CN105670972B - 水貂绿脓杆菌血清g型菌株及其灭活疫苗和应用 - Google Patents

水貂绿脓杆菌血清g型菌株及其灭活疫苗和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株水貂绿脓杆菌血清G型菌株及其应用，属于水貂绿脓杆菌菌株的分离和应用领域。本发明从多例疑似患有水貂出血性肺炎的病死水貂肺脏中，通过分离、鉴定和筛选等方法，最终得到一株致病力强、稳定性高的水貂绿脓杆菌血清G型DL012菌株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12144。本发明还公开了用该菌株制备灭活疫苗的方法，包括：培养菌株，获得菌液；加入灭活剂，将菌液灭活；混匀佐剂和菌液，配苗，即得。安全性、免疫效力试验证明，用本发明所分离的水貂绿脓杆菌血清G型DL012菌株制备的灭活疫苗具有较高的安全性和良好的免疫效力，对于绿脓杆菌所致的水貂出血性肺炎能够提供好的临床保护作用。

Description

水貂绿脓杆菌血清G型菌株及其灭活疫苗和应用
技术领域
本发明涉及水貂绿脓杆菌，尤其涉及一株水貂绿脓杆菌血清G型菌株，本发明进一步涉及用该菌株制备的预防水貂出血性肺炎的灭活疫苗，属于水貂绿脓杆菌的分离和应用领域。
背景技术
水貂出血性肺炎是由绿脓杆菌(又称铜绿假单胞菌，Pseudomonas aeruginosa)感染引起的一种高度致死性传染病，多发于每年9至11月份，该菌可通过患病水貂形成的飞沫及气溶胶传播。发病急、死亡快，所以又称铜绿假单胞菌肺炎，以呼吸困难、口鼻出血、突发性死亡为主要特征，死后典型症状为口鼻流出血样泡沫，剖检肺脏呈弥漫性出血。
绿脓杆菌，属于γ变性菌门假单胞菌科，为需氧或兼性厌氧菌的革兰氏阴性杆菌。目前对绿脓杆菌分型常用方法是血清学分型，国际血清分型系统根据菌体O抗原将其分为20个不同的血清型。日本科学家Homma根据O抗原将绿脓杆菌分为A～N群，并且根据此系统形成的试剂盒在国际社会形成广泛应用。
绿脓杆菌为条件致病菌，广泛存在于环境中，接种疫苗是预防该病的有效方法，同时避免了使用抗生素导致菌株产生耐药性。中国于上世纪80年代初首次报道了水貂出血性肺炎病例，此后相继有该病报道，调查发现中国各地水貂出血性肺炎以G型为主，流行情况为60％～80％不等，其次是B型和C型，由于各血清型之间无交叉保护，制备的单苗具有针对性。因此，研制一种防治水貂出血性肺炎的安全性好、保护效力高的灭活疫苗具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株致病力强、稳定性高的水貂绿脓杆菌血清G型菌株；
本发明的目的之二是将所分离的水貂绿脓杆菌血清G型菌株应用于防治水貂出血性肺炎。
本发明的目的之三是提供一种制备防治水貂出血性肺炎的灭活疫苗的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明从多例疑似患有水貂出血性肺炎的病死水貂肺脏中，通过分离、鉴定、筛选、检测最终得到了24株血清G型菌株，对24株菌株的致病力进行筛选，得到致病力较好的3株血清G型菌株，对3株菌株稳定性进行筛选最终得到了稳定性高的水貂绿脓杆菌血清G型DL012株，已将分离的菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.12144；分类命名为：铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2016年2月24日：保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明无菌采集疑似患有水貂出血性肺炎的病死水貂肺脏，接种2％牛血清肉汤琼脂平板，37℃过夜培养，挑取疑似单菌落划线接种绿脓素测定用培养基(PDP)，37℃培养24小时，挑取阳性菌落接种5ml 2％牛血清肉汤培养基，37℃培养过夜，记为F0代。