CS276528B6 - Inaktivovaná vakcína proti virovým původcům reprodukčních poruch u prasnic a způsob její přípravy - Google Patents

Abstract

Řešení se týká inaktivované vakcíny proti reprodukčním poruchám u prasnic, charakterizovaných tzv. SMEDI syndromem. Vakcína sestává ze dvou virových složek: parvoviru prasat a enteroviru prasat. Typ enteroviru je volen tak, aby byla zabezpečena imunita proti převalujícímu typu. Vakcína se připravuje tak, že se oba virové antigeny pomnožují izolovaně na primárních buněčných kulturách prasečích ledvin. Pomnožené virové suspenze se klarifikují odstředěním a titrují se na přítomnost viru. K inaktivaci virů se s výhodou používá formalin. Suspenze inaktivovaných antigenů v udržova- ■ cím médiu se mísí s lipoidním adjuvans v poměru: 1 obj. díl inaktivovaného parvoviru, 1 obj. díl inaktivovaného enteroviru a 1 obj. díl lipoidního adjuvans.

Description

Předmětem vynálezu Je bivalentní inaktivovaná vakcína proti významným virovým původcům reprodukčních poruch u prasnic, parvoviru a enteroviru, a způsob její přípravy.

Vakcína Je určena k imunoprofylaxi prasnic proti parvoviru a enteroviru, které Jsou příčinami reprodukčních poruch, charakterizovaných tzv. SMEDI syndromem. Hlavními příznaky syndromu Jsou potraty, odúmrť a mumifikace plodů, rození málo životných selat a následná snížená plodnost. Obranou proti uvedeným infekcím Jsou především humorální protilátky, jejichž tvorbu lze navodit parenterální inokulací inaktivovaných virů, stimulovaných . vhodnými adjuvantii.

Imunizace proti parvoviru byla dosud řešena vývojem různých druhů vakcín. Nedostatkem těchto vakcín Je, že zabezpečují ochranu pouze proti Jednomu z původců.

Serologickým a virologickým vyšetřením v chovech se zvýšeným výskytem mrtvě rozených selat bylo prokázáno značné rozšíření prasečího enteroviru typu 6.

Na základě epizootologických rozborů bylo zjištěno, že se oba viry v chovech prasat vyskytují paralelně a klinické projevy mohou být vyvolány souběžným účinkem obou původců. Vývoj bivalentní vakcíný proti parvoviru a enteroviru, který je cílem vynálezu, je proto motivován snahou o zabezpečení imunoprofylaxe proti SMEDI syndromu v plné šíři.

Zárukou splnění uvedeného požadavku je inaktivovaná vakcína proti virovým původcům reprodukčních poruch u prasnic, charakterizovaných SMEDI syndromem, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že inaktivovaná vakcína sestává ze stejných objemových dílů suspenze inaktivovaného parvoviru prasat v udržovacím médiu, suspenze inaktivovaného enteroviru prasat typu 6 v udržovacím médiu a lipoidního adjuvans, obsahujícího ve 100 objemových dílech 5 obj. dílů lipofilního neionogenního tenzidu ze skupiny polyoxyethylenesterů nebo polyoxyethylensorbitanesterů kyseliny laurové, palmitové, stearové nebo olejové, s výhodou polyoxyethýlensorbitanmonooleátu, 45 obj. dílů parafinového oleje a 50 obj. dílů fyziologického roztoku.

Podstata způsobu přípravy této bivalentní vakcíny, který Je rovněž předmětem vynálezu, spočívá v tom, že se uvedené virové antigeny pomnožují každý zvlášť na primárních buněčných kulturách epitelu prasečích ledvin, známým způsobem klařifikují, inaktivují formalinem a po smísení emulgují v lipoidním adjuvans.

Charakteristika použitých virových kmenů: ·

Parvovirus 42/82 P byl izolován z placenty prasnice poražené v raném stadiu březosti z chovu s endemickým výskytem reprodukčních poruch. Identifikace viru byla provedena serologicky srovnáním se sbírkovým kmenem parvoviru prasat. Kmenový virus je udržován ve zmrazeném stavu při -70 °C.

Enterovirus 42/82 E byl izolován z fétu prasnice poražené v raném stadiu březosti z chovu s endemickým výskytem reprodukčních poruch. Virus byl serologicky typizován Jako 6. typ prasečího enteroviru. K typizaci byla použita sada typových sér připravených imunizací králíků sbírkovými kmeny prasečích enterovirů. Kmenový virus je udržován ve zmraženém stavu při -70 °C.

Množení parvoviru .

Virus je množen na rozrůstajících se primárních kulturách prasečích ledvin. Buňky získané trypsinací fragmentů prasečích ledvin Jsou suspendovány v živném médiu a nasazeny v denzitě 10$ v 1 ccm do kultivačních nádob. Inkubace probíhá v termostatu při +37 °C. Za 24 h jsou kultury kontrolovány pod mikroskopem a pokud jsou na stěně nádob zjišťovány drobné ostrůvky nově narostlých buněk, je kultura vhodná k infekci parvovirem.

Virus je přímo aplikován do média rozrostlých buněčných kultur v 5%ním objemu kultivačního média. Virus se množí pozvolna, největší koncentrace dosahuje cca po 5 denní inkubaci, kdy se paušálně sklízí. V průběhu inkubace se buněčná kultura postupně rozrůstá a souběžně se virus pomnožuje bez výrazného cytopatogenního efektu. Po skončení inkubace se kultura zmrazí při teplotě nižší než -20 °C. K uvolnění viru se doporučuje kultivační láhve * * . CS 276 528 B6 2

2x až 3x zmrazit a opět rozmrazit, načež se virová suspenze lehce odstředí. Koncentrace viru se stanoví hemaglutinačním testem s morčecími krvinkami. Specifita viru se ověřuje hemaglutiňačně inhibičním testem se sérem monospecificky pozitivním na parvovirus. Virus, který bude zpracován na vakcínu v průběhu 14 dnů lze ponechat v chladírně při +4 °C, při delším skladování se zmražuje na -20 °C.

