MXPA97010149A - Vacunas de virus vivo prrs de baja patogenicidad y metodos de preparacion de las mismas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a vacunas de PRRS vivo o modificado para administrarse a cerdos, las cuales son de baja virulencia y confieren inmunidad efectiva contra el PRRS. Las vacunas preferidas incluyen aislados de virus que tienen diámetros de placa promedio de menos de aproximadamente 2mm y baja patogenicidad. Una vacuna preferida incluye una cepa de diámetro de placa pequeño, No. de Acceso ATCC VR2509. Las vacunas de la invención pueden administrarse a hembras reproductoras o cerdas jóvenes y a lechones destetados, y son efectivas para inmunizar a los cerdos contra ambas formas de la enfermedad, la respiratoria y la reproductiva.

Description

VACUNAS DE VIRUS VIVO PRRS DE BAJA PATOGENICIDAD Y MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE LAS MISMAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. Campo da la Invención La presente invención se relaciona ampliamente con las vacunas de virus vivos de baja patogenicidad para la administración a cerdos para conferir inmunidad efectiva en los cerdos contra las infecciones virales del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) . De manera más particular, la invención pertenece a las vacunas vivas, junto con los métodos de inmunización de cerdos contra el virus de la PRRS y los métodos para preparar tales vacunas. Un virus PRRS nuevo, sustancialmente aislado y purificado, de baja patogenicidad, No. de Acceso ATCC VR2509, también forma parte de la invención. 2. Descripción dß la Técnica Anterior La PRRS ha emergido en los últimos años como una enfermedad viral importante de los cerdos. La PRRS causa fallas reproductivas severas en cerdas preñadas, manifestadas en forma de partos prematuros, incremento en el número de REF: 26329 cerdos nacidos muertos, momificados y débiles, disminución en los porcentajes de partos y regreso retardado al celo. Los signos del PRRS reproductivo agudo generalmente duran 2-4 meses en las granjas afectadas, pero los problemas respiratorios de la enfermedad pueden continuar durante muchos años, causando pérdidas de producción significativas. Se han reportado varios estudios sobre la patogénesis de la infección por el virus de la PRRS en cerdas/cerdas jóvenes con un embarazo avanzado (77-95 días de gestación) . En cada estudio, se demostró la capacidad del virus del PRRS para causar infección transplacentaria y patogenicidad fetal. Sin embargo, la patogenicidad fetal no fue obvia en las cerdas a la mitad de la gestación, y los fetos a la mitad de la gestación infectados en el útero permanecieron casi normales. Bajo condiciones de campo, existen algunas granjas que no han mostrado problemas reproductivos agudos o la forma respiratoria crónica de la enfermedad pero son serológicamente positivas al PRRS. Las bases de la carencia de signos clínicos de la enfermedad en tales casos no están bien comprendidas. Se ha sugerido que pueden existir cepas del virus del PRRS de baja patogenicidad y que esas son responsables de infecciones en poblaciones de cerdos que no exhiben los síntomas clínicos del PRRS. Diferentes investigadores han reportado un número de aislados de virus del PRRS. Todos han mostrado tener ARN y envolturas que contienen lípidos, pero no la capacidad de hemaglutinación de los eritrocitos de diferentes especies animales.

