MUTANTE DEL VIRUS DE HERPES EQUINO SENSIBLE A LA TEMPERATURA Y VACUNA VIVA DEL MISMO
La presente invención se refiere a un mutante del virus de aborto equino, un proceso para la preparación de dicho mutante, uso de dicho mutante y vacunas vivas derivadas de dicho mutante. El virus de aborto equino (EHV-1 ), un virus de herpes, es un patógeno equino principal responsable del aborto inducido viral, enfermedad neurológica tal como paresis, infecciones del tracto respiratorio superior, y enfermedad de potrillo neonatal (NFD). NDF resulta de la infección transplacental de los fetos en proximidad al término, que nacen débiles con enfermedad respiratoria severa y alguna ictericia debido a la infección del h ígado por EHV-1 . Estos animales usualmente mueren dentro de un pocos días después del nacimiento. El virus de rinoneumonitis equino (EHV-4) es la causa principal de enfermedad aguda del tracto respiratorio ("rinoneumonitis" ) e infecta la mayoría de los caballos durante sus primeros dos años de vida . La rinoneumonitis se caracteriza por fiebre, anorexia , y descarga nasal serosa abundante que más tarde se vuelve mucopurulenta . En raras ocasiones la infección por EHV4 causa aborto en yeguas embarazadas. Además, EHV1 y EHV4 establecen infecciones latentes de por vida, persistentes. En la reactivación los virus causan enfermedad recurrente, acompañada por difusión del virus y transmisión a otros animales. El control de la infección del virus de herpes equino y sus enfermedades permanecen inadecuados, en particular contra abortos
¡ to&im ám €fltfetip^ por EHVI , paresis y enfermedad del potrillo neonatal quß wita transplacental del feto próximo al término. Aunque las vacunas vivas así modificadas y vivas se encuentran disponibles, ninguna vacuna parece bloquear la infección suficientemente, no evitar el establecimiento de latencia por virus de tipo silvestre. Por lo tanto, existe una gran necesidad de vacunas seguras con protección mejorada contra infecciones del campo de estos virus, particularmente contra infecciones causadas por EHV1 . La presente invención se proporciona para tales vacunas. En un primer aspecto, la presente invención proporciona un mutante de EHV-1 como se deposita en la Colección Europea de Cultivo de Células Animales (ECACC), Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, RU el 1 0 de Junio de 1999 bajo el número de acceso V99061001 , y progenie de la misma. Los mutantes Ts de EHV-1 de acuerdo a la invención se caracterizan fenotípicamente además porque • forman placas pequeñas cuando crecen en varias estirpes de caballo, • han perdido su habilidad para crecer en células de riñon de conejo, en particular células RK1 3, y • se limitan en su habilidad para causar viremia (es decir, son capaces de; Los mutantes Ts de EHV-1 de acuerdo a la invención tienen la ventaja de que la replicación se restringe al tracto respiratorio superior de equido convencional sin o con viremia limitada . Los mutantes Ts son
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para yeguas embarazadas mientras que dan origen a estimulación
significativa después del crecimiento en el tracto respiratorio superior. Los mutantes Ts no se forman de manera regresiva de animal a animal limitados así en su potencial para la transmisión y reversión Para los propósitos de esta invención "progenie" se define para incluir también cepas obtenidas por pasaje en serie serial del mutante Ts de EHV-1 depositado. Para los propósitos de esta invención, un mutante sensible a temperatura se define como un virus mutante que tiene un crecimiento deteriorado en o arriba de una cierta temperatura a la cual el tipo silvestre tiene un crecimiento normal. Los mutantes Ts de EHV-1 de acuerdo a la presente invención se caracterizan porque son sensibles a temperatura en la temperatura corporal del animal huésped. Los mutantes Ts de EHV-1 de la presente invención no se replican arriba de una temperatura de 38.5 a 39.0°C. Preferentemente, los mutantes Ts de EHV-1 de acuerdo a la invención no se replican a una temperatura de 38 5°C Para los propósitos de esta invención, las placas pequeñas se define como placas que son al menos de la mitad a un tercio del tamaño de las placas formadas por la cepa de origen de tipo silvestre en células equinas. Para los propósitos de esta invención la "habilidad limitada para causar viremia" se define como la habilidad para causar nada o poco grado de viremia (es decir, solamente detectable) para 1 a 3 o 4 días en algunos animales con respecto a la habilidad de la cepa de origen para causar viremia.
