CN101258247B - Prrs病毒、感染性克隆、其突变体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供分离的感染性多核苷酸，例如感染性克隆，其核苷酸序列与PRRS病毒例如VR-2332、Lelystad或其它等具有同一性，并且任选在编码nsp2多肽的ORF1区中还包括缺失。

Description

PRRS病毒、感染性克隆、其突变体及其使用方法
继续申请数据
本申请要求于2005年6月24日申请的美国临时专利申请顺序号60/694,021的权益，所述临时申请的全部公开内容通过引用结合到本文中。
发明背景
猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)是以仔猪呼吸障碍和母猪生殖障碍为特征的病原体(Benfield等，J.Vet.Diagn.Invest.，4：127-133(1992)；Collins等，J.Vet.Diagn.Invest，4：117-126(1992)；Wensvoort等，Vet.Q.，13：121-130(1991))，这类疾病目前在大多数国家流行。该综合征首先于1987年在美国被称为“神秘猪病(mysteryswinedisease)”并于1990年在欧洲发现。两种原型病毒株(Lelystad和VR-2332)在核苷酸序列上有约40％的差异，代表两种不同基因型，称为欧洲株(EU或1型，Lelystad；Meulenberg等，Virology，192：62-72(1993))和北美株(NA或2型，VR-2332；Nelsen等，J.Virol，73：270-80(1999))(Fang等，VirusRes.，100：229-235(2004)；Mardassi等，J.Gen.Virol，75：681-5(1994)；Meng等，Arch.Virol，140：745-55(1995)；Ropp等，J.Virol，78：3684-3703(2004))。该病也称为Wabash综合征、神秘猪病、猪生殖和呼吸综合征、猪瘟、猪流行性流产和呼吸综合征、蓝色流产病(blueabortiondisease)、蓝耳病、abortusblau和seuchenhafterspatabortderschweine。该病的特征是受孕母猪的生殖障碍和各年龄段仔猪的呼吸问题。该病在养猪业有重大负面影响。
PRRSV是隶属于尼多病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)的有囊膜的正链RNA病毒(Cavanagh，Arch.Virol，142：629：633(1997))。PRRSV基因组长度为15.1-15.5kb(Meulenberg等，Virology，192：62-72(1993)；Nelsen等，J.Virol，73：270-80(1999))。基因组的最初75％编码病毒复制所需的复制酶多蛋白，包括两个大的可读框(ORF)(1a和1b)，它们由病毒编码的蛋白酶共翻译加工成较小的蛋白质(Snijder等，JGen.Virol，79：961-79(1998))。结构蛋白由7个下游ORF编码，从3′-共终端嵌套(nestedset)的亚基因组mRNA(sgmRNA)翻译(Meulenberg等，Virology，192：62-72(1993)；Pattnaik等，Cell69：1011-1020(1992))。在VR-2332株中，基因组编码区(15，411碱基)分别侧接189个和151个核苷酸的5′和3′非翻译区。
已经充分表征了PRRSVVR-2332株的完整基因组序列(Pattnaik等，Cell，69：1011-1020(1992))、PRRSV组成型地产生缺陷亚基因组RNA(称为畸形(heteroclite，拉丁语：不常见形式))的能力(Yuan等，Virology，275：158-169(2000))；Yuan等，VirusResearch，105：75-87(2004))，及其体外和体内生长特性(Murtaugh等，Vet.Immunol.Immunopathol，102：105-349(2004))。另外，已经产生了该15.4kbNAPRRSV基因组的感染性克隆并检查了其引起猪病的能力(pVR-HN；Nielsen等，J.Virol.，77：3702-3711(2003))。
PRRSV持续引起全世界重大经济损失。可使用疫苗，但是它们是基于一种PRRSV株，并且有证据表明PRRSV株在抗原水平和遗传水平上不同。另外，尽管在欧洲和美国鉴定了病毒，但是新的疾病表型一直都在不断出现。
发明概述
先前的报道表明，任何PRRS病毒株的缺失和/或突变对病毒生长通常都有极大的害处。具体地讲，个别实验室已经在病毒3′端造成了突变，所得病毒不稳定并能快速回复突变成野生型序列，或生长非常差或完全不生长(Lee等，Virol.，331：47-62(2005)；Choi等，J.Virol.，80：723-736(2006)；Lee等，Virolog.，346：238-250(2005))。因此，在欧洲(1型基因型)和VR-2332(2型基因型)的核苷酸序列的比较中，尚不知道在VR-2332NSP2中不造成极大害处的突变。然而，将新2型PRRS病毒的全基因组序列与VR-2332进行比对，已开始提供有关在何处可进行有活性的突变的知识。进一步的缺失诱变表明，nsp2氨基酸324-813间的区域对体外生长并非必须。
本发明提供分离的感染性多核苷酸，该多核苷酸包含与SEQIDNO：1具有至少88％同一性的核苷酸序列并具有SEQIDNO：1的核苷酸2062至核苷酸3864的至少39个连续核苷酸的缺失。也提供分离的感染性多核苷酸，该多核苷酸包含与SEQIDNO：14具有至少88％的同一性的核苷酸序列并具有SEQIDNO：14的核苷酸2061至核苷酸3545的至少39个连续核苷酸的缺失。分离的多核苷酸可存在于载体中、分离的病毒颗粒中、存在于细胞中或其组合。当存在于载体中时，RNA聚合酶启动子可与该多核苷酸操作性连接。分离的多核苷酸可以是RNA。分离的多核苷酸可包括2个或更多缺失，而且每个缺失都独立地为至少37个连续核苷酸。分离的多核苷酸还可包括存在于缺失中的外源多核苷酸，而且外源多核苷酸可编码多肽，例如可检测标记。
本发明也提供分离的多核苷酸，该多核苷酸包含与SEQIDNO：1具有至少88％同一性的核苷酸序列并具有SEQIDNO：1的核苷酸2062至核苷酸3864的至少39个连续核苷酸的至少一个缺失，而且其中当该多核苷酸引入细胞中时，能复制并产生感染性病毒颗粒。分离的多核苷酸可存在于载体中、分离的病毒颗粒中、存在于细胞中或其组合。当存在于载体中时，RNA聚合酶启动子可与该多核苷酸操作性连接。分离的多核苷酸可以是RNA。分离的多核苷酸可包括2个或更多缺失，而且每个缺失都独立地为至少37个连续核苷酸。分离的多核苷酸还可包括存在于缺失中的外源多核苷酸，而且外源多核苷酸可编码多肽，例如可检测标记。
本发明还提供感染性克隆，该克隆的多核苷酸包含与SEQIDNO：1具有至少88％同一性的核苷酸序列并具有SEQIDNO：1的核苷酸2062至核苷酸3864的至少39个连续核苷酸的至少一个缺失。也提供感染性克隆，该克隆的多核苷酸包含与SEQIDNO：14具有至少88％的同一性的核苷酸序列并具有SEQIDNO：14的核苷酸2061至核苷酸3545的至少39个连续核苷酸的至少一个缺失。感染性克隆可存在于细胞中。RNA聚合酶启动子可与该多核苷酸操作性连接。感染性克隆可包括2个或更多缺失，而且其中每个缺失都独立地为至少37个连续核苷酸。分离的多核苷酸还可包括存在于缺失中的外源多核苷酸，而且外源多核苷酸可编码多肽，例如可检测标记。
本发明也提供分离的感染性多核苷酸，所述多核苷酸包括核苷酸序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12或SEQIDNO：13和由感染性多核苷酸编码的nsp2多肽，所述感染性多核苷酸包括核苷酸序列SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12或SEQIDNO：13。
术语“包含”及其变体当出现在说明书和权利要求书中时，不具有限制意义。除非另有说明，否则“一个(种)”和“至少一个(种)”可互换使用，是指一个(种)或多个(种)。
附图简述
图1.A.感染性多核苷酸VR-V7(在本文中也称为V6G7475A)的核苷酸序列(SEQIDNO：1)。B.感染性多核苷酸VR-V5的核苷酸序列(SEQIDNO：2)。C.感染性多核苷酸VR-V5G7475A的核苷酸序列(SEQIDNO：3)。D.感染性多核苷酸VR-V6的核苷酸序列(SEQIDNO：4)。E.感染性多核苷酸MN184A的核苷酸序列(SEQIDNO：5)。F.感染性多核苷酸MN184B的核苷酸序列(SEQIDNO：6)。G.感染性多核苷酸Nsp2Δ324-434的核苷酸序列(SEQIDNO：7)。H.感染性多核苷酸Nsp2Δ324-523的核苷酸序列(SEQIDNO：8)。I.感染性多核苷酸Nsp2Δ543-632的核苷酸序列(SEQIDNO：9)。J.感染性多核苷酸Nsp2Δ633-726的核苷酸序列(SEQIDNO：10)。L.感染性多核苷酸Nsp2Δ543-726的核苷酸序列(SEQIDNO：11)。L.感染性多核苷酸Nsp2Δ727-813的核苷酸序列(SEQIDNO：12)。M.感染性多核苷酸Nsp2Δ324-726的核苷酸序列(SEQIDNO：13)。
图2.PRRSVVR-2332株全长克隆的装配。分4个部分(I-IV)扩增15.4基因组，向所述部分中掺入病毒cDNA中存在的唯一的限制酶切割位点(FseI、AvrII、BsrGI)或者在5′和3′端通过插入诱变添加到PRRSV序列上(分别为SphI、PacI)。将T7聚合酶启动子和2个非模板G残基和T残基放在病毒序列之前。pOK12载体(24)经修饰成包括PacI位点和50个核苷酸的聚腺苷酸尾的肝炎delta核酶下游。
图3.感染性克隆或猪后代的核苷酸改变的示意图。给出了PRRSV基因组结构组织图，其下是全长基因组比较。在ORF1a和1b上标出了推定的非结构蛋白切割，用向下箭头表示。在ORF1a和1b下标明了特征基序，用向上箭头表示其在PRRSV基因组[木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶α和β(PCPα、PCPβ)；半胱氨酸蛋白酶(CP)；丝氨酸/3C蛋白酶(SP/3CP)；聚合酶(POL)；富含半胱氨酸/组氨酸(C/H)；解旋酶(He1)；非洲爪蟾(Xenopuslaevis)同系物聚(U)-特异性核糖核酸内切酶(XendoU)；Ivanov等，Proc.NatlAcad.Sci.USA，101：12694-12699(2004)；Ziebuhr等，J.Gen.Virol，81：853-879(2000)]中的位置。核苷酸差异用竖条表示。1.wt株VR-2332(U87392)与来自VR-2332的疫苗(IngelvacMLV或RespPRRS，AF066183)的比较。2.wt株VR-2332与pVR-V6G7475A的比较。3.pVR-V5与体内传代的V5-1-P3(Sw612)的比较。4.wt株VR-2332与Sw612的比较。详细的核苷酸变化列于表4和表5。
图4.PRRSV感染后猪的血清转化。使饲养的猪感染天然wt株VR-2332(□)、IngelvacMLV(X)、V5-1P3(○)或未感染(■)。在指定天数采集血清样品，采用针对核壳蛋白的抗PRRSV抗体，通过IDEXXElisa测定血清转化。
图5.A.对所有感染性克隆的P3后代(第一谱系)以及wt株VR-2332进行噬斑测定，显示不同噬斑大小。B.猪(Sw612)中生长后的V5-1P3后代产生类似于wt株VR-2332的噬斑。
图6.A.对所有感染性克隆的P3后代(第二谱系)以及wt株VR-2332进行噬斑测定，显示与第一谱系病毒制备物不同的噬斑大小。B.P4病毒滴度表明，尽管有类似的噬斑大小，但是感染性克隆后代不能象wt株VR-2332或Sw612病毒那样复制。
图7.A.按照实施例1所述，同时检查wt株VR-2332(◆)、Sw612(▲)、pVR-HN(□)、pVR-V5(X)、pVR-V5G7475A(*)、pVR-V6(●)、pVR-V6G7475A(○)的P3代的一步生长动力学。在所有时间点wt株VR-2332和Sw612病毒复制的滴度约高出10倍。pVR-V6G7475A(与天然病毒或疫苗相比没有氨基酸变化)产生的病毒，在所有时间点的滴度都比其它感染性克隆后代要高。各病毒制备物的最终滴度列于附表中。
图8.对pVR-V6G7475A的不同后代以及Sw612和最初的体外转录物进行RNA印迹分析表明，畸形早在P1就产生了，而且与基因组RNA一起，随着不断传代而越来越多。然而，转录RNA(Tx)不含可检测到的畸形。