Brava Descripción de la Invención La presente invención supera los problemas expuestos anteriormente, y proporciona vacunas para el PRRS, vivas o vivas modificadas, mejoradas para administrarse a -cerdos. Las vacunas de la invención comprenden una cantidad suficiente de virus vivo o virus modificado para conferir inmunidad efectiva en los cerdos contra la infección por PRRS natural virulenta. Como se usa aquí, "inmunidad efectiva" se refiere a la capacidad de la vacuna para prevenir la infección por PRRS en cerdos, la cual da signos clínicos sustanciales de la enfermedad. Es decir, que los cerdos inmunizados pueden o no ser serológicamente positivos para el PRRS, pero no exhibir ningún síntoma clínico sustancial. En las formas preferidas, las vacunas de la invención incluyen un virus vivo nuevo designado MN-Hs, el cual fue depositado en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, el 26 de Julio de 1995, y se acordó como No. de Acceso ATCC VR2509. Este virus ha mostrado ser sustancialmente avirulento y confiere inmunidad efectiva. Las vacunas del mismo pueden ser administradas a hembras reproductoras, cerdas jóvenes, jabatos o lechones destetados, y tal administración puede ser por cualesquier medios convenientes tales como inyección intramuscular o administración oral-nasal. De manera general, las dosis de la vacuna podrían contener de aproximadamente 104 hasta aproximadamente 108 unidades formadoras de placa del virus. De manera más general, la invención también pertenece a un método para preparar vacunas para cerdos para la PRRS, el cual implica obtener primero por técnicas de clonación en placa una cepa o asilado de virus del PRRS que tiene un diámetro de placa promedio de menos de aproximadamente 2 mm sobre césped confluente de células MARC-145, y preparar una vacuna viva de tal cepa. El linaje celular MARC-145 ha sido depositado en la ATCC y se acordó como No. de Acceso ATCC . De manera preferible, las vacunas de la invención consisten esencialmente de tales virus de diámetro de placa pequeño el cual se obtuvo en forma sustancialmente purificada. El virus preferido No. de Acceso ATCC VR2509 tienen tal diámetro de la placa pequeña, y como se indicó es en esencia completamente avirulento aunque confiere inmunidad.

Breve Deacripción da loa Dibujos La Figura 1 es una fotografía que ilustra la morfología y tamaño de la placa del aislado de virus del PRRS MN-Hs (<2 mm) sobre el linaje celular MARC-145; La Figura 2 es una fotografía que ilustra la morfología y tamaño de la placa del aislado de virus del PRRS MN-HL (3-5 mm) sobre el linaje celular MARC-145; y La Figura 3 es una fotografía que ilustra la morfología y tamaño de la placa del aislado de virus del PRRS MN-W (2-3 mm) sobre el linaje celular MARC-145.

Descripción Detallada da la Modalidad Preferida Los siguiente ejemplos exponen las técnicas preferidas para aislar, identificar y clonar la cepa de virus del PRRS de baja patogenicidad, así como una técnica preferida para la producción de vacunas de la misma; deberá comprenderse que esta información se proporciona a manera de ilustración únicamente, y que de ninguna manera deberá ser tomada como limitante del alcance total de la invención. Las referencias mencionadas se incorporan aquí como referencia.

Ejemplo 1 Resumen En este ejemplo, se investigó la patogénesis de una variante de placa pequeña (MN-Hs) del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) en cerdas preñadas. La cepa MN-Hs fue inicialmente clonada a partir del virus MN-H que fue una mezcla de virus de placa pequeña y grande (MN-H) . En el primer experimento para comparar la patogenicidad fetal, se inocularon intranasalmente 2 cerdas preñadas cada una a los 86 días de gestación como MN-Hs, MN-HL, un aislado de campo (MN-W) , y medio de cultivo celular (controles), respectivamente. Todas las cerdas se dejaron parir hasta su término excepto las cerdas control. Las cerdas infectadas fueron virémícas al día 7 después de la inoculación (Pl) seroconvertidas al día 14 Pl por una prueba de anticuerpo fluorescente indirecto (IFA) . Dos cerdas infectadas con virus MN-Hs dieron a luz a 14 cerdos vivos y 5 muertos, mientras que 2 cerdas infectadas con virus MN-HL parieron o cerdos vivos y 25 muertos. Dos cerdas inoculadas con MN-W parieron 10 lechones vivos y 20 muertos. Dos cerdas control tuvieron 16 cerdos normales hasta el sacrificio a los 107 dias de gestación. El virus se aisló de 1 (66.7%) de 24 cerdos nacidos vivos, 9 (64.3%) de 14 nacidos muertos y 3 (12.0%) de 25 momificados de las 6 cerdas infectadas. Seis de 13 sueros de cerdos nacidos muertos de 4 cerdas infectadas con MN-HL o MN-W mostraron tener títulos de anticuerpo de virus del PRRS que fluctúan de 1:16-1:1,024 por el método IFA. En un experimento posterior para repetir los resultados con el virus MN-Hs, se inocularon intranasalmente 2 cerdas preñadas a los 6 días de gestación con MN-Hs, intramuscular ente con MN-Hs e intranasalmente con un aislado de campo diferente (OVL-173) , respectivamente, y todas las cerdas se dejaron parir hasta su término. Las dos cerdas infectadas intranasal e intramuscularmente con virus MN-Ha parieron 15 cerdos vivos con 6 muertos y 25 cerdos vivos con 5 muertos, respectivamente, mientras que 2 cerdas infectadas con OVL-173 dieron a luz a 6 cerdos vivos y 24 muertos. Esos resultados sugieren que la patogenicidad del virus del PRRS para los fetos de cerdo difiere entre los aislados del virus, y la cepa MN-Hs del virus del PRRS es un virus moderadamente patógeno. Se encontró que la detección de anticuerpo del virus del PRRS en sueros de cerdos nacidos muertos es un método útil para el diagnóstico de la infección fetal.

