JPH07250683A - ウイルス感染力の抗体依存性促進に関連するウイルスに対するワクチン - Google Patents

ウイルス感染力の抗体依存性促進に関連するウイルスに対するワクチン

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JPH07250683A
JPH07250683A JP6318624A JP31862494A JPH07250683A JP H07250683 A JPH07250683 A JP H07250683A JP 6318624 A JP6318624 A JP 6318624A JP 31862494 A JP31862494 A JP 31862494A JP H07250683 A JPH07250683 A JP H07250683A
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Thomas Christoph Mettenleiter
トーマス・クリストフ・メツテンライター
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、ウイルス感染力の抗体依存性促進
に関連するウイルスに対するワクチンに関する。 【構成】 このようなワクチンは、ヘルペスウイルスゲ
ノムに挿入されたウイルスの抗原をコードする遺伝子を
有しており、細胞から細胞へ伝播することができ非感染
性後代ビリオンを産生するヘルペスウイルスベクターか
ら成る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞から細胞へ伝播す
ることができ非感染性後代ビリオンを産生する生存ウイ
ルスベクター、かかる生存ウイルスベクターを含む細胞
培養物及びこの生存ウイルスベクターに基づくワクチン
に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】動物及
びヒトのウイルス感染の大多数は命にかかわることはな
く、感染後に回復し、同一ウイルスの再感染に対する相
対的または絶対的な耐性状態を獲得させる。宿主防御の
要因として細胞性免疫メカニズムを挙げることもできる
が、ほとんどの耐性は特異的抗ウイルス抗体に依存する
と考えられている。ウイルスは複合抗原であり、それ自
体が、異なる種々の抗原決定基またはエピトープに対す
る抗ウイルス抗体の産生を刺激すると予想することがで
きる。すべての抗ウイルス抗体が必ずしもウイルス中和
抗体であるとは限らない(ＰｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄＪ.
Ｓ.,Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ３１,３３５-３５５,１９８６)。しかしなが
ら、これらのウイルス中和抗体または非中和抗体に加え
て、別の抗体グループ、即ちウイルスの感染力を促進す
る抗体群が存在する。この現象は、ウイルス感染力の抗
体依存性促進（ＡＤＥ）として知られており、種々のマ
クロファージ感染性ウイルスに関して観察されている。
【０００３】ウイルス感染力のＡＤＥは、単球またはマ
クロファージがウイルス単独よりも効率的にウイルスと
抗体との複合体に感染したときに生じる。ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのウイルス感染のＡＤＥは、
デング熱ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、ミューリー
谷脳炎ウイルス及び黄熱病ウイルスのような種々のフラ
ビウイルス類、ダニ脳炎ウイルス、セムリキ森林脳炎ウ
イルス、西部ウマ脳炎ウイルス及びシンドビスウイルス
のようなアルファウイルス類、乳酸デヒドロゲナーゼウ
イルス（トガウイルス科）、ヒト呼吸器合胞体ウイル
ス、インフルエンザＡ型ウイルス、狂犬病ウイルス、ネ
コ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ヒト及びネコの
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ，ＦＩＶ）並びにネズミサイ
トメガロウイルスなどの広範囲のウイルスについて報告
されている(Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ １９８６,前出;
Ｏｌｓｅｎ,Ｃ.Ｗ.,Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ ３６,１-３７,１９９３参照)。
【０００４】疾患発生病理の変質をｉｎ ｖｉｖｏに生
じさせるウイルス感染力のＡＤＥに関連するウイルスの
場合、ＡＤＥは、これらのウイルスに対するワクチンの
開発に重要な関係を有している。何故なら、ウイルス抗
原のワクチン接種によって促進抗体が予め存在している
と、被接種宿主が対象分野のウイルスに感染したときに
感染及び発病が促進されると考えられるからである。
【０００５】例えば、ネコの場合、ＦＩＰＶスパイクタ
ンパク質を発現し得る生存ワクシニアウイルスをワクチ
ン接種したネコの抗原投与後の「若死」症候群が報告さ
れている。組換えワクシニアウイルスをワクチン接種し
た子ネコはワクチン非接種動物よりも早く死亡し、抗原
投与後に生き残ったワクチン接種子ネコは天然発生ＦＩ
Ｐよりもはるかに重症のＦＩＰに罹患した(Ｖｅｎｎｅ
ｍａ Ｈ.ら、Ｊ.Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４,１４０７-１
４０９,１９９０)。
【０００６】ＡＤＥに関与するメカニズムに関しては、
ウイルスとの複合体を形成した促進抗体が、免疫グロブ
リンのＦｃ部分の受容体または補体成分の受容体を含む
細胞、マクロファージ及び単球に対してウイルスを結合
させ易くすると示唆されている。受容体とウイルス−抗
体複合体との結合が増加すると感染力が増加することに
なる(Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ,Ｊ.Ｓ.,１９８６,前
出)。
【０００７】従って、ウイルス感染力のＡＤＥに関連す
るウイルスに対して有効で、宿主の免疫系に提示された
ときに抗体の付随的な誘発を伴うことなく防御免疫応答
を誘発するようなワクチンの開発が切実に要望されてい
る。
【０００８】最近になって、新しい方法に基づく新世代
の生存ヘルペスウイルスワクチンがＨｅｆｆｎｅｒ,Ｓ.
