CN113736811B - 促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进tsh s 、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用，该质粒DNA序列中包括温度敏感血凝素tsh基因、胞膜脂蛋白bor基因和囊泡蛋白yncE基因，其中，tsh基因由温度敏感血凝素转运蛋白tsh β 基因和温度敏感血凝素效应蛋白tsh s 基因组成。该质粒的构建包括目的基因的克隆、yncE基因连接pETDuet‑1质粒、tsh基因和bor基因连接pETDuet‑1质粒及yncE2基因连接pETDuet‑1/tsh/bor质粒等步骤。本发明将上述质粒转化入表达菌株细胞，使目的蛋白共表达，用于制备基因工程菌疫苗的引物特异性强、灵敏度高。本发明的方法能够促进tsh s 、yncE基因胞外表达高效表达有活性蛋白，所制得疫苗防治效果突出。

Description

促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程菌疫苗技术领域，涉及一种促进多基因共表达的质粒，具体地说 是促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用。
背景技术
禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Eschirechia coli，APEC)具有专一的 毒力因子，可引起鸡、火鸡及其他禽类急性全身性肠外感染，其引起的禽大肠杆菌病 (AvianColibacillosis，AC)临床上以心包炎、肝周炎、气囊炎、蜂窝组织炎为典 型症状的大肠杆菌败血症和输卵管炎、腹膜炎、雏鸡脐炎肿头综合征等较为常见，是 目前导致世界养禽业特别是肉鸡业经济损失最为严重的细菌性传染病。
APEC有多种不同的毒力基因，其中，温度敏感血凝素(tsh)基因中包含有温度 敏感血凝素转运蛋白(tshβ)基因和温度敏感血凝素效应蛋白(tshs)基因两部分功 能基团，位于ColⅤ质粒上，与雏鸡的早期AC感染有关。tshs基因是双功能蛋白编码 基因，所编码的效应蛋白Tshs兼具粘附和蛋白水解功能，使得tsh基因可作为APEC 菌株的特定遗传标志。
现有技术中，禽大肠杆菌病仍然主要通过消除易感因素或药物防控，但随着耐药菌株及药物残留问题的增加，禽产品质量安全愈来愈受到人们重视，因此，仍需要研 发非抗生素途径特别是通过接种疫苗方式防控禽大肠杆菌病。然而，由于大肠杆菌血 清型众多且不同血清型甚至同血清型的不同菌株之间也缺乏交叉免疫，给利用疫苗防 治本病带来极大挑战，限制大肠杆菌病疫苗广泛使用。同时，大肠杆菌单独表达tsh 基因呈包涵体表达的现象，该种蛋白不具备蛋白活性无法实现后续的疫苗制备，tsh 基因所表达的Tsh效应蛋白作为一种自转运分泌蛋白，在工程菌中却很难实现其自转 运分泌功能，影响基因工程菌疫苗的制备。
发明内容
本发明的一个目的，是提供一种促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒，通过选 择特定基因，利用蛋白间相互作用的原理，解决Tsh效应蛋白和YncE蛋白胞外分泌 与活性问题，构建促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒，实现可用于制备禽大肠杆 菌病基因工程菌疫苗的目的；
本发明的另一个目的，是提供上述质粒的构建方法，通过目的基因克隆、转化、 筛选yncE2基因与tsh基因和bor基因序列方向相反这种特定连接方式的阳性克隆等 步骤，达到成功构建促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒的目的。
本发明还有一个目的，是提供上述质粒用于制备禽大肠杆菌病基因工程菌疫苗的应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒，其DNA序列中包括温度敏感血凝素 tsh基因、胞膜脂蛋白bor基因和囊泡蛋白yncE基因，其中，tsh基因由温度敏感血 凝素转运蛋白tshβ基因和温度敏感血凝素效应蛋白tshs基因组成。
本发明还提供了一种促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒的构建方法，它按照 如下的步骤依次进行：
S1.目的基因的克隆
以禽致病性大肠杆菌基因为模板，利用引物分别扩增tsh基因、bor基因和yncE 基因，其中，引物序列如下：
tsh基因上游引物：5’-CCGGAATTCGATGAACAGAATTTATTCTCTTCGC-3’，
tsh基因下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGAATGAATAACGAATATTAGCGT-3’；
bor基因上游引物：5’-GGAAGATCTTAGGATTCTGCCGTTTTTA-3’，
bor基因下游引物：5’-CCGCTCGAGCATATCGATGGGCAACTA-3’；
yncE基因上游引物：5’-CGGGATCCGATGCATTTACGTCATCTGTTTT-3’，
yncE基因下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTACAGCGCAATACGAATCAC-3’；
S2.yncE基因连接pETDuet-1质粒
将S1扩增所得的yncE基因连接至克隆载体，经转化，筛选阳性克隆，酶切回收 带有酶切位点的yncE基因并连接入pETDuet-1质粒，经转化，筛选阳性克隆，提取 pETDuet-1/yncE质粒作模板，利用引物扩增yncE2基因；
其中，yncE2基因上游引物序列：5’-ACATGCATGCATGCGTCCGGCGTAGAGG-3’，
yncE2基因下游引物序列：5’-ACATGCATGCACCCCTCAAGACCCGTTTAG-3’；
S3.tsh基因和bor基因连接pETDuet-1质粒
将S1扩增所得的tsh基因和bor基因分别连接至克隆载体，经转化，筛选阳性 克隆，分别酶切回收带有酶切位点的tsh基因和bor基因并依次连接入pETDuet-1质 粒，经转化，筛选阳性克隆，提取pETDuet-1/tsh/bor质粒；
S4.yncE2基因连接pETDuet-1/tsh/bor质粒
将S1扩增所得的yncE2基因连接至克隆载体，经转化，筛选阳性克隆，酶切回 收带有酶切位点的yncE2基因并连接入pETDuet-1/tsh/bor质粒，经转化，筛选yncE2 基因与tsh基因和bor基因序列方向相反的克隆，提取pETDuet-1/tsh/bor/yncE2质 粒，即为促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒。
作为一种限定，所述表达细胞为BL21(DE3)感受态细胞。
作为另一种限定，所述扩增tsh基因的方法为：
S11).将O78血清型的禽致病性大肠杆菌菌株接种，培养，挑取单个菌落接种， 振荡培养，提取质粒，作模板备用；
S12).按以下程序PCR扩增：T1：94℃、4min；T2：94℃、40s；T3：52℃、40s； T4：68℃、4min；T2-T4：25-35个循环；T5：72℃、10min；
PCR体系为：模板5.0μL、2×HIFI Mix 30μL、10μmM tsh基因上游引物和下 游引物各3μL、ddH2O 19μL；
所述扩增bor基因的方法为：
S13).将O78血清型的禽致病性大肠杆菌菌株接种，培养，挑取单个菌落接种， 振荡培养，煮沸裂解菌液，作模板备用；
S14).按以下程序PCR扩增：T1：95℃、5min；T2：94℃、40s； T3：53.7℃、30s；T4：68℃、1min；T2-T4：25-35个循环；T5：72℃、10min；
PCR体系为：模板2.5μL、2×HIFI Mix 25μL、10μmM bor基因上游引物和下 游引物各2.5μL、ddH2O17.5μL；
所述扩增yncE基因的方法为：
S15).将O1/O2/O65血清型的多凝禽致病性大肠杆菌菌株接种，培养，挑取单个 菌落接种，振荡培养，煮沸裂解菌液，作模板备用；
S16).按以下程序PCR扩增：T1：94℃、10min；T2：94℃、30s； T3：56℃、30s；T4：72℃、1min；T2-T4：25-35个循环；T5：72℃、10min；
PCR体系为：模板5.0μL、2×HIFI Mix 30μL、10μmM yncE基因上游引物和 下游引物各3μL、ddH2O19μL。
作为第三种限定，所述扩增yncE2基因的PCR程序为：T1：94℃、10min；T2：9 4℃、30s；T3：56℃、30s；T4：68℃、1.5min；T2-T4：25-35个循环；T5：72℃、 10min；
PCR体系为：模板2.0μL、2×HIFI Mix 25μL、10μmM yncE2基因上游引物和 下游引物各2μL、ddH2O19μL。
作为第四种限定，步骤S2中，将S1扩增所得的yncE基因连接至pEASY克隆载 体后转化至Trans1-T1感受态细胞；
将S1扩增所得的bor基因连接至pGEM-T克隆载体后转化至DH5α感受态细胞。
作为第五种限定，步骤S3中，将S1扩增所得的tsh基因连接至pGEM-T克隆载 体后转化至Trans2-Blue感受态细胞；
将S1扩增所得的bor基因连接至pGEM-T克隆载体后转化至DH5α感受态细胞。
作为第六种限定，步骤S4中，将S1扩增所得的yncE2基因连接至pTOPO克隆载体后转化至DH5α感受态细胞。
本发明还提供了促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒的一种应用，它是将pETDuet-1/tsh/bor/yncE2质粒转化入表达菌株细胞，使目的蛋白共表达，用于制备 基因工程菌疫苗。
作为第一种限定，所述表达菌株细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；
所述使目的蛋白共表达的方法为：将转化后的表达菌株细胞培养至对数期，加入终浓度0.5-1.5mM的IPTG或乳糖，于25-37℃温度下，诱导4.5-20h，诱导目的基因共 表达目的蛋白，目的蛋白作为疫苗的主要成分用于基因工程菌疫苗生产，防治禽大肠 杆菌病。
yncE2是对yncE基因添加启动子，RBS等相关DNA序列之后的yncE基因序列，是 为了实现多基因共表达质粒的构建。本发明质粒构建过程中，连接多基因的先后顺序 及三个基因之间顺序的正反，及所增加序列所包含的元件主要是基于下述原因：
