SK281024B6

SK281024B6 - Vakcíny obsahujúce živý vírus prrs s nízkou patogenitou a spôsoby ich prípravy

Info

Publication number: SK281024B6
Application number: SK1657-97A
Authority: SK
Inventors: Han Soo Joo
Original assignee: Regents Of The University Of Minnesota
Priority date: 1995-06-21
Filing date: 1996-06-19
Publication date: 2000-11-07
Also published as: AU703084B2; EP0833661A1; CZ412797A3; BR9608648A; DK0833661T3; JPH11509087A; HUP9903169A2; ATE215384T1; HU227754B1; CN1126569C; KR100444809B1; HUP9903169A3; CZ291611B6; HK1016870A1; PL184231B1; MX9710149A; CN1188417A; DE69620402D1; EP0833661A4; JP3954101B2

Abstract

Sú opísané živé alebo modifikované živé PRRS vakcíny na podanie prasatám, ktoré majú nízku virulenciu a vytvárajú účinnú imunitu proti PRRS. Preferované vakcíny obsahujú izoláty vírusu, ktoré majú priemerný priemer plaku menší než asi 2 mm a majú nízku patogenitu. Preferovaná vakcína obsahuje kmeň s malým priemerom plaku, ATCC prírastkové č. VR 2509. Vakcíny môžu byť podané chovným samiciam alebo mladým prasniciam a odstaveným prasiatkam a sú účinné pri imunizácii prasiat proti tak respiračnej, ako aj reprodukčnej forme ochorenia.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález je všeobecne zameraný na živé vírusové vakcíny s nízkou patogenitou na podanie prasatám kvôli vytvoreniu účinnej imunity prasiat proti infekcii vírusom respiračného a reprodukčného syndrómu prasiat (PRRS). Presnejšie sa vynález týka takýchto živých vakcín, spolu so spôsobmi imunizácie prasiat proti PRRS vírusu a spôsobov prípravy takýchto vakcín. Nový, skutočne izolovaný a purifikovaný PRRS vírus s nízkou patogenitou, ATCC prírastkové č. VR2509, tiež tvorí časť vynálezu.

Doterajší stav techniky

PRRS sa objavil v posledných niekoľkých rokoch ako významné vírusové ochorenie prasiat. PRRS spôsobuje vážnu poruchu reprodukcie brezivých svíň, ktorá sa prejavuje vo forme predčasného pôrodu, zvýšeným počtom mŕtvo narodených, mumifikovaných a prasiatok s nízkou pôrodnou hmotnosťou, zníženým stupňom pôrodnosti a spomaleným návratom k estru. Akútne reprodukčné príznaky PRRS trvajú asi 2 - 4 mesiace na postihnutých farmách, ale respiračné problémy spôsobené ochorením môžu pretrvávať mnoho rokov, čo spôsobuje signifikantnú stratu produkcie. Bolo publikovaných niekoľko štúdií patogenézy PRRS vírusovej infekcie v poslednej časti (75. - 95. deň gestácie) brezivých svíň/mladých prasníc. V každej štúdii bola demonštrovaná schopnosť PRRS vírusu spôsobovať transplacentámu infekciu a fetálnu patogenitu. Ale fetálna patogenita nebola pravidlom pri sviniach v strednej časti gestácie, a plody v strednej časti gestácie infikované in utero zostávali väčšinou normálne.

V poľných podmienkach existujú niektoré farmy, ktoré nemajú ani akútne reprodukčné problémy, ani chronické respiračné formy ochorenia, ale sú sérologicky pozitívne na PRRS. Príčina chýbania klinických príznakov ochorenia v takých prípadoch nie je dobre známa. Bolo naznačené, že môžu existovať kmene PRRS vírusu s nízkou patogenitou a že sú zodpovedné za infekciu populácie prasiat, ktoré nemajú klinické príznaky PRRS. Rôzni výskumníci opísali mnoho izolátov PRRS vírusu. Ukázalo sa, že všetky obsahujú RNA a lipidy obsahujúce obaly, ale nemajú hemaglutinínovú schopnosť k erytrocytom rôznych živočíšnych druhov.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález prekonáva načrtnuté problémy a poskytuje zlepšenú živú alebo modifikovanú živú PRRS vakcínu na podanie prasatám. Vakcíny podľa predkladaného vynálezu obsahujú dostatočné množstvo živého alebo modifikovaného živého vírusu na navodenie účinnej imunity prasiat proti virulentnému prirodzenému typu PRRS infekcie. Tak, ako sa tu používa, znamená „účinná imunita“ schopnosť vakcíny brániť PRRS infekcii prasiat, ktorá by viedla k významným klinickým príznakom ochorenia. To znamená, že imunizované prasatá môžu alebo nemusia byť sérologicky pozitívne na PRRS, ale nemajú žiadne klinické príznaky.