图9.A.PRRSV基因组的图示。在ORF1a和1b上标出了推定的非结构蛋白切割，用向下箭头表示。在ORF1a和1b下标明了特征基序，表示其在PRRSV基因组[木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶α和β(PL1)；半胱氨酸蛋白酶(PL2)；丝氨酸/3C蛋白酶(3CL)；聚合酶(RdRp)；解旋酶(He1)；非洲爪蟾同系物聚(U)-特异性核糖核酸内切酶(N)；Ziebuhr等，2000；Ivanov等，2004；Gorbalenya等，2006]中的位置。B.MN184A和MN184B的ORF1蛋白(复制酶)的比较和推定的加工示意图。比较中包括了nsp2中所见的简并性。C.MN184A和MN184B的ORF2-7蛋白的比较示意图。
图10.不同PRRSV的ORF5氨基酸序列比对。深灰色框是指氨基酸高度保守(＞80％；在16-19个残基之间相同)，中度灰色框(＞60％；在12-15个残基之间相同)、浅灰色框(＞40％；在8-11个残基之间相同)和无阴影框(＜40％；小于8个残基相同)表示更少保守的残基。虚线区表示推定的信号序列，框起来的区域表示所提出的跨膜区，指出了超变区(HV-1和HV-2)，而病毒离子中所提出的蛋白质方向用粗斜体表示。向下箭头(↓)表示可能与M蛋白相互作用的保守半胱氨酸残基。星号表示两个保守推定的N-糖基化位点，而超变区1含有株系/分离物特异性N-糖基化位点(NxS/T)。以下GenBank全长序列用于进行比较：VR-2332(U87392)、IngelvacMLV(AF066183)、01NP1.2(DQ056373)、PL97-1(AY58524)、PA-8(AF176348)、SP(AF184212)、BJ-4(AF331831)、HN1(AY457635)、16244B(AF046869)、HB-1(AY150312)、HB-2(AY262352)、CH-1a(AY032626)、P129(AF494042)、JA142(AY424271)、SDPRRS-01-08(AY375474)、EuroPRRSV(AY366525)、Lelystad(M96262)、IAF-93-653(U64931)、IAF-Klop(AY184209)、98-3298(DQ306877)、98-3403(DQ306878)、99-3584(DQ306879)。
图11.不同PRRSV的Nsp1β氨基酸序列比对。图的产生和色彩方案描述于图10的图例中。两个完全保守推定的催化残基用星号表示，而框起来的氨基酸表示1型分离物和EAV中的MN184的序列保守。所提出的切割位点用向下箭头(↓)表示。
图12.不同PRRSV的Nsp2氨基酸序列比对。星号表示完全保守推定的半胱氨酸蛋白酶催化残基(Cys和His)，而框起来的氨基酸表示PRRSV和EAV中的蛋白酶序列保守。所提出的切割位点用实心箭头(↓)表示；其它可能的切割位点用虚线箭头表示；信号肽，实心灰色框；跨膜区，用虚线黑框表示；潜在N-糖基化位点，用星号(*)表示。图的产生和色彩方案描述于图10的图例中。
说明性实施方案的详述
本发明包括猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332的感染性克隆。本文所用的术语“感染性克隆”是具有两个组件的多核苷酸：在原核宿主细胞中复制的载体序列，以及在本文中称为感染性多核苷酸的第二多核苷酸。当体外转录得到RNA多核苷酸并引入感受细胞时，感染性多核苷酸复制(作为RNA)并产生感染性病毒颗粒。因此，感染性多核苷酸可以DNA形式存在于载体中，以RNA形式存在于病毒颗粒中，或者以分离的DNA或RNA形式存在。术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，无论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸，其包括双链和单链DNA和RNA。除非另有说明，否则多核苷酸包括其互补形式。本领域技术人员可以容易地确定多核苷酸的互补核苷酸序列。多核苷酸可包括具有不同功能的核苷酸序列，包括例如编码序列和非编码序列(例如调节序列和/或非翻译区)。可直接从天然来源获取多核苷酸，或者借助于重组技术、酶促技术或化学技术而制备多核苷酸。多核苷酸在拓扑学上可以是线状或环状的。多核苷酸可以是例如载体(例如表达载体或克隆载体)的组成部分或片段。
如果是天然存在的话，多核苷酸优选是分离的，更优选是纯化的。“分离的”化合物(例如多核苷酸、多肽或病毒颗粒)是与其天然环境中分开和分离的化合物。“纯化的”化合物是至少60％不含与其天然缔合的其它成分，优选75％、最优选90％不含与其天然缔合的其它成分。在天然生物体之外产生(例如通过化学方法或重组方法产生)的诸如多核苷酸和多肽等化合物，按定义就认为是分离和纯化的，因为它们在天然环境中不存在。
本发明感染性多核苷酸的实例包括感染性多核苷酸VR-V7(SEQIDNO：1)。VR-V7在本文中也称为V6G7475A。本发明感染性多核苷酸的其它实例包括VR-V5(SEQIDNO：2)、VR-V5G7475A(SEQIDNO：3)和VR-V6(SEQIDNO：4)。应当注意，尽管本文公开的SEQIDNO：1、2、3、4、5、6和其它病毒的核苷酸序列为DNA序列，本发明还涵盖相应的RNA序列及其RNA互补序列和DNA互补序列。
本发明的其它感染性多核苷酸的多核苷酸序列具有与参考多核苷酸类似的结构。参考多核苷酸包括SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、PRRS病毒的欧洲原型株即Lelystad(Genbank检索号M96262；SEQIDNO：14)，和PRRS病毒的北美原型株即VR-2332(Genbank检索号U87392；SEQIDNO：15)。相似性称为“％同一性”，是根据两个多核苷酸残基(即候选感染性多核苷酸的核苷酸序列和参考多核苷酸的核苷酸序列)比对并优化沿其序列长度的相同核苷酸数目而测定的；在比对中允许一个或两个序列中的空位，以便优化共享核苷酸的数目，尽管各序列中的核苷酸仍然保持其合适顺序。在本发明的某些方面，空位(也称为缺失)存在于候选感染性多核苷酸序列中。候选感染性多核苷酸是具有与参考多核苷酸进行比较的核苷酸序列的多核苷酸。候选感染性多核苷酸可以从动物(例如从感染PRRSV的猪)中分离，从培养的细胞系中分离，或者使用重组技术或化学合成或酶促合成而制备。使用用于进行核苷酸序列比对的任何市售计算机算法，对两个核苷酸序列进行比较。优选使用GCGWisconsin软件包(Accelrys，Inc.)10.3版(2001)的GAP程序，对两个核苷酸序列进行比较。GAP程序使用Needleman等的算法(J.Mol.Biol，48：443-453(1970))，以寻找这样的两个完整序列的比对：使得匹配数最大而空位数最小。优选对所有GAP搜索参数都采用缺省值，包括打分矩阵＝NewsgapDNA.cmp，空位权重＝50，长度权重＝3，平均匹配＝10，平均错配＝0。在使用GAP搜索算法的两个核苷酸序列的比较中，结构相似性称为“％同一性”。当使用GAP程序测定结构相似性时，优选的多核苷酸与参考多核苷酸的结构相似性为至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
多核苷酸是否是感染性多核苷酸，可通过以下方法来确定：将候选感染性多核苷酸插入到载体中，体外转录候选感染性多核苷酸，用所得RNA分子转染感受细胞并测定后代病毒RNA、后代病毒核壳蛋白、测定感染性病毒颗粒或其组合。载体优选具有成为低拷贝数并在插入大的(例如15kb)插入序列后保持稳定的特征。合适载体的实例是pOK和pOK12(GenBank检索号AF223639，Vieira等，Gene，100：189-194(1991))，具有这些特征的其它载体是已知和可用的。在载体中，候选感染性多核苷酸是启动子的紧接下游。适用的启动子是可以诱导并产生高水平转录的启动子，例如T7RNA聚合酶启动子，例如TAATACGACTCACTATA(SEQIDNO：16)或RNA聚合酶启动子SP6和T3。候选感染性多核苷酸的转录通常包括对载体进行限制性内切核酸酶消化，使其成为线状，再通过常规和众所周知的体外转录方法产生RNA转录物。体外转录试剂盒是市售的(例如mMessagemMachine，得自Ambion，Austin，TX)。
体外转录后，用常规方法纯化RNA，再用于转染感受细胞。感受细胞的实例包括例如BHK-21(其允许产生一轮病毒颗粒)、CL-2621、MA-104(ATCCCRL-2378)、MARC-145(Kim等，Arch.Virol，133：477-483(1993))、从这些细胞系经无性繁殖而来的细胞系、或原代猪肺泡巨噬细胞。有效转染细胞的方法包括使用1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵和胆固醇(DMRIE-C)以及其它市售产品，优选DMRIE-C。有效转染原代猪肺泡巨噬细胞的方法是本领域已知的(GrootBramel-Verheige等，Virol.，278：380-389(2000))。通常，转染可使用2-3微克RNA，但是也可使用更多和更少量。经过合适时间后，可通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)等，来测定后代病毒RNA的存在。同样，可通过核壳特异性抗体等来测定后代病毒核壳蛋白。此外，用候选感染性多核苷酸转染的细胞所产生的病毒颗粒是否可感染其它细胞，这可通过使未感染的感受细胞接触来自感染细胞的上清液来测定。任选可观察到致细胞病变效应(CPE)。当候选感染性多核苷酸产生后代病毒RNA、后代病毒蛋白(核壳、膜、GP5和其它蛋白质)并感染其它感受细胞时，则认为它是感染性多核苷酸。
在本发明的某些方面，感染性多核苷酸包括非结构蛋白2(nsp2)(是由ORF1编码的多蛋白中存在的若干(预测12种)多肽中的一种)编码核苷酸的缺失。在PRRS病毒及其感染性多核苷酸中，可以通过鉴定木瓜蛋白酶样蛋白酶1β的切割位点来确定编码nsp2的第一个氨基酸的核苷酸，预测是在VR-2332的ORF1氨基酸383位的甘氨酸之后。
对于编码nsp2的最后一个氨基酸的核苷酸的鉴定，并未凭经验测定出ORF1a-编码的多蛋白准确nsp2C-端切割位点，因此尚不知道对应于编码区3′端的核苷酸。然而，已经提出两个预测C-端切割位点：一个Gly|Gly(其中2个甘氨酸残基间的垂直线表示切割位置)在VR-2332的氨基酸980，另一个在VR-2332的氨基酸1197。在所有可用PRRSV序列的比对中，在该蛋白内有若干完全保守Gly|Gly双联体，它们也是多蛋白的nsp2C端切割位点(VR-2332中的氨基酸646、980、1116、1196、1197)。其它病毒和感染性多核苷酸中Gly|Gly双联体的位置可通过比较nsp2序列与图12中公开的Gly|Gly双联体而鉴定。目前的研究认为，nsp2中可能有至少3个切割位点，对应于氨基酸980、1116、1196或1197。
nsp2多肽包括N端存在的高度保守的胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶结构域(在图3中为CP，而在图9中为PL2)，以及靠近nsp2C端的3-4个预测跨膜结构域(其中跨膜结构域的数目因C-端切割位点的位置不同而异)。通常，编码PL2结构域或所有预测跨膜结构域的氨基酸的核苷酸的缺失，产生能在感受细胞中复制的多核苷酸，但却不产生感染性病毒颗粒。因此，本发明的感染性克隆通常不包括完整PL2结构域或所有预测跨膜结构域的缺失。
胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶结构域的编码核苷酸是VR-V7的核苷酸1474-1776(SEQIDNO：I)、VR-2332的核苷酸1474-1776(Genbank检索号U87392)和Lelystad的核苷酸1482-1784(Genbank检索号M96262)。可通过将PRRS病毒所编码的nsp2多肽的氨基酸序列与图12所公开的氨基酸序列比对进行比对，鉴定其它PRRS病毒核苷酸序列中胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶结构域的位置，并确定哪些核苷酸编码与胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶结构域一起排列(lineupwith)的氨基酸。或者，可以通过将PRRS病毒所编码的nsp2多肽的氨基酸序列与其它动脉炎病毒所产生的nsp2多肽的氨基酸序列进行比对，鉴定其它PRRS病毒的nsp2多肽氨基酸序列，所述其它动脉炎病毒例如马动脉炎病毒(EAV)和乳酸脱氢酶-提高病毒(LDV)。
编码VR-V7(SEQIDNO：1)、VR-2332(Genbank检索号U87392)，和Lelystad(Genbank检索号M96262)的预测跨膜结构域的编码核苷酸见表1。
表1.编码预测跨膜结构域的Nsp2核苷酸.
