JP2004532601A - ウマヘルペスウイルスの温度感受性変異株及びその生ワクチン - Google Patents
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Abstract
本発明は、宿主動物の体温、より特定的には38.5℃以上の温度で温度感受性であるウマ流産ウイルス(EHV−1)変異株に関する。温度感受性変異株は、EHV−1感染受容性動物のEHV−1感染を予防するワクチン接種に使用できる。本発明は更に、このような変異株から誘導された生ワクチンに関する。
Description
【0001】
本発明は、ウマ流産ウイルス(EHV−1)の突然変異体、該突然変異体の製造方法、該突然変異体の使用、及び、該突然変異体から誘導された生ワクチンに関する。
【0002】
ヘルペスウイルスに属するウマ流産ウイルス(EHV−1)は、ウイルス誘発性流産、不全麻痺のような神経疾患、上気道の感染症及びウマ新生児病(neonatal foal disease,NFD)の原因となるウマの重大な病原体である。NFDは出産時期が迫った胎仔の経胎盤感染によって引き起こされ、このような胎仔は、生まれつき弱くて重い呼吸器疾患があったり、また、幾つかの場合には肝臓がEHV−1感染されて黄疸を呈したりする。これらの動物は通常は生後数日以内に死亡する。ウマの鼻肺炎ウイルス(EHV−4)は急性気道疾患(“鼻肺炎”)の主因であり、生後2年以内に殆どのウマに感染する。鼻肺炎の特徴は、発熱、食欲不振、及び、次第に粘液膿性になる多量の鼻漿液の分泌である。稀なケースとして、EHV4感染が妊娠した雌ウマの流産を引き起こすこともある。更に、EHV1及びEHV4は終生持続する潜伏感染症として定着する。ウイルスが再活性化すると病気が再発し、これに付随してウイルスが飛散して他の動物に伝播する。
【0003】
ウマのヘルペスウイルス感染及びそれらによる疾患のコントロール、特にEHV−1媒介流産、不全麻痺、及び、出産時期が迫った胎仔の経胎盤感染によって引き起こされるウマ新生児病のコントロールはまだ適切に行われていない。不活化ワクチン及び修飾した生ワクチンは存在しているが、どのワクチンも感染を十分に阻止できるとは考えられない。また、どのワクチンも野生型ウイルスの潜伏が定着することを予防できるとは考えられない。従って、これらのウイルスの野外感染の予防効果、特にEHV−1によって引き起こされる感染症の予防効果が改善された安全なワクチンが大いに要望されている。
【0004】
本発明はこのようなワクチンを提供する。
【0005】
第一の特徴によれば本発明は、European Collection of Animal Cell Culture(ECACC),Salisbury,Wiltshire SPA 0JG,UKに1999年6月10日付けで登録番号No.V99061001で寄託されたEHV−1 Ts変異株及びその後代を提供する。
【0006】
本発明のEHV−1 Ts変異株は更に、以下の表現型的特徴を有している:
・複数のウマ細胞系で増殖したときに小プラーク(溶菌斑)を形成する、
・ウサギ腎細胞、特にRK13細胞では増殖能力を失う、及び、
・ウイルス血症を引き起こす能力は小さい。
【0007】
本発明のEHV−1 Ts変異株は、その複製がコンベンショナルなウマ科動物の上気道に限定されており続発性のウイルス血症が全く見られないかまたは少ないという利点を有している。Ts変異株は上気道で増殖後に有意な免疫刺激を生じさせるるにもかかわらず妊娠した雌ウマに安全である。Ts変異株は動物から動物に容易に戻り継代しないので、伝播及び復帰の潜在能力は小さい。
【0008】
本発明の目的に沿った“後代”の定義は、寄託されたEHV−1 Ts変異株のその後の連続継代によって得られたすべての株を包含する。
【0009】
本発明の目的に沿った温度感受性変異株の定義は、野生型が正常に増殖するある温度以上で増殖が低下する突然変異ウイルスを意味する。本発明のEHV−1 Ts変異株は、宿主動物の体温で温度感受性であることを特徴とする。本発明のEHV−1 Ts変異株は38.5℃−39.0℃の温度以上で複製されない。好ましくは本発明のEHV−1 Ts変異株は38.5℃の温度で複製されない。
【0010】
本発明の目的に沿った小プラークの定義は、野生型親株によってウマ細胞中に形成されるプラークの少なくとも1/2−1/3の大きさのプラークを意味する。
【0011】
本発明の目的に沿った“ウイルス血症を引き起こす能力が小さい”の定義は、ウイルス血症を引き起こす親株の能力に比べて1日から3日または4日までの間にウイルス血症を引き起こす能力が幾つかの動物では全く存在しないかまたは低グレード(即ち、漸く検出できる程度)であることを意味する。
【0012】
本発明の温度感受性EHV−1変異株は、感染したウシ、ウマまたはその他の許容細胞培養物を34℃で無毒性濃度の5−ブロモ−2−デオキシウリジン、アザシチジンのような突然変異誘発物質によって処理し、次いでウシ、ウマまたはその他の許容細胞系中でこれらの処理培養物から後代ウイルスを生物クローニングすることによって得ることができる。
【0013】