ら(Ｊ.Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７,１５２９−１５３７,１
９９３)及びＰｅｅｔｅｒｓ,Ｂ.ら(Ｊ.Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ,６７,１７０−１７７,１９９３)によって開示され
た。これらの文献には、ヘルペスウイルス偽狂犬病ウイ
ルス（ＰＲＶ）のビリオンエンベロープの成分でありＨ
ＳＶ糖タンパク質ｇＤの相同体である糖タンパク質ｇｐ
５０が、遊離ＰＲＶビリオンの感染力に必須であること
が証明されている。ｇｐ５０欠失ビリオンは標的細胞内
に侵入できないため非感染性である。ｇｐ５０発現の欠
失したウイルス突然変異体は、染色体ＤＮＡ中にウイル
スｇｐ５０遺伝子を安定に内包した遺伝子操作細胞系で
単離され、遺伝欠陥の表現型相補に導くｇｐ５０- Ｐ
ＲＶによる感染中にこの遺伝子を発現する。得られたビ
リオンは、細胞系から提供されたｇｐ５０をそのエンベ
ロープに含み、十分に感染性の所謂ヌルウイルスであ
る。
【０００９】しかしながら、非相補性細胞の感染後には
ｇｐ５０が失われ、その結果として、これらの細胞から
放出されるビリオンは非感染性である。重要なことは、
細胞から細胞への直接的なウイルス伝播にはｇｐ５０が
不要であり、これは、表現型相補されたビリオンによる
一次感染後のウイルス伝播が細胞から細胞への直接伝達
のみによって生じることを意味する。
【００１０】また、表現型相補されずに細胞結合形態で
存在するｇｐ５０発現の欠失したＰＲＶ突然変異体を使
用したときにも同じ結果が得られた。
【００１１】
【課題を解決するための手段】上記のｇｐ５０- ＰＲ
Ｖ突然変異体に基づいて、被接種宿主の体内でのみ複製
し他の動物に伝播しないが被接種宿主の体内で防御免疫
を誘発し得る安全な生ワクチンが設計された。
【００１２】本発明はここに、ウイルス感染力のＡＤＥ
に関連するウイルスに対するワクチンの開発中に遭遇す
る諸問題を解決する新規な構想、即ち、細胞から細胞へ
伝播することができ非感染性後代ビリオンを産生する生
存ウイルスをウイルス感染力のＡＤＥに関連するウイル
スの抗原をコードする遺伝子のベクターとして使用する
ことを提案する。このようなベクターウイルスは、ヘル
ペスウイルスまたはポックスウイルス例えばワクシニア
に由来し得る。
【００１３】特に、細胞から細胞へ伝播することが可能
であり、非感染性後代ビリオンを産生する生存ヘルペス
ウイルスを細胞結合形態で鼻腔内経由または腸管外経由
で宿主に投与すると、体液性抗体の付随的な誘発を伴う
ことなく該ヘルペスウイルスに対する有意な防御が誘発
されることが知見された。
【００１４】従って本発明は、ウイルス感染力の抗体依
存性促進（ＡＤＥ）に関連するウイルスの抗原をコード
する遺伝子を内包するベクターとして使用できる生存ウ
イルス、特に、ヘルペスウイルスに関する。
【００１５】かかる生存ヘルペスウイルスベクターは、
標的細胞への侵入を担当するウイルスタンパク質をコー
ドする遺伝子の突然変異の結果として該ウイルスタンパ
ク質の発現が欠失しているが細胞から細胞への伝播特性
を維持しているウイルスであってもよい。かかるウイル
スはこのような遺伝欠陥に対して表現型相補される所謂
ヌルウイルスである。
【００１６】突然変異は、天然発生ウイルスの遺伝子中
に存在する遺伝情報に比べて同じ遺伝子中の遺伝情報の
変化であると理解されたい。
【００１７】突然変異としては特に、標的細胞への侵入
を担当する機能性ウイルスタンパク質を産生できないヘ
ルペスウイルス突然変異体を生じるような核酸の置換、
欠失、挿入もしくは反転、または、それらの組み合わせ
がある。
