UA47433C2 - Вакцини проти живого вірусу prrs з низькою патогенністю і способи їх одержання - Google Patents

Abstract

Живі або модифіковані живі вакцини PRRS, які мають низьку вірулентність і викликають вироблення ефективного імунітету проти PRRS у свиней. Кращі вакцини включають ізоляти вірусу, які мають середні діаметри бляшки менше 2 мм та низьку патогенність. Краща вакцина включає штам із бляшкою маленького діаметра, доступ у базу даних АТСС № VR2509. Вакцини винаходу можуть уводитися свиноматкам-виробникам або підсвинкам та відлученим поросятам і є ефективними для імунізації свиней проти респіраторної та репродуктивної форм захворювання.

Description

Опис винаходу

Даний винахід широко пов'язаний з низькопатогенними живими вірусними вакцинами для уведення свиням з 2 метою вироблення ефективного імунітету у свиней проти інфекцій вірусом репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (РКК5). Більш конкретно, винахід стосується таких живих вакцин спільно зі способами імунізації свиней проти вірусу РКК і способами отримання таких вакцин. Новий, по суті виділений і очищений вірус РКК із низькою патогенністю, під МоМК2509 доступу у базу даних АТСС, також становить частину винаходу. РКК5 виникнув в останні декілька років як важливе вірусне захворювання свиней. РКК викликає 70 важку репродуктивну недостатність у вагітних свиноматок, яка виявляється у формі передчасних опоросів, збільшення кількості мертвонароджених, муміфікованих та слабких поросят, зниженої частоти опоросів та затримки відновлення тічки. На уражених фермах гострі ознаки репродуктивних розладів при РКК5З у цілому продовжуються 2-4 місяця, але респіраторні симптоми захворювання можуть продовжуватися протягом багатьох років, спричиняючи значні продуктивні втрати. Були опубліковані декілька досліджень патогенезу інфекції 12 вірусом РКК у вагітних свиноматок/підсвинків на пізніх термінах вагітності (77-95 днів вагітності). У кожному з цих досліджень була продемонстрована спроможність вірусу РКК5 викликати трансплацентарну інфекцію та патологічний стан плоду. Проте у свиноматок у середні терміни вагітності патологічний стан плоду не розвивався, і плоди, інфіковані внутрішньоутробно у середні терміни вагітності, залишалися у цілому нормальними.

У польових умовах є декілька ферм, на яких не було виявлено ні гострих репродуктивних розладів, ні хронічної респіраторної форми захворювання, але які є серологічно позитивними на РКК5. Причини відсутності клінічних симптомів захворювання у таких випадках недостатньо зрозумілі. Було висловлене припущення, що можуть існувати штами вірусу РКК5 з низькою патогенністю, і що вони відповідальні за інфекції у популяції свиней, які не виявляють клінічних симптомів РККЗ. Різні дослідники повідомляли про ряд ізолятів вірусу РКК5. с 29 Було показано, що усі вони мають РНК та оболонки, які містять ліпіди, але не мають спроможності до Ге) гемаглютинації еритроцитів різноманітних видів тварин.

Даний винахід долає вказані вище проблеми і надає удосконалені живі або модифіковані живі вакцини проти

РКК5 для уведення свиням. Вакцини винаходу включають достатню кількість живого або модифікованого живого вірусу для вироблення ефективного імунітету у свиней проти інфекції вірулентним РКК дикого типу. о

Використовуваний тут термін "ефективний імунітет" належить до спроможності вакцини запобігти у свиней се інфекції РКК5, які викликають розвиток істотних клінічних ознак захворювання. Тобто, імунізована свиня може бути або може не бути серологічне позитивною за РКК5, але у неї немає прояви будь-яких істотних клінічних З симптомів. ча

