竭和休克，造成驴驹迅速死亡。在兽医临床上，抗生素的滥用还产生了严重的食品安全问题。因此，针对本病必须以疫苗预防为主的综合性预防控制措施。

目前市场上并无驴等马属动物的大肠杆菌疫苗。其它畜种的大肠杆菌疫苗主要有两种，一种为菌体灭活苗，另一种为菌毛亚单位疫苗。在临床使用中都需要多次免疫才能产生良好的保护效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种预防和/或防治大肠杆菌性腹泻的产品。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供一株大肠埃希氏菌Escherichia coli驴腹泻性大肠杆菌La株。

本发明提供的大肠埃希氏菌Escherichia coli驴腹泻性大肠杆菌La株的保藏编号为CGMCC NO.14058。

本发明提供的驴腹泻性大肠杆菌La株的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli。该大肠埃希氏菌Escherichia coli已于2017年4月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏登记号为CGMCCNo.14058。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了上述大肠埃希氏菌Escherichia coli驴腹泻性大肠杆菌La株的新用途。

本发明提供了上述大肠埃希氏菌Escherichia coli驴腹泻性大肠杆菌La株在如下(a1)-(a4)中任一种中的应用：

(a1)制备预防和/或防治大肠杆菌性腹泻的产品；

(a2)预防和/或防治大肠杆菌性腹泻；

(a3)制备降低大肠杆菌性腹泻发生率的产品；

(a4)降低大肠杆菌性腹泻发生率。

上述应用中，所述产品为疫苗。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种疫苗。

本发明提供的疫苗包括大肠埃希氏菌Escherichia coli和菌毛亚单位。

上述疫苗中，所述大肠埃希氏菌Escherichia coli和所述菌毛亚单位的配比为75亿cfu：(2.0-2.5)mg。

上述疫苗中，所述大肠埃希氏菌Escherichia coli可为上述大肠埃希氏菌Escherichia coli驴腹泻性大肠杆菌La株；

所述菌毛亚单位可为k99菌毛亚单位；所述k99菌毛亚单位的氨基酸序列为序列1。

在本发明的具体实施例中，驴腹泻性大肠杆菌La株和K99菌毛亚单位的配比为75亿：2.375mg。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述疫苗的制备方法。

本发明提供的上述疫苗的制备方法包括如下步骤：

(1)将大肠杆菌菌液与甲醛水溶液混匀，得到灭活体系，反应，得到灭活菌苗溶液；

(2)将所述灭活菌苗溶液与菌毛亚单位溶液混匀，得到所述疫苗。

上述方法中，所述大肠杆菌在所述灭活体系中的浓度为100亿个/mL；

所述甲醛在所述灭活体系中的体积分数为0.5％；

所述反应条件为37℃反应48-72h。

上述方法中，所述大肠杆菌菌液是将大肠杆菌菌株接种于营养肉汤培养液中混匀得到的，所述营养肉汤培养液是将蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g和氯化钠5.0g溶于1L蒸馏水中得到的。

上述方法中，所述步骤(1)和(2)之间还包括加入硫代硫酸钠水溶液终止灭活的步骤。所述硫代硫酸钠可与甲醛反应，用于去除菌液中的甲醛，终止灭活反应。

所述终止灭活的方法包括如下步骤：向灭活菌苗溶液中加入硫代硫酸钠水溶液，得到终止体系。所述灭活菌苗溶液和硫代硫酸钠水溶液的体积比为39:1。

所述终止灭活后还包括离心和稀释的步骤。所述离心和稀释的方法包括如下步骤：将所述终止体系在3000rpm条件下离心30min，收集上清液，得到离心后菌液；用灭菌生理盐水将所述离心后菌液稀释至大肠杆菌浓度为10⁹个/mL。