【００１８】または、所望の特性を有する生存ヘルペス
ウイルスベクターは、上記に定義の遺伝欠陥を有し、表
現型相補されずに細胞結合形態を有しているウイルスで
あってもよい。
【００１９】本発明のベクターのベースとなるヘルペス
ウイルスの特性及びそれらの調製は従来技術に概説され
ている(Ｈｅｆｆｎｅｒら、１９９３,前出;Ｐｅｅｔｅ
ｒｓら、１９９３,前出:国際特許出願ＰＣＴ／ＮＬ９３
／００１４６及びＰＣＴ／ＥＰ９３／０１６６１)。
【００２０】好ましくは、標的細胞内へのウイルスの侵
入を担当するウイルスタンパク質をベクターが発現でき
ないようにするヘルペスウイルスベクター中の遺伝欠陥
は、該ウイルスタンパク質をコードする遺伝子に外来Ｄ
ＮＡ配列を挿入するか（挿入性失活）及び／または該遺
伝子の全部または一部を欠失させることによって得られ
る。
【００２１】本発明のヘルペスウイルスベクターは、上
記に概説した所望の特性を示す任意のヘルペスウイルス
に由来し得る。好ましいヘルペスウイルスベクターは、
単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス
（ＶＺＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、
偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ネコヘルペスウイルス
（ＦＨＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）及びウマ
ヘルペスウイルスから成るヘルペスウイルスグループか
ら選択される。
【００２２】本発明の好ましい実施態様では、ヘルペス
ウイルスが偽狂犬病ウイルスから成る生存ヘルペスウイ
ルスベクターが提供される。
【００２３】上述の所望の特性を有する偽狂犬病ウイル
スベクターは、ｇｐ５０をコードする遺伝子の突然変異
の結果として糖タンパク質ｇｐ５０を（機能）発現する
ことができない偽狂犬病ウイルスでよい。即ち、偽狂犬
病ウイルスは遺伝子型ｇｐ５０-であるが、ｇｐ５０糖
タンパク質によって相補される。即ち偽狂犬病ウイルス
は表現型ｇｐ５０+である。
【００２４】または、適当な偽狂犬病ウイルスは遺伝子
型ｇｐ５０-であり、細胞結合形態である。
【００２５】本発明の生存ヘルペスウイルスベクターに
おいては、ウイルス感染力のＡＤＥに関連するウイルス
の抗原をコードする遺伝子を、ヘルペスウイルスの非必
須領域、即ち、ウイルスの感染または複製に必要な機能
のようなヘルペスウイルスの本質的機能を破壊すること
なく該遺伝子を取り込むために使用できる領域に挿入す
る。このような領域はヘルペスウイルスの専門家にはよ
く知られている。
【００２６】例えば、ＰＲＶの場合には、ｇｐ５０、ｇ
ｐ６３、ｇＩ、ｇＩＩＩ、ｇＸ、ＩＩＫ、チミジンキナ
ーゼ（ＴＫ）、リボヌクレオチドレダクターゼ（Ｒ
Ｒ）、プロテインキナーゼ（ＰＫ）または２８Ｋをコー
ドする遺伝子のようないくつかの非必須領域が開示され
ている(Ｐｅｅｔｅｒｓら、１９９３,前出;ｄｅ Ｗｉ
ｎｄ,Ｎ.ら、Ｊ.Ｖｉｒｏｌ ６４,４６９１-４６９６,
１９９０;Ｍｏｏｒｍａｎ,Ｒ.Ｊ.Ｍ.ら、Ｊ.Ｇｅｎ.Ｖ
ｉｒｏｌ ７１,１５９１-１５９５,１９９０;Ｐｅｔｒ
ｏｖｓｋｉｓ,Ｅ.Ａ.ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５９,１
９３-１９５,１９８７;ｖａｎ Ｚｉｊｌ,Ｍ.ら、Ｊ.Ｇ
ｅｎ.Ｖｉｒｏｌ ７１,１７４７-１７５５,１９９０;
Ｔｈｏｍｓｅｎ,Ｄ.Ｒ.ら、Ｇｅｎｅ ５７,２６１-２
６５,１９８７;Ｋｅｅｌｅｒ,Ｃ.Ｌ.ら、Ｇｅｎｅ ５
０,２１５-２２４,１９８６;Ｗｈｅａｌｅｙ,Ｍ.Ｅ.