V preferovaných formách obsahujú vakcíny podľa predkladaného vynálezu nový živý vírus označený MN-Hs, ktorý bol uložený v Američan Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, 26.7.1995, a bol označený ATCC prírastkovým číslom VR2509. Pri tomto víruse bolo ukázané, že je v podstate a virulentný a že navodzuje účinnú imunitu. Jeho vakcíny môžu byť podané chovným samiciam, mladým prasniciam, kancom alebo odstaveným prasiatkam, a také podanie môže byť uskutočnené akýmikoľvek bežnými prostriedkami, ako je intramuskuláma injekcia alebo orálno-nazálne podanie. Všeobecne obsahujú dávky vakcíny od asi 10⁴ do asi 10⁸jednotiek vírusu formujúcich plaky.

Všeobecnejšie sa vynález tiež týka spôsobu prípravy PRRS vakcín pre prasatá, ktorý zahrnuje najprv získanie kmeňa alebo izolátu PRRS vírusu, ktorý má priemerný priemer plaku menší než asi 2 mm, plakovými klonovacími metódami v konfluentnej vrstve MARC-145 buniek, a prípravu živej vakcíny z takého kmeňa. MARC-145 bunková línia bola uložená v ATCC a bola označená prírastkovým číslom ATCC CRL 12219. Výhodne sa vakcíny podľa predkladaného vynálezu skladajú v podstate z takéhoto vírusu s malým priemerom plaku, ktorý je získaný v podstate v čistej forme. Preferovaný vírus ATCC prírastkové č. VR2509 má taký malý priemer plaku a ako bolo ukázané, je v podstate úplne avirulentný, a pritom navodzuje imunitu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 je fotografia ilustrujúca morfológiu a veľkosť plaku izolátu PRRS vírusu MNHs (< 2 mm) na MARC-145 bunkovej línii.

Obrázok 2 je fotografia ilustrujúca morfológiu a veľkosť plaku izolátu PRRS vírusu MN-H_L (3-5 mm) na MARC-145 bunkovej línii.

Obrázok 3 je fotografia ilustrujúca morfológiu a veľkosť plaku izolátu PRRS vírusu MN-W (2-3 mm) na MARC-145 bunkovej línii.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady uvádzajú preferované techniky izolácie, identifikácie a klonovania kmeňa PRRS vírusu s nízkou patogenitou, rovnako ako preferované techniky produkcie vakcín z neho vyrobených; malo by byť jasné, že táto informácia je poskytnutá iba ako ilustrácia a nie ako obmedzenie celkového rozsahu vynálezu. Uvedené odkazy sú zahrnuté tu uvedeným odkazom.

Príklad 1 Súhrn

V tomto príklade bola skúmaná patogenéza variantu s malými plakmi (MN-Hs) vírusu reprodukčného a respiračného syndrómu prasiat pri brezivých sviniach. MN-Hs kmeň bol najprv klonovaný z MN-H vírusu, ktorý bol zmesou vírusov s malými a s veľkými (MN-H) plakmi. V prvom pokuse na porovnanie fetálnej patogenity boli 2 brezivé svine, každá v 86. deň gestácie, inokulované intranazálne MN-Hs, MN-H_L, poľným izolátom (MN-W) a bunkovým kultivačným médiom (kontrolou), v príslušnom poradí. Všetkým sviniam bolo umožnené porodiť v ich termínoch okrem kontrolných sviň. Infikované svine boli viremické v deň 7 po inokulácii (PI) a sérokonvertovali v deň 14 PI podľa testu s nepriamou fluorescenčnou protilátkou (IFA). Dve svine infikované MN-Hs vírusom porodili 14 živých a 5 mŕtvych prasiatok, zatiaľ čo 2 svine infikované MN-H_l vírusom porodili 0 živých a 25 mŕtvych prasiatok. Dve svine inokulované MN-W porodili 10 živých a 20 mŕtvych prasiatok. Dve kontrolné svine mali 16 normálnych plodov pri zabití v deň 107 gestácie. Vírus bol izolovaný od 16 (66,7 %) z 24 mŕtvo narodených, 9 (64,3 %) zo mŕtvo narodených a 3 (12,0 %) z 25 mumifikovaných prasiatok od 6 infikovaných sviň. 6 z 13 sér od mŕtvo narodených prasiatok od 4 MN-H_L alebo MN-W infikovaných svíň malo titre protilátky proti PRRS vírusu v rozmedzí od 1 : 16 do 1 : 1,024 podľa IFA metódy. V ďalšom pokuse na opakovanie výsledkov s MN-Hs vírusom boli 2 brezivé svine, každá v deň 86 gestácie, inokulované intranazálnc MN-Hs, intramuskuláme MN-Hs, resp. intranazálne iným poľným izolátom (OVL-173), a bolo im umožnené porodiť v termíne. Dve svine infikované intranazálne a intramuskuláme MN-Hs vírusom porodili 15 živých a 6 mŕtvych prasiatok, resp. 25 živých a 5 mŕtvych prasiatok, zatiaľ čo 2 svine infikované OVL-173 porodili 6 živých a 24 mŕtvych prasiatok. Tieto výsledky naznačujú, že patogenita PRRS vírusu pre plody svíň sa líši medzi izolátmi vírusu, a MN-Hs kmeň PRRS vírusu je málo patogénny vírus. Zistilo sa, že detekcia PRRS vírusových protilátok v sére mŕtvo narodených prasiatok je užitočnou metódou pre diagnostiku fctálnej infekcie.