上述方法中，所述菌毛亚单位溶液(溶剂为0.01mol/L的PBS)的浓度为9.5mg/mL；

所述灭活菌苗溶液与所述菌毛亚单位溶液的体积比为3:1。

上述方法中，所述大肠埃希氏菌Escherichia coli可为上述大肠埃希氏菌Escherichia coli驴腹泻性大肠杆菌La株；

所述菌毛亚单位可为k99菌毛亚单位；所述k99菌毛亚单位的氨基酸序列为序列1。在本发明的具体实施例中，所述k99菌毛亚单位的制备方法如下：将大肠杆菌K99菌株接种于LB液体培养基中，振摇培养后离心，弃上清液，收集沉淀；用PBS悬浮沉淀，恒温水浴作用后离心，除去菌体，收集上清液；向上清液中加入饱和硫酸铵，4℃过夜，沉淀菌毛蛋白，离心，收集沉淀；向沉淀中加入PBS溶解沉淀，得到k99菌毛亚单位溶液。

上述方法中，步骤(2)后还包括向所述疫苗中添加防腐剂的步骤；所述防腐剂具体可为硫柳汞；所述硫柳汞按照质量分数为0.01％的量加入所述疫苗中。

为了解决上述技术问题，本发明最后还提供了上述疫苗或上述方法制备得到的疫苗的新用途。

本发明提供了上述疫苗或上述方法制备得到的疫苗在如下(a1)-(a4)中任一种中的应用：

(a1)制备预防和/或防治大肠杆菌性腹泻的产品；

(a2)预防和/或防治大肠杆菌性腹泻；

(a3)制备降低大肠杆菌性腹泻发生率的产品；

(a4)降低大肠杆菌性腹泻发生率。

上述应用中，所述疫苗或上述方法制备得到的疫苗可用于防治马属动物大肠杆菌性腹泻；所述马属动物具体可为驴，也包括驴驹，马和骡等其他马属动物也均属于本发明的保护范围。

本发明使用驴体分离到的特异性大肠杆菌菌株和菌毛亚单位制成菌体-菌毛亚单位复合疫苗，提供了一种特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗，建立一种特异性全面防治驴驹大肠杆菌性腹泻的微生态防控体系。通过实验证明：本发明的复合疫苗可以有效的提高抗原的免疫原性，激发黏膜免疫应答，增强对大肠杆菌性腹泻的预防效果，具有防控驴驹大肠杆菌性腹泻的功能。与现有技术相比，本发明的复合疫苗不仅能减少动物抗菌药物的使用、降低动物产品抗菌药物残留、减缓动物源性耐药菌的产生，还避免了耐药性细菌在动物间或动物与人之间传播的优点，有望成为临床预防大肠杆菌的优秀特异性疫苗。

附图说明

图1为16s rDNA的PCR鉴定结果。

保藏说明

菌种名称：大肠埃希氏菌

拉丁名：Escherichia coli

菌株编号：驴腹泻性大肠杆菌La株

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2017年4月21日

保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.14058

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的营养琼脂平板的制备方法如下：将蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g和琼脂15.0g溶于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至46℃左右，制成平板。

实施例1、驴腹泻性大肠杆菌La株的分离培养和鉴定

一、驴腹泻性大肠杆菌La株的分离培养

无菌采集腹泻驴驹的肛门拭子，涂于营养琼脂平板上，放于37℃恒温箱中培养24h。从培养基上挑取圆形凸起、光滑、半透明、直径2～3mm、灰白色等具有大肠杆菌特征的菌落，涂于营养琼脂平板上，放于37℃恒温箱中培养24h，传3代进行分离纯化，得到驴腹泻性大肠杆菌La株。

二、驴腹泻性大肠杆菌La株的鉴定

1、生理生化鉴定

生理生化鉴定采用XK型全自动细菌鉴定/药敏分析仪鉴定。具体步骤如下：

(1)接种准备

取盛有10mL的生理盐水一支。用无菌接种针，从待检细菌的平板中挑取待检菌落(驴腹泻性大肠杆菌La株)，使其加入10mL的样本稀释液中，从而制成约0.5麦氏单位均匀的菌悬液。

(2)接种(菌悬液)

拆开试剂盒包装，取出生化试剂盒，打开试剂盒盖，在标签上填写待检标本的标本号，用微量移液器吸取150μL菌悬液0.15，加入各生化杯中(肠杆菌试剂盒B2、D1、D2、D3；非发酵菌试剂盒D1；葡萄球菌试剂盒D1、D2；链球菌D)。