经过PCR鉴定、16S rRNA基因序列进行分析，结果表明：PCR鉴定为阳性，测序结果与预期相符，符合片段大小为956bp。然后对其形态、生化特性、培养特性进行分析，结果表明，分离株符合绿脓杆菌的形态、生化及培养特性，初步鉴定为阳性的菌液。对初步鉴定为阳性的菌液进行血清型鉴定检测，筛选出24株血清G型菌株。然后对血清G型菌株进行纯化，得到编号HL001、DL002、SD003、DL004、PL005、SD006、SD007、WD008、SD009、SD010、SD011、DL012、DL013、WH014、SD015、SD016、WD017、SD018、SD019、SD020、WD021、SD022、SD023和SD024菌株。然后，对上述24株血清G型菌株的致病力进行筛选，得到致病力较好的3株G型菌株：PL005株、DL012株和WH014株。进一步对将绿脓杆菌血清G型PL005株、DL012株和WH014株的稳定性进行筛选，最终得到了稳定性高的绿脓杆菌血清G型DL012株。
为了验证本发明绿脓杆菌血清G型DL012株的免疫效力，本发明对绿脓杆菌血清G型DL012株的毒力和免疫原性进行测定，毒力测定表明：绿脓杆菌血清G型DL012株对小鼠的LD50为1.1×105CFU；对2～5月龄水貂LD50为9.28×104CFU。免疫原性测定表明：用该分离株F1代制备的疫苗免疫2～5月龄水貂5只，免后21日，以10LD50进行攻毒，免疫组保护率为5/5，对照组保护率为0/5。以上结果表明绿脓杆菌血清G型DL012株分离株F1代免疫原性良好。
进一步，本发明将绿脓杆菌血清G型DL012株制备成三批灭活疫苗，对非靶动物、对靶动物单剂量和超剂量进行安全性试验，结果表明：非靶动物、靶动物临床表现均正常，注射局部和全身无不良反应，全部存活。对灭活疫苗的效力进行试验，结果表明：对于水貂：G型灭活疫苗免后21日攻毒，三批疫苗对免疫组水貂保护率均不小于80％，对照组水貂均100％发病；对于小鼠：免后21日攻毒，三批疫苗对免疫组小鼠保护率均不小于90％，对照组水貂均100％发病。对免疫持续期进行试验，结果表明：G型灭活疫苗对水貂抗绿脓杆菌DL012株的保护期为6个月，免疫保护率均不小于80％。以上说明血清G型DL012株安全性较好，能够提供好的临床保护。
本发明还提供了血清G型DL012株在制备防治水貂出血性肺炎的应用。
为此，本发明提供了一种防治水貂出血性肺炎的疫苗组合物，包括：预防或治疗上有效量本发明所分离的绿脓杆菌血清G型DL012菌株以及药学上可接受的佐剂。
本发明进一步提供了一种制备所述防治水貂出血性肺炎的疫苗组合物的方法，该方法包括：
(1)培养绿脓杆菌血清G型DL012株，得到菌液；
(2)向菌液中加入灭活剂，将菌液灭活；
(3)灭活后的菌液与佐剂混合均匀，配苗，即得。
步骤(1)中将血清G型DL012株接种含2％牛血清肉汤琼脂平板，37℃过夜培养，挑取单个典型菌落进行扩大培养，按培养基体积总量的1％接种TSB培养基，37℃通气搅拌培养；
步骤(2)中向菌液中加入的灭活剂是甲醛，加入甲醛至其终浓度为菌液体积总量的0.1％，灭活24小时。
步骤(3)中，所述的佐剂为氢氧化铝胶，其中，氢氧化铝胶为体积百分比为30％氢氧化铝胶。
本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明所分离的水貂绿脓杆菌血清G型DL012菌株致病力强、稳定性高，其制备的灭活疫苗具有较高的安全性和良好的免疫效力，对于绿脓杆菌所致的水貂出血性肺炎能够提供好的临床保护，能有效预防水貂出血性肺炎。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“疫苗”意指将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。
术语“佐剂”意指非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。
