CN104623650A - 鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法及其制品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法及其制品。该方法包括如下步骤：用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌I型、II型及大肠埃希氏菌O78型接种于适宜培养基培养，经甲醛溶液灭活后，与油佐剂乳化制成。用于预防鸭的传染性浆膜炎和大肠埃希氏菌病。本发明的疫苗的制备方法操作简单，制备出的疫苗性能稳定，能有效地预防鸭传染性浆膜炎和鸭大肠杆菌病这两种疾病。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉及一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法及其制品。
背景技术
鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的急性或慢性接触性、败血性传染病。鸭大肠埃希氏菌病(Escherchia coli)是由致病性大肠杆菌引起的出血性、渗出性和败血性的传染病。不同品种、天龄及性别的鸭群均可感染发病，而且这两种病通常混合并发感染。鸭发生传染性浆膜炎后，往往继发鸭大肠埃希氏菌病，导致鸭群大批死亡，给养殖场造成严重的经济损失。
鸭传染性浆膜炎又称为鸭疫里默氏杆菌病是目前造成养鸭业经济损失的最主要传染病之一，在全球范围内大多数有集约化养鸭生产的国家和地区均有本病发生，在我国几乎所有养鸭区都有发生。本病的发病率在5%-100%，死亡率通常为5%-70%或更高，鸭的易感天龄为10-30天。使用疫苗进行免疫接种是控制该病的有效措施。
鸭大肠杆菌病是由鸭埃希氏大肠杆菌引起的各种天龄鸭的急性败血性细菌病，以心包炎、气囊炎、肝周炎、腹膜炎为主要特征，在鸭群中常与鸭疫里默氏杆菌病伴发。鸭埃希氏大肠杆菌有O8、O15、O19、O73、O78等多个血清型普遍存在。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌的二联灭活疫苗的制备方法及其制品。
为了达成上述目的，本发明提供一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
（1）种子液的制备，将鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌基础种子分别接种于相应的血清含量为3wt%~5wt %的培养基中进行培养，得到种子液；
（2）制苗用菌液的制备，在相应的血清含量为2wt%~3wt%的培养基中接入步骤（1）得到的种子液进行培养得到；
（3）灭活，将步骤（2）得到的制苗用菌液进行灭活；
（4）疫苗的制备，在步骤（3）得到的灭活菌液中加入4wt%的吐温-80并与矿物油佐剂混合、乳化、分装，得到油乳剂灭活疫苗成品。
优选地，其中所述鸭疫里默氏杆菌疫苗株为I型和II型，且所述鸭疫里默氏杆菌I和II型菌的培养条件为：发酵罐37℃培养10-12h，培养菌液的OD值达到30-40。
优选地，其中所述大肠埃希氏菌为O78型，且所述大肠埃希氏菌的培养条件为：发酵罐37℃培养6-8h，培养菌液的OD值达到30以上。
优选地，其中所述鸭疫里默氏杆菌的培养基为特制胰酶大豆培养基。特制胰酶大豆培养基的制备方法如下：胰蛋白胨，10g；大豆蛋白胨，10g；酵母浸出干粉，5g；葡萄糖，2g；NaCl，5g；调节pH值为 7.4±0.2，补足水分至1000mL，分装后于121℃高压灭菌20 min，置4℃冰箱备用，使用前加入适量的无菌鸭胚浸出液。制备TSA固体培养基时，在其中另外加入琼脂粉15 g，同样高压灭菌，冷却至适宜温度，加入适量的预先温育的无菌鸭胚浸出液。无菌操作倒入灭菌平皿中，制成平板，室温凝固后，倒置4℃冰箱备用。
优选地，所述大肠埃希氏菌的培养基为改良马丁肉汤培养基。改良马丁肉汤培养基的制备方法如下：改良马丁汤（pH 7.4±0.2），牛肉汤500ml，猪胃消化液500ml ，NaCl 2.5g 。上述成分混合后，以NaOH调节pH值为 7.4±0.2，煮沸20－40分钟，补足水分至1000ml，冷却沉淀，抽取上清液，经滤纸过滤，滤液应为澄清，淡黄色。按需要量分装后，于116℃高压灭菌30 min，置4℃保存备用，用前加入0.03-0.06wt%的无菌辅酶。制备改良马丁固体培养基时，在其中另外加入琼脂粉15 g，加热熔化后，分装到小试管中，高压灭菌。或分装到三角瓶中高压灭菌后，冷却到适宜温度加入0.03-0.06wt%的无菌辅酶并混匀后制备平皿，室温凝固并无菌检验合格后，置4℃保存备用。
为了更完善本发明的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌的二联灭活疫苗的制备方法，在步骤（1）得到种子液后和步骤（2）得到制苗用菌液后都还包括检验提纯的步骤（活菌计数、灭活及灭活检验等（方法按兽药典2010版进行））。