(3)生化培养

将接种完毕的生化试剂盒放入35℃-37℃培养箱中，肠杆菌、非发酵菌、葡萄球菌、链球菌、弧菌和真菌进行18-24h培养。

(4)上机鉴定

取出培养完毕的生化试剂盒，加入相应的补充试剂(肠杆菌试剂盒A1孔添加靛基质试剂2滴；非发酵菌试剂盒F1孔添加硝酸盐A、硝酸盐B试剂各1滴，当“硝酸盐”为阴性时，为防止产生假阴性，需要加入少许锌粉，如果不变色表明硝酸盐阳性，如果变为红色，表明硝酸盐阴性；葡萄球菌试剂盒F1孔添加硝酸盐A、硝酸盐B试剂各1滴)，然后进入细菌鉴定/药敏分析仪鉴定操作界面，选择“细菌鉴定”，在检验类别中，选取与生化试剂盒一致的鉴定内容，将添加完辅助试剂后的试剂盒放入检定仪图盘，双击待测标本相对应样品信息，选择试剂盒类型级相关必选条件，点击自动鉴定，检定仪将自动鉴定出细菌名称，鉴定完成后可进行药敏试剂盒的鉴定，保存结果后并打印“微生物检测报告”。

(5)处理

所有使用过的试管、塑料吸头、菌悬液、生化试剂盒等必须按《医疗废物管理条例》的规定进行焚烧或高压灭菌。

(6)生化鉴定结果

生理生化鉴定结果如表1所示。“+”表示阳性；“-”表示阴性。

表1、生理生化鉴定结果

麦芽糖	蔗糖	赖氨酸	乳糖	尿素	靛基质
						+	-	+	+	-	+
七叶苷	丙二酸盐	鸟氨酸	山梨醇	OF	水杨苷
						-	-	+	+	+	-
枸缘酸盐	肌醇	精氨酸	棉子糖	ONPG	甘露醇
						-	-	-	+	+	+

2、鉴别培养基鉴定

将菌落(驴腹泻性大肠杆菌La株)涂于中国蓝琼脂平板，放于37℃恒温箱中培养24h，大肠杆菌使中国蓝琼脂平板变蓝色。大肠杆菌在麦康凯琼脂培养基培养显红色菌落。大肠杆菌在伊红美兰琼脂培养基培养显黑色带金属闪光的菌落。

3、细菌16s rDNA测序鉴定

(1)基因组DNA提取

按照SK8255(细菌)试剂盒操作提取驴腹泻性大肠杆菌La株的基因组DNA。

(2)PCR扩增

以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，采用引物27F和1492进行PCR扩增，得到驴腹泻性大肠杆菌La株的16S rDNA序列。引物序列如下：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反应体系为模板(基因组DNA20-50ng/μL)0.5μL、10×Buffer(with Mg²⁺)2.5μL、dNTP(各2.5mM)1μL、酶0.2μL、上下游引物(10uM)各0.5μL，最后加ddH₂O至25μL。

PCR反应程序为94℃4min预变性，然后是94℃45s、55℃45s、72℃1min共30次；72℃修复延伸10min，4℃终止反应。

(3)电泳检测及纯化

使用1％琼脂糖电泳检测PCR产物。电泳(150V、100Ma)20min后观察。并使用SK8131试剂盒纯化PCR产物。

PCR产物的电泳结果如图1所示。从图中可以看出：PCR扩增得到大小约为1500bp的目的条带。

(4)测序分析

对PCR产物进行测序，使用Dnastar软件分析测序结果，并将获得的16S rDNA序列在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上进行比对。