Materiály a metódy

Vírus a bunková kultúra. V tejto štúdii boli použité tri rôzne izoláty PRRS vírusu. Izolát MN-H bol odvodený od séra zdravých odchovných prasiat na farme so subklinickými príznakmi PRRS. MN-H vírus bol najprv zmesou vírusových populácií s rôznou veľkosťou plakov. Vírusy s malými (MN-Hs) a veľkými (MN-H_L) plakmi boli separátne klonované z MN-H vírusu a každý vírus bol plakovo purifikovaný štyrikrát pre prvý pokus a ešte šesťkrát pre ďalší pokus s použitím metódy klonovania plakov podľa Him et al., Am. J. Vet. Res:, 52: 1649 - 1652 (1991). V každej takej plakovej pasáži boli konfluentné MARC-145 (permisívny kloň odvodený od obličkovej bunkovej línie afrických zelených opíc (MA-104)) bunkové monovrstvy kultivované v 60 mm x 15 mm Petriho miskách (bunky boli udržované v Eaglovom minimálnom esenciálnom médiu (MEM) doplnenom 3 % obj. fetálneho teľacieho séra (FCS), 0,15 % obj. uhličitanu sodného a antibiotikami (Kim et al. Árch. Virol. 133: 477 - 483 (1993)) a boli inokulované príslušným vírusom. Kultúry boli inkubované pri 37 °C počas 60 minút, potom bolo inokulum odstránené a kultúry boli jedenkrát premyté MEM. Potom bol 5 ml alikvót kvapalného kultivačného média pridaný do každej z misiek skladajúcich sa z rovnakého objemu 2 x MEM a 1,6 % prevareného Noble agaru (Disco Laboratories) doplneného 50 pg dietylaminoetyl(DEAE)-dextranu/mI. Plame boli ďalej inkubované pri 37 ° C počas 5 dní v CO₂ inkubátore. Na konci inkubácie boli plakové kultúry vizualizované pridaním 3 ml PBS doplneného 1 % obj. neutrálnej červene. Selektované plaky boli klonované zoškrabnutím sterilnou Pasteurovou pipetou a boli pasážované inokuláciou na neinfikované MARC-145 bunkové monovrstvy. Na permanentné farbenie bol agar starostlivo odstránený a bunková monovrstva bola farbená s 2 ml 1 % (obj.) kryštalickej fialovej farby v 20 % (obj.) etanole počas 10 minút. Platne boli potom opláchnuté vodou kvôli uľahčeniu vyšetrenia plakov.

PRRS vírus MN-W bol izolovaný zo séra chovaných svíň z farmy s typickými príznakmi PRRS a OVL-173 bol získaný z Oxford Veterinary Laboratories, Worthington, MN.

Zvieratá a vývoj pokusu. Brezivé svine okolo dňa 80 gestácie boli zakúpené od farmy, ktorá nemala v minulosti žiadne známky infekcie PRRS vírusom. Svine boli na farme vakcínované dvakrát ročne proti parvovírusu prasiat (PPV) a Leptospira spp. Boli získané presné chovné dáta o každej svini. Po zakúpení bola každá sviňa umiestnená od delene v izolovanej miestnosti v University of Minnesota. V deň 86 gestácie boli dve svine inokulované intranazálne MN-Hs, resp. MN-H_L, resp. MN-W vírusom (2 ml, ÍO^50-5,5TCID₅₀/ml). Zostávajúce dve svine boli inokulované bunkovým kultivačným médiom a slúžili ako kontroly. Vzorky séra od každej svine boli odobraté v intervaloch na izoláciu vírusu a sérológiu. Šiestim infikovaným sviniam bol umožnený prirodzený pôrod a dve kontrolné svine boli usmrtené v deň 107 gestácie kvôli vyšetreniu plodov. Pri pôrode boli od živých a mŕtvo narodených prasiatok odobraté vzorky krvi a pľúc a od mumifikovaných plodov bola odobratá hrudná tekutina na izoláciu vírusu a na sérológiu. V druhom pokuse bol MN-Hs vírus plakovo purifikovaný ešte šesťkrát pred inokuláciou. Dve brezivé svine každá v deň 86 gestácie, boli inokulované intranazálne MN-Hs, intramuskulárne MN-Hs a intranazálne iným poľným izolátom (OVL-173) a všetkým sviniam bol umožnený pôrod v termíne. Pri pôrode boli merané dĺžky temeno - zadok mumifikovaných alebo mítvo narodených plodov na hodnotenie času úmrtia (Marrable et al, J. Agric. Sci, 69: 443 - 447 (1967)). Boli odobraté vzorky krvi a pľúc a boli analyzované, ako je opísané v prvom pokuse.