У кращі форми вакцини винаходу включають новий живий вірус, позначений як ММ-Нег, який був депонований 39 в Американській колекції типових культур (АТСС), 12301 Рагкіажп Огіме, КосКміїе, МО, 20852, і йому був З привласнений МоуУкК2509 доступу у базу даних АТСС. Було показано, що цей вірус є по суті авірулентним і викликає ефективний імунітет. Його вакцини можна уводити свиноматкам-плідникам, підсвинкам, кабанам або відлученим поросятам, і таке уведення може здійснюватися будь-яким зручним способом, таким як « внутрішньом'язова ін'єкція або перорально-інтраназальне уведення. У цілому, дози вакцини повинні містити від З 70 приблизно 107 до приблизно 103 одиниць вірусу, які утворюють бляшки. с Більш узагальнено, винахід також стосується способу отримання свинячих вакцин проти РКК5, який включає :з» спочатку отримання за допомогою методу клонування бляшок штаму або ізоляту вірусу РКК5, який має середній діаметр бляшки не менше приблизно 2мм на конфлюентному газоні клітин МАКС-145, та отримання живої вакцини з такого штаму. Лінія клітин МАКС-145 була депонована в АТСС, і їй був привласнений Мо доступу їз 395 у базу даних АТСС. Переважно, вакцини винаходу мають по суті такий вірус з маленьким діаметром бляшки, який отриманий в очищеній формі. Кращий вірус МОМК2509 доступу у базу даних АТСС має такий маленький - І діаметр бляшки і, як вказано, є по суті цілком авірулентним, у той же час викликаючи вироблення імунітету. їз Стислий опис креслень

Фіг.1 являє собою фотографію, яка ілюструє морфологію та розмір бляшки ізоляту (95) 50 ММ-Нез вірусу РКК (« 2мм) на лінії клітин МАКС-145; Фіг2 являє собою фотографію, яка ілюструє морфологію, та розмір бляшки ізоляту ММ-НІ. вірусу РККЗ (3-5мм) на лінії клітин МАКО-145; та Фіг.3 являє сб» : Й с. : . Й вт, собою фотографію, яка ілюструє морфологію, і розмір бляшки ізоляту ММ-МУ/ вірусу РККЗ (2-Змм) на лінії клітин

МАКС-145.

Докладний опис кращого варіанта реалізації 99 Наведені приклади подають кращі методики виділення, ідентифікації та клонування низькопатогенного штаму

ГФ) вірусу РКК, а також кращу методику виробництва вакцин із нього; варто розуміти, що ця інформація надана 7 тільки як ілюстрація, і ніщо в ній не варто розцінювати як обмеження загального обсягу домагань винаходу.

Згадані літературні джерела включені в опис як посилання.

Приклад1 бо Реферат

У цьому прикладі був досліджений патогенез утворюючого дрібні бляшки варіанта (ММ-Нз) вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (РКК5) у вагітних свиноматок. Штам ММ-Не спочатку клонували з вірусу ММ-Н, який являє собою суміш вірусів, які утворюють дрібні та великі бляшки (ММ-Н). У першому експерименті для порівняння патогенності для плоду по 2 вагітні свиноматки, кожну на 86 день бо вагітності, інтраназально інокулювали відповідно ММ-Не, ММ-НІ, польовим ізолятом (ММ-МУ) або уводили середовище для культури клітин (контрольні). Усім свиноматкам давали можливість опороситися по закінченні їхньої вагітності за винятком контрольних свиноматок. На 7 день після інокуляції (ПІ) у інфікованих свиноматок спостерігали вірусемію, і на 14 день ПІ за допомогою реакції непрямої імунофлюоресценції (НІФ)

ВИЯВЛЯЛИ сероконверсію. Дві свиноматки, інфіковані вірусом ММ-Нв, народили 14 живих та 5 мертвих поросят, тоді як 2 свиноматки, інфіковані вірусом ММ-НІ., опоросилися 25 мертвими поросятами при відсутності живих поросят. Дві свиноматки, інфіковані МІМ-МУ, опоросилися 10 живими та 20 мертвими поросятами. У двох контрольних свиноматок при забої на 107 день вагітності було 16 нормальних плодів. Вірус був виділений у 16 (66,795) із 24 живонароджених, 9 (64,3905) із 14 мертвонароджених і З (12,0905) із 25 муміфікованих поросят від б 7/0 інфікованих свиноматок. У сироватці в шести з 13 мертвонароджених поросят від 4 свиноматок, інфікованих

ММ-НІГІ. або ММ-МУ, титри антитіл проти вірусу РКК5 були, за даними визначення за допомогою НІФ, у діапазоні від 1:16 до 1:1,024. У наступному експерименті для повторення результатів, отриманих з вірусом МІМ-Нв, 2 вагітних свиноматки, кожну на 86 день вагітності, інфікували відповідно інтраназально ММ-Нв, внутрішньом'язово ММ-Нег та інтраназально другим польовим ізолятом (ОМІ-173), і усім свиноматкам давали у/5 Можливість опороситися по закінченні їхньої вагітності. Дві свиноматки, інфіковані інтраназально та внутрішньом'язово вірусом ММ-Нв, опоросилися відповідно 15 живими і 6 мертвими та 25 живими і 5 мертвими поросятами, тоді як 2 свиноматки, інфіковані ОМІ -173, народили 6 живих і 24 мертвих поросяти. Ці результати свідчать про те, що серед виділених вірусів патогенність вірусу РККЗ різна для плодів свиней, і штам ММ-Нае вірусу РКК являє собою слабко патогенний вірус. Було встановлено, що виявлення антитіла проти вірусу РЕНз у сироватці мертвонароджених поросят є способом діагностики інфекції плоду, який можна застосовувати.