本発明のTs変異株の有利な特性は、ワクチンを製造するために極めて好適に使用できることである。従って、本発明の第二の特徴によれば、本発明のEHV−1 Ts変異株と、医薬として許容される担体またはビヒクルとから成る組成物、特にワクチン組成物が提供される。より特定的には、本発明の(ワクチン)組成物は、ECACC,Salisbury,UKに寄託された登録番号V99061001を有するEHV−1 Ts変異株及び/またはその後代を含む。本発明のワクチンに好適に使用できる医薬として許容される担体またはビヒクルは、滅菌水、塩類溶液、PBSなどのような水性バッファである。更に、本発明のワクチンは、アジュバント、安定剤、抗酸化剤などのようなその他の添加剤を含有し得る。
【0014】
本発明のワクチン組成物は安全であり、ウマ科動物のEHV−1感染症を臨床的及びウイルス的に予防するため、並びに、ウイルス誘発性の流産及び不全麻痺を予防するために使用できる。更に、本発明のワクチンは、経胎盤感染を阻止し、従って産まれたばかりのポニーのウマ新生児病を予防することが知見された。本発明のワクチン組成物は、ウマだけでなく、ロバ、シマウマなどのようなEHV−1感染受容性の別の動物にも投与できる。EHV−1及びEHV−4の感染に受容性の畜牛もまた本発明のワクチンによって処置できる。
【0015】
更に意外にも、本発明のEHV−1 Ts変異株を含むワクチンがEHV−1感染症を予防するだけでなくEHV−4感染による疾患及びこれに付随するウイルスの飛散を予防することが知見された。従ってこのようなワクチンは、ワクチン接種したウマ科動物の交差予防を得るために有効である。このようなワクチンでは予防の改善が得られるので、野生型ウイルスの感染を効果的に阻止する。
【0016】
本発明のワクチン組成物は以下の標準手順によって調製できる。本発明のワクチンは好ましくは生ワクチンである。生ワクチンを製造するためには、EHV−Ts変異株のシード(seed)ウイルスをウシまたはウマの腎細胞の一次または二次培養物のような細胞培養物で増殖させる。このようにして増殖させたウイルスは、組織細胞培養液及び/または組織培養細胞を収集することによって回収できる。場合によっては回収中に、増殖基板からの感染性粒子の遊離を改善する技術例えば音波処理によってウイルスの回収率を向上させてもよい。生ワクチンは懸濁液の形態で調製されてもよくまたは凍結乾燥されてもよい。
【0017】
本発明のワクチンに使用できる適当な医薬として許容される担体は、滅菌水、塩類溶液、PBSなどのような水性バッファーである。更に、本発明のワクチンはアジュバント、安定剤、抗酸化剤などのような別の添加剤を含み得る。
【0018】
適当な安定剤は例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン及びグルコースのような糖質、アルブミン及びカゼインを非限定例とするタンパク質及びタンパク質分解産物、ウシ血清または脱脂乳のようなタンパク質含有物質、並びに、アルカリ金属リン酸塩を非限定例とするバッファーである。凍結乾燥ワクチン組成物には1種または複数の安定剤を添加するのが好ましい。
【0019】
適当なアジュバントの非限定例は、水酸化アルミニウム、リン酸塩または酸化物、アンフィジェン、トコフェロール、モノホスフェニルリピドA、ムラミルジペプチド、油エマルジョン、グルカン、カーボマー、ブロックコポリマー、サイトカイン及びQuil Aのようなサポニンである。アジュバントの添加量はアジュバント自体の種類に依存する。
【0020】
本発明のEHV−1 Ts変異株は好ましくは、胎仔も含む数日から数歳の年齢のコンベンショナルな血清反応陰性動物に投与される。ワクチンは、皮内、経口、噴霧、エアゾール、眼内及び鼻腔内投与を非限定例とする非腸管外経路で動物に投与できる。あるいは、ワクチンは腸管外投与経路で投与できる。好ましくはワクチンを皮内または鼻腔内投与する。
【0021】
一般には、EHV−1感染予防を誘発するために有効な量でEHV−1 Ts変異株ウイルスを投与する。投与量は一般に、投与経路、投与時間、並びに、ワクチン接種を受ける動物の年齢、健康及び食餌に依存するであろう。動物1頭あたり102−109pfu/投与、好ましくは103−105pfu/投与、より好ましくは1頭あたり104pfu/投与の量でウイルスを投与できる。
【0022】
本発明のワクチンはまた、別の生ワクチンまたは不活化ワクチンと同時的にまたは付随的に投与し得る。これらの追加ワクチンは非腸管外または腸管外の経路で投与できる。好ましくは追加ワクチンの腸管外投与が勧告される。
【0023】
実施例
1.温度感受性変異株EHV−1 TS C147の単離及びキャラクタリゼーション
ちょうど集密になる日数まで培養したウマ皮膚(equine dermal,ED)細胞の75cm2の単層に0.001のm.o.i.でEHV−1を感染させた。接種物(2.0ml)を吸着させ(1時間、37℃)、除去し、単層をPBSで洗浄し、次いで40μg/mlの5−ブロモ−2−デオキシウリジンを含有する組織培養培地(25ml)を補給し、34℃でインキュベートした。最大CPEに達すると(接種7日後)、培養物を回収し(−40℃で凍結し次いで37℃で解凍)、PBSに4℃で一夜透析し、37℃のED細胞中のEHV−1感染力を滴定し、次いで、96−ウェルの微量滴定プレートで増殖させたED細胞に34℃でクローニングした。単一のEHV−1フォーカスをもつウェルを同定し、最大CPEまで増殖させ、次いで、ED細胞を使用して許容温度(34℃)及び制限温度(39℃)で表現型を判別するために少量(全量200μl中の20μl)のサンプルを使用した。温度感受性クローンを更にウシ腎細胞JCK株(Jayの仔ウシ腎臓−Intervet株)に継代接種し、マスター処理シードを作製した。