Izolácia vírusu a sérológia. Na izoláciu vírusu bola každá vzorka séra alebo supematant pľúcneho homogenátu umiestnený na 24-jamkovú platňu a boli pridané MARC-145 bunky (1 - 2 x 10⁵ buniek/ml) suspendované v MEM doplnenom 3 % obj. FCS. Kultúry boli pozorované počas 5 až 7 dní na cytopatický účinok (CPE) typický pre PRRS vírus. Platne boli dvakrát zmrazené a rozmrazené a supematanty boli inokulované do jamiek 96-jamkovej mikroplatne s čerstvou suspenziou MARC-145 buniek a boli inkubované počas 3 až 4 dní. Vírusová infekcia bola vyšetrovaná pozorovaním tak CPE, ako aj špecifickej fluorescencie s použitím PRRS vírusu pozitívneho referenčného séra.

Séra od svíň a prasiat boli testované na protilátky s použitím metódy nepriamej fluorescenčnej protilátky (IFÁ) (Yoon et al, J. Vet. Diag. lnvest, 4: 144 - 147 (1992)). 96-jamkové testovacie platne boli pripravené s použitím MARC-145 bunkovej línie. Niektoré séra boli testované.na protilátky k PPv testom inhibície hemaglutinácie (Hl), ako bolo opísané skôr (Joo et al, Aust. Vet. J, 52: 422 - 424 (1976)).

Výsledky

Izoláty PRRS vírusu ukazovali pri počiatočnej izolácii rôznu veľkosť plakov. MN-H_S izolát bol klonovaný do dvoch rôznych populácií MN-Hs a MN-H_L podľa veľkosti ich plakov. Po klonovaní mali plaky MN-Hs a MN-H_L, priemer < 2 mm, resp. 3 až 5 mm, zatiaľ čo veľkosť plakov pre MN-W bola 2 až 3 mm (pozri obrázky).

Pri sviniach po infekcii izolátmi PRRS vírusu neboli pozorované žiadne významné klinické príznaky okrem miernej anorexie detegovanej pri sviniach 112 a 153 5 dní po inokulácii (PI). Vírus bol izolovaný zo vzoriek séra od šiestich zo šesť svíň sedem dní PI a od jednej zo šiestich svíň 14 dní PI. Vysoké titre protilátok boli detegované pri všetkých inokulovaných sviniach 14 dní PI, ako je ukázané v tabuľke 1.

Tabuľka 1: Virémia a protilátková odpoveď pri 86 dní brezivých sviniach po pokusnej infekcii izolátmi PRRS vírusu

Dni po inokulácii

sviňa Infikovaný č. vírus 0 7 14 21 28

17 MN-Hs -/-' </- -/1.024 -/1,024 -/256 53 MN-Hs -/- +/- -/1.024 -/1,024 -/1,024

Tabuľka 2: Výsledky pôrodov a izolácia vírusu od svíň v dni gestácie infikovaných rôznymi izolátmi PRRS vírusu

	Svine		Tlody
SvÄač	Dni*	Víru s/apfi sob	Celkom	LB	SB	M	Cr rozsah dĺžky⁸	Izolácia víru-
			Experiment l
17	115	MN-Hj/IN	9	6	0	3	27-32	6/9
53	113	MN-Hs/TN	10	8	1	1	25-38	6/10

t$3	114	MN-Hl/IN	13	0	2	11	24-32	2/11
14?	112	MN-Hl/IN	12	0	4	8	18-30	3/7

M	112	MN-W/1N	15	8	3	4	25-28	5/15
112	118	MN-W/TN	15	2	4	9	24-31	6/11

124	lOT*	kontrola	14	14			ND	0/14
95	107*	komrola	12	12			ND	0/12

			Experiment II
155	lis	MN-Hí/IN	11	7	3	1	28-35	8/11
49	114	MN-Hs/IN	10	8	2	0	34-37	9/10

176	112	MN-HsfiM	15	12	2	1	15-36	3/15
110	113	MN-Hs/IM	15	13	2	0	32-34	2/15

800	108	OVL-I73/IN	12	1	9	2	27-28	1/12
44	108	OVUI73/TN	18	5	10	3	26-29	10/18

^a deň gestácie pri pôrode alebo zabití ^b dĺžka temeno - zadok (cm) mumifikovaných alebo mŕtvo narodených plodov ^c počet vzoriek s izolovaným vírusom/počet testovaných vzoriek ^d svine boli usmrtené v deň 107 gestácie kvôli vyšetreniu plodov

LD = živo narodené, SB = mŕtvo narodené, M = mumifikované, IN= intranazálne, IM = intramuskulárne, ND = neurčené.

