CZ412797A3

CZ412797A3 - Vakciny živého viru PRRS s nízkou patogenitou a způsoby jejich přípravy

Info

Publication number: CZ412797A3
Application number: CZ974127A
Authority: CZ
Inventors: Han Soo Joo
Original assignee: Regents Of The University Of Minnesota
Priority date: 1995-06-21
Filing date: 1996-06-19
Publication date: 1998-05-13
Also published as: HK1016870A1; SK165797A3; EP0833661B1; US5690940A; EP0833661A1; MX9710149A; BR9608648A; KR19990022848A; AU703084B2; JP3954101B2; JP4709094B2; DE69620402D1; CA2225388A1; CZ291611B6; JP2006306894A; RU2192887C2; AU6336196A; DE69620402T2; CN1188417A; CA2225388C

Description

Vakciny živého viru PRRS s nízkou patogenitou a způsoby jejich přípravy

Oblast techniky

Předkládaný vynález je obecně zaměřen na živé virové vakciny s nízkou patogenitou pro podání prasatům pro navození účinné imunity u prasat proti infekci virem respiračního a reprodukčního syndromu prasat (PRRS). Přesněji, vynález se týká takových živých vakcin, spolu se způsoby imunizace prasat proti PRRS viru a metod pro přípravu takových vakcin. Nový, významně izolovaný a purifikovaný PRRS virus s nízkou patogenitou, ATCC přírůstkové č. VR2509, také tvoří část vynálezu.

Dosavadní stav techniky

PRRS se objevil v posledních několika letech jako významné virové onemocnění prasat. PRRS způsobuje vážnou poruchu reprodukce u březích sviní, která se projevuje ve formě předčasného porodu, zvýšeným počtem mrtvě narozených, mumifikovaných a selat s nízkou porodní hmotností, sníženým stupněm porodnosti a zpomaleným návratem k estru. Akutní reprodukční příznaky PRRS trvají asi 2-4 měsíce na postižených farmách, ale respirační problémy způsobené onemocněním mohou přetrvávat mnoho let, což způsobuje signifikantní ztrátu produkce. Bylo popsáno několik studií patogenese PRRS virové infekce v poslední části (75 - 95 den gestace) březích sviní/mladých prasnic. V každé studii byla demonstrována schopnost PRRS viru způsobovat transplacentární infekci a fetální patogenita. Nicméně, fetální patogenita nebyla pravidlem u sviní ve střední části gestace, a plody ve střední

části gestace infikované in utero zůstávaly většinou normální.

V polních podmínkách existují některé farmy, které nevykazují ani akutní reprodukční problémy, ani chronické respirační formy onemocnění, ale jsou serologicky pozitivní na PRRS. Příčina pro chybění klinických příznaků onemocnění v takových případech není dobře známa. Bylo naznačeno, že mohou existovat kmeny PRRS viru s nízkou patogenitou a že jsou odpovědné za infekci populace prasat, které nevykazují klinické příznaky PRRS. Různí výzkumníci popsali mnoho izolátů PRRS viru. U všech se ukázalo, že obsahují RNA a lipidy obsahující obaly, ale nemají hemaglutininovou schopnost k erytrocytům různých živočišných druhů.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález překonává problémy nastíněné výše a poskytuje zlepšenou živou nebo modifikovanou živou PRRS vakcinu pro podání prasatům. Vakciny podle předkládaného vynálezu obsahují dostatečné množství živého nebo modifikovaného živého viru pro navození účinné imunity u prasat proti virulentnímu přirozenému typu PRRS infekce. Jak se zde používá, znamená účinná imunita schopnost vakciny bránit PRRS infekci prasat, která by vedla k významným klinickým příznakům onemocnění. To znamená, že imunizovaná prasat mohou nebo nemusí být serologicky pozitivní na PRRS, ale nevykazují žádné klinické příznaky.

V preferovaných formách obsahují vakciny podle předkládaného vynálezu nový živý virus označený MN-Hs, který byl uložen v Američan Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, 26.7.1995, a byl označen ATCC přírůstkovým

Λ

číslem VR2509. u tohoto viru bylo ukázáno, že je v podstatě avirulentní a že navozuje účinnou imunitu. Jeho vakciny mohou být podány chovným samicím, mladým prasnicím, kancům nebo odstaveným selatům, a takové podání může být provedeno jakýmikoliv běžnými prostředky jako je intramuskulární injekce nebo orální-nasální podání. Obecně obsahují dávky vakciny od asi 10⁴ do asi 10⁸ plaky formujících jednotek viru.

