CN101690807A - 鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉及一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗及其制备方法。具体是用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌I型、II型及大肠埃希氏菌O78型接种于适宜培养基培养，经甲醛溶液灭活后，与油佐剂乳化制成。用于预防鸭的传染性浆膜炎和大肠埃希氏菌病。本发明的疫苗的制备方法操作简单，制备出的疫苗性能稳定，能有效的预防鸭传染性浆膜炎和鸭大肠杆菌病两种疾病。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉及一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的急性或慢性接触性、败血性传染病。鸭大肠埃希氏菌病(Escherchia coli)是由致病性大肠杆菌引起的出血性、渗出性和败血性的传染病。不同品种、天龄及性别的鸭群均可感染发病，而且这两种病通常混合并发感染。鸭发生传染性浆膜炎后，往往继发鸭大肠埃希氏菌病，导致鸭群大批死亡，给养殖场造成严重的经济损失。
鸭传染性浆膜炎又称为鸭疫里默氏杆菌病是目前造成养鸭业经济损失的最主要传染病之一，在全球范围内大多数有集约化养鸭生产的国家和地区均有本病发生，在我国几乎所有养鸭区都有发生。本病的发病率在5％-100％，死亡率通常为5％-70％或更高，鸭的易感天龄为10-30天。使用疫苗进行免疫接种是控制该病的有效措施，但鸭疫里默氏菌血清型众多，到目前为止，共报道有21个血清型(1-21型)，各血清型之间又没有交叉保护，这就要求使用疫苗的抗原血清型必须与生产中流行菌株的血清型一致。
鸭大肠杆菌病是由鸭埃希氏大肠杆菌引起的各种天龄鸭的急性败血性细菌病，以心包炎、气囊炎、肝周炎、腹膜炎为主要特征，在鸭群中常与鸭疫里默氏杆菌病伴发。鸭埃希氏大肠杆菌有O8、O15、O19、O73、O78等多个血清型普遍存在。
发明内容
本发明提供一种可以有效预防鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌的二联灭活疫苗的制备方法。
本发明的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)种子液的制备，将鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌基础种子分别接种于相应的培养基中进行培养，得到种子液；
(2)制苗用菌液的制备，在相应的培养基中接入步骤(1)得到的种子液进行培养得到；
(3)灭活，将步骤(2)得到的制苗用菌液进行灭活；
(4)疫苗的制备，在步骤(3)得到的灭活菌液中加入油佐剂等辅料，乳化分装，得到疫苗成品。
优选地，所述鸭疫里默氏杆菌疫苗株为I型和II型。
优选地，所述大肠埃希氏菌为O78型。
优选地，所述鸭疫里默氏杆菌的培养基为特制胰酶大豆培养基。特制胰酶大豆培养基的制备方法如下：胰蛋白胨，10g；大豆蛋白胨，10g；酵母浸出干粉，5g；葡萄糖，2g；NaCl，5g；调节pH值为7.4±0.2，补足水份至1000mL，分装后于121℃高压灭菌20min，置4℃冰箱备用，使用前加入适量的无菌鸭胚浸出液。制备TSA固体培养基时，在其中另外加入琼脂粉15g，同样高压灭菌，冷却至适宜温度，加入适量的预先温育的无菌鸭胚浸出液。无菌操作倒入灭菌平皿中，制成平板，室温凝固后，倒置4℃冰箱备用。
优选地，所述大肠埃希氏菌的培养基为改良马丁肉汤培养基。改良马丁肉汤培养基的制备方法如下：改良马丁汤(pH 7.4±0.2)，牛肉汤500ml，猪胃消化液500ml，NaCl 2.5g。上述成分混合后，以NaOH调节pH值为7.4±0.2，煮沸20-40分钟，补足水份至1000ml，冷却沉淀，抽取上清液，经滤纸过滤，滤液应为澄清，淡黄色。按需要量分装后，于116℃高压灭菌30min，置4℃保存备用，用前加入0.03-0.06％的无菌辅酶。制备改良马丁固体培养基时，在其中另外加入琼脂粉15g，加热熔化后，分装到小试管中，高压灭菌。或分装到三角瓶中高压灭菌后，冷却到适宜温度加入0.03-0.06％的无菌辅酶并混匀后制备平皿，室温凝固并无菌检验合格后，置4℃保存备用。
为了更完善本发明的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌的二联灭活疫苗的制备方法，在步骤(1)得到种子液后和步骤(2)得到制苗用菌液后都还包括检验提纯的步骤。
优选地，所述步骤(3)中是用甲醛溶液灭活菌液。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤(4)中制备出的疫苗为油乳剂灭活疫苗。
本发明还提供一种用上述制备方法制备而来的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗。
本发明的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗采用的种子菌是经过血清学调查，严格筛选出来的。能有效预防鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌。本发明的疫苗制备方法简单，产品效果稳定。而且鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗单次注射，可以有效预防鸭传染性浆膜炎和鸭大肠杆菌病两种疾病的目的，省时省事，预防效率高。
下面将详细介绍本发明的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗及其制备方法。
具体实施方式
本发明的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗采用的种子菌是经过血清学调查，严格筛选出来的。鸭疫里默氏杆菌是通过细菌的分离纯化、RA 16sRNA基因的克隆、生化实验、动物试验以及血清学等一系列的实验共分离鉴定了148株鸭疫里默氏杆菌，其中RA 1型菌56株(占分离菌的37.84％)，RA 2型菌32株(占分离菌的21.62％)，其它血清型60株(占分离菌的40.54％)。在分离的菌中RA1和RA2两个血清型占有绝对的优势。在对已有的RA1型和RA2型菌株进行免疫原性检测，成功筛选出免疫原性良好的I型和II型各一株鸭疫里默氏杆菌作为制备疫苗的候选株。对鸭疫里默氏杆菌分离鉴定的同时，对大肠埃希氏菌也进行了分离鉴定，通过细菌的分离纯化、生化实验、动物试验以及大肠埃希氏菌单因子血清的凝集实验等一系列的检测表明，成功分离鉴定了近百株大肠埃希氏菌，O8、O15、O19、O73、O78等多个血清型都普遍存在，总数占到分离菌的90％以上，其中O78占到总数的35.7％(35/98)，试验结果表明O78为主要的血清型。在对35株大肠埃希氏菌O78株进行的免疫原性试验后，成功筛选到一株大肠埃希氏菌作为制备疫苗的候选株。