Vírus bol izolovaný od jedného alebo od viac plodov z každého vrhu infikovaných svíň. Výsledky izolácie vírusu od jednotlivých prasiat zo šiestich infikovaných svíň v pokuse 1 ukazujú, že približne polovica vyšetrených plodov (28 zo 63 prasiat) bola pozitívna na izoláciu vírusu. Medzi prasatami testovanými na prítomnosť vírusu bolo 16 (66,7 %) z 24 živo narodených prasiat, 9 (64,3 %) zo 14 mŕtvo narodených prasiat a 3 (12,0 %) z 25 mumifikovaných prasiat pozitívnych na vírus. Z 28 prasiat pozitívnych na vírus vo vzorke séra bolo 10 prasiat negatívnych na vírus vo vzorkách pľúc testovaných na izoláciu vírusu.

Séra od mŕtvo narodených prasiat od svíň 153, 147, 68 a 112 boli testované na protilátky proti PRRS vírusu IFA a na PPV H_l a výsledky sú ukázané v tabuľke 3. Šesť z 13 sér od mŕtvo narodených prasiat a 2 z 25 hrudných tekutín od mumifikovaných prasiat malo protilátky proti PRRS vírusu. IFA titre boli v rozsahu od 1 : 16 - 1 : 1,024, zatiaľ čo žiadne sérum nemalo protilátky k PPV. Trinásť zo 14 živo narodených prasiat od svíň 17 a 53 malo protilátky ako k PRRS vírusu (IFA titre 1 : 64 - 1 : 1,024) , tak aj PPV (H_Ltitre 1:512- 1: 16384).

Tabuľka 3: Detekcia protilátok proti PRRS vírusu a PPV v sére mŕtvo narodených prasiat od svíň infikovaných PRRS vírusom.

Sviňa č	Infikovaný	Anamnéza vrhu	Teeované plody	PRRSV IFA	PPV Hj.
153	MN-Hl	OLB. 2SB. 11 M	SB (32)’ SB (27)	2S6	< 8‘ <8
147	MN-Hl	0 LB. 4 SB. 1 M	SB (30) SB (30) SB (29) SB(28)	<4 1.024 <4	< 8 < 8 < 8
68	MN-W	8LB, 3SB. 4 M	SB(27) SB(25) SB (28)	<4	< 8 <8 < 8
112	MN-W	2 LB, 4 SB, 9 M	SB(31) SB (29) SB (26) SB(24)	<4 256 256 16	<8 <8 <8 NT

^a dĺžka temeno - zadok (cm) ^b reciprocity IFA alebo H_L titra ^c LB - živo narodené; SB - mŕtvo narodené; M - mumifikácia

Diskusia

Predkladaná štúdia potvrdila schopnosť rôznych izolátov PRRS vírusov spôsobovať transplacentámu infekciu a patogénne účinky na plody svíň v neskorej fáze gestácie. Ale bol tu závažný rozdiel v patogenite medzi izolátmi PRRS vírusu. Keď boli svine, ktoré rodili už viackrát, inokulované transnazálne PRRS vírusom ATCC-VR 2332 v deň 93 gestácie (Christianson, W. T. et al., Can. J. Vet. Res., 57: 262 - 268 (1993)), potom porodili priemerne 5,8 živých prasiatok a 6 mŕtvych plodov na vrh. V predkladanej štúdii 6 svíň, ktoré boli infikované MH-H_L alebo 2 poľnými vírusmi, porodilo 2,7 živých a 11,5 mŕtvych prasiatok na vrh, a preto sú tieto vírusy považované za vysoko virulentné. Patogenita medzi ATCC-VR 2332 a virulentnými vírusmi použitými v tejto štúdii bola odlišná. Toto môže byť spôsobené trvaním gestácie v čase infekcie, pretože ATCC VR-2332 bol infikovaný o sedem dní neskôr. 6 svíň infikovaných MN-Hs porodilo priemerne 9,0 živých a 2,7 mŕtvych prasiatok na vrh. Tieto výsledky sú zreteľne odlišné od výsledkov získaných pre virulentný vírus čo naznačuje, že MN-Hs vírus je mierne patogénny kmeň.

Je zaujímavé, že vážne rozdiely boli pozorované v pôrodoch od svíň infikovaných MN-Hs a MN-H_L vírusmi, ktoré boli rovnakého pôvodu. Za rovnakých podmienok spôsobil vírus MN-Hs, resp. MN-H_L 5, resp. 25 mŕtvo narodených prasiatok (p < 0,005). Podľa prezentovaných výsledkov možno usúdiť, že patogenita MN-Hs a MN-H_L je signifikantne odlišná, keď jeden je slabo a druhý vysoko patogénny vírus.