Los mutantes de EHV-1 sensibles a temperatura de acuerdo a la invención pueden obtenerse por tratamiento de cultivos celulares de bovino infectado, equino u otros permisivos a 34°C con concentración no tóxicas de un mutagen tal como 5-bromo-2-deoxi uridina , azactidina y lo similar durante la replicación viral in vitro, seguida por clonación biológica de virus de progenie de dichos cultivos tratados en estirpes de bovino o equino y otras permisivas. Las propiedades favorables de los mutantes Ts de acuerdo con la invención los hace adecuados para utilizarse en la preparación de una vacuna. De esta manera , en un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición, en particular una composición de vacuna, que comprende un mutante Ts de EHV-1 de acuerdo a la invención, y un vehículo o portador farmacéuticamente adecuado. Más específicamente, una composición (de vacuna) de acuerdo con la invención comprende el mutante Ts de EHV-1 depositado en ECACC, Salisbury, RU que tiene el número de acceso V99061001 y/o progenie del mismo. Los vehículos o portadores farmacéuticamente aceptables que son adecuados para utilizarse en vacunas de acuerdo con la invención son agua estéril, salina, reguladores acuosos tales como PBS y lo similar. Además, una vacuna de acuerdo con la invención puede comprender otros aditivos tales como adyuvantes, estabilizadores, anti-oxidantes y otros. Las composiciones de vacuna de acuerdo a la invención son seguras y pueden utilizarse para proteger al equido clínica y virológicamente contra infecciones con EHV-1 y para proteger contra paresis y abortos inducidos por el virus. Además, se encuentra que la
vacuna de acuerdo a la invención detiene la infección transplacental, protegiendo así al potrillo recién nacido de los efectos de enfermedad de potrillo neonatal. La composición de vacuna de acuerdo a la presente invención puede administrarse no solamente a caballos sino que también a otros animales que son susceptibles a infección de EHV-1 tales como burros, zebras y lo similar. El ganado que se ha reportado que es susceptible a infección de EHV-1 y EHV-4 también puede tratarse con la vacuna de acuerdo con la invención . Se encontró además sorprendentemente que las vacunas que comprenden un mutante Ts de EHV-1 de acuerdo a la invención no solamente protegen contra infecciones de EHV-1 sino que también contra la enfermedad y la difusión asociada del virus después de la infección de EHV-4. De esta manera, tal vacuna puede ser útil para obtener protección cruzada en el equido vacunado. Dichas vacunas dan origen a protección mejorada bloqueando así de manera eficaz la infección con virus de tipo silvestre . Las composiciones de vacuna de acuerdo a la invención pueden prepararse siguiendo los procedimientos estándar. Una vacuna de acuerdo con la invención preferentemente es una vacuna viva. Para la preparación de la vacuna viva, el virus de descendencia del mutante Ts de EHV-1 puede desarrollarse en un cultivo celular, tal como células de equino o riñon de bovino secundario. Los virus así desarrollados pueden cosecharse al recolectar los fluidos de cultivo celular de tejido y/o células. Opcionalmente, durante la recolección , la producción de los virus puede promoverse por técnicas que mejoran la liberación de las partículas
'tülir ilt crecido, por ejemplo, sonicación. La vacuna viva forma de una suspensión o puede liofilizarse Los vehículos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para utilizarse en una vacuna de acuerdo con la invención son agua estéril , salina, reguladores acuosos tales como PBS y lo similar. Además, una vacuna de acuerdo a la invención puede comprender otros aditivos tales como adyuvantes, estabilizadores, anti-oxidantes y otros. Los estabilizadores adecuados son por ejemplo carbohidratos incluyendo sorbitol, manitol, almidón , sucrosa , dextran y glucosa , proteínas