分子鉴定结果如下：驴腹泻性大肠杆菌La株16S rDNA序列大小为1398bp(GenBank为KY882036.1)，经过序列比对分析，确认其为大肠杆菌。

4、亚型鉴定

对驴腹泻性大肠杆菌La株的致病性亚型进行鉴定，鉴定结果表明：本发明的驴腹泻性大肠杆菌La株为致病性大肠杆菌O78亚型。具体步骤如下：将驴腹泻性大肠杆菌La株划线接种于营养琼脂平板上，37℃培养24h，挑取单菌落接种于100mL营养肉汤培养基，37℃，180r/min摇菌培养24h。取20μL接种于营养琼脂平板上进行细菌计数，最后用营养肉汤将致病性大肠杆菌菌液稀释至10⁹cfu/mL，121℃高压1h，恢复室温后，按0.1％加入甲醛溶液，制备成抗原溶液，取25μL抗原溶液分别于10种O抗原定型血清(O₆、O₈、O₉、O₂₁、O₅₁、O₇₈、O₈₆、O₁₀₁、O₁₂₅、O₁₄₈、O₁₅₈，均购自中国兽药监察所)进行玻片凝集试验，并按规定标准判定致病性大肠杆菌血清型为O78。

三、菌种保藏

鉴于上述鉴定结果，步骤一得到的驴腹泻性大肠杆菌La株为大肠埃希氏菌的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。该大肠埃希氏菌Escherichia coli已于2017年4月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏登记号为CGMCC No.14058。

实施例2、特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗的制备

一、甲醛灭活菌苗的制备

1、将驴腹泻性大肠杆菌La株营养肉汤培养液和甲醛水溶液混匀，得到灭活体系，驴腹泻性大肠杆菌La株在灭活体系中的浓度为100亿个/mL，甲醛在灭活体系中的体积分数为0.5％。驴腹泻性大肠杆菌La株营养肉汤培养液是将实施例1中分离得到的驴腹泻性大肠杆菌La株接种于营养肉汤培养液(营养肉汤培养液是蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g和氯化钠5.0g溶于1L蒸馏水中得到的)中混匀得到的。

将灭活体系置于37℃温箱中作用48-72h，以达到杀死细菌的目的，得到灭活后的菌液。

2、向灭活后的菌液中加入硫代硫酸钠水溶液(硫代硫酸钠的浓度为0.2g/mL，去除菌液中的甲醛)，灭活后的菌液和硫代硫酸钠水溶液的体积比为39:1，终止灭活，得到终止体系；将终止体系3000rpm离心30min后，收集上清液，得到离心后菌液；用灭菌生理盐水将离心后菌液稀释至驴腹泻性大肠杆菌La株浓度为10⁹个/mL，即得到甲醛灭活菌苗。

二、k99菌毛亚单位的制备

1、将大肠杆菌K99菌株接种于LB液体培养基中，37℃振摇培养72h，8000g离心15分钟，弃上清液，收集沉淀。

2、用0.01mol/L PBS悬浮沉淀，置60℃恒温水浴作用30min后，8000g离心30min除去菌体，收集上清液。

3、向上清液中加入50％饱和硫酸铵(上清液与硫酸铵的体积比为1:3)，4℃过夜，沉淀菌毛蛋白，12000r/min离心20min，收集沉淀，加入0.01mol/L的PBS溶解沉淀，得到k99菌毛亚单位溶液。

4、k99菌毛亚单位溶液的蛋白含量检测

取2μL K99菌毛亚单位溶液加到紫外蛋白检测仪中检测蛋白含量。结果表明：K99菌毛亚单位溶液中蛋白含量为9.5mg/mL。

5、k99菌毛亚单位溶液的SDS-PAGE检测

按常规方法进行SDS-PAGE，使用12％分离胶和5％浓缩胶。电泳后经考马斯亮蓝G-250染色，脱色。以标准蛋白质分子量作对照，确定k99菌毛亚单位溶液中k99菌毛亚单位(氨基酸序列为序列1)的分子量大小为17kDa。

三、特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗的制备

1、向步骤一制备的甲醛灭活菌苗中加入步骤二制备的K99菌毛亚单位溶液，甲醛灭活菌苗和K99菌毛亚单位溶液的体积比为3:1，得到特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗。复合疫苗中驴腹泻性大肠杆菌La株和K99菌毛亚单位的配比为75亿：2.375mg。

