MXPA99001461A - Preparaciones de proteccion cruzada de herpesvirus equino y metodo de preparacion y utilizacion delas mismas - Google Patents

Abstract

Se describen aquíuna vacuna de EVH-1 que proporciona protección frente a enfermedades asociadas a EHV-1 y EHV-4 y métodos de preparación y utilización de la misma.

Description

PREPARACIONES DE PROTECCIÓN CRUZADA DE HERPESVIRUS EQUINO Y MÉTODO DE PREPARACIÓN Y UTILIZACIÓN DE LAS MISMAS Esta invención se relaciona con el descubrimiento de una preparación de Herpesvirus Equino que protege frente al aborto y a la enfermedad respiratoria producidos por el Herpesvirus Equino de tipo 1 y frente a la enfermedad respiratoria producida por el Herpesvirus Equino de tipo 4. Más concretamente, esta invención se relaciona con una vacuna eficaz y con métodos de preparación y utilización de la misma. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El aborto equino y la rinopneumonitis equina son enfermedades comúnmente reconocidas atribuidas a los Herpesvirus Equinos de tipos 1 (EHV-1) y 2. El Herpesvirus Equino de tipo 2 es ahora denominado EHV-4, ya que se ha determinado que la estructura molecular es significativamente diferente de EHV-1. EHV-1 es principalmente responsa-ble de la producción de enfermedad respiratoria. Las pérdidas económicas consecuentes a la enfermedad respiratoria producida por cualquiera de los subtipos de EHV en caballos jóvenes se deben a la incapacidad o a la alteración de la capacidad para rendir en competición. Las pérdidas económicas que se producen por la infección de yeguas gestantes son debidas al aborto. También se ha asociado un síndrome del sistema nervioso central al EHV-1; dicha enfermedad progresa desde parálisis ascendente hasta una parálisis completa y, en algunos casos, hasta la muerte. Debido a la falta de homología entre EHV-1 y EHV-4, se ha propuesto que sólo una vacuna de herpesvirus equino que contuviera ambos subtipos EHV-1 y EHV-4 protegería del aborto y de las diversas formas de enfermedad respiratoria. De hecho, la Patente EE.UU. N° 4.083.958 describe una vacuna de herpesvirus equino que protege sólo frente al aborto y a la enfermedad respiratoria producidos por EHV-1. No reivindica que proteja frente a la enfermedad respiratoria producida por EHV-4. La Patente EE.UU. N° 5.084.271 indica que la exposición de potros a EHV-1, ya sea vivo o inactivado, produce una respuesta de anticuerpos sólo para EHV-1. La exposición de potros a EHV-4 produce una respuesta serológica tanto a EHV-1 como a EHV-4. Sin embargo, no se mostró ninguna protección real frente a la inoculación. La última patente reivindica que una vacuna efectiva debe contener EHV-4 solo o una combinación de EHV-1 y EHV-4. De este modo, no se esperaría que una vacuna monovalente EHV-1 protegiera frente a los síndromes respiratorios de EHV-1 y EHV-4, así como frente al aborto producido por EHV-1. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye una cepa de Herpesvirus Equino del subtipo 1 (EHV-1) denominada aquí AB69 o un equivalente de la misma, que es útil en la preparación de antígenos para inducción de una respuesta inmune protectora para EHV-1 y EHV-4. También se incluye en la invención una preparación tal como una vacuna monovalente, que contiene la AB69 y que puede ser usada para vacunar a potros jóvenes, équidos adultos o yeguas gestantes, con objeto de proporcionar protección frente a la enfermedad respiratoria producida por EHV-1 o por EHV-4 y, además, de proporcionar protección frente al aborto debido a EHV-1. También se incluye en la invención un método para hacer la preparación y utilizar la misma para proteger a los caballos. Se contempla que las preparaciones vacunales de esta invención puedan también proporcionar protección frente a la aparición de enfermedad del sistema nervioso central causada por EHV-1. En la presente realización, la invención incluye el procedimiento de preparación de dicha vacuna monovalente EHV-1 propagando la cepa AB69 o un equivalente de la misma en un cultivo celular continuo, recogiendo y purificando por eliminación de los restos celulares del sobrenadante vírico, concentrando, inactivando químicamente y adyuvando como se describe con más detalle a continuación. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se ha indicado anteriormente, la presente invención se relaciona con un virus EHV-1 que, cuando se introduce en una preparación tal como una vacuna y se administra parenteralmente a caballos, proporciona protección de todos los caballos frente a las enfermedades asociadas a EHV-1 y EHV-4. Más concretamente, la vacuna EHV-1 descrita proporciona protección a las yeguas gestantes frente al aborto causado por EHV-1, protege a los caballos de la enfermedad respiratoria producida por EHV-1 o EHV-4 y reduce la aparición de enfermedad del sistema nervioso central producida por EHV-1. La cepa vírica EHV-1 útil para la preparación de esta vacuna fue aislada del tej ido pulmonar infectado de un feto abortado durante un estudio de inoculación. El aislado, denominado AB69, fue depositado con el número de acceso ATCC . Este virus fue pasado dos veces en una Línea de Células Dérmicas Equinas para establecer una Siembra Patrón. El virus puede crecer en líneas celulares susceptibles que repliquen de manera efectiva el virus a un nivel suficiente para obtener una cantidad suficiente (masa antigénica) como para ser inmunológicamente suficiente para obtener protección frente a EHV-1 y EHV-4. Lo que sigue es una descripción no limitante, aunque ilustrativa, de un método de replicación del virus y de preparación de una vacuna con el mismo. El método consiste en las etapas de 1) infectar una línea celular susceptible con un virus EHV-1; 2) permitir que dicho virus EHV-1 crezca en un medio soporte del crecimiento hasta producirse un efecto citopático (ECP) significativo; 3) recoger dicho medio soporte del crecimiento que contiene dicho virus EHV-1, células muertas, restos celulares y células infectadas para producir un material cosechado; 4) inactivar dicho material cosechado con un agente inactivante adecuado, y 5) adyuvar dicho material cosechado inactivado. La línea celular susceptible es preferiblemente de origen equino, más preferiblemente una Línea Celular Dérmica Equina, una Línea Celular de Riñon Equina o una Línea Celular Pulmonar Fetal Equina. Esta línea celular es utilizada para hacer crecer la cepa EHV-1 hasta títulos elevados. La línea celular puede crecer en botellas de Roux, botellas rotatorias o biorreactores como cultivo en suspensión o sobre perlas microportadoras , utilizando cualquier medio y suero que soporte el rápido crecimiento de las células. Los medios preferidos son el Medio Mínimo Esencial de Earle o de Hank (MEME y MEMH, respectivamente) con adición de glutamina y aminoácidos no esenciales. Los sueros preferidos para el crecimiento celular son el suero equino fetal, bovino fetal o de ternera. La línea celular crece hasta la confluencia y luego es infectada con el virus EHV-1 con una multiplicidad de infección (MDI) que muestra producir rendimientos máximos de partículas víricas infecciosas por mililitro de medio. Preferiblemente, esta MDI es de entre 0,0001 y 1,0. Se deja que la línea celular infectada crezca hasta que las células muestran un efecto cítopático (ECP) significativo. Un ECP significativo se define como una destrucción >80% de las células, visualizada microscópicamente por las células muertas desprendidas de la superficie del recipiente de crecimiento de las perlas microportadoras. El medio que contiene células infectadas, células muertas, restos celulares y EHV-1 es recogido separándolo de los recipientes en los que crece y transfiriéndolo a recipientes de mantenimiento tales como tanques o bolsas. Este material cosechado es purificado por filtración o centrifugación para eliminar las células y los restos celulares, tras de lo cual se concentran los fluidos sobrenadantes por ultrafiltración, ultracentrifugación o cromatografía en columna. Los fluidos concentrados son inactivados por adición de cualquier agente inactivante que conserve la antigenicidad del virus . Los agentes inactivantes preferidos son beta-propiolactona, formalina o etilenimina binaria. Se pueden añadir conservantes, tales como timerosal, a los fluidos inactivados. Después de la inactivación, se adyuva el material inactivado. Se puede usar cualquier número de adyuvantes, incluyendo, aunque sin limitación, Carbopol 934P(R), HavlogenÍR>, Polygen(R> , copolímeros de bloque, polímeros, aceites, sales de aluminio tales como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, citokinas e inmunomoduladores y sus combinaciones. Después de adyuvar, se pueden añadir estabilizantes tales como glicerol/EDTA para mejorar la estabilidad del antígeno. Como comprobarán los expertos en la técnica, una vez que el virus puede ser propagado como se ha descrito anteriormente, se pueden obtener derivados del mismo, incluidas las subunidades, por medios conocidos en la técnica, tales como extracción del virus. Adicionalmente, los antígenos protectores pueden ser identificados a nivel molecular y reproducidos y expresados usando tecnología recombinante .

