CN85109506A - 菌苗的制备方法 - Google Patents
菌苗的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN85109506A CN85109506A CN85109506.2A CN85109506A CN85109506A CN 85109506 A CN85109506 A CN 85109506A CN 85109506 A CN85109506 A CN 85109506A CN 85109506 A CN85109506 A CN 85109506A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vehicle
- plasmid
- clone
- dna
- site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 32
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims 3
- 108010000916 Fimbriae Proteins Proteins 0.000 claims 2
- 101100117236 Drosophila melanogaster speck gene Proteins 0.000 claims 1
- STECJAGHUSJQJN-GAUPFVANSA-N Hyoscine Natural products C1([C@H](CO)C(=O)OC2C[C@@H]3N([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)C)=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-GAUPFVANSA-N 0.000 claims 1
- STECJAGHUSJQJN-UHFFFAOYSA-N N-Methyl-scopolamin Natural products C1C(C2C3O2)N(C)C3CC1OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- STECJAGHUSJQJN-FWXGHANASA-N scopolamine Chemical compound C1([C@@H](CO)C(=O)O[C@H]2C[C@@H]3N([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)C)=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-FWXGHANASA-N 0.000 claims 1
- 229960002646 scopolamine Drugs 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 33
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 4
- 238000005192 partition Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 13
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 8
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 4
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 3
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 108010038854 colibacterin Proteins 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 229940049547 paraxin Drugs 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 108010046845 tryptones Proteins 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明是通过把DNA片段插入到含有高拷贝 质粒和分割位点(Partition locus)的克隆运载体 中，有关克隆大片段DNA的一种新方法。
对用转化过的大肠杆菌产生987P纤毛蛋白，并 与疫苗相结合以预防和治疗幼猪的腹泻方面，本发 明的方法是特别有用的。
该方法作为创建真核生物DNA基因库的一种 工具，也是十分有用的。
Description
本发明与克隆运载体和基因克隆方法有关，特别是与987P纤毛基因克隆的方法有关，也同由此产生含纤毛的菌苗有关。
