CN107557375A - tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法，它包括依次进行的双基因克隆、tsh基因和iss基因连接pETDuet‑1质粒、转化表达菌及目的基因的共表达等步骤。本发明构建了基于温度敏感血凝素（tsh）和增强血清抵抗蛋白（iss）的微生物细胞模型，并进行了生物转化，方法简单，过程易于控制，共表达菌株中含有tsh和iss双基因，双基因表达的成功率高；本发明还提供了上述菌株在防治禽大肠杆菌病中的应用。本发明适用于构建tsh和iss双基因共表达菌株，并将由它制备的基因工程菌疫苗应用于防治禽大肠杆菌病中。

Description

tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种双基因表达菌株的构建方法及其应用，具体地说是一种tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法及其应用。

背景技术

禽大肠杆菌病（Avian colibacillosis，AC）,是由禽致病性大肠杆菌（Avianpathogenic Escherichia coli，APEC）引起鸡、火鸡及其他禽类局部或全身性肠外感染的总称，临床上以大肠杆菌性脐炎、蜂窝织炎、输卵管炎、腹膜炎和肿头综合征及败血症（心包炎、肝周炎、气囊炎）等较为常见，受染禽群死亡率增高、胴体废弃率增加、生长率及饲料转换率下降，是目前阻碍世界养禽业特别是肉鸡业健康发展的最为严重的细菌性传染病，其所造成的经济损失每年高达数百万美元。

多年的生产实践表明，禽大肠杆菌病通过消除易感因素或药物防控的效果甚微，加之随着耐药菌株及药物残留问题的增加，禽产品质量安全愈来愈受到人们的重视。因此，开辟非抗生素途径特别是通过接种疫苗防控禽大肠杆菌病的发生和流行、减少禽产品污染及保证食品安全，具有广阔的发展前景。然而，由于大肠杆菌血清型众多且不同血清型甚至同血清型的不同菌株之间也缺乏交叉免疫，给利用疫苗防治本病带来极大的挑战，也是限制大肠杆菌病疫苗广泛使用的重要原因。

但令人欣慰的是，不同血清型APEC存在共同的致病物质,多数研究者认为温度敏感血凝素（tsh）基因和增强血清抵抗蛋白（iss）基因在APEC中普遍存在，tsh蛋白是一种定植于禽呼吸道、与雏鸡早期高死亡率有关的自动转运分泌蛋白，具有黏附和蛋白溶解活性，在APEC致病机理方面是一个重要的毒力因子，故可作为研发广谱疫苗的关键靶。iss蛋白为一种膜蛋白，能够10-50倍地提高APEC的血清抵抗能力。血清抵抗是APEC致病机制之一，APEC的血清抵抗能力的提高有利于致病菌在机体内存活。因此，如果基于多数APEC共有的tsh基因和iss基因，利用基因工程方法构建表达APEC tsh和iss基因的大肠杆菌菌苗BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/iss，探索有效防治不同血清型APEC感染的广谱疫苗具有重大的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法，构建了基于温度敏感血凝素（tsh）和增强血清抵抗蛋白（iss）的微生物细胞模型，并进行了生物转化，该方法简单，过程易于控制，共表达菌株中含有tsh和iss双基因，双基因表达的成功率高；

本发明的另外一个目的，是提供上述菌株在防治禽大肠杆菌病中的应用。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

一种tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法，它按照如下的步骤依次进行：

（Ⅰ）双基因的克隆

以禽致病性大肠杆菌质粒为模板，利用PCR分别对温度敏感血凝素tsh基因和增强血清抵抗iss基因进行扩增，在PCR扩增过程中，

tsh基因的引物序列如下：

上游引物：5’-CCGGAATTCATGAACAGAATTTATTCTCTTCGC-3’，

下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGAATGAATAACGAATATTAGCGT-3’

iss基因的引物序列如下：

上游引物：5’-GGAAGATCTTAGGATTCTGCCGTTTTTA-3’，

下游引物：5’-CCGCTCGAGCATATCGATGGGCAACTA-3’；

（Ⅱ）tsh基因和iss基因连接pETDuet-1质粒

将扩增后的目的基因连接至克隆载体中，转化克隆菌、筛选阳性克隆、酶切后回收带有酶切位点的目的基因，将带有酶切位点的目的基因连接至表达载体中，转化克隆菌、筛选阳性克隆菌，提取鉴定后的pETDuet-1/tsh/iss质粒；

（Ⅲ）转化表达菌及目的基因的共表达

将pETDuet-1/tsh/iss质粒转入表达菌株BL21(DE3)中，诱导表达蛋白。

作为本发明的限定：

一、步骤（Ⅰ）中，所述PCR技术扩增tsh基因后，产物的长度为4134bp；扩增iss基因后，产物的长度为346bp。

二、步骤（Ⅰ）中，所述PCR扩增tsh基因和iss基因的具体过程如下：

（1）将O78血清型的禽致病性大肠杆菌菌株划线接种于伊红美兰琼脂平板，37℃培养16h后，挑取单个菌落接种于 5mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm振荡培养16h后提取质粒；

（2）以该质粒为模板，扩增tsh基因和iss基因；

PCR扩增tsh基因的体系为：模板5.0μL、2×HIFI Mix 30μL、10μmM上游引物和下游引物各3μL、ddH₂O 19μL；

PCR扩增iss基因的体系为：模板2.5μL、2×HIFI Mix 25μL、10μmM上游引物和下游引物各2.5μL、ddH₂O17.5μL。

三、步骤（Ⅰ）中，

PCR扩增tsh基因的程序为：T1：94℃、4min；T2：94℃、40s；T3：52℃、40s；T4：68℃、4min；T2-T4：30个循环；T5：72℃、10 min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存；

PCR扩增iss基因的程序为：T1：95℃、5min；T2：94℃、40s；T3：53.7℃、30s；T4：68℃、1min；T2-T4：30个循环；T5：72℃、10 min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存。

四、步骤（Ⅱ）中，tsh基因和iss基因连接pETDuet-1质粒的具体制备过程，按照如下的步骤顺序进行：

a.tsh基因连接pGEM-T克隆载体，形成pGEM-T/tsh，并将其转化至Trans2-Blue感受态细胞中；

b.挑取阳性克隆菌并提取质粒，酶切回收tsh基因；

c.酶切回收的tsh基因连接pETDuet-1质粒，形成pETDuet-1/tsh质粒，并将其转化至Trans2-Blue感受态细胞中；

d.iss基因连接pGEM-T克隆载体，形成pGEM-T/iss,并将其转化至DH5α感受态细胞中;

e.挑取阳性克隆菌提取质粒，酶切回收iss基因;

f.酶切回收的iss基因与pETDuet-1/tsh质粒连接,形成pETDuet-1/tsh/iss质粒，并将其转化至DH5α感受态细胞中；

g.鉴定阳性克隆菌，提取pETDuet-1/tsh/iss质粒。

上述连接过程中，连接双基因的先后顺序主要是基于下述原因：

①扩增后tsh基因较长（4134bp），pETDuet-1载体大小为5420bp，两者大小比较接近，连接难度较大，且tsh基因中含有的酶切位点较多，导致载体上的多克隆位点中许多酶切位点不能使用，从而增加了克隆和表达载体的选择难度，所以经过大量的实验的比对，优先连接tsh基因；反之如果先连接iss（346bp）基因，后连接tsh基因，则会使得连接概率大大降低，甚至无法顺利连接上；