①、大肠杆菌表达系统表达的外源蛋白多为包涵体形式，胞外分泌性蛋白很难在大肠杆菌表达系统中实现，且不同基因组合之间在同一质粒的连接顺序，转录反应方 向等都影响外源蛋白的分泌表达。本发明中实现tshs、yncE两个外源基因的分泌表 达，源于基因的选择组合，质粒和外源基因的关系，以及不同外源基因之间转录顺序 的探索，从而实现外源基因的分泌表达；
②、根据①中原因，本发明最终所选择的三个基因，其中一个来源于禽致病性大肠杆菌的质粒基因，即tsh基因；另外两个来源于禽致病性大肠杆菌的基因组DNA基 因，即yncE和bor基因；通过研究发现，约60％的禽致病性大肠杆菌含有tsh基因， 100％的禽致病性大肠杆含有bor基因，100％的禽致病性大肠杆菌含有yncE基因，其 中Tsh蛋白为一种自转运蛋白，通过某些基因的协助，可以将效应蛋白分泌至细菌细 胞外面，YncE为囊泡蛋白，有促进胞内蛋白外分泌表达的功能，同时具有较好的免 疫原性，Bor蛋白为一种胞膜脂蛋白蛋白，为细胞膜蛋白，有助于提高Tsh蛋白和YncE 蛋白的免疫作用。
③、根据①②中所述，扩增后tsh基因较长(4135bp)，pETDuet-1载体大小为5420bp，两者大小比较接近，连接难度较大，且tsh基因中含有的酶切位点较多，导 致载体上的多克隆位点中许多酶切位点不能使用，从而增加了克隆和表达载体的选择 难度，所以经过实验比对，优先连接tsh基因；反之如果先连接bor(346bp)基因， 后连接tsh基因，则会使得连接概率大大降低，甚至无法顺利连接上；同时由于连接 yncE基因的时候需要在yncE基因的前后两端引入T7启动子序列，T7终止子序列， RBS序列，乳糖操纵子，-10区序列和-35区序列，从而对pETDuet-1质粒载体进行 了相应改造，改造后的pETDuet-1质粒包含了两套相同的多克隆位点和酶切位点，所 以只能先将tsh基因和bor基因连接至pETDuet-1质粒，然后将质粒元件和yncE基 因连接至含tsh和bor基因的pETDuet-1质粒，共同组成新质粒 pETDuet-1/tsh/bor/yncE2。由于改造的新质粒中外源基因总大小远大于pETDuet-1 质粒的大小，所以pKX2020质粒的性质与原pETDuet-1质粒完全不同。
④、根据①②③中描述，挑取不同阳性克隆，进行酶切鉴定，确定tsh基因，bor 基因的转录方向与yncE基因转录方向相同和相反的两种菌落，进行诱导表达，得到 tsh基因和bor基因与yncE基因转录方向相反的克隆具更高的蛋白表达量和分泌量。
本发明所制备的pETDuet-1/tsh/bor/yncE2质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞后作为生物材料，命名为BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/bor/yncE，该菌株分类命名为大 肠埃希氏菌(Escherichia coli)已于2021年5月26日，在位于北京市朝阳区北辰西路1号 院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号：CGMCC No.22610，经保藏单位检测该生物材料状态为存活。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明提供的促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用，具有 如下优点：
(1)PCR扩增tsh、bor、yncE多基因过程中，所用的引物特异性强，能准确扩 增出目的片段；
(2)tsh和bor双基因与pETDuet-1质粒连接的过程简便，克隆载体和表达载体 选择合适，连接的成功率高；
(3)yncE基因与pETDuet-1/tsh/bor质粒连接后实现Tsh蛋白胞外分泌表达， 解决基因工程表达蛋白活性无法用于疫苗制备的问题，且表达效果好；
(4)本发明的应用方法简便，过程易于控制，所转化细胞可共表达tsh、bor、 yncE多基因，表达成功率高。
综上所述，本发明的质粒适于促进tshs、yncE基因胞外表达，本发明的构建方法适于工业生产，本发明的质粒可用于基因工程菌疫苗的制备，用于防治禽大肠杆菌病。
下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明。
附图说明
图1为实施例1中pETDuet-1质粒图谱及tsh基因，bor基因，yncE基因之间位 置示意图；
图2为实施例1中以APEC质粒为模板tsh基因的扩增结果，图中：M为DNA分 子质量标准,其它的条带为tsh基因条带；
图3为实施例1中胶回收试剂盒回收的tsh基因检测结果，图中：M为DNA分子 质量标准；其它条带为tsh基因条带；
图4为实施例1中pETDuet-1质粒提取结果，图中：M为DNA分子质量标准；泳 道1和2分别为不同平板的两个菌落；
图5为实施例1中菌落PCR检测48个Trans2-Blue/pGEM-T/tsh菌落结果，图 中：M为DNA分子质量标准；图中1-48号泳道分别为同一个平板培养基中培养的Tr ans2-Blue/pGEM-T/tsh单菌落为模板，通过菌落PCR扩增的结果；
图6为实施例1中利用1.0％琼脂糖凝胶电泳对图5中5、18和20号菌落培养物 提取的质粒进行检测的结果图，图中：M为DNA分子质量标准；5号泳道为图5中5 号菌落的质粒、18号泳道为图5中18号菌落的质粒、20号泳道为图5中20号菌落 的质粒；
图7为实施例1中利用1.5％琼脂糖凝胶电泳对图6中5、18和20号质粒的酶切 结果进行检测的结果图，图中：M为DNA分子质量标准；5s、18s和20s泳道分别为 图6中5、18和20号质粒经EcoRⅠ和HindⅢ内切酶双酶切产物，5d、18d和20d泳 道分别为图6中5、18和20号质粒经EcoRⅠ内切酶单酶切产物；
图8为实施例1中图6中5、20号质粒酶切后切胶回收的tsh基因以及pETDuet-1 质粒切胶回收产物电泳检测结果图，图中：M为DNA分子质量标准；5和20号泳道分 别为图6中5和20号pGEM-T/tsh质粒酶切后切胶回收到的tsh基因，pET条带为 pETDuet-1质粒；
图9为实施例1中菌落PCR检测48个Trans2-Blue/pETDuet-1/tsh菌落的结果， 图中：M为DNA分子质量标准；1-48号泳道分为同一个平板培养基中挑取的48个Tr ans2-Blue/pETDuet-1/tsh单菌落的PCR鉴定结果；
图10为实施例1中利用1.0％琼脂糖凝胶电泳对图9中的1-5和25-29号Trans 2-Blue/pETDuet-1/tsh菌的质粒进行检测的结果图，图中：M为DNA分子质量标准， 1-5号泳道分别为图9中1-5号菌落培养后提取的质粒电泳检测结果，25-29号泳道 分别为图9中25-29号菌落培养后提取的质粒电泳检测结果；
图11为实施例1中利用1.0％琼脂糖凝胶电泳对图10中27号质粒的酶切结果进 行检测的结果图，图中：M为DNA分子质量标准；27号泳道为27号质粒经EcoRⅠ和 HindⅢ内切酶酶切产物；
图12为实施例1中利用1.0％琼脂糖凝胶电泳对bor基因的扩增结果进行检测的结果图，图中：M为DNA分子质量标准，泳道1-8分别为以致病性禽大肠杆菌的质粒 为模板，以46.8℃、50.3℃、53.7℃、57.2℃、60.3℃、63.2℃、65.4℃、67℃为 退火温度扩增的346bp的bor基因，泳道9为以本公司实验室保存的345bp大小的 bor基因为模板扩增的346bp的bor基因；
图13为实施例1中胶回收试剂盒切胶回收的346bp的bor基因图，图中：M为 DNA分子质量标准；bor泳道为346bp的bor基因切胶回收的产物；
图14为实施例1中菌落PCR检测由同一平板培养基上培养的10个DH5α /pGEM-T/bor菌落的电泳结果，图中：M为DNA分子质量标准，1-10泳道分别为10 个bor基因连接pGEM-T载体后转化DH5α菌，挑取的10个单菌落为模板，通过菌落 PCR的检测结果；
图15为实施例1中图14中1、6、8、9号菌落培养物提取的质粒电泳检测结果 图，图中：M为DNA分子质量标准，1、6、8、9泳道分别为图14中1、6、8、9号菌 落的质粒电泳结果；
图16为实施例1中1.0％琼脂糖凝胶电泳检测胶回收试剂盒对图15中四个质粒 酶切后的bor基因回收的图谱，图中：M为DNA分子质量标准；bor泳道为图15中质 粒酶切后经胶回收试剂盒回收后的产物检测结果；
图17为实施例1中菌落PCR检测由同一平板培养基上培养的10个DH5α /pETDuet-1/tsh/bor菌落的电泳检测结果图，图中：M为DNA分子质量标准，D1-D10 泳道分别为bor基因连接pETDuet-1/tsh载体，转化DH5α后挑取的10个单菌落为 模板，菌落PCR检测bor基因的结果；
图18为实施例1中利用0.8％琼脂糖凝胶电泳对图17中D1、D6、D7、D8、D9、 D10号菌落培养后提取的质粒进行检测的结果图，图中：M为DNA分子质量标准，D1、 D6、D7、D8、D9、D10泳道分别为图17中D1、D6、D7、D8、D9、D10号菌的质粒；
图19为实施例1中利用1.0％琼脂糖凝胶电泳对图18中D1、D6、D7、D8号质粒 的酶切结果进行检测的结果图，图中：M1和M2为DNA分子质量标准，D1、D6、D7、 D8泳道为图18中D1、D6、D7、D8号质粒经EcoRⅠ内切酶、HindⅢ内切酶、BglⅡ内 切酶、XhoⅠ内切酶酶切后电泳检测结果；
图20为实施例1中利用1.0％琼脂糖凝胶电泳对yncE基因的扩增结果进行检测 的结果图，图中：M为DNA分子质量标准，泳道17分别为以不同致病性禽大肠杆菌 菌株为模板扩增的1083bp的yncE基因，泳道8为阴性对照；
图21为实施例1中pEASY-yncE克隆菌落PCR结果，图中：M为DNA分子质量标 准；泳道1-10为目的基因扩增，其中泳道2、3、6、10菌落有目的条带，其余菌落 为载体自连结果；
图22为实施例1中pEASY-yncE质粒酶切结果，图中：M为DNA分子质量标准， 泳道1、3、5、7为构建质粒，2、4、6、8为前一泳道质粒酶切结果；
图23为实施例1中pETDuet-1/yncE克隆菌落PCR结果，图中：M为DNA分子质 量标准，1-10泳道为对应扩增结果均有1583bp特异性条带；
图24为实施例1中pETDuet-1/yncE质粒酶切结果，图中：M为DNA分子质量标 准；泳道1、3、5、7为构建质粒，2、4、6、8为前一泳道质粒酶切结果，泳道9为 pETDuet-1质粒，泳道10为pETDuet-1质粒酶切结果；