VR-V7VR-2332Lelystad
跨膜结构域I881-901881-901761-781
跨膜结构域II913-934913-934793-814
跨膜结构域III963-980963-980843-860
跨膜结构域IV985-1003985-1003865-883
可以通过将PRRS病毒所编码的nsp2多肽的氨基酸序列与图12所公开的氨基酸序列比对进行比对，鉴定其它PRRS病毒核苷酸序列中跨膜结构域的位置，并确定哪些核苷酸编码与跨膜结构域一起排列的氨基酸。或者，可以用计算机算法来鉴定跨膜结构域的位置，所述算法例如Rost等(NucleicAcidsRes.，32(WebServerissue)：W321-326(2004)所述的PredictProtein算法，或Krogh等(J.Mol.Biol.，305：567-580(2001))所述的TMHMM算法，这些算法可得自互联网。
本发明的感染性多核苷酸中存在的缺失通常介于编码胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶结构域的核苷酸与编码跨膜结构域的核苷酸之间，而且不会导致ORF1读框的移码。如上所述，缺失通常不包括胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶结构域的所有编码核苷酸、跨膜结构域的所有编码核苷酸或其组合。在某些方面，例如当感染性多核苷酸与SEQIDNO：1具有结构相似性时，缺失的5′边界在核苷酸2305、核苷酸2205、核苷酸2105或核苷酸2062，而缺失的3′边界在核苷酸3774、核苷酸3804、核苷酸3834或核苷酸3864。在其它方面，例如当感染性多核苷酸与SEQIDNO：14具有结构相似性时，缺失的5′边界在核苷酸2304、核苷酸2204、核苷酸2104或核苷酸2061，而缺失的3′边界在核苷酸3455、核苷酸3495、核苷酸3525或核苷酸3545。缺失可以是至少39个核苷酸、48个核苷酸或57个核苷酸。在某些方面，缺失可以是至少267个核苷酸、至少276个核苷酸或至少285个核苷酸。在某些方面，缺失不大于489个核苷酸、不大于459、不大于429或不大于402个核苷酸。感染性多核苷酸在nsp2区内可具有不止一个缺失。
源自VR-V7并含有缺失的感染性多核苷酸的实例公开于表2。
表2.源自VR-V7的感染性多核苷酸(SEQIDNO：1)。
多核苷酸* SEQ ID NO：1 的缺失核苷酸 ORF1缺失的 氨基酸 病毒滴度 (PFU/ml) 表型概述**
Nsp2 Δ180-323 1876-2304 563-705 - 不能存活
Nsp2 Δ242-323 2056-2304 623-705 - 不能存活
Nsp2 Δ324-434 2305-2637 706-816 +(～105) 小嗜斑
Nsp2 Δ324-523 2305-2904 706-905 +(～105-106) 中等
Nsp2 Δ543-632 2962-3231 925-1014 +(～105) 小嗜斑
Nsp2 Δ633-726 3232-3513 1015-1108 +(～105) 小嗜斑
Nsp2 Δ543-726 2962-3513 925-1108 +(～105) 小嗜斑
Nsp2 Δ727-813 3514-3774 1109-1195 +(～105) 小嗜斑
Nsp2 Δ324-726 2305-3513 706-1108 +(～101-2) ND
Nsp2 Δ324-813 2305-3774 706-1195 - 不能存活
Nsp2 Δ727-845 3514-3870 1109-1227 - 不能存活
Nsp2 Δ324-845 2305-3870 706-1227 - 不能存活
*缺失是指nsp2的氨基酸缺失，例如在病毒Nsp2Δ180-323中，nsp2的氨基酸180-323缺失。
**噬斑大小是相对于野生型VR-2332所产生的噬斑。
含有缺失的感染性多核苷酸可包括插入到缺失位置的外源多核苷酸。“外源”多核苷酸是指外源核苷酸序列，即通常在PRRS病毒或其感染性克隆中不存在的核苷酸序列。外源多核苷酸可以并优选编码多肽。合适的外源多核苷酸包括编码可检测标记的多核苷酸，所述标记例如容易通过不同方法检出的分子。实例包括可通过其荧光、酶促活力或免疫学特性而检测的荧光多肽(例如绿色、黄色、蓝色或红色荧光蛋白)、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶和其它分子(例如c-myc、flag、6xhis、HisGln(HQ)金属结合肽和V5表位)，并且通常可用于在细胞(例如培养细胞)或已经从动物中取出的组织样品中进行检测时。其它可使用的外源多核苷酸是编码由其它实体(例如细胞和病原体)所表达的多肽的多核苷酸。外源多核苷酸经表达，产生能表达外源抗原的感染性多核苷酸。外源核苷酸序列的实例包括编码由病原体所表达的蛋白质的核苷酸序列，所述病原体优选猪病原体，例如猪圆环病毒(porcinecircovirus)2型、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)(例如猪肺炎支原体P46蛋白和P65蛋白)、胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis)(例如胞内劳森菌的外膜蛋白)、不同PRRSV株的ORF5和猪链球菌(Streptococcussuis(例如猪链球菌38-kDa蛋白)。nsp2多肽具有B细胞表位并有望具有免疫原性。nsp2多肽所包含的外源表位有望导致针对外源表位的免疫应答。外源多核苷酸的额外实例包括编码生物反应调节剂的多核苷酸，所述调节剂例如IFN-α、IFN-γ、IL-12、IL-2、TNF-α和IL-6。
将外源多核苷酸插入到缺失区，使其在编码nsp1α和nsp1β可读框的读框内，并且可以例如串联方式插入不止一个外源多核苷酸，可以包含编码3个c-myc表位的核苷酸序列。含有插入到缺失位置的外源多核苷酸的感染性多核苷酸的总大小通常不大于16,000碱基、不大于15,800碱基、不大于15,600碱基、不大于15,400碱基或不大于15,200碱基(包括聚A尾)。插入可存在于具有以下缺失的感染性多核苷酸中：Nsp2Δ324-434、Nsp2Δ324-523、Nsp2Δ543-632、Nsp2Δ633-726、Nsp2Δ543-726、Nsp2Δ727-813或Nsp2Δ324-726缺失，优选Nsp2Δ324-434、Nsp2Δ543-632、Nsp2Δ633-726、Nsp2Δ543-726、Nsp2Δ727-813或Nsp2Δ324-726。在缺失位置中含外源多核苷酸的感染性克隆的优选实例包括具有编码238个氨基酸的绿色荧光蛋白编码区的Nsp2Δ324-434缺失的感染性多核苷酸，具有编码238个氨基酸的绿色荧光蛋白编码区的Nsp2Δ543-632缺失的感染性多核苷酸，具有编码10个氨基酸的c-myc表位编码区的Nsp2Δ324-434缺失的感染性多核苷酸(EQKLISEEDL，SEQIDNO：17)，具有编码10个氨基酸的c-myc表位编码区的Nsp2Δ324-434缺失的感染性多核苷酸，以及具有各含编码10个氨基酸c-myc表位的串联重复序列的编码区的Nsp2Δ324-726缺失或Nsp2Δ543-726缺失的感染性多核苷酸。
感染性多核苷酸通常存在于载体中，感染性多核苷酸和载体的组合称为感染性克隆，这是通过反求遗传学而制备的。载体是复制多核苷酸，例如质粒、噬菌体或粘粒，另一种多核苷酸可连接到所述载体上，从而使所连接的多核苷酸能复制。载体含有本发明多核苷酸的载体的构建使用本领域已知的标准重组DNA技术(参见例如Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。可提供载体用于进一步克隆(多核苷酸的扩增)，即克隆载体；或用于编码区所编码的多肽的表达，即表达载体，或其组合。术语载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、粘粒载体、或人工染色体载体。通常，载体在大肠杆菌等细菌宿主中可复制。优选的载体是质粒。
载体的选择取决于所得构建体的各种所需特征，例如选择性标记、载体复制率等。适用作为感染性克隆组成部分的优选载体同时是克隆载体和表达载体。有用的载体在宿主细胞中具有低拷贝数。克隆或表达本文的载体的合适宿主细胞是原核细胞或真核细胞。优选的宿主细胞分泌最少量的蛋白水解酶。合适的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性生物，例如大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)。用于制备、操作和维持感染性克隆的示例性宿主细胞是DH-5α、DH-1(ATCC33849)和AG-1，优选DH-1或AG-1。
载体包括与感染性多核苷酸操作性连接的调节序列。术语“操作性连接”是指组件的并置关系能允许它们按所需方式起作用。当调节序列与本发明感染性多核苷酸的连接方式使得在与调节序列相容的条件下能表达编码区时，则调节序列与本发明感染性多核苷酸“操作性连接”。通常，启动子是与RNA聚合酶高特异性结合的启动子，这类启动子包括T7、SP6和T3。通常启动子位于感染性多核苷酸第一个核苷酸的紧接上游。优选的GGT插入到启动子与感染性多核苷酸的第一个核苷酸之间。任选并优选的载体在聚A区的下游也含有肝炎delta病毒核酶。
载体任选和优选包括一种或多种选择性标记序列，该序列通常编码的分子可灭活或检测生长培养基中的化合物，或者被培养基中的化合物检测到。例如，包括选择性标记的序列可赋予转化细胞抗生素抗性，或可赋予转化细胞化合物-特异性代谢。选择性标记序列的实例是能赋予卡那霉素抗性、氨苄青霉素抗性、四环素抗性和新霉素抗性的序列。
当在感染性克隆中产生nsp2多肽编码核苷酸的缺失时，可采用本领域已知的标准重组DNA技术(参见例如Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。正如本领域技术人员所知，在构建感染性克隆(和当在感染性克隆中构建缺失)期间的标准实践是通过核苷酸序列分析所预期核苷酸序列(例如缺失或其它改变)的存在和其它突变的不存在来证实。同样，当测定候选感染性多核苷酸以确定其是否是感染性的时，标准实践是通过核苷酸序列分析污染的野生型病毒不存在来证实。
本发明也包括公开于SEQIDNO：5和SEQIDNO：6的分离的感染性多核苷酸，以及与SEQIDNO：5或SEQIDNO：6具有结构相似性的感染性多核苷酸。测定结构相似性的方法如本文所述。本发明该方面的优选的感染性多核苷酸与SEQIDNO：5或SEQIDNO：6的结构相似性为至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。如果多核苷酸存在于病毒颗粒中，而且在接触感受细胞时在感受细胞中复制并产生感染性病毒颗粒，则认为与SEQIDNO：5或SEQIDNO：6具有结构相似性的该多核苷酸就是感染性多核苷酸。
本发明也包括分离的病毒颗粒。本文所用的术语“病毒颗粒”可互换使用，是指被囊膜包围的本发明多核苷酸。本发明的病毒颗粒，当加入到培养的感受细胞中时，可复制产生更多病毒颗粒。
病毒颗粒可通过在体内或在细胞培养中传代培养。体内传代包括接种猪(Faaberg等，美国专利7,041,443)。在细胞培养中传代包括使培养细胞接触病毒颗粒并在适合病毒的条件下培养细胞，以复制并产生更多病毒颗粒。优选的培养细胞不是无限增殖化细胞系或转化细胞系(即不能无限分裂的细胞)。优选的原代猪肺泡巨噬细胞可用于在细胞培养中传代(Faaberg等，美国专利7,041,443)。
本发明的病毒可被灭活，即不能在体内复制和/或在细胞培养中复制。灭活方法是本领域已知的，包括用以下标准化学灭活剂处理本发明的病毒颗粒：例如醛试剂，例如福尔马林、乙醛等；活性酸性醇类，包括甲酚、苯酚等；酸，例如苯甲酸、苯磺酸等；内酯，例如β-丙内酯和己内酯；以及活化内酰胺、碳二亚胺和羰基二杂芳化合物，例如羰基二咪唑。紫外线和γ射线等辐射也可用于灭活病毒。
本发明也包括减毒病毒颗粒(即引起猪的神秘猪病症状的能力下降的病毒)以及制备减毒病毒颗粒的方法。产生减毒病毒的方法是本领域已知的。通常，将本发明的病毒传代，即用于感染培养细胞，让其复制，然后收获。重复该步骤，直到病毒在猪中的毒力下降。例如，可将病毒在细胞培养中传代10次，然后测定病毒毒力。如果毒力尚未下降，则将不注射到动物中的病毒在细胞培养中再传代10次。重复该步骤，直到毒力下降。一般而言，通过用病毒接种猪并评价临床症状的存在和/或LD50而测定毒力(参见例如Halbur等，J.Vet.Diagn.Invest，8：11-20(1996)，Halbur等，Vet.Pathol，32：200-204(1995)和Park等，Am.J.Vet.Res.，57：320-323(1996))。优选毒力下降，使得减毒病毒不引起动物死亡，优选不引起疾病的临床症状。