②通过长期、大量对致病性禽大肠杆菌的实验研究，发现tsh基因较iss基因更重要，tsh在APEC致病过程中起粘附作用，并具有非常好的免疫原性和反应原性；

③在双基因表达过程中，连接到载体中的第一个基因的蛋白表达的量要大于第二个基因的表达量，基于此，最终确定双基因的连接过程中，先连接tsh基因，后连接iss基因。

五、步骤（Ⅲ）中，所述转化表达菌，实现目的基因的共表达过程如下：

将pETDuet-1/tsh/iss质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，将其培养至对数期后，加入IPTG或乳糖，于18-39℃的诱导温度下，诱导4-24h，诱导表达蛋白。

本发明还提供了上述菌株的应用，即基于上述tsh和iss双基因共表达菌株制备的基因工程菌疫苗，在防治禽大肠杆菌病中的应用。

本发明所制备的BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/iss生物材料（大肠埃希氏菌Escherichia coli）已于2017年5月25日在CGMCC进行保藏，保藏编号为14188，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，经保藏单位检测该生物材料状态为存活。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

本发明提供的tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法，具有如下优点：

（1）PCR扩增tsh和iss双基因过程中，所用的引物特异性强，能快速扩增出目的片段；

（2）tsh和iss双基因与pETDuet-1质粒连接的过程简单，克隆载体和表达载体选择合适，连接的成功率高；

（3）本发明所提供的方法简单，过程易于控制，共表达菌株中含有tsh和iss双基因，双基因表达的成功率高。

本发明适用于构建tsh和iss双基因共表达菌株，并将其制备的基因工程菌疫苗应用于防治禽大肠杆菌病中。

本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。

附图说明

图1 为pETDuet-1质粒图谱

图2 为以APEC质粒为模板tsh基因的扩增结果（图中：M为DNA分子质量标准, 其它的条带为tsh基因条带）；

图3 为胶回收试剂盒回收的tsh基因检测结果（图中：M为DNA分子质量标准；其它条带为tsh基因条带）；

图4 为pETDuet-1质粒提取结果（图中：M为DNA分子质量标准；泳道1和2分别为不同平板的两个菌落）；

图5 为菌落PCR检测48个Trans2-Blue/pGEM-T/tsh菌落结果（图中：M为DNA分子质量标准；图中1-48号泳道分别为同一个平板培养基中培养的Trans2-Blue/pGEM-T/tsh单菌落为模板，通过菌落PCR扩增的结果）；

图6 为利用1.0%琼脂糖凝胶电泳对图5中5、18和20号菌落培养物提取的质粒进行检测的结果图（图中：M为DNA分子质量标准；5号泳道为图5中5号菌落的质粒、18号泳道为图5中18号菌落的质粒、20号泳道为图5中20号菌落的质粒）；

图7 为利用1.5%琼脂糖凝胶电泳对图6中5、18和20号质粒的酶切结果进行检测的结果图（图中：M为DNA分子质量标准；5s、18s和20s泳道分别为图6中5、18和20号质粒经EcoRⅠ和HindⅢ内切酶双酶切产物，5d、18d和20d泳道分别为图6中5、18和20号质粒经EcoRⅠ内切酶单酶切产物）；

图8 为图6中5、20号质粒酶切后切胶回收的tsh基因以及pETDuet-1质粒切胶回收产物电泳检测结果图（图中：M为DNA分子质量标准；5和20号泳道分别为图6中5和20号pGEM-T/tsh质粒酶切后切胶回收到的tsh基因，pET条带为pETDuet-1质粒）；

图9 为菌落PCR检测48个Trans2-Blue/pETDuet-1/tsh菌落的结果（图中：M为DNA分子质量标准；1-48号泳道分为同一个平板培养基中挑取的48个Trans2-Blue/pETDuet-1/tsh单菌落的PCR鉴定结果）；

图10 为利用1.0%琼脂糖凝胶电泳对图9中的1-5和25-29号Trans2-Blue/pETDuet-1/tsh菌的质粒进行检测的结果图（图中：M为DNA分子质量标准，1-5号泳道分别为图9中1-5号菌落培养后提取的质粒电泳检测结果，25-29号泳道分别为图9中25-29号菌落培养后提取的质粒电泳检测结果）；

图11 为利用1.0%琼脂糖凝胶电泳对图10中27号质粒的酶切结果进行检测的结果图（图中：M为DNA分子质量标准；27号泳道为27号质粒经EcoRⅠ和HindⅢ内切酶酶切产物）

图12 为利用1.0%琼脂糖凝胶电泳对iss基因的扩增结果进行检测的结果图（图中：M为DNA分子质量标准，泳道1～8分别为以致病性禽大肠杆菌的质粒为模板，以46.8℃、50.3℃、53.7℃、57.2℃、60.3℃、63.2℃、65.4℃、67℃为退火温度扩增的346bp的iss基因，泳道9为以本公司实验室保存的345bp大小的iss基因为模板扩增的346bp的iss基因）；

图13 为胶回收试剂盒切胶回收的346bp的iss基因图（图中：M为DNA分子质量标准；iss泳道为346bp的iss基因切胶回收的产物）；

图14 为菌落PCR检测由同一平板培养基上培养的10个DH5α/pGEM-T/iss菌落的电泳结果（图中：M为DNA分子质量标准，i1-i10泳道分别为10个iss基因连接pGEM-T载体后转化DH5α菌，挑取的10个单菌落为模板，通过菌落PCR的检测结果）；

图15 为图14中i1、i6、i8、i9号菌落培养物提取的质粒电泳检测结果图（图中：M为DNA分子质量标准，i1、i6、i8、i9泳道分别为图14中i1、i6、i8、i9号菌落的质粒电泳结果）；

图16 为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测胶回收试剂盒对图15中四个质粒酶切后的iss基因回收的图谱（图中：M为DNA分子质量标准；iss泳道为图15中质粒酶切后经胶回收试剂盒回收后的产物检测结果）；