ら、Ｊ.Ｖｉｒｏｌ ６２,４１８５-４１９４,１９８
８；ｖａｎＺｉｊｌ,Ｍ.ら、Ｊ.Ｖｉｒｏｌ ６５,２７
６１-２７６５,１９９１;Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ,Ｔ
ｈ.Ｃ.ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９,４９８-５０３,
１９９０;米国特許第４,６０９,５４８号、欧州特許第
０２６３２０７号)。ＨＳＶには例えばＴＫ(Ｓｈｉｈ,
Ｍ−Ｆら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.:８１,
5867-５８７０,１９８４)、ＶＺＶには例えばＴＫ(Ｌｏ
ｗｅ,Ｒ.Ｓ.ら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.
８４,３８９６-３９００,１９８７)、ＨＣＭＶには例え
ばβ遺伝子(Ｓｐａｅｔｅ,Ｒ.Ｒ.ら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔ
ｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.８４,７２１３-７２１７,１９８
７)、ＢＨＶ−１には例えばＴＫ及びｇＩＩＩ(Ｋｉｔ,
Ｓ.ら、Ａｒｃｈ.Ｖｉｒｏｌ １２４,１-２０,１９９
２;Ｋｉｔ,Ｍ.ら、Ｖａｃｃｉｎｅ ９,５６４-５７２,
１９９１)、ＦＨＶにはＴＫ(Ｃｏｌｅ,Ｇ.Ｅ.ら、Ｊ.Ｖ
ｉｒｏｌ ６４,４９３０-４９３８,１９９０)が開示さ
れている。
【００２７】ヘルペスウイルスゲノムの非必須領域に遺
伝子を挿入するために、クローニングベクターにＤＮＡ
配列を挿入する公知の手順並びにｉｎ ｖｉｖｏ相同組
換えまたはコスミドクローニング技術を使用し得る(Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ,Ｔ.ら、(１９８２),"Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ",Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ;欧州特許出願第０７４
８０８号;Ｒｏｉｚｍａｎ,Ｂ.＆ Ｊｅｎｋｉｎｓ,Ｆ.
Ｊ.,Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９,１２０８,１９８５;Ｈｉ
ｇｕｃｈｉ,Ｒ.ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ.１６,７３５１,１９８８;ｄｅ Ｗｉｎｄ,Ｎ.ら、
Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.６４,４６９１-４６９６,１９９０;ｖａ
ｎ Ｚｉｊｌ,Ｍ.ら、Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.６２,２１９１-２
１９５,１９８８;Ａｃｋｅｒｍａｎｎ,Ｍ.,Ｊ.Ｖｅｔ-
Ｍｅｄ.Ｂ.,３５,３７９-３９６,１９８８,及び前節に
記載の方法)。
【００２８】本発明のヘルペスウイルスベクターによっ
て異種遺伝子を発現させるための必須要件は、異種遺伝
子に操作可能に連結された適正なプロモーターである。
プロモーターの選択範囲が、ヘルペスウイルスベクター
に感染した細胞中で遺伝子転写を指令し得る真核性、原
核性またはウイルス性プロモーターのいずれにも及ぶこ
とは当業者に容易に理解されよう。例えば、レトロウイ
ルスのＬＴＲプロモーター(Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ.
Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７９,６７７７-６
７８１,１９８２)、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉ
ｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ,Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９,１４２
２-１４２７,１９８０)、サイトメガロウイルス即時型
初期プロモーター(Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら、Ｃｅｌｌ
４１,５２１-５３０,１９８５)、β−グロビンプロモー
ター(Ｓｍｉｌｅｙ,Ｊ.Ｒ.ら，Ｊ.Ｖｉｒｏｌ,６１,２
３６８-２３７７(１９８７),Ｋｒｉｅｇｌｅｒ,Ｍ.,Ｇ
ｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ,３-８
１,ｅｄ.Ｋｒｉｅｇｌｅｒ,Ｍ.,Ｆｒｅｅｍａｎ ＆Ｃ
ｏｍｐａｎｙ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,１９９０)などを、ヘ
ルペスウイルス遺伝子のプロモーター以外に例示でき
る。
【００２９】本発明によってヘルペスウイルスベクター
に挿入されるウイルス感染力のＡＤＥに関連するウイル
スの抗原をコードする遺伝子は、ワクチン接種による防
御が必要で被接種宿主の体内で防御免疫応答を誘発し得
る抗原をコードしている任意のウイルスに由来し得る。
【００３０】本発明の生存ヘルペスウイルスベクターに
基づくワクチン開発の対象となるウイルス感染力のＡＤ
Ｅに関連するウイルスの例は上述した。
【００３１】好ましくは、本発明の生存ヘルペスウイル
スベクターは、ＦＩＰＶ、ブタ再発性呼吸器症候群ウイ
ルス（ＰＲＲＳＶ）、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、
アフリカブタ熱ウイルス、ＦＩＶ及びＨＩＶから成るグ
ループから選択されるウイルスの抗原をコードしている
遺伝子を含む。
【００３２】極めて好ましくは、本発明の生存ヘルペス
ウイルスはＦＩＰＶまたはＰＲＲＳＶの抗原をコードし
ている遺伝子を含む。
【００３３】ＰＲＲＳＶ遺伝子をヘルペスウイルスベク
ターに挿入する場合、該遺伝子は好ましくは、読み取り
枠（ＯＲＦ）２〜７から成るグループから選択された読
み取り枠（ＯＲＦ）であり、ＯＲＦ４、５または７が特
に好ましい(Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ,Ｋ-Ｋら、Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ １９３,３２９-３３９,１９９３;国際特許出
願ＷＯ９２／２１３７５)。
【００３４】ヘルペスウイルスベクターによって発現さ
れ得るウイルス感染力のＡＤＥに関連するウイルスの抗
原の適当な例としては、ＦＩＰＶの場合、スパイク
（Ｓ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質及びヌクレオキ
ャプシド（Ｎ）タンパク質(Ｖｅｎｎｅｍａ,Ｈ.ら、Ｊ.
Ｖｉｒｏｌ ６４,１４０７-１４０９,１９９０;Ｖｅｎ
ｎｅｍａ,Ｈ.ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８１,３２７-３
３５,１９９１)、ＰＲＲＳＶの場合、ＯＲＦ２〜７、特
にＯＲＦ４、５または７(Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎら、１
９９３,前出;国際特許出願ＷＯ９２／２１３７５)、Ｈ
ＩＶ及びＦＩＶの場合、表面／エンベロープタンパク
質、アフリカブタ熱ウイルスの場合、ウイルスエンベロ
ープ糖タンパク質、ウマ動脈炎ウイルスの場合、ＯＲＦ
４またはＯＲＦ５がある。
【００３５】さらに、本発明はまた、ウイルス感染力の
ＡＤＥに関連するウイルスから宿主を防御するための、
上記ヘルペスウイルスベクターと医薬として許容される
担体または希釈剤とから成る鼻腔内投与ワクチンを提供
する。
【００３６】本発明はさらに、医薬として許容される担
体または希釈剤に加えて上記ヘルペスウイルスを細胞結
合形態で含む細胞培養物から得られた感染細胞を含む抗
ウイルスワクチンを提供する。
【００３７】細胞結合ウイルスワクチンを鼻腔内投与ま
たは非経口投与するための医薬として許容される担体ま
たは希釈剤は当業者によく知られている。
【００３８】通常は、無細胞ヘルペスウイルスを使用す
るまでは凍結乾燥形態で安定剤の存在下に保存する。次