通常，用于制备本发明减毒病毒的细胞培养包括非猪哺乳动物来源的细胞。非猪哺乳动物细胞培养的实例包括例如细胞系MA-104(ATCCCRL-2378)、细胞系MARC-145(Kim等，Arch.Virol，133：477-483(1993))和细胞系CL-2621(Baustita等，J.Vet.Diagn.Invest.，5：163-165(1993))。优选将混合细胞培养用于制备本发明的减毒病毒颗粒。在混合细胞培养中，有至少2类细胞存在。优选的混合细胞培养包括无限增殖化细胞系或转化细胞系和原代细胞培养。当病毒在无限增殖化细胞系或转化细胞系中繁殖缓慢或完全不繁殖时，混合细胞培养尤其有用。用于混合细胞培养的无限增殖化细胞系或转化细胞系的优选实例包括例如细胞系MARC-145(Kim等，Arch.Virol，133：477-483(1993))和细胞系MA-104(ATCCCRL-2378)。优选用于混合细胞培养的原代细胞培养是来源于猪。用于混合细胞培养的原代细胞培养的优选实例是原代猪肺泡巨噬细胞。
本发明还包括由表2公开的多核苷酸中存在的nsp2编码区所编码的多肽，包括那些能存活的。本发明也包括抗体，包括能与表2公开的多核苷酸中存在的nsp2编码区所编码的多肽特异性结合的单克隆抗体和多克隆抗体。除非另有说明，否则术语“抗体”包括保留对靶抗原的结合活性的完整抗体的片段。这类片段包括Fv、F(ab′)和F(ab′)2片段，以及单链抗体(scFv)。可与多肽“特异性结合”的本文所用的抗体是仅与能诱导抗体合成的抗原表位相互作用的抗体，或能与结构相关表位相互作用的抗体。在合适条件下，能与表位“特异性结合”的抗体与表位相互作用，甚至在多种潜在结合靶标存在的情况下。本文所用的术语“多肽:抗体复合物”是指当抗体与多肽或其亚基或其类似物特异性结合所产生的复合物。在某些方面，本发明的抗体包括不与VR-2332所编码的全长nsp2多肽(例如Genbank检索号U87392，ORF1氨基酸384-1363(也参见Allende等，J.Gen.Virol，80：307-315(1999)或ORF1氨基酸384-1580(也参见Ziebuhr等，J.Gen.Virol，81：853-879(2000))特异性结合的抗体。可采用本领域常规方法鉴定这类抗体。
可用完整多肽制备本发明的抗体。任选本文所述的nsp2多肽可与载体多肽共价结合或缀合，以改善多肽的免疫学特性。有用的载体多肽是本领域已知的。多克隆抗体的制备是众所周知的。可通过免疫各种温血动物以及转基因动物来获取多克隆抗体，所述温血动物例如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠、仓鼠、豚鼠和大鼠，所述转基因动物例如具有免疫原的转基因的绵羊、牛、山羊或猪。可使用具有Fc结合部分(例如蛋白A等)的亲和柱，将所得抗体从其它蛋白质中分离出来。
可通过本领域技术人员熟知的各种技术获取单克隆抗体。简而言之，用所需抗原免疫的动物的脾细胞通常通过与骨髓瘤细胞融合，成为无限增殖化细胞(参见例如Antibodies：ALaboratoryManual，Harlow等编著，ColdSpringHarborLaboratoryPress：ColdSpringHarbor，NewYork，(1988))。可通过本领域众所周知的技术，从杂交瘤培养物中分离并纯化单克隆抗体。
在某些实施方案中，可通过噬菌体展示或组合方法，重组产生抗体。噬菌体展示和组合方法可用于分离重组抗体，这类抗体能与本文所述多肽或其生物活性亚基或其类似物结合(参见例如Ladner等，美国专利号5,223,409)。这类方法可用于产生人类单克隆抗体。
本发明也提供组合物，该组合物包括感染性多核苷酸、PRRS多核苷酸、病毒颗粒或本发明的抗体。这类组合物通常包括药学上可接受的载体。本文所用的“药学上可接受的载体”包括与给药相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。也可将额外的活性化合物掺入到组合物中。
可采用药学领域众所周知的方法制备组合物。一般而言，可配制与计划给药途径相容的组合物。给药途径的实例包括灌注和胃肠外(例如静脉内)、皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(局部)和经粘膜给药。溶液剂或混悬剂可包括以下成分：无菌稀释剂，例如给药用水、盐水、固定油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌药物，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如1，2-乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如醋酸、柠檬酸或磷酸；电解质，例如钠离子、氯离子、钙离子和镁离子，以及调节渗透压的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可用盐酸或氢氧化钠等酸或碱调节pH。可将组合物装入安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多剂量小管内。
组合物可包括无菌水溶液剂(当为水溶性时)或分散剂和无菌粉针剂，其可用于在临用时制备无菌溶液剂或分散剂。对于静脉内给药，合适载体包括生理盐水、抑菌水(bacteriostaticwater)、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ.)或磷酸缓冲盐(PBS)。组合物通常是无菌的，当适于注射用时，应该是容易注射的流体。在生产和贮存条件下应当稳定，并能阻止细菌和真菌等污染微生物的活动。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物。通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)可以预防微生物的作用。在许多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以达到注射用组合物的延长吸收。
可通过将所需量的活性化合物(即本发明的感染性多核苷酸或PRRS病毒)掺入到合适溶剂中，并视需要加入一种上述成分或其组合，然后进行除菌过滤，制备无菌溶液剂。通常，通过将活性化合物掺入到无菌溶媒中，制备分散剂，其中含有基础分散介质和其它所需的上述成分。就用于制备无菌注射用溶液剂的无菌粉针剂而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，自先前无菌过滤的溶液剂得到活性成分和任何额外所需成分的粉针剂。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。为了口服治疗用目的，可将活性化合物与赋形剂混合，用于片剂、糖锭剂或胶囊剂(例如明胶胶囊剂)形式。这些组合物也可制成粉剂或悬浮于水溶液剂中，使这些粉剂和/或溶液剂可添加到动物饲料或动物饮用水中。可用各种已知试剂使这些组合物有适当甜味或香味，以便让猪口服摄取疫苗。
也可通过适于给予多核苷酸制剂的任何方法给予活性化合物，所述方法例如使用基因枪、生物注射器和皮肤贴剂以及无针头的方法，例如以下文献中公开的微粒DNA疫苗技术：Johnston等(美国专利号6,194,389)。另外，可以采用鼻内给药，参见例如Hamajima等，Clin.Immunol.Immunopathol.，88：205-210(1998)。也可使用脂质体和微胶囊。
可将活性化合物与可保护化合物、防止其从体内快速消除的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。可用标准技术制备这样的制剂。材料也可得自市售来源，例如AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals，Inc.。脂质体混悬剂也可用作药学上可接受的载体。可按本领域技术人员已知方法制备它们。
可通过标准药学方法，在细胞培养中或实验动物体内测定这类活性化合物的毒性和疗效，例如测定LD50(50％群体死亡的剂量)和ED50(50％群体有疗效的剂量)。毒性和疗效间的剂量比率就是治疗指数，可表示为LD50/ED50的比值。优选表现出高治疗指数的化合物。
得自细胞培养测定和动物研究的数据可用于描述剂量范围，用于本领域。这类化合物的剂量优选在包括无毒性或几乎无毒性的ED50的循环浓度范围内。在该范围内的剂量变化取决于所用剂型和所用给药途径。
组合物可每天给予一次或多次至每周给予一次或多次，包括每隔一天一次。熟练技术人员将会知道某些因素会影响有效治疗患者所需的剂量和时间，所述因素包括但不限于疾病的严重程度、先前的治疗、患者的总体健康状况和/或年龄和所患有的其它疾病。此外，用有效量多肽对患者进行治疗，可包括单次治疗或优选包括系列治疗。
本发明包括使用本文所述组合物的方法。一方面，本发明包括治疗动物的神秘猪病的一种或多种症状的方法，所述动物可能因PRRS病毒感染而引起神秘猪病。该方法包括将有效量的本发明组合物给予动物，所述动物患有神秘猪病或具有神秘猪病症状，或有患上该病的危险。
对神秘猪病或神秘猪病症状的治疗可以是预防性的，或者，可以在疾病或其症状发展之后开始治疗。本文所用的术语“症状”是指神秘猪病患者的客观证据。神秘猪病相关症状和对所述症状的评价在本领域是常规和已知的。症状实例包括流产、厌食、发热、嗜睡、肺炎、耳朵变红/蓝、呼吸困难和呼吸率增加(呼吸急促)。预防性治疗是在PRRS病毒引起的疾病症状出现之前开始，在本文中是指对处于疾病或其症状发展的“危险”中的患者的治疗。通常，动物“处于危险中”就是动物存在于这样的区域中：其中患有疾病或其症状的动物已经诊断出和/或有可能接触PRRS病毒。因此，在本文所述病症出现之前、期间或之后给予组合物。在病症发展之后开始的治疗可使一种病症的症状的严重程度减少或完全消除症状。
在某些方面，方法通常包括给予动物包含有效量的本发明病毒颗粒的组合物。“有效量”是有效预防神秘猪病症状表现、降低疾病症状的严重程度和/或完全消除症状的用量。通常，有效量是在未来接触PRRS病毒期间能产生保护动物的体液免疫应答和/或细胞免疫应答的用量。用于组合物的病毒颗粒可含有具有本文所述的缺失的感染性多核苷酸。任选感染性多核苷酸也包括存在于缺失位置的外源多核苷酸。使用具有缺失(或缺失位置上存在外源多核苷酸)的病毒颗粒的优势是：可以容易地与其它PRRS病毒(包括在野外存在的野生型PRRS病毒)区分开来。可通过从动物中分离病毒，然后进行测序、限制酶消化或基于PCR的特定核苷酸扩增，来鉴定病毒颗粒。这样的“标记”病毒颗粒在本领域通常称为标记疫苗。
在本发明的其它方面，本文所述的感染性克隆和/或感染性多核苷可用于研究活性基因插入，用于研究替代表达的RNA或蛋白质(而不是全长病毒)，用于研究病毒重组并可针对截短nsp2来研究全长nsp2的免疫原性特性。
实施例
实施例1
开发了北美猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)原型VR-2332株的全长cDNA克隆，其中相对wt株VR-2332各改进形式比最初形式具有更少的核苷酸改变。回收并分析各感染性克隆的后代病毒，用于核苷酸序列验证，体外生长率和噬斑大小。经证实来自一个感染性克隆的后代能在体内大量复制，因为它们和α-PRRSV抗体的反应速率与wt病毒相同。对体内后代进行RNA印迹分析也表明，缺陷的亚基因组RNA(称为畸形(不常见形式))与全长基因组一起存在。对感染的MA-104细胞培养的传代系列进行并行RNA印迹分析表明，重组病毒仅能逐渐得到与体内感染中所见RNA相似的全长RNA和畸形RNA的分布型(profile)。
材料与方法
细胞和病毒株。MA-104细胞或其后代MARC-145细胞(ATCCCRL-11171)是一种支持PRRSV复制的非洲绿猴肾上皮细胞系(Meng等，J.Vet.Diagn.Invest，8：374-81(1996))，将这类细胞系在37℃/5％CO2下维持在补充1mg/mlNaHCO3和10％胎牛血清(FBS)的Eagle氏最低必须培养基(EMEM)(JRHBiosciences56416)中。当单层生长达到70-80％长满时，用RNA转染培养细胞或用病毒感染培养细胞。PRRSV北美原型VR-2332株和IngelvacMLV先前已有描述(Yuan等，VirusRes.，79：189-200(2001))。在这两种细胞系中，VR-2332株都培养至相同滴度。
病毒RNA纯化。如以下文献所述，纯化病毒RNA(vRNA)(Chen等，J.Gen.Virol.，75：925-930(1994)；Yuan等，VirusRes.，79：189-200(2001))。简而言之，在感染后(p.i.)4天从感染VR-2332的MARC-145细胞中收获上清液。于12,000rpm离心除去细胞碎片之后，将上清液铺在2ml0.5M蔗糖垫上，于76,000xg离心4小时。沉淀的病毒体重悬于0.5mlLES(0.1MLiC1/5mMEDTA/1.0％SDS)中，再于56℃加入100μg蛋白酶K进一步消化以除去所有蛋白质。10分钟孵育后，用酸性苯酚和苯酚/氯仿提取vRNA提取几次，再在70％v/v乙醇中沉淀。沉淀的vRNA立即重悬于50μlH2O或无RNase的TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)中，贮存于-80℃。