Materiales y Métodos Virus y cultivo celular. Se usaron tres aislados de virus del PRRS diferentes en este estudio. Un MN-H aislado se derivó del suero de un cerdo de vivero sano en una granja con signos de PRRS subclínicos. El virus MN-H fue inicialmente una mezcla de poblaciones de virus con tamaños de placa variables. Se clonaron virus de placa pequeña (MN-Hs) y grande (MN-HL) por separado a partir de virus MN-H, y cada virus se purificó en placa cuatro veces para el primer experimento y seis veces adicionales para el experimento subsecuente por un método de clonación en placa de acuerdo con Him et al., Am. J. Vet . Res . , 52:1649-1652 (1991). En cada uno de tales pases de placa, las monocapas celulares de MARC-145 confluentes (una clona permisiva derivada de un linaje celular de riñon de mono verde Africano (MA-104)) se hicieron crecer en cajas de Petri de 60 mm x 15 mm (las células se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle (MEM) suplementado con 3% de suero de carnero fetal (FCS), 0.15% de carbonato de sodio, y antibióticos (Kim et al., Arch. Virol . , 133:477-483 (1993)) y se inocularon con un virus respectivo. Los cultivos se incubaron durante 60 minutos 37°C después lo cual el inoculo se removió y los cultivos se lavaron una vez con MEM. Posteriormente se agregó una alícuota de 5 ml de medio de cultivo líquido a cada caja, que consistió de un volumen igual de 2X MEM y 1.6% de agar de Noble hervido (Disco Laboratories) suplementado con 50 µg de dietilaminoetilo (DEAE) -dextran/ml. Las placas se incubaron adicionalmente durante 5 días a 37°C en un incubador de C02. Al final del periodo de incubación, los cultivos en placa se visualizaron agregando a estos 3 ml de PBS suplementado con rojo neutro al 1%. Las placas seleccionadas se clonaron recolectando con una pipeta de Pasteur estéril y se pasaron por inoculación sobre monocapas de células MARC-145 no infectadas. Para una tinción permanente, el agar se removió cuidadosamente y las monocapas celulares se tiñeron con 2 ml de cristal violeta al 1% en etanol al 20% durante 10 minutos. Las placas se enjuagaron con agua de la llave para facilitar el examen de las placas. El virus del PRRS MN-W se aisló del suero de cerdas enfermas de una granja con signos de PRRS agudo típico, v el OVL-173 se obtuvo de Oxford Veterinary Laboratories, Worthington, MN.

Aniaal y diseño experimental. Las cerdas preñadas de aproximadamente 80 días de gestación se obtuvieron de una granja que no tenía historia de evidencia clínica o serológica de infección por virus del PRRS. Las cerdas habían sido vacunadas dos veces al año contra el parvovirus porcino (PPV) y Leptospira spp. , en la granja. Se obtuvieron las fechas de reproducción exactas de cada una. Después de comprarse, cada cerda fue alojada por separado en un cuarto de aislamiento en la Universidad de Minnesota. A los 86 días de gestación, las dos cerdas fueron cada inoculadas intranasalmente con virus MN-Hs, MN-HL y MN-W (2 ml, ?o5-0-5-5 TCID5o/p?l), respectivamente. Las dos cerdas restantes se inocularon con medio de cultivo celular y sirvieron como controles. Se recolectaron muestras de suero de cada una de las cerdas a intervalos para el aislamiento del virus y serología. Seis cerdas infectadas se dejaron parir naturalmente, y dos cerdas control se sacrificaron a los 107 días de gestación, para examinar los fetos. Al momento de parir, se recolectaron muestras de sangre y pulmón de lechones vivos y nacidos muertos y de fluidos torácicos de fetos momificados para el aislamiento del virus y serología. En el segundo experimento, el virus MN-Hs fue purificado en* placa seis veces adicionales antes de la inoculación. Se inocularon intranasalmente dos cerdas preñadas, cada una a los 86 días de gestación con MN-Hs, intramuscularmente con MN-Hs e intranasalmente con un aislado de campo diferente (OVL-173), y todas las cerdas se dejaron parir hasta sus términos. Al momento del parto, se midieron las longitudes de las ancas coronadas de fetos momificados y nacidos muertos para estimar el tiempo de la muerte. (Marrable et al., J. Agrie . Sci . , 69:443-447 (1967)). Se recolectaron y analizaron muestras de sangre y pulmón como se describe en el primer experimento.