Esta invención es aún ilustrada, pero sin pretender limitarla, mediante los siguientes ejemplos, donde todas las partes y porcentajes son en peso a menos que se indique de otro modo . EJEMPLOS EJEMPLO 1 Se hizo crecer una Línea Celular Dérmica Equina a aproximadamente un 90% de confluencia en botellas rotatorias de 1750 cm2 usando MEME + 10% de suero de ternera fetal. Las células confluentes fueron infectadas con una cepa de EHV-1 denominada AB69 y transferidas a (MEME) que contenía Aminoácidos No Esenciales, Glutamina, Sulfato de Neomicina y (Polimixina B) . Los cultivos celulares infectados fueron incubados a 37°C durante tres a seis días o hasta que hubo un ECP del 90-95%, después de lo cual las células y los fluidos fueron asépticamente recogidos en un solo recipiente. La cosecha fue entonces aclarada por filtración a través de un filtro de 5 µ y concentrada cinco veces usando ultrafiltración a través de un cartucho de PM 100.000. Los fluidos concentrados fueron inactivados por ajuste del pH a entre 8,0 y 8,3, añadiendo Beta-propiolactona a una concentración final de entre un 0,05 y un 0,15% e incubando a 37°C durante tres a seis horas, controlando al mismo tiempo el pH entre 6,8 y 7,2 con NaOH 10 N. El último período de incubación hidrolizó la Beta-propiolactona. Después de completarse la inactivación, los fluidos fueron adyuvados por adición de Havlogen(R> y se añadió timerosal como conservante para completar la producción de la vacuna. La vacuna producida por este procedimiento fue denominada EHV-1 MHD 91-001. Se llevó a cabo un estudio de vacunación/inoculación para determinar si la vacuna EHV-1 MHD 91-001 podría proteger a las yeguas gestantes de la enfermedad respiratoria EHV-1 y del aborto causado por el herpesvirus equino. Durante este estudio, cuarenta y cinco yeguas en el segundo trimestre de gestación (la media era el 5o mes de gestación) fueron separadas en dos grupos. Un grupo que contenía 22 yeguas gestantes fue designado como controles no vacunados . El segundo grupo de 23 yeguas fue vacunado con 2,0 mi de la EHV-1 MHD 91-001 durante el 5o, 1 ° y 9 ° mes de gestación. Para la inoculación respiratoria, el grupo vacunado contenía 22 yeguas, ya que una yegua murió después de la inoculación tras resbalar y romperse la espalda. Para la inoculación de aborto, el grupo vacunado contenía sólo 19 yeguas gestantes hacia el final del período de inoculación (una yegua abortó al principio del estudio, la yegua que murió después de la inoculación tras resbalar y romperse la espalda y dos yeguas que sabía que estaban abiertas al comienzo de la prueba fueron asignadas al azar al grupo vacunado el primer día de vacunación) . Todas las yeguas fueron inoculadas (tanto si estaban preñadas como si no, ya que las yeguas no gestantes podían ser aún utilizadas para la inoculación respiratoria) . Las yeguas fueron sedadas con Rompun( ) , de Bayer Corporation, antes de la inoculación. Cada yegua fue entonces inoculada con AB69 de pasaje temprano a una razón de dosis de aproximadamente 105,0 DICT50. Esta inoculación fue realizada por vía intranasal utilizando un nebulizador que producía un fino aerosol, que forzó al virus hacia los pulmones . Se había visto que el virus y el procedimiento de inoculación producían aborto y enfermedad respiratoria en yeguas gestantes en estudios previos de titulación de la inoculación. Después de la inoculación, todas las yeguas fueron colocadas en