图17 为菌落PCR检测由同一平板培养基上培养的10个DH5α/pETDuet-1/tsh/iss菌落的电泳检测结果图（图中：M为DNA分子质量标准，D1-D10泳道分别为iss基因连接pETDuet-1/tsh载体，转化DH5α后挑取的10个单菌落为模板，菌落PCR检测iss基因的结果）；

图18 为利用0.8%琼脂糖凝胶电泳对图17中D1、D6、D7、D8、D9、D10号菌落培养后提取的质粒进行检测的结果图（图中：M为DNA分子质量标准， D1、D6、D7、D8、D9、D10泳道分别为图17中D1、D6、D7、D8、D9、D10号菌的质粒）；

图19 为利用1.0%琼脂糖凝胶电泳对图18中D1、D6、D7、D8号质粒的酶切结果进行检测的结果图（图中：M1和M2为DNA分子质量标准，D1、D6、D7、D8泳道为图18中D1、D6、D7、D8号质粒经EcoRⅠ内切酶、HindⅢ内切酶、BglⅡ内切酶、XhoⅠ内切酶酶切后电泳检测结果）；

图20 为利用15%的尿素—SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对各菌株的诱导表达产物进行检测的结果图（图中：M为蛋白分子质量标准，BL21A和BL21B泳道为BL21（DE3）/pETDuet-1/tsh/iss菌株的两个不同菌落的诱导表达产物，O57和O78泳道分别为O57和O78血清型禽致病性大肠杆菌培养产物，图中箭头所指位置为目的蛋白所在位置）；

图21 为BL21（DE3）/pETDuet-1/tsh/iss菌株通过肌肉注射途径免疫AA⁺肉鸡后抗体检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所用试剂如无特殊说明，均为现有的本领域技术人员通用的试剂；

所用的试验方法，如无特殊说明，均为现有的试验方法。

下述实施例中：快速质粒小提试剂盒（StarPrep Plasmid Miniprep Kit200rxn），购自北京康润诚业生物科技有限公司；

快速胶回收试剂盒（EasyPure Quick Gel Extraction Kit 200rxn），购自北京全式金生物技术有限公司；

pGEM-T载体购自Promega公司；

pETDuet-1载体购自Novagen公司。

实施例1 tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法

本实施例按照如下的步骤顺序进行：

1、双基因的克隆

以禽致病性大肠杆菌质粒为模板，利用PCR分别对温度敏感血凝素tsh基因和增强血清抵抗iss基因进行扩增，在PCR扩增过程中，tsh基因的引物序列和iss基因的引物序列根据NCBI数据库中公布的tsh（NCBI查询号NC_007675.1）和iss基因（NCBI查询号AF042279.1）设计。

Ⅰ、tsh基因和iss基因引物序列的设计

根据NCBI数据库中公布的tsh（NCBI查询号NC_007675.1）和iss基因（NCBI查询号AF042279.1）设计，具体如下：

tsh基因的引物序列如下：

上游引物：5’-CCGGAATTCATGAACAGAATTTATTCTCTTCGC-3’（SEQ ID NO.1），

下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGAATGAATAACGAATATTAGCGT-3’（SEQ ID NO.2）；

iss基因的引物序列如下：

上游引物：5’-GGAAGATCTTAGGATTCTGCCGTTTTTA-3’（SEQ ID NO.3），

下游引物：5’-CCGCTCGAGCATATCGATGGGCAACTA-3’（SEQ ID NO.4）；

Ⅱ、目的基因的获得

将O78血清型的禽致病性大肠杆菌（APEC）菌株(含有tsh和iss基因)划线接种于伊红美兰琼脂平板，37℃培养16h后，挑取单个菌落接种于 5mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm振荡培养16h后提取质粒；质粒的提取按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法提取质粒DNA作为基因获取的模板；

以提取的APEC菌株的质粒为模板，按照如下PCR体系和程序分别先后扩增tsh基因和iss基因：

PCR扩增tsh基因的反应体系：模板5.0μL、2×HIFI Mix 30μL、10μmM上游引物和下游引物各3μL、ddH₂O 19μL；

PCR扩增tsh基因的程序为：T1（预变性）：94℃、4min；T2（变性）：94℃、40s；T3（退火）：52℃、40s；T4（延伸）：68℃、4min；T2-T4：30个循环；T5（延伸）：72℃、10 min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存；

PCR扩增iss基因的体系为：模板2.5μL、2×HIFI Mix 25μL、10μmM上游引物和下游引物各2.5μL、ddH₂O17.5μL；

PCR扩增iss基因的程序为：T1（预变性）：95℃、5min；T2（变性）：94℃、40s；T3（退火）：37.5℃、30s；T4（延伸）：68℃、1min；T2-T4：30个循环；T5（延伸）：72℃、10 min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存。

PCR扩增的产物分别经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收试剂盒回收tsh和iss基因，具体结果见图2、图3、图12（图12对iss基因PCR扩增过程中不同的退火温度进行了探索，综合各种因素及结果选定37.5℃为最佳的退火温度）和图13，由图2、图3、图12和图13可知，tsh和iss基因条带适合于切胶回收，大小符合预期。