全长病毒cDNA的构建。用EnhancedAvianHSRT-PCR试剂盒(Sigma，HSRT-100)进行cDNA合成。用8种PCR引物(表3)扩增涵盖完整VR-2332基因组的4种重叠cDNA片段(图2)。循环条件为94℃2分钟，然后在94℃15秒，在68℃4-5秒，再在68℃5分钟的35次循环。各PCR片段用QIAEXII凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化并用TOPOTACloning试剂盒(InvitrogenK450001)克隆到pCR2.1-TOPO载体中。对提供各片段的质粒进行核苷酸序列分析。与亲本VR-2332序列(GenBank提交号U87392)相比具有最少核苷酸突变的片段用于装配全长cDNA，如图2所示。在每个重叠区，唯一的限制酶位点用于连接侧接片段。4个消化片段(代表全长基因组序列)逐步准确装配成修饰的低拷贝质粒载体(pOK12HDV-PacI)。通过将含有HDV反基因组(antigenome)核酶的244bpSmaI至SacII片段和来自转录载体2.0(Johnson等，J.Virol，71：3323-3327(1997)；Pattnaik等，Cell，69：1011-1020(1992))的T7RNA聚合酶终止序列插入到pOK12的相应位点(Vieira等，Gene，100：189-194(1991))，修饰载体使其包含HDV核酶。通过用以下引物组进行寡核苷酸突变，再通过融合PCR，使该244bp片段中的Ncol限制酶位点被唯一的PacI位点取代：5′pOK12HDV-2157/3′pOK12HDV-257和5′pOK12HDV-257/聚A-修饰(表3)。在全长cDNA克隆中，病毒基因组序列的前面是T7RNA聚合酶启动子，1个或2个G残基和T残基，接着是50个核苷酸的聚腺苷酸尾。装配的克隆在大肠杆菌的DH5α株中繁殖，然后进行全基因组核苷酸序列证实。
表3.用于该项研究的寡核苷酸引物。正向引物在名称后面用斜线(/)表示，反向引物的前面加有斜线。插入的限制酶位点用带下划线的斜体表示。
*基因组位置基于GenBankSubmissionU87392
全长cDNA克隆的修饰和序列分析。使用QuikChange多位点定向诱变试剂盒(Stratagene)修饰来自pVR-V4至pVR-V6G7475A的所有cDNA克隆。然后将全基因组cDNA质粒插入序列提交给明尼苏达大学高级遗传分析中心(UniversityofMinnesotaAdvancedGeneticAnalysisCenter，AGAC)进行核苷酸序列分析，使用合适的测序引物(表3)。pVR-V4至pVR-V6G7475A之间，以及与亲本VR-2332、其相应的减毒疫苗株InglevacMLV和pVR-HN、VR-2332的第一感染性克隆之间的序列差异，列于表4(Nelsen等，J.Virol.，73：270-80(1999)；Yuan等，VirusRes.，79：189-200(2001)；Nielsen等，J.Virol.，77：3702-3711(2003))。
表4.PRRSV株与VR-2332感染性克隆间的核苷酸差异。仅显示记录核苷酸差异的位置。VR-2332株显示的核苷酸用无阴影框表示。浅阴影框表示对感染性克隆而言是独特的核苷酸差异，中等阴影框表示也在IngervacMLV中可见的核苷酸，而黑阴影框表示猪的独特核苷酸。未测序区用斜线表示。
*负的碱基是指在转录后存在于RNA中的核苷酸，它们来自感染性多核苷酸紧接上游的RNA聚合酶启动子。在传代9次后，这些来自启动子的核苷酸在感染性多核苷酸中通常不再存在。
体外转录。用PacI切割聚(A)尾下游，使全长cDNA克隆成为线状。用mMESSAGEMACHINETM试剂盒(Ambion)和优化的2∶1比例的类似于GTP的甲基化帽，产生加帽的[m7G(5′)ppp(5′)G帽类似物]RNA转录物。在20-μl反应混合物中，从2μgDNA模板中产生约50-60μgRNA。增加类似于GTP的帽的比率显著降低RNA收率。然后通过酸性苯酚-氯仿、再用异丙醇沉淀，纯化RNA并重悬于无核酸酶的TE缓冲液(pH8.0)中。通过在1％乙二醛变性琼脂糖凝胶上与野生型VR-2332病毒RNA比较大小，来评价RNA的质量，并通过在OD260的分光光度法进行定量测定。
MARC-145细胞转染。根据Nielsen(Nielsen等，J.Virol，77：3702-3711(2003))所述方法，产生改良的转染方法。对于转染，将MARC-145细胞接种到6孔板(2-3×105细胞/孔)中的3ml完全培养基[补充10％胎牛血清(FBS)的EMEM]中，并在37℃/5％CO2孵育20-24小时，直到约80％长满(Collins等，J.Vet.Diagn.Invest.，4：117-126(1992))。将在500μlOpti-MEMI还原型血清培养基(Invitrogen)中稀释的4μg体外转录的RNA和在1mlOpti-MEM培养基中稀释的2μl溴化1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基铵和胆固醇(DMRIE-C；Invitrogen)混合在一起并短时涡旋震荡。MARC-145细胞用2mlOpti-MEM培养基洗涤1次，然后立即用脂质：RNA复合物溶液覆盖。用不含RNA的DMRIE-C(2μl)作为阴性对照，用含10-100ng(野生型)wtVR-2332株纯化病毒RNA的DMRIE-C作为阳性对照。接触脂质：RNA复合物4小时之后，洗涤单层并加入新鲜完全培养基(含10％FBS的EMEM)。每天监测转染细胞的上清液，看是否出现致细胞病变效应(CPE)，并在转染后72-96小时传代到新鲜MARC-145上。
后代病毒RNA的检测。为了检测后代病毒RNA，收获转染和感染的MARC-145细胞的细胞培养上清液。用QiaAmp病毒RNA试剂盒(Qiagen)分离RNA。选用对VR-2332株核苷酸具有特异性的引物对进行RT-PCR，所述核苷酸指示感染性克隆突变的残基(表3)。通过对RT-PCR产物中存在的克隆特异性核苷酸的核苷酸序列证实，获得感染性克隆后代的确认。
后代病毒核壳蛋白的检测。用间接免疫荧光测定(IFA)检测体外转录RNA转染的MARC-145细胞中或后代病毒感染的MARC-145细胞中的病毒蛋白表达，所述细胞是在盖玻片上制备的。在室温下将感染的细胞在3.7％低聚甲醛的磷酸缓冲盐水(PBS)溶液(pH7.5)中固定10分钟。固定的细胞用PBS洗涤，在PRRSV核壳蛋白特异性的单克隆抗体SDOW17(Magar等，Can.J.VetRes.，59：232-234(1995))中于37℃孵育45分钟，再与缀合了异硫氰酸荧光素的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)(Sigma)于37℃孵育45分钟(1∶100稀释)。盖玻片用PBS洗涤，用凝胶封固油封固在玻片中，在荧光显微镜下观察。
病毒噬斑测定。用转染或感染的MARC-145细胞的细胞上清液(10倍稀释)感染6孔板上的MARC-145细胞单层，并在室温下孵育1小时。然后用新鲜EMEM/10％FBS洗涤感染的单层，立即用1XMEM(SigmaM4144)/10％FBS/2％(w/v)NaHCO3/1X谷氨酰胺/1X非必须氨基酸/10mMHEPES/2％(v/v)庆大霉素中的无菌1％SeaPlaque琼脂糖(BioWhittakerMolecularApplications，Rockland，Maine)覆盖，并在37℃/5％CO2中反转孵育5天。仔细去除琼脂糖后，将细胞用5％结晶紫的20％乙醇溶液染色10-30分钟，以观察噬斑大小。
病毒生长曲线。用无血清EMEM稀释的亲本或重组PRRSV，按0.001的感染复数(MOI)接种T-75瓶中的MARC-145单层。在室温下轻轻搅拌并连接1小时之后，移出接种物，将单层用无血清EMEM洗涤3次。洗涤之后加入4ml完全培养基，然后将瓶子在37℃/5％CO2下孵育至多5天。在加入培养基后立即(0小时时间点)和24、48、72、96和120小时分别收获等分试样(0.5ml)并贮存于-80℃。连续稀释的样品用于感染新鲜MARC-145细胞，再如上所述地处理细胞。除去琼脂糖之后，观察噬斑并计数。生长曲线结果用PFU/ml表示。
后代病毒的体内接种。将来自PRRSV-血清阴性群体的10只混合品种和混合性别的4周龄猪分成3组，每组2头。第一组接受103.550％组织培养感染性剂量(TCID50)的克隆病毒(pVR-V5，在MARC-145细胞上第3代)/ml，第二组接受105.4TCID50/ml亲本病毒株VR-2332(在MARC-145细胞上第4代)，而第3组是接种EMEM的对照(mock)。所有动物经肌内注射接受2ml接种物。整个实验中将动物关在单独房间里，每天观察临床病征。在感染后28天处死所有猪。为了回收病毒，单个血清样品用不完全EMEM稀释5倍，在室温下放置在新鲜MARC-145单层上1-2小时，同时轻轻搅拌。再移出接种物，加入完全EMEM。将感染的细胞在37℃/5％CO2中孵育，每天观察。一旦CPE明显时，将感染细胞上清液在-80℃冷冻，直到进行进一步表征。
RNA印迹分析。将pVR-V6G7475A转录物转染到MA104细胞中，然后在新鲜细胞上传几代。对于随后的RNA印迹分析，将来自第1代(P1)、P3、P6、P8和P10的上清液稀释1∶50，然后在同一天用于感染细胞(1ml/T75瓶)。同时，将感染的猪血清稀释10倍，用于(1ml)感染单独的T75瓶。感染后3天所有瓶内都可见致细胞病变效应。按照先前(Nelsen等，J.Virol，73：270-80(1999))所述，用RNeasyMidi试剂盒(Qiagen)提取胞内RNA，然后在乙二醛变性凝胶上电泳(electrophoresce)(15μg/样品)。让pVR-V6G7475转录RNA(100ng)跑电泳，作为对照。按照先前(Nelsen等，J.Virol，73：270-80(1999))所述，将RNA转移至0.45微米MagnaGraph尼龙转移膜(Osmonics)后，用标记的寡核苷酸/1a-p222(用多核苷酸激酶(Promega)末端标记γ-32P-ATP(Amersham))检测该膜。
后代病毒的核酸序列分析。对于用QIAmp病毒RNA小试剂盒(Qiagen)分离的病毒RNA，用SMARTMRACEcDNA扩增试剂盒(BDBioscience)或5′-或3′-FullRaceCoreSet(TaKaRaBioInc)进行cDNA端5′-和3′-快速扩增(RACE)。从引物对的RT-PCR产物中确定残余核苷酸序列，开发该引物对以覆盖VR-2332株的全基因组(表3)，如先前所述(Yuan等，VirusRes，79：189-200(2001))。将产物提交给明尼苏达大学高级遗传分析中心，用于核酸序列测定。用Lasergene序列分析软件SeqMan套(DNASTAR，Inc.)，将具有至少3重覆盖的完整病毒序列进行初步组合，并进一步使用GCGWisconsinPackage10.3版软件(AccelrysInc.)进行分析。在所有与重组病毒株的核苷酸比较中都使用VR-2332株(GenBank检索号U87392)、IngelvacMLV株(GenBank检索号AF066183)和cDNA克隆pVR-HN(GenBank检索号AY150564；Nielsen等，J.Virol.，77：3702-3711(2003))。
结果
pOK12载体的修饰。pOK12(GenBank检索号AF223639；Vieira等，Gene，100：189-194(1991))是一种低拷贝克隆载体，通过用SmaI(酶位点在pOK12的273bp)和SalI(位点在307bp)消化，并插入含有肝炎delta病毒(HDV)核酶的载体2.0(7)的244bpSmaI-SalI片段，从而修饰pOK12。再通过现有KpnI位点(pOK12HDV位点在273bp)的诱变，进一步修饰载体(pOK12HDV)，以通过利用引物对5′-pOK12HDV-257SphIPacI/3′-pOK12HDV-257SphIPacI而插入PacI限制酶位点。加入HDV核酶，从而在聚A尾的3′端提供有效而准确的切割。研究表明修饰并非获得感染性后代病毒所必须的。