图25为实施例1中pTOPO-yncE2克隆菌落PCR结果，图中：M为DNA分子质量 标准，泳道1-9分别为单克隆PCR鉴定结果，泳道10为阴性对照；
图26为实施例1中pTOPO-yncE2质粒酶切结果，图中：M为DNA分子质量标准， 泳道1为pTOPO-yncE2质粒，泳道2为pTOPO-yncE2质粒酶切结果；
图27为实施例1中DH5α/pETDuet-1/tsh/bor/yncE菌落PCR结果，图中：M 为DNA分子质量标准，泳道1-16为单菌落PCR扩增结果，其中1，3，4，8，9，11， 13和15号菌株为阳性菌株，泳道H2O为阴性对照；
图28为实施例1中图27中3号、4号菌提取pETDuet-1/tsh/bor/yncE质粒Sph Ⅰ酶切结果，图中：M为DNA分子质量标准，泳道1、3分别为图27中3、4号质粒， 泳道2、4为前一泳道质粒酶切结果；
图29为实施例1中图27中3号、4号pETDuet-1/tsh/bor/yncE质粒经限制性 内切酶NotⅠ、BamHⅠ酶切后的检测结果，图中：M为DNA分子质量标准，泳道1、2 分别为pETDuet-1/yncE2/tsh/bor质粒及酶切结果，泳道3、5分别为图27中3、4 号质粒，泳道4、6为前一泳道质粒酶切结果；
图30为实施例1中3号BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/bor/yncE菌株37℃诱导表 达后电泳检测结果，图中：M为蛋白分子质量标准，泳道1-3分别为为诱导前上清、 诱导4.5h上清、诱导20h上清，泳道4-6分别为诱导前菌体沉淀、诱导4.5h菌体沉 淀、诱导20h菌体沉淀；
图31为实施例1中4号BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/bor/yncE菌株37℃诱导表 达后电泳检测结果，图中：M为蛋白分子质量标准，泳道1-3分别为为诱导前上清、 诱导4.5h上清、诱导20h上清，泳道4-6分别为诱导前菌体沉淀、诱导4.5h菌体沉 淀、诱导20h菌体沉淀；
图32为实施例1中BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/bor/yncE，图中：M为蛋白分 子质量标准，0h为诱导前上清和菌体，2h～8h分别为诱导后2h、4h、6h、8h样品的 离心上清和菌体稀释2倍后蛋白样品；
图33为实施例1中BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/bor/yncE发酵过程中蛋白样品 检测结果，图中：M为蛋白分子质量标准，0h为诱导前上清和菌体，2h～10h下方， 分别为诱导后2h、4h、6h、8h和10h时样品的离心上清和菌体稀释2倍后蛋白样品；
图34为实施例1中BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/bor/yncE发酵过程中蛋白样品 检测结果，图中：M为蛋白分子质量标准，泳道1-3分别为为诱导前上清、诱导5h 上清、诱导10h上清，泳道4～6分别为诱导前菌体沉淀、诱导5h菌体沉淀、诱导 10h菌体沉淀；
图35为实施例8中免疫前后各组鸡抗体水平检测结果。
图36为实施例9中不同菌株诱导后离心上清的目的蛋白电泳检测图。
具体实施方式
下述实施例中所用试剂如无特殊说明，均为现有的本领域技术人员通用的试剂；所用的试验方法，如无特殊说明，均为现有的试验方法。
下述实施例中：快速质粒小提试剂盒(StarPrep Plasmid Miniprep Kit200rxn)， 购自北京康润诚业生物科技有限公司；
快速胶回收试剂盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit 200rxn)，购自北京全式金生物技术有限公司；
pGEM-T载体购自Promega公司；
pETDuet-1载体购自Novagen公司；
pTOPO-T载体购自GenStar公司。
Trans2-Blue感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。
Trans1-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。
DH5α购自GenStar公司。
BL21(DE3)购自GenStar公司。
实施例1一种促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒的构建方法
本实施例按照如下的步骤顺序进行：
S1.目的基因的克隆
1、目的基因tsh、bor基因的克隆
以禽致病性大肠杆菌质粒和裂解菌液为模板，利用PCR分别对温度敏感血凝素tsh基因和胞膜脂蛋白bor基因进行扩增，在PCR扩增过程中，tsh基因的引物序列 和bor基因的引物序列根据NCBI数据库中公布的tsh(NCBI查询号NC_007675.1) 和bor基因(NCBI查询号AF042279.1)设计。
Ⅰ、tsh基因和bor基因引物序列的设计
根据NCBI数据库中公布的tsh(NCBI查询号NC_007675.1)和bor基因(NCBI 查询号KX912686.1)设计，具体如下：
tsh基因的引物序列如下：
上游引物：5’-CCGGAATTCGATGAACAGAATTTATTCTCTTCGC-3’，
下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGAATGAATAACGAATATTAGCGT-3’；
bor基因的引物序列如下：
上游引物：5’-GGAAGATCTTAGGATTCTGCCGTTTTTA-3’，
下游引物：5’-CCGCTCGAGCATATCGATGGGCAACTA-3’；
Ⅱ、目的基因的获得
将O78血清型的禽致病性大肠杆菌(APEC)菌株(含有tsh和bor基因)划线接种 于伊红美兰琼脂平板，37℃培养16h后，挑取单个菌落接种于5mL LB液体培养基中， 37℃200rpm振荡培养16h后提取质粒，同时菌液煮沸裂解；质粒的提取和菌液裂解 按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法提取质粒和基因组DNA作为基因获 取的模板；
以提取的APEC菌株的质粒和基因组为模板，按照如下PCR体系和程序分别先后 扩增tsh基因和bor基因：
PCR扩增tsh基因的反应体系：模板5.0μL、2×HIFI Mix 30μL、10μmM上游 引物和下游引物各3μL、ddH2O 19μL；
PCR扩增tsh基因的程序为：T1(预变性)：94℃、4min；T2(变性)：94℃、 40s；T3(退火)：52℃、40s；T4(延伸)：68℃、4min；T2-T4：30个循环；T5(延 伸)：72℃、10min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存；
PCR扩增bor基因的体系为：模板2.5μL、2×HIFI Mix 25μL、10μmM上游引 物和下游引物各2.5μL、ddH2O17.5μL；
PCR扩增bor基因的程序为：T1(预变性)：95℃、5min；T2(变性)：94℃、 40s；T3(退火)：37.5℃、30s；T4(延伸)：68℃、1min；T2-T4：30个循环；T5 (延伸)：72℃、10min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存。
PCR扩增的产物分别经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收试剂盒回收tsh和bor基因，具体结果见图2、图3、图12(图12对bor基因PCR扩增过程中不同的退火 温度进行了探索，综合各种因素及结果选定37.5℃为最佳的退火温度)和图13，由 图2、图3、图12和图13可知，tsh和bor基因条带适合于切胶回收，大小符合预 期。
tsh基因经扩增后的产物序列经由华大基因公司测序后，结果如下： GATGAACAGAATTTATTCTCTTCGCTACAGCGCTGTGGCCCGGGGCTTTATTGCCGTATCTGAGTTTGCTAGGAAATGTGTTCATAAGTCTGTCAGACGT CTGTGTTTCCCGGTTTTATTACTGATCCCGGTACTATTCTCTGCAGGAAGTCTTGCGGGAACGGTCAATAATGAACTCGGGTATCAGTTATTTCGTGATT TTGCTGAAAATAAGGGGATGTTCCGCCCGGGGGCAACGAATATCGCTATTTATAATAAGCAGGGAGAATTTGTCAGTACGCTGGATAAGGCAGCTATGCC TGATTTCAGTGCTGTGGATTCGGAAATCGGTGTGGCGACACTGATAAACCCGCAGTATATCGCCAGCGTGAAACATAACGGGGGATATACAAACGTTAGC TTTGGTGATGGTGAAAACCGTTACAATATCGTGGACCGGAATAATGCGCCGTCACTGGATTTTCATGCCCCCCGGCTGGATAAACTGGTGACAGAGGTTG CCCCTACTGCGGTGACGGCGCAGGGGGCAGTGGCTGGCGCATATCTGGATAAGGAGCGCTATCCTGTTTTTTATCGTCTGGGGTCTGGTACTCAGTATAT TAAGGACAGTAACGGACAGCTGACAAAAATGGGAGGTGCATATTCCTGGCTGACCGGCGGGACTGTCGGTAGCCTGTCATCCTATCAGAATGGAGAAATG ATTAGCACCAGTTCAGGTCTGGTTTTTGATTACAAACTTAATGGTGCAATGCCCATTTATGGCGAGGCCGGTGACAGCGGTTCGCCTTTATTTGCTTTTG ATACTGTTCAGAATAAATGGGTGCTGGTCGGTGTTCTTACTGCGGGGAATGGCGCGGGGGGCAGGGGAAATAACTGGGCTGTTATTCCACTGGATTTTAT CGGGCAGAAATTTAATGAAGACAACGATGCCCCGGTCACGTTCAGAACATCGGAAGGTGGTGCACTGGAGTGGAGCTTTAACAGCAGTACCGGAGCTGGT GCGCTGACACAGGGAACCACCACATATGCCATGCACGGGCAGCAGGGAAATGACCTGAATGCTGGTAAGAACCTGATATTTCAGGGGCAGAATGGTCAGA