Obecněji se vynález také týká způsobu přípravy PRRS vakcin pro prasata, který zahrnuje nejprve získání kmen nebo izolát PRRS viru, který má průměrný průměr plaku menší než asi 2 mm, plakovými klonovacími metodami v konfluentní vrstvě MARC-145 buněk, a přípravu živé vakciny z takového kmene. MASR-145 buněčná linie byla uložena v ATCC a byla označena přírůstkovým číslem ATCC_________. Výhodně se vakciny podle předkládaného vynálezu skládají v podstatě z takovéhoto viru s malým průměrem plaku, který je získán ve v podstatě čisté formě. Preferovaný virus ATCC přírůstkové č. VR2509 má takový malý průměr plaku a jak bylo ukázáno, je v postatě úplně avirulentní, a přitom navozuje imunitu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je fotografie ilustrující morfologii a velikost plaku izolátu PRRS viru MN-Hs (< 2 mm) na MARC-145 buněčné linii;

Obrázek 2 je fotografie ilustrující morfologii a velikost plaku izolátu PRRS viru MN-_HL (3-5 mm) na MARC-145 buněčné linii; a

Obrázek 3 je fotografie ilustrující morfologii a velikost plaku izolátu PRRS viru MN-W (2-3 mm) na MARC-145 buněčné linii.

Následující příklady uvádějí preferované techniky pro izolaci, identifikaci a klonování kmene PRRS viru s nízkou patogenitou, stejně jako preferované techniky pro produkci vakcin z něho vyrobených; mělo by být jasné, že tato informace je poskytnuta pouze jako ilustrace a nikoliv jako omezení celkového rozsahu vynálezu. Uvedené odkazy jsou zde uvedeny jako odkazy.

Příklad 1

Souhrn

V tomto příkladu byla zkoumána patogenese varianty s malými plaky (MN-Hs) viru reprodukčního a respiračního syndromu prašanu březích sviní. MN-Hs kmen byl nejprve klonován z MN-H viru, který byl směsí virů s malými a s velkými (MN-H) plaky. V prvním pokusu pro srovnání fetální patogenity byly 2 březí svině každá v den 86 gestace inokulovány intranasálně MN-Hs, MN-H1, polním izolátem (MN-W) a buněčným kultivačním mediem (kontrolou), v příslušném pořadí. Všem sviním bylo umožněno porodit v jejich termínech kromě kontrolních sviní. Infikované svině byly viremické v den 7 po inokulaci (PI) a serokonvertovaly v den 14 PI podle testu s nepřímou fluorescentní protilátkou (IFA). Dvě svině infikované MN-Hs virem porodily 14 živých a 5 mrtvých selat, zatímco 2 svině infikované MN-H1 virem porodily 0 živých a 25 mrtvých selat. Dvě svině inokulované MN-W porodily 10 živých a 20 mrtvých selat. Dvě kontrolní svině měly 16 normálních plodů při porážce v den 107 gestace. Virus byl «··· tH izolován od 16 (66,7 %) ze 24 mrtvě narozených, 9 (64,3 %) ze 14 mrtvě narozených a 3 (12,0%) ze 25 mumifikovaných selat od 6 infikovaných sviní. 6 ze 13 sér od mrtvě narozených selat od 4 MN-H1 nebo MN-W infikovaných sviní mělo titry protilátky proti PRRS viru v rozmezí od 1:16 do 1:1,024 podle IFA metody.

V dalším pokusu pro opakování výsledků s MN-Hs virem byly 2 březí svině každá v den 86 gestace inokulovány intranasálně MN-Hs, intramuskulárně MN-Hs, resp. intranasálně jiným polním izolátem (OVL-173), a bylo jim umožněno porodit v termínu. Dvě svině infikované intranasálně a intramuskulárně MN-Hs virem porodily 15 živých a 6 mrtvých selat, resp. 25 živých a 5 mrtvých selat, zatímco 2 svině infikované OVL-173 porodily 6 živých a 24 mrtvých selat. Tyto výsledky naznačují, že patogenita PRRS viru pro plody sviní se liší mezi izoláty viru, a MN-Hs kmen PRRS viru je málo patogení virus. Detekce PRRS virových protilátek v séru mrtvě narozených selat byla shledána jako užitečná metoda pro diagnostiku fetální infekce.