corrales cercados, donde se las pudo observar en cuanto a signos de enfermedad respiratoria y aborto. Con objeto de determinar la protección frente a la enfermedad respiratoria, se observó a las yeguas y se les tomó muestras diariamente durante 11 días post-inoculación. La observación diaria post-inoculación de todas las yeguas incluía la evaluación y puntuación de los signos clínicos de enfermedad respiratoria, incluyendo la descarga nasal (exudado) y la elevada temperatura rectal. Adicionalmente, se tomaron muestras de sangre diariamente. Se midieron los recuentos de glóbulos blancos y se intentó el aislamiento del virus de las "buffy coats" separadas de las muestras diarias de sangre. Además, cada día de ensayo se tomaron muestras de los pasajes nasales de cada yegua con una torunda, poniendo las torundas en medio de transporte para intentar posteriormente el aislamiento del virus. Con objeto de determinar la protección frente al aborto, todos los potros vivos, los potros muertos y los fetos abortados fueron analizados en cuanto a indicaciones de infección por EHV-1. Se recogieron muestras de sangre y muestras de tejido de necropsia para intentar aislar el virus. En las Tablas la, Ib y le se muestran los resultados de la evaluación respiratoria. En la Tabla 2 se muestran los resultados de la evaluación del aborto. Tal como se muestra en la Tabla la, las yeguas vacunadas mostraron un 96,1% de reducción de la descarga vírica de exudados nasales en comparación con las yeguas control no vacunadas. Después de la inoculación por aerosol de EHV-1, se recuperó virus EHV-1 de las muestras nasales recogidas de los vacunados en sólo 2 de 242 (9,826%) intentos de aislamiento, mientras que se recuperó virus EHV-1 de 51 de 242 (21,07%) muestras recogidas de las yeguas control no vacunadas . Tal como se demuestra en la Tabla Ib, la respuesta de temperatura de las yeguas vacunadas post-inoculación fue significativamente menor que la de las yeguas control el día 2 de observación pos -inoculación. Este día, todos los vacunados mostraron temperaturas rectales normales (98, 0-100, 9°F) y 13 de 22 (59,09%) de las yeguas control no vacunadas mostraron elevadas temperaturas rectales (101°F o superior) . La gravedad de la enfermedad respiratoria EHV-1 en las yeguas control no vacunadas quedó además indicada por sus puntuaciones de exudado nasal post-inoculación. Tal como se observa en la Tabla le, las puntuaciones de exudado nasal diarias individuales de más de o igual a 4 indican un nivel significativo de enfermedad respiratoria. Dos de las 22 yeguas vacunadas (9,09%) y 9 de las 22 (40,09%) yeguas control no vacunadas desarrollaron este nivel de enfermedad. Esta diferencia entre la enfermedad respiratoria en las yeguas vacunadas en comparación las yeguas control es estadísticamente significativa (p<0,03). La gravedad de la enfermedad respiratoria EHV-1 en las yeguas control no vacunadas quedó también indicada por la tendencia mostrada en sus recuentos de glóbulos blancos ("WBC") post-inoculación, no mostrados. Entre los días 2 y 5 post-inoculación, las yeguas control no vacunadas mostraron una depresión más pronunciada de sus WBC medios que las yeguas vacunadas . Resumiendo, la vacuna monovalente EHV-1 que contenía sólo la cepa EHV-1 mostró una protección signifi-cativa frente a la enfermedad respiratoria inducida por EHV- 1 en comparación con yeguas control no vacunadas post-inoculación.