术语“免疫”意指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。
术语“免疫原性”意指能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力，即指抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫反应。
附图说明
图1为分离株16S rRNA基因片段PCR扩增结果，其中：M：DL 2000Marker；1：分离株；2：阳性对照；3：阴性对照；
图2为绿脓杆菌血清G型PL005、DL012、WH014的F1代在传代过程中菌体含量变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、试验材料
1.1主要试剂
rTaq、dNTP、DL2000DNA Marker、pMD18-T载体和DH5α均购自宝生物工程(大连)有限公司；胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司产品；琼脂糖购自生工生物工程(上海)有限公司；氨苄(Amp+)购自Sigma公司；甘油、甲醛溶液和NaCl均购自国药集团。
1.2培养基
LB培养基、LB琼脂平板、2％牛血清肉汤培养基、2％牛血清肉汤琼脂平板和TSB培养基。
1.3阳性血清
绿脓杆菌分型用标准血清系列，购自日本生研株式会社。
1.4试验动物
18～20g清洁级昆明小鼠购自哈药集团三精制药有限公司；2～5月龄水貂购自黑龙江省尚志市五仁养貂专业合作社(绿脓杆菌B型、C型和G型玻片凝集试验抗体阴性)。
1.5病料
无菌采集疑似患有水貂出血性肺炎的病死水貂肺脏89份，标记1#～89#，4℃保存备用。
实验例1绿脓杆菌血清G型菌株的分离、鉴定及纯化
1、实验方法
1.1绿脓杆菌菌株的初步分离
分别无菌沾取89份病料切面划线接种2％牛血清肉汤琼脂平板，37℃过夜培养，挑取疑似单菌落划线接种绿脓素测定用培养基(PDP)，37℃培养24小时，若产绿色素，菌落周围呈浅绿色，为绿脓杆菌阳性。挑取阳性菌落接种5ml 2％牛血清肉汤培养基，37℃培养过夜，记为F0代。
1.2阳性菌株16S rRNA基因鉴定
1.2.1PCR鉴定
根据GenBank参考菌株序列，用Primer 5.0软件设计一对绿脓杆菌基因的特异性引物，用于绿脓杆菌基因部分序列的扩增。以提取的分离株的DNA为模板，引物为：上游引物为5′-GGAATCGTCGGACTAC-3′；下游引物为5′-TCCCTAGTTCCATCC-3′(引物由上海生物工程有限公司合成)。预期扩增产物目的片段大小为956bp。反应体系为25μl：Buffer 2.5μl、dNTP2μl、上下游引物各1μl、模板1μl、rTaq 0.5μl、去离子水补齐。反应程序为95℃5min；95℃1min、55℃1min、72℃1min，循环35次；72℃10min。进行PCR扩增，1％的琼脂糖凝胶电泳，得到16S rRNA基因片段。
1.2.2 16S rRNA基因序列分析
扩增片段经连接转化提取重组质粒，阳性重组子命名为pPA16S-1。分析测序结果的16S rRNA基因片段的大小。
1.3阳性分离株形态、生化特性及培养特性
对阳性分离株做进一步的菌属鉴定，取PCR鉴定为阳性的F0代划线培养的典型菌落，进行革兰氏染色，在油镜下观察细菌应为革兰氏阴性杆菌；同时对菌落进行氧化酶试验应为阳性；在2％牛血清肉汤培养基上生长，培养基应均匀混浊，呈黄绿色；在绵羊鲜血琼脂平板上，应产生明显的β溶血；在PDP斜面上生长，应产绿色素，菌落周围应呈浅绿色。
1.4血清型鉴定
将鉴定为阳性的F0代菌液，应用绿脓杆菌分型用标准血清进行血清型检测，进一步筛选不同血清型的绿脓杆菌。操作步骤按绿脓杆菌分型用标准血清系列的说明书进行。混感病料不做进一步筛选。
1.5血清G型分离株的纯化
对初步筛选为血清G型阳性分离株F0代进行纯化，划线培养挑取单个典型菌落进行扩大培养，将获得的F1代，-70℃冰箱甘油保存。