新生的幼猪腹泻是起因于某些大肠杆菌菌株在小肠中的生长。这些菌株能合成肠毒素（enderotoxims），肠毒素引起腹泻和脱水，而腹泻和脱水又常常造成幼猪的死亡。这些产肠毒素的大肠杆菌菌株的特点是它能够通过纤毛附着到小肠的上皮上，所以能在小肠里迅速增殖。
已经知道大肠杆菌许多不同的纤毛血清型同新生的幼猪腹泻有关，其中主要血清型是K88ac、K88ab、K99和987P等。K88ac、K88ab和K99的基因已经知道是质粒编码的，并已被克隆。然而，987P纤毛的编码基因仍未被克隆，并且还未确定这些基因是在质粒上，还是位于染色体上。
已经认为能够用一种或几种纤毛抗原给母猪接种，从而产生抗体，而这些抗体又转过来会阻止产肠毒素的大肠杆菌附着到幼猪的小肠上进行繁殖，而不引起与感染有关的症状。因而希望生产足够量的纤毛抗原，可以给动物作大规模的疫苗接种。从野生型大肠杆菌分离纤毛，因为纤毛数量很少而有困难。然而，如果纤毛编码的基因能被克隆到适当寄主的高拷贝质粒运载体中，纤毛的表达就可以提高10-100倍，然后这些纤毛能够大量被分离，这样产生的纤毛没有野生型的肠毒素，而野生型的肠毒素可以引起不希望有的疫苗付反应。
常认为987P基因的克隆如果可能的话，也是极为困难的。首先，基因的位置还没有被确定，而且还认为要使987P能够表达需要有非常大的DNA片段。DNA大片段在高拷贝质粒运载体中是特别不稳定的。
本发明为克隆DNA大片段提供组建克隆运载体的方法，包括把DNA大片段和一个分割位点（Partition locus），插入到一个高拷贝质粒中，如pBR或pACYC基础运载体。
特别优先考虑的质粒是pBR322、pBR329和pACYC184。
本发明也为组建987P纤毛表达的克隆运载体提供方法。
987P纤毛的工作已经使本发明者得到结论，分割位点插入到一个质粒克隆运载体内，如pBR质粒，可使或者增强。DNA大片段稳定地克隆到这种运载体内。
此发明的目的是提供pBTA599质粒，即以前称之为pBR329/par。
进一步的目的是提供重组合质粒pBTA201和pBTA200。
另一目的是要提供包括一个质粒的克隆运载体，这个质粒有一段含有分割位点的DNA片段和一段包含有987P纤毛蛋白编码基因的DNA片段。
本发明也为组建能够表达987P纤毛的克隆运载体提供方法，这方法包括：
（ⅰ）把一段含有分割位点的DNA片段插入到一个合适的质粒，如pBR329，pBR322或pACYC184中。
（ⅱ）把一段含有表达987P纤毛基因的DNA片段插入到（ⅰ）的质粒中。
最优先采用的分割位点是从F小型质粒pML31分离到的SOP位点（如Austin and Wierzbick，PLASmlDS，1983.10.73-81，所述）。
本发明进一步提供一株转化了的微生物，即用本发明的方法产生的克隆运载体所转化了的微生物。用于本发明的非常合适的微生物是大肠杆菌。本发明一个优先考虑的特点是用能表达987P纤毛蛋白的克隆运载体转化大肠杆菌，特别优先的是用pBTA201转化。
本发明也提供一种菌苗，它含有能表达987P纤毛蛋白的克隆运载体的并经改造过的大肠杆菌。
另一方面，本发明的菌苗可以包含有从改造过的细菌培养物中分离到的987P纤毛。
图1是本发明的运载体pBTA599的DNA限制性内切酶酶切图谱。
图2是pBTA201的限制性内切酶酶切图谱，52Kb的插入片段和运载体。
克隆运载体的构建：
克隆运载体通过把F小型质粒pML31的分割位点插入到pBR329中构建而成的。
pBR322系质粒缺乏对等分割所需要的功能，这意思是pBR322不能稳定地存在超过50代。然而，分割位点编码一种机制，它保证细胞分裂时质粒也精确地分割（Meacock and Cohen，Cell.20，S29-S42，1980。和Tucker et al.Cel.38，191-201，1984）。
分割位点已被证明位于大肠杆菌的F质粒上（Austin and Wierzbick，PLASMID，10，73-81，1983），更准确地说在F质粒的46-49.4kb区域（Ogura and Hiraga，proc Natl.Acad，Sci.USA，80，4784-4788，1983）。这特异性的分割位点被称为Sop位点。
我们已经把pML31的F质粒的SmaI/HpaI片段（45.3-49.4kb）克隆到pBR329的PvuⅡ位点上。质粒pML31在5mM NaCl，1mM Tris，pH7.4，1mM MgSO4和0.1mM DTT（中等盐浓度缓冲液），37℃中相继用SmaI，然后HpaI酶解。酶解物加到0.8%琼脂糖凝胶上（电泳），4.1kb片段洗脱到NA45滤纸上。在酶解物中存在的4.2kb左右的片段同4.1kb片段一起被洗脱下来。用含有1M NaCl的TE缓冲液中在65℃加热60分钟，把DNA从NA45滤纸上洗脱下来。NaCl的浓度降低到0.2M，该DNA用苯酚、氯仿抽提，最后用乙醇沉淀。pBR329运载体在中等盐浓度缓冲液里经过PvuⅡ酶解，然后在0.1M Tris pH8中经过磷酸酶酶解。被洗脱的HpaI，SmaI片段和磷酸酶酶解的pBR329各约600毫微克，在1mM ATP，10mM DTT，10mM MgCl2和10mM Tris pH8中，用1单位的T4-DNA连接酶在4℃进行连接反应过夜。连接反应物转化用CaCl2新制备的感受态MC1061细胞。在LB+氨苄青霉素平板上，选择含pBR329的菌落，以及在LB+氯霉素平板上再筛选含有插入片段的菌落，从含有插入片段的菌落来的质粒，用PstI和PvuI酶解，确定所要的4.1kb HpaI/SmaI片断已经插入。这片段应该含有分割位点，因而不仅应该使pBR329变得稳定，而且还使得从这一运载体来的任何重组合分子也变得稳定，例如，含有大的DNA插入片段的pBR329。这一新的运载体称之为pBTA599，表示于图1。