Матеріали та методи

Вірус та клітинна культура.. У цьому дослідженні використовувалися три різні ізоляти вірусу РЕКЗ5. Ізолят

ММ-Н був отриманий із сироватки здорового поросяти, який утримується в розпліднику, на фермі із субклінічною ознакою інфекції вірусом РКК5. Спочатку вірус ММ-Н являв собою суміш популяцій вірусів із розмірами бляшок, сч ов Які варіюють. Віруси, які утворюють дрібні (ММ-Нз) та великі (ММ-НІ) бляшки, клонувалися окремо від вірусу

ММ-Н, і кожний вірус чотири рази виділяли з бляшки для нового експерименту і шість додаткових разів для і) наступного експерименту за допомогою методу клонування бляшок відповідно до Ніт еї аї.. Ат. У. Меї. Кезв., 52:1649-1652 (1991). При кожному такому пасажі бляшок конфлюентні моношари клітин МАКС-145 (пермісивний клон, отриманий із клітинної лінії нирок зеленої африканської мартишки (МА-104)) вирощували у чашках Петрі с зо розміром бомм х 15мм (клітини підтримували у мінімальному головному середовищі Ігла (МГ) із додаванням Зо плодової баранячої сироватки (ПБС), 0,1595 карбонату натрію та антибіотиків (Кіт еї аї., Агсп. Мігої., і, 133:477-483 (1993)) та інфікували відповідним вірусом. Культури інкубували протягом 60 хвилин при 37"С, після «г чого інокулят видаляли і культури одноразово промивали МГС. Після цього у кожну чашку додавали бмл аліквоту рідкого культурального середовища, яке складається з рівного об'єму 2Х МГ і 1,690 кип'яченого агара -

МобБіе (Оізсо Іарогайгіез) з добавкою 5БОмкг діетіламіноетіл (ДЕАЕ)-декстрану/мл. Чашки продовжували «Е інкубувати протягом 5 днів при 37"С у СО 5 інкубаторі. Наприкінці періоду інкубації бляшечні культури візуалізували за допомогою додавання в них Змл фізіологічного розчину з фосфатним буфером із додаванням 1956 нейтрального червоного. Відібрані бляшки клонували за допомогою взяття стерильною пастерівською піпеткою та переносу шляхом інокуляції на неінфіковані моношари клітин МАКС-145. Для постійного « забарвлення агар обережно видаляли і клітинні моношари забарвлювали 2мл 195 кристалічним фіолетовим в шщ с 2095 етанолі протягом 10 хв. Чашки обполіскували водопровідною водою для полегшення дослідження бляшок.

Штам ММ-М/ вірусу РКК5 виділяли із сироватки хворих свиноматок ферми з типовими ознаками гострого з РЕК, а ОМІ-173 одержували з Охіога Мейегіпагу І арогайгіев, МУогіпіпдіоп, ММ.

Тварини і структура експерименту. Вагітних свиноматок приблизно на 80 день вагітності одержували на фермі, де в минулому не було клінічних або серологічних даних за інфекцію вірусом РКК5. Свиноматок двічі на їх рік вакцинували проти свинячого парвовірусу (РРУ) і видів І еріозріга на фермі. Одержували точні дані про дати виведення кожної свиноматки. Після закупівлі кожну свиноматку тримали окремо в ізольованому помешканні в - університеті Міннесоти. На 86 день вагітності, кожну з двох свиноматок інтраназально інокулювали відповідно «г» вірусом ММ-Не, ММ-НІ та ММ-М/ (2мл,102-55ТС|Овр/мл). Двох свиноматок, які залишилися, інокулювали середовищем для культури клітин і вони слугували контролем. Зразки сироватки від кожної свиноматки брали о через інтервали часу для виділення вірусу та серологічного дослідження. Шести інфікованим свиноматкам дали с» можливість опороситися природним шляхом, а двох контрольних свиноматок забивали на 107 день вагітності для дослідження плодів. Після опоросу для виділення вірусу та серологічного дослідження брали зразки крові та легенів живих та мертвонароджених поросят та рідини із грудної порожнини в муміфікованих плодів. У другому експерименті перед інокуляцією вірус ММ-Не шість додаткових разів виділяли з бляшок. Двох вагітних свиноматок, на 86 день вагітності кожну, інтраназально інокулювали ММ-Не та інтраназально іншим польовим