TTAACCTTAAGGATTCGGTTTCTCAGGGGGCGGGTTCCCTGACGTTCCGTGATAATTACACAGTAACAACCTCTAACGGAAGTACCTGGACCGGTGCCGG TATTGTTGTGGACAACGGGGTGTCCGTAAACTGGCAGGTTAATGGTGTTAAGGGCGATAACCTGCATAAAATTGGTGAAGGTACGCTGACGGTACAGGGT ACAGGTATTAATGAAGGTGGCCTGAAGGTCGGGGACGGAAAGGCTGTACTGAACCAGCAGGCGGACAATAAAGGACAGGTGCAGGCGTTCAGCAGTGTTA ATATTGCCAGTGGCCGGCCGACCGTGGTACTGACTGATGAGCGGCAGGTAAATCCGGATACCGTCTCATGGGGATATCGTGGGGGCACACTGGATGTTAA TGGTAACAGTCTGACGCTTCATCAGTTGAAGGCGGCAGATTATGGTGCCGTGCTGGCGAATAACGTTGATAAACGGGCCACTATCACGCTGGACTATGCC CTGCGGGCTGACAAAGTAGCACTGAATGGCTGGTCGGAATCAGGTAAAGGAACTGCCGGAAATTTATATAAATACAATAACCCGTACACAAATACGACGG ATTACTTCATCCTGAAGCAGAGCACCTATGGTTATTTCCCCACGGACCAGAGCAGCAACGCCACCTGGGAGTTTGTGGGGCACAGTCAGGGGGATGCACA GAAACTGGTAGCTGACCGTTTCAATACTGCAGGGTATCTGTTTCACGGACAACTGAAAGGCAATCTGAATGTGGACAATCGCCTGCCTGAAGGCGTTACC AGTGCTCTGGTGATGGACGGAGCTGCGGATATCTCCGGTACATTCACCCAGGAAAACGGGCGTCTGACGCTGCAGGGGCATCCGGTTATCCATGCATACA ATACTCAGTCTGTGGCTGTCAAACTGGCTGCCAGTGGAGACCATTCGGTTCTGACTCAGCCTACGTCATTCAGTCAGGAGGACTGGGAGAACCGCAGTTT TACCTTTGACAGGCTGTCACTGAAGAACACTGATTTTGGTCTTGGTCGCAATGCCACACTGAACACAACCATCCAGGCAGATAACTCCAGCGTCACGCTG GGCGACAGCCGGGTATTTATCGACAAAAACGATGGCCAGGGAACAGCCTTTACCCTTGAAGAAGGCACATCTGTTGCAACTAAAGATGCAGATAAAAGTG TCTTCAACGGCACCGTCAACCTGGATAATCAGTCAGTGCTGAATATCAATGATATATTCAATGGCGGAATACAGGCGAACAACAGTACCGTGAATATCTC CTCAGACAGTGCCGTTCTGGGGAACTCAACACTGACCAGTACCGCCCTGAATCTGAACAAGGGAGCAAATGCTCTGGCCAGTCAGAGTTTTGTTTCTGAC GGTCCAGTGAATATTTCTGATGCCACCCTGAGTCTGAACAGCCGTCCTGATGAGGTATCTCACACACTTTTACCTGTATACGATTATGCCGGTTCATGGA ACCTGAAGGGAGACGATGCCCGCCTGAACGTGGGGCCGTACAGTATGTTGTCAGGTAATATCAATGTTCAGGATAAAGGGACTGTCACCCTCGGAGGGGA AGGGGAACTGAGTCCTGACCTGACTCTTCAGAATCAGATGTTGTACAGCCTGTTTAACGGGTACCGCAATATCTGGAGCGGGAGCCTGAATGCACCGGAT GCCACCGTCAGCATGACAGACACCCAGTGGTCGATGAACGGAAACTCCACGGCAGGAAATATGAAACTTAACCGGACAATAGTCGGTTTTAACGGGGGAA CATCACCGTTCACGACACTGACAACAGATAATCTGGACGCGGTTCAGTCAGCATTTGTCATGCGTACAGACCTTAACAAGGCAGACAAACTGGTGATAAA CAAGTCGGCAACAGGTCATGACAACAGCATCTGGGTTAACTTCCTGAAAAAACCTTCTAACAAGGACACGCTTGATATTCCACTGGTCAGCGCACCTGAA GCGACAGCTGATAATCTGTTCAGGGCATCAACACGGGTTGTGGGATTCAGTGATGTCACCCCCATCCTTAGTGTCAGAAAAGAGGACGGGAAAAAAGAGT GGGTCCTCGATGGTTACCAGGTTGCACGTAACGACGGCCAGGGTAAGGCTGCCGCCACATTCATGCACATCAGCTATAACAACTTCATCACTGAAGTTAA CAACCTGAACAAACGCATGGGCGATTTGAGGGATATTAATGGCGAAGCCGGTACGTGGGTGCGTCTGCTGAACGGTTCCGGCTCTGCTGATGGCGGTTTC ACTGACCACTATACCCTGCTGCAGATGGGGGCTGACCGTAAGCACGAACTGGGAAGTATGGACCTGTTTACCGGCGTGATGGCCACCTACACTGACACAG ATGCGTCAGCAGACCTGTACAGCGGTAAAACAAAATCATGGGGTGGTGGTTTCTATGCCAGTGGTCTGTTCCGGTCCGGCGCTTACTTTGATGTGATTGC CAAATATATTCACAATGAAAACAAATATGACCTGAACTTTGCCGGAGCTGGTAAACAGAACTTCCGCAGCCATTCACTGTATGCAGGTGCAGAAGTCGGA TACCGTTATCATCTGACAGATACGACGTTTGTTGAACCTCAGGCGGAACTGGTCTGGGGAAGACTGCAGGGCCAAACATTTAACTGGAACGACAGTGGAA TGGATGTCTCAATGCGTCGTAACAGCGTTAATCCTCTGGTAGGCAGAACCGGCGTTGTTTCCGGTAAAACCTTCAGTGGTAAGGACTGGAGTCTGACAGC CCGTGCCGGCCTGCATTATGAGTTCGATCTGACGGACAGTGCTGACGTTCATCTGAAGGATGCAGCGGGAGAACATCAGATTAATGGCAGAAAAGACAGTCGTATGCTTTACGGTGTGGGGTTAAATGCCCGGTTTGGCGACAATACGCGTCTGGGGCTGGAAGTTGAACGCTCTGCATTTGGTAAATACAACACAGATG ATGCGATAAACGCTAATATTCGTTATTCATTCTGA
tsh基因经过PCR扩增后，产物的长度为4135bp。
bor基因经扩增后的产物序列经由华大基因公司测序后，结果如下：
TAGGATTCTGCCGTTTTTATTATTGTGAGCAATACACACGCGCTTCCAGCGGAGTATAAATGCCTAAAGTAATAAAACCGAGCAATCCATTTA CGAATGTTTGCTGGGTTTCTGTTTTAACAACATTTTCTGCGCCGCCACAAATTTTGGCTGCATCGACAGTTTTCTTCTGCCCAATTCCAGAAACGA AGAAATGATGGGTGATGGTTTCCTTTGGTGCTACTGCTGTCTGTTTGTTTTGAACAGTAAACGTCTGTTGAGCACATCCTGTAATAAGCAGGGCCA GCGCAGTAGCGAGTAGCATTTTTTTCATGGTGTTATTCCCGATTAGTTGCCCATCGATATG
bor基因经过PCR扩增后，产物的长度为346bp。
2、目的基因yncE基因扩增
以血清型O1/O2/O65的多凝大肠杆菌菌株为模板进行yncE基因扩增，利用PCR 对囊泡蛋白yncE基因进行扩增，在PCR扩增过程中，yncE基因的引物序列根据NCBI 数据库中公布的yncE基因(NCBI查询号NC_000913.3)设计。
Ⅰ、yncE基因引物序列的设计
根据NCBI数据库中公布的yncE基因(NCBI查询号NC_000913.3)设计，具体如 下：
yncE基因的引物序列如下：
上游引物：5’-CGGGATCCGATGCATTTACGTCATCTGTTTT-3’，
下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTACAGCGCAATACGAATCAC-3’；
yncE2片段的引物序列如下：
上游引物：5’-ACATGCATGCATGCGTCCGGCGTAGAGG-3’，
下游引物：5’-ACATGCATGCACCCCTCAAGACCCGTTTAG-3’；
Ⅱ、目的基因的获得
将血清型的禽致病性大肠杆菌(APEC)菌株(含有yncE基因)划线接种于伊红美 兰琼脂平板，37℃培养16h后，挑取单个菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm振荡培养16h后提取质粒；质粒的提取按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、 试剂和方法提取质粒DNA作为基因获取的模板；
以血清型O1/O2/O65的多凝大肠杆菌菌株为模板进行yncE基因扩增，按照如下PCR体系和程序扩增yncE基因：
PCR扩增yncE基因的反应体系：模板2.0μL、2×HIFI Mix 10μL、10μmM上 游引物和下游引物各1μL、ddH2O 6μL；
PCR扩增yncE基因的程序为：T1(预变性)：94℃、10min；T2(变性)：94℃、 30s；T3(退火)：56℃、30s；T4(延伸)：72℃、1min；T2-T4：30个循环；T5(延 伸)：72℃、10min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存；
PCR扩增的产物分别经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收试剂盒回收yncE基因并连接至pEASY载体，具体结果见图20、21、22，由图20可知，yncE基因条带适合 于切胶回收，大小符合预期。