2、实验结果
2.1细菌分离结果
89份病料经细菌分离培养，83份菌落为疑似，形态基本符合目标菌落形态，培养基变黄绿色。6份病料未培养出菌落或菌落形态不符，判为阴性。
2.2PCR鉴定及序列分析
2.2.1分离株16S rRNA基因片段PCR扩增结果
根据GenBank参考菌株序列设计引物，以分离株的DNA为模板，PCR扩增16S rRNA基因片段。其中一分离菌株的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，在1000bp处扩增出1条片段，与预期结果相符，表明该分离株为16S rRNA基因阳性。
2.2.2 16S rRNA基因片段测序结果
测序结果预期相符，片段大小为956bp。
2.3形态、生化特性及培养特性
对PCR鉴定为阳性的分离菌株进行培养，革兰氏染色结果为革兰氏阴性杆菌；氧化酶试验阳性；在2％牛血清肉汤培养基上生长，培养基均匀混浊，呈黄绿色；在绵羊鲜血琼脂培养基上菌落周围出现溶血环；PDP斜面上生长，产绿色素，菌落周围呈浅绿色。以上结果表明，分离株符合绿脓杆菌的形态、生化及培养特性。
2.4血清型鉴定结果
将初步鉴定为阳性的83份菌液，应用绿脓杆菌分型用标准血清(日本生研株式会社)进行血清型检测，筛选出24株血清G型菌株。
2.5血清G型分离株的纯化
对24株血清G型的F0代进行纯化，获得F1代，保留部分新鲜菌液置4℃，其余分装-70℃甘油保存。编号定为HL001、DL002、SD003、DL004、PL005、SD006、SD007、WD008、SD009、SD010、SD011、DL012、DL013、WH014、SD015、SD016、WD017、SD018、SD019、SD020、WD021、SD022、SD023和SD024。
实验例2绿脓杆菌血清C型菌株致病力和稳定性的筛选
1、实验方法
1.1致病力筛选
分别将符合要求的各血清G型分离株F1代进行下列操作，稀释至107CFU/mL和108CFU/mL，每个滴度滴鼻接种10只小鼠，0.1mL/只，设生理盐水对照组10只；记录小鼠死亡情况，选择48小时内可使半数及半数以上小鼠死亡的血清G型备选株。
1.2传代稳定性测定
将符合标准的血清G型候选菌F1代连续传代至F25代。每次传代后震荡培养18小时，分别对F1、F3、F6、F9、F12、F15、F18、F21和F24代进行活菌计数及形态观察，最终筛选菌数含量多、稳定的一株作为制苗及检验用菌种。
2、实验结果
2.1致病力筛选
血清G型疫苗株致病力的结果见表1，2和3，从表1，2和3中可以看出对照组小鼠均健活，24株血清G型绿脓杆菌108CFU/mL浓度可使半数及以上小鼠48小时内死亡的有3株：PL005株、DL012株和WH014株。
表1血清G型疫苗株致病力筛选结果
表2血清G型疫苗株致病力筛选结果
表3血清G型疫苗株致病力筛选结果
2.2稳定性筛选
将血清G型绿脓杆菌PL005株、DL012株和WH014株培养物连续传25代，每三代进行活菌计数及细菌形态观察，菌体含量如图2所示，3株在25代次内菌体含量均稳定，形态特征变化不明显，但DL012株相对更为稳定且CFU数更加高，因此筛选此株为制苗及检验用菌株，命名为DL012株。本发明将血清G型绿脓杆菌DL012株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12144；分类命名为：铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa；保藏时间是：2016年2月24日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实验例3血清G型绿脓杆菌DL012株的毒力和免疫原性测定
1、实验方法
1.1毒力测定
1.1.1对小鼠的毒力测定