Ф, ізолятом (ОМІ-173), і усім свиноматкам давали можливість опороситися по закінченні термінів їх вагітності. ко Після опоросу в муміфікованих або мертвонароджених плодів вимірювали вінцеву-крижову довжину для оцінки часу смерті (Маггабіе сеї аї., 3. Адгіс. Зсі,, 69:443-447 (1967)) Зразки крові та легенів брали та бо аналізували, як описано у першому експерименті.

Виділення та серологія вірусу. Для виділення вірусу кожний зразок сироватки або надосадової рідини легеневого гомогенату розміщали у лунках 24-лункової пластини і додавали клітини МАКС-145 (1-2х10Уклітин/мл), суспендовані в МГС із додаванням 395 ПБС. Культури спостерігали протягом 5-7 днів для виявлення цитопатичних ефектів (ЦПЕ), типових для вірусу РКЕК5. Планшети двічі заморожували і відтавали, і 65 зразки надосадової рідини інокулювали у лунках 9б-лункових пластин свіжою суспензією клітин МАКС- 145 і інкубували протягом 3-4 днів. Дані за вірусну інфекцію досліджували за допомогою спостережень як за СПЕ, так і специфічною флюоресценцією з використанням еталонної свинячої сироватки, яка містить вірус РЕК.

Сироватку від свиноматок та поросят випробували на наявність антитіл за допомогою реакції непрямої імунофлюоресценції (НІФ) (Мооп еї аї., 9УМеїОіад. Іпмеві, 4:144-147 (1992)), 9б-лункові пластини, які тестують, готували з використанням ліній клітин МАКС-145. Деякі зразки сироватки випробували на наявність антитіл проти РРМ (вірусу прогресуючої пневмонії овець) за допомогою тесту придушення гемаглютинації (НІ), як описано раніше (со еї аї., А!йві. Меї. 9., 52:422-424(1976)).

Результати

При початковому виділенні ізоляти вірусу РККЗ давали різні розміри бляшки. Ізолят ММ-Н по розміру їхньої 70 бляшки клонували на дві різні популяції ММ-Не та ММ-НІ.. Після клонування відповідні розміри ММ-Нз і МІМ-НІ., стійко знаходилися в діапазоні від « 2мм до З3-5мм у діаметрі, тоді як ці розміри в ММ-М/ складали 2-Змм (див. фігури).

Крім незначної анорексії, виявленої у свиноматок 112 і 153 протягом 5 днів після інокуляції (ПІ), у свиноматок після інфекції ізолятами вірусу РКК5 не спостерігалися виражені клінічні ознаки. Вірус виділяли зі /5 Зразків сироватки у шести із шести свиноматок через сім днів ПІ та в однієї із шести свиноматок через 14 днів

ПІ. Як наведено у таблиці 1, у всіх інфікованих свиноматок через 14 днів ПІ були виявлені високі титри антитіл. ю

Вірус виділяли у одного або більше плодів у кожного приплоду інфікованих свиноматок. Результати виділення вірусу в окремих поросят від шести інфікованих свиноматок в експерименті 1 показали, що приблизно (о) половина досліджуваних плодів (28 із 63 поросят) була позитивною по виділенню вірусу. Серед поросят, досліджуваних на присутність вірусу, 16 (66,7906) із 24 живонароджених поросят, 9 (64,390) із 14 мертвонароджених поросят та З (12,095) із 25 муміфікованих поросят були вірус-позитивними. З 28 поросят, со зо вірус-позитивних по зразках їхньої сироватки, 10 поросят були негативними по вірусу, коли на виділення вірусу досліджували зразки їхніх легенів. со