Aislamiento del virus y serología. Para el aislamiento del virus, cada muestra de suero o sobrenadante del ho ogeneizado de pulmón se colocó en los pozos de una placa de 24 pozos, y se les agregó células MARC-145 (1-2 x 105 células/ml) suspendidas en MEM suplementado con 3% de FCS. Los cultivos se observaron por los efectos citopáticos (CPE) típicos o virus del PRRS durante 5-7 días. Las placas se congelaron y descongelaron dos veces, y los sobrenadantes se inocularon en los pozos de una microplaca de 96 pozos con suspensión de células MARC-145 frescas y se incubaron durante 3-4 días. Las evidencias de infección por virus se examinaron observando tanto los CPE como la fluorescencia específica usando un suero de cerdo positivo de referencia de virus del PRRS. Los sueros de las cerdas y cerdos se probaron para anticuerpo por medio de un método de anticuerpo fluorescente indirecto (IFA) (Yoon et al., J. Vet . Diag. Xnvest . , 4:144-147 (1992)). Las placas de prueba de 96 pozos se prepararon usando células del linaje MARC-145. Algunos de esos sueros fueron probados para el anticuerpo para PPV por la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HL) como se describió anteriormente (Joo et al., Aust . Vet . J. , 52:422-424 (1976)).

Resultados Los aislados de virus del PRRS mostraron tamaños de placa diferentes en el aislamiento inicial. El aislado de MN-H se clonó en dos poblaciones diferentes de MN-Hs y MN-HL por sus tamaños de placa. Después de la clonación, los tamaños de placa respectivos para MN-Hs y MN-HL fluctuaron consistentemente de <2 mm y 3-5 mm en los diámetros, mientras que aquellos de MN-W fueron de 2-3 mm (véanse las Figuras) . No se observaron signos clínicos mayores en las cerdas después de la infección con aislados de virus del PRRS, además de la anorexia moderada detectada en cerdas 112 y 153 durante 5 días después de la inoculación (Pl) . Los virus se aislaron de muestras de suero de seis de las seis cerdas siete días Pl y una de las seis cerdas 14 días Pl. Los altos títulos de anticuerpo detectaron en todas las cerdas, inoculadas 14 días Pl, como se expone en la Tabla 1.

Tabla 1. Viremia y respuesta del anticuerpo en cerdas con un periodo dß gestación de 86 dias después de la infección experimental con aislados de virus del PRRS Días Después de la Inoculación Cerda Infectada 0 7 14 21 28 No. con el Virus 17 MN-Hs -/-a +/- -/l, 024 -/l, 024 -/256 53 MN-Hs -/- +/- -/l, 024 -/l, 024 -/l, 024 Tabla 2. Resultados al momento de parir y aislamiento del virus de cerdas con un periodo de gestación de 86 dias infectadas con diferentes aislados dß virus del PRRS aDía gestacional al momento del parto o sacrificio bLongitud de las ancas coronadas (cm) de fetos momificados o nacidos muertos cNúmero de muestras de aislado de virus/número de muestras probadas dLas cerdas fueron sacrificadas a los 107 días de gestación para examinar los fetos LB-nacido vivo; SB-nacido muerto; M-momificado; IN- intranasal; IM-intramuscular; ND-no determinado.