选取健康小鼠40只，分成4组，每组10只，DL012株菌液进行10倍系列稀释，取10-1～10-4滴度，滴鼻接种小鼠，0.1mL/只，观察7日，记录各组小鼠死亡情况，按Reed-Muench法计算分离株对小鼠半数致死量(LD50)。
1.1.2对水貂的毒力测定
选取健康水貂20只，分成4组，每组5只，DL012株菌液进行10倍系列稀释，取100～10-3滴度，滴鼻接种水貂，0.2mL/只，观察7日，记录各组水貂的死亡情况，按Reed-Muench法计算该分离株对水貂LD50。
1.2免疫原性测定
将F1代DL012株菌液调整至3.0×108CFU/ml，经0.1％甲醛溶液灭活，皮下接种5只2～5月龄健康水貂，1.0ml/只，另5只作为对照。免后21日，以10LD50攻击水貂，滴鼻接种0.2ml/只。攻毒后观察7日，免疫组应至少保护4/5，对照组应全部死亡。
2实验结果
2.1血清G型DL012株毒力测定
2.1.1对小鼠的毒力
对小鼠进行LD50测定，结果见表4，血清G型DL012株对小鼠的LD50为1.1×105CFU。
表4血清G型DL012株LD50结果
2.1.2对水貂的毒力
对水貂进行LD50测定，结果见表5，血清G型DL012株对2～5月龄水貂LD50为9.28×104CFU。
表5血清G型DL012株对2～5月龄水貂LD50结果
2.2免疫原性
血清G型DL012株免疫原性结果见表6。用该分离株F1代制备的疫苗免疫2～5月龄水貂5只，免后21日，以10LD50进行攻毒，免疫组保护率为5/5，对照组保护率为0/5。结果表明分离株F1代免疫原性良好。
表6血清G型DL012株免疫原性
实验例4血清G型DL012株灭活疫苗的制备及成品检验
1、实验方法
1.1疫苗的制备
将血清G型DL012株划线接种含2％牛血清肉汤琼脂平板，37℃过夜培养，挑取单个典型菌落进行扩大培养，按培养基体积总量的1％接种TSB培养基，37℃通气搅拌培养；按菌液体积总量0.1％加入甲醛溶液，灭活24小时，期间搅拌3次；获得灭活菌液加入体积百分比为30％的氢氧化铝胶进行配苗。按此方法，制备3批疫苗。
1.2安全性试验
制备的3批疫苗分别进行对非靶动物安全性试验，对靶动物单剂量和超剂量安全性试验。
1.2.1对非靶动物的安全性试验
制备的3批疫苗分别腹腔接种18～20g小鼠，0.3ml/只，10只/批，接种后观察14日。记录小鼠局部及全身反应情况。
1.2.2靶动物单剂量和超剂量免疫安全性试验
选取30只2月龄水貂，随机分为6组，5只/组，制备的3批疫苗分别进行单剂量(1～3组)和超剂量(4～6组)皮下免疫，单剂量1.0ml/只，超剂量2.0ml/只。免疫后观察14日，记录水貂局部及全身反应情况。
1.3效力试验
1.3.1对水貂的效力试验
试制的三批疫苗均进行下列操作，取2～5月龄健康易感水貂10只，随机分为2组，每组5只。第1组水貂皮下注射疫苗1.0ml/只；第2组水貂不免疫作为对照。免后21日，两组水貂分别滴鼻接种10LD50的DL012株菌液0.2ml，攻毒后观察7日。对照组水貂应全部死亡，免疫组水貂应至少保护4只。
1.3.2对小鼠的效力试验
试制的三批疫苗均进行下列操作，取体重18～20g清洁级昆明小鼠20只，随机分为2组，每组10只。第1组小鼠各腹腔注射疫苗0.3ml；第2组小鼠不免疫作为对照。免后21日，两组小鼠分别滴鼻接种10LD50的DL012株菌液0.1ml，攻毒后观察7日。对照组小鼠应全部死亡，免疫组小鼠应至少保护8只。
1.4免疫期效力试验
试制的三批疫苗均进行下列操作，取2～5月龄水貂40只，20只免疫，20只为对照。分别于免后30、90、180和210日滴鼻攻击10LD50的DL012株菌液0.2ml，免疫组和对照组各5只。免后观察14日，对照组水貂应全部死亡，免疫组水貂应至少保护4只为合格。
2、实验结果
2.1制苗结果
共制备3批疫苗，批号分别为01-G批、02-G批和03-G批，每批为2000ml，20ml/瓶。
2.2疫苗的安全性试验结果
2.2.1疫苗对非靶动物的安全试验结果