【0024】
2.EHV−1 TS C147株の温度感受性表現型
マスターシードウイルス(MSV)+1°レベルのEHV−1 TS C147株を、ウシ胎仔の肺(BEL26株−Intervet株)、ウシ腎臓(Jayの仔ウシ腎臓,JCK株−Intervet株)、ウマ皮膚(ED)細胞、ウマ皮膚クローンW48 C10(ED W48 C10−Intervet株)及びウマ皮膚クローンW7 C5(ED W7 C5−Intervet株)中で37℃及び38.5℃で平行滴定した。MSV+1°継代レベルのウイルスは38.5℃で増殖できなかった。結果を表1に示す。
【0025】
3.EHV−1 TS C147株はEHV−4様の特性をもつ
EHV−1とEHV−4とを識別するためのパラメーターは、ウサギ腎(RK13)細胞中の複製能力である。EHV−1株はRK13細胞中で複製できるが、この細胞はEHV−4株に不応性である。MSV+1°レベルのEHV−1 TS C147株、その野生型親株であるEHV−1株、immediate early geneが欠失したEHV−1株(EHV−1 IE)、病原性EHV−1株CHLi及びEHV−4の野外単離物をRK13細胞及びウマ皮膚(ED)細胞中で37℃で平行滴定した。表2の結果は、TS C147株を含む4つのEHV−1株及びEHV−4株がED細胞中では複製され得るが、EHV−1 TS C147株及びEHV−4株はRK13細胞中で複製されなかったことを示す。
【0026】
【表1】
(a)5日間のインキュベーション後の力価;<1.1 log10 TCID50/mlとして表される力価は、滴定試験した4×200μlの最低希釈度(10−1)のウイルス中にEHV−1フォーカスが検出されなかったことを表す。
【0027】
【表2】
a=<1.1 log10 TCID50/mlとして表される力価は滴定した4×200μlの最低希釈度(10−1)中にEHV−1 CPEが検出されなかったことを表す。
【0028】
4.コンベンショナルポニーのEHV−1感染及びEHV−4感染に対する臨床的及びウィルス学的な予防
EHV−1中和(VN)抗体が少ないかまたは存在しない29頭のコンベンショナルポニーのうち、15頭には5.3 log10 TCID50の用量のEHV−1 TS C147株を鼻腔内(IN)にワクチン接種し、ワクチン非接種対照とするために14頭にはワクチン接種しなかった。一回のINワクチン接種の約1カ月後、ワクチン接種した8頭のポニー及びワクチン接種しない8頭のポニー(対照)には野外EHV−1株をINでチャレンジ投与し、EHV−1ワクチン接種した7頭と対照の6頭とから成るグループにはEHV−4の新しい野外単離物をINでチャレンジ投与した。ワクチン接種及びチャレンジ投与の後、動物の臨床反応、鼻腔粘液中のウイルス飛散、感染白血球(ウイルス血症)及びEHV−1中和抗体をモニターした。
【0029】
15頭のポニーのうちの11頭では1−8日間でワクチンウイルスが低い力価に増殖し(鼻腔粘液ピーク力価1.5−3.0 log10 TCID50/ml)、また、15頭の動物のうちの7頭では1−4日間で低グレード(漸く検出できる程度)の白血球ウイルス血症が生じた。しかしながら15頭のポニー全部が血清変換(seroconversion)していた。対照的に、それぞれ10日間または14日間毎日モニターした14頭の対照ポニーの鼻腔粘液または血液からはEHV−1が全く回収されず、動物はチャレンジ感染の後までEHV−1に対して血清反応陰性のままであった。2つのグループ(ワクチン接種群及び対照群)の各々に属する10頭の動物で同レベルの発熱が観察された。これらの所見を表3にまとめる。
【0030】
EHV−1の鼻腔内チャレンジ投与後、ワクチン接種したポニーの鼻腔粘液に排出されたウイルスは対照動物から回収されたウイルスに比べてかなり減少していた。同様に、8頭中の7頭では1回のワクチン接種によって白血球ウイルス血症が予防されたが、1頭は1日でウイルス陽性になった。しかしながら対照的に、ワクチン接種しなかったポニーは8頭全部がウイルス血症になり、7頭は3−4日で、1頭は1日でウイルス血症になった。対照ポニーは8頭全部が1−6日で微熱から高熱の発熱を生じたが、ワクチン接種した動物は8頭全部が平熱を維持していた。ワクチン接種した動物はチャレンジ感染に対して8頭全部が免疫記憶的に反応しなかったが、対照動物は8頭全部が有意なEHV−1中和抗体で反応した。これらの所見を表4にまとめる。
【0031】
EHV−4の鼻腔内チャレンジ投与後、ワクチン接種したポニーでは7頭中の1頭の鼻腔粘液からウイルスが一回だけ回収されたが、対照ポニーでは6頭全部が2−3日で有意に増加した力価のウイルスを排出した。例外は1頭であった。EHV−1ワクチン接種したポニーは7頭全部がウイルス血症にならなかったが、対照的に対照ポニーは6頭中の3頭が1−3日間でウイルス血症になった。EHV−4のチャレンジ感染に対しては、対照動物は6頭中の3頭が2−3日の発熱を生じたが、ワクチン接種したポニーは7頭全部が影響をうけなかった。ワクチン接種した動物では7頭中の4頭及び対照動物では6頭中の5頭でそれぞれ1−3日及び2−6日の多少の呼吸数増加が見られた(15−20呼息/分)。これらの所見を表5にまとめる。