いで、投与前に、水、緩衝生理食塩水、アルコール、グ
リセロールのような多価アルコールまたはオイルエマル
ジョンなどの担体または希釈剤でワクチンを復元する。
【００３９】所望の場合、本発明のワクチンを、一種以
上のアジュバントと配合する。適当な例としては、Ｑｕ
ｉｌ Ａのようなサポニン類、水酸化アルミニウム、コ
レラまたは破傷風のトキソイド、オイルエマルジョン
（水中油型もしくは油中水型）または水性ビタミンＥ分
散液がある。
【００４０】任意に、クエン酸のような安定剤、チメロ
サール、メルチオラート及びゲンタマイシンのような防
腐剤を添加してもよい。
【００４１】このような調剤をエーロゾル、スプレーま
たは液滴として鼻腔内投与し得る。
【００４２】細胞結合ヘルペスウイルスワクチン製剤は
よく知られており、マレック病ウイルスワクチンとして
商業的にも汎用化している。
【００４３】本発明において、細胞結合形態のヘルペス
ウイルスベクターを得るためには、例えば、非相補性細
胞培養物にヌルウイルスを感染させるかまたは非相補性
細胞培養物に上記に定義の遺伝欠陥を有するヘルペスウ
イルスベクターのゲノムＤＮＡをトランスフェクトす
る。ヘルペスウイルスベクター増殖用の適当な細胞培養
物は、エイプ細胞（ｖｅｒｏ細胞）、ブタ細胞（ＳＫ
６）、ハムスター細胞（ＢＨＫ）及びウシ細胞（ＭＤＢ
Ｋ）から得られる。
【００４４】十分な期間の培養後、トリプシンを添加し
ておいたリン酸塩緩衝液を用いて培養物から細胞を採取
し得る。次に、ＤＭＳＯ（７.５〜１５％）を添加した
細胞増殖培地から成り得る凍結用培地にペレット化細胞
を再浮遊させる。通常は−１９６℃の液体窒素下にワク
チンを保存及び運搬する。
【００４５】使用前に、細胞培養培地から緩衝生理食塩
水までの範囲の公知の希釈剤をラクトアルブミン加水分
解物のようなタンパク質性添加剤と共にワクチンに添加
し得る。
【００４６】ワクチンの投与量は、有効量のベクターウ
イルス、即ちウイルス感染力のＡＤＥに関連するビルレ
ントウイルスの抗原投与に対して被接種宿主の体内で免
疫を誘発し得る量の生存ヘルペスウイルスベクターが投
与される量である。
【００４７】典型的な投与量は０.５〜１.５ｍｌ中に１
０2〜１０7のＴＣＩＤ50を含む量である。
【００４８】実施例１ ＰＲＶ ｇｐ５０突然変異体のワクチン接種 ワクチン （ａ）ｇＸ、ｇｐ５０、ｇｐ６３及びｇＩを含むＵｓ領
域に欠失を有する４部構成の(quadruple)ＰＲＶ欠失突
然変異体を、ｇｐ５０タンパク質産物に相補性のＭＴ５
０−３細胞(Ｒａｕｈ,Ｉ.ら、Ｊ.Ｖｉｒｏｌ ６５,５
３４８-５３５６,１９９１)で増殖させる。動物あたり
１０5のＴＣＩＤ50の用量を使用する。４部構成のＰＲ
Ｖ欠失突然変異体の構築は、慣用の組換えＤＮＡ方法
（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９３／０１６６１）を用い
て行うことができる。図１にその概要を示す。
【００４９】（ｂ）Ｖｅｒｏ細胞中で同じウイルスを増
殖させて維持する。細胞内存在量として計算して上記と
均等な量のウイルスを動物あたりの投与量として調製す
る。
【００５０】ワクチン接種 ４〜５週齢のブタを５グループに分ける。
【００５１】グループ１（７）：ワクチン（ａ）を鼻腔
内投与； グループ２（７）：同じくワクチン（ａ）を筋肉内投与
（２ｍｌ）； グループ３（７）：ワクチン（ｂ）を筋肉内投与（１０
5・5細胞／投与）； グループ４（７）：ワクチン（ｂ）を筋肉内投与（１０
4細胞／投与）； グループ５（７）：非処理対照動物。
【００５２】鼻腔内投与では１ｍｌのワクチンを各鼻孔
に与える。
【００５３】抗原投与 ワクチン接種の３週後に、全部のブタに対して、１０7
ＴＣＩＤ50の７５Ｖ１９株を鼻腔内に抗原投与する。
【００５４】血清学 ワクチン接種の０、３、４、５及び７週後に血液サンプ
ルを採取する。ＶＮ試験で血清を試験する。
【００５５】結果 成長速度 ワクチン接種は、対照ブタで観察されたよりも１４日以
上の期間にわたって極めて重大な体重減少から各グルー
プを有意に防御した（図２）。
【００５６】グループ２は約７日後に抗原刺激時の体重
を回復した。グループ１は８日後、グループ３及び４は
９−１０日を要した。各グループ毎の抗原投与時点に対
する成長速度を図２に示す。
【００５７】血清学 図３に示す時点に各グループのＶＮ力価を測定した。倍
加希釈物を調製し、１００ ＴＣＩＤ50の偽狂犬病と共
に３７℃で２４時間インキュベートした。次に、ウイル
ス−血清混合物をＶｅｒｏ細胞に播種し、ＣＯ2インキ
ュベータ内で３７℃で４日間インキュベーション後にｃ
ｐｅを読み取った。
【００５８】グループ２のブタだけが、抗原投与の時点
で補体の存否にかかわりなくＶＮ力価を示したが特に補