疫苗对小鼠的安全性试验结果见表7和表8，从结果可以看出，3批疫苗接种小鼠后，在观察期内小鼠全部健活，临床表现正常、免疫局部和全身无不良反应。
表7对小鼠的安全性试验临床观察结果
注：*仅于免疫当日幼貂采食量有所减少
表8疫苗对小鼠的安全性试验局部及全身反应结果
2.2.2最小使用日龄靶动物单剂量免疫的安全试验结果
疫苗对最小使用日龄靶动物单剂量免疫安全性试验结果见表9和表10。从结果可以看出，3批疫苗单剂量接种最小使用日龄水貂后，在观察期内水貂全部健活，临床表现均正常、注射局部和全身无不良反应，全部存活。
表9对水貂最小使用日龄单剂量免疫安全性试验临床观察结果
注：*仅于免疫当日水貂采食量有所减少、精神沉郁
表10对水貂最小使用日龄单剂量免疫安全性试验局部及全身反应
2.2.3靶动物一次超剂量免疫安全性试验结果
疫苗对靶动物一次超剂量免疫安全性试验结果见表11和表12。从结果可以看出，3批疫苗超剂量接种水貂后，在观察期内水貂全部健活，临床表现正常、免疫局部和全身无不良反应，全部存活。
表11靶动物一次超剂量免疫安全性试验临床观察结果
注：*仅于免疫当日水貂采食量有所减少
表12靶动物一次超剂量免疫安全性试验局部及全身反应结果
2.3试制三批疫苗的效力试验
2.3.1对水貂的效力试验结果
结果如表13所示，G型灭活疫苗免后21日攻毒，三批疫苗免疫组水貂均保护率均不小于80％，对照组水貂均100％发病。
表13对水貂的免疫效力试验结果
2.3.2对小鼠的效力试验结果
结果如表14所示，免后21日攻毒，三批疫苗免疫组小鼠均保护率均不小于90％，对照组水貂均100％发病。
表14对小鼠的免疫效力试验结果
2.4免疫持续期试验结果
结果如表15所示，表明G型灭活疫苗对水貂抗绿脓杆菌DL012菌株的保护期为6个月，免疫保护率均不小于80％。
表15免疫持续期试验结果

Claims (10)

1.一株水貂绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)血清G型菌株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12144。
2.权利要求1所述的水貂绿脓杆菌血清G型菌株在制备防治水貂出血性肺炎疫苗中的用途。
3.一种防治水貂出血性肺炎的疫苗组合物，其特征在于，包括：防治上有效量的权利要求1所述的水貂绿脓杆菌血清G型菌株和药学上可接受的佐剂。
4.一种制备水貂绿脓杆菌血清G型菌株灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养权利要求1所述的水貂绿脓杆菌血清G型菌株，得到菌液；
(2)向菌液中加入灭活剂，将菌液灭活；
(3)灭活后的菌液与佐剂混合均匀，配苗，即得。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述培养包括：将权利要求1所述的水貂绿脓杆菌血清G型菌株接种到牛血清肉汤琼脂平板，过夜培养，挑取单个典型菌落接种到TSB培养基，通气搅拌培养，得到菌液。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述过夜培养和通气搅拌培养的温度均为37℃。
7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的灭活剂是甲醛。
8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中向菌液中加入甲醛，至其终浓度为菌液体积总量的0.1％；所述的灭活时间为24小时。
9.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的佐剂为体积百分比为30％的氢氧化铝胶。
10.由权利要求4～9任一项方法制备得到的预防水貂出血性肺炎的灭活疫苗。
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