Tabla la. Enfermedad respiratoria EHV-1 - Aislamiento del virus de muestras nasales DÍAS POST-INOCULACIÓN Números de días de observación de la descarga vírica post-inoculación *N° de observaciones posibles .

Tabla Ib. Enfermedad respiratoria EHV-1 - Temperatura superior a 101°F DÍAS POST-INOCULACIÓN Número de yeguas con temperaturas superiores a 101°F cada día * Las temperaturas elevadas el día 2 y 3 post-inoculación son indicativas de signos clínicos.

Tabla le. Enfermedad respiratoria EHV-1 - Puntuación de exudado nasal >4 DÍAS POST-INOCULACIÓN Número de yeguas con puntuaciones de exudado nasal >4 cada día *E1 número de diferentes yeguas con puntuaciones de exudado nasal iguales a o >4 indica signos clínicos significativos de enfermedad.

La observación del aborto post-inoculación fue continuada después de haber completado las observaciones respiratorias . Como se ha mencionado anteriormente, las yeguas fueron colocadas al azar en corrales a razón de dos yeguas por corral . La selección de las compañeras de corral se basó en la compatibilidad. Las yeguas fueron observadas diariamente por la mañana y por la tarde en cuanto a cualquier signo de parto. Siempre que una yegua parió un potro vivo o muerto y/o un feto abortado, se inició el siguiente procedimiento. 1) En el caso de que una yegua de parto estuviese teniendo dificultades, el veterinario de la granja asistió al alumbramiento. Una yegua en este estudio requirió asistencia. 2) Potros vivos - Al descubrir un feto vivo, se recogieron inmediatamente muestras de sangre para los estudios de aislamiento vírico de la "buff coat" y, de ser necesario, para estudios serológicos en el caso de muerte neonatal debida a EHV-1. 3) Fetos abortados y Potros muertos - Todos los fetos abortados y los potros muertos fueron inmediatamente colocados en el refrigerador de la sala de necropsias para frenar la autolisis. Todos los exámenes post-mórtem fueron realiza dos por el veterinario de la granja y el personal de investigación a cargo del proyecto. Todos los exámenes de necropsia incluyeron lo siguiente: a) observaciones visuales de los órganos del potro en cuanto a evidencia de patología macroscópica, b) recogida de muestras de sangre para estudios serológicos y de aisla- miento del virus y c) recogida de muestras de tejido de timo, pulmones, corazón, hígado, riñon y bazo, las cuales fueron colocadas en recipientes individuales que contenían formalina tamponada al 10% para los estudios histopa tológicos o MEME con una concentración 5X de neomicina y polimixina B para los aislamientos del virus. En las Tablas 2a y 2b se muestra el resumen de los partos de las yeguas. Las Tablas 2a y 2b incluyen la siguiente información para cada yegua gestante vacunada y no vacunada: 1) el número de la yegua, (2) la fecha del calendario de parto de la yegua, (3) el día post-inoculación en el que se produjo el parto, (4) el tipo de parto experimentado por cada yegua de ensayo, (5) el estado de salud de los potros en el parto y (6) la causa potencial de la muerte fetal y/o el virus infeccioso que contribuyó a la muerte del neonato. En la parte inferior de las Tablas, se da el rango de días para el parto y los días medios de parto post-inoculación para cada grupo de ensayo. Dieciséis de las diecinueve yeguas preñadas vacunadas, lo que era igual a un 84,21%, parieron potros sanos normales post-inoculación con EHV-1. Una yegua preñada vacunada tuvo problemas durante el intento de parto de un feto casi a término en presentación dorsal transversa. El feto murió durante el parto asistido mecánicamente. Se vio en estudios de aislamiento vírico que este neonato distócico era de cultivo negativo para el virus de inoculación EHV-1. La muerte de este potro no fue debida a la vacuna ni al virus de inoculación EHV-1. Dos fetos de yeguas vacunadas resultaron ser positivos al virus EHV-1 post-inoculación. Para las yeguas control no vacunadas, 15 de 22 (68,20%) parieron potros sanos normales . El cultivo de los 15 potros normales estaba libre de virus de inoculación EHV-1. Sin embargo, el virus EHV-1 fue aislado de los tejidos de los 7 neonatos abortados o muertos en el grupo control no vacunado. Por lo tanto, los vacunados mostraron una reducción del 67% en la incidencia de fetos y neonatos infectados por EHV-1 en comparación con las yeguas control no vacunadas . Esto demuestra claramente la eficacia de la vacuna monovalente EHV-1 en relación con la protección de las yeguas preñadas frente al aborto. Esto demostró que la vacuna monovalente EHV-1 produjo una reducción en la enfermedad respiratoria causada por EHV-1 en yeguas vacunadas en comparación con yeguas control no vacunadas. Además, la vacuna monovalente EHV-1 efectuó una reducción del aborto o la muerte en neonatos de yeguas gestantes vacunadas en comparación con yeguas gestantes control no vacunadas en un estudio de vacuna-ción/inoculación usando EHV-1 como virus de inoculación.

Tabla 2a - Resumen de partos para 19 yeguas gestantes vacunadas con EHV-1 monovalente tras inoculación intranasal con virus EHV-1 subtipo 1 El día medio post-inoculación para el parto fue el 58, el rango varió de 16 a 87 días. Los abortos/muertes debidos a EHV-1 fueron 2/19 ó 10,5%. Potros normales: 16/19 (84,2%) .