El virus se aisló de uno o más fetos en cada carnada de cerdas infectadas. Los resultados de aislamiento del virus de cerdos individuales de seis cerdas infectadas en el Experimento I mostraron que aproximadamente la mitad de los fetos (28 de 63 cerdos) examinados fueron positivos al aislamiento del virus. Entre los cerdos probados para La presencia del virus, 16 (66.7%) de 24 cerdos nacidos vivos, 9 (64.3%) de 14 cerdos nacidos muertos, y 3 (12.0%) de cerdos momificados fueron positivos al virus. De 28 cerdos positivos al virus de sus muestras de suero, 10 cerdos fueron negativos para el virus cuando sus pruebas de tumor se probaron para el. aislamiento del virus. Los sueros de los cerdos nacidos muertos de las cerdas 153, 147, 68 y 112 se probaron para anticuerpos para el virus del PRRS por IFA y para PPV por HL, y los resultados se muestran en la Tabla 3. Seis de los 13 sueros de los cerdos nacidos muertos y 2 de 25 fluidos torácicos de los cerdos momificados tuvieron anticuerpo para el virus del PRRS. Los títulos de IFA fluctuaron de 1:16-1:1,024, mientras que ninguno de los sueros tuvieron anticuerpo para PPV. Trece de 14 cerdos nacidos vivos de la cerdas 17 y 53 tuvieron anticuerpos para ambos virus PRRS (títulos de IFA 1:64-1:1,024) y PPV (títulos de HL 1:512-1:16,384).

Tabla 3. Detección de anticuerpos para el virus del PRRS y PPV an sueros de cerdos nacidos muertos de cerdas infectadas con virus del PRRS aLongitud de las ancas coronadas (cm) bRecíprocos del título del IFA o HL °LB-nacido vivo; SB-nacido muerto; M-momificación Discusión El presente estudio confirmó la capacidad de diferentes aislados de virus del PRRS para causar infección transplacentaria y efectos patógenos sobre los fetos de células en la etapa final de gestación. Sin embargo, ni hubo una diferencia obvia en la patogenicidad entre los aislados, de virus del PRRS. Cuando se inocularon cerdas parturientas múltiples intranasalmente con virus del PRRS ATCC-VR 2332 al día 93 de la gestación, (Christianson, W. T. et al., Can J. Vet . Res. , 57:262-268 (1993)), a un promedio de 5.8 lechones vivos y 6.0 fetos muertos por carnada. En el presente estudio, se infectaron 6 cerdas con MN-HL O 2 virus de campo que parieron un promedio de 2.7 cerdos vivos y 11.5 cerdos muertos por carnada, y de este modo esos virus fueron considerados altamente virulentos. La patogenicidad entre el ATCC-VR 2332 y los virus virulentos usados en este estudio fue diferente. Esto puede deberse a las edades gestacionales al momento de la infección puesto que el virus ATCC-VR 2332 fue infectado 7 días más tarde. Mientras que 6 cerdas infectadas con MN-Hs dieron a luz a un promedio de 9.0 cerdos vivos y 2.7 cerdos muertos por carnada. Esos resultados son notablemente diferentes a aquellos para los virus virulentos, indicando que el virus MN-Hs es una cepa modernamente patógena. Es interesante que se observó una diferencia obvia en los resultados al momento de parir de las cerdas infectadas con virus MN-Hs y MN-HL que fueron del mismo origen. Bajo las mismas condiciones, los virus MN-Hs y MN-HL produjeron de 5 a 25 cerdos nacidos muertos (p <0.005), respectivamente. Con los presentes resultados, puede concluirse que la patogenicidad del MN-Hs y el MN-HL es-significativamente diferente, una es una cepa moderada y el otro es un virus altamente patógeno. El aislamiento del virus de las carnadas infectadas con virus del PRRS fue relativamente fácil, y el virus se aisló en un porcentaje similar entre los cerdos vivos y los nacidos muertos. Debido a que el virus no puedo ser recuperado de todos los cerdos en una carnada infectada, deberá intentarse el aislamiento del virus para un propósito de diagnóstico de al menos 2 o más lechones por carnada. También, se encontró que aislamiento del virus se llevó a cabo de manera más conveniente del suero que de muestras de tejido pulmonar. En las carnadas de cerdas infectadas con virus virulento, uno o más cerdos nacidos muertos tuvieron anticuerpo específico para el virus del PRRS detectable. Esos resultados sugieren que la detección del anticuerpo de lechones nacidos muertos o preabsorbidos puede ser un método útil para el diagnóstico de la infección por virus del PRRS en carnadas anormales. Este método podría ser valioso en laboratorios en donde están disponibles técnicas e instalaciones para el aislamiento de virus. En el presente estudio, 6 de 13 cerdos nacidos muertos tuvieron títulos de anticuerpo positivos para el virus del PRRS pero para el PPV, asegurando que los anticuerpos detectados son de origen fetal y se deben al virus del PRRS. No se sabe porque algunas manadas infectadas con el virus del PRRS no desarrollan signos clínicos. Se ha experimentado que manadas con un estado de salud alto antes de la infección por el virus del PRRS demuestran una respuesta clínica moderada, en comparación con aquellas con un bajo nivel de enfermedad. El estado saludable prevaleciente, junto con las diferencias de la cepa demostradas en este estudio son explicaciones posibles para las diferencias evidentes en la presentación clínica. De manera adicional, puede postularse que puede ocurrir una interacción entre los virus de placa pequeña y grande dentro de un animal huésped y modificar la patogenicidad. Esto puede ser cierto, si se considera que existe una carencia de problemas reproductivos en la granja, que en donde se aisló el virus MN-H a pesar de que está presente un virus MN-HL del PRRS altamente patogénico en la granja.