y productos de degradación de los mismos incluyendo pero no limitándose a albúmina y caseína , agentes que contienen proteína tales como suero de bovino o leche desnatada, y reguladores que incluyen pero no se limitan a fosfatos de metal álcali. En composiciones de vacuna liofilizadas es preferible agregar uno o más estabilizadores. Los adyuvantes adecuados incluyen pero no se limitan a hidróxído de aluminio, fosfato u óxido, anfigen, tocoferoles, lípido A de monofosfenil, dipéptido de muramilo, emulsiones de aceite, glucanos, carómeros, copolímeros de bloque, citoquinas y saponinas tales como Quil A. La cantidad de adyuvante agregado depende de la naturaleza del adyuvante por sí mismo. Los mutantes de Ts de EHV-1 de acuerdo a la invención se administran preferentemente a animales seronegativos, convencionales que varían en edad de unos pocos días a varios años, incluyendo aquellos en potrillos. La vacuna puede administrarse a los animales a través de vías de administración no parenterales, incluyendo pero no limitándose a
•-^^" ^- TltÉfiiilIffTMfl linistración intradermal, oral, de rocío, aerosol, intra-ocular, e intranasal. Alternativamente, la vacuna puede administrarse a través de vías de administración parenteral. Preferentemente, la vacuna se administra intradérmicamente o intranasalmente. En general, el virus mutante Ts de EHV-1 se administra a una cantidad que es eficaz para inducir la protección contra infección de EHV-1 . La dosis general dependerá de la vía de administración, el tiempo de administración, así como también la edad, salud y dieta del animal a vacunarse. El virus puede administrarse en una cantidad entre 102 y 10 pfu/dosis por animal, preferentemente entre 1 03 y 105 pfu/dosis y más preferentemente a 1 04 pfu/dosis por animal. Las vacunas de acuerdo con la invención también pueden darse simultáneamente o concomitantemente con otras vacunas inactivas o vivas. Estas vacunas adicionales puede administrarse no parenteralmente o parenteralmente. Preferentemente, las vacunas adicionales se recomiendan para administración parenteral. EJEMPLOS 1. Aislamiento v caracterización de una cepa mutante de EHV-1 sensible a la temperatura TS C147 Las monocapas solo confluentes, de un d ía de 75 cm2 de células dérmicas equinas (ED) se infectaron en m.o.i de 0.001 con EHV-1 Inoculo (2.0 ml) se absorbe (1 hora , 37 °C), removió y las monocapas se enjuagaron con PBS y después se re-alimentaron con medio de cultivo de tejido (25 ml) que contiene 40 µg/ml de 5-bromo-2-deoxi uridina e incubaron a 34 °C. A CPE máximo (7 días después de la inoculación) , el
.?ait?í *iíkíA¿?¿iiílii *» *Mk».> <Nfflv<t4se recolectó (congeló a -40 °C y después se descongeló a 37° C), dializó durante la noche a 4 °C contra PBS, concentró para infectividad de EHV-1 en células ED a 37 °C y subsecuentemente se clonó a 34° C en células ED crecidas en placas de microconcentración de 96 cavidades. Las cavidades con foco de EHV-1 único se identificaron , dejaron crecer a CPE máximo y después una muestra pequeña (20 µl fuera de 200 µl total) se utilizó para fenotipar a temperaturas restringidas (39 °C y permisivas (34°C) utilizando células ED. Los clones sensibles temperatura se pasaron además en células de Riñon de bovino, JCK cepa (Cepa de Intervet Riñon de Bovino de Jay) para producir las semillas de trabajo y maestra. 2. Fenotipo sensible a la temperatura de cepa TS C147 de EHV-1 La cepa TS C147 de EHV-1 a un nivel de Virus de Semilla Maestra (MSV)+1 ° se concentró en paralelo con el Pulmón de Embrión de Bovino (cepa BEL26-cepa de Intervet), Riñon de Bovino (cepa de Riñon de Becerro de Jay, JCK-cepa de Intervet), células Dérmicas Equinas (ED), Clon Dérmico Equino W48 C 1 0 (ED W48 1 0 - cepa de Intervet), y Clon Dérmico Equino W7 C5 (ED W7 C5- cepa de Intervet) a 37 °C y 38.5°C. El virus a nivel de paso MSV+ 1 ° falló en crecer a 38.5°C. Los resultados se dan en la Tabla 1 . 3. Cepa TS C147 de EHV-1 tiene características como EHV-4 Un parámetro para la diferenciación entre EHV-1 y EHV-4 es su habilidad para replicar en células de riñon de conejo (RK1 3). Las cepas de EHV-1 se replican bien en células RK1 3 pero las células son refractarias a cepas de EHV-4, la cepa TS C 147 de EHV-1 a nivel MSV+ 1 0 ,