1.pBTA599的分析
对克隆到pBTA599的大片段的稳定性以及这些大型质粒的转化效率作了试验。
在987P质粒DNA基因库的构建中，分离出60.4kb质粒（pBTA201），从pBTA201来的33kb BamHI片段被亚克隆到pBTA599中，产生41.3kb的质粒（pBTA360）。这些质粒的转化效率与pBR322和pBTA599进行比较。大约各10毫微克质粒转化200微升CaCl2新制备的感受态MC1061细胞，结果总结于表1。
表1
质粒 质粒大小 转化效率
（菌落数/微克）
pBR322 4.2kb 2.0×106
pBTA599 8.4kb 3.38×105
pBTA360 41.3kb 2.4×104
pBTA201 60.4kb 1×103
随着质粒大小的增加，转化效率下降，与pBR322相比较，60.4kb质粒pBTA201的转化效率降低3次方，这是很容易估计到的。pBTA201和pBTA360的52kb和33kb的插入DNA片段，在转化和许多代生长中也保持稳定。
已经得到证明的是pBTA599稳定地保持和可克隆更大的片段的能力与pBR329（亲代运载体）相似。人的DNA用BamHl部分酶解，产生大的DNA片段，酶解在中等盐浓度中进行每微克人DNA用1单位BamHl。在8分钟和15分钟取样，合并，连接到经BamHl酶切和磷酸酶去磷的pBTA599上。每种运载体各约250毫微克与5微克的人DNA连接，并且转化到CaCl2新制备的MC1061细胞中。从两种转化中挑出氨苄青霉素抗性菌落，分离质粒DNA。来自48株pBTA599和48株pBR329的DNA插入片段作比较。pBTA599连接反应中插入片段平均大小是16.2kb，而在pBR329的是5.2kb。因为两个连接反应中都使用经同样部分酶解的人DNA，显然pBTA599比它的亲本运载体pBR329更倾向克隆大片段DNA。因而可以得到结论，分割位点插入到pBR系列质粒中，将使得或增强较长DNA片段稳定地克隆到这种运载体中。
主要的结果是它能用质粒构建成较高等真核生物（如人）的DNA基因库。这样可以不需要柯斯质粒作克隆运载体。
987P基因的定位：
为了确定987P纤毛编码基因是染色体上的还是质粒编码的，已作了如下实验。
987P的野生型分离物与大肠杆菌K12 NXR菌株用定量培养液方法进行杂交。对数期野生型给体和K12受体培养物以1∶100的比例（受体菌过量）混匀，杂交混合物在37℃静止培养1小时，然后涡动旋转终止杂交配对。把杂交混合物倒在羊血+萘啶酮酸琼脂平板上。用987P抗血清的凝集反应测定987P的表达来筛选反式接合子（transconjugants）。分离得到许多正反应的菌落。在这些菌落上可以看到含有野生型987P菌株的部分质粒成份。这意思是987P基因是在质粒DNA上，而不是在染色体DNA上编码的。
从野生型987P大肠杆菌构建质粒DNA基因库：
采用经Hansen和Olsen（J.Bacterol.135，227-238，1978）修改的方法，从野生型987P大肠杆菌中分离质粒DNA，以保证大型质粒有高的产量。
质粒DNA用BamHI部分酶解，产生大于30kb的DNA片段，水解在中等盐浓度缓冲液中进行。在水解15、30、45和60分钟时取样。15分钟水解可产生所需大小的片段。pBTA599在中等盐浓度缓冲液中用BamHI酶解，然后在0.1M Tris，pH8中进行磷酸酶酶解反应。在1mM ATP-10mM Tris，pH8-10mM MgCl2-10mM DTT中，987P部分酶解物与磷酸酶处理过的运载体在4℃用1单位T4-DNA连接酶进行连接反应，过夜。大约250毫微克运载体与5微克左右部分水解物连接。把连接反应物转化用CaCl2新制备的感受态MC1061细胞，得到约4000个ApR的菌落，其中94%是对四环素敏感的，说明它们带有插入的DNA片段。用987P纤毛特异性抗血清进行菌落免疫测定，结果筛选到500个左右987P已表达的菌落。
4个正反应的菌落被检测出，它们代表两种类型。2个菌落含有68kb的插入片段（pBTA200），另外二个含有52kb（pBTA201）。
52kb的插入片段和运载体（pBTA201）的限制性内切酶图谱示于图2。
987P的操纵子可能（跨越）在pBTA201插入片段的较大区域里，因为从pBTA201没有分离到任何仍能表达987P纤毛的亚克隆。
987P菌苗的生产