Ejemplo 2 Las vacunas preferidas de acuerdo con la invención puede administrarse a cerdas jóvenes reproductoras, cerdas, jabatos o lechones destetados. La administración puede ser intramuscular o nasal y puede darse en cualquier momento. Sin embargo, se prefiere vacunar a las hembras reproductoras antes del apareamiento para protegerlas durante todo e? periodo de preñez, e inmediatamente después del destete para cerdos jóvenes, para proteger a este último vivero, que cede y finalizar las etapas. De manera general, las vacunas de la invención sedan en dosis de 2 ml las cuales contienen aproximadamente 104 hasta aproximadamente 108 unidades formadoras de placa (PFU) , y de manera más preferible aproximadamente 106 PFU. La inmunidad dura al menos un periodo de preñez en el caso de las hembras reproductoras, mientras que la vacunación después del destete de los lechones jóvenes conferirá inmunidad para la protección a través del periodo final. Las vacunas preferidas de acuerdo con la invención pueden proporcionar un amplio intervalo de, protección cruzada.

Las vacunas de acuerdo con la invención pueden incluir virus vivos o virus modificados (atenuados) , así como portadores, estabilizadores y/o adyuvantes convencionales.

Ejemplo 3 Introducción En este ejemplo, se examinó la capacidad de una vacuna compuesta de la cepa MN-Hs del PRRSC Norteamericano para proteger a lechones de 3 semanas de edad de la viremia. causada por infección con la cepa MN-HL virulenta del PRRSV Norteamericano. La enfermedad respiratoria asociada con la infección por el PRRSV Norteamericano se debió principalmente a la infección por patógenos secundarios presentes en granjas de cerdos. Sin embargo, bajo condiciones experimentales, los signos clínicos respiratorios en los cerdos infectados con PRRSV Norteamericano no se reprodujeron consistentemente debido a la ausencia de esos patógenos secundarios . Por lo tanto, la detección de la viremia es el mejor indicador de la infección por PRRS Norteamericano. La ausencia de viremia después del desafio con la cepa MN-HL indica que los lechones vacunados con la cepa MN-Hs son inmunes a la infección por la cepa MN-HL.