【0032】
【表3】
【0033】
【表4】
【0034】
【表5】
【0035】
5.EHV−1感染が原因のウマの不全麻痺及び流産の予防方法
EHV−1中和(VN)抗体が少ないかまたは存在しない12頭の妊娠雌ウマに対して、そのうちの6頭には妊娠約6カ月目にワクチンを鼻腔内(IN)接種し、次いで12頭の雌ウマ全部に、EHV−1流産の危険が最も高い妊娠時期、即ち妊娠約9カ月目に病原性EHV−1株をINでチャレンジ投与した。ワクチン接種及びチャレンジ投与の後、動物の臨床反応、鼻腔粘液中のウイルス飛散、感染白血球(ウイルス血症)及びEHV−1中和抗体をモニターした。
【0036】
ワクチン接種した雌ウマでは6頭全部の鼻腔粘液からワクチンウイルスは全く回収されなかったが、6頭中の5頭で低グレードの一過性(1−3日)ウイルス血症が検出され、6頭全部がEHV−1に対する有意なVN抗体をもつように血清変換していた。ワクチン接種した動物と平行に10−14日間モニターした対照雌ウマでは6頭全部の鼻腔粘液または白血球からEHV−1が検出されなかったが、6頭中の1頭はほぼ2カ月半後に血清変換を示した。これらの所見を表6にまとめる。
【0037】
チャレンジ投与の後、ワクチン接種した雌ウマでは鼻腔粘液中に排出されたウイルスが有意に減少していた(6頭中の5頭から6頭中の2頭に減少、1−2日で2.4−3.7 log10 TCID50/mlから1.5−1.7 log10 TCID50/mlに減少)。また、ワクチン接種しなかった対照雌ウマでは6頭中の5頭がウイルス血症になったが、ワクチン接種した雌ウマは6頭全部がウイルス血症にならなかった。対照グループの雌ウマは6頭中の5頭が1−5日で発熱し、3頭は不全麻痺が進行して重い黄疸が併発し、2頭は子宮頸部のプラグが崩壊して胎児駆出の徴候を示した。この2頭のうちの1頭は死亡したが、もう1頭は最終的に安楽死させなければならなかった。双方の動物の胎仔は死亡していた。別の3頭の雌ウマは流産した。5つの胎仔の胎内組織はEHV−1陽性であった。しかしながら対照的に、ワクチン接種した雌ウマは6頭全部が正常に出産した。ワクチン接種した雌ウマで観察された唯一の臨床反応は6頭中の1頭が示した一過性(1日)の発熱であった。正常に出産した対照雌ウマはチャレンジ投与の直前に実際には血清変換していた。これらの所見を表7に示す。
【0038】
【表6】
a=動物をワクチン接種グループから隔離しておいたのでモニターしなかった。
【0039】
【表7】
5+ 対照雌ウマは、グループ1の雌ウマのワクチン接種の3カ月後の採血で血清反応陰性であったがチャレンジ投与前に血清変換していた。
【0040】
6.妊娠雌ウマに対するEHV−1 TS C147の安全性
妊娠約9カ月(EHV−1流産の危険が最も高い時期)の4頭の雌ウマに保護用量の10倍量を自然経路で接種し、流産をモニターした。表8の結果は、これらの雌ウマは4頭全部がEHV−1に対して血清変換されたこと、4頭中の1頭が一過性のウイルス血症になったが正常に出産したことを示す。これらのポニーがそれぞれの母乳を飲む前に採取した血液サンプル中のEHV−1 VN抗体は4頭中の3頭で陰性であったが、1頭は初乳摂取に起因するVN抗体陽性を示した(モニター期間の中間の早い時間に産まれた)。これらの結果を表8にまとめる。
【0041】
【表8】
a=誕生時のEHV−1中和抗体
b=モニター期間の中間の早い時間に誕生し、誕生後少なくとも3時間を経過したポニーから採血した。
c=未解決、即ち、試験待ち。
【0042】
7.ターゲット種の間でEHV−1 TS C147伝播は生じない
EHV−実験に使用されたことのない(すべてのタイプの)離乳したポニー(特定病原体非含有のSPFポニー)で戻し継代試験を実施した。
【0043】
2頭のSPFポニーに、保護用量の10倍量のマスタシードウイルス+1°継代レベルのEHV−1 TS C147株を鼻腔内(IN)接種し、数日間にわたって収集したウイルス陽性鼻腔粘液を使用して別の2頭のポニーに同様に感染させた。IN接種後、ポニーの(i)鼻腔粘液中のウイルス飛散、(ii)臨床反応及び(iii)EHV−1に対する血清変換をモニターした。
【0044】
MSV+1°レベルのEHV−1 TS C147株を与えたポニーは鼻腔粘液中にウイルスを排出し、血清変換を示した。しかしながら、ウイルス陽性鼻腔粘液サンプルのプールはEHV−1実験に使用されたことのない別の2頭のポニーに感染できなかった。これは、これらのポニーの鼻腔粘液からEHV−1を回収できなかったこと、及び、EHV−1に対する血清変換を示さなかったことから判断した。別の4頭のSPFポニーで試験を繰り返すことによって、即ち、2頭にMSV+1°で接種し次いで別の2頭に最初の2頭のポニーから採取したウイルス陽性鼻腔粘液を与えることによってこれらの結果を確認した。結果を表9及び10にまとめる。
【0045】
【表9】
【0046】
【表10】
本発明は、ウマ流産ウイルス(EHV−1)の突然変異体、該突然変異体の製造方法、該突然変異体の使用、及び、該突然変異体から誘導された生ワクチンに関する。