Materiály a metody

Virus a buněčná kultura - v této studii byly použity tři různé izoláty PRRS viru. Izolát MN-H byl odvozen od séra zdravých odchovných prasat na farmě se subklinickými příznaky PRRS. MN-H virus byl nejprve směsí virových populací s různou velikostí plaků. Viry s malými (MN-Hs) a velkými (MN-H1) plaky byly separátně klonovány z MN-H viru a každý virus byl plakově purifikován čtyřikrát pro první pokus a ještě šestkrát pro pro další pokus za použití metody klonování plaků podle Him et al., Am. J. Vet. Res., 52: 1649 - 1652 (1991). V každé takové plakové pasáži byly konfluentní MARC-145 (permisivní klon odvozený od ledvinné buněčné linie afrických zelených opic (MA-104)) buněčné

monovrstvy kultivovány v 60 mm x 15 mm Petriho miskách (buňky byly udržovány v Eaglově minimálním esenciálním mediu (MEM) doplněném 3 % fetálního telecího séra (FCS), 0,15 % uhličitanu sodného a antibiotiky (Kim et al., Arch. Virol. 133: 477 - 483 (1993)) a byly inokulovány příslušným virem. Kultury byly inkubovány při 37 °C po 60 minut, potom bylo inokulum odstraněno a kultury byly jedenkráte promyty MEM. Potom byl 5 ml alikvot kapalného kultivačního media přidán do každé z misek, skládajících se ze stejného objemu 2xMEM a 1,6% převařeného Noble agaru (Disco Laboratories) doplněného 50 μg diethylaminoethyl (DEAE)-dextranu/ml. Plotny byly dále inkubovány při 37 °C po 5 dní v CO₂ inkubátoru. Na konci inkubace byly plakové kultury vizualizovány přidáním 3 ml PBS doplněného 1 % neutrální červeně. Selektované plaky byly klonovány seškrábnutím sterilní Pasteurovou pipetou a byly pasážovány inokulací na neinfikované MARC-145 buněčné monovrstvy. Pro permanentní barvení byl agar pečlivě odstraněn a buněčná monovrstva byla barvena 2 ml 1% krystalické violeti ve 20% ethanolu po 10 minut. Plotny byly potom opláchnuty vodou pro usnadnění vyšetření plaků.

PRRS virus MN-W byl izolován ze séra nemocných sviní z farmy s typickými příznaky PRRS a OVL-173 byl získán z Oxford Veterinary Laboratories, Worthington, MN.

Zvířata a vývoj pokusu. Březí svině okolo dne 80 gestace byly zakoupeny od farmy, která neměla v minulosti žádné známky infekce PRRS virem. Svině byly na farmě vakcinovány dvakrát ročně proti prasečímu parvoviru (PPV) a Leptospira spp. Byla získána přesná chovná data o každé svini. Po zakoupení byla každá svině umístěna odděleně v izolované místnosti na

University of Minnesota. V den 86 gestace byly dvě svině inokulovány intranasálně MN-Hs, MN-H1, resp.a MN-W virem (2 ml, 10⁵·⁰ ” ^5,5 TCID₅₀/ml). Zbývající dvě svině byly inokulovány buněčným kultivačním mediem a sloužily jako kontroly. Vzorky séra od každé svině byly odebrány v intervalech pro izolaci viru a sérologii. Šesti infikovaným sviním byl umožněn přirozený porod, a dvě kontrolní svině byly poraženy v den 107 gestace pro vyšetření plodů. Při porodu byly od živých a mrtvě narozených selat odebrány vzorky krve a plic a od mumifikovaných plodů byla odebrána hrudní tekutina pro izolaci viru a pro sérologii. Ve druhém pokusu byl MN-Hs virus plakově purifikován ještě šestkrát před inokulací. Dvě březí svině každá v den 86 gestace byly inokulovány intranasálně MN-Hs, intramuskulárně MN-Hs a intranasálně jiným polním izolátem (OVL-173) a všem sviním byl umožněn porod v termínu. Při porodu byly měřeny délky temeno

- zadek mumifikovaných nebo mrtvě narozených plodů pro hodnocení doby úmrtí (Marrable et al., J. Agric. Sci., 69: 443 - 447 (1967)). Byly odebrány vzorky krve a plic a byly analyzovány, jak je popsáno v prvním pokusu.

Izolace viru a sérologie. Pro izolaci viru byl každý vzorek séra nebo supernatant plicního homegenátu umístěn na 24 jamkovou plotnu a byly přidány MARC-145 buňky (1 - 2 x 10⁵ buněk/ml) suspendované v MEM doplněném 3 % FCS. Na kulturách byl po dobu 5 až 7 dní pozorován cytopatický účinek (CPE) typický pro PRRS virus. Plotny byly dvakrát zmraženy a rozmraženy a supernatant byl inokulován do jamek 96 jamkové mikroplotny s čerstvou suspensí MARC-145 buněk a byly inkubován po 3 až 4 dny. Virová infekce byla vyšetřována pozorováním jak CPE, tak specifické fluorescence za použití PRRS virus pozitivního referenčního séra.