全长cDNA克隆的构建。克隆策略见图2。使用指定引物对，通过RT-PCR，从纯化VR-2332病毒RNA扩增4个重叠基因组片段(图2，表3)。将各片段分别克隆到pCR2.1-TOPO载体中，产生中间克隆pCR-SphI-FseI(区段I)、pCR-FseI-AvrII(区段II)、pCR-AvrII-BsrGI(区段III)和pCR-BsrGI-PacI(区段IV)。再按照克隆名称所示，用2种独特的限制酶消化cDNA克隆。对4个片段进行凝胶纯化，逐步连接到载体pOK12HDV-PacI上，产生PRRSV全长cDNA克隆(pVR-V4)。在全长cDNA克隆中，病毒基因组序列由T7RNA聚合酶启动子驱动，随后是50个核苷酸的聚腺苷酸尾。当转染感受细胞时，克隆pVR-V4的RNA转录物不表现出典型PRRSV感染性，尽管在几次传代中可检出病毒RNA。当与VR-2332株进行比较时，检出导致21个氨基酸变化的总共45个核苷酸突变(表4，表5)，尽管若干突变与先前在IngelvacMLV中鉴定的相同(Yuan等，VirusRes.，61：87-98(1999))。
表5.PRRSV株与VR-2332感染性克隆间的氨基酸差异。仅显示记录核苷酸差异的位置，以及已鉴定基因组区内相应的氨基酸位置。VR-2332株显示的氨基酸用无阴影框表示，与VR-2332相同的感染性克隆氨基酸用空框表示。各单框内的文本代表因表2所示核苷酸差异而导致的沉默改变或氨基酸改变。浅阴影框表示感染性克隆独特的核苷酸差异，中等阴影框表示也在IngervacMLV中可见的核苷酸，而黑阴影框表示猪的独特核苷酸。斜线隔开的氨基酸表示ORF2a/ORF2b氨基酸数目。未测序区用斜线表示。
因为pVR-V4中许多突变发生在编码推定的解旋酶、聚合酶和其它Nidovims基序(图3，表4)的关键区，所以产生基因组区段III的额外克隆(pCR-AvrII-BsrGI)并完全对其测序。用所得的大多数序列准确片段替代pVR-V4的区段III之后，我们再测定完整基因组全长克隆(pVR-V5)的核苷酸序列。除了取代区和4个自发突变(核苷酸1595、13860、14336和14404)之外，这两个基因组克隆是相同的(表4)。对pVR-V5进行序列分析表明，与VR-2332株相比，该克隆包含总共23个突变。在这23个突变中，仅8个核苷酸突变编码氨基酸变化，5个氨基酸残基突变与IngelvacMLV相同，因此预测对体外复制没有不利影响(表4)。
分别使用引物13860C2T/和14979A2G/，对基因组区段IV进行定点诱变以修复核苷酸13860和14979，得到克隆pVR-V6。这两个核苷酸的突变将会矫正GP5的氨基酸残基25(L→F)和核壳蛋白的残基31(T→A)。对克隆pVR-V6进行序列分析证实，与pVR-V5相比，核苷酸已经矫正回复到野生型(wf)VR-2332核苷酸，而且未导致基因组内的任何其它核苷酸改变(表4和表5)。最终，用寡聚物7475G2A，对pVR-V5和pVR-V6两者的基因组区段III进行定点诱变，以便矫正来自wtVR-2332的nt7475上的变化。nt7475上G→A的变化导致两个重组克隆中的ORF1氨基酸2429的甘氨酸(G)变为亲本VR-2332病毒株中可见的谷氨酸(E)。最终再次对2个克隆pVR-V5G7475A和pVR-V6G7475A进行完全测序，发现分别与原始重组质粒pVR-V5和pVR-V6相比仅有一个(nt7475)改变(表5)。因此，pVR-V6G7475A除了含有在IngelvacMLV中可见的变化之外，还含有11个核苷酸变化，而没有与VR-2332株不同的氨基酸变化。
正如图3所示意的最终构建体(pVR-V6G7475A)以及表4和表5中详述的，所有全长克隆在基因组中仍然零散分布有核苷酸改变，主要在未充分了解的ORF1区。然而，推测阻止pVR-V4完全进行病毒复制的大群ORF1b核苷酸变化在全长基因组克隆的后期形式被修复。仅有一个核苷酸突变(nt11329编码G3739A突变)在pVR-V5ORF1b和后期克隆中保留，而且该突变不阻止IngelvacMLV在培养细胞中有效感染和复制。表4和表5也显示先前公开的感染性克隆pVR-HN的残基信息(Nielsen等，J.Virol，77：3702-3711(2003))，显示出在动物体内复制。pVR-HN中残基数量大幅度增加(15个核苷酸)，直接表明IngelvacMLV超过最终构建体pVR-V6G7475A的序列(7个核苷酸)。
重组病毒的表征。产生各cDNA克隆的全长RNA转录物。转染cDNA转录物或wtVR-2332病毒RNA(vRNA)的MARC-145细胞产生CPE，其特征是在转染后48-72小时细胞聚集，然后裂解。重组转录物引起的CPE被延迟，并且与wtVR-2332vRNA所引起的CPE有些不同，后者的CPE表现为大量聚集、脱落和破裂。在转染后96小时，转染VR-2332vRNA的大多数细胞都经历裂解并从培养板上脱落，而来自体外克隆的RNA转录物转染的细胞中CPE则没有那么严重。
从转染细胞中收获病毒(PO)，等分试样(用培养基将10μl稀释至1ml)用于感染MARC-145细胞，用于后代病毒扩增。检测CPE之后，再次收获病毒(P1)，等分试样用于再感染MARC-145细胞。细胞上清液中的重组病毒(P2)用于病毒RNA纯化，将其再次用于获得RT-PCR片段，使用引物对5′-6800/3′-ORF1b(nt6796-7614)和P51/05P4(nt13757-14341)。提交所得PCR片段用于核苷酸序列分析，以证实所见的感染性是因为转染的感染性构建体的全长RNA转录物，而不是因为污染wt病毒。在来自pVR-V5的后代病毒中可见在残基7329、7475、7554和13860核苷酸差异的核苷酸突变，而在来自pVR-V5G7475A的病毒中检出7329、7554和13860。同样，在pVR-V6后代中检出在残基7329、7475和7554的突变，而在来自pVR-V6G7475A的病毒中检出7329和7554的突变(表4和表5)。在来自wtvRNA转染的P2病毒中未见到相应突变。
重组病毒的免疫荧光分析。使用直接免疫荧光测定，检测PRRSV核壳蛋白在感染的MARC-145细胞中的表达。通过该方法，所有感染重组病毒转录物(P2等)以及vRNA的细胞都是阳性的。按照先前Rowland等(VirusRes.，64：1-12(1999))的报道，核壳蛋白的大量核仁积聚非常明显。
来自pVR-V5的重组病毒的体内感染。从用cDNA克隆pVR-V5的RNA转录物转染的MARC-145细胞的P3中回收重组病毒，将该病毒接种到仔猪中，与wtVR-2332、疫苗病毒IngelvacMLV和盐水(阴性对照)平行。在感染后第0、3、5、7、14、21和28天采血并通过HerdChekPRRS2XRELISA(IDEXX)分析血清转化和病毒回收。在28天，所有感染动物的血清转化动力学都大致相同，表明pVR-V5重组病毒在体内复制良好(图4)。在实验过程中所有动物都缺乏临床病征，但意想不到的是，wt株VR-2332在仔猪中往往不产生明显疾病并仅在短时间内(通常在感染后14天)导致淋巴结增大。
用pVR-V5(Sw612)后代感染动物，在感染后14天采集血清样品，用于感染新鲜MARC-145单层，用于回收体内传代的重组病毒。正如先前所述，来自克隆pVR-V5RNA转录物体外转染的病毒仅引起最小CPE(证据是感染细胞的聚集)，而从第14天的实验动物血清回收的病毒却在感染后96小时引起典型CPE(细胞聚集，脱离和破坏)。这表明，当pVR-V5在体内复制时，病毒基因型或表型已经发生变化。
为了阐明表型出现明显变化的原因，对从一头猪(Sw612)回收并在MARC-145细胞中传代一次以扩增Sw612后代的病毒进行全基因组序列分析(图3、表4和表5)。当与用于感染猪的病毒pVR-V5相比时，在Sw612中保留了17个感染性cDNA克隆-特异性核苷酸变化，其中有些也可见于IngelvacMLV(7/17核苷酸)。在来自体内感染的病毒中未观察到存在于原始pVR-V5克隆转录物5′端的两个非病毒G残基和紧接着的T残基。在核苷酸位置9958(R)、14336(Y)和15411(Y)可见简并性。在位置9958的wtVR2332样核苷酸(G)显示出与IngelvacMLV样核苷酸(A)的简并性。这种变化分别导致甘氨酸残基向谷氨酸残基突变(表2)。在位置14336，检测到感染性克隆-特异性碱基(C)和wtVR-2332-特异性碱基(T)的简并性，这反映沉默突变。发生了另一突变(nt7475)，其中在G残基回复成wt残基A。然而，还有另外5个核苷酸差异(nt102、827、1379、14686和15411)，在在该项研究的任何其它病毒中都未观察到。核苷酸102位于前导序列内，尽管不被翻译。然而，如果前导序列被翻译出来的话，所编码的ORF(VR-2332核苷酸1-100)将会延长一个氨基酸残基(W)。在残基827和1379的突变导致ORF1a突变，这两种情况都会导致wtVR-2332所编码的丙氨酸变为Sw612的缬氨酸。在pVR-V5的nt7475上的鸟嘌呤残基已经突变成wt的腺嘌呤。这导致G3294A非保守氨基酸突变，其位于ORF1a预测的蛋白酶切割产物NSP7中，而该基因组区迄今为止尚没有确定功能。位于ORF6的核苷酸14686显示出从wtVR-2332的鸟嘌呤变为Sw612的丙氨酸，但仍编码甘氨酸。其它独特核苷酸变化发生在病毒序列(nt15411)3′顶端，在聚A尾开始之前。在此情况下，先前保守胸腺嘧啶残基与胞嘧啶残基具有简并性。这些基因变化，尽管有很多信息，但都没有直接揭示所观察到的生长表型变化的原因。然而，它的确揭示了PRRSV体内复制的错误特性并表明来自wtVR-2332的适度不同的病毒基因组序列可以有效复制(图3)。
病毒噬斑大小的比较。在MARC-145细胞上，在感染后120小时平行进行重组病毒和wtVR-2332的噬斑大小测定(图5A)。VR-2332株形成的噬斑大小平均为3mm，而pVR-HNcDNA克隆的第3代形成稍小的噬斑(平均2.5mm)。相比之下，来自pVR-V5和pVR-V6的重组病毒仅获得微小噬斑，而且仅能通过显微镜检才可见(图5A)。从克隆pVR-V5G7475A和pVR-V6G7475A回收的重组病毒所形成的噬斑，其平均大小分别为1.5mm和2mm。然而，在另一种测定中，从来自VR-FLV5的重组病毒的体内感染回收病毒后代(Sw612)，其产生的噬斑要大得多，大致等于来自WtVR2332的噬斑大小和数量(图5B)。
仅保留最小体积的含有各重组病毒的细胞上清液。因此，为了充分检查核苷酸变化对决定噬斑大小的作用，我们将来自pVR-V5、pVR-V6、pVR-V5G7475A和pVR-V6G7475A的新鲜RNA转录物，转染到MARC-145细胞中(称为第二谱系)。感染后5天，再次分析各感染性克隆的第3代病毒的噬斑大小，并与wtVR-2332、VR-HN和Sw612病毒进行比较。与先前的噬斑测定不同，所有噬斑大小看来都类似，而得自pVR-V5、pVR-V6、pVR-V5G7475A的重组病毒仅比体内来自wtVR-2332、Sw612和pVR-V6G7475A病毒的噬斑稍小一些(图6A)。然而，重组病毒并没有直接模仿真实的病毒感染，因为与wtVR-2332或与已经猪(Sw612)传代的pVR-V5重组病毒相比，其滴度低约10倍(图6B)。
第一和第二谱系病毒制备物的核苷酸序列分析。对接种到猪(V5-1-P3)中的来自pVR-V5的第3代病毒进行有限的核苷酸序列分析(因为病毒贮液的限制)，并且对以上获得的来自pVR-V5的第3代病毒(V5-2-P3)进行完全核苷酸序列分析，从而揭示噬斑大小差异的遗传原因。这些分析表明，两个单独制备的V5病毒在5′端有序列差异(表4)。产生微小噬斑的病毒(V5-1-P3)没有外源5′-端核苷酸，如wt株VR-2332的核苷酸序列所示，而产生较大噬斑的病毒(V5-2-P3)在5′端具有4个非模板胸腺嘧啶残基(表4)。我们所能得到的残留的V5-1-P3病毒核苷酸序列与V5-2-P3病毒、以及亲本克隆的核苷酸序列准确匹配。然而，V5-2-P3病毒的全序列分析表明，病毒在若干基因组位点表现出核苷酸简并性。当分析第2谱系病毒VR-FLV5G7475A-P3和VR-FLV6G7475A-P3的有限区域时，也得到类似发现。这最后2个感染性克隆后代显示不同的5′-端并表现出序列的简并性。
病毒生长曲线。用MARC-145细胞和第3代病毒(第二谱系)同时完成一步病毒生长曲线测定(图7)。从pVR-V5、pVR-V5G7475A、pVR-V6和pVR-V6G7475A和pVR-HN回收的重组病毒表现出类似的一步病毒生长率，但是它们的复制峰值全都明显低于wt株VR-2332和Sw612，pVR-V5的体内后代。另外，与来自pVR-V5G7475A和pVR-V6G7475A的病毒相比，来自pVR-V5、pVR-V6和pVR-HN的重组病毒制备物的复制率有所降低。除了IngelvacMLV中可见的改变之外，最后两个感染性克隆分别只编码13个和11个核苷酸差异，导致与wtVR-2332序列不同的2个和0个氨基酸改变。这些数据表明，只具有来自VR-2332及其减毒后代IngelvacMLV的11个核苷酸变化的病毒，在复制上有某些缺陷。相比之下，所得wtVR-2332和Sw612病毒的滴度比未在猪体内传代的重组病毒的滴度高出约6-15倍(图7)。