Tabla 2b - Resumen de partos para 22 yeguas control no vacunadas tras inoculación intranasal con virus EHV-1 subtipo 1 El día medio post-inoculación para el parto fue el 56, el rango varió de 20 a 83 días. Los abortos/muertes debidos a EHV-1 fueron 7/22 (31,8%). Potros normales: 15/22 (68,2%). EJEMPLO 2 Se estudió EHV-1 MHD 91-001 seriada descrita en el EJEMPLO 1 en un estudio de vacunación/inoculación en cuanto a su capacidad para proteger a los jóvenes destetados seronegativos de la enfermedad respiratoria producida por EHV-4. Se utilizaron veinte caballos puros destetados seronegativos a EHV-1 y EHV-4 en este estudio. Todos los caballos fueron paridos y mantenidos en aislamiento y, de este modo, no tuvieron exposición previa a EHV-4 o EHV-1. Un mes antes de la primera vacunación y el día de la primera vacunación, todos los destetados fueron sangrados para confirmar que todos eran seronegativos. Diez de los destetados fueron vacunados con una dosis de 1 mi de la vacuna monovalente para EHV-1 EHV-1 MHD 91-001. A los veintiocho días de la primera vacunación, se administró una dosis de refuerzo de 1 mi a los destetados vacunados. A los catorce días del refuerzo, todos los destetados fueron inoculados con una cepa EHV-4 heteróloga denominada T446. Todos los destetados fueron observados en cuanto a signos clínicos de enfermedad respiratoria EHV-4 durante 11 días post-inoculación. Cada destetado fue inoculado intranasalmente con 104'0 DICT50 del virus EHV-4 usando el nebulizador previamente descrito. Los signos clínicos de enfermedad respiratoria quedaban indicados por la observación de los exudados nasales y una elevada temperatura. Los exudados nasales fueron puntuados diariamente por un solo individuo para mantener la consistencia de las observaciones. Se asignaron grados de puntuación de 0 a 6 en base a la gravedad de la enfermedad. Una puntuación de 4 o más fue determinada como indicativa de enfermedad respiratoria significativa. Adicionalmente, se sacaron muestras de sangre para evaluación del recuente de WBC y de las respuestas de los títulos serológicos y se tomaron muestras nasales con torundas para los aislamientos del virus . En las Tablas 3a y 3b se muestran los resultados del aislamiento del virus y de los exudados nasales y en la Tabla 4 se muestran los resultados serológicos . Las respuestas de temperatura eran significativas, lo mismo que los recuentos de glóbulos blancos. Esto no es anormal para la enfermedad respiratoria asociada a EHV-4. Hubo una diferencia en la descarga vírica, según se determinó por aislamientos del virus de las torundas nasales (Tabla 3a) . Un número medio de 6,7 controles no vacunados eliminó virus en sus exudados nasales a lo largo del período Post-Inoculación de 11 días, mientras que un número medio de 3,4 vacunados eliminó virus. Esto se correspondía con una reducción del 52% en la descarga vírica. La diferencia en las puntuaciones de exudado nasal entre los vacunados y los controles no vacunados era estadísticamente significativa (Tabla 3b) . El 80% de los animales control no vacunados demostró puntuaciones de exudado nasal >4 , que indicaban enfermedad respiratoria grave, mientras que sólo un 20% de los animales vacunados demostró puntuaciones de exudado nasal >4. Esto representa una reducción del 75% de la enfermedad respiratoria en los vacunados. Incluso de mayor importancia es el hecho de que los vacunados sólo demostraron 2 días de puntuaciones de exudado nasal >4, mientras que los controles no vacunados demostraron 10 días de puntuaciones de exudado nasal >4. La Tabla 4 muestra la respuesta serológica (título de neutralización sérica) de los destetados postvacunación, el día de refuerzo, el día de inoculación y 14 días post-inoculación. Una prueba de que no hubo preexposición ni a EHV-4 ni a EHV-1 antes de la inoculación, es que los controles no vacunados seguían siendo seronegativos para ambos subtipos víricos. Todos los destetados demostraron títulos serológicos positivos para EHV-4 post-inoculación. A diferencia de las publicaciones de otros científicos, todos los destetados vacunados, excepto uno, desarrollaron títulos séricos de neutralización tanto para EHV-1 como para EHV-4 como resultado de la primera o de la segunda vacunación. Esto confirma que esta vacuna monovalente EHV-1 es efectiva en la producción de respuestas serológicas tanto a EHV-1 como a EHV-4. La declinación general de los títulos de neutralización séricos de EHV-1 y de EHV-4 a los 14 días post-inoculación sugiere que el virus de inoculación EHV-4 neutraliza a ambos anticuerpos EHV-1 y EHV-4, que fueron desarrollados por la vacuna monovalente EHV-1. En resumen, se ha demostrado que la vacuna monovalente EHV-1 de esta invención produce protección frente a una inoculación respiratoria de EHV-4 y produce una respuesta serológica tanto para EHV-1 como para EHV-4 en caballos destetados que no estuvieron preexpuestos a ningún subtipo vírico.