体存在下にＶＮ力価を示した（表１）。この観察は、抗
原投与の場合にもグループ２だけが１週以内に従来のブ
ースター応答を速やかに示したが、他の全部のグループ
は天然型対照グループによく似た遅延応答を示すことか
らも確認された。
【００５９】意外にも、鼻腔内接種したグループ１は対
照よりも低いＶＮ応答を示した。血清学的結果と防御デ
ータとを総合すると、ヌルウイルス及び細胞結合ｇｐ５
０-ウイルスによる用量依存的な鼻腔内ワクチン接種は
中和（＋／−Ｃ’）抗体の非存在下に有意な防御を示し
たことが明らかである。
【００６０】
【表１】
【００６１】実施例２ ４部構成の突然変異体中のＰＲＲＳＶ ＯＲＦ７のクロ
ーニング プラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ ＳＫ+（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ ＃２１２２０５）をＨｉｎＣＩＩ及びＢａ
ｍＨＩによって切断し、末端をアルカリホスファターゼ
によって脱リン酸化した。ｇＸ、ｇｐ５０及びｇｐ６３
のＯＲＦとｇＩ及びＰＫの部分とを含むＰＲＶのＵＳ領
域のクローン化したＳｐｈＩフラグメントから、ＰＫ及
びｇＸのＯＲＦの部分を含むＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩフラ
グメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ+ベクターに
クローニングした。このためには、まずＳｐｈＩによっ
て消化し、Ｋｌｅｎｏｗによって末端を埋め戻し、次い
でＢａｍＨＩによって消化した。残りのフラグメントを
アガロースゲルから単離し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと共
にベクターにクローニングし、プラスミドｐＢｇＸを作
製した。ｇＸ配列の下流に多重クローニング部位を生成
するために、プラスミドｐＢｇＸをＸｂａＩで切断し、
末端をＫｌｅｎｏｗで埋め戻し、次にプラスミドをＢａ
ｍＨＩでさらに切断し、末端をアルカリホスファターゼ
で脱リン酸化した。出発プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＳＫ+からＢａｍＨＩ及びＨｉｎｃＩＩ消化によ
ってＢａｍＨＩ ＨｉｎｃＩＩフラグメントを単離し、
アガロースゲルから単離した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
の多重クローニング部位の大部分を含むこのフラグメン
トを次に、Ｔ４ ＤＡＮリガーゼと共にｐＢｇＸベクタ
ーに結合してｐＢｇＸ+ベクターを作製した。ＰＲＲＳ
ＶのＯＲＦ７をｐＢｇＸ+ベクターにクローニングする
ために、ベクターをＰｓｔＩで消化し、末端をＫｌｅｎ
ｏｗで埋め戻し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化
した。ＰＲＲＳＶの全構造遺伝子を含むプラスミドｐＰ
ＲＲＳＶ−Ｔ１（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎら、１９９３，
前出）から、ＨｉｎｃＩＩ及びＳｍａＩで二重消化して
ＯＲＦ７を単離し、０.５２ｋｂフラグメントを含むＯ
ＲＦ７をアガロースゲルから単離し、Ｔ４ ＤＮＡポリ
メラーゼと共にｐＢｇＸ+にクローニングし、プラスミ
ドｐＢＸ７を作製した。ＰＲＶのＵＳ領域との３’相同
を生成するために、ベクターｐＢＸ７をＥｃｏＲＶで切
断し、末端をアルカリホスファターゼによって脱リン酸
化した。１１Ｋ遺伝子とｇＩ及び２８Ｋ遺伝子の部分と
を含むＰＲＶのＵＳ領域からＳｐｈＩ ＢａｍＨＩフラ
グメントをＫｌｅｎｏｗで末端を埋め戻すことによって
平滑にし、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼと共にｐＢＸ７に
クローニングした。インサートの配向を確認した後、Ｐ
ＲＶ ＰＫ遺伝子の一部とＰＲＶ ｇＸ遺伝子の一部と
ＰＲＶ ｇＸ遺伝子に融合したＰＲＲＳＶ ＯＲＦ７と
ＰＲＶ ｇＩ遺伝子の一部と、ＰＲＶ １１Ｋ遺伝子と
ＰＲＶ ２８Ｋ遺伝子の一部とを含むプラスミドｐＢＱ
７を、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ７を含む４部構成の突然変異
体の作製に使用した。
【００６２】β−ｇａｌを含む４部構成の突然変異体か
ら単離した４部構成のＰＲＲＳＶＯＲＦ７を含む突然変
異ＤＮＡを作製すたるめに、インサートをｐＢＱ７と共
にｇｐ５０発現細胞系ＭＴ５０−３にコトランスフェク
トした。完全ＣＰＥが明らかになった後、細胞及び上清
を採取し、プラークアッセイ条件下に系列希釈物をＭＴ