H *4e EHV-1 de origen de tipo silvestre, cepa de EHV-1 deficiente en vi * * ' gen anterior inmediato (EHV-1 IE), cepa CHLi de EHV-1 y un aislado de EHV-4 de campo se concentraron en paralelo a 37 °C en células RK 1 3 y células dérmicas equinas (ED). Los resultados dados en la Tabla 2 muestran que las 4 cepas de EHV-1 , incluyendo la cepa TS C147 y la cepa EHV-4 se replican en células ED pero la cepa TS C 147 de EHV-1 y cepa de EHV-4 no crecieron en células RK1 3. TABLA 1 : Concentraciones relativas de cepa TS C147 de EHV-1 a 37 ° y 38.5 ° en varias cepas de célula equina y bovina.
a concentraciones después de 5 d ías de incubación ; concentraciones dadas como < 1 . 1 logio TCID50/ml representan ningún foco de EHV-1 detectados en 4 x 200 µl de la dilución inferior (1 0' 1 ) del virus probado en concentración Tabla 2. Habilidad de las células de riñon de conejo para soportar la replicación de cepas TS C147 de EHV-1
a = concentraciones dadas como < 1 .1 log10 TCID50/ml representan ningún foco de EHV-1 detectados en 4 x 200 µl de la dilución inferior (1 0' 1 ) del virus probado en la concentración 4. Protección virolóqica y clínica de ponis convencionales contra infecciones por EHV-1 v EHV-4 De 29 ponis convencionales con poco o nada de anticuerpo de neutralización de EHV-1 (VN), 1 5 se vacunaron intranasalmente (IN) con una dosis de 5.3 log10 TCID50 de cepa TS C 147 de EHV-1 mientras que 14 ponis se dejaron sin vacunar para servir como control sin vacunar. Aproximadamente un mes después de una vacuna I N única , 8 ponis vacunados y 8 no vacunados (control) se cambiaron IN con una cepa de capo de EHV-1 mientras que un grupo de 7 animales vacunados de EHV-1 y 6 de control se cambiaron IN con un aislado de campo reciente de EHV- 4. Después de la vacunación y cambio, los animales se monitorearon para
i.?»^ _m ta t mtí?iU?^?^. «ite*^ , r«É £ i 3fS? <j.ínicas, difusión del virus en moco nasal, leucocitos infectados ( lwWa) y anticuerpo neutralizante de EHV-1 . El virus de vacuna creció a bajas concentraciones (concentraciones máximas de moco nasal 1 .5 a 3.0 logio TCID50/ml) por 1 a 8 días en 1 1 /15 ponis y también resultó en viremia de leucocito de bajo grado (solo detectable) por 1 a 4 días en 7 de 1 5 animales. Sin embargo, todos los 1 5 ponis se sero convirtieron . En contraste ningún EHV-1 se recuperó del moco nasal o la sangre de 14 ponis de control monitoreados diariamente por 10 o 14 días respectivamente y los animales permanecieron seronegativos a EHV-1 hasta después de la infección por cambio. Un nivel similar de pirexia se observa en 1 0 animales en cada uno de los dos grupos (vacunado y control). Estos descubrimientos se resumen en la Tabla 3. Después del cambio de EHV-1 intranasal, existió una reducción significativa en virus excretado en moco nasal por los ponis vacunados relativo a aquel recuperado de los animales de control. De manera similar, una sola vacuna evitó viremia de leucocito en 7 de 8 ponis mientras que un pony fue solo positivo por 1 día. En contraste, sin embargo, todos los 8 ponis sin vacunar se vuelven virémicos, 7 por 3 a 4 días y 1 por 1 día. Los 8 ponis de control se vuelve de moderadamente a altamente febriles por 1 a 6 d ías pero los 8 animales vacunados permanecieron normales. Ninguno de los 8 animales vacunados respondieron anamnésticametne a la infección de cambio mientras q ue 8 animales de control respondieron con un anticuerpo neutralizante de EHV- 1 significativo. Estos descubrimientos se resumen en la Tabla 4.