Зразки сироватки від мертвонароджених поросят свиноматок 153, 147, 68 та 112 досліджували на наявність «т антитіл до вірусу РКК5 за допомогою НІФ та РРМ за допомогою НІ, і результати наведені у таблиці 3. У шести з 13 зразків від мертвонароджених поросят і в 2 із 25 зразків рідини від муміфікованих поросят було антитіло до в. вірусу РКК5. Титри НІФ варіювали від 1:16 до 1:1,024, тоді як у жодному зі зразків сироватки не було антитіла «т до РРУ. У тринадцятьох із 14 живонароджених поросят від свиноматок 17 і 53 були антитіла і до вірусу РККЗ (титри НІФ 1:64 до 1:1,024), та РРМ (титри НІ. 1:512 1:16,384). « й - ин Інн з пн ПО щ ї» нм сере 675,00; вв 'жх 00001803 Мем 026,80 2536 во, ї» ПИ ПИ ПОН ПОН ПОН ПОН ВАНН КОН КО в маки і. р ями яв 6ют е пи п Я ПОН ПО ПОЛОН ПОН КОН ПО сю вва мем в в81410000000000002523000001 БИ мам варив с» пи п Я ПОН ПО ПОЛОН ПОН КОН ПО пи: ЕЕ НН В ПОЛ НАННЯ вве 01жнеюль 12123310 59 гсттьь1гс о ю мм рв)02/01011111 3370010,

ПИ ПИ ПОН ПОН ПОН ПОН ВАНН КОН КО бо м мениму 15 302101011101100003ая00000оив пи п Я ПОН ПО ПОЛОН ПОН КОН ПО вою ловіомсетммі 2) 10121116 из вв

ЗДень вагітності при опоросі або забої вВінцево-крижова довжина (см) муміфікованих або мертвонароджених плодів сКількість виділених зразків вірусу/кількість випробуваних зразків 4Свиноматок забивали на 107 день вагітності дослідження плодів

І В - живонароджені;

ЗВ - мертвонароджені;

М - муміфіковані;

ІМ - інтраназально;

ІМ - внутрішньом'язово;

МО - не визначалася " свиноматки 1111вветівві1111св 1111111ввеюломі111в 11111111 вве вве см 11вве1в о 11111ввеовві111в 11111ввевв1111в 111 о со аВінцево-крижова довжина (см) т вОбернені величини НІФ або титру НІ. - с| В - живонароджені; «

ЗВ - мертвонароджені;

М - муміфікація

Обговорення

Дане дослідження підтвердило спроможність різних ізолятів вірусу РКК5 викликати трансплацентарну « 20 інфекцію і справляти патогенний вплив на плоди свиноматок на пізніх термінах вагітності. Проте між ізолятами - с вірусу РКК5 спостерігалося очевидне розходження патогенності. Коли провадили інтраназальну інокуляцію свиноматок, які багаторазово народжували, вірусом РКК АТСС-МУК2332 на 93 день вагітності (Спізіапзоп, МУ. Т. :з» еїа!.. Сап. 9. Меї. Кев., 57:262-268 (1993)), вони у середньому народжували 5,8 живих поросят та 6,0 мертвих плодів на приплід. У даному дослідженні б свиноматок, інфікованих МІМ-НІ або 2 польовими вірусами, опоросилися у середньому 2,7 живими та 11,5 мертвими поросятами на приплід, і, таким чином, ці віруси їх розцінюються як високо вірулентні. Патогенність АТСС-УК2332 та вірулентних вірусів, використаних у цьому дослідженні, була різна. Це може бути внаслідок термінів вагітності під час інфекції, оскільки вірусом і АТСС-МК2332 інфікували на 7 днів пізніше. Тим часом, б свиноматок, інфікованих ММ-Не, народжували у їх середньому 9,0 живонароджених та 2,7 мертвих поросят на опорос. Ці результати значно відрізняються від 20 результатів для вірулентних вірусів, показуючи, що вірус ММ-Не являє собою слабко патогенний штам. о Цікаво, що спостерігалося очевидне розходження опоросу свиноматок, інфікованих вірусами ММ-Не та с ММ-НГ, які були однакового походження. У однакових умовах віруси ММ-Не та ММ-НІ. викликали народження відповідно 5 і 25 мертвих поросят (р « 0,005). За результатами даного дослідження можна прийти до висновку, що патогенність ММ-Не та ММ-НІ. по суті різна, причому один являє собою слабопатогенний штам, а другий - високопатогенний вірус.

Виділення вірусу у приплодів, інфікованих вірусом РЕКК5, було відносно легким, і вірус виділявся з (Ф. однаковою частотою в живих та мертвонароджених поросят. Через те, що вірус не можна було виділити в усіх ко поросят в інфікованому приплоді, спробу виділення вірусу з діагностичною ціллю варто починати щонайменше у 2 або більш поросят на приплід. Було також виявлено, що виділення вірусу більш зручно проводити зі зразків бо Сироватки, ніж зі зразків легеневої тканини.