..?♦< —Λ • ·· • «· » ·'·

Λ»*· ·

Λ—

Λ ··· • · · ·· » ·9

9»«9

Séra od sviní a prasat byla testována na protilátky za použití metody nepřímé fluorescentní protilátky (IFA) (Yoon et al., J. Vet. Diag. Invest., 4: 144 - 147 (1992)). 96 jamkové testovací plotny byly připraveny za použití MARC-145 buněčné linie. Některá séra byla testována na protilátky k PPv testem inhibice hemaglutinace (Hl) jak bylo popsáno dříve (Joo et al., Aust. Vet. J., 52: 422 - 424 (1976)).

Výsledky

Izoláty PRRS viru ukazovaly plaků při počáteční izolaci různou velikost. MN-H izolát byl klonován do dvou různých populací MN-Hs a MN-H1 podle velikosti jejich plaků. Po klonování měly plaky MN-Hs a MN-H1 průměr < 2 mm, resp. 3 až 5 mm, zatímco velikost plaků pro MN-W byla 2 až 3 mm (viz obrázky).

U sviní po infekci izoláty PRRS viru nebyly pozorovány žádné významné klinické příznaky kromě mírné anorexie detekované u sviní 112 a 153 5 dní po inokulaci (PI). Virus byl izolován ze vzorků séra od šesti ze šesti sviní sedm dní PI a od jedné ze šesti sviní 14 dní PI. Vysoké titry prtilátek byly detekovány u všech inokulovaných sviní 14 dní PI, jak je ukázáno v tabulce 1.

Tabulka 1: Viremie a protilátková odpověď u 86 denních březích sviní po pokusné infekci izoláty PRRS viru

i ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 \| Dny po inokulaci \| 1________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________:___________________:_______________________________________________________________________________________ _ . 1
\|svině 1 č. I	Infikovaný virus	0 7	14	21	1 1 28 \| i
1 117	MN-Hs	-/-^a +/-	-/1,024	-/1,024	-/256 \|
\|53 1	MN-Hs	-/- +Λ	-/1,024	-/1,024	-/1,024 \| 1

Tabulka 2: Výsledky porodů a izolace viru od sviní v 86 dnu gestace infikovaných různými izoláty PRRS viru

Svině Plody

«. Dny Virus/způsob Celkem LB SB M Cr rozsah Izolace vin.

délky

Experiment I

17	115	MN-Hs/IN	9	6	0	3	27-32	6/9
53	113	MN-Hs/IN	10	8	1	1	25-38	6/10

153	114	MN-Hl/IN	13	0	2	11	24-32	2/11
147	112	MN-Hl/IN	12	0	4	8	18-30	3/7

68	112	MN-W/IN	15	8	3	4	25-28	5/15
112	118	MN-W/IN	15	2	4·	9	24-31	6/11

124	107^d	Control	14	14	-	-	ND	0/14
95	107^d	Control	12	12	-	-	ND	0/12

Experiment II.
155	115	MN-Hs/IN	11	7	3	1	28-35	8/11
49	114	MN-Hs/IN	10	8	2	0	34-37	9/10

176	112	MN-Hs/IM	15	12	2	1	15-36	3/15
110	113	MN-Hs/IM	15	13	2	0	32-34	2/1 5 y-

800	108	OVL-173/IN	12	1	9	2	27-28	1/12
44	108	OVL-173/IN	18	5	10	3	26-29	10/18

^a den gestace při porodu nebo porážce ³⁰ délka týl-zadek (cm) mumif ikovaných nebo mrtvě narozených plodů ^c počet vzoků s izolovaným virem/počet testovaných vzorků

• · · svině byly poraženy v den 107 gestace pro vyšetření plodů LD = živě narozené, SB = mrtvě narozené, M = mumifikované, IM = intramuskulárně, ND = neurčeno.

Virus byl izolován od jednoho nebo od více plodů z každého vrhu infikovaných sviní.Výsledky izolace viru od jednotlivých prasat ze šesti infikovaných sviní v pokusu 1 ukazují, že přibližně polovina vyšetřených plodů (28 ze 63 prasat) byla pozitivní na izolaci viru. Mezi prasaty testovanými na přítomnost viru bylo 16 (66,7%) ze 24 živě narozených prasat, 9 (64,3%) ze 14 mrtvě narozených prasat a 3 (12,0%) ze 25 mumifikovaných prasat pozitivní na virus. Ze 28 prasat pozitivních na virus ve vzorku séra bylo 10 prasat negativních na virus ve vzorcích plic testovaných na izolaci viru.