含有表达987P纤毛和装配诸基因的重组合质粒的寄主细胞，是作成冷冻干燥管保存在生产菌株收集站。细胞从贮藏管还原恢复，在选择性营养琼脂培养基平板上分离单菌落。生长后，表达987P的菌落用血清凝集反应进行鉴定，大多数活化的菌落被用来发酵罐生产的接种物，用来接种发酵罐的接种物其培养基含有胰蛋白胨、酵母提取物、盐和碳源。发酵反应用标准方法和工艺上熟练者所用的操作进行检测。当完成时，纤毛产物在原位同细菌细胞分离，离心除去生物量废物。得到的纤毛悬浮液用缓冲液洗涤，并用空心纤维超滤作用浓缩到最后的水溶液。
在质量检查和滴定分析之后，水溶液浓缩物用防腐剂贮存在4℃。
在油乳化菌苗中水的配方是按987P浓缩物水溶液同其它消过毒的抗原成分和防腐剂一起的精确体积用无菌方法测定。水相用无菌水配到某一个体积，与无菌的油相体积相等。整个水相以预定比例，在高速匀浆过程中加到油相里，以给出最后的配方。
菌苗的试验：
给幼猪喂未接种菌苗的母猪乳，或者喂用含有987P+纤毛抗原的大肠杆菌菌苗接种过的母猪乳，然后用987P+产肠毒素的大肠杆菌（ETEC）进行一系列对照攻击试验。试验的目的是要证明：
a.接种菌苗的母猪哺乳的幼猪受保护不患腹泻，以及受987P ETEC攻击不致引起死亡。
b.接种菌苗的母猪哺乳的幼猪中，在小肠减少987P ETEC菌的菌落化（Colonization）。
c.在接种菌苗母猪的初乳和血清中，以及它们幼猪的血清中，有显著的抗体效价。
方法学：
在对照攻击试验中使用的菌苗含有四种纯化的纤毛抗原，K88ac、K88ab、K99和987P以及油性佐剂。
母猪在受孕期间（产幼猪前8周和1-2周）用菌苗和无效药物作肌肉注射两次。
幼猪在攻击接种之前允许自然哺乳。在5-13小时幼令时，它们给予口服二种表达987P纤毛和产肠毒素的大肠杆菌菌株混合物。攻击接种的菌苗含有每种菌株各1×109成活细菌。
腹泻的初步诊断是凭视觉确定。在攻击接种后16-28小时，根据腹泻的存在、严重度或不腹泻，对选定的幼猪进行验尸。作如下的实验室试验来确定腹泻的原因。
a.从小肠的近、中、远端切片，作细菌计数。
b.相同位置的内脏进行组织病理学检查，鉴别病理变化以及附着到肠细胞上的细菌的存在。
c.以消化酶（碱性磷酸酶，乳糖酶）的水平作为结构性粘膜细胞损伤的指标，（如在轮环病毒（rotavirus）腹泻中，这些酶的浓度大大减少）。特异的抗纤毛IgG抗体的效价，用酶联免疫吸附分析法进行测定。
结果
来自对照组喂未接种菌苗母猪乳的幼猪中，100%幼猪出现严重的腹泻。而从接种菌苗的母猪组来的幼猪，有22.5%只遭受中度的短暂的（轻度）腹泻（looseness）（表2）。两组之间观察到的差异是高度显著的（x2＝40.9 P＜0.005）。
表2
菌苗对987P ETEC免疫试验的效率
处理组 母猪数 幼猪数 幼猪腹泻数（%）
对照组 3 26 26（100）a
接种菌苗组 4 40 9（22.5）a
a.显著性差异（X2-40.9，P＜0.005）
对照组所有幼猪的腹泻是十分严重的，并且引起的脱水（约10%）对生命有威胁。随后，剩下的对照组幼猪在接受攻击试验（challenge）后32-36小时都遭死亡。相反，从接种菌苗免疫的母猪组来的幼猪，当在接受攻击试验后46-48小时试验停止时，没有一头出现腹泻。
如用肠粘膜碎屑中细菌数量表示，与注射无效药物的母猪喂乳的幼猪作比较，喂乳的接种菌苗的母猪乳的幼猪中小肠远端部分的细菌集积明显地减少（t＝47，14d.f.P＜0.005）。
从接受攻击试验（Challenge）的幼猪内脏切片的组织病理学看出，所有对照组的幼猪中肠道细菌广泛地粘着在小肠粘膜上。而来自接种菌苗免疫的母猪生的幼猪，很少有或者没有肠道细菌附着在粘膜上。
根据消化酶的测定和组织病理学检查，意味着没有任何病毒与本病症有关。
组织病理学
在接种菌苗的母猪的血浆和初乳样品中，以及它们幼猪的血浆样品中已证明有高度特异的抗987P抗体效价，而注射无效药物的母猪及其幼猪只有很低水平的抗体（表3见下页）。在喂接种菌苗母猪乳的幼猪中，平均效价与对照组母猪的幼猪中平均效价之间的差异是高度显著的，如t＝15.7，46d.f.，P＜0.001。
a）在ELISA中血清最大稀释度的倒数。
b）几何平均效价，为进行几何平均数的计算，试验的血清最低稀释度作为ELISA法负值样品的效价。与这种样品有关的平均数在数字前标有＜符号
c）95%C.I.（可靠区间，Confidence inferval）：95%效价所属范围（X±1.96s/
）。
nd：实验未进行。
从这些结果可以得到结论，从接种菌苗的母猪获得适当数量初乳的幼猪，将会有效地防止987P ETEC菌在肠粘膜中集积，进而防止了腹泻。
Claims (23)
1、克隆DNA大片段的克隆运载体的构建方法、其特征是包括把DNA大片段以及一个分割位点插入到高拷贝质粒运载体内。
2、根据权利要求1的方法，其中所说的DNA大片段至少有60kb。
3、表达987P纤毛的克隆运载体构建方法，其特征是把一个分割位点引入到高拷贝质粒中。
4、根据权利要求3的方法，其中高拷贝质粒是pBR类型或pACYC类型。
5、根据权利要求4的方法，其中质粒是pBR322。
6、根据权利要求4的方法，其中质粒是pBR329。
7、根据权利要求4的方法，其中质粒是pACYC184。
8、构建能够表达987P纤毛的克隆运载体的方法其特征包括：
（ⅰ）把含有一分割位点的DNA片段插入到适当的质粒中，