yncE基因经扩增后的产物序列经由华大基因公司测序后，结果如下：
GATGCATTTACGTCATCTGTTTTCATCGCGCCTGCGTGGTTCATTACTGTTAGGTTCATTG CTTGTTGTTTCATCATTCAGTACGCAGGCCGCAGAAGAAATGCTGCGTAAAGCGGTAGGT AAAGGTGCCTACGAAATGGCTTATAGCCAGCAAGAAAACGCGCTGTGGCTCGCCACTTCG CAAAGCCGCAAACTGGATAAAGGTGGCGTGGTTTATCGTCTTGATCCGGTCACTCTGGAA GTGACGCAGGCGATCCATAACGATCTCAAGCCGTTTGGTGCCACCATCAATAACACGACT CAGACGTTGTGGTTTGGTAACACCGTAAACAGCGCGGTCACGGCGATAGATGCCAAAACG GGCGAAGTGAAAGGCCGTCTGGTGCTGGATGATCGTAAGCGCACGGAAGAGGTGCGCCCG CTGCAACCGCGTGAGCTGGTAGCTGACGATGCCACGAACACCGTTTACATCAGTGGTATT GGTAAAGAGAGCGTGATTTGGGTCGTTGATGGCGGGAATATCAAACTGAAAACCGCCATC CAGAACACCGGTAAAATGAGTACCGGTCTGGCGCTGGATAGCGAAGGCAAACGTCTTTAC ACCACTAACGCTGACGGCGAATTGATTACCATCGACACCGCCGACAATAAAATCCTCAGC CGTAAAAAGCTGCTGGATGACGGCAAAGAGCACTTCTTTATCAACATTAGCCTTGATACC GCCAGGCAGCGTGCATTTATCACCGATTCTAAAGCCGCAGAAGTGTTAGTGGTCGATACC CGTAATGGCAATATTCTGGCGAAGGTTGCGGCACCGGAATCACTGGCTGTGCTGTTTAAC CCCGCGCGTAATGAAGCCTACGTAACGCATCGTCAGGCAGGTAAAGTCAGTGTGATTGAC GCGAAAAGCTATAAAGTGGTGAAAACGTTCGATACGCCGACTCATCCAAACAGCCTGGCG CTGTCTGCCGATGGCAAAACGCTGTATGTCAGTGTGAAACAAAAATCCACTAAACAGCAG GAAGCTACCCAGCCAGACGATGTGATTCGTATTGCGCTGTAA
yncE基因经过PCR扩增后，产物的长度为1063bp。
S2.yncE基因连接pETDuet-1质粒
yncE设计引物分别引入以下酶切位点(划横线处)：BamHⅠ(上游引物划横线序列)、NotⅠ(下游引物划横线序列)，yncE2引物引入酶切位点(划横线处)：SphⅠ (引物划横线序列)。
yncE引物序列：上游引物：5’-CGGGATCCGATGCATTTACGTCATCTGTTTT-3’
下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTACAGCGCAATACGAATCAC-3’
yncE2引物序列：上游引物：5’-ACATGCATGCATGCGTCCGGCGTAGAGG-3’
下游引物：5’-ACATGCATGCACCCCTCAAGACCCGTTTAG-3’。
Ⅰ、yncE基因连接pEASY克隆载体，形成pEASY/yncE，并将其转化至Trans1-T1 感受态细胞中；
yncE基因和pEASY克隆载体连接体系如下：
连接体系5μL：
pEASY载体 1μL
yncE基因 4μL
37℃连接30min，将连接产物转化至Trans1-T1感受态细胞中，方法按照如下的 步骤顺序依次进行：
a.将5μL连接产物中加入100μL的Trans1-T1感受态细胞中，于冰盒中静置 30min；
b.42℃热激40s后，置冰盒中静置2min；
c.加入400μL不含抗生素的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养60min；
d.预先将含100mM AMP的LB平板，37℃放置2h备用；
e.振荡培养后的菌液均匀涂布至上述平板培养基，37℃培养16h；
f.挑取单菌落，使用M13F/R进行菌落PCR鉴定。
PCR体系如下：2μL菌液模板、10μL 2×HIFI MIX II、M13上下游引物各0.5 μL、7μLddH2O，共计：20μL。
PCR程序如下：预变性94℃10min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min， 30个循环，72℃延伸10min。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
结果见图21，由图可知，2、3、6、10菌落为PCR阳性克隆菌。
Ⅱ、选取阳性菌落，培养后按照质粒试剂盒说明提取质粒进行酶切鉴定，结果 见图22。
酶切鉴定体系如下：
双酶切体系10μL：(检测目的基因于载体是否连上)
单酶切体系和双酶切体系分别进行如下鉴定过程：
37℃过夜酶切，80℃失活20min后，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图22， 均为阳性质粒。经鉴定正确的质粒用于yncE目的片段的切胶回收并连接pETDuet-1 载体(下述步骤Ⅲ)。
Ⅲ、挑取阳性克隆菌并提取质粒，酶切回收yncE基因，并连接pETDuet-1质粒， 形成pETDuet-1/yncE，并转化至Trans1-T1感受态细胞。
酶切体系如下：
pEASY/yncE质粒、pETDuet-1质粒双酶切体系100μL：
连接体系10μL：
该体系16℃过夜连接，将10μL连接产物转化至Trans1-T1感受态细胞中，按 照如下的步骤顺序依次进行：
a.向10μL连接产物中加入100μL的Trans1-T1感受态细胞，冰盒中静置 30min；
b.42℃热激40s后，置冰盒中静置2min；
c.加入400μL不含抗生素的LB培养基，37℃200rpm振荡培养60min；
d.将含100mM AMP的LB平板，37℃放置2h备用；
e.振荡培养后的菌液均匀涂布至上述平板培养基，37℃培养16h；
f.挑取单菌落，使用T7通用引物进行菌落PCR鉴定。
PCR体系如下：2μL菌液模板、10μL 2×HIFI MIX II、T7上下游引物各0.5 μL、7μLddH2O，共计：20μL。
PCR程序如下：预变性94℃10min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min， 30个循环，72℃延伸10min。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图23。
Ⅳ、选取pETDuet-1/yncE阳性菌落，培养后提取质粒，进行酶切鉴定；
参照质粒提取试剂盒说明，提取步骤Ⅲ中阳性菌的质粒于37℃双酶切2h检测， 经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图24。
双酶切体系10μL：
Ⅴ、yncE2片段连接pTOPO克隆载体克隆载体，形成pTOPO/yncE2并将其转化至 DH5α感受态细胞中；
以pETDuet-1/yncE质粒为模板进行yncE2基因扩增。
PCR反应体系：25μL 2×HIFI Mix、yncE2引物2μL上游引物、2μL下游引物、 ddH2O19μL、模板2μL，共50μL。
PCR反应条件：预变性94℃10min，94℃变性30s，56℃退火30s，68℃延伸 1min30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行 目的条带回收。
回收产物和pTOPO克隆载体的连接体系如下：
pTOPO克隆载体 1μL
yncE2 4μL
该体系37℃连接30min，将10μL连接产物转化至DH5α感受态细胞中，它按照 如下的步骤顺序依次进行：
a.将5μL连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞中，于冰盒中静置30min；
b.42℃热激40s后，置冰盒中静置2min；
c.加入400μL不含抗生素的LB培养基，37℃150rpm振荡培养60min；
d.将含100mM AMP的LB平板，37℃放置2h备用；
e.振荡培养后的菌液均匀涂布至上述平板培养基，37℃培养16h；
f.挑取单菌落，使用M13通用引物进行菌落PCR鉴定。
PCR鉴定的体系为：模板2.0μL、2×HIFI Mix 10μL、10μmM上游引物和下游 引物各0.5μL、ddH2O 7μL，共计20μL；
PCR扩增的程序为：T1：94℃、10min；T2：94℃、30s；T3：56℃、30s；T4： 68℃、1min30s；T2-T4：30个循环；T5：72℃、10min；扩增完成后，扩增产物于4 ℃保存。产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图25。
选取阳性菌落，培养后提取质粒。
pTOPO/yncE2质粒酶切体系为：
质粒酶切检测后结果见图26，目的片段大小一致，且符合预期，成果扩增并可 以进行酶切回收yncE2片段。
S3.tsh基因和bor基因连接pETDuet-1质粒
tsh设计引物分别引入以下酶切位点(划横线处)：EcoRⅠ(上游引物划横线序 列)、HindⅢ(下游引物划横线序列)，
tsh引物序列：上游引物：5’-CCGGAATTCGATGAACAGAATTTATTCTCTTCGC-3’
下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGAATGAATAACGAATATTAGCGT-3’。
bor设计引物分别引入以下酶切位点(划横线处)：BglⅡ(上游引物划横线序列)、XhoⅠ(下游引物划横线序列)，
bor基因引物序列：上游引物：5’-GGAAGATCTTAGGATTCTGCCGTTTTTA-3’
下游引物：5’-CCGCTCGAGCATATCGATGGGCAACTA-3’。
Ⅰ、tsh基因连接pGEM-T克隆载体，形成pGEM-T/tsh，并将其转化至Trans2-Blue 感受态细胞中；
tsh基因和pGEM-T克隆载体连接体系如下：
连接体系10μL：
16℃过夜连接，将10μL连接产物转化至Trans2-Blue感受态细胞中，方法按照 如下的步骤顺序依次进行：