У приплодів свиноматок, інфікованих вірулентним вірусом, у одного або більш мертвонароджених поросят було виявляєме антитіло, специфічне для вірусу РККЗ5. Ці результати свідчать про те, що виявлення антитіла у мертвонароджених поросят або у поросят, які ще не ссали матір, може бути придатним способом для діагностики інфекції вірусом РККЗ у патологічних приплодів Цей спосіб варто було б застосовувати у в5 лабораторіях, де немає методик і засобів для виділення вірусу. У даному дослідженні у б із 13 мертвонароджених поросят були позитивні титри антитіл до вірусу РКК5, але не до РРУ, переконуючи в тому,

що виявлені антитіла мають плодове походження і утворюються внаслідок наявності вірусу РККЗ5.

Відомо, чому у деяких чередах, інфікованих вірусом РКК5, не розвиваються клінічні ознаки. Спостерігалося, що в чередах із гарним станом здоров'я перед інфекцією вірусом РКК5 виявлялася більш слабка клінічна реакція, у порівнянні з чередами з більш низьким рівнем здоров'я. Переважний стан здоров'я, поряд із розходженнями штамів, показані у цьому дослідженні, є можливими поясненнями очевидних розходжень клінічного прояву. Крім того, можна підтверджувати, що взаємодія між вірусами, які утворюють дрібні та великі бляшки може відбуватися в організмі тварини і змінювати патогенність. Це може бути істиною, якщо ми врахуємо, що на фермі, де був виділений вірус ММ-Н, не було репродуктивних проблем, незважаючи на 7/0 присутність на фермі патогенного вірусу ММ-НІ. РЕК.

Приклад2

Кращі вакцини згідно з винаходом можуть уводитися селекційним підсвинкам, свиноматкам, кабанам або відлученим поросятам. Уведення може провадитися внутрішньом'язово або перорально-інтраназально і проводитися в будь-який час. Проте для захисту на весь період вагітності кращі вакцинації свиноматок-виробників перед спарюванням і невдовзі після відібрання маленьких поросят для їхнього захисту у пізні терміни вигодовування, росту та на завершальних стадіях.

У цілому, вакцини винаходу уводяться в дозах 2мл, які містять від приблизно 10 4 до приблизно 108 бляшкоутворюючих одиниць (БУС), і ще краще приблизно 10 БУО. У випадку свиноматок-виробників імунітет буде продовжуватися щонайменше один період вагітності, тоді як вакцинація маленьких поросят після

Відібрання викликає вироблення імунітету для захисту протягом усього заключного періоду відгодівлі. Кращі вакцини згідно з винаходом можуть дати широкий діапазон перехресного захисту.

Вакцини згідно з винаходом можуть включати живий або модифікований живий (ослаблений) вірус, а також звичайні носії, стабілізатори та/або ад'юванти.

Приклад З Га

Введення

У цьому прикладі досліджувалася спроможність вакцини, складеної зі штаму ММ-Не Північно-американського і9) вірусу РКК5, захистити поросят 3-тижневого віку від віремії, яка була викликана інфекцією вірулентним штамом

МІМ-НІ. Північно-американського вірусу РЕК. Респіраторне захворювання, пов'язане з інфекцією

Північно-американського вірусу, у першу чергу викликано інфекцією вторинними патогенами, присутніми на «се свинофермах. Проте у експериментальних умовах респіраторні клінічні ознаки у свиней, інфікованих

Північно-американським вірусом РКК5З, не відтворюються зі сталістю унаслідок відсутності цих вторинних о патогенів. Тому виявлення віремії є кращим показником інфекції Північно-американським вірусом РЕККЗ5. «І

Відсутність віремії після контрольного зараження штамом ММ-НІ вказує, що поросята, вакциновані штамом

МІч-Нег, мають імунітет до інфекції штамом МІМ-НІ.. -

Матеріали і методи «Її

Двадцять поросят З-тижневого віку були придбані на фермі, де не було РКЕК5. Дванадцять поросят були інтраназально вакциновані штамом МН-Нзг (2мл, 1025ТСІОво/мл), а 8 поросят, які залишилися були контрольними. Вакциновані та контрольні поросята утримувалися в окремих помешканнях блоку-ізолятора. «