（ⅱ）把含有表达987P纤毛基因的DNA片段插入到（ⅰ）的质粒中。
9、根据权利要求8的方法，其中分割位点是从F小型质粒pML31分离到的SOP位点。
10、克隆运载体可由权利要求1至9的任何一种方法得到。
11、本克隆运载体特征是已经插入含有一分割位点的DNA片段和含有987P纤毛蛋白编码基因的DNA片段。
12、克隆运载体是pBTA599。
13、重组合质粒是pBTA201和pBTA200。
14、根据权利要求10，微生物是经一种克隆运载体所转化过的。
15、根据权利要求14的微生物，其中所说的微物是大肠杆菌。
16、根据权利要求14或15的微生物，其中克隆运载体能够表达987P纤毛蛋白。
17、根据权利要求14至16中任一项的微生物，其中克隆运载体是pBTA201。
18、用于予防和治疗新生猪腹泻的菌苗的制备方法，其特征是将纯化的菌毛抗原连同987P菌毛一起与可供药用的载体稀释剂或佐剂混合而制得。
19、权利要求18所述的方法，其中所说的987P菌毛是由克隆运载体转化的大肠杆菌培养物中分离出来的。
20、权利要求19所述的方法，其中所说的大肠杆菌是由能表达987p菌毛蛋白的克隆运载体转化的。
21、权利要求20所述的方法，其中所说的克隆之载体是由权利要求1至9中任何一项所述方法制得的。
22、权利要求18所述的方法，其中所说的纯化的菌毛抗原可为K88ac，K88ab或K99。
23、权利要求20所述的方法，其中所说的菌毛蛋白总是采用DNA重组技术合成的。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPG8403 | 1984-12-04 | ||
| AUPG840384 | 1984-12-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN85109506A true CN85109506A (zh) | 1986-09-10 |
| CN1017451B CN1017451B (zh) | 1992-07-15 |
Family
ID=3770864
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN85109506A Expired CN1017451B (zh) | 1984-12-04 | 1985-12-04 | 菌苗的制备方法 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0242359B1 (zh) |
| JP (1) | JPS62501675A (zh) |
| KR (1) | KR870700021A (zh) |
| CN (1) | CN1017451B (zh) |
| AU (1) | AU596958B2 (zh) |
| DE (1) | DE3587473T2 (zh) |
| DK (1) | DK370186A (zh) |
| ES (1) | ES8705033A1 (zh) |
| FI (1) | FI863145A0 (zh) |
| HK (1) | HK70594A (zh) |
| NZ (1) | NZ214428A (zh) |
| SG (1) | SG87794G (zh) |
| WO (1) | WO1986003410A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA859297B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107693786A (zh) * | 2017-11-07 | 2018-02-16 | 聊城大学 | 特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU616662B2 (en) * | 1987-04-27 | 1991-11-07 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Peptide production by protein engineering |
| DE3871489D1 (de) * | 1987-10-26 | 1992-07-02 | Akzo Nv | Impfstoff gegen e.coli-blutvergiftung bei gefluegel. |
| HU221664B1 (hu) * | 1999-03-31 | 2002-12-28 | MTA Állatorvostudományi Kutatóintézete | Élő, szájon át adható Escherichia coli vakcina készítésére alkalmas törzs a sertések választási hasmenésének megelőzésére és a törzs előállítására alkalmas eljárás |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2094314A (en) * | 1981-02-05 | 1982-09-15 | Wellcome Found | Recombinant DNA |