tsh基因经扩增后的产物序列经由华大基因公司测序后，结果如下：

ATGAACAGAATTTATTCTCTTCGCTACAGCGCTGTGGCCCGGGGCTTTATTGCCGTATCTGAGTTTGCTAGGAAATGTGTTCATAAGTCTGTCAGACGTCTGTGTTTCCCGGTTTTATTACTGATCCCGGTACTATTCTCTGCAGGAAGTCTTGCGGGAACGGTCAATAATGAACTCGGGTATCAGTTATTTCGTGATTTTGCTGAAAATAAGGGGATGTTCCGCCCGGGGGCAACGAATATCGCTATTTATAATAAGCAGGGAGAATTTGTCAGTACGCTGGATAAGGCAGCTATGCCTGATTTCAGTGCTGTGGATTCGGAAATCGGTGTGGCGACACTGATAAACCCGCAGTATATCGCCAGCGTGAAACATAACGGGGGATATACAAACGTTAGCTTTGGTGATGGTGAAAACCGTTACAATATCGTGGACCGGAATAATGCGCCGTCACTGGATTTTCATGCCCCCCGGCTGGATAAACTGGTGACAGAGGTTGCCCCTACTGCGGTGACGGCGCAGGGGGCAGTGGCTGGCGCATATCTGGATAAGGAGCGCTATCCTGTTTTTTATCGTCTGGGGTCTGGTACTCAGTATATTAAGGACAGTAACGGACAGCTGACAAAAATGGGAGGTGCATATTCCTGGCTGACCGGCGGGACTGTCGGTAGCCTGTCATCCTATCAGAATGGAGAAATGATTAGCACCAGTTCAGGTCTGGTTTTTGATTACAAACTTAATGGTGCAATGCCCATTTATGGCGAGGCCGGTGACAGCGGTTCGCCTTTATTTGCTTTTGATACTGTTCAGAATAAATGGGTGCTGGTCGGTGTTCTTACTGCGGGGAATGGCGCGGGGGGCAGGGGAAATAACTGGGCTGTTATTCCACTGGATTTTATCGGGCAGAAATTTAATGAAGACAACGATGCCCCGGTCACGTTCAGAACATCGGAAGGTGGTGCACTGGAGTGGAGCTTTAACAGCAGTACCGGAGCTGGTGCGCTGACACAGGGAACCACCACATATGCCATGCACGGGCAGCAGGGAAATGACCTGAATGCTGGTAAGAACCTGATATTTCAGGGGCAGAATGGTCAGATTAACCTTAAGGATTCGGTTTCTCAGGGGGCGGGTTCCCTGACGTTCCGTGATAATTACACAGTAACAACCTCTAACGGAAGTACCTGGACCGGTGCCGGTATTGTTGTGGACAACGGGGTGTCCGTAAACTGGCAGGTTAATGGTGTTAAGGGCGATAACCTGCATAAAATTGGTGAAGGTACGCTGACGGTACAGGGTACAGGTATTAATGAAGGTGGCCTGAAGGTCGGGGACGGAAAGGCTGTACTGAACCAGCAGGCGGACAATAAAGGACAGGTGCAGGCGTTCAGCAGTGTTAATATTGCCAGTGGCCGGCCGACCGTGGTACTGACTGATGAGCGGCAGGTAAATCCGGATACCGTCTCATGGGGATATCGTGGGGGCACACTGGATGTTAATGGTAACAGTCTGACGCTTCATCAGTTGAAGGCGGCAGATTATGGTGCCGTGCTGGCGAATAACGTTGATAAACGGGCCACTATCACGCTGGACTATGCCCTGCGGGCTGACAAAGTAGCACTGAATGGCTGGTCGGAATCAGGTAAAGGAACTGCCGGAAATTTATATAAATACAATAACCCGTACACAAATACGACGGATTACTTCATCCTGAAGCAGAGCACCTATGGTTATTTCCCCACGGACCAGAGCAGCAACGCCACCTGGGAGTTTGTGGGGCACAGTCAGGGGGATGCACAGAAACTGGTAGCTGACCGTTTCAATACTGCAGGGTATCTGTTTCACGGACAACTGAAAGGCAATCTGAATGTGGACAATCGCCTGCCTGAAGGCGTTACCAGTGCTCTGGTGATGGACGGAGCTGCGGATATCTCCGGTACATTCACCCAGGAAAACGGGCGTCTGACGCTGCAGGGGCATCCGGTTATCCATGCATACAATACTCAGTCTGTGGCTGTCAAACTGGCTGCCAGTGGAGACCATTCGGTTCTGACTCAGCCTACGTCATTCAGTCAGGAGGACTGGGAGAACCGCAGTTTTACCTTTGACAGGCTGTCACTGAAGAACACTGATTTTGGTCTTGGTCGCAATGCCACACTGAACACAACCATCCAGGCAGATAACTCCAGCGTCACGCTGGGCGACAGCCGGGTATTTATCGACAAAAACGATGGCCAGGGAACAGCCTTTACCCTTGAAGAAGGCACATCTGTTGCAACTAAAGATGCAGATAAAAGTGTCTTCAACGGCACCGTCAACCTGGATAATCAGTCAGTGCTGAATATCAATGATATATTCAATGGCGGAATACAGGCGAACAACAGTACCGTGAATATCTCCTCAGACAGTGCCGTTCTGGGGAACTCAACACTGACCAGTACCGCCCTGAATCTGAACAAGGGAGCAAATGCTCTGGCCAGTCAGAGTTTTGTTTCTGACGGTCCAGTGAATATTTCTGATGCCACCCTGAGTCTGAACAGCCGTCCTGATGAGGTATCTCACACACTTTTACCTGTATACGATTATGCCGGTTCATGGAACCTGAAGGGAGACGATGCCCGCCTGAACGTGGGGCCGTACAGTATGTTGTCAGGTAATATCAATGTTCAGGATAAAGGGACTGTCACCCTCGGAGGGGAAGGGGAACTGAGTCCTGACCTGACTCTTCAGAATCAGATGTTGTACAGCCTGTTTAACGGGTACCGCAATATCTGGAGCGGGAGCCTGAATGCACCGGATGCCACCGTCAGCATGACAGACACCCAGTGGTCGATGAACGGAAACTCCACGGCAGGAAATATGAAACTTAACCGGACAATAGTCGGTTTTAACGGGGGAACATCACCGTTCACGACACTGACAACAGATAATCTGGACGCGGTTCAGTCAGCATTTGTCATGCGTACAGACCTTAACAAGGCAGACAAACTGGTGATAAACAAGTCGGCAACAGGTCATGACAACAGCATCTGGGTTAACTTCCTGAAAAAACCTTCTAACAAGGACACGCTTGATATTCCACTGGTCAGCGCACCTGAAGCGACAGCTGATAATCTGTTCAGGGCATCAACACGGGTTGTGGGATTCAGTGATGTCACCCCCATCCTTAGTGTCAGAAAAGAGGACGGGAAAAAAGAGTGGGTCCTCGATGGTTACCAGGTTGCACGTAACGACGGCCAGGGTAAGGCTGCCGCCACATTCATGCACATCAGCTATAACAACTTCATCACTGAAGTTAACAACCTGAACAAACGCATGGGCGATTTGAGGGATATTAATGGCGAAGCCGGTACGTGGGTGCGTCTGCTGAACGGTTCCGGCTCTGCTGATGGCGGTTTCACTGACCACTATACCCTGCTGCAGATGGGGGCTGACCGTAAGCACGAACTGGGAAGTATGGACCTGTTTACCGGCGTGATGGCCACCTACACTGACACAGATGCGTCAGCAGACCTGTACAGCGGTAAAACAAAATCATGGGGTGGTGGTTTCTATGCCAGTGGTCTGTTCCGGTCCGGCGCTTACTTTGATGTGATTGCCAAATATATTCACAATGAAAACAAATATGACCTGAACTTTGCCGGAGCTGGTAAACAGAACTTCCGCAGCCATTCACTGTATGCAGGTGCAGAAGTCGGATACCGTTATCATCTGACAGATACGACGTTTGTTGAACCTCAGGCGGAACTGGTCTGGGGAAGACTGCAGGGCCAAACATTTAACTGGAACGACAGTGGAATGGATGTCTCAATGCGTCGTAACAGCGTTAATCCTCTGGTAGGCAGAACCGGCGTTGTTTCCGGTAAAACCTTCAGTGGTAAGGACTGGAGTCTGACAGCCCGTGCCGGCCTGCATTATGAGTTCGATCTGACGGACAGTGCTGACGTTCATCTGAAGGATGCAGCGGGAGAACATCAGATTAATGGCAGAAAAGACAGTCGTATGCTTTACGGTGTGGGGTTAAATGCCCGGTTTGGCGACAATACGCGTCTGGGGCTGGAAGTTGAACGCTCTGCATTTGGTAAATACAACACAGATGATGCGATAAACGCTAATATTCGTTATTCATTCTGA