本发明的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗是用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌I型、II型及大肠埃希氏菌O78型作为种子菌接种于适宜培养基培养，经甲醛溶液灭活后，与油佐剂乳化制成。用于预防鸭的传染性浆膜炎和大肠埃希氏菌病。
制备实施例：
1培养基
1.1鸭疫里默氏杆菌培养基
鸭疫里默氏杆菌采用特制胰酶大豆液体培养基培养。
1.2大肠埃希氏菌培养基
大肠埃希氏菌采用改良马丁肉汤培养。
2半成品的制备
2.1鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌
2.1.1生产种子的制备
取出鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌基础种子各1瓶，划线接种于相应的培养基上，37℃培养24小时，选取典型菌落5-10个混合于TSB肉汤中，接种鲜血斜面上，置37℃培养24小时，保存于4℃冰箱，经检验纯粹后作为生产种子批。保存期不超过7d。
2.1.2工作种子液的制备
将生产种子接种于适量的相应的培养基中，37℃振荡培养24小时，经检验纯粹后作为工作种子液。置4℃保存不超过3d。
2.1.3制苗用菌液制备
按培养基的量接入5％-10％的种子液37℃培养8-14小时。
2.1.4纯粹检验及活菌计数
菌液培养完成后，取样用相同的培养基进行纯粹检验。按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录15进行，应纯粹。同时作活菌计数，按附录17进行。各菌活菌数应不低于3×1010CFU/ml。
2.1.5灭活
加入0.2-0.6％的甲醛溶液，经37℃灭活24-48小时，然后用特制的胰酶大豆固体及液体培养基、马丁肉汤、马丁斜面、血斜面、沙氏培养基斜面进行灭活检验，并对液体培养物移植一代，应无菌生长。
3油乳剂灭活疫苗的制备
3.1油相的制备
注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸铝2份，配油相时，先取少量白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与司本-80及白油混合均匀，116℃灭菌30分钟备用。
3.2水相的制备
经116℃30分钟灭菌的吐温-80 4份，冷却至室温时加入96份菌液，充分振摇，使吐温-80完全溶解为止。
3.3乳化
按油水2∶1的比例将水相和油相混合，并预混4小时以上。8000rpm高速线性剪切乳化。在终止乳化前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。
2.4分装
乳化结束后，取样做物理性状检查，合格后定量分装。
疫苗成品的检验：
物理性状：
外观为乳白色乳剂。
剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，以后各滴均应不分散。
稳定性，取疫苗10ml装入离心管内，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层，管底析出的水相应不大于0.5ml。
粘度，取1ml吸管(下口的内径1.2mm，上口内径2.7mm)，吸取25℃疫苗1ml，垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，应不超过8秒。
无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
安全检验：用3天龄健康鸭10只，各颈部皮下注射疫苗1ml，观察14天，应不出现因注射疫苗而引起的局部或全身不良反应。
效力检验：3天龄健康鸭30只，各颈部皮下注射疫苗0.5ml；同时设30只作为非免疫对照。3周后，免疫鸭和非免疫鸭各随机分为三组，各分别肌肉注射致死量鸭疫里默氏杆菌和大肠埃希氏菌的强毒菌液，观察14天，各组对照鸭死亡6/10以上，免疫鸭至少健活6/10。
甲醛、硫柳汞含量测定：按《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用生物制品通则的规定。
贮藏：在2-8℃保存。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)种子液的制备，将鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌基础种子分别接种于相应的培养基中进行培养，得到种子液；
(2)制苗用菌液的制备，在相应的培养基中接入步骤(1)得到的种子液进行培养得到；
(3)灭活，将步骤(2)得到的制苗用菌液进行灭活；
(4)疫苗的制备，在步骤(3)得到的灭活菌液中加入要用辅料，混合、分装，得到疫苗成品。
2.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌分别为I型和II型。
3.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述大肠埃希氏菌为O78型。
4.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌的培养基为特制胰酶大豆液体培养基。
5.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述大肠埃希氏菌的培养基为改良马丁肉汤培养基。
6.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)得到种子液后和步骤(2)得到制苗用菌液后都还包括检验提纯的步骤。
7.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中是用甲醛溶液灭活菌液。
8.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(4)中制备出的疫苗为油乳剂灭活疫苗。
9.一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗，其特征在于，是用权利要求1所述的制备方法制备而来。
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