| NZ199866A (en) * | 1981-03-09 | 1984-11-09 | Cetus Corp | Vaccine for prevention of gastroenteric disease:non-pathogenic strain genetically engineered to comprise genes for adhesin and/or toxoids |
| DK242883A (da) * | 1982-06-02 | 1983-12-03 | Cetus Corp | Fremgangsmaade til frembringelse af konstruerede rekombinant plasmider |
| DK410783D0 (da) * | 1982-09-16 | 1983-09-09 | Benzon A Salfred | Fremgangsmade til stabilisering af plasmider |
| JPH074257B2 (ja) * | 1983-06-17 | 1995-01-25 | 三菱油化株式会社 | 新規なプラスミド |
| EP0180192B1 (en) * | 1984-10-29 | 1992-02-05 | Research Association For Utilization Of Light Oil | Novel plasmids |
| JPH0694095A (ja) * | 1992-09-08 | 1994-04-05 | Mitsubishi Steel Mfg Co Ltd | 回転抵抗調整機構 |
-
1985
- 1985-12-03 ES ES549531A patent/ES8705033A1/es not_active Expired
- 1985-12-04 JP JP61500188A patent/JPS62501675A/ja active Pending
- 1985-12-04 DE DE86900017T patent/DE3587473T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-04 ZA ZA859297A patent/ZA859297B/xx unknown
- 1985-12-04 CN CN85109506A patent/CN1017451B/zh not_active Expired
- 1985-12-04 EP EP86900017A patent/EP0242359B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-04 AU AU52097/86A patent/AU596958B2/en not_active Expired
- 1985-12-04 WO PCT/AU1985/000306 patent/WO1986003410A1/en active IP Right Grant
- 1985-12-04 NZ NZ214428A patent/NZ214428A/xx unknown
- 1985-12-04 KR KR860700521A patent/KR870700021A/ko not_active Application Discontinuation
-
1986
- 1986-08-01 FI FI863145A patent/FI863145A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1986-08-04 DK DK370186A patent/DK370186A/da not_active Application Discontinuation
-
1994
- 1994-06-30 SG SG87794A patent/SG87794G/en unknown
- 1994-07-21 HK HK70594A patent/HK70594A/xx unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107693786A (zh) * | 2017-11-07 | 2018-02-16 | 聊城大学 | 特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗 |
| CN107693786B (zh) * | 2017-11-07 | 2021-06-29 | 聊城大学 | 特异性防治驴驹大肠杆菌性腹泻的复合疫苗 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA859297B (en) | 1986-08-27 |
| DE3587473D1 (zh) | 1993-08-26 |