Через 2 тижні після вакцинації проводили контрольні зараження шести вакцинованих поросят (поросята МоМо з 81 по 86) та 4 контрольних поросят (поросята МоМо з 93 по 96) інтраназальним уведенням штаму МН-НІ. (2мл, - с 104,5 ТСІОрво/мл) (група 1). Аналогічним чином через 6 тижнів після вакцинації проводили контрольні зараження "» залишившихся 6 вакцинованих поросят (поросята МоМо з 87 по 92) та 4 контрольних поросят (поросята МоМо з 97 " по 100) (група І). Усіх поросят щодня спостерігали для виявлення клінічних ознак. Крім того, у кожного поросяти щотижня брали зразки крові для (1) виділення вірусу з використанням культури клітин МАКС-145 (Мооп еї аї., 9. Меї. Оіад. Іпмеві, 6:289-292 (1994)) і (2) визначення титрів антитіла нейтралізації сироватки (НС) ве (Рагк еї аі.. Ат. У. Меї. Кев., 57:320-323 (1996)); виявлення антитіла НС у вакцинованих поросят вказує на -1 захисний імунітет до вірулентного Північно-американського вірусу РКК5.

Результати ве Після вакцинації у поросят груп | та ІІ вірус вакцини виділяли до З тижнів після вакцинації. Після с 20 контрольного зараження клінічні ознаки не спостерігали в жодного з контрольних та вакцинованих поросят груп та Ії. сю Група І. Під час контрольного зараження антитіло НС не було виявлено в жодного поросяти. Після контрольного зараження вірус контрольного зараження був виділений як у вакцинованих, так і в контрольних поросят. Крім того, як у вакцинованих, так і в контрольних поросят розвилася віремія (таблиця 1).

Група ІІ. Вакциновані поросята виробляли антитіло НС, починаючи з З тижнів після вакцинації, і під час

ГФ! контрольного зараження в них були титри від 1:2 до 1:8. Після контрольного зараження вірус контрольного зараження не був виділений у вакцинованих поросят, тоді як у контрольних поросят розвилася віремія (таблиця о 4). Ці результати показують, що у вакцинованих поросят був набутий захисний імунітет до вірулентного

Північно-американського вірусу РКК. 60 агро 48810100 б5 Група

ПОМ ТЕ я НИ Ох НО ПОН ПОН Ст НОЯ НО КОХ НО пи тт т т т т ПЕ ПОЛОН ПОЛОН КОНЯ ПО вм г ПИМО РТ П ПНЯ ПОЗУ НОЯ ОН ПОН ПОН ПОН НО пи т т т Ес ОО ПОЕТ ПОЛОН ПОН КОНЯ ПО вм пи т В т т Я т ПО ПОЛОН КОНЯ КОНЯ ПО ме 1 о ввої і ни вої тла 1 154145, і

М 2 Вакциновані; С - контроль с а - контрольно заражені вірусом ММ-НІ. о

Ь - виділення вірусу/гитру антитіла НС

Поросят у групах І та ІІ забивали відповідно через 4 та 8 тижнів після вакцинації со

Claims (1)

1. 30 Формула винаходу со

   1. Вакцина, яка вміщує вірус Північно-американського свинячого репродуктивного та респіраторного в синдрому і який має позначення АТСС МК2509. че

   2. Вакцина згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що вірус є живий. Зо З. Вакцина згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що доза вакцини містить від 107 до 108 БУО. М

   4. Спосіб імунізації свині проти Північно-американського свинячого репродуктивного та респіраторного синдрому, який включає етапи уведення свині вакцини згідно з п. 1.

   5. Спосіб згідно з п. 4, який відрізняється тим, що вірус є живий. «

   6. Спосіб згідно з п. 4, який відрізняється тим, що свиня є зрілою свиноматкою-виробником. З7З 70 7. Спосіб згідно з п. 4, який відрізняється тим, що свиня є поросям.

   с 8. Спосіб згідно з п. 4, який відрізняється тим, що вакцина уводиться внутрішньом'язово інтраназально або :з» перорально.