vRNA的RNA印迹分析。PRRSV缺陷sgRNA先前鉴定为畸形亚基因组RNA(拉丁语：不常见形式)，已经显示出是PRRSV感染的成分，而且不能通过例如以低感染复数培养细胞传代或蔗糖梯度离心的标准方法与全长病毒基因组分离(Yuan等，Virology，275：158-169；30(2000)；Yuan等，VirusRes.，105：75-87(2004))。为了研究全长cDNA基因组克隆体外转录期间是否产生或在随后转染/感染之后出现PRRSV畸形，进行RNA印迹分析。使用全长RNA转录物和从转染的MA-104细胞中产生的病毒的第1、3、6、8和10代的10μl上清液(1∶100稀释)，接种装有新鲜MA-104细胞T-75瓶，同时加入1∶10稀释的Sw612血清(2ml总计/瓶)。4天后，收获胞内PRRSVRNA，将15μg各制备物通过变性琼脂糖凝胶电泳分离，并转移至尼龙膜上。当RNA交联后，将膜用与ORF1a5′端互补的选择用于全长VR-2332基因组以及畸形(/1a-222；29)的32P-放射性标记探针杂交。如图8所示，RNA转录物大部分为单条带，以全长vRNA形式迁移，而第1代和以后的PRRSVRNA则同时以全长和先前鉴定为畸形的亚基因组大小形式迁移。另外，杂交强度逐代增加。因为在同一时间点从等体积的感染细胞上清液中收获病毒，该观察结果表明，vRNA随时间变化而在复制上更加有效。最后，在将Sw612所产生的病毒与细胞培养所产生的病毒相比时，RNA条带模式无法区分，这充分表明在体外和体内容易形成和复制缺陷RNA，因此是PRRSV感染的天然组成部分。
讨论
理论上，病毒的感染性cDNA克隆应当与亲本序列相同，以便产生能模拟野生型感染的反求遗传系统。进行了大量努力，以产生完全忠实的PRRSVVR-2332株基因组，但是因为在若干位点有无法预测的自发突变，所以我们尚未成功地产生这样的感染性克隆：其与我们实验室测序的wt株VR-2332没有差异。该项研究所用的高保真DNA聚合酶可以减少人工突变，但是在逆转录过程中不能避免这样的突变(Malet等，J.Virol.Methods，109：161-70(2003))。另外，PRRSV表现出惊人的病毒进化和株系变异这一事实(Chang等，J.Virol，76：4750-6(2002)；Murtaugh等，Adv.Exp.Med.Biol，440：787-94(1998)；Yoon等，Adv.Exp.Med.Biol，494：25-30(2001))容易以高频率结合，导致株系的基因间重组(Yuan等，VirusRes.，61：87-98(1999))，经历基因间重组，形成PRRSV亚基因组RNA和畸形(Nelsen等，J.Virol，73：270-80(1999)；Yuan等，Virology，275：158-169(2000)；Yuan等，VirusResearch，105：75-87(2004))，并在野外分离株的无法预知的核苷酸位点上经常表现出核苷酸简并性，从而使这一起始目标既耗费时间又受益太少。与VR-2332株相比，感染性DNA构建体具有仅11个核苷酸突变，在已知参与病毒复制的结构域(5′端和3′端，ORF1b)外，认为对wt病毒产生来说是足够的，而感染性克隆的下游目标用于发病机制研究和结构：功能研究。在编码解旋酶基序(NSP10)的病毒区域中pVR-HN更类似于IngelvacMLV。对这两个感染性克隆进行进一步病理比较，可阐明亲本株、VR-2332及其疫苗株后代IngelvacMLV之间的差异。
从PRRSVVR-2332株感染性克隆的构建和评价中可获得有用信息。首先，PRRSVVR-2332株不能耐受所有突变而生存下去。特定核苷酸或氨基酸突变可有助于或妨碍病毒复制，挑战是要确定哪些突变对生存而言是致死的。在不产生感染性病毒体的克隆pVR-V4中，总共有与wt亲本株VR-2332不同的42个核苷酸差异。在这42个核苷酸改变中，若干核苷酸导致沉默突变(20个残基)或以其它已知PRRSV株存在(直接模拟IngelvacMLV的9个氨基酸残基突变)，允许预测这些改变对病毒复制而言可能是非致死性的。因此，预测导致12个氨基酸改变和2个3′UTR核苷酸突变(在IngelvacMLV中都不可见)的11个核苷酸改变，对PRRSVVR-2332株而言是致死的。在pVR-V5和随后的构建体中，矫正了19个变化，包括在IngelvacMLV基因组中未见到的若干沉默突变和9个异常氨基酸变化，以及在疫苗株中可见的8个其它变化。这导致第一个证据证明构建体是感染性的，尽管在pVR-V5中，2个氨基酸突变仍然存在，其中一个通过定点诱变而改变，产生pVR-V6。在pVR-V5G7475A和pVR-V6G7475A中修复其余氨基酸变化，尽管这些克隆仍含有VR-2332株和所得疫苗株所没有的沉默突变。
若干独特观察结果得自该项研究。首先，所产生的病毒的各谱系可导致独特5′端序列，而这在wt株VR-2332中却无法检出。我们也不能找到噬斑大小与核苷酸序列的关系。第二，我们看见在猪体内复制后的独特核苷酸改变，这可能反映了PRRSV聚合酶的固有特性。所有核苷酸改变在本质上是不稳定的(transitional)并且不表现出偏倚(5A/G和4C/T)。尽管在体内传代后可见核苷酸7475上的GA回复，但是我们无法将该位点与随后增加的噬斑大小相关联，因为发生了其它非模板改变。另外，对产生较大噬斑的来自V5的病毒的第3代(V5-2-P3)进行全基因组序列分析表明，来自产生微小噬斑的V5病毒的不同5′端序列用于感染猪(V5-1-P3)。然而，我们可以下结论：突变对病毒复制不是致死性的，因为该病毒在猪体内传代后在MARC-145细胞产生wt-大小的噬斑并且以与亲本病毒几乎相同的速率生长(图5A、6和7)。
值得考虑的是以下事实：对V5、V5G7475A和V6G7475A体外第3代进行序列分析，看来表现出在进行病毒复制的同时，PRRSV复制酶复合物允许发生频繁转换和不频繁颠换。这可能反映病毒复制酶已经进化，使得它可以产生新PRRSV基因组遗传形式，然后评价它们在其它变异体中的能力，产生优化的“适应(fit)”病毒。当PRRSV在体内连续传代期间也注意到这些观察结果(Chang等，J.Virol.，76：4750-63(2002))。当检测到更多复制时，目前的测序工作是检查后代的全长基因组。最终，目前已经清楚，PRRSVVR-2332株复制酶容易合成畸形，同时产生全长vRNA。这个于1992年分离并表征的原型株系在逐渐获得复制适应中可能是独特的，因为制备更新毒株的感染性克隆的其它研究者没有观察到同样的效应(Truong等，Virology，325：308-319(2004))。畸形形成的作用和强力病毒复制的伴随表现表明，PRRSV进化中畸形具有有利作用。
实施例2
目前，在美国明尼苏达州已经鉴定出许多看来是新型PRRSV的有毒力的分离物。ORF5核苷酸序列分析以及与明尼苏达大学兽医诊断实验室(UniversityofMinnesotaVeterinaryDiagnosticLaboratory)PRRSV数据库(＞5000种分离物)进行比较，表明分离物是2型谱系，但是与先前的分离物明显不同。此外，它们与先前于1990年代早期在加拿大和1998年在明尼苏达州所见的分离物有着非常密切的关系(Mardassi等，J.Gen.Virol，75：681-685(1994))。ORF5的限制性片断长度多态性(RFLP)分析也证明，它们属于与这些早期病例(称为1-8-4分离物)相同的一组病毒(Wesley等，JVet.Diagn.Invest，10：140-144(1998))，因此称为MN184分离物。因为它们与除一种以外的所有先前分离的MNPRRSV分离物都明显不同，所以将这些新分离物中的两种在猪肺泡巨噬细胞(PAM)即宿主细胞上同时扩增，对病毒(称为MN184A和MN184B)进行全长基因组分析。这两种分离物是从两个单独的农场、在不同时间采集到的。
材料与方法
为了对MN184分离物测序，用QIAmp病毒RNAMini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)，从感染PRRSV的细胞上清液中提取病毒RNA(vRNA)，然后进行RT-PCR(QiagenOneStepRT-PCR试剂盒)。根据GenBank所保藏的不同株PRRSV的公开序列以及新产生的MN184序列，设计引物(按要求得到)。用5′-FuI1RACECore试剂盒(TaKaRaBio，Madison，WI)，得到两种PRRSV分离物的5′核苷酸序列。用SMARTTMRACEcDNA扩增试剂盒(Clontech，MountainView，CA)进行3′-RACE。RT-PCR产物通过凝胶纯化(QIAquick，Qiagen)，克隆到pGEM-T载体(Promega，Madison，WI)中，每种RT-PCR产物选择3-5个克隆用于测序。用PCR特异性引物或编码SP6启动子引物和T7启动子引物的载体，在两个方向完成核苷酸序列测定。将产物提交给提交给明尼苏达大学高级遗传分析中心，用ABI377自动化DNA片段分析仪进行序列测定。获得具有至少3重基因组覆盖的高质量序列。使用GeneTool序列分析程序(BioToolsInc.，Edmonton，AlbertaCA)和Lasergene(DNASTAR，Madison，Wis.)来装配并分析测序数据。
用CLUSTALX(Thompson等，NucleicAcidsRes.，24：4876-4882(1997))或WisconsinPackage10.3版(AccelrysInc.，SanDiego，CA)产生多序列比对。用ClustalX(1.83.1版；IUBDNA权重矩阵，空位罚分15.00，空位长度罚分6.66)，比对全长PRRSV序列。用WisconsinPackage10.3版Distances程序(Jukes-Cantordistance方法，因为考虑到简并符号，所以部分匹配)，进一步分析所得比对。对于图10，用WisconsinPackage的Pileup程序(Blosum62打分矩阵，空位权重＝8，长度权重＝2，加权末端)来比对序列。使用Jalview，给比对的冗余性打分，并为％同一性上色(Clamp等，Bioinformatics，12：426-427(2004))，然后转移到AdobePhotoshopCS，8.0版，用于灰度转化。对于图11，用WisconsinPackage的Pileup程序(Blosum62打分矩阵，空位权重＝8，长度权重＝2，加权末端)，进行序列比对。对于图12，用SingnalP服务器预测信号肽(Bendtsen等，J.MoLBiol.，340：783-795(2004))。跨膜区得自PHDhtm(Rost等，ProteinSci.，5：1704-1718(1996))，而潜在N-糖基化位点用PredictProtein服务器(Rost等，NucleicAcidsRes.，32：W321-W326(2003))通过PROSITE来鉴定(Bairoch等，NucleicAcidsRes.，25：217-221(1997))。用WisconsinPackage的Pileup程序(Blosum62打分矩阵，空位权重＝8，长度权重＝2，加权末端)进行序列比对。
结果
基因组比对证明，这两种PRRSV与其它北美2型全长测序的基因组相比非常独特(＞14.5％核苷酸差异)，而与1型(欧洲)全长序列的比较证实，分离物仅起源于2型基因型，因为它们在核苷酸水平上与EuroPRRSV和Lelystad株仅有约59％相似性。显然，这些2型MN184分离物代表迄今为止检测到的最短的PRRSV基因组(15019个核苷酸，不包括聚A尾)。另外，没有见到特异性区域，这表明这些分离物来自1型株与2型株之间的病毒重组。
全长序列分析表明，两种MN184分离物其实在遗传上是独特的。它们共享98.0％核苷酸相似性即2％差异。这样的差异率是出乎意外的，因为它们突然同时出现在明尼苏达，在当时在我们的PRRSV数据库中未见明确的新近相关的分离物。表6表示两种分离物间具体的核苷酸和氨基酸比较，而图9表示这两株之间的氨基酸差异。这两种分离物在基因组的若干区域都具有核苷酸简并性，主要在预测的ORF1的nsp2区(表6)。在这些分离物中可见核苷酸简并性的事实表明，PRRSV可由感染动物内的若干单一种类组成，这些种类通常称为一群相关而又不同的病毒序列。
表6.单个PRRSV基因组区和所翻译蛋白质的详细分析，以及在各区所测的简并碱基数目。简并定义为在3个或更多印迹图(tracefile)的不同印迹图上对于某个特定碱基检测到不止一个核苷酸。
区域 碱基 核苷酸 长度 ％核苷酸 相似性 ％核苷酸 同一性 简并碱 基数 (184A/184B) 氨基酸 长度 ％氨基酸 相似性 ％氨基酸 同一性