Séra od mrtvě narozených prasat od sviní 153, 147, 68 a 112 byla testována na protilátky proti PRRS viru IFA a na PPV H_l a výsledky jsou ukázány v tabulce 3. Šest ze 13 sér od mrtvě narozených prasat a 2 ze 25 hrudních tekutin od mumifikovaných prasat mělo protilátky proti PRRS viru. IFA titry byly v rozsahu od 1:16 - 1:1,024, zatímco žádné sérum nemělo protilátky k PPV. Třináct ze 14 živě narozených prasat od sviní 17 a 53 mělo protilátky jak k PRRS viru (IFA titry 1:64 - 1:1,024) tak PPV (H_l titry 1:512 - 1:16384).

· · 9 · 0 * * φ Í+--++·-;·™ *<♦ φ ♦ Φ 9 9 99 • · · · 4 ♦ · Φ φ Φ Φ · «»*·»· ,·φφ

999 9 9 9 · * ·« · · * ··

Tabulka 3: Detekce protilátek proti PRRS viru a PPV v séru mrtvě narozených prasat od sviní infikovaných PRRS virem.

Svině č.	Infikovaný virus	Anamnesa vrhu	Testované plody	PRRSV IFA	PPV h_l
153	MN-H1	OLB, 2SB,	SB (32)^a	<4^b	<8^b
		11 M
			SB (27)	256	<8
147	MN-H1	OLB, 4SB,	SB (30)	<4	<8
		8M
			SB (30)	'1,024	<8
			SB (29)	<4	<8
			SB (28)	<4	<8
68	MN-W	8LB, 3SB,	SB (27)	<4	<8
		4M
			SB (25)	16	<8
			Sb (28)	<4	<8
112	MN-W	2LB, 4SB,	SB (31)	<4	<8
		9M
			SB (29)	256	<8
			SB (26)	256	<8
			SB (24)	16	NT

^a délka týl-zadek (cm) ^b Reciprocity IFA nebo H_L titru ^cLB-živě narozené; SB-mrtvě narozené; M-mumifikace

Diskuse

Předkládaná studie potvrdila schopnost různých izolátů PRRS virů způsobovat transplacentární infekci a patogenní účinky na plody sviní v pozdní fázi gestace. Nicméně, byl zde závažný rozdíl v patogenitě mezi izoláty PRRS viru. Když byly vícekrát rodivší svině inokulovány transnasálně PRRS virem ATCC-VR 2332 v den 93 gestace (Christianson, W. T. et al., Can. J. Vet. Res., 57: 262 - 268 (1993)), potom porodily průměrně 5,8 živých selat a 6 mrtvých plodů na vrh. V předkládané studii bylo 6 sviní infikovaných MH-H1 nebo 2 polními viry porodilo 2,7 živých a 11,5 mrtvých selat na vrh, a proto jsou tyto viry považovány za vysoce virulentní. Patogenita mezi ATCC-VR 2332 a virulentními viry použitými v této studii byla odlišná. Toto může být způsobeno trváním gestace v době infekce, protože ATCC VR-2332 byl infikován o sedm dní později. 6 sviní infikovaných MN-Hs porodilo průměrně 9,0 živých a 2,7 mrtvých selat na vrh. Tyto výsledky jsou jasně odlišné od výsledků získaných pro virulentní virus což naznačuje, že MN-Hs virus je mírně patogenní kmen.

Je zajímavé, že vážné rozdíly byly pozorovány v porodech od sviní infikovaných MN-Hs a MN-H1 viry, které byly stejného původu. Za stejných podmínek způsobil virus MN.Hs, resp. MN.H1 5, resp. 25 mrtvě narozených selat (p<0,005). Podle presentovaných výsledků může být usouzeno, že patogenita MN-Hs a MN-H1 je signifikantně odlišná, kdy jeden je slabě a druhý vysoce patogenní virus.

Izolace viru z vrhů infikovaných PRRS virem byla relativně snadná a virus byl izolován v podobném poměru od živých a mrtvých selat. Protože virus nemohl být získán od všech selat v

infikovaném vrhu, měla by být izolace viru pro diagnostické účely provedena od alespoň 2 nebo více selat na vrh. Dále bylo zjištěno, že izolace viru se lépe provádí ze séra než ze vzorků plicní tkáně.

Ve vrzích od sviní infikovaných virulentním virem mělo jedno nebo více mrtvě narozených selat detekovatelné protilátky specifické pro PRRS virus. Tyto výsledky naznačují, že detekce protilátek od mrtvě narozených nebo selat před kojením může být užitečnou metodou pro diagnostiku PRRS infekce v abnormálních vrzích. Tato metoda bude výhodná v laboratořích, ve kterých nejsou prostředky a techniky pro izolaci viru dosupné. V předkládané studii, 6 ze 13 mrtvě narozených selat mělo pozitivní titry protilátek proti PRRS viru, ale ne proti PPV, což potvrzuje, že detekované protilátky jsou fetálního původu a že jsou způsobeny PRRS virem.