Izolácia vírusu z vrhov infikovaných PRRS vírusom bola relatívne ľahká a vírus bol izolovaný v podobnom pomere od živých a mŕtvych prasiatok. Pretože vírus nemohol byť získaný od všetkých prasiatok v infikovanom vrhu, mala by byť izolácia vírusu na diagnostické účely uskutočnená od aspoň 2 alebo viac prasiatok na vrh. Ďalej bolo zistené, že izolácia vírusu sa lepšie vykonáva zo séra než zo vzoriek pľúcneho tkaniva.

Vo vrhoch od sviň infikovaných virulentným vírusom malo jedno alebo viac mŕtvo narodených prasiatok detegovateľné protilátky špecifické pre PRRS vírus. Tieto výsledky naznačujú, že detekcia protilátok od mŕtvo narodených prasiatok alebo prasiatok pred dojčením môže byť užitočnou metódou pre diagnostiku PRRS infekcie v abnormálnych vrhoch. Táto metóda bude výhodná v laboratóriách, v ktorých nie sú prostriedky a techniky na izoláciu vírusu dostupné. V predkladanej štúdii 6 z 13 mŕtvo narodených prasiatok malo pozitívne titre protilátok proti PRRS vírusu, ale nie proti PPV, čo potvrdzuje, že detegované protilátky sú fetálneho pôvodu a že sú spôsobené PRRS vírusom.

Nie je známe, prečo sa v niektorých stádach infikovaných PRRS vírusom nevyvinú klinické príznaky. Bolo ukázané, že stáda s dobrým zdravotným stavom pred infekciou PRRS majú miernejšiu klinickú odpoveď v porovnaní s tými, ktoré majú horší zdravotný stav. Panujúci zdravotný stav, spolu s rozdielmi v kmeňoch demonštrovanými v tejto štúdii, sú možným vysvetlením jasných rozdielov v klinickej prezentácii. Okrem toho je možné predpokladať, že u hostiteľa sa môžu vyskytovať interakcie medzi vírusmi s malými a veľkými plakmi a že môžu modifikovať patogenitu. Tak to môže byť, pokiaľ berieme do úvahy, že tu nemáme reprodukčné problémy na farme, kde bol izolovaný

SK 281024 Β6

MN-H izolát vírusu, aj keď bol vysoko patogénny PRRS vírusu MN-H_l na farme prítomný.

Príklad 2

Preferované vakcíny podľa predkladaného vynálezu môžu byť podané chovným mladým prasniciam, sviniam, kancom alebo odstaveným prasiatkam. Podanie môže byť intramuskuláme alebo orálno-nazálnc a môže byť podané v akýkoľvek čas. Ale pre chovné samice sú vakcinácie preferované pred kopuláciou, aby sa dosiahla ochrana počas celého času brezivosti a pre prasiatka tesne pred odstavením kvôli ochrane počas neskoršieho odchovu a chovu až do finálneho štádia.

Všeobecne sú vakcíny podľa vynálezu podané v 2 ml dávkach, ktoré obsahujú od asi 10⁴ do 10⁸ plaky formujúcich jednotiek (PFU) a výhodnejšie okolo 10⁶ PFU. Imunita bude v prípade chovných samíc pretrvávať aspoň počas jednej doby brezivosti, zatiaľ čo vakcinácia po odstavení prasiatok bude sprostredkovávať imunitu až do zabitia. Preferované vakcíny podľa predkladaného vynálezu môžu poskytovať široký rozsah skríženej ochrany.

Vakcíny podľa predkladaného vynálezu môžu indukovať živé alebo modifikované živé (atenuované) vírusy, rovnako ako konvenčné nosiče, stabilizátory a/alebo adjuvans.

Príklad 3 Úvod

V tomto príklade bola vyšetrovaná schopnosť vakcíny zloženej z MN-Hs kmeňa severoamerického PRRSV chrániť 3-týždňové prasiatka pred virémiou spôsobenou infekciou virulentným kmeňom MN-H_L severoamerického PRRSV. Respiračné ochorenie súvisiace s infekciou severoamerickým PRRSV je primárne spôsobené infekciou sekundárnymi patogénmi prítomnými na prasačích farmách. Ale v pokusných podmienkach, respiračné klinické príznaky pri prasatách infikovaných severoamerickým PRRSV nie sú konzistentne reprodukované vzhľadom na absenciu týchto sekundárnych patogénov. Preto je detekcia virémie najlepším ukazovateľom infekcie severoamerickým PRRSV. Absencia virémie po infekcii MN-H_L kmeňom ukazuje, že prasiatka vakcinované MN-Hs kmeňom sú imúnne proti infekcii MN-H_l kmeňom.