Množení enteroviru

Virus je pomnožován na kompletním porostu buněčné kultury epitelu prasečích ledvin. Buňky získané trypsinací tkáňových fragmentů jsou suspendovány do živného média a nasazeny v denzitě 10$ v 1 ccm do kultivačních nádob. Kultury jsou inkubovány při teplotě 37 °C až do dosažení kompletního porostu na stěně lahví, což bývá obvykle za 4 dny. Živné médium je slito a nahrazeno udržovacím médiem bez séra a kultury jsou připraveny k infekci virem.

Virus je inokulován přímo do udržovacího média v množství 2 až 3 % objemu kultivačního média v nádobě.

Enterovirus se vyznačuje rychlým růstem doprovázeným typickým cytopatogenním efektem charakterizovaným zakulacováním buněk a jejich uvolňováním ze skla. Po úplném rozpadu buněčné kultury se lahve s narostlým virem jednou zmrazí na -20 °C a po rozmražení se mírným odstředěním vyčeří. Koncentrace viru v suspenzi je ověřována titrací na primárních buněčných kulturách prasečích ledvin ve zkumavkách. K přípravě vakcíny je vhodný virus o titru minimálně 10’5 ΤΟΠ^θ/Ο,Ι ccm.

Specifita viru se ověřuje seroneutralizačním testem se specifickým sérem na prasečí enterovirus typu 6. Vytitrovaný virus s ověřenou sterilitou a specifitou je připraven k výrobě vakcíny. Virus lze skladovat 14 dnů při teplotě +2 °C, při delším skladování,se doporučuje zmrazit při -20 °C. ’

Příprava vakcíny

Inaktivace parvoviru a enteroviru probíhá odděleně. K virovým suspenzím se za stálého míchání pozvolna přidává při pokojové teplotě zředěný formalin (10 %), a to na 100 ml virové suspenze 1 ccm zředěného formalínu tak, aby bylo dosaženo výsledné koncentrace formalínu 0,1 %. Inaktivace probíhá při pokojové teplotě 5 až 6 h. Potom se virová suspenze uloží do lednice při +2 °C.

Po 3 denní inkubaci při teplotě +2 °C se ověřuje, zda buněčné suspenze neobsahují rezidua živého viru. Inokulací buněčných kultur se ověřuje absence enteroviru a hemaglutinačním testem s morčecími krvinkami absence parvoviru.

K přípravě bivalentní vakcíny se míchá:

díl inaktivovaného parvoviru díl inaktivovaného enteroviru díl lipoidního adjuvantia

Směsi se míchají při pokojové teplotě 4 až 6 h. Potom.se vakcína uloží do chladírny při teplotě +2 °C. Vakcína má vzhled homogenní šedobílé emulze, její konzistence se nemění ani po několikaměsíčním skladování.

U vakcíny se provádí tyto zkoušky:

Zkouška sterility . .

Vakcína se naočkuje na plotny krevního agaru a do tekutého živného média. Po přiměřené délce inkubace se nesmí vyskytnout bakteriální a plísňové kontaminace.

Zkouška neškodnosti . Zkouška neškodnosti se provádí na dvou odstavených selatech. Selata se očkují dávkou a 3 ccm intramuskulárně. Po naočkování se selata klinicky sledují 10 dní. Během pozorovací doby nesmí dojít ke zvýšení teploty a ke zhoršení zdravotního stavu.

Zkouška účinnosti ' *»

CS 276 528 B6

Doporučuje se provádět na skupině 4 až 6 králíků. Králíci jsou imunizováni a 1 ml a po 14 dnech revakcinováni stejnou dávkou. Za 10 dní po revakcinaci se odebere krev pro serologické vyšetření specifických protilátek. Imunita proti enteroviru je dostačující pokud seroneutralizační titr dosáhne minimální hodnoty 1 : 128. Imunita proti parvoviru je dostačující pokud u poloviny imunizovaných králíků dosáhne hemaglutinačně inhibiční titr minimální hodnoty 1 : 32.

Pozn. Tvorba protilátek proti parvoviru prasat u králíků je relativně nižší než proti enteroviru.

Délka exspirace vakcíny je 8 měsíců od data výroby, za předpokladu, že byla uložena při teplotě +2 až 4 °C.

Claims (2)

1. PATENTOVÍ NÁROKY

   1. Inaktivovaná vakcína proti virovým původcům reprodukčních poruch u prasnic, charakterizovaných SMEDI syndromem, vyznačující se tím, že sestává ze stejných objemových dílů suspenze inaktivovaného parvoviru prasat v udržovacím médiu, suspenze inaktivovaného enteroviru prasat typu 6 v udržovacím médiu a lipoidního adjuvans, obsahujícího ve 100 objemových dílech 5 obj. dílů lipofilního neionogenního tenzidů ze skupiny polyoxyethylenesterů nebo polyoxyethylensorbitanestenů kyseliny laurové, palmitové, stearové nebo olejové, s výhodou polyoxyethylensorbitanmonooleátu, 45 obj. dílů parafinového oleje a 50 obj. dílů fyziologického roztoku. ‘
2. 2. Způsob přípravy vakcíny podle nároku 1, vyznačující se tím, že se uvedené virové antigeny pomnožují každý zvlášť na primárních buněčných kulturách epitelu prasečích ledvin, známým způsobem klarifikují, inaktivují formalinem a po smísení emulgují v lipoidním adjuvans.