Tabla 3a - Enfermedad respiratoria EHV-4 -- Aislamiento del virus de torundas nasales DÍAS POST-INOCULACIÓN Número de destetados que eliminan virus cada día post-inoculación Días medios de aislamiento de virus para vacunados = 3,4 (30,9%). Días medios de aislamiento de virus para controles no vacunados = 6,7 (60,9%) 50% de reducción de los días medios de aislamiento del virus.

Tabla 3b - Enfermedad respiratoria EHV-1 -- Puntuación de exudado nasal >4 Número de destetados con puntuaciones de exudado nasal >4 para cada día 80% de los controles no vacunados demostraron puntuaciones de exudado nasal significativas, 20% de los vacunados demostraron puntuaciones de exudado nasal significativas.

Tabla 4a y 4b - Títulos séricos de neutralización EHV-1 y EHV-4 registrados para 10 destetados vacunados y 10 destetados control no vacunados recogidos pre y post-vacunación y pre y post-inoculación con virus EHV-4 Tabla 4a TMG = Título medio geométrico. VI = Vacunación 1. V2 = Vacunación 2 Habiendo descrito de este modo la invención, resultará obvio que la misma puede variar de muchas formas . No se ha de considerar que dichas variaciones se apartan del espíritu y alcance de esta invención y todas esas modificaciones pretender ser incluidas en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES 1. Una vacuna monovalente EHV-1 que proporciona protección frente a enfermedades asociadas a EHV-1 y EHV-4.
2. 2. La vacuna según la Reivindicación 1, que proporciona protección frente a la enfermedad respiratoria causada tanto por EHV-1 como por EHV-4 y su combinación.
3. 3. La vacuna según la Reivindicación 1, consistente en una cepa de EHV-1 denominada AB69 o una cepa equivalente.
4. 4. Un método de preparación de la vacuna según la Reivindicación 1, consistente en las siguientes etapas : a. infectar una línea celular susceptible con un virus EHV-1; b. dejar que dicho virus EHV-1 crezca en un medio de soporte del crecimiento hasta que se produce un ECP significativo; c. recoger dicho medio de soporte del creci- miento que contiene dicho virus EHV-1, células muertas, restos celulares y células infectadas para producir un material de cosecha; d. inactivar dicho material de cosecha con un agente inactivante adecuado, y e. adyuvar dicho material de cosecha inactivado.
5. 5. El método según la Reivindicación 4, donde dicha línea celular es una línea celular equina.
6. 6. El método según la Reivindicación 5, donde dicha línea celular equina es seleccionada entre el grupo consistente en una línea celular dérmica equina, una línea celular de riñon equino y una línea celular de pulmón fetal equino.
7. 7. El método según la Reivindicación 4, donde el agente inactivante es seleccionado entre el grupo consistente en beta-propiolactona, formalina y etilenimina binaria.
8. 8. El método según la Reivindicación 4, donde el adyuvante es seleccionado entre el grupo consistente en HavlogenlR>, Carbopol 934P( >, Polygen(R) , copolímeros de bloque, polímeros, aceites, sales de aluminio, cito inas, inmunomoduladores y combinaciones de los mismos.
9. 9. El método según la Reivindicación 4, donde se añade un estabilizante a la vacuna.
10. 10. El método según la Reivindicación 4, donde dicho material de cosecha es purificado antes de inactivarlo.
11. 11. El método según la Reivindicación 10, donde dicha purificación consiste en filtración, ultrafiltración, cromatografía en columna o combinaciones de éstas.
12. 12. El método según la Reivindicación 4, donde dicho material de cosecha es concentrado antes de inactivarlo.
13. 13. Un procedimiento para proteger a un caballo frente a enfermedades asociadas a EHV-1, EHV-4 o una combinación de los mismos, consistente en administrar al caballo una vacuna según se ha indicado en la Reivindicación 1.
14. 14. Un procedimiento para proteger a un caballo frente a enfermedades asociadas a EHV-1, EHV-4 o una combinación de los mismos, consistente en administrar al caballo una vacuna según se ha indicado en la Reivindicación 3.