Materiál a metódy

Dvadsať 3-týždňových prasiatok bolo zakúpených od farmy bez PRRS infekcie. Dvanásť z týchto prasiatok bolo vakcínovaných intranazálne MN-Hs kmeňom (2 ml, 10^4-5TCID50/ml) a zvyšných 8 prasiatok slúžilo na kontrolu. Vakcinované a kontrolné prasiatka boli umiestnené v oddelených miestnostiach izolačnej jednotky. Šesť vakcínovaných prasiatok (prasiatka č. 81-86) a 4 kontrolné prasiatka (prasiatka č. 93 - 96) bolo infikovaných intranazálne MN-HL kmeňom (2 ml, 10⁴’⁵ TCID50/ml) 2 týždne po vakcinácii (skupina 1). Zostávajúcich 6 vakcínovaných prasiatok (prasiatka č. 87 - 92) a 4 kontrolné prasiatka (prasiatka č. 97 - 100) boli infikované rovnako 6 týždňov po vakcinácii (skupina 2). Pri všetkých prasiatkach boli denne pozorované klinické príznaky. Okrem toho, jeden raz týždenne boli odoberané vzorky krvi od každého prasiatka na (1) izoláciu vírusu s použitím MARC-145 bunkovej kultúry (Yoon et al., J. Vet. Diag. Invest, 6: 289 - 292 (1994)) a (2) na určenie titrov sérových neutralizačných (SN) protilátok (Park et al., Am. J. Vet. Res., 57: 320 - 323 (1996)); detekcia SN protilátok pri vakcínovaných prasiatkach ukazovala protektívnu imunitu proti virulentnému severoamerickému PRRSV.

Výsledky

Po vakcinácii bol vakcinačný vírus izolovaný od prasiatok v skupine 1 a 2 viac ako 3 týždne po vakcinácii. Po infekcii neboli klinické príznaky pozorované pri žiadnom z kontrolných a vakcínovaných prasiatok v skupine 1 a 2.

Skupina 1. SN protilátka nebola detegovaná pri žiadnom prasiatku v čase infekcie. Po infekcii bol infekčný vírus získaný tak od vakcínovaných, ako aj od kontrolných prasiatok. Ďalej, ako pri vakcínovaných, tak aj pri kontrolných prasiatkach sa vyvinula virémia (tabuľka 1).

Skupina 2. Vakcinované prasiatka produkovali SN protilátky počnúc od 3 týždňov po vakcinácii, a titre boli medzi 1 : 2 a 1 : 8 v čase infekcie. Po infekcii nebol od vakcínovaných prasiatok infekčný vírus izolovaný, zatiaľ čo pri kontrolných prasiatkach sa vyvinula virémia (tabuľka 4). Tieto výsledky ukazujú, že vakcinované prasiatka majú získanú ochrannú imunitu proti virulentnému severoamerickému PRRSV.

Tabuľka 4. Detekcia virémie a SN protilátky pri 3-týždňových prasiatkach vakcínovaných a infikovaných 2 alebo 6 týždňov po vakcinácii

Prasa č.				Týždeň po vakcinácii
	0		2-			S		7	8
Skupina
8IV	-/ >		-/-	-/-	-/2
82V		./.		+ /-	+ /-
83V		-/	+ /-	+ /-	+ /2
84V	-/·	-/-	-/-	-/-	+/-
85V		-/-	+/-	+ /-	Ή4
86V	-!	-/-	+/-	+ /-	-Z4
93C	I·		-/-	+ /-	+ /-
94C	·!·	·/·		+ /-	+ /8
95C		1·		+ /-	+ /4
96C		-/-	./.	+ /-	*/·
Skupina 2
87V	-/·	·/-	-Z-	♦ /*		-/2	-12	./8	-/8 <
88V	-/-	-t-	+ /-		-/-	-/4	-/4	-/64	• /128
89V	-/·	/·	+/	-/-	-Z2	-/8	-/8	-/8	-/32
90V	-/-	-/-	+/-	+ /-	-/4	-Z8	-/8	-/128	-/64
9IV	-/-	-/-	+/	-/2	-/2	-/8	14	•/32	-/64
92V	-/-			-/-	/4	-/2	• 14	-/4	-/128
97C	-/-	./.	-/.		-/-	-/-	-t-	+ /-	+ /-
98C		-/-	-/.	-/-	-Z-	-/-	/·	+ /-	+ /-
99C			-1-	-/-	-/.			*/-	*/-
100C	-/-		-t-	-/-	-Z-	-/-		+ /-	-/2

V = vakcinované; C = kontrola ^a = infikované MN-H_L vírusom ^b = izolácia vírusu/titre SN protilátok