【0002】
ヘルペスウイルスに属するウマ流産ウイルス(EHV−1)は、ウイルス誘発性流産、不全麻痺のような神経疾患、上気道の感染症及びウマ新生児病(neonatal foal disease,NFD)の原因となるウマの重大な病原体である。NFDは出産時期が迫った胎仔の経胎盤感染によって引き起こされ、このような胎仔は、生まれつき弱くて重い呼吸器疾患があったり、また、幾つかの場合には肝臓がEHV−1感染されて黄疸を呈したりする。これらの動物は通常は生後数日以内に死亡する。ウマの鼻肺炎ウイルス(EHV−4)は急性気道疾患(“鼻肺炎”)の主因であり、生後2年以内に殆どのウマに感染する。鼻肺炎の特徴は、発熱、食欲不振、及び、次第に粘液膿性になる多量の鼻漿液の分泌である。稀なケースとして、EHV4感染が妊娠した雌ウマの流産を引き起こすこともある。更に、EHV1及びEHV4は終生持続する潜伏感染症として定着する。ウイルスが再活性化すると病気が再発し、これに付随してウイルスが飛散して他の動物に伝播する。
【0003】
ウマのヘルペスウイルス感染及びそれらによる疾患のコントロール、特にEHV−1媒介流産、不全麻痺、及び、出産時期が迫った胎仔の経胎盤感染によって引き起こされるウマ新生児病のコントロールはまだ適切に行われていない。不活化ワクチン及び修飾した生ワクチンは存在しているが、どのワクチンも感染を十分に阻止できるとは考えられない。また、どのワクチンも野生型ウイルスの潜伏が定着することを予防できるとは考えられない。従って、これらのウイルスの野外感染の予防効果、特にEHV−1によって引き起こされる感染症の予防効果が改善された安全なワクチンが大いに要望されている。
【0004】
本発明はこのようなワクチンを提供する。
【0005】
第一の特徴によれば本発明は、European Collection of Animal Cell Culture(ECACC),Salisbury,Wiltshire SPA 0JG,UKに1999年6月10日付けで登録番号No.V99061001で寄託されたEHV−1 Ts変異株及びその後代を提供する。
【0006】
本発明のEHV−1 Ts変異株は更に、以下の表現型的特徴を有している:
・複数のウマ細胞系で増殖したときに小プラーク(溶菌斑)を形成する、
・ウサギ腎細胞、特にRK13細胞では増殖能力を失う、及び、
・ウイルス血症を引き起こす能力は小さい。
【0007】
本発明のEHV−1 Ts変異株は、その複製がコンベンショナルなウマ科動物の上気道に限定されており続発性のウイルス血症が全く見られないかまたは少ないという利点を有している。Ts変異株は上気道で増殖後に有意な免疫刺激を生じさせるるにもかかわらず妊娠した雌ウマに安全である。Ts変異株は動物から動物に容易に戻り継代しないので、伝播及び復帰の潜在能力は小さい。
【0008】
本発明の目的に沿った“後代”の定義は、寄託されたEHV−1 Ts変異株のその後の連続継代によって得られたすべての株を包含する。
【0009】
本発明の目的に沿った温度感受性変異株の定義は、野生型が正常に増殖するある温度以上で増殖が低下する突然変異ウイルスを意味する。本発明のEHV−1 Ts変異株は、宿主動物の体温で温度感受性であることを特徴とする。本発明のEHV−1 Ts変異株は38.5℃−39.0℃の温度以上で複製されない。好ましくは本発明のEHV−1 Ts変異株は38.5℃の温度で複製されない。
【0010】
本発明の目的に沿った小プラークの定義は、野生型親株によってウマ細胞中に形成されるプラークの少なくとも1/2−1/3の大きさのプラークを意味する。
【0011】
本発明の目的に沿った“ウイルス血症を引き起こす能力が小さい”の定義は、ウイルス血症を引き起こす親株の能力に比べて1日から3日または4日までの間にウイルス血症を引き起こす能力が幾つかの動物では全く存在しないかまたは低グレード(即ち、漸く検出できる程度)であることを意味する。
【0012】
本発明の温度感受性EHV−1変異株は、感染したウシ、ウマまたはその他の許容細胞培養物を34℃で無毒性濃度の5−ブロモ−2−デオキシウリジン、アザシチジンのような突然変異誘発物質によって処理し、次いでウシ、ウマまたはその他の許容細胞系中でこれらの処理培養物から後代ウイルスを生物クローニングすることによって得ることができる。
【0013】
本発明のTs変異株の有利な特性は、ワクチンを製造するために極めて好適に使用できることである。従って、本発明の第二の特徴によれば、本発明のEHV−1 Ts変異株と、医薬として許容される担体またはビヒクルとから成る組成物、特にワクチン組成物が提供される。より特定的には、本発明の(ワクチン)組成物は、ECACC,Salisbury,UKに寄託された登録番号V99061001を有するEHV−1 Ts変異株及び/またはその後代を含む。本発明のワクチンに好適に使用できる医薬として許容される担体またはビヒクルは、滅菌水、塩類溶液、PBSなどのような水性バッファである。更に、本発明のワクチンは、アジュバント、安定剤、抗酸化剤などのようなその他の添加剤を含有し得る。
【0014】