Después del carolo de EHV-4 intranasal, el virus se recuperó del moco nasal de uno de 7 ponis vacunados en una ocasión pero todos los 6 ponis de control excretaron virus a una concentración significativamente más elevada de 2 a 3 días, con una excepción Ninguno de los 7 ponis vacunados de EHV-1 se vuelve virémico en contraste a 3 de 6 ponis de control por 2 a 3 d ías pero ninguno de los 7 ponis vacunados se afectaron. Existió un incremento ligero (1 5 a 20 expiraciones/minuto) en la velocidad de respiración en 4 de 7 vacunados y 5 de 6 animales de control por 1 a 3 y 2 a 6 días respectivamente. Estos descubrimientos se resumen en la Tabla 5. TABLA 3: Resultados después de la vacunación Resultado - No + ve/No Total (rango & duración de actividad máxima)
TABLA 4: Después del cambio de EHV-1 Resultado - No + ve/No Total (rango & duración de actividad máxima)
TABLA 5: Después del cambio de EHV-4 Resultado - No + ve/No Total (rango & duración de actividad máxima)
5. Protección de eauido contra paresis y abortos debido a la infección de EHV-1 De 12 yeguas embarazadas con poco o nada de anticuerpo de
neutralización de EHV-1 (VN), 6 se vacunaron intranasalmente (IN) a aproximadamente 6 meses de gestación y después las 12 yeguas se cambiaron IN con una cepa patogénica de EHV-1 en la etapa crítica de gestación de abortos por EHV-1 principalmente aproximadamente 9 meses de gestación. Después de la vacunación y cambio, los animales se monitorearon para reacciones qu ímicas, difusión de virus en moco nasal, leucocitos infectados (viremia) y anticuerpo de neutralización de EHV-1 . Aunque ningún virus de vacuna se recupera de moco nasal de cualquiera de 6 yeguas vacunadas, se detecto viremia transitoria (1 a 3 días) de bajo grado en 5 de 6 yeguas y los 6 animales se sero convirtieron con anticuerpo VN significativo a EHV-1 . Ninguna de las 6 yeguas de control, monitoreadas en paralelo a animales vacunados por 10 a 14 días, produjeron EHV-1 de moco nasal o leucocitos pero 1 de 6 animales se sero convirtieron algunos 2 meses después. Estos descubrimientos se resumen en la Tabla 6. Después del cambio, existió una reducción significativa (2 fuera de 6 en comparación con 5 de 6 y 1 .5 a 1 .7 log10 TCID50/ml por 1 -2 días en comparación de 2.4 a 3.7 log10 TCID50/ml por 1 -6 días) en virus excretado en moco nasal por las yeguas vacunadas. De manera similar ninguna de las 6 yeguas vacunadas se volvieron virémicas en contraste con 5 de 6 yeguas de control sin vacunar. En el grupo de control 5 de 6 yeguas se volvieron febriles por 1 a 5 d ías, 3 también desarrollaron paresis acompañada por ictericia severa y desintegración del pulmón cervical en 2 yeguas con señales de eyección fetal. Uno de los dos animales murieron mientras que el 2do tuvo que matarse en extremis.