Prasiatka v skupine 1, resp. 2 boli usmrtené 4, resp. 8 týždňov po vakcinácii.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Vakcína proti respiračnému a reprodukčnému syndrómu prasiat (PRRS) zahrnujúca vírus majúci označenie ATCC VR2509.
2. Vakcína podľa nároku 1, kde vírus je živý.
3. Vakcína podľa nároku 1, kde dávka vakcíny obsahuje od 10⁴ do 10⁸ PFU (plak tvoriacich jednotiek).
4. Vakcína zahrnujúca kmeň severoamerického vírusu PRRS, ktorý tvorí plaky majúce priemerný priemer menší než 2 mm, pokiaľ sú plaky získané spôsobom zahrnujúcim kroky:

a) inokulácia alikvotu buniek s kmeňom, kde bunky majú označenie CRL 12219, kde alikvot je získaný z konfluentnej monovrstvy buniek kultivovaných v Eaglovom minimálnom esenciálnom médiu doplnenom 3 % obj. fetálneho teľacieho séra a 0,15 % obj. uhličitanu sodného, pričom alikvot obsahuje 1 až 2 x 10⁵ buniek na ml Eaglovho minimálneho esenciálneho média doplneného 3 % obj. fetálneho teľacieho séra a 0,15 % obj. uhličitanu sodného;

b) inkubácia alikvotu pri 37 °C počas 60 minút;

c) odstránenie inokula z alikvotu;

d) premytie alikvotu Eaglovým minimálnym esenciálnym médiom;

e) resuspendovanie alikvotu v 5 ml 2x Eaglovho minimálneho esenciálneho média a 1,6 % prevareného Noble agaru doplneného 250 gg dietylaminoetyl(DEAE)-dextránu;

f) nanášanie alikvotu na platne; a

g) ďalšie inkubovanie alikvotu pri 37 °C počas 5 dní v CO₂inkubátore za vzniku plakov.
5. Vakcína podľa nároku 4, kde vakcína obsahuje živý kmeň severoamerického vírusu PRRS.
6. Vakcína podľa nároku 4, kde kmeň má označenie ATCC VR2509.
7. Spôsob prípravy vakcíny, vyznačujúci sa t ý m , že zahrnuje kroky:

A. získanie kmeňa severoamerického vírusu PRRS klonovaním izolátov získaných z plaku; a

B. prípravu vakcíny z kmeňa získaného v kroku A., ktorý tvorí plaky majúce priemerný priemer menší než 2 mm, pokiaľ sú plaky získané spôsobom zahrnujúcim kroky:

a) inokulácia alikvotného množstva buniek s kmeňom, kde bunky majú označenie CRL 12219, kde alikvotná časť je získaná z konfluentnej monovrstvy buniek kultivovaných v Eaglovom minimálnom esenciálnom médiu doplnenom 3 obj. fetálneho teľacieho séra a 0,15 % obj. uhličitanu sodného, pričom alikvot obsahuje 1 až 2 x 10⁵ buniek na ml Eaglovho minimálneho esenciálneho média doplneného 3 % obj. fetálneho teľacieho séra a 0,15 % obj. uhličitanu sodného;

b) inkubácia alikvotu pri 37 °C počas 60 minút;

c) odstránenie inokula z alikvotu;

d) premytie alikvotu Eaglovým minimálnym esenciálnym médiom;

e) resuspendovanie alikvotu v 5 ml 2x Eaglovho minimálneho esenciálneho média a 1,6 % prevareného Noble agaru doplneného 250 gg dietylaminoetyl(DEAE)-dextránu;

ľ) nanášanie alikvotu na platne; a

g) ďalšie inkubovanie alikvotu pri 37 “C počas 5 dní v CO₂inkubátore za vzniku plakov.
8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m , že vakcína zahrnuje živý kmeň severoamerického vírusu PRRS.
9. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m , že spôsob prípravy vakcíny zahrnuje krok získania kmeňa v purifikovanej forme.
10. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m , že kmeň má označenie ATCC VR2509.
11. Izolovaný a purifikovaný kmeň severoamerického vírusu PRRS, ktorý tvorí plaky majúce priemerný priemer menší než 2 mm, pokiaľ sú plaky získané spôsobom zahrnujúcim kroky:

a) inokulácia alikvotu buniek s kmeňom, kde bunky majú označenie CRL 12219, kde alikvot je získaný z konfluentnej monovrstvy buniek kultivovaných v Eaglovom minimálnom esenciálnom médiu doplnenom 3 % obj. fetálneho teľacieho séra a 0,15 % obj. uhličitanu sodného, pričom alikvot obsahuje 1 až 2 x 10⁵ buniek na ml Eaglovho minimálneho esenciálneho média doplneného 3 % obj. fetálneho teľacieho séra a 0,15 % obj. uhličitanu sodného;

b) inkubácia alikvotu pri 37 °C počas 60 minút;

c) odstránenie inokula z alikvotu;

d) premytie alikvotu Eaglovým minimálnym esenciálnym médiom;

e) resuspendovanie alikvotu v 5 ml 2x Eaglovho minimálneho esenciálneho média a 1,6 % prevareného Noble agaru doplneného 250 gg dietylaminoetyl(DEAE)-dextránu;

f) nanášanie alikvotu na platne; a

g) ďalšie inkubovanie alikvotu pri 37 °C počas 5 dní v CO₂inkubátore za vzniku plakov.
12. Izolovaný a purifikovaný kmeň severoamerického vírusu PRRS podľa nároku 11, uložený pod označením ATCC VR 2509.