Není známo, proč se u některých stád infikovaných PRRS virem nevyvinou klinické příznaky. Bylo ukázáno, že stáda s dobrým zdravotním stavem před infekcí PRRS vykazují mírnější klinickou odpověď ve srovnání s těmi, která mají horší zdravotní stav. Panující zdravotní stav, spolu s rozdíly v kmenech demonstrovanými v této studii, jsou možným vysvětlením pro jasné rozdíly v klinické presentaci. Kromě toho je možno předpokládat, že u hostitele se mohou vyskytovat interakce mezi viry s malými a velkými plaky a že mohou modifikovat patogenitu. Tak tomu může být, pokud bereme v úvahu, že zde postrádáme reprodukční problémy na farmě, kde byl izolován MN-H izolát viru, i když byl vysoce patogení PRRS viru MN-H1 na farmě přítomen.

* · · • « ♦ · ♦ • · 9 • 9 9 · 9 9'

9 9 9

9 99 « · 9 9 9 9

9 9

99

Příklad 2

Preferované vakciny podle předkládaného vynálezu mohou být podány chovným mladým prasnicím, sviním, kancům nebo odstaveným selatům. Podání může být intramuskulární nebo orálně nasální a může být podáno v jakoukoliv dobu. Nicméně pro chovné samice jsou vakcinace preferovány před kopulací pro ochranu po celou dobu březosti a pro selata těsně před odstavením pro ochranu během pozdějšího odchovu a chovu až do finálního stadia.

Obecně jsou vakciny podle vynálezu podány ve 2 ml dávkách, které obsahují od asi 10⁴ do 10⁸ plaky formujících jednotek (PFU) a lépe okolo 10⁶ PFU. Imunita bude v případě chovných samic přetrvávat alespoň jednu dobu březosti, zatímco vakcinace po odstavení selat bude zprostředkovávat imunitu až do porážky. Preferované vakciny podle předkládaného vynálezu mohou poskytovat široký rozsah zkřížené ochrany.

Vakciny podle předkládaného vynálezu mohou indukovat živé nebo modifikované živé (atenuované) viry, stejně jako konvenční nosiče, stabilizátory a/nebo adjuvans.

Příklad 3

Úvod

V tomto příkladu byla vyšetřována schopnost vakciny složené z MN-Hs kmene severoamerického PRRSV chránit 3-týdenní selata před viremií způsobenou infecí virulentním kmenem MN-H1 severoamerického PRRSV. Respirační onemocnění související s infekcí severoamerickým PRRSV je primárně způsobeno infekcí

φ e ·

sekundárními patogeny přítomnými na prasečích farmách. Nicméně, za pokusných podmínek, respirační klinické příznaky u prasat infikovaných severoamerickým PRRSV nejsou konsistentně reprodukovány vzhledem k absenci těchto sekundárních patogenů. Proto je detekce viremie nej lepším ukazatelem infekce severoamerickým PRRSV. Absence viremie po infekci MN-H1 kmenem ukazuje, že selata vakcinovaná MN-Hs kmenem jsou imunní k infekci MN-H1 kmenem.

Materiál a metody

Dvacet 3 týdeních selat bylo zakoupeno od farmy bez PRRS infekce. Dvanáct z těchto selat bylo vakcinováno intranasálně MN-Hs kmenem (2 ml, 10⁴·^Ξ TCIDso/ml) a zbylých 8 selat sloužilo jako kontroly. Vakcinovaná a kontrolní selata byla umístěna v oddělených místnostech izolační jednotky. Šest vakcinovaných selat (selata č. 81 - 86) a 4 kontrolní selata (selata č. 93 96) byla infikována intranasálně MN-H1 kmenem (2 ml, 10⁴'⁵TCIDso/ml) 2 týdny po vakcinaci (skupina 1). Zbylých 6 vakcinovaných selat (selata č. 87 - 92) a 4 kontrolní selata (selata č. 97 - 100) byla infikována stejně 6 týdnů po vakcinaci (skupina 2). U všech selat byly denně pozorovány klinické příznaky. Kromě toho, jednou týdně byly odebírány vzorky krve od každého selete na (1) izolaci viru za použití MARC-145 buněčné kultury (Yoon et al., J. Vet. Diag. Invest, 6: 289 - 292 (1994)) a (2) určení titrů sérových neutralizačních (SN) protilátek (Park et al., Am. J. Vet. Res., 57: 320 - 323 (1996)); detekce SN protilátek u vakcinovaných selat ukazovala protektivní imunitu proti virulentnímu severoamerickému PRRSV.