a.将10μL连接产物中加入50μL的Trans2-Blue感受态细胞中，于冰盒中静 置30min；
b.42℃热激30s后，置冰盒中静置2min；
c.加入440μL不含抗生素的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养60min；
d.预先将X-gal、IPTG均匀涂布于含100mM AMP的LB平板，37℃放置；
e.振荡培养后的菌液均匀涂布至上述平板培养基，37℃过夜培养；
f.挑取白色菌落，进行菌落PCR鉴定；
PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃变性40s，52℃退火40s，68℃延伸4min， 30个循环；72℃延伸10min，4℃保存，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图 5，由图可知，5、18和20号菌落为PCR阳性克隆菌，14号菌扩增条带为非目的条带； 仍然需要对质粒以及基因进行进一步的鉴定。
Ⅱ、选取阳性菌落，培养后按照质粒试剂盒说明提取质粒，结果见图6(由图 可知5和20号菌的质粒一致，且符合预期，18号菌的质粒较小，不符合预期大小)， 并对提取的质粒进行酶切鉴定；
酶切鉴定体系如下：
双酶切体系10μL：(检测目的基因于载体是否连上)
单酶切体系10μL：(检测目的基因与载体连接后质粒大小)
单酶切体系和双酶切体系分别进行如下鉴定过程：
37℃过夜酶切，80℃失活20min后，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图7，由 图可见5和20号质粒双酶切后有两条带，且与目的条带大小相同，18号质粒条带大 小与目的条带不同，所以5和20号质粒为阳性质粒。经鉴定正确的质粒用于tsh目 的片段的切胶回收(下述步骤Ⅲ)。
Ⅲ、挑取阳性克隆菌并提取质粒，酶切回收tsh基因，
酶切体系如下：
pGEM-T/tsh质粒双酶切体系80μL：
酶切后的结果见图8，由图可见tsh基因大小符合预期，pETDuet-1质粒大小也符合预期。
Ⅳ、酶切回收的tsh基因连接pETDuet-1质粒(具体的图谱见图1)，形成 pETDuet-1/tsh质粒，并将其转化至Trans2-Blue感受态细胞中；
tsh基因与表达载体pETDuet-1连接的过程按照如下步骤依次进行：
对pETDuet-1质粒进行酶切，双酶切体系为：
该体系37℃过夜酶切，80℃失活20min后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳后切胶，按 照胶回收试剂盒说明回收质粒，并经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4，由图可 知，条带1和2分别为不同平板的两个菌落，其培养液提取的质粒大小一致，符合预 期大小，适合后续工作需要。
将鉴定回收的tsh基因和pETDuet-1表达载体进行连接，构建pETDuet-1/tsh 表达质粒，具体连接体系及连接方法如下：
连接体系10μL：
该体系16℃过夜连接，将10μL连接产物转化至Trans2-Blue感受态细胞中， 按照如下的步骤顺序依次进行：
a.向10μL连接产物中加入50μL的Trans2-Blue感受态细胞，冰盒中静置 30min；
b.42℃热激30s后，置冰盒中静置2min；
c.加入450μL不含抗生素的LB培养基，37℃200rpm振荡培养60min；
d.将含100mM AMP的LB平板，37℃放置2h备用；
e.振荡培养后的菌液均匀涂布至上述平板培养基，37℃过夜培养；
f.挑取48个单菌落(编号为1-48号)，进行菌落PCR鉴定；
菌落PCR反应体系：向PCR管中加入10μL 2×HIFI MixⅡ；1μL上游引物，1 μL下游引物；2μL模板，6μL ddH2O共20μL；
PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃变性40s，52℃退火40s，68℃延伸4min， 30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图 9，由图可见除31号菌落外，其余均为阳性菌落，但需要进行更深一步鉴定。
Ⅴ、选取阳性菌落，培养后提取质粒，进行酶切鉴定；
参照质粒提取试剂盒说明，提取步骤Ⅳ中1-5和25-29号菌的质粒，经1.0％琼 脂糖凝胶电泳检测，结果见图10，由图可知27号菌的质粒大小符合预期，其余质粒 较小，不符合预期大小，选取27号质粒进行双酶切鉴定；
双酶切体系10μL：
37℃过夜酶切，80℃失活20min后，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图11， 由图可知酶切后产物条带大小符合预期大小，经鉴定正确的质粒用于下述步骤中与 bor基因连接。
Ⅵ、bor基因连接pGEM-T克隆载体，形成pGEM-T/bor,并将其转化至DH5α感受 态细胞中；bor基因和pGEM-T克隆载体的连接体系如下：
该体系16℃过夜连接，将10μL连接产物转化至DH5α感受态细胞中，它按照如 下的步骤顺序依次进行：
a.将10μL连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞中，于冰盒中静置30min；
b.42℃热激90s后，置冰盒中静置2min；
c.加入500μL不含抗生素的LB培养基，37℃150rpm振荡培养60min；
d.预先将X-gal、IPTG均匀涂布于含100mM AMP的LB平板，37℃放置；
e.振荡培养后的菌液均匀涂布至上述平板培养基，37℃过夜培养；
f.挑取10个(编号为i1-i10)白色菌落，进行菌落PCR鉴定；
PCR鉴定bor基因的体系为：模板2.0μL、2×HIFI Mix 10μL、10μmM上游引 物和下游引物各1μL、ddH2O 6μL，共计20μL；
PCR扩增bor基因的程序为：T1：95℃、10min；T2：94℃、40s；T3：53.7℃、 30s；T4：68℃、1min；T2-T4：30个循环；T5：72℃、10min；扩增完成后，扩增 产物于4℃保存。产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图14，由图可见i1-i10 号菌落均为阳性克隆，但仍需要进行进一步鉴定；
g.选取阳性菌落，培养后提取质粒，检测后结果见图15，由图可见i1、i6、i8、i9号质粒大小一致，且符合预期，可以进行酶切回收bor基因。
Ⅶ、挑取阳性克隆菌培养后提取质粒，酶切回收bor基因；
提取的pGEM-T/bor质粒进行双酶切，酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，
pGEM-T/bor质粒双酶切体系为：
该体系37℃过夜酶切，65℃失活20min后1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，按照胶回 收试剂盒说明回收bor基因，结果见图16，由图可知其大小与bor基因预期大小相 同。
Ⅷ、酶切回收的bor基因与pETDuet-1/tsh质粒连接,形成pETDuet-1/tsh/bor 质粒，并将其转化至DH5α感受态细胞中；
bor基因连接至pETDuet-1/tsh质粒的连接体系及连接过程如下：
连接体系：
该体系16℃过夜连接，将10μL连接产物转化至DH5α感受态细胞中，转化方 法与步骤Ⅵ中转化方法一致；
转化后挑取10个单菌落(D1-D10)至10μL无菌水中，取2μL做模板，菌落用 PCR检测bor基因；
菌落PCR反应体系：向PCR管中加入10μL 2×HIFI MixⅡ；1μL上游引物，1 μL下游引物；2μL模板，6μL ddH2O共20μL；
PCR反应条件：95℃预变性10min；94℃变性40s，53.7℃退火30s，68℃延伸 1min，30个循环；72℃延伸10min，产物于4℃保存，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检 测，结果见图17，由图可见D1-D10号菌落均为阳性，但仍需进行进一步鉴定。
Ⅸ、鉴定阳性克隆菌，提取pETDuet-1/tsh/bor质粒。
选取D1、D6、D7、D8、D9、D10六个菌落接种至含100mM AMP的LB培养基中， 37℃,180rpm振荡培养16h，按照质粒提取试剂盒说明提取质粒并经酶切鉴定，结果 见图18和图19，由图18可见，D1、D6、D7、D8号菌的质粒大小符合预期，D9、D10 号菌的质粒较小，不符合预期大小，由图19可知D1、D6、D7、D8号质粒全部为阳性 质粒，
酶切体系如下：
pETDuet-1/tsh/bor质粒四酶切体系10μL：
该体系37℃过夜酶切，65℃失活20min后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果 见图19。
S4.yncE2片段连接pETDuet-1/tsh/bor质粒
I、酶切回收S2中所得的yncE2片段与pETDuet-1/tsh/bor质粒连接,形成pETDuet-1/tsh/bor/yncE2质粒，并将其转化至DH5α感受态细胞中；
酶切鉴定正确的克隆pTOPO-yncE2与pETDuet-1/tsh/bor载体摇菌扩繁，提取质粒，SphⅠ限制性内切酶于37℃酶切2h后进行切胶回收。
yncE2片段连接至pETDuet-1/tsh/bor质粒的酶切体系及连接过程如下：
酶切体系：
连接体系：
该体系16℃过夜连接，将10μL连接产物转化至DH5α感受态细胞中，转化方 法与S2中步骤Ⅴ中转化方法一致；转化后挑取单菌落(D1-D10)至10μL无菌水中， 取2μL做模板，菌落使用yncE2引物PCR检测；
PCR体系如下：2μL菌液模板、10μL 2×HIFIMIX II、yncE2上下游引物各0.5 μL、7μLddH2O，共计：20μL。
PCR程序如下：预变性94℃10min，94℃变性30s，56℃退火30s，68℃延伸 1min30s，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
结果见图27，由图可见1，3，4，8，9，11，13和15号菌株为阳性菌株。
II、鉴定阳性克隆菌，提取pETDuet-1/tsh/bor/yncE质粒。
选取3、4号菌落接种至含100mM AMP的LB培养基中，37℃,180rpm振荡培养过 夜，按照质粒提取试剂盒说明提取质粒并于37℃酶切2h，鉴定结果见图28、29。