本発明のワクチン組成物は安全であり、ウマ科動物のEHV−1感染症を臨床的及びウイルス的に予防するため、並びに、ウイルス誘発性の流産及び不全麻痺を予防するために使用できる。更に、本発明のワクチンは、経胎盤感染を阻止し、従って産まれたばかりのポニーのウマ新生児病を予防することが知見された。本発明のワクチン組成物は、ウマだけでなく、ロバ、シマウマなどのようなEHV−1感染受容性の別の動物にも投与できる。EHV−1及びEHV−4の感染に受容性の畜牛もまた本発明のワクチンによって処置できる。
【0015】
更に意外にも、本発明のEHV−1 Ts変異株を含むワクチンがEHV−1感染症を予防するだけでなくEHV−4感染による疾患及びこれに付随するウイルスの飛散を予防することが知見された。従ってこのようなワクチンは、ワクチン接種したウマ科動物の交差予防を得るために有効である。このようなワクチンでは予防の改善が得られるので、野生型ウイルスの感染を効果的に阻止する。
【0016】
本発明のワクチン組成物は以下の標準手順によって調製できる。本発明のワクチンは好ましくは生ワクチンである。生ワクチンを製造するためには、EHV−Ts変異株のシード(seed)ウイルスをウシまたはウマの腎細胞の一次または二次培養物のような細胞培養物で増殖させる。このようにして増殖させたウイルスは、組織細胞培養液及び/または組織培養細胞を収集することによって回収できる。場合によっては回収中に、増殖基板からの感染性粒子の遊離を改善する技術例えば音波処理によってウイルスの回収率を向上させてもよい。生ワクチンは懸濁液の形態で調製されてもよくまたは凍結乾燥されてもよい。
【0017】
本発明のワクチンに使用できる適当な医薬として許容される担体は、滅菌水、塩類溶液、PBSなどのような水性バッファーである。更に、本発明のワクチンはアジュバント、安定剤、抗酸化剤などのような別の添加剤を含み得る。
【0018】
適当な安定剤は例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン及びグルコースのような糖質、アルブミン及びカゼインを非限定例とするタンパク質及びタンパク質分解産物、ウシ血清または脱脂乳のようなタンパク質含有物質、並びに、アルカリ金属リン酸塩を非限定例とするバッファーである。凍結乾燥ワクチン組成物には1種または複数の安定剤を添加するのが好ましい。
【0019】
適当なアジュバントの非限定例は、水酸化アルミニウム、リン酸塩または酸化物、アンフィジェン、トコフェロール、モノホスフェニルリピドA、ムラミルジペプチド、油エマルジョン、グルカン、カーボマー、ブロックコポリマー、サイトカイン及びQuil Aのようなサポニンである。アジュバントの添加量はアジュバント自体の種類に依存する。
【0020】
本発明のEHV−1 Ts変異株は好ましくは、胎仔も含む数日から数歳の年齢のコンベンショナルな血清反応陰性動物に投与される。ワクチンは、皮内、経口、噴霧、エアゾール、眼内及び鼻腔内投与を非限定例とする非腸管外経路で動物に投与できる。あるいは、ワクチンは腸管外投与経路で投与できる。好ましくはワクチンを皮内または鼻腔内投与する。
【0021】
一般には、EHV−1感染予防を誘発するために有効な量でEHV−1 Ts変異株ウイルスを投与する。投与量は一般に、投与経路、投与時間、並びに、ワクチン接種を受ける動物の年齢、健康及び食餌に依存するであろう。動物1頭あたり102−109pfu/投与、好ましくは103−105pfu/投与、より好ましくは1頭あたり104pfu/投与の量でウイルスを投与できる。
【0022】
本発明のワクチンはまた、別の生ワクチンまたは不活化ワクチンと同時的にまたは付随的に投与し得る。これらの追加ワクチンは非腸管外または腸管外の経路で投与できる。好ましくは追加ワクチンの腸管外投与が勧告される。
【0023】
実施例
1.温度感受性変異株EHV−1 TS C147の単離及びキャラクタリゼーション
ちょうど集密になる日数まで培養したウマ皮膚(equine dermal,ED)細胞の75cm2の単層に0.001のm.o.i.でEHV−1を感染させた。接種物(2.0ml)を吸着させ(1時間、37℃)、除去し、単層をPBSで洗浄し、次いで40μg/mlの5−ブロモ−2−デオキシウリジンを含有する組織培養培地(25ml)を補給し、34℃でインキュベートした。最大CPEに達すると(接種7日後)、培養物を回収し(−40℃で凍結し次いで37℃で解凍)、PBSに4℃で一夜透析し、37℃のED細胞中のEHV−1感染力を滴定し、次いで、96−ウェルの微量滴定プレートで増殖させたED細胞に34℃でクローニングした。単一のEHV−1フォーカスをもつウェルを同定し、最大CPEまで増殖させ、次いで、ED細胞を使用して許容温度(34℃)及び制限温度(39℃)で表現型を判別するために少量(全量200μl中の20μl)のサンプルを使用した。温度感受性クローンを更にウシ腎細胞JCK株(Jayの仔ウシ腎臓−Intervet株)に継代接種し、マスター処理シードを作製した。
【0024】
2.EHV−1 TS C147株の温度感受性表現型
マスターシードウイルス(MSV)+1°レベルのEHV−1 TS C147株を、ウシ胎仔の肺(BEL26株−Intervet株)、ウシ腎臓(Jayの仔ウシ腎臓,JCK株−Intervet株)、ウマ皮膚(ED)細胞、ウマ皮膚クローンW48 C10(ED W48 C10−Intervet株)及びウマ皮膚クローンW7 C5(ED W7 C5−Intervet株)中で37℃及び38.5℃で平行滴定した。MSV+1°継代レベルのウイルスは38.5℃で増殖できなかった。結果を表1に示す。