优选地，其中步骤（4）所述矿物油佐剂与灭活菌液的油水比是2：1，且矿物油佐剂为Marc-52白油佐剂。
优选地，其中步骤（3）中所述的灭活为：鸭疫里默氏杆菌中加入0.3wt%~0.4wt%的甲醛溶液，经37℃灭活18-24小时；大肠埃希氏菌中加入0.3wt%~0.4wt%的甲醛溶液，经37℃灭活48-54小时。
本发明还提供一种用上述制备方法制备而来的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗。
本发明的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗采用的种子菌是经过血清学调查，严格筛选出来的。能有效预防鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌。本发明的疫苗制备方法简单，产品效果稳定。而且鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗单次注射，可以有效预防鸭传染性浆膜炎和鸭大肠杆菌病两种疾病的目的，省时省事，预防效率高。
附图说明
图1A为鸭疫里默氏杆菌I型菌株的生长曲线测定图之一；
图1B为鸭疫里默氏杆菌I型菌株的生长曲线测定图之二；
图1C为鸭疫里默氏杆菌I型菌株的生长曲线测定图之三；
图2A为鸭疫里默氏杆菌II型菌株的生长曲线测定图之一；
图2B为鸭疫里默氏杆菌II型菌株的生长曲线测定图之二；
图2C为鸭疫里默氏杆菌II型菌株的生长曲线测定图之三；
图3A为大肠杆菌的生长曲线测定图之一；
图3B为大肠杆菌的生长曲线测定图之二；
图3C为大肠杆菌的生长曲线测定图之三。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。本发明所采用的生物材料鸭疫里默氏杆菌I型和II型，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）。本发明所采用的生物材料大肠埃希氏菌为O78型，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）。
应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
本发明的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗是用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌I型、II型及大肠埃希氏菌O78型作为种子菌接种于适宜培养基培养，经甲醛溶液灭活后，与油佐剂乳化制成。用于预防鸭的传染性浆膜炎和大肠埃希氏菌病。
一、制备实施例：
1 培养基
1.1 鸭疫里默氏杆菌培养基
鸭疫里默氏杆菌采用特制胰酶大豆液体培养基培养。
1.2 大肠埃希氏菌培养基
大肠埃希氏菌采用改良马丁肉汤培养。
2 半成品的制备
2.1鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌
2.1.1生产种子的制备
取出鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌基础种子各1瓶。鸭疫里默氏杆菌菌种用特制胰酶大豆液体培养基回溶至冻干前的体积，划线接种于特制胰酶大豆固体培养基平皿上，含5% CO2的环境下37℃培养24小时，选取典型菌落接种特制胰酶大豆固体培养基斜面上，置37℃培养24小时，保存于2-8℃冰箱，经检验纯粹后作为一级种子。一级种子接种于适量的特制胰酶大豆液体培养基（含3wt%~5wt%新生牛血清）中，37℃振荡培养20-22h，经检验纯粹后作为二级种子。
大肠埃希氏杆菌菌种用改良马丁肉汤回溶至冻干前的体积，划线接种改良马丁平皿上， 37℃培养18小时，选取典型菌落接种改良马丁斜面上，置37℃培养18小时，保存于2-8℃冰箱，经检验纯粹后作为一级种子。将一级种子接种于适量的改良马丁肉汤中，37℃振荡培养18h，经检验纯粹后作为二级种子。
2.1.2 工作种子液的制备
按培养基总量的3wt%~5 wt %将生产种子接种于适量的相应的培养基中，37℃振荡培养24小时，经检验纯粹后作为工作种子液。
2.1.3制苗用菌液制备
在进行鸭疫里默氏杆菌培养时，按培养基总量的5wt%-10wt%加入生产种子，全自动发酵罐37℃培养。鸭疫里默氏杆菌I和II型菌发酵罐37℃培养10-12h，培养菌液的OD值达到30-40（见图1 A、图1B、图1 C、图2A、图2B、图2C）。在进行大肠埃希氏菌培养时，按培养基总量的5wt%-10wt%加入生产种子，全自动发酵罐37℃培养6-8h，培养菌液的OD值达到30以上（见图3 A、图3B、图3 C）。
2.1.4纯粹检验及活菌计数
菌液培养完成后，取样用相同的培养基进行纯粹检验。按《中华人民共和国兽药典》（2005年版）附录15进行，应纯粹。同时作活菌计数，按附录17进行。
2.1.5 灭活
鸭疫里默氏杆菌中加入0.3wt%~0.4wt%的甲醛溶液，经37℃灭活18-24小时；大肠埃希氏菌中加入0.3wt%~0.4wt%的甲醛溶液，经37℃灭活48-54小时，然后用特制的胰酶大豆固体及液体培养基、马丁肉汤、马丁斜面、血斜面、沙氏培养基斜面进行灭活检验，并对液体培养物移植一代，应无菌生长。