tsh基因经过PCR扩增后，产物的长度为4134bp，经扩增后的tsh基因目的片段序列如SEQ ID NO.5所示。

iss基因经扩增后的产物序列经由华大基因公司测序后，结果如下：

TAGGATTCTGCCGTTTTTAACAATGCAGGATAATAGGATGAAAAAAATGTTATTTTCTGCCGCTCTGGCAATGCTTATTACAGGATGTGCTCAACAAACGTTTACTGTTGGAAACAAACCGACAGCAGTAACACCAAAGGAAACCATCACTCATCATTTCTTCGTTTCGGGAATTGGACAAGAGAAAACTGTTGATGCAGCCAAAATTTGTGGCGGTGCAGAAAATGTTGTTAAAACAGAAACTCAGCAAACATTCGTAAATGGATTGCTCGGTTTTATCACTTTTGGCATCTATACTCCGCTGGAAGCCCGAGTATATTGCTCACAATAGTTGCCCATCGATATG

iss基因经过PCR扩增后，产物的长度为346bp，经扩增后的iss基因目的片段序列如SEQID NO.6所示。

2、tsh基因和iss基因连接pETDuet-1质粒

tsh设计引物分别引入以下酶切位点(划横线处)：EcoR Ⅰ（上游引物划横线序列）、Hind Ⅲ （下游引物划横线序列），

tsh引物序列：上游引物：5’-CCG GAATTC ATGAACAGAATTTATTCTCTTCGC-3’

下游引物：5’-CCC AAGCTT TCAGAATGAATAACGAATATTAGCGT-3’。

iss设计引物分别引入以下酶切位点(划横线处)：Bgl Ⅱ（上游引物划横线序列）、XhoⅠ（下游引物划横线序列），

iss基因引物序列：上游引物：5’-GGA AGATCT TAGGATTCTGCCGTTTTTA-3’

下游引物：5’-CCG CTCGAG CATATCGATGGGCAACTA-3’。

Ⅰ、tsh基因连接pGEM-T克隆载体，形成pGEM-T/tsh，并将其转化至Trans2-Blue感受态细胞中；

tsh基因和pGEM-T克隆载体连接体系如下：

连接体系 10 μL：

16℃过夜连接，将10μL连接产物转化至Trans2-Blue感受态细胞中，方法按照如下的步骤顺序依次进行：

a. 将10μL连接产物中加入50μL的Trans2-Blue感受态细胞中，于冰盒中静置30min；

b. 42℃热激30s后，置冰盒中静置2min；

c. 加入440μL不含抗生素的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养60min；

d. 预先将X-gal、IPTG均匀涂布于含100mM AMP的LB平板，37℃放置；

e. 振荡培养后的菌液均匀涂布至上述平板培养基，37℃过夜培养；

f. 挑取白色菌落，进行菌落PCR鉴定；

PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃变性40s，52℃退火40s，68℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5，由图可知，5、18和20号菌落为PCR阳性克隆菌，14号菌扩增条带为非目的条带；仍然需要对质粒以及基因进行进一步的鉴定。

Ⅱ、 选取阳性菌落，培养后按照质粒试剂盒说明提取质粒，结果见图6（由图可知5和20号菌的质粒一致，且符合预期，18号菌的质粒较小，不符合预期大小），并对提取的质粒进行酶切鉴定；

酶切鉴定体系如下：

双酶切体系10μL：（检测目的基因于载体是否连上）

单酶切体系10 μL：（检测目的基因与载体连接后质粒大小）

单酶切体系和双酶切体系分别进行如下鉴定过程：

37℃过夜酶切，80℃失活20min后，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图7，由图可见5和20号质粒双酶切后有两条带，且与目的条带大小相同，18号质粒条带大小与目的条带不同，所以5和20号质粒为阳性质粒。经鉴定正确的质粒用于tsh目的片段的切胶回收（下述步骤Ⅲ）。

Ⅲ、挑取阳性克隆菌并提取质粒，酶切回收tsh基因，

酶切体系如下：

pGEM-T/tsh质粒双酶切体系 80 μL：

酶切后的结果见图8，由图可见tsh基因大小符合预期，pETDuet-1质粒大小也符合预期。

Ⅳ、酶切回收的tsh基因连接pETDuet-1质粒(具体的图谱见图1)，形成pETDuet-1/tsh质粒，并将其转化至Trans2-Blue感受态细胞中；

tsh基因与表达载体pETDuet-1连接的过程按照如下步骤依次进行：

对pETDuet-1质粒进行酶切，双酶切体系为：

该体系37℃过夜酶切，80℃失活20min后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳后切胶，按照胶回收试剂盒说明回收质粒，并经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4，由图可知，条带1和2分别为不同平板的两个菌落，其培养液提取的质粒大小一致，符合预期大小，适合后续工作需要。

将鉴定回收的tsh基因和pETDuet-1表达载体进行连接，构建pETDuet-1/tsh表达质粒，具体连接体系及连接方法如下：

连接体系10 μL：

该体系16℃过夜连接，将10μL连接产物转化至Trans2-Blue感受态细胞中，按照如下的步骤顺序依次进行：

a. 向10μL连接产物中加入50μL的Trans2-Blue感受态细胞，冰盒中静置30min；

b. 42℃热激30s后，置冰盒中静置2min；

c. 加入450μL不含抗生素的LB培养基，37℃ 200rpm振荡培养60min；

d.将含100mM AMP的LB平板，37℃放置2h备用；

e. 振荡培养后的菌液均匀涂布至上述平板培养基，37℃过夜培养；

f. 挑取48个单菌落（编号为1-48号），进行菌落PCR鉴定；

菌落PCR反应体系：向PCR管中加入10μL 2×HIFI MixⅡ； 1μL上游引物，1μL下游引物；2μL模板，6μL ddH₂O共20μL；

PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃变性 40s，52℃退火40s，68℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图9，由图可见除31号菌落外，其余均为阳性菌落，但需要进行更深一步鉴定。

Ⅴ、选取阳性菌落，培养后提取质粒，进行酶切鉴定；

参照质粒提取试剂盒说明，提取步骤Ⅳ中1-5和25-29号菌的质粒，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图10，由图可知27号菌的质粒大小符合预期，其余质粒较小，不符合预期大小，选取27号质粒进行双酶切鉴定；

双酶切体系10 μL：

37℃过夜酶切，80℃失活20min后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图11，由图可知酶切后产物条带大小符合预期大小，经鉴定正确的质粒用于下述步骤中与iss基因连接。

Ⅵ、iss基因连接pGEM-T克隆载体，形成pGEM-T/iss,并将其转化至DH5α感受态细胞中;

iss基因和pGEM-T克隆载体的连接体系如下：

该体系16℃过夜连接，将10μL连接产物转化至DH5α感受态细胞中，它按照如下的步骤顺序依次进行：

a. 将10μL连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞中，于冰盒中静置30min；

b. 42℃热激90s后，置冰盒中静置2min；

c. 加入500μL不含抗生素的LB培养基，37℃ 150rpm振荡培养60min；

d. 预先将X-gal、IPTG均匀涂布于含100mM AMP的LB平板，37℃放置；

e. 振荡培养后的菌液均匀涂布至上述平板培养基，37℃过夜培养；

f. 挑取10个（编号为i1-i10）白色菌落，进行菌落PCR鉴定；

PCR鉴定iss基因的体系为：模板2.0μL、2×HIFI Mix 10μL、10μmM上游引物和下游引物各1μL、ddH₂O 6μL，共计20μL；

PCR扩增iss基因的程序为：T1：95℃、10min；T2：94℃、40s；T3：53.7℃、30s；T4：68℃、1min；T2-T4：30个循环；T5：72℃、10 min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图14，由图可见i1-i10号菌落均为阳性克隆，但仍需要进行进一步鉴定；

g. 选取阳性菌落，培养后提取质粒，检测后结果见图15，由图可见i1、i6、i8、i9号质粒大小一致，且符合预期，可以进行酶切回收iss基因。

Ⅶ、挑取阳性克隆菌培养后提取质粒，酶切回收iss基因;

提取的pGEM-T/iss质粒进行双酶切，酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，

pGEM-T/iss质粒双酶切体系为：

该体系37℃过夜酶切，65℃失活20min后1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，按照胶回收试剂盒说明回收iss基因，结果见图16，由图可知其大小与iss基因预期大小相同。

Ⅷ、酶切回收的iss基因与pETDuet-1/tsh质粒连接,形成pETDuet-1/tsh/iss质粒，并将其转化至DH5α感受态细胞中；

iss基因连接至pETDuet-1/tsh质粒的连接体系及连接过程如下：

连接体系：

该体系16℃过夜连接，将10μL连接产物转化至DH5α感受态细胞中，转化方法与步骤Ⅵ中转化方法一致；

转化后挑取10个单菌落（D1-D10）至10μL无菌水中，取2μL做模板，菌落用PCR检测iss基因；

菌落PCR反应体系：向PCR管中加入10μL 2×HIFI MixⅡ；1μL上游引物，1μL下游引物；2μL模板，6μL ddH₂O共20μL；

PCR反应条件：95℃预变性10min；94℃变性 40s，53.7℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，产物于4℃保存，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图17，由图可见D1-D10号菌落均为阳性，但仍需进行进一步鉴定。

Ⅸ、鉴定阳性克隆菌，提取pETDuet-1/tsh/iss质粒。

选取D1、D6、D7、D8、D9、D10六个菌落接种至含100mM AMP的LB培养基中，37℃,180rpm振荡培养16h，按照质粒提取试剂盒说明提取质粒并经酶切鉴定，结果见图18和图19，由图18可见，D1、D6、D7、D8号菌的质粒大小符合预期，D9、D10号菌的质粒较小，不符合预期大小，由图19可知D1、D6、D7、D8号质粒全部为阳性质粒，

酶切体系如下：

pETDuet-1/tsh/iss质粒四酶切体系 10 μL：

该体系37℃过夜酶切，65℃失活20min后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测（结果见图19）。

3、转化表达菌、目的基因的共表达

将鉴定后的pETDuet-1/tsh/iss质粒转入表达菌株BL21(DE3)中，形成BL21(DE3)/pETDuet-1/tsh/iss菌株（该菌株保藏于CGMCC，CGMCC No.14188,建议的分类命名是：大肠埃希氏菌），诱导表达蛋白，具体的转入过程按照如下的步骤顺序依次进行：

a. 将10μL质粒加入100μL的BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min；

b. 42℃热激45s后，置冰盒中静置2min；

c. 加入500μL不含抗生素的LB培养基，37℃ 200rpm振荡培养60min；

d. 将含100mM AMP的LB平板，37℃放置2h备用；

e. 振荡培养后的菌液均匀涂布至上述平板培养基，37℃过夜培养；

f. 选取阳性菌落接种至含100mM AMP的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养16h，以1:100比例接入新鲜培养基后将其培养至对数期后，加入IPTG，于37℃的诱导温度下，诱导8h，诱导表达蛋白。用15%的尿素—SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测菌株的诱导表达产物，结果见图20。

实施例2-4 tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法

实施例2-4分别为一种tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法，实施步骤与实施例1相似，不同之处仅在于：

步骤3转化表达菌、目的基因的共表达，将pETDuet-1/tsh/iss质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，将其培养至对数期后，加入乳糖，诱导表达蛋白时的温度和时间不同，具体为：

实施例2，诱导温度18℃的下，诱导时间10h，诱导表达蛋白；

实施例3，诱导温度22℃的下，诱导时间24h，诱导表达蛋白；

实施例4，诱导温度39℃的下，诱导时间4h，诱导表达蛋白。

实施例5 tsh和iss双基因共表达菌株的应用方法

本实施例利用实施例1-4所提供的tsh和iss双基因共表达菌株制备工程菌疫苗，制备方法为现有的制备方法，制备的工程菌疫苗可以应用在防治禽大肠杆菌病中。

下面是利用实施例1-4所提供的tsh和iss双基因共表达菌株制备的工程菌疫苗在肉鸡中的应用实验：

AA⁺肉鸡按饲养手册饲养至14日龄，分为3组，即试验组、阴性对照组和灭活苗阳性对照组，试验组每只鸡通过股部肌肉注射给药，剂量为1.2×10⁸cfu/只（0.2mL），阴性对照组每只鸡通过股部肌肉注射0.2mL培养基，灭活苗阳性对照组每只鸡通过股部肌肉注射0.1mL甲醛灭活的APEC致病菌，每组33只鸡，注射免疫前每组鸡采血检测抗体，免疫后7d和14d采血检测抗体，具体结果见图21。

由图21可见试验组抗体增高水平明显高于阴性对照组，且高于阳性（灭活苗）对照组。抗体水平高低反映了鸡体抵抗大肠杆菌病的能力，一般抗体水平越高，鸡体抵抗大肠杆菌病能力越强。

实施例1-5，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北科星药业有限公司

<120> tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法及其应用

<130> 2017-07-13

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tsh基因上游引物

<400> 1

ccggaattca tgaacagaat ttattctctt cgc 33

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tsh基因下游引物

<400> 2

cccaagcttt cagaatgaat aacgaatatt agcgt 35

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> iss基因上游引物

<400> 3

ggaagatctt aggattctgc cgttttta 28

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> iss基因下游引物

<400> 4

ccgctcgagc atatcgatgg gcaacta 27

<210> 5

<211> 4134

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增后tsh基因目的片段

<400> 5

atgaacagaa tttattctct tcgctacagc gctgtggccc ggggctttat tgccgtatct 60

gagtttgcta ggaaatgtgt tcataagtct gtcagacgtc tgtgtttccc ggttttatta 120

ctgatcccgg tactattctc tgcaggaagt cttgcgggaa cggtcaataa tgaactcggg 180

tatcagttat ttcgtgattt tgctgaaaat aaggggatgt tccgcccggg ggcaacgaat 240

atcgctattt ataataagca gggagaattt gtcagtacgc tggataaggc agctatgcct 300

gatttcagtg ctgtggattc ggaaatcggt gtggcgacac tgataaaccc gcagtatatc 360

gccagcgtga aacataacgg gggatataca aacgttagct ttggtgatgg tgaaaaccgt 420

tacaatatcg tggaccggaa taatgcgccg tcactggatt ttcatgcccc ccggctggat 480

aaactggtga cagaggttgc ccctactgcg gtgacggcgc agggggcagt ggctggcgca 540

tatctggata aggagcgcta tcctgttttt tatcgtctgg ggtctggtac tcagtatatt 600

aaggacagta acggacagct gacaaaaatg ggaggtgcat attcctggct gaccggcggg 660

actgtcggta gcctgtcatc ctatcagaat ggagaaatga ttagcaccag ttcaggtctg 720

gtttttgatt acaaacttaa tggtgcaatg cccatttatg gcgaggccgg tgacagcggt 780

tcgcctttat ttgcttttga tactgttcag aataaatggg tgctggtcgg tgttcttact 840

gcggggaatg gcgcgggggg caggggaaat aactgggctg ttattccact ggattttatc 900

gggcagaaat ttaatgaaga caacgatgcc ccggtcacgt tcagaacatc ggaaggtggt 960

gcactggagt ggagctttaa cagcagtacc ggagctggtg cgctgacaca gggaaccacc 1020

acatatgcca tgcacgggca gcagggaaat gacctgaatg ctggtaagaa cctgatattt 1080

caggggcaga atggtcagat taaccttaag gattcggttt ctcagggggc gggttccctg 1140

acgttccgtg ataattacac agtaacaacc tctaacggaa gtacctggac cggtgccggt 1200

attgttgtgg acaacggggt gtccgtaaac tggcaggtta atggtgttaa gggcgataac 1260

ctgcataaaa ttggtgaagg tacgctgacg gtacagggta caggtattaa tgaaggtggc 1320

ctgaaggtcg gggacggaaa ggctgtactg aaccagcagg cggacaataa aggacaggtg 1380

caggcgttca gcagtgttaa tattgccagt ggccggccga ccgtggtact gactgatgag 1440

cggcaggtaa atccggatac cgtctcatgg ggatatcgtg ggggcacact ggatgttaat 1500

ggtaacagtc tgacgcttca tcagttgaag gcggcagatt atggtgccgt gctggcgaat 1560

aacgttgata aacgggccac tatcacgctg gactatgccc tgcgggctga caaagtagca 1620

ctgaatggct ggtcggaatc aggtaaagga actgccggaa atttatataa atacaataac 1680

ccgtacacaa atacgacgga ttacttcatc ctgaagcaga gcacctatgg ttatttcccc 1740

acggaccaga gcagcaacgc cacctgggag tttgtggggc acagtcaggg ggatgcacag 1800

aaactggtag ctgaccgttt caatactgca gggtatctgt ttcacggaca actgaaaggc 1860

aatctgaatg tggacaatcg cctgcctgaa ggcgttacca gtgctctggt gatggacgga 1920

gctgcggata tctccggtac attcacccag gaaaacgggc gtctgacgct gcaggggcat 1980

ccggttatcc atgcatacaa tactcagtct gtggctgtca aactggctgc cagtggagac 2040

cattcggttc tgactcagcc tacgtcattc agtcaggagg actgggagaa ccgcagtttt 2100

acctttgaca ggctgtcact gaagaacact gattttggtc ttggtcgcaa tgccacactg 2160

aacacaacca tccaggcaga taactccagc gtcacgctgg gcgacagccg ggtatttatc 2220

gacaaaaacg atggccaggg aacagccttt acccttgaag aaggcacatc tgttgcaact 2280

aaagatgcag ataaaagtgt cttcaacggc accgtcaacc tggataatca gtcagtgctg 2340

aatatcaatg atatattcaa tggcggaata caggcgaaca acagtaccgt gaatatctcc 2400

tcagacagtg ccgttctggg gaactcaaca ctgaccagta ccgccctgaa tctgaacaag 2460

ggagcaaatg ctctggccag tcagagtttt gtttctgacg gtccagtgaa tatttctgat 2520

gccaccctga gtctgaacag ccgtcctgat gaggtatctc acacactttt acctgtatac 2580

gattatgccg gttcatggaa cctgaaggga gacgatgccc gcctgaacgt ggggccgtac 2640

agtatgttgt caggtaatat caatgttcag gataaaggga ctgtcaccct cggaggggaa 2700

ggggaactga gtcctgacct gactcttcag aatcagatgt tgtacagcct gtttaacggg 2760

taccgcaata tctggagcgg gagcctgaat gcaccggatg ccaccgtcag catgacagac 2820

acccagtggt cgatgaacgg aaactccacg gcaggaaata tgaaacttaa ccggacaata 2880

gtcggtttta acgggggaac atcaccgttc acgacactga caacagataa tctggacgcg 2940