Materiales y Métodos Se obtuvieron 20 lechones de 3 semanas de edad de una granja libre de PRRS. Doce de los lechones fueron vacunados intranasalmente con la cepa MN-Hs (2 ml, 104-5 TCID5o/ml) , y los 8 lechones restantes sirvieron como controles. Los lechones vacunados y control se alojaron en cuartos separados de una unidad de aislamiento. Seis de los lechones vacunados (lechones nos. 81-86) y 4 lechones control (lechones nos. 93-96) fueron desafiados intranasalmente con la cepa MN-HL (2 ml, 104'5 TCID50/ml) 2 semanas después de la vacunación (Grupo I) . Los 6 lechones vacunados restantes (lechones nos. 87-92) y 4 lechones control (lechones nos. 97-100) fueron desafiados de manera similar 6 semanas después de la vacunación (Grupo II) . Todos los lechones se observaron diariamente para registrar los signos clínicos. De manera adicional, se recolectaron muestras de sangre semanalmente de cada lechón para (1) aislamiento del virus usando cultivo de células MARC-145 (Yoon et al., J. Vet . Diag. Invest . , 6:289-292 (1994)) y (2) determinación de los títulos de anticuerpo de neutralización en suero (SN) (Park et al., Am. J. Vet . Res . , 57:320-323 (1996)); la detección de anticuerpo SN en lechones vacunados indica inmunidad protectora al PRRSV Norteamericano virulento.

Resultados Después de la vacunación, el virus de la vacuna se aisló de lechones en los Grupos I y II tres semanas después de la vacunación. Después del desafío, no se observaron signos clínicos en ninguno de los lechones control y vacunados en los Grupos I y II.

Grupo I. No se detectó anticuerpo SN en ninguno de los lechones al momento del desafío. Después del desafío, el virus desafiante se recuperó tanto de los lechones vacunados" como de los controles. Además, ambos lechones vacunados y control desarrollaron viremia (Tabla 1) .

Gruo II. Los lechones vacunados produjeron anticuerpo SN comenzando a las tres semanas después de la vacunación y mostraron títulos de entre 1:2 y 1:8 al momento del desafío. Después del desafío, el virus desafiante no se aisló de los lechones vacunados, mientras que los lechones control desarrollaron viremia (Tabla 4) . Esos resultados demuestran que los lechones vacunados adquirieron inmunidad protectora al PRRSV Norteamericano virulento.

Tabla 4. Detección da la viremia y anticuerpo SN an 1echones de 3 semanas de edad vacunados y desafiados 2 ó 6 semanas después de la vacunación Cerdo Semana después de la vacunación No. Grupo I 81 V -/-b -/~ -/- -/- -/2 82 V -/- -/- -/- +/- +/- 83 V -/- -/- +/- +/- +/2 84 V -/- -/- -/- -/- +/- 85 V -/- -/- +/- +/- +/4 86 V -/- -/- +/- +/- -/4 93 C -/- -/- -/- +/- +/- 94 C -/- -/- -/- +/- +/8 95 C -/- -/- -/- +/- +/4 96 C -/- -/- -/- +/- +/- Cerdo Semana después de la vacunación No. 0 1 2a 3 4 5 6a 7 8 Grupo II 87 V -/- -/- -/- +/+ -/- -/2 -/2 -/8 -/8 88 V -/- - /- +/- -/- -/- -/4 -/4 -/64 -/128 89 V -/- -/- +/- -/- -/2 -/8 -/8 -/8 -/32 90 V -/- - /- +/- +/- -/4 -/8 -/8 -/128 -/64 91 V -/- - /- +/- -/2 -/2 -/8 -/4 -/32 -/64 92 V -/- -/ - -/- -/- -/4 -/2 -/4 -/4 -/128 97 C -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- +/- 98 C -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- +/- 99 C -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- +/- 100 C -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/- -/2 V= Vacunado; C = Control a = Desafiado con virus MN-HL b = Aislamiento de virus/títulos de anticuerpo SN Los lechones en los Grupos I y II se sacrificaron a las 4 y 8 semanas después de la vacunación, respectivamente.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Una vacuna, caracterizada porque comprende un virus que tiene la designación ATCC VR2509.

2. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el virus está vivo.

3. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la dosis de la vacuna contiene de 104 a 108 PFU.

4. Un método para inmunizar un cerdo contra el síndrome reproductivo y respiratorio porcino Norteamericano, caracterizado porque comprende los pasos de administrar al cerdo la vacuna de conformidad con la reivindicación 1.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el virus está vivo.

6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el cerdo es una hembra reproductora madura .

7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el cerdo es un lechones.

8. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la vacuna se administra intramuscular, intranasal, u oralmente.