| SG87794G (en) | 1994-10-14 |
| JPS62501675A (ja) | 1987-07-09 |
| AU596958B2 (en) | 1990-05-24 |
| ES549531A0 (es) | 1987-04-16 |
| EP0242359A1 (en) | 1987-10-28 |
| CN1017451B (zh) | 1992-07-15 |
| FI863145A (fi) | 1986-08-01 |
| EP0242359A4 (en) | 1989-02-23 |
| DK370186D0 (da) | 1986-08-04 |
| ES8705033A1 (es) | 1987-04-16 |
| HK70594A (en) | 1994-07-29 |
| NZ214428A (en) | 1989-04-26 |
| EP0242359B1 (en) | 1993-07-21 |
| WO1986003410A1 (en) | 1986-06-19 |
| DE3587473T2 (de) | 1993-11-04 |
| KR870700021A (ko) | 1987-02-28 |
| AU5209786A (en) | 1986-07-01 |
| FI863145A0 (fi) | 1986-08-01 |
| DK370186A (da) | 1987-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3920300B2 (ja) | ローソニア・イントラセルラリスの培養、抗−ローソニア・イントラセルラリスワクチン及び診断薬 | |
| CN1211488C (zh) | 改构的植物病毒作为异源肽的载体 | |
| EP2271663B1 (en) | Novel avian astrovirus | |
| KR20060054352A (ko) | 유럽 기원의 로소니아 인트라셀룰라리스, 및 이의 백신,진단제 및 사용 방법 | |
| EP0020743A1 (en) | Canine parvovirus vaccine | |
| CN107338208B (zh) | 一种猪萎缩性鼻炎d型产毒多杀巴斯德氏菌疫苗株及其应用 | |
| CN110201153B (zh) | 一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN114507272A (zh) | 牛赤羽病病毒疫苗 | |
| KR940004541B1 (ko) | 트레포네마 히오디센테리아 박테린의 제조방법 | |
| CN85109506A (zh) | 菌苗的制备方法 | |
| CN103275228A (zh) | K99-987p-f41重组蛋白及其应用 | |
| CN105543120B (zh) | 一种副猪嗜血杆菌五价灭活疫苗 | |
| CN114752532B (zh) | 一株能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株及其应用 | |
| CN103602637A (zh) | 猪支原体肺炎疫苗株 | |
| CN106834168A (zh) | 一种猪链球菌2型弱毒株及其应用 | |
| CN113957007B (zh) | 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗 | |
| CN1297657C (zh) | 绿脓杆菌甘露糖敏感血凝菌毛株 | |
| JP5820564B2 (ja) | プラスミドｄｎａ調製物およびそれらの作製方法 | |
| CN111961121B (zh) | 产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗 | |
| CN1519311B (zh) | 胞内劳森氏菌培养、抗该菌的疫苗和诊断试剂 | |
| CN109608541B (zh) | 一种抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体及其制备方法 | |
| CN1195062C (zh) | 非抗生素抗性穿梭质粒表达载体及其构建方法和应用 | |
| CN106148376A (zh) | 一种K88ac+产肠毒素大肠杆菌致弱株构建方法与应用 | |
| KR101210082B1 (ko) | 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물 및 그 제조방법 | |
| CN113736811B (zh) | 促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C13 | Decision | ||
| GR02 | Examined patent application | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |