JPS62501675A - 方法及びワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 方法及びワクチン 本発明は、遺伝子、特に繊毛遺伝子９８７Ｐのクローニングベクター及びクロー ニング方法、並びに当該方法によって生産された繊毛を含むワクチンに閤するも のである。

技術的背景 ある種の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　が小腸内で繁殖することが原因で小豚新生児 の下痢が起こる。

このある梗の大腸菌は、小豚に下痢及び脱水症及び脱水症を引き起こし、時とし て死に至らしめる中毒性物質エンテロトキシンを合成する。これらの中毒性物質 エンテロトキシン合成能を有する大腸菌株は、小腸内で急激に繁殖することを特 徴とするが、それは、繊毛によって小腸の上皮に付着する細菌の能力によるもの である。

大腸菌の異なった繊毛の種類が新生児の下痢と関係しており、主なものとして、 Ｋ８８ａｃ、に８８ａｂ、に９９及び９８７Ｐがあげられる。Ｋ８８ａｃ、に８ ８ａｂ及びに９９の遺伝子は、プラスミド遺伝子であることが知られており、既 に、クローニングされている。しかしながら、繊毛９８７ＰをコーＰする遺伝子 は、まだクローン化されておらず、これらの遺伝子がプラスミド遺伝子であるの か染色体遺伝子であるのかいまだ決定されていない。

−ｍ又はそれ以上の繊毛を抗原として牝膓にワクチン接種することｋよって抗体 が生成され、小腸の小腸への中毒性物質エンテロトキシン生産能を有する大腸菌 の付着と繁殖、及び感染と関係し・た症状の発生が防止される。それ故ｋ、動物 に大規模〒ワクチン接種するのに充分量の繊毛の抗原を生産することが望まれる 。野生株の大腸菌から繊毛を分離するのは、大Ｍ菌の繊毛の数が少ないの１困難 フある。しかしながら、繊毛をコードする遺伝子を多次表ツラスミドベクターに より適当な宿主中でクローニング〒きれば、繊毛の発現は、１０−１００倍にな る。これらの線毛は、多ｉＫ分離することが１き、こうして生産された繊毛は、 ワクチン接８１に際して望ましくない副次的効果をもたらす野生タイツの中毒性 初旬エンテロトキシンを含んでいない。

９８７Ｐ遺伝子のクローニングは、不可能ではないとしても、きわめて困難であ ると考えられてきた。先ず、遺伝子の所在部所が決定されていないし、また、９ ８７Ｐの発現を可能とするために非常に大型のＤＮＡ断片が必要とされると考え られていた。大きいＤＮＡ断片は、多次製ｆラスミドベクター中ではきわ゛めて 不安定である。

発明の開示 本発明は、大型のＤＮＡ断片をクローニングするためのクローニングベクターの 作成方法を提供するもの１あり、この方法は、ＤＮＡの大型断片及び遺伝子座区 分をｐＢＲ又はｐＡＣＹＣ起源のベクターの如き多次與グラスミド中釦挿入する ことから成る。

ＩＲＩ／ｃ好適なりラスミドは、ｐＢ１２２、ｐＢＲ５２９及びｐＡＣＹＣ１８ ４である。

本発明は、繊毛９８７Ｐを発現させるクローニングベクターを作成する方法をも 提供するもの！ある。

本発明者らは、繊毛９８７Ｐを使用して、ｐＢＲプラスミドの如きクローニング ｆラスミドベクター中へ遺伝子座区分を挿入すると、そのようなベクター中で大 型ＤＮＡ断片のクローニングが安定化されるとい５結論を得た。

本発明の目的は、ｐＢＲ５２９／ｐａｒとして知られているｐＢＴＡ５９９を提 供することを目的としている。

更に１組換えシラスミド、ｐＢＴＡ２０１及びｐＢＴＡ２００を提供することを 目的としている。

他の目的は、繊毛蛋白質９８７Ｐをコードする遺伝子を含む遺伝子座区分のＤＮ Ａ断片を挿入したシラスミドから成るクローニングベクターを提供することであ る。

本発明は、繊毛も９８７Ｐを発現するクローニングベクターを作成するための方 法をも提供するもの１あり、その方法は、 （１）　遺伝子座区分を含むＤＮＡ断片を、ｐＢＩｔ３２９、ｐＢＲ３２２又は ｐＡＣＹＣ１８４の如き適宜のシラスミドに挿入すること、及び（Ｉｌｌ　＆毛 ９８７Ｐの発現遺伝子を含むＤＮＡ断片を、工程（１）のシラスミド中に挿入す ること、から成る。

最も好適な遺伝子座区分は、ミニＦプラスミドｐＭＬ３１から分離したＳＯＰ遺 伝子座〒あり、これは、Ａｕ５ｔｉｎ及びｗｉｅｒｚ−ｂｉｃｋｉ、シラスミド 、１０．７３−８１．１９８３、に記載されている。

本発明は、更に、本発明方法によって生産されたクローニングベクターによって 形質転換された形質転換微生物を提供する。本発明において使用する非常に好適 な微生物は、大Ｊｌ！菌フある。大腸菌が、繊毛蛋白質９８７Ｐを発現するクロ ーニングベクターによって形質転換されることがこの発明の特徴となっている。

％に、大腸菌が、ｐＢＴＡ２０１　Ｋよって形質転換されることは好適である。

本発明は、また、繊毛蛋白質９８７Ｐを発現するこの発明のクローニングベクタ ーを含むように変異させた大腸菌から成るワクチンを提供する。

あるいは、本発明のワクチンは、変異させた細菌を培養して分離した繊毛９８７ Ｐから成るもの〒ある。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明のベクターｐＢＴＡ５９９のＤＮＡ制限地図を示す。

第２図は、５２Ｋｂの挿入物及びベクター、ｐＢＴＡ２０１の制限地図を示す。

本発明の最良の実施態様 ミ＝Ｆプ２スミドｐＭＬ３１から分割した遺伝子座区分をｐＢＲ３２９に挿入す ることＫよって、クローニングベクターを作成した。

ｐＢＲ５２２から誘導されるシラスミドは、同じ分割に必要な機能を欠いている 。これは、ｐＢＲ３２２は、５０世代を越えて安定に維持されないことを意味す る。しかしながら、分割した遺伝子座は、細胞分裂に際して、シラスミドを正確 に分割するメカニズムをコードする。（Ｍｅａｃｏｋ及びＣｈｏｅｎ、　ＣＥＬ Ｌ、　２０゜５２９−８４２．１９８０及びＴｕｃｋｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、ｃＥ ＬＬ、　３８．１９１−２０１．１９８４）。

遺伝子座区分は、大腸菌のＦプラスミド上に所在すること（Ａｕｓｔｉｎ及びＷ ｉｅｒｚｂｉｃｋｉ、シラスミド、１０．７Ｍ−８１，１９８５）、そして、東 には、Ｆプラスミドの４６−４９．４Ｋｂの範囲に所在すること（Ｏｑ　及びＨ ｆｒａｈａ％Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ　、Ｓｃ　ｉ　、ＵＳＡ、　８０．４７８４−４７８８．１９８３）、 が知られている。この特定の遺伝子座区分は。ＳＯＰ遺伝子座として知られてい る。

切断部位にクローニングした。シラスミドｐＭＬ３１は、続いて、５ｍＭ　Ｎａ ｅｌ、１ｍＭ）リスｐＨ７，４，１ｍＭＭｇＳＯ４及び０．１　ｍＦＶで分解し た。分解物を０．８％アガロースゲル上で展開させ、ＮＡ４５ペーパー上に４． ＩＫｂ断片を溶出させた。４．ＩＫｂ断片と共Ｋ、分解物中に存在する約４．２ Ｋｂの断片が溶出された。

ＤＮＡは、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１を含むＴＥ中で６５Ｃで６０分間加熱するととｋよ って、ＮＡ４５に一／ぐ−から抽出した。ＮａＣ１の濃度を０．２Ｍま〒降下さ せ、ＤＮＡをフェノール、クロロホルムで抽出し、次い〒最終的にエタノールで 沈殿させた。ｐＢＲ３２９ベクターは、培養基塩緩衝液中でＰｖｕ　ＩＩで分解 し、続いて、Ｏ，ｌｆ）リスｐＨ８中フホス７アターゼ〒処理した。　約処理し たｐＢＲ３２９を、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ１ユニツトにより４Ｃ？−夜１　ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭＤＤＴ、１０ｍＭＭｇＣ１２及び１０ｍＭ）リスｐＨ８，０中 で連結させた。次いで、ＣａＣＡ！□処理したコンピテントＭＣ１０６１細胞を 形質転換させた。ＬＢ＋アンピシリン含有プレート上〒ｐＢＲ３２９を含むコロ ニーを選択し、ＬＢ＋クロラムフェニコール含有プレート上で挿入いることを確 認した。この断片は、遺伝子座区分を含むことから、ｐＢＲ３２９を安定化させ るのみならず、このベクターから誘導される組換え分子、例えば、大型ＤＮＡ挿 入やを含むｐＢＲ３２９を安定化させる。この新規ベクターは、ｐＢＴＡ５９９ と称し、第１図に示される。

ｔ　ｐＢＴＡ５９９０分析 ｐＢＴＡ５９９中にクローン化した大型ＤＮＡ断片の安定性及びこの大型シラス ミドの形質転換効率について調査した。

９８７ＰプラスミドのＤＮＡシイゾラリーを作成するに際して、６０．４Ｋｂグ ラスミド（ｐＢＴＡ２０１　）を分離した。

ｐＢＴＡ２０１から得た３３Ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片をｐＢＴＡ５９９中に挿入し て４１．３Ｋｂシラスミド（ｐＢＴＡ３６０）を生成させた。このプラスミドの 形質転換効率を、ｐＢＲ３２２及びｐＢＴＡ５９９と比較した。約１０ｎＨの各 プラスミド２００１ｎｌのＣａＣ１２−ｒ！処理したコンピテントＭＣ１０６１ 細胞を形質転換させた。結果を要約して表１に示す。

１１！１ ｐＢＲ３２２４２Ｋｂ　２．Ｏｘ　１０６ｐＢＴＡ５９９　８．４Ｋｂ　Ｌ３８ ｘ１０５ｐＢＴＡ３６０　４１．！Ｉ　Ｋｂ　２．４　Ｘ　１０’ｐＢＴＡ２０ １　６０．４Ｋｂ　Ｉ　Ｘ１０δシラスミドの大きさが増加するはど、形質転換 効率は減少−ｆ’る。６０．４ＫｂプラスミドｐＢＴＡ２０１の形質転換効率は 、ｐＢＲ５２２と比較して、３１ｏｇｓ低いだけ！あり、大型ＤＮＡ断片のクロ ーニングが充分可能フある。ｐｎ’ｒＡ２０１及びｐＢＴＡ　Ｓ　６０からの５ ２Ｋｂ及び５５ＫｂのＤＮＡ挿入物は、共に、形質転換及び多数世代を通じて安 定に維持された。

ｐＢＲ５２９（親ベクター）と比較してより大型のＤＮＡ断片を安定に保持しク ローン化１゛るｐＤＴＡｓ９９の能力が証明された。ヒ）　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｙ：　 Ｂａｍ　ＩＩ　ｉ％部分分解して大きいＤＮＡ断片を生成させた。分解は、ヒ） ＤＮＡ／Ｊ、ｇ当たり一ゼ処理したｐＢＴＡ５９９に連結した。各ベクターの約 ２５０　ｆｉｇがヒトＤＮＡ５μ＃と連結され、ＣａＣ１！２　テ処理したＭＣ １０６１Ｍ胞を形質転換させた。アンピシリン耐性コロニーを選び、プラスミド ＤＮＡＹ分離した。４８のｐＢＴｋ　５９９及びｐＢｎ　５２９組換え体からＤ ＮＡの挿入物サイズを比較した。ｐ１３ＴＡ　５９９からの挿入物の平均サイズ は、、　１６．２　Ｋｂフ、Ｉ）ＢＲ５２９からは５．２Ｋｂであった。

同じヒ）ＤＮＡ部分を使用したの↑、ｐＢＴＡ５９９は、その親ベクターｐＥ３ Ｒ３２９よりも大型の’ＤＮＡ断片を選択的にクローン化するようフある。それ 故に、ｐＢＲプラスミドへの遺伝子座区分の挿入は、より大型のＤＮＡ断片のク ローニングを安定化すると結論ずけられる。

重要なことは、より高度の底熱核、例えばヒトからのＤＮＡライブラリーを基に してプラスミドを作成することができることである。このことは、クロニングベ クターＣｏ５ｔｎｉｄの必要性がないことを示す。

９８７Ｐ遺伝子の所在 繊毛９８７Ｐをコードする遺伝子が、染色体又はプラスミド遺伝子１あるか決定 するために、次の実験を実施した。

９８７Ｐの野生タイプを大腸菌のに１２ＮｘＲ株とゾロス法によって一緒にした 。野性タイプの供与体及びに１２合で混合した。混合物を静止させて６７℃１１ 時間培養し、次いフ、かきまぜて中断した。混合物を羊の血液十Ｎａ１ａｄｉｘ ｉｃ　Ａｃ１ｄ寒天上に塗付した。接合体リスクＩＪ　−ニングは、９８７Ｐ抗 血清を用いた接合による９８７Ｐの発現テストによって実施した。多数の陽性コ ロニーが分離された。このことは、野性タイプの９８７Ｐ株のプラスミド取分の 一部を含んでいることを示す。これは、９８７Ｐ遺伝子が、染色体ＤＮＡ上に↑ はなくプラスミドＤＮＡ上に所在することを示すものである。

野性タイプ９８７Ｐ犬腸菌からのプラスミドＤＮＡライブラリーの作成 ９８７Ｐ大腸菌の野生タイプ分離菌から、大型プラスミドの収率な向上させるた めに改良したＨａｎｓｅｎ及び０１ｓｅｎの方法（Ｊ’、　１３ａｃｔｅｒｉｏ １．１６５．２２７−２５８゜１９７８）によって、プラスミドＤＮＡを分離し た。

プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　’ｌ　Ｂ　ａｎｔ　ｌ且で部分分解１して５０　Ｋｂよ り大型のＤ　Ｎ　Ａ断片を作成した。分解は、緩衝液中１５．６０．４５及び６ ０分の分解処理により実施して部分標品な得た。所望の断片サイズは、１５分の 分解物として得た。Ｉ）Ｂ’ｌ’Ａ３９９ベクターは、１３ａｍＨＩ↑緩衝液中 分解し、次いで、０．１　Ｍ）リスｐＨ８中でホスファターゼ処理しｒ、：、９ ８７１）の部分分解物を、１　ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐ、１０ｍＭ）リスｐｉ−１８， １０ｍＭ　ＭｇＣｌ１２及び１０ｍＭ　ＤＴＴ中で７４−ＤＮＡリガーゼ１単位 と４℃ｆ１液、ホスファターゼ処理したベクターに連結した。約２５０μＩベク ターは約５μｇの部分分解物に連結された。これ′ｔ％ＣａＣｌ２処理したコン ビテン）ＭＣ１０６１細胞を形質転換させた。ＡｐＲ−６その９４％はＴｅｔＳ の約４，０００コロニーが生成されたが、これらは、挿入されたＤＮＡ断片を含 んでいることを示す。

約５００のコロニーについて繊毛９８７Ｐに特異的な抗血清によるコロニーイミ ュノアツセイによって９８７Ｐの発現なスクリーニングした。

４つの陽性のコロニーが発見され、２つのタイプを得た。

２つのコロニーは、６８Ｋｂ挿入物（ｐＩ３ＴＡ２００　）を、他の２つのコロ ニーは、５２Ｋｂ挿入物（ｐＩ３ＴＡ２０１　）Ｙ含む。

５２Ｋｂ挿入物及びベクター（ｐＩＩＴＡ２０１　）の制限地図を第２図に示す 。

ｐＩ３ＴＡ　２０１から、繊毛９８７Ｐを発現するサシクローンは分離されない ので、９８７Ｐオペロユ〆は、ｐＢＴＡ２０１挿入物の広い領域に及んｆいよう 。

９８７Ｐワクチンの生産 繊毛９８７Ｐを発現する組換えプラスミド及び構造遺伝子を含む宿主を凍結乾燥 状態ｆ培養コレクションとして保存している。保存容器から細胞を再生させ、選 択栄養培地上に塗付して単一コロニーを生成させた。生育後。

９８７Ｐを発現するコロニーを血清−接合法で固定し、最も活性の高いコロニー を培養の接種菌を得ろために使用した。接種菌は、トリジトン酵母エキス及び炭 素源から成る培地を含む培養物の積として使用される。発酵は通常使用される標 準的方法及び操作で実行した。完了後、繊毛生産物は、細菌細胞からそのまま分 離し、不用の残渣は遠心分離した。繊毛懸濁液は、緩衝液受洗浄し、中空繊維紐 フィルターにより最終的に濃縮化した。

濃縮物は、品質管理及び力価評価の後、４℃で保存剤を用いて保存した。

油中水型エマルジョンワクチンの作成は、濃縮物９８７Ｐの容量を殺菌した抗原 成分及び保存剤と一緒に正確に無菌的に計量するととＫより実施される。水層は 、殺菌水により、殺菌油層の容量と同等まフ補完した。水層を事前に決定した割 合！油層に加え、高速均質化処理して最終製品を得た。

ワクチン試験 ９８７Ｐのエンテロト片シン生産能を有する大腸菌（ＥＴＥＣ）を使用した一連 のコントロール試験を、ワクチン非接種の牝豚又は繊毛９８７Ｐ抗原を含む大腸 酌ワクチンでワクチン接種した牝豚の乳を飲む小豚中１実施した。試験の目的な 次に示す。

ａ、９８７Ｐ　ＥＴＥＣＫよって引き起こされる下痢及び病死から、ワクチン接 種した牝豚の乳を飲むＪ＼豚を保ａすること、 ｂ、ワクチンを接種した牝豚の乳を飲む小豚の小腸における９８７Ｐ　ＥＴＥＣ の繁殖を減少させること、Ｃ，ワクチン接種した牝豚の初乳及び血清とそれらの 小豚の血清中の抗体力価 コントロール試験フ使用したワクチンは、Ｋ８８ａｃ。

Ｋ８８　ａｂ、　Ｋ９９及び９８７Ｐの４つの精製された繊毛抗体を油性補助薬 と一緒に含んでいる。

牝豚に妊娠中２度にわたつ【ワクチン又は偽薬を接種する（分娩前８週間及び１ −２週間）。小豚は実施の前は自然に授乳してもよい。５時間及び１３時間の後 、繊毛９８７Ｐを発現する二つのエンテロトキシン生産能を有する大腸菌混合物 を経口的に投与する。接種抛は、ｌＸ１０９の生育可能な細菌を含んフいた。

下痢の最初の診断は、視覚により評価した。実施して１６から２８時間後、選ば れた小腸１ｃ）き、下痢症状の有無により検査した。次の研究試験を下痢の原因 を確認するために実施した。

ａ、小腸の基部、中間部及び末端部における細菌数、ｂ、腸の同じ部分を組織羊 的にみて、病理学上の変化及びエンテロサイＨＣ付着する細菌の存在を同定した 。

Ｃ０構造上の粘着細胞の損傷を示す消化酵素（アルカリホスファクーゼ、ラクタ ーゼ）のレベル（例えは、ロタウィルス性下痢において、これらの酵素の濃度は 、著しく低くなる）。

特異的抗繊毛ＩｇＧ抗体力価を酵素イムノソルベントアッセイ法により決定した 。

結　果 ワクチン接種した礼服から生まれた少豚の２２．５％が軽い一時的下痢症状を示 しただけフあるが、コントロールの礼服からの小腸の１００ｑｂが重い下痢症状 を示した（表２）。２つのグループの差異は、非常に顕著であった（　Ｘ２＝　 ４０．９、ｐ＜ｏ、ｏ　ｏ　ｓ　）。

表２ ９８７Ｐ　ＥＴＥＣ投与に対するワクチンの有効性処理グループ　礼服数量　小 腸数量　下痢症の小腸数量コントロール　３　２６　２６（１００）ａワクチン 接種　４　４０　９（２２，５）ａａ、は、顕著な差異（Ｘ２＝４０．９、ｐ＜ ０．００５）を示す。

コントロールの全ての小腸の下痢は、非常ＶｃＮ＜、結果として生ずる脱水症状 （約１０ｑｂ）は、瀕死の重症であった。結果的には、残りのコントロールの小 腸は、投与後３２〜３６時間後死亡した。対照的Ｋ、ワクチン接種した礼服から の小腸は、投与後４６〜４８時間たって実験が終了した時点フも下痢症状を示さ なか？た。

かき取った粘膜の細菌数によって示される小腸末端の細菌の繁殖は、偽薬接種し た礼服の哨乳小豚に比較して、ワクチン接種した礼服の咄乳小豚の場合、非常に 顕著忙減少した（ｔ＝４．７．１４ｄ、ｆ、、ｐ＜０．Ｄ　ｏ　ｓ　）。

投与した小腸の臓器の組織病理学的知見フは、ワクチン接種した礼服、からの小 鉢フは、粘膜に対する大腸菌の付着はほとんどなかったのに対して、全てのコン トロールの小腸では、牟腸粘膜に大腸菌の顕著な付着がみられ、た。

消化酵素アラ七イ及び組織病理学的知見〒は、病状に対してウィルス畔関与して いないことが示された。

ワクチン接ｆｉした礼服の血清及び初乳の標品に、それらの小腸の血清標品と同 様、高い特異的抗９８７Ｐ抗体力価がみられたが、偽薬接種の礼服及びその小腸 で也ま非常に低い抗体レベルマあった（表３）。ワクチン接穂した礼服の咄乳児 とコントロール牝豚の咄乳児の平均力価の間の差異は、非常にＷＪ著〒、例えば 、ｔ＝１５．７．４６ｄ、５、ｐ＜ｏ、ｏｏｌ　’ｔ’あった。

大腸菌ワクチンに対する礼服及び、Ｊ・−豚の血清学的反応 抗９８７Ｐ　ＩｇＧ力価３ 礼服Ａ　処　理　ワクチン接種　分娩礼服　平均　９５０りＣ，Ｉ前礼服　小腸 　小腸 血清　血清　初乳　血清　力価 Ｃ５３：ｌントａ−ｈ　ｎｄ　７０　ｎｄ　＜３１　２８−５６１６４　コント ロール　５ａ　ｓ８　１３６　＜２８　１１−７１１８７　コントロール　＜２ ｓ　５ｏ　１１７　＜５４　２７−ａ２１１０　ワクチン接種　５０　１００９ 　９（１６５０４２０８−４４１８２ワクチン接９．　３０　５２１　８１９　 ２５７　１５９−３５２０６　ワクチン接＆　９４　７５７　５６２　５９９　 ４６８−７６２６１　ワクチン接物　＜２５　２４０７　８６９　８９５　７５ ３−１０９ａ、ＥＬＩＳＡ中の最大血清希釈度の逆数。

ｂ、相剰平均力価。相剰平均力価の計算を可能とするためＫ、試験した最小の血 清希釈度をＥＬＩＳＡＫ未反応の標品の力価として用いた。そのような標品を含 んだ乎均値は、〈で示される範囲にある。

ｃ、９５％Ｃ，１，，（信頼限界）：力価の９５％が存在する範囲（量±１．９ ６Ｓ／ｒｎ　）。

ｎｄ実験は実施していない。

これらの結果から、ワクチン接種した礼服の初乳の適量を咄乳した小７豚は、小 腸粘膜における９８７Ｐ　ＥＴＥＣの繁殖及びその、結果として起こる下痢から 確実に保護されることが判明した。

手続ネ市正；卦（方式） 昭和６２年５月　１日

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．大型ＤＮＡ断片と遺伝子座区分を多複製プラスミドベクターに挿入すること から成る大型ＤＮＡ断片をクローニングするためのクローニングベクターの作製 方法。
2. ２．当該大型ＤＮＡ断片が、少なくとも６０Ｋｂである請求の範囲第１項の方法 。
3. ３．遺伝子座区分を多複製プラスミドに挿入することを特徴とする繊毛９８７Ｐ 発現のためのクローニングベクターの作成方法。
4. ４．多複製プラスミドが、ｐＢＲタイプ又はｐＡＣＹＣタイプである請求の範囲 第３項の方法。
5. ５．プラスミドが、ｐＢＲ３２２である請求の範囲第４項の方法。
6. ６．プラスミドが、ｐＢＲ３２９である請求の範囲第４項の方法。
7. ７．プラスミドが、ｐＡＣＹＣ１８４である請求の範囲第４項の方法。
8. ８．（Ｉ）遺伝子座区分を含むＤＮＡ断片を適宜のプラスミド中に挿入すること 、及び （ＩＩ）（Ｉ）のプラスミド中に、繊毛９８７Ｐの発現遺伝子を含むＤＮＡ断片 を挿入すること、 から成る繊毛９８７Ｐを発現し得るクローニングベクターの作製方法。
9. ９．遺伝子座区分が、ミニＦプラスミドｐＭＬ３１から分離したＳＯＰ遺伝子座 である請求の範囲第８項の方法。
10. １０．請求の範囲第１〜第９項のいずれかの方法によって製造されたクローニン グベクター。
11. １１．遺伝子座区分を含むＤＮＡ切片及び繊毛９８７Ｐ蛋白質をコードする遺伝 子を含むＤＮＡ切片が挿入されたクローニングベクター。
12. １２．クローニングベクターｐＢＴＡ５９９。
13. １３．紺換えプラスミドｐＢＴＡ２０１及びｐＢＴＡ２００。
14. １４．請求の範囲第１０項のクローニングベクターにより形質転換された微生物 。
15. １５．微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である請求の範囲第１４項の微生物。
16. １６．クローニングベクターが繊毛９８７Ｐ蛋白質を発現し得る請求の範囲第１ ４〜第１５填のいずれかの微生物。
17. １７．クローニングベクターが、ｐＢＴＡ２０１である請求の範囲第１４〜第１ ６項のいずれかの微生物。
18. １８．請求の範囲第１〜第９項のいずれかの方法によって製造されるクローニン グベクターによつて形質転換された大腸菌を含むワクチン。
19. １９．繊毛９８７Ｐ蛋白質を発現し得るクローニングベクターによって形質転換 された大腸菌を含むワクチン。
20. ２０．繊毛９８７Ｐ蛋白質を発現し得るクローングベクターによって形質転換さ れた大腸菌の培養物から分離された繊毛９８７Ｐを含むワクチン。
21. ２１．精製繊毛抗体を９８７Ｐ及び製薬的に受け入れ可能な助剤又は坐薬から成 る豚新生児の下痢の処理又は防止に使用するためのワクチン。
22. ２２．精製繊毛抗体が、Ｋ８８ａｃ、Ｋ８８ａｂ及びＫ９９から選択される請求 の範囲第２１項のワクチン。
23. ２３．組換えＤＮＡ操作で製造された繊毛９８７Ｐ蛋白質。
24. ２４．繊毛９８７Ｐ単独又は一種以上の繊毛抗体と共に投与することから成る豚 新生児の下痢の調節方法。
25. ２５．繊毛抗体が、Ｋ８８ａｃ、Ｋ８８ａｂ及びＫ９９の一種以上である請求の 範囲第２４項の方法。
26. ２６．繊毛抗体と共に毒素を投与する請求項第２４〜第２５項のいずれかの方法 。
27. ２７．毒素が、熱安定性のＳＴ及び／又は熱不安定のＬＴ毒素である請求の範囲 第２６項の方法。
28. ２８．より高度の成熟核からのＤＮＡライブラリーにおいて請求の範囲第１０項 記載のクローニングベクターを使用する方法。