9. Un método para preparar una vacuna, caracterizado porque comprende los pasos de: (A) obtener por colonización en placa una cepa de PRRSV Norteamericano; y (B) preparar la vacuna a partir de la cepa obtenida en el paso (a) , en donde la cepa da placas que tienen un diámetro promedio de menos de 2 mm cuando las placas se obtienen por un método que comprende los pasos de: (a) inocular una alícuota de células con la cepa, en donde las células tienen la designación - CRL 12219, en donde la alícuota ser obtiene de una monocapa confluente de las células mantenidas en medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 3% de suero de carnero fetal y 0.15% de carbonato de sodio, en donde la alícuota incluye 1-2 X 105 células por ml de medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 3% de suero de carnero fetal y 0.15% de carbonato de sodio; (b) incubar la alícuota a 37°C durante 60 minutos; (c) remover el inoculo de la alícuota; (d) lavar la alícuota con medio esencial mínimo de Eagle; (e) resuspender la alícuota en 5 ml de medio esencial mínimo de Eagle 2X y 1.6% de* suplemento de agar de Noble hervido con 250 µg de dietilaminoetil (DEAE)- dextran; (f) cultivar la alícuota; y (g) incubar adicionalmente la alícuota a 37 °C durante 5 días en un incubador de C02 para dar las placas.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la vacuna comprende una cepa de PRRSV Norteamericano vivo.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el método de preparar la vacuna incluye el paso de obtener la cepa en forma purificada.

12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la cepa tiene la designación ATCC CR2509.

13. Una vacuna, caracterizada porque comprende una cepa de PRRSV Norteamericano, caracterizada porque la cepa da placas que tienen un diámetro promedio de menos de 2 mm cuando las placas se obtienen por un método que comprende los pasos de: (a) inocular una alícuota de células con la cepa, en donde las células tienen la designación CPL 12219, en donde la alícuota ser obtiene de una monocapa confluente de las células mantenidas en medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 3% de suero de carnero fetal y 0.15% de carbonato de sodio, en donde la alícuota incluye 1-2 X 105 células por ml de medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 3% de suero de carnero fetal y 0.15% de carbonato de sodio; (b) incubar la alícuota a 37°C durante 60 minutos; (c) remover el inoculo de la alícuota; (d) lavar la alícuota con medio esencial mínimo de Eagle; (e) resuspender la alícuota en 5 ml de medio esencial mínimo de Eagle 2X y 1,6% de suplemento de agar de Noble hervido con 250 µg de dietilaminoetil (DEAE)- dextran; (f) cultivar la alícuota; y (g) incubar adicionalmente la alícuota a 37°C durante 5 días en un incubador de C02 para dar las placas.

14. La vacuna de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la vacuna comprende una cepa de PRRSV Norteamericano vivo.

15. La vacuna de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la cepa tiene la designación ATCC VR2509.

16. Una cepa de PRRSV Norteamericano aislada y purificada, caracterizada porque la cepa tiene la designación ATCC VR2509.

17. La cepa de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la cepa está viva.

18. Una cepa de PRRSV Norteamericano aislada y purificada, caracterizada porque la da placas que tienen un diámetro promedio de menos de 2 mm cuando las placas se obtienen por un método que comprende los pasos de: (a) inocular una alícuota de células con la cepa, en donde las células tienen la designación CRL 12219, en donde la alícuota ser obtiene de una monocapa confluente de las células mantenidas en medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 3% de suero de carnero fetal y 0.15% de carbonato de sodio, en donde la alícuota incluye 1-2 X 105 células por ml de medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 3% de suero de carnero fetal y 0.15% de carbonato de sodio; (b) incubar la alícuota a 37°C durante 60 minutos; (c) remover el inoculo de la alícuota; (d) lavar la alícuota con medio esencial mínimo de Eagle; (e) resuspender la alícuota en 5 ml de medio esencial mínimo de Eagle 2X y 1.6% de suplemento de agar de Noble hervido con 250 µg de dietilaminoetil (DEAE)- dextran; (f) cultivar la alícuota; y (g) incubar adicionalmente la alícuota a 37°C durante 5 días en un incubador de C02 para dar las placas.

19. La cepa de conformidad con la reivindicación erizada porque la cepa está viva.