用k99菌毛亚单位溶液将0.5％的绵羊血红细胞致敏，与10×系列稀释的标准阳性血清(购自中国兽药监察所)进行凝集反应，出现半数红细胞凝集的最大稀释倍数即为其血凝效价。结果表明：K99菌毛亚单位间接血凝效价为1:100。

2、将防腐剂硫柳汞按照质量分数为0.01％的量加入特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗中，充分振荡后，得到特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗成品，在无菌条件下分装保存。

实施例3、特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗的应用

一、致病性检测试验

1、菌液制备

将致病性大肠杆菌La株接种于LB培养基中，37℃摇菌24h；取20μL菌液倍比稀释后，涂板培养计数，计算结果表明：每毫升菌液中细菌含量为5亿。

2、攻毒试验

16只家兔分为实验组8只和对照组8只：实验组每只家兔腹腔接种1mL菌液，对照组每只家兔腹腔接种1mL生理盐水，饲养观察7d；

20只小白鼠分为实验组10只和对照组10只：实验组每只小白鼠腹腔接种0.2mL菌液，对照组每只小白鼠腹腔接种0.2mL生理盐水，饲养观察7d。

3、试验结果

实验组兔子6只发病，且2只死亡，对照组兔子均健康。实验组小白鼠10只均发病，且5只死亡，对照组小白鼠均健康。结果表明大肠杆菌La株为致病性大场杆菌。

二、疫苗免疫小鼠实验

1、免疫

取24只小白鼠分为实验组、对照组1和对照组2，每组8只；实验组每只注射2mL复合疫苗成品，注射两次，间隔15天)；对照组1每只注射2mL生理盐水，注射两次，间隔15天)；对照组2每只注射2mL生理盐水，注射两次，间隔15天。饲养20天后，每只小白鼠取血液制备血清，采用玻片凝集法检测血清抗体效价。结果表明：实验组抗体平均效价为1:2⁶，对照组1和对照组2效价均为0。

2、攻毒试验

完成步骤1后对小白鼠进行攻毒实验，实验组和对照组1每只小白鼠注射0.2mL菌液，对照组2每只小白鼠注射0.2mL生理盐水，攻毒后观察七天。结果表明：实验组小白鼠均健康；对照组1的小白鼠均发病，发病症状为注射18h后开始出现精神沉郁，食欲饮欲废绝，粪便稀软，从24h至72h共死亡5只，剖检后使用中国蓝弱选择培养基在肝脏和肠道分离到与攻毒菌株形态特征一致的典型致病性大肠杆菌。其余3只的症状持续至144h左右，最后耐过；对照组2的小白鼠均健康。说明本发明的复合疫苗成品可以有效防治大肠杆菌。

三、疫苗免疫驴驹试验

1、抗体效价

选46头孕龄相同的妊娠母驴随机分为实验组和对照组，每组23头。实验组妊娠母驴产前45天，30天分别注射5mL复合疫苗成品；对照组妊娠母驴产前45天、30天分别注射5mL生理盐水，免疫后15-25天，采母驴血液，离心后取其血清。用玻片凝集法进行抗体效价检测。结果表明：实验组抗体平均效价为1：2⁶，对照组均为阴性。

2、大肠杆菌腹泻发生率

统计实验组和对照组46头母驴生产的45日龄内的驴驹腹泻发生率。并采用氟苯尼考注射液(购买自湖北武当动物药业有限责任公司，兽药目录号：2547)对实验组和对照组中发生腹泻的驴驹进行抗生素治疗。

结果表明：实验组23头母驴共出生23头驴驹，45日龄内腹泻发生率为4.3％(1/23)，而经过抗生素治疗后均治愈；对照组出生23头驴驹，45日龄内腹泻发生率为30.4％(7/23)，还是有3头驴驹死亡，死亡率为13.0％(3/23)。