【0025】
3.EHV−1 TS C147株はEHV−4様の特性をもつ
EHV−1とEHV−4とを識別するためのパラメーターは、ウサギ腎(RK13)細胞中の複製能力である。EHV−1株はRK13細胞中で複製できるが、この細胞はEHV−4株に不応性である。MSV+1°レベルのEHV−1 TS C147株、その野生型親株であるEHV−1株、immediate early geneが欠失したEHV−1株(EHV−1 IE)、病原性EHV−1株CHLi及びEHV−4の野外単離物をRK13細胞及びウマ皮膚(ED)細胞中で37℃で平行滴定した。表2の結果は、TS C147株を含む4つのEHV−1株及びEHV−4株がED細胞中では複製され得るが、EHV−1 TS C147株及びEHV−4株はRK13細胞中で複製されなかったことを示す。
【0026】
【表1】
(a)5日間のインキュベーション後の力価;<1.1 log10 TCID50/mlとして表される力価は、滴定試験した4×200μlの最低希釈度(10−1)のウイルス中にEHV−1フォーカスが検出されなかったことを表す。
【0027】
【表2】
a=<1.1 log10 TCID50/mlとして表される力価は滴定した4×200μlの最低希釈度(10−1)中にEHV−1 CPEが検出されなかったことを表す。
【0028】
4.コンベンショナルポニーのEHV−1感染及びEHV−4感染に対する臨床的及びウィルス学的な予防
EHV−1中和(VN)抗体が少ないかまたは存在しない29頭のコンベンショナルポニーのうち、15頭には5.3 log10 TCID50の用量のEHV−1 TS C147株を鼻腔内(IN)にワクチン接種し、ワクチン非接種対照とするために14頭にはワクチン接種しなかった。一回のINワクチン接種の約1カ月後、ワクチン接種した8頭のポニー及びワクチン接種しない8頭のポニー(対照)には野外EHV−1株をINでチャレンジ投与し、EHV−1ワクチン接種した7頭と対照の6頭とから成るグループにはEHV−4の新しい野外単離物をINでチャレンジ投与した。ワクチン接種及びチャレンジ投与の後、動物の臨床反応、鼻腔粘液中のウイルス飛散、感染白血球(ウイルス血症)及びEHV−1中和抗体をモニターした。
【0029】
15頭のポニーのうちの11頭では1−8日間でワクチンウイルスが低い力価に増殖し(鼻腔粘液ピーク力価1.5−3.0 log10 TCID50/ml)、また、15頭の動物のうちの7頭では1−4日間で低グレード(漸く検出できる程度)の白血球ウイルス血症が生じた。しかしながら15頭のポニー全部が血清変換(seroconversion)していた。対照的に、それぞれ10日間または14日間毎日モニターした14頭の対照ポニーの鼻腔粘液または血液からはEHV−1が全く回収されず、動物はチャレンジ感染の後までEHV−1に対して血清反応陰性のままであった。2つのグループ(ワクチン接種群及び対照群)の各々に属する10頭の動物で同レベルの発熱が観察された。これらの所見を表3にまとめる。
【0030】
EHV−1の鼻腔内チャレンジ投与後、ワクチン接種したポニーの鼻腔粘液に排出されたウイルスは対照動物から回収されたウイルスに比べてかなり減少していた。同様に、8頭中の7頭では1回のワクチン接種によって白血球ウイルス血症が予防されたが、1頭は1日でウイルス陽性になった。しかしながら対照的に、ワクチン接種しなかったポニーは8頭全部がウイルス血症になり、7頭は3−4日で、1頭は1日でウイルス血症になった。対照ポニーは8頭全部が1−6日で微熱から高熱の発熱を生じたが、ワクチン接種した動物は8頭全部が平熱を維持していた。ワクチン接種した動物はチャレンジ感染に対して8頭全部が免疫記憶的に反応しなかったが、対照動物は8頭全部が有意なEHV−1中和抗体で反応した。これらの所見を表4にまとめる。
【0031】
EHV−4の鼻腔内チャレンジ投与後、ワクチン接種したポニーでは7頭中の1頭の鼻腔粘液からウイルスが一回だけ回収されたが、対照ポニーでは6頭全部が2−3日で有意に増加した力価のウイルスを排出した。例外は1頭であった。EHV−1ワクチン接種したポニーは7頭全部がウイルス血症にならなかったが、対照的に対照ポニーは6頭中の3頭が1−3日間でウイルス血症になった。EHV−4のチャレンジ感染に対しては、対照動物は6頭中の3頭が2−3日の発熱を生じたが、ワクチン接種したポニーは7頭全部が影響をうけなかった。ワクチン接種した動物では7頭中の4頭及び対照動物では6頭中の5頭でそれぞれ1−3日及び2−6日の多少の呼吸数増加が見られた(15−20呼息/分)。これらの所見を表5にまとめる。
【0032】
【表3】
【0033】
【表4】
【0034】
【表5】
【0035】
5.EHV−1感染が原因のウマの不全麻痺及び流産の予防方法
EHV−1中和(VN)抗体が少ないかまたは存在しない12頭の妊娠雌ウマに対して、そのうちの6頭には妊娠約6カ月目にワクチンを鼻腔内(IN)接種し、次いで12頭の雌ウマ全部に、EHV−1流産の危険が最も高い妊娠時期、即ち妊娠約9カ月目に病原性EHV−1株をINでチャレンジ投与した。ワクチン接種及びチャレンジ投与の後、動物の臨床反応、鼻腔粘液中のウイルス飛散、感染白血球(ウイルス血症)及びEHV−1中和抗体をモニターした。