• · ♦ * ♦ φ · ♦ ···♦ ««


•	Φ	9	• Φ	ΦΦ
Φ	«	•	♦ Φ Φ Φ	Φ- 9
•	•	Φ	•	9 9
• 9		·· ·	··	9 9

Výsledky

Po vakcinaci byl vakcinační virus izolován od selat ve skupině 1 a 2 více než 3 týdny po vakcinaci. Po infekci nebyly klinické příznaky pozorovány u žádného z kontrolních a vakcinovaných selat ve skupině 1 a 2.

Skupina 1. SN protilátka nebyla detekována u žádného selete v době infekce. Po infekci byl infekční virus získán jak od vakcinovaných, tak od kontrolních selat. Dále, jak u vakcinovaných, tak u kontrolních selat se vyvinula viremie (tabulka 1).

Skupina 2. Vakcinovaná selata produkovala SN protilátky od 3 týdne po vakcinaci a titry byly mezi 1:2 a 1:8 v době infekce. Po infekci nebyl od vakcinovaných selat infekční virus izolován, zatímco u kontrolních selat se vyvinula viremie (Tabulka 4). Tyto výsledky ukazují, že vakcinovaná selata mají získanou ochrannou imunitu proti virulentnímu severoamerickému PRRSV.

Tabulka 4. Detekce viremie a SN protilátky u 3 týčeních selat vakcinovaných a infikovaných 2 nebo 6 týdnů po vakcinaci

Prase č.	Týden 0	po 1	vakcinaci	4	5	6^a	7	8
2^a	3
skupina 1
81V	-/-^b	-/-	-/-	-/-	-/2
82V	-/-	-/-	-/-	+/-	+/-
83V	-/-	-/-	+/-	+/-	+/2
84V	-/-	-/-	-/-	-/-	+/-
85V	-/-	-/-	+/-	+/-	+/4
86V	-/-	-/-	+/-	+/-	-/4
93C	-/-	-/-	-/-	+/-	+/-
94C	-/-	-/-	-/-	+/-	+/8
95C	-/-	-/-	-/-	+/-	+/4
96C	-/-	-/-	-/-	+/-	+/-
Skupina 2
87V	-/-	-/-	-/-	. ⁺/ ⁺	-/-	-/2	-/2	-/8	-/8
88V	-/-	-/-	+/-	-/-	-/-	-/4	-/4	-/64	-/128
89V	-/-	-/-	+/-	-/-	-/2	-/8	-/8	-/8	-/32
90V	-/-	-/-	+/ -	+/-	-/4	-/8	-/8	-/128	-/64
91V	-/-	-/-	+/-	-/2	-/2	-/8	-/4	-/32	-/64
92V		-/-	-/-	-/-	-/4	-/2	-/4	-/4	-/128
97C	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	+/-	+/-
98C	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	+ /-	+/-
99C	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	+/-	+/-
100C	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	+/-	-/2

V = vakcinované; C = kontrola ^a = infikované MN-H1 virem ^b = izolace viru/titr SN protilátek

Selata ve skupině 1, resp. 2 byla usmrcena 4, resp. 8 týdnů po vakcinaci.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Vakcina zahrnující virus mající označení ATCC VR2509.
2. Vakcina podle nároku 1, kde virus je živý.
3. Vakcina podle nároku 1, do 10⁸ PFU.

kde dávka vakciny obsahuje od 10⁴
4. Způsob imunizace prasat proti severoamerickému reprodukčnímu a respiračnímu syndromu t

v y z podle načující se nároku 1 prasatům.

m, že prasat zahrnuje podání vakciny
5.

že

Způsob podle nároku 4 virus je živý.

m, že v prasetem je dospělá chovná
6. Způsob podle nároku 4 y svině.

m, že
7. Způsob podle nároku 4 v prasetem je sele.

m, že
8. Způsob podle nároku 4 v vakcina je podána intramuskulárně, c

intranasálně s nebo m, t orálně.
9. Způsob přípravy vakciny vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(A) získání kmene severoamerického PRRSV klonováním plaku; a φφ φφ (Β) přípravu vakciny ze kmene získaného v kroku (A), kde kmen dává plaky mající průměrný průměr menší než 2 mm, pokud jsou plaky získány způsobem zahrnujícím kroky:

(a) inokulace alikvotu buněk s kmenem, kde buňky mají označení CRL 12219, kde alikvot je získán z konfluentní monovrstvy buněk kultivovaných v Eaglově minimálním esenciálním mediu doplněném

3 % fetálního telecího séra a 0,15 % uhličitanu sodného, přičemž alikvot obsahuje 1 až 2 x 10⁵ buněk na ml Eaglova minimálního esenciálního media doplněného 3 % fetálního telecího séra a 0,15 % uhličitanu sodného;

(b) inkubace alikvotu při 37 °C po 60 minut;

(c) odstranění inokula z alikvotu;

(d) promytí alikvotu Eaglovým minimálním esenciálním mediem;

(e) resuspendování alikvotu v 5 ml 2x Eaglova minimálního esenciálního media a 1,6% převařeného Noble agaru doplněného 250 μg diethylaminoethyl(DEAE)-dextranu;

(f) plotnování alikvotu; a (g) další inkubování alikvotu při 37 θϋ po 5 dní v CO₂inkubátoru pro vznik plaků.
10. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že vakcina zahrnuje živý kmen severoamerického PRRSV.
11. Způsob podle nároku 9vyznačujicí se tím, i

« « • * ♦ · · ··«· ·· • · ·· ··* · • · ·· ·· že způsob přípravy vakciny zahrnuje purifikované formě.

krok získání kmene v
12. Způsob podle nároku 9 v y z n že kmen má označení ATCC VR2509.

ačující se t í m,
13. Vakcina zahrnující kmen severoamerického PRRSV, kde dává plaky mající průměrný průměr menší než 2 mm, pokud jsou plaky získány způsobem zahrnujícím kroky:

kmen (a) inokulace alikvotu buněk s kmenem, kde buňky mají označení CRL 12219, kde alikvot je získán z konfluentní monovrstvy buněk kultivovaných v Eaglově minimálním esenciálním mediu doplněném 3 % fetálního telecího séra a 0,15 % uhličitanu sodného, přičemž alikvot obsahuje 1 až 2 x 10⁵ buněk na ml Eaglova minimálního esenciálního media doplněného 3 % fetálního telecího séra a 0,15 % uhličitanu sodného;

(b) inkubace alikvotu při 37 °C po 60 minut;

(c) odstranění inokula z alikvotu;

(d) promytí alikvotu Eaglovým minimálním esenciálním mediem;

(e) esenciálního media a 1,6% převařeného Noble agaru doplněného 250 μg diethylaminoethyl(DEAE)-dextranu;

resuspendování alikvotu v 5 ml 2x Eaglova minimálního (f) plotnování alikvotu; a (g) další inkubování alikvotu při 37 °C po 5 dní v C0₂ inkubátoru pro vznik plaků.
14. Vakcina podle nároku 13, kde vakcina obsahuje živý kmen severoamerického PRRSV.
15. Vakcina podle nároku 13, kde kmen má označení ATCC VR2509.
16. Izolovaný a purifikovaný kmen severoamerického PRRSV, kde kmen má označení ATCC VR 2509.
17. Kmen podle nároku 16, kde kmen je živý.
18. Izolovaný a purifikovaný kmen severoamerického PRRSV, kde kmen dává plaky mající průměrný průměr menší než 2 mm, pokud jsou plaky získány způsobem zahrnujícím kroky:

(a) inokulace alikvotu buněk s kmenem, kde buňky mají označení CRL 12219, kde alikvot je získán z konfluentní monovrstvy buněk kultivovaných v Eaglově minimálním esenciálním mediu doplněném

3 % fetálního telecího séra a 0,15 % uhličitanu sodného, přičemž alikvot obsahuje 1 až 2 x 10⁵ buněk na ml Eaglova minimálního esenciálního media doplněného 3 % fetálního telecího séra a 0,15 % uhličitanu sodného;

(b) inkubace alikvotu při 37 °C po 60 minut;

(c) odstranění inokula z alikvotu;

(d) promytí alikvotu Eaglovým minimálním esenciálním mediem;

(e) resuspendování alikvotu v 5 ml 2x Eaglova minimálního . 4-4.....-4-441-4-----------··♦----· 4 '4 ’ 4'· • 4 44

4»444

4 4 4 44 »444 4444

---4-----------44’4» «· —4- »44

4 4 44»

4 4 »4» 4·

4 · 4·

444 44»4 esenciálního media a 1/6% převařeného Noble agaru doplněného 250 μg diethylaminoethy1(DEAE)-dextranu;

(f) plotnování alikvotu; a (g) další inkubování alikvotu při 37 °C po 5 dní v C0₂inkubátoru pro vznik plaků.
19. Kmen podle nároku 18, kde kmen je živý.