５０−３細胞で平板培養した。感染２日後に後代ウイル
スをＢｌｕｏ−Ｇａｌアガロースオーバーレイによって
突然変異表現型に基づいてスクリーニングした。白色プ
ラークを回収し、さらに３回プラークを精製した。
【００６３】ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ７特異的ＭｏＡＢ ｐ
３−Ａ２７で感染細胞をプローブすることによってＰＲ
ＲＳＶ ＯＲＦ７の発現を免疫蛍光検査した。選択を行
って、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ７を含む４部構成の突然変異
体の１つ、ＰｒＶＱ−６（図４）をさらに動物実験に使
用した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＰＲＶ親株、４部構成突然変異体及びＭＤＢ
Ｋ細胞系を安定に形質転換させたＰＲＶ遺伝子フラグメ
ントのＵｓ領域のゲノムマップ。
【図２】 ４部構成ＰＲＶ突然変異体及び細胞結合ＰＲ
Ｖ突然変異体でワクチン接種したブタ及びワクチン非接
種のブタの抗原投与の８日前から１１日後までの相対成
長（グループ１＝Ｑｕａｄ ＩＮ、グループ２＝Ｑｕａ
ｄ ＩＭ、グループ３＝細胞 ＩＭ ５.５、グループ
４＝細胞 ＩＭ ４.０、グループ５＝対照）。
【図３】 抗原投与の３週前から３週後までのブタから
採取した血液サンプルのウイルス中和抗体の抗体価。グ
ループの名称は図２と同じ。
【図４】 ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ７インサートを含むＰＲ
Ｖ突然変異ＰＲＶＱ−６のＵｓ領域のゲノムマップ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トーマス・クリストフ・メツテンライター ドイツ連邦共和国、デー−7400・ツービン ゲン、バイスドルンベツク・14／173

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞から細胞へ伝播することができ非感
    染性後代ビリオンを産生する生存ウイルスベクターであ
    って、前記ベクターが、ウイルス感染力の抗体依存性促
    進（ＡＤＥ）に関連するウイルスの抗原をコードする遺
    伝子を内包していることを特徴とする生存ウイルスベク
    ター。
  2. 【請求項２】 ベクターがヘルペスウイルスであること
    を特徴とする請求項１に記載の生存ウイルスベクター。
  3. 【請求項３】 ヘルペスウイルスが、単純疱疹ウイル
    ス、偽狂犬病ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ウシヘ
    ルペスウイルス及びウマヘルペスウイルスから成るグル
    ープから選択されることを特徴とする請求項２に記載の
    生存ウイルスベクター。
  4. 【請求項４】 ヘルペスウイルスが、偽狂犬病ウイルス
    であることを特徴とする請求項３に記載の生存ウイルス
    ベクター。
  5. 【請求項５】 偽狂犬病ウイルスが、遺伝子型ｇｐ５０
    -及び表現型ｇｐ５０+であることを特徴とする請求項４
    に記載の生存ウイルスベクター。
  6. 【請求項６】 遺伝子が、ＦＩＰＶ、ＰＲＲＳＶ、ＥＡ
    Ｖ、アフリカブタ熱ウイルス、ＦＩＶ及びＨＩＶから成
    るグループから選択されたウイルスの抗原をコードして
    いることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に
    記載の生存ウイルスベクター。
  7. 【請求項７】 請求項１から６のいずれか一項に記載の
    生存ウイルスベクターを細胞結合形態で含む非相補性細
    胞培養物。
  8. 【請求項８】 ウイルス感染力のＡＤＥに関連するウイ
    ルスから宿主を防御するための、請求項１から６のいず
    れか一項に記載の生存ウイルスベクターと医薬として許
    容される担体または希釈剤とから成ることを特徴とする
    鼻腔内投与ワクチン。
  9. 【請求項９】 ウイルス感染力のＡＤＥに関連するウイ
    ルスから宿主を防御するための、請求項７に記載の細胞
    培養物の感染細胞と医薬として許容される担体または希
    釈剤とから成ることを特徴とするワクチン。
  10. 【請求項１０】 ウイルス感染力のＡＤＥに関連するウ
    イルスから宿主を防御する鼻腔内投与ワクチンを調製す
    るための請求項１から６のいずれか一項に記載の生存ウ
    イルスベクターの使用。
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