酶切体系如下：
pETDuet-1/tsh/bor/yncE质粒酶切体系10μL：
3号菌质粒经NotⅠ酶切之后为一条较亮的条带，推测可能为5666bp与5759bp 条带的重合，是yncE2片段与tsh基因反向连接的结果，即为目的条带，因此，该菌 成果构建pETDuet-1/tsh/bor/yncE2目的质粒；4号菌质粒经NotⅠ酶切之后为两个 条带，推测可能为4734bp与6691bp条带的重合，是yncE2基因与tsh基因同向连接 的结果。BamHⅠ酶切后均出现一个条带，推测可能有酶切位点突变。
所得pETDuet-1/tsh/bor/yncE2质粒，如图1所示，其DNA序列中包括温度敏感 血凝素tsh基因、胞膜脂蛋白bor基因和囊泡蛋白yncE基因，其中，tsh基因由温 度敏感血凝素转运蛋白tshβ基因和温度敏感血凝素效应蛋白tshs基因组成，用于基 因工程菌疫苗，防治禽大肠杆菌病。
其中，上述构建方法中所有PCR程序的T2-T4循环数均可以为25-35个循环中的 任意整数。
实施例2一种促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒的应用方法
通过转化表达菌实现目的基因的共表达：
将鉴定后的pETDuet-1/tsh/bor/yncE2质粒转入表达菌株BL21(DE3)中，形成BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/bor/yncE菌株，诱导表达蛋白，具体的转入过程按照如 下的步骤顺序依次进行：
a.将1μL质粒加入100μL的BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min；
b.42℃热激40s后，置冰盒中静置2min；
c.加入400μL不含抗生素的LB培养基，37℃200rpm振荡培养60min；
d.将含100mM AMP的LB平板，37℃放置2h备用；
e.振荡培养后的菌液均匀涂布至上述平板培养基，37℃过夜培养；
f.选取阳性菌落接种至含100mM AMP的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养 16h，以1:120比例接入新鲜培养基后将其培养至对数期后，加入终浓度1.0mM的IPTG， 于37℃的诱导温度下，诱导4.5h，诱导表达蛋白。
用10％的SDS-PAGE凝胶电泳检测菌株的诱导表达产物，结果见图30、31；由图 可知反向连接的3号菌株蛋白表达量校正向连接的4号菌株高。
实施例3-7促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒的应用方法
实施例3-7分别为一种促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒的应用方法，实施 步骤与实施例2相似，不同之处仅在于：
将pETDuet-1/tsh/bor/yncE2质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，于50L发酵 罐中将其培养至对数期后，加入的IPTG或乳糖浓度不同，诱导表达蛋白时的温度和 时间不同，具体为：
实施例3，加入终浓度0.5mM的IPTG，诱导温度25℃下，诱导时间为8h，诱导 表达蛋白结果见图32，由图可见诱导后上清中便有目的蛋白表达，图中箭头所示为 目的蛋白位置，随着诱导时间的延长，蛋白表达量增多；
实施例4，加入终浓度0.8mM的乳糖，诱导温度30℃的下，诱导时间10h，诱 导表达蛋白结果见图33，由图可见诱导后上清中便有目的蛋白表达，图中箭头所示 为目的蛋白位置，随着诱导时间的延长，蛋白表达量增多；
实施例5，加入终浓度1.5mM的乳糖，诱导温度37℃的下，诱导时间4h，诱导 表达蛋白结果见图34。
实施例6，加入终浓度1.5mM的IPTG，诱导温度37℃下，诱导时间为10h；
实施例7，加入终浓度1.2mM的IPTG，诱导温度30℃下，诱导时间为20h。
实施例8促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒的应用
本实施例利用实施例1所制得的促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒，诱导后获得Tsh，YncE和Bor蛋白，以其为主要成分制备亚单位疫苗，制备的亚单位疫苗应用于 预防禽大肠杆菌病中。
SPF鸡按饲养手册饲养至14日龄，分为2组，即试验组和阴性对照组，每组8只鸡，试验组每只鸡通过股部肌肉注射给药，剂量为0.1mL，阴性对照组每只鸡通过股部肌 肉注射0.1mL生理盐水，注射免疫前每组鸡采血检测抗体，免疫后7d和14d采血检测抗 体，攻毒后7天，统计死亡率，计算疫苗保护率，具体结果见图35和下表：
由图35可见，从7日龄至21日龄阴性对照组抗体滴度呈下降趋势，14和21日 龄阴性对照组抗体滴度为阴性。免疫组7日龄至21日龄的抗体滴度也呈下降趋势， 下降速度更快，这与注射免疫引起的抗原抗体中和反应有关，21日龄攻毒后免疫组 抗体滴度上升明显。
结果表明，试验组抗体增高水平明显高于阴性对照组。抗体水平高低反映了鸡体抵抗大肠杆菌病的能力，一般抗体水平越高，鸡体抵抗大肠杆菌病能力越强。
实施例9不同质粒tsh基因表达情况
将DH5α/pET-24(+)/tsh，BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/iss，BL21(DE3) /pETDuet-1/tsh/bor/yncE三种质粒分别接种至含Amp的LB平板培养基，置37℃培 养箱中16h后，挑取单菌落接种至含Amp的LB培养基，37℃180rpm条件下振荡培 养16h后，以1：100比例转接至含Amp的LB培养基中，37℃180rpm条件下振荡培 养5h后，加入终浓度1mM的IPTG，37℃诱导20h后，取离心菌体和上清液，制备 SDS-PAGE蛋白样品，电泳检测Tsh蛋白表达情况。
结果如图36所示，图中：M为蛋白分子质量标准，泳道1、2、3分别为DH5α/pET-24(+)/tsh，BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/iss，BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/bor/yncE 诱导前离心上清；泳道4、5、6分别为DH5α/pET-24(+)/tsh，BL21(DE3) /pETDuet-1/tsh/iss，BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/bor/yncE诱导后离心上清，由图 可见诱导后泳道4和5无目的蛋白，泳道6可见目的蛋白(图中箭头所示)，表明本发 明的质粒Tsh蛋白高效表达。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然 可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同 替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包 含在本发明权利要求保护的范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北科星药业有限公司
<120> 促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用
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caaggacacg cttgatattc cactggtcag cgcacctgaa gcgacagctg ataatctgtt 3120
cagggcatca acacgggttg tgggattcag tgatgtcacc cccatcctta gtgtcagaaa 3180
agaggacggg aaaaaagagt gggtcctcga tggttaccag gttgcacgta acgacggcca 3240
gggtaaggct gccgccacat tcatgcacat cagctataac aacttcatca ctgaagttaa 3300
caacctgaac aaacgcatgg gcgatttgag ggatattaat ggcgaagccg gtacgtgggt 3360
gcgtctgctg aacggttccg gctctgctga tggcggtttc actgaccact ataccctgct 3420
gcagatgggg gctgaccgta agcacgaact gggaagtatg gacctgttta ccggcgtgat 3480
ggccacctac actgacacag atgcgtcagc agacctgtac agcggtaaaa caaaatcatg 3540
gggtggtggt ttctatgcca gtggtctgtt ccggtccggc gcttactttg atgtgattgc 3600
caaatatatt cacaatgaaa acaaatatga cctgaacttt gccggagctg gtaaacagaa 3660
cttccgcagc cattcactgt atgcaggtgc agaagtcgga taccgttatc atctgacaga 3720
tacgacgttt gttgaacctc aggcggaact ggtctgggga agactgcagg gccaaacatt 3780
taactggaac gacagtggaa tggatgtctc aatgcgtcgt aacagcgtta atcctctggt 3840
aggcagaacc ggcgttgttt ccggtaaaac cttcagtggt aaggactgga gtctgacagc 3900
ccgtgccggc ctgcattatg agttcgatct gacggacagt gctgacgttc atctgaagga 3960
tgcagcggga gaacatcaga ttaatggcag aaaagacagt cgtatgcttt acggtgtggg 4020
gttaaatgcc cggtttggcg acaatacgcg tctggggctg gaagttgaac gctctgcatt 4080
tggtaaatac aacacagatg atgcgataaa cgctaatatt cgttattcat tctga 4135