iláJ ??. ;. t«^l . «.ÜU.^. ^^. »*, . tüimfa Ambos animales llevaban potrillos muertos. Tres yeguas además abortaron. Los tejidos fetales de 5 fetos fueron positivos de EHV-1 . Sin embargo, en contraste las 6 yeguas vacunadas parieron normalmente. La única reacción clínica observada en yeguas vacunadas fue pirexia transitoria (1 día) en una de 6 yeguas. La yegua de control que parió normalmente tuvo de hecho que sero convertirse justo antes del cambio. Estos descubrimientos se resumen en Tabla 7. TABLA 6: Resultados después de vacunación Resultado - No + ve/No Total (rango & duración de actividad máxima)
1 5 a = No se monitorea debido a que los animales se mantienen en asilamiento lejos del grupo vacunado. TABLA 7: Resultados después del cambio Resultado - No + ve/No Total (rango & duración de actividad máxima)
6. Seguridad de TS C147 de EHV-1 en yeguas embarazadas Cuatro yeguas a aproximadamente 9 meses de gestación (etapa crítica para abortos por EHV-1 ) se inocularon por la vía natural con 10 veces la dosis protectora y monitorearon para abortos. Los resultados dados en la Tabla 8 muestra que las 4 yeguas se sero convirtieron a EHV- 1 , una de las 4 yeguas se vuelven transitoriamente virémicas pero parieron normalmente. Tres de 4 potrillos fueron negativos en anticuerpo de VN de EHV-1 en muestras sanguíneas, se recolectaron antes de lactar de la madre respectiva mientras que no potrillo fue positivo en anticuerpo VN
Í??? É ?±A..> - Z± H?»—^*^ ißj p¡H o a , a toma de colostro (nacido entre intervalos de monitoreo en las horas anteriores). Los resultados se resumen en la Tabla 8. TABLA 8: Una seguridad de sobredosis para yeguas embarazadas en el estado crítico de gestación para abortos por EHV-1
a = anticuerpo de neutralización EHV-1 al nacer. b = nacido entre intervalos de monitoreo en horas tempranas y el potrillo sangra al menos 3 horas después del nacimiento. c = pendiente, es decir, se esta haciendo 7. Ninguna de transmisión de TS C147 de EHV-1 entre especias objetivo Un estudio de reversión se realiza en potrillos inocentes de EHV (todos los tipos) (potrillos SPF, libres de patógenos específicos). Dos potrillos SPF se inocularon intranasalmente (IN) con 10 veces la dosis protectora de cepa TS C147 de EHV-1 a nivel de paso Virus de Semilla Maestro + 1 o y moco nasal positivo de virus recolectado durante varios días utilizados para infectar de manera similar un par
l&i táal de potrillos SPF. Después de la inoculación IN, los potrillos se monitorearon por (1 ) difusión del virus en moco nasal, (ii) reacciones clínicas y (iii) seroconversión a EHV-1 . A los potrillos que se les da cepa TS C147 de EHV-1 a nivel MSV + 1 ° excretaron virus en moco nasal y se sero convirtieron. Sin embargo, un grupo muestras de moco nasal positivo de virus fallaron en infectar un par adicional de potrillos inocentes de EHV como se juzga de la falla de recuperar EHV-1 de su moco nasal y la ausencia de seroconversión en EHV-1 . Los resultados se confirmaron al repetir el estudio con 4 potrillos SPF adicionales, 2 inoculados con MSV+ 1 ° seguidos por 2 que dan positivos en virus de moco nasal de los primeros dos potrillos. Los resultados se resumen en las Tablas 9 y 1 0. TABLA 9. Reversión de cepa TS C147 de EHV-1 en potrillos inocentes de EHV-1 PASAJE UNO: Potrillos 1 &2 inoculados intranasalmente con TS C147 de EHV-1 (10x dosis protectora) a nivel MSV+1 °.
PASO DOS : Potrillos 5 & 6 inoculados intranasalmente con moco nasal positivo en virus de potrillos 1 & 2.
TABLA 10 Reversión de cepas TS C147 de EHV-1 de potrillos inocentes de EHV-1 PASAJE UNO: Potrillos 7 & 8 inoculados intranasalmente con TS 147 de EHV-1 (10x dosis protectora) en nivel MSV+10
PASO DOS : Potrillos 9 & 10 inoculados intranasalmente con moco nasal positivo en virus de potrillos 7 & 8.