【0036】
ワクチン接種した雌ウマでは6頭全部の鼻腔粘液からワクチンウイルスは全く回収されなかったが、6頭中の5頭で低グレードの一過性(1−3日)ウイルス血症が検出され、6頭全部がEHV−1に対する有意なVN抗体をもつように血清変換していた。ワクチン接種した動物と平行に10−14日間モニターした対照雌ウマでは6頭全部の鼻腔粘液または白血球からEHV−1が検出されなかったが、6頭中の1頭はほぼ2カ月半後に血清変換を示した。これらの所見を表6にまとめる。
【0037】
チャレンジ投与の後、ワクチン接種した雌ウマでは鼻腔粘液中に排出されたウイルスが有意に減少していた(6頭中の5頭から6頭中の2頭に減少、1−2日で2.4−3.7 log10 TCID50/mlから1.5−1.7 log10 TCID50/mlに減少)。また、ワクチン接種しなかった対照雌ウマでは6頭中の5頭がウイルス血症になったが、ワクチン接種した雌ウマは6頭全部がウイルス血症にならなかった。対照グループの雌ウマは6頭中の5頭が1−5日で発熱し、3頭は不全麻痺が進行して重い黄疸が併発し、2頭は子宮頸部のプラグが崩壊して胎児駆出の徴候を示した。この2頭のうちの1頭は死亡したが、もう1頭は最終的に安楽死させなければならなかった。双方の動物の胎仔は死亡していた。別の3頭の雌ウマは流産した。5つの胎仔の胎内組織はEHV−1陽性であった。しかしながら対照的に、ワクチン接種した雌ウマは6頭全部が正常に出産した。ワクチン接種した雌ウマで観察された唯一の臨床反応は6頭中の1頭が示した一過性(1日)の発熱であった。正常に出産した対照雌ウマはチャレンジ投与の直前に実際には血清変換していた。これらの所見を表7に示す。
【0038】
【表6】
a=動物をワクチン接種グループから隔離しておいたのでモニターしなかった。
【0039】
【表7】
5+ 対照雌ウマは、グループ1の雌ウマのワクチン接種の3カ月後の採血で血清反応陰性であったがチャレンジ投与前に血清変換していた。
【0040】
6.妊娠雌ウマに対するEHV−1 TS C147の安全性
妊娠約9カ月(EHV−1流産の危険が最も高い時期)の4頭の雌ウマに保護用量の10倍量を自然経路で接種し、流産をモニターした。表8の結果は、これらの雌ウマは4頭全部がEHV−1に対して血清変換されたこと、4頭中の1頭が一過性のウイルス血症になったが正常に出産したことを示す。これらのポニーがそれぞれの母乳を飲む前に採取した血液サンプル中のEHV−1 VN抗体は4頭中の3頭で陰性であったが、1頭は初乳摂取に起因するVN抗体陽性を示した(モニター期間の中間の早い時間に産まれた)。これらの結果を表8にまとめる。
【0041】
【表8】
a=誕生時のEHV−1中和抗体
b=モニター期間の中間の早い時間に誕生し、誕生後少なくとも3時間を経過したポニーから採血した。
c=未解決、即ち、試験待ち。
【0042】
7.ターゲット種の間でEHV−1 TS C147伝播は生じない
EHV−実験に使用されたことのない(すべてのタイプの)離乳したポニー(特定病原体非含有のSPFポニー)で戻し継代試験を実施した。
【0043】
2頭のSPFポニーに、保護用量の10倍量のマスタシードウイルス+1°継代レベルのEHV−1 TS C147株を鼻腔内(IN)接種し、数日間にわたって収集したウイルス陽性鼻腔粘液を使用して別の2頭のポニーに同様に感染させた。IN接種後、ポニーの(i)鼻腔粘液中のウイルス飛散、(ii)臨床反応及び(iii)EHV−1に対する血清変換をモニターした。
【0044】
MSV+1°レベルのEHV−1 TS C147株を与えたポニーは鼻腔粘液中にウイルスを排出し、血清変換を示した。しかしながら、ウイルス陽性鼻腔粘液サンプルのプールはEHV−1実験に使用されたことのない別の2頭のポニーに感染できなかった。これは、これらのポニーの鼻腔粘液からEHV−1を回収できなかったこと、及び、EHV−1に対する血清変換を示さなかったことから判断した。別の4頭のSPFポニーで試験を繰り返すことによって、即ち、2頭にMSV+1°で接種し次いで別の2頭に最初の2頭のポニーから採取したウイルス陽性鼻腔粘液を与えることによってこれらの結果を確認した。結果を表9及び10にまとめる。
【0045】
【表9】
【0046】
【表10】
Claims (5)
- ECACCに登録番号No.V99061001で寄託されたEHV1 Ts−突然変異株またはその後代であることを特徴とするウマ流産ウイルス(EHV−1)の温度感受性(Ts)変異株。
- 請求項1に記載の温度感受性変異株と医薬として許容されるビヒクルまたは担体とから成る医薬組成物。
- 請求項1に記載の温度感受性変異株と医薬として許容される担体または希釈剤とから成るウマ科動物のEHV−1感染症の予防及び/または治療用ワクチン。
- EHV−1感染症の予防及び/または治療用ワクチンを製造するための請求項1に記載の温度感受性変異株の使用。
- 請求項4に記載のワクチンを動物に投与することから成るEHV−1感染に対する動物の免疫感作方法。
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