<210> 10
<211> 346
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
taggattctg ccgtttttat tattgtgagc aatacacacg cgcttccagc ggagtataaa 60
tgcctaaagt aataaaaccg agcaatccat ttacgaatgt ttgctgggtt tctgttttaa 120
caacattttc tgcgccgcca caaattttgg ctgcatcgac agttttcttc tgcccaattc 180
cagaaacgaa gaaatgatgg gtgatggttt cctttggtgc tactgctgtc tgtttgtttt 240
gaacagtaaa cgtctgttga gcacatcctg taataagcag ggccagcgca gtagcgagta 300
gcattttttt catggtgtta ttcccgatta gttgcccatc gatatg 346
<210> 11
<211> 1063
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gatgcattta cgtcatctgt tttcatcgcg cctgcgtggt tcattactgt taggttcatt 60
gcttgttgtt tcatcattca gtacgcaggc cgcagaagaa atgctgcgta aagcggtagg 120
taaaggtgcc tacgaaatgg cttatagcca gcaagaaaac gcgctgtggc tcgccacttc 180
gcaaagccgc aaactggata aaggtggcgt ggtttatcgt cttgatccgg tcactctgga 240
agtgacgcag gcgatccata acgatctcaa gccgtttggt gccaccatca ataacacgac 300
tcagacgttg tggtttggta acaccgtaaa cagcgcggtc acggcgatag atgccaaaac 360
gggcgaagtg aaaggccgtc tggtgctgga tgatcgtaag cgcacggaag aggtgcgccc 420
gctgcaaccg cgtgagctgg tagctgacga tgccacgaac accgtttaca tcagtggtat 480
tggtaaagag agcgtgattt gggtcgttga tggcgggaat atcaaactga aaaccgccat 540
ccagaacacc ggtaaaatga gtaccggtct ggcgctggat agcgaaggca aacgtcttta 600
caccactaac gctgacggcg aattgattac catcgacacc gccgacaata aaatcctcag 660
ccgtaaaaag ctgctggatg acggcaaaga gcacttcttt atcaacatta gccttgatac 720
cgccaggcag cgtgcattta tcaccgattc taaagccgca gaagtgttag tggtcgatac 780
ccgtaatggc aatattctgg cgaaggttgc ggcaccggaa tcactggctg tgctgtttaa 840
ccccgcgcgt aatgaagcct acgtaacgca tcgtcaggca ggtaaagtca gtgtgattga 900
cgcgaaaagc tataaagtgg tgaaaacgtt cgatacgccg actcatccaa acagcctggc 960
gctgtctgcc gatggcaaaa cgctgtatgt cagtgtgaaa caaaaatcca ctaaacagca 1020
ggaagctacc cagccagacg atgtgattcg tattgcgctg taa 1063

Claims (8)

1.一种促进tsh s 、yncE基因胞外表达的质粒的构建方法，其特征在于，它按照如下的步骤依次进行：
S1. 目的基因的克隆
以禽致病性大肠杆菌基因为模板，利用引物分别扩增tsh基因、bor基因和yncE基因，其中，引物序列如下：
tsh基因上游引物：5’-CCGGAATTCGATGAACAGAATTTATTCTCTTCGC-3’，
tsh基因下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGAATGAATAACGAATATTAGCGT-3’；
bor基因上游引物：5’-GGAAGATCTTAGGATTCTGCCGTTTTTA-3’，
bor基因下游引物：5’-CCGCTCGAGCATATCGATGGGCAACTA-3’；
yncE基因上游引物：5’-CGGGATCCGATGCATTTACGTCATCTGTTTT-3’，
yncE基因下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTACAGCGCAATACGAATCAC-3’；
S2. yncE基因连接pETDuet-1质粒
将S1扩增所得的yncE基因连接至克隆载体，经转化，筛选阳性克隆，酶切回收带有酶切位点的yncE基因并连接入pETDuet-1质粒，经转化，筛选阳性克隆，提取pETDuet-1/yncE质粒作模板，利用引物扩增yncE2基因；
其中，yncE2基因上游引物序列：5’-ACATGCATGCATGCGTCCGGCGTAGAGG-3’，
yncE2基因下游引物序列：5’-ACATGCATGCACCCCTCAAGACCCGTTTAG-3’；
S3. tsh基因和bor基因连接pETDuet-1质粒
将S1扩增所得的tsh基因和bor基因分别连接至克隆载体，经转化，筛选阳性克隆，分别酶切回收带有酶切位点的tsh基因和bor基因并依次连接入pETDuet-1质粒，经转化，筛选阳性克隆，提取pETDuet-1/tsh/bor质粒；
S4. yncE2基因连接pETDuet-1/tsh/bor质粒
将S2扩增所得的yncE2基因连接至克隆载体，经转化，筛选阳性克隆，酶切回收带有酶切位点的yncE2基因并连接入pETDuet-1/tsh/bor质粒，经转化，筛选yncE2基因与tsh基因和bor基因序列方向相反的克隆，提取pETDuet-1/tsh/bor/yncE2质粒，即为促进tsh s 、yncE基因胞外表达的质粒。
2.根据权利要求1所述的促进tsh s 、yncE基因胞外表达的质粒的构建方法，其特征在于，所述扩增tsh基因的方法为：
S11).将O78血清型的禽致病性大肠杆菌菌株接种，培养，挑取单个菌落接种，振荡培养，提取质粒，作模板备用；
S12).按以下程序PCR扩增：T1：94℃、4min；T2：94℃、40s；T3：52℃、40s；T4：68℃、4min；T2-T4：25-35个循环；T5：72℃、10 min；
PCR体系为：模板5.0μL、2×HIFI Mix 30μL、10μmM tsh基因上游引物和下游引物各3μL、ddH2O 19μL；
所述扩增bor基因的方法为：
S13).将O78血清型的禽致病性大肠杆菌菌株接种，培养，挑取单个菌落接种，振荡培养，煮沸裂解菌液，作模板备用；
S14).按以下程序PCR扩增：T1：95℃、5min；T2：94℃、40s；T3：53.7℃、30s；
T4：68℃、1min；T2-T4：25-35个循环；T5：72℃、10 min；
PCR体系为：模板2.5μL、2×HIFI Mix 25μL、10μmM bor基因上游引物和下游引物各2.5μL、ddH2O17.5μL；
所述扩增yncE基因的方法为：
S15).将O1/O2/O65血清型的多凝禽致病性大肠杆菌菌株接种，培养，挑取单个菌落接种，振荡培养，煮沸裂解菌液，作模板备用；
S16).按以下程序PCR扩增：T1：94℃、10min；T2：94℃、30s；T3：56℃、30s；
T4：72℃、1min；T2-T4：25-35个循环；T5：72℃、10 min；
PCR体系为：模板5.0μL、2×HIFI Mix 30μL、10μmM yncE基因上游引物和下游引物各3μL、ddH2O19μL。
3.根据权利要求1所述的促进tsh s 、yncE基因胞外表达的质粒的构建方法，其特征在于，所述扩增yncE2基因的PCR程序为：T1：94℃、10min；T2：94℃、30s；T3：56℃、30s；T4：68℃、1.5min；T2-T4：25-35个循环；T5：72℃、10 min；
PCR体系为：模板2.0μL、2×HIFI Mix 25μL、10μmM yncE2基因上游引物和下游引物各2μL、ddH2O19μL。
4.根据权利要求1所述的促进tsh s 、yncE基因胞外表达的质粒的构建方法，其特征在于，步骤S2中，将S1扩增所得的yncE基因连接至pEASY克隆载体后转化至Trans1-T1感受态细胞。
5.根据权利要求1所述的促进tsh s 、yncE基因胞外表达的质粒的构建方法，其特征在于，步骤S3中，将S1扩增所得的tsh基因连接至pGEM-T克隆载体后转化至Trans2-Blue感受态细胞；
将S1扩增所得的bor基因连接至pGEM-T克隆载体后转化至DH5α感受态细胞。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的促进tsh s 、yncE基因胞外表达的质粒的构建方法，其特征在于，步骤S4中，将S2扩增所得的yncE2基因连接至pTOPO克隆载体后转化至DH5α感受态细胞。
7.一种促进tsh s 、yncE基因胞外表达的质粒的应用，其特征在于，它是将权利要求1中制得的pETDuet-1/tsh/bor/yncE2质粒转化入表达菌株细胞，使目的蛋白共表达，用于制备基因工程菌疫苗。
8.根据权利要求7所述的促进tsh s 、yncE基因胞外表达的质粒的应用，其特征在于，所述表达菌株细胞为BL21(DE3)感受态细胞；
所述使目的蛋白共表达的方法为：将转化后的表达菌株细胞培养至对数期，加入终浓度0.5-1.5mM 的IPTG或乳糖，于25-37℃温度下，诱导4.5-20h，诱导目的基因共表达目的蛋白，用作基因工程菌疫苗，防治禽大肠杆菌病。
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