gttcagtcag catttgtcat gcgtacagac cttaacaagg cagacaaact ggtgataaac 3000

aagtcggcaa caggtcatga caacagcatc tgggttaact tcctgaaaaa accttctaac 3060

aaggacacgc ttgatattcc actggtcagc gcacctgaag cgacagctga taatctgttc 3120

agggcatcaa cacgggttgt gggattcagt gatgtcaccc ccatccttag tgtcagaaaa 3180

gaggacggga aaaaagagtg ggtcctcgat ggttaccagg ttgcacgtaa cgacggccag 3240

ggtaaggctg ccgccacatt catgcacatc agctataaca acttcatcac tgaagttaac 3300

aacctgaaca aacgcatggg cgatttgagg gatattaatg gcgaagccgg tacgtgggtg 3360

cgtctgctga acggttccgg ctctgctgat ggcggtttca ctgaccacta taccctgctg 3420

cagatggggg ctgaccgtaa gcacgaactg ggaagtatgg acctgtttac cggcgtgatg 3480

gccacctaca ctgacacaga tgcgtcagca gacctgtaca gcggtaaaac aaaatcatgg 3540

ggtggtggtt tctatgccag tggtctgttc cggtccggcg cttactttga tgtgattgcc 3600

aaatatattc acaatgaaaa caaatatgac ctgaactttg ccggagctgg taaacagaac 3660

ttccgcagcc attcactgta tgcaggtgca gaagtcggat accgttatca tctgacagat 3720

acgacgtttg ttgaacctca ggcggaactg gtctggggaa gactgcaggg ccaaacattt 3780

aactggaacg acagtggaat ggatgtctca atgcgtcgta acagcgttaa tcctctggta 3840

ggcagaaccg gcgttgtttc cggtaaaacc ttcagtggta aggactggag tctgacagcc 3900

cgtgccggcc tgcattatga gttcgatctg acggacagtg ctgacgttca tctgaaggat 3960

gcagcgggag aacatcagat taatggcaga aaagacagtc gtatgcttta cggtgtgggg 4020

ttaaatgccc ggtttggcga caatacgcgt ctggggctgg aagttgaacg ctctgcattt 4080

ggtaaataca acacagatga tgcgataaac gctaatattc gttattcatt ctga 4134

<210> 6

<211> 346

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 扩增后iss基因目的片段

<400> 6

taggattctg ccgtttttaa caatgcagga taataggatg aaaaaaatgt tattttctgc 60

cgctctggca atgcttatta caggatgtgc tcaacaaacg tttactgttg gaaacaaacc 120

gacagcagta acaccaaagg aaaccatcac tcatcatttc ttcgtttcgg gaattggaca 180

agagaaaact gttgatgcag ccaaaatttg tggcggtgca gaaaatgttg ttaaaacaga 240

aactcagcaa acattcgtaa atggattgct cggttttatc acttttggca tctatactcc 300

gctggaagcc cgagtatatt gctcacaata gttgcccatc gatatg 346

Claims (7)

1.一种tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于，它按照如下的步骤依次进行：

（Ⅰ）双基因克隆

以禽致病性大肠杆菌质粒为模板，利用PCR分别对温度敏感血凝素tsh基因和增强血清抵抗iss基因进行扩增，在PCR扩增过程中，

tsh基因的引物序列如下：

上游引物：5’-CCGGAATTCATGAACAGAATTTATTCTCTTCGC-3’，

下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGAATGAATAACGAATATTAGCGT-3’

iss基因的引物序列如下：

上游引物：5’-GGAAGATCTTAGGATTCTGCCGTTTTTA-3’，

下游引物：5’-CCGCTCGAGCATATCGATGGGCAACTA-3’；

（Ⅱ）tsh基因和iss基因连接pETDuet-1质粒

将扩增后的目的基因连接至克隆载体中，转化克隆菌、筛选阳性克隆、酶切后回收带有酶切位点的目的基因，将带有酶切位点的目的基因连接至表达载体中，转化克隆菌、筛选阳性克隆菌，提取鉴定后的pETDuet-1/tsh/iss质粒；

（Ⅲ）转化表达菌及目的基因的共表达

将pETDuet-1/tsh/iss质粒转入表达菌株BL21(DE3)中，诱导表达蛋白。

2.根据权利要求1所述的tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于：步骤（Ⅰ）中，所述PCR扩增tsh基因后，产物的长度为4134bp；扩增iss基因后，产物的长度为346bp。

3.根据权利要求1所述的tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于步骤（Ⅰ）中，所述PCR扩增tsh基因和iss基因的具体过程如下：

（Ⅰ1）将O78血清型的禽致病性大肠杆菌菌株划线接种于伊红美兰琼脂平板，37℃培养16h后，挑取单个菌落接种于 5mL LB液体培养基中，37℃ 200rpm振荡培养16h后提取质粒；

（Ⅰ2）以该质粒为模板，扩增tsh基因和iss基因；

PCR扩增tsh基因的体系为：模板5.0μL、2×HIFI Mix 30μL、10μmM上游引物和下游引物各3μL、ddH₂O 19μL；

PCR扩增iss基因的体系为：模板2.5μL、2×HIFI Mix 25μL、10μmM上游引物和下游引物各2.5μL、ddH₂O 17.5μL。

4.根据权利要求1所述的tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于步骤（Ⅰ）中,

①PCR扩增tsh基因的程序为：

T1：94℃、4min；

T2：94℃、40s；

T3：52℃、40s；

T4：68℃、4min；

T2-T4：30个循环；

T5：72℃、10 min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存；

②PCR扩增iss基因的程序为：

T1：95℃、5min；

T2：94℃、40s；

T3：53.7℃、30s；

T4：68℃、1min；

T2-T4：30个循环；

T5：72℃、10 min；扩增完成后，扩增产物于4℃保存。

5.根据权利要求1所述的tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于，步骤（Ⅱ）中，tsh基因和iss基因连接pETDuet-1质粒的具体制备过程按照如下的步骤顺序进行：

（Ⅱ1）tsh基因连接pGEM-T克隆载体，形成pGEM-T/tsh，并将其转化至Trans2-Blue感受态细胞中；

（Ⅱ2）挑取阳性克隆菌并提取质粒，酶切回收tsh基因；

（Ⅱ3）酶切回收的tsh基因连接pETDuet-1质粒，形成pETDuet-1/tsh质粒，并将其转化至Trans2-Blue感受态细胞中；

（Ⅱ4）iss基因连接pGEM-T克隆载体，形成pGEM-T/iss, 并将其转化至DH5α感受态细胞中;

（Ⅱ5）挑取阳性克隆菌提取质粒，酶切回收iss基因;

（Ⅱ6）酶切回收的iss基因与pETDuet-1/tsh质粒连接,形成pETDuet-1/tsh/iss质粒，并将其转化至DH5α感受态细胞中；

（Ⅱ7）鉴定阳性克隆菌，提取pETDuet-1/tsh/iss质粒。

6.根据权利要求1所述的tsh和iss双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于，步骤（Ⅲ）中，所述转化表达菌及目的基因的共表达过程如下：

将pETDuet-1/tsh/iss质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，将其培养至对数期后，加入IPTG或乳糖，于18-39℃的诱导温度下，诱导4-24h，诱导表达蛋白。

7.权利要求1-6中任意一项所述的tsh和iss双基因共表达菌株的应用，其特征在于：基于所述tsh和iss双基因共表达菌株制备的基因工程菌疫苗，在防治禽大肠杆菌病中的应用。