3 油乳剂灭活疫苗的制备
3.1 油相的制备
注射用白油94份、司本-80 6份、硬脂酸铝2份，加热溶解混合均匀，116℃灭菌30分钟备用。
3.2 水相的制备
无菌的吐温-80 4份加入96份菌液，充分振摇，使吐温-80完全溶解为止。
3.3 乳化
按油水2：1的比例将水相和油相混合，并预混4小时以上。8000rpm高速线性剪切乳化。在终止乳化前加入1wt%硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01wt%。
3.4 分装
乳化结束后，定量分装。
疫苗成品的检验：
物理性状：外观为乳白色乳剂。
剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，以后各滴均应不分散。
稳定性，取疫苗10ml装入离心管内，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层，管底析出的水相应不大于0.5ml。
粘度，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
安全检验：用3天龄健康鸭10只，各颈部皮下注射疫苗1ml，观察14天，应不出现因注射疫苗而引起的局部或全身不良反应。
效力检验：3天龄健康鸭30只，各颈部皮下注射疫苗0.5ml；同时设30只作为非免疫对照。3周后，免疫鸭和非免疫鸭各随机分为三组，各分别肌肉注射致死量鸭疫里默氏杆菌和大肠埃希氏菌的强毒菌液，观察14天，各组对照鸭死亡6/10以上，免疫鸭至少健活6/10。
甲醛、硫柳汞含量测定： 按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用生物制品通则的规定。
贮藏：在2-8℃保存。
二、效果实施例
用本发明方法制备的疫苗免疫30只3日龄鸭，在免疫后21天，连同相同条件下饲养的对照鸭，每组10只，分别用相对应的强毒攻击，攻毒后14天剖检存活鸭。结果显示：制品接种鸭后，对对应强毒的攻击均具有良好的保护效果，免疫保护均达7/10以上，对照鸭死亡数大于等于6/10。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）种子液的制备，将鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌基础种子分别接种于相应的血清含量为3wt%~5wt %的培养基中进行培养，得到种子液；
（2）制苗用菌液的制备，在相应的血清含量为2wt%~3wt%的培养基中接入步骤（1）得到的种子液进行培养得到；
（3）灭活，将步骤（2）得到的制苗用菌液进行灭活；
（4）疫苗的制备，在步骤（3）得到的灭活菌液中加入4wt%的吐温-80并与矿物油佐剂混合、乳化、分装，得到油乳剂灭活疫苗成品。
2.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌分别为I型和II型，且所述鸭疫里默氏杆菌I和II型菌的培养条件为：发酵罐37℃培养10-12h，培养菌液的OD值达到30-40。
3.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述大肠埃希氏菌为O78型，且所述大肠埃希氏菌的培养条件为：发酵罐37℃培养6-8h，培养菌液的OD值达到30以上。
4.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌的培养基为特制胰酶大豆液体培养基。
5.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述大肠埃希氏菌的培养基为改良马丁肉汤培养基。
6.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤（1）得到种子液后和步骤（2）得到制苗用菌液后都还包括检验提纯的步骤。
7.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的灭活为：鸭疫里默氏杆菌中加入0.3wt%~0.4wt%的甲醛溶液，经37℃灭活18-24小时；大肠埃希氏菌中加入0.3wt%~0.4wt%的甲醛溶液，经37℃灭活48-54小时。
8.如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述矿物油佐剂与灭活菌液的油水比是2：1，且矿物油佐剂为Marc-52白油佐剂。
9.如权利要求8所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述矿物油佐剂为油水比是2：1的Marc-52白油佐剂。
10.一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗是通过权利要求1-9任一所述的制备方法制得。
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