   9. Спосіб отримання вакцини, який включає етапи: (А) отримання за допомогою клонування бляшок штаму Північно-американського вірусу РКК5; та (В) отримання вакцини із штаму, отриманого на етапі (а), у якому штам дає бляшки, які мають середній те діаметр менше 2 мм, коли бляшки отримані за допомогою способу, який включає етапи: -І (а) інфікування аліквоти клітин штамом, у якої клітини мають позначення СК 12219, причому аліквота отримана з конфлюентного моношару клітин, підтримуваних у мінімальному головному середовищі Ігла з те додаванням 395 фетальної сироватки теляти та 0,1595 карбонату натрію, при цьому аліквота вміщує о 250 5 клітин на мл мінімального головного середовища Ігла з додаванням 295 фетальної сироватки 1-2х10 с» теляти та 0,1595 карбонату натрію; (б) інкубації аліквоти при 37"С протягом 60 хвилин; (в) видалення інокуляту з аліквоти; 52 (г) промивання аліквоти мінімальним головним середовищем Ігла; Ф! (д) повторного суспензування аліквоти у 5 мл 2Х мінімального головного середовища Ігла та 1,695 кип'яченого агару Мобіе з додаванням 250 мкг діетиламіноетил (ДЕАЕ)-декстрану; о (е) розміщення аліквоти на чашки; та (ж) подальшої інкубації аліквоти при 37"С протягом 5 днів у СО» інкубаторі для отримання бляшок. 6о 10. Спосіб згідно з п. 9, який відрізняється тим, що вакцина включає живий штам Північно-американського вірусу РЕК.

   11.Спосіб згідно з п. 9, який відрізняється тим, що спосіб отримання вакцини включає етап отримання штаму в очищеній формі.

   12. Спосіб згідно з п. 9, який відрізняється тим, що штам має позначення АТСС УК2509. бо 13. Вакцина, яка включає штам Північно-американського вірусу РКЕК5, причому штам дає бляшки, які мають середній діаметр менше 2 мм, коли бляшки отримані за допомогою способу, який включає етапи: (а) інфікування аліквоти клітин штамом, у якої клітини мають позначення СК 12219, причому аліквота отримана з конфлюентного моношару клітин, підтримуваних у мінімальному головному середовищі Ігла з додаванням Зб фетальної сироватки теляти та 0,1595 карбонату натрію, при цьому аліквота вміщує 1 а ж 107 клітин на мл мінімального головного середовища Ігла з додаванням 395 фетальної сироватки теляти та 0,1595 карбонату натрію; (б) інкубації аліквоти при 37"С протягом 60 хвилин; 70 (в) видалення інокуляту з аліквоти; (г) промивання аліквоти мінімальним головним середовищем Ігла; (д) повторного суспензування аліквоти у 5 мл 2Х мінімального головного середовища Ігла та 1,695 кип'яченого агару Мобіе з додаванням 250 мкг діетиламіноетил (ДЕАЕ)-декстрану; (е) розміщення аліквоти на чашки; та (ж) подальшої інкубації аліквоти при 37"С протягом 5 днів у СО 5 75 інкубаторі для отримання бляшок.

   14. Вакцина згідно з п. 13, яка відрізняється тим, що включає живий штам Північно-американського вірусу РЕНЗБ.

   15. Вакцина згідно з п. 13, яка відрізняється тим, що штам має позначення АТСС УК2509.

   16. Виділений та очищений штам Північно-американського вірусу РКК5, у якому штам має позначення АТСС Ук2509.

   17. Штам згідно з п. 16, який відрізняється тим, що штам є живий.

   18. Виділений та очищений штам Північно-американського вірусу РКЕКЗ, причому штам дає бляшки, які мають середній діаметр менше 2 мм, коли бляшки отримані за допомогою способу, який включає етапи: (а) інфікування аліквоти клітин штамом, у якої клітини мають позначення СК 12219, причому аліквота сч ов Отримана з конфлюентного моношару клітин, підтримуваних у мінімальному головному середовищі Ігла з додаванням 395 фетальної сироватки теляти та 0,15956 карбонату натрію, при цьому аліквота включає (о) 1 а ж 107 клітин на мл мінімального головного середовища Ігла з додаванням 395 фетальної сироватки теляти та 0,1595 карбонату натрію; ло ке й | (зе) зо (6) інкубації аліквоти при 37"С протягом 60 хвилин; (в) видалення інокуляту з аліквоти; (зе) (г) промивання аліквоти мінімальним головним середовищем Ігла ; « (д) повторного суспензування аліквоти 5 мл 2Х мінімального головного середовища Ігла та 1,695 кип'яченого агару Мобіе із додаванням 250 мкг діетиламіноетил (ДЕАЕ)-декстрану; - (е) розміщення аліквоти на чашки; та « (ж) подальшої інкубації аліквоти при 37"С протягом 5 днів у СО» інкубаторі для отримання бляшок.

   19. Штам згідно з п. 18, який відрізняється тим, що штам є живий.

   - . и? щ» -і щ» (95) сю» іме) 60 б5