序列表

<110>聊城大学

<120>特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>261

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

Met Thr His Gln Thr His Ala Tyr His Met Val Asn Pro Ser Pro Trp

1 5 10 15

Pro Leu Thr Gly Ala Leu Ser Ala Leu Leu Met Thr Ser Gly Leu Ile

20 25 30

Met Trp Phe His Tyr Asn Ser Met Ala Leu Leu Thr Leu Gly Phe Thr

35 40 45

Thr Asn Leu Leu Thr Met Tyr Gln Trp Trp Arg Asp Val Ile Arg Glu

50 55 60

Gly Thr Phe Gln Gly His His Thr Pro Ile Val Gln Lys Gly Leu Arg

65 70 75 80

Tyr Gly Met Val Leu Phe Ile Val Ser Glu Val Phe Phe Phe Ala Gly

85 90 95

Phe Phe Trp Ala Phe Tyr His Ser Ser Leu Ala Pro Thr Pro Glu Leu

100 105 110

Gly Gly Cys Trp Pro Pro Thr Gly Ile Ile Pro Leu Asn Pro Leu Glu

115 120 125

Val Pro Leu Leu Asn Thr Ser Val Leu Leu Ala Ser Gly Val Ser Ile

130 135 140

Thr Trp Ala His His Ser Leu Met Glu Gly Asn Arg Lys His Met Leu

145 150 155 160

Gln Ala Leu Phe Ile Thr Ile Ser Leu Gly Val Tyr Phe Thr Leu Leu

165 170 175

Gln Ala Ser Glu Tyr Tyr Glu Thr Ser Phe Thr Ile Ser Asp Gly Val

180 185 190

Tyr Gly Ser Thr Phe Phe Met Ala Thr Gly Phe His Gly Leu His Val

195 200 205

Ile Ile Gly Ser Thr Phe Leu Ile Val Cys Phe Leu Arg Gln Leu Tyr

210 215 220

Tyr His Phe Thr Ser Asn His His Phe Gly Phe Glu Ala Ala Ala Trp

225 230 235 240

Tyr Trp His Phe Ile Asp Val Val Trp Leu Phe Leu Tyr Val Ser Ile

245 250 255

Tyr Trp Trp Gly Ser

260

Claims

1.一种疫苗，其活性成分为大肠埃希氏菌Escherichia coli和菌毛亚单位；

所述大肠埃希氏菌Escherichia coli为大肠埃希氏菌Escherichia coli驴腹泻性大肠杆菌La株，其保藏编号为CGMCC NO.14058；

所述菌毛亚单位为k99菌毛亚单位；

所述k99菌毛亚单位的氨基酸序列为序列1。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述大肠埃希氏菌Escherichia coli和所述菌毛亚单位的配比为75亿cfu ：（2.0-2.5）mg。

3.权利要求1或2所述的疫苗的制备方法，包括如下步骤：

（1）将大肠杆菌菌液与甲醛水溶液混匀，得到灭活体系，反应，得到灭活菌苗溶液；

（2）将所述灭活菌苗溶液与菌毛亚单位溶液混匀，得到所述疫苗；

所述大肠杆菌为大肠埃希氏菌Escherichia coli驴腹泻性大肠杆菌La株，其保藏编号为CGMCC NO.14058；

所述菌毛亚单位为k99菌毛亚单位；

所述k99菌毛亚单位的氨基酸序列为序列1。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌在所述灭活体系中的浓度为100亿个/mL；

所述甲醛在所述灭活体系中的体积分数为0.5%；

所述反应条件为37℃反应48-72 h。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述菌毛亚单位溶液的浓度为9.5 mg/mL；

所述灭活菌苗溶液与所述菌毛亚单位溶液的体积比为3:1。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）后还包括向所述疫苗中添加防腐剂的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述防腐剂为硫柳汞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述硫柳汞按照质量分数为0.01%的量加入所述疫苗中。

9.权利要求1或2所述的疫苗或权利要求3-8任一所述的方法制备得到的疫苗在如下（a1）或（a2）中的应用：

（a1）制备预防和/或防治大肠杆菌性腹泻的产品中的应用；

（a2）制备降低大肠杆菌性腹泻发生率的产品；

所述大肠杆菌性腹泻为马属动物大肠杆菌性腹泻。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述马属动物为驴。