5’UIR ORF1A NSP1a NSP1b NSP2 NSP3 NSP4 NSP5 NSP6 NSP7 NSP8 ORF1B NSP9 NSP10 NSP11 NSP12 ORF2a/GP2 ORF2b/E ORF3/GP3 ORF4/GP4 ORF5/GP5 ORF6/M ORF7/N 3’UTR 1-190 191-7309 191-688 689-1339 1340-3886 3887-5224 5225-5836 5837-6346 6347-6394 6395-7171 7172-7309 7306-11679 7288-9225 9226-10548 10549-11217 11218-11679 11681-12451 11686-11907 12304-13068 12849-13385 13396-13998 13983-14507 14497-14868 14869-15019 190 7119 498 651 2547 1338 612 510 48 777 138 4374 1938 1323 669 462 771 222 765 537 603 525 372 151 99.5 98.5 98.8 98.3 98.0 98.7 98.5 99.2 100.0 99.3 99.3 99.2 98.9 99.3 99.3 99.6 99.0 99.6 98.6 98.5 97.8 99.6 98.9 100 98.9 96.7 98.5 97.5 94.6 98.7 96.4 95.3 100.0 99.3 99.3 98.9 98.8 98.9 99.3 99.4 98.3 99.6 98.6 98.5 97.7 97.4 98.9 98.0 1/0 16/109 1/0 2/3 10/76 0/0 0/13 3/17 0/0 0/0 0/0 5/4 1/1 3/3 0/0 1/0 1/0 0/0 0/0 0/0 1/0 0/0 0/0 1/1 - 2372 166 217 849 446 204 170 16 259 46 1457 646 441 223 153 222 73 254 178 200 174 123 - - 96.8 97.6 97.2 94.2 99.3 97.1 97.1 100 99.6 97.6 99.5 99.4 99.8 99.5 99.3 98.0 100 97.6 98.9 96.5 100 97.6 - - 96.5 97.6 95.9 94.2 98.9 97.1 97.1 100 99.2 97.6 99.2 98.9 99.3 99.5 99.3 97.3 100 97.6 98.9 96.5 100 97.6 -
为了更精确查明这些与其它PRRSV株有最大差异的MN184分离物的单个区域，并确定导致2型病毒基因组长度差异的区域，将这两种分离物与原型2型VR-2332株的序列进行比较。可以再次分辨出两种分离物之间的差异，其中与分离物MN184A相比，分离物MN184B与VR-2332株的相似性稍高一些。与VR-2332的核苷酸和氨基酸比较表明，单个MN184分离物区分别在81.5-94.7％和78.4-100％之间变化，但是对应于ORF5的区域(分别为86.4-86.7％和87.0-87.5％)预测nsp1β(分别为83.8-84.0％和84.8-85.4％)和nsp2(分别为81.5-85.5％和78.4-79.5％)是变化最大的。最有趣的是仅预测nsp2基因组区显示出核苷酸长度上的差异，而且两种MN184分离物都具有相同的nsp2缺失，详述如下。比较也表明5′和3′UTR′是基因组的最保守区域(分别为94.7％和94.0％)，表明在病毒复制和转录的重要区域中的序列保守性。
ORF5编码不同的PRRSV结构蛋白(GP5)，经常用于PRRSV诊断性鉴定(Kapur等，J.GenVirol，77：1271-1276(1996))。GP5是预测的具有内结构域(endodomain)和外结构域(ectodomain)的3次跨膜蛋白。30个氨基酸外结构域是由短的高度保守区组成，通常含有以两个超变区为界的至少2个N-糖基化位点。已知这30个氨基酸区的高度保守区编码2型株的病毒附着表位(Plagemann，Virology，290：11-20(2001)；Ostrowski等，J.Virol，76：4241-4250(2002)；Plagemann等，Arch.Virol，147：2327-2347(2002))。将全长基因组的同组GP5、以及在加拿大鉴定的原始RFLP184分离物(IAF-93-653，IAF-Klop)和于1998-1999在明尼苏达鉴定的原始RFLP184分离物(98-3298、98-3403、99-3584)进行比对(图10)。PRRSVGP5的比对表明新MN184分离物与其它非RFLP1842型株之间的氨基酸同一性范围为82.5％-87.7％。有趣的是，新MN184分离物与老RFLP184分离物间的氨基酸差异颇大(5.7％-12.2％)，因此我们没有发现新RFLP184病毒的明确来源。有限的比对显示，所观察到的大多数氨基酸差异都是在超变区发现的(图10)。MN184分离株中保留两个保守N-糖基化位点，除了在分离物MN184B中所检测到的编码氨基酸44的核苷酸简并性以外。。
Nsp1β编码木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(denBoon等，J.Virol，69：4500-4505(1995))。完成了MN184分离物与可用的2型nsp1β序列非冗余组以及1型EuroPRRSV株和Lelystad的氨基酸比对(图11)。Nsp1β蛋白具有大量完全保守氨基酸，而且所有测序基因组中都保留了所提出的催化残基(denBoon等，J.Virol，69：4500-4505(1995))。按照氨基酸相似性排序的比对表明，MN184分离物比起其它已测序的全长2型序列而言更类似于1型株。具体地讲，5个氨基酸(在图11中加框)直接模拟1型株。然而，在其它非冗余2型序列中保守的氨基酸在MN184分离物中也是最保守的，但是分散的氨基酸和氨基酸相似性(84.8-85.4％)表明2型蛋白比目前知道的更多样。因此，比对进一步限定了nsp1β所保留的残基，它们可能对PRRSV的复制周期而言是至关重要的。
按照配对同一性的顺序，nsp2非冗余序列的氨基酸比对见图12。高度保守的胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(PL2)结构域存在于N-端，先前已通过与马动脉炎病毒(EAV)nsp2比对而预测(Snijder等，J.Gen，Virol，79：961-979(1998)；Ziebuhr等，JGen.Virol，81：853-879(2000))。该蛋白C端附近有3-4个预测跨膜结构域(McGuffin等，Bioinformatics，16：404-405(2000))，但是尚未根据经验测出准确的C端切割位点。已经提出了两个预测的C-端切割位点，一个G|G在VR-2332nsp2氨基酸980(Allende等，JGen.Virol，80：307-315(1999))，而另一个在氨基酸1197(Ziebuhr等，J.Gen.Virol，81：853-879(2000))，但是该蛋白质内有若干完全保守G|G双联体(VR-2332nsp2氨基酸646、980、1116、1196、1197；图12中向下箭头)。先前的工作也表明，预测的nsp2蛋白富含脯氨酸并含有多个潜在B细胞表位(Oleksiewicz等，J.Virol，75：3277-3290(2001)；Fang等，VirusRes.，100：229-235(2004)；Ropp等，J.Virol，78：3684-3703(2004))。PRRSVnsp2的大中心区(VR-2332nsp2氨基酸148-880)尚不知功能，但在长度上有很大变化。此外，已测序的PRRSV的1型株与2型株间的长度差异已经作图到nsp2的这个可变中心区(图12)。迄今为止，已知已测序的1型基因组比大多数2型PRRSV短313-364个碱基(Meulenberg等，Virology，192：62-72(1993)；Fang等，VirusRes.，100：229-235(2004)，Ropp等，J.Virol.，78：3684-3703(2004))。然而，多重序列比对确定MN184基因组含有迄今为止预测最短的nsp2(2547bp)，比原型2型VR-2332株还短393bp。此外，它在翻译蛋白质中含有3个不连续缺失，缺失大小分别包括111、1和19个氨基酸，分别对应于PRRSVVR-2332株nsp2的氨基酸位置324-434、486和505-523(图12)。这3个缺失导致若干脯氨酸残基和预测B细胞表位的丧失。除了这些缺失以外，还可见来自其它2型株的nsp2氨基酸序列的明显变化，有时对应于同一相应位置上所见的1型氨基酸(图12)。比较两个PRRSV基因型的nsp2预测蛋白证明2型病毒中氨基酸同一性范围为66％-99％，而1型病毒中为88-90％，但是基因型间差异大(＜45％相似性)。具体地讲，MN184分离物表现出与所有2型nsp2预测蛋白具有66-80％氨基酸同一性，而与1型株仅具有43-45％同一性。当在图12中研究多序列比对时，我们也注意到在这两种基因型中的所有插入或缺失的实例都发生在该超变中心区。对此，Shen等(Arch.Virol.，145：871-883(2000))首先报道PRRSV北美2型株SP在相对于PRRSVVR-2332nsp2的氨基酸位置813和814间具有36个氨基酸的独特插入。另一位研究人员在PRRSV分离物HB-2(sh)/2002nsp2的位置466-477上发现独特的12个氨基酸缺失(Gao等，Arch.Virol.，149：1341-1351(2004))。当与LV株比较时，17个氨基酸的缺失发生在新鉴定的欧洲样PRRSV分离物中(Fang等，VirusRes.，100；229-235(2004)；Ropp等，J.Virol，78：3684-3703(2004))。尽管在MN184分离物和其它2型病毒之间可见的缺失包括1型与其它2型PRRSV之间检测到的大部分最大缺失，但是突变的实例并不一贯沿氨基酸的相同延伸方向发生。所有这些数据都表明，nsp2ORF含有对PRRSV复制而言是必要的保守蛋白酶基序和预测跨膜跨越区，但是对大中心部分中的突变是高度敏感的。
在明尼苏达突然出现的反映184RFLP模式的PRRSV野外分离物仍然是个谜，尽管目前正在了解该事件的结果。明尼苏达兽医诊断实验室目前正对来自ORF5序列需求总数约1/4的类似184RFLP分离物进行常规测序。另外，目前不仅在明尼苏达、而且在爱荷华、威斯康星、南达科他、堪萨斯、密苏里、伊利诺斯、内布拉斯加、肯塔基、俄克拉荷马和怀俄明，都已检测到184RFLP模式。我们选择从两个分离物中得到全长序列，因为需要了解是否这是不止一种病毒类型，而且要了解这一事实：用分离的MN184A诊断的猪群其表现的PRRS症状比用分离的MN184B感染的猪群更温和，该事实是由参与研究的病理学家报道的。病毒株尚未接种到首次用于实验的动物中以证实病症表现，但是有兴趣地注意到，当分析基因组时，分离的MN184B具有多得多的检测到的核苷酸简并性，这可能反映了所报道疾病的严重程度。
该基因组分析使我们对野外存在的大量核苷酸序列和氨基酸序列变异有了更多了解。造成这类变异的因素可与以下因素有关：猪的现有管理方式、猪和公猪精液的州际和国际运输、兽群内不同PRRSV分离物彼此混合以及病毒本身的特性。全基因组序列的产生也使我们能够监测基因组变异在何处可以耐受以及哪些区域更保守。作为该项研究以及先前的出版物(Ropp等，J.Virol，78：3684-3703(2004))的结果，呈现出这样的印象：nsp2、nsp1β和ORF5是非常多变的蛋白质。
该项研究也已提供清楚的证据证明，nsp2的大小不再用于区分两种PRRSV基因型。对nsp2经进化以展示具有3个不连续缺失的2型基因组的新发现，产生迄今为止的最短基因组(15,019kb)，表明PRRSV可以进化，以消除非必要基因组区并使基因组更紧凑。最终，尽管目前仅可推测PRRSV中的遗传变异的显著性，但是在环境选择压力下，ORF5、nsp1β和nsp2中可见的进化变化应当与PRRSV的生物学适应性有合理的关系。
本文所引用的所有专利、专利申请和出版物以及可用的电子材料的完整公开内容(包括例如提交给例如GenBank和RefSeq的核苷酸序列，提交给例如SwissProt、PIR、PRF、PDB以及从GenBank和RefSeq注释编码区中翻译的的氨基酸序列)全都通过引用结合到本文中。已经给出的前述发明详述和实施例仅为便于理解的目的。对此应视为没有不必要的限制。本发明不限于所示和所述的准确细节，因为本领域技术人员显而易见的变化会包括在由权利要求书所限定的本发明之中。
除非另有说明，否则说明书和权利要求书所用的表示成分量、分子量等的数量可理解为在所有情况下都用术语“约”来修饰。因此，除非另有说明，否则说明书和权利要求书所提出的数量参数都是近似值，可因本发明所得到的所需特性而异。完全不得视为限制等同于权利要求书的范围的原则，各数量参数应当至少理解为按照所报道的有效数值并应用常规四舍五入技术。
尽管数量范围和参数提出本发明的宽范围是近似值，但是在具体实施例中提出的数值却是尽可能的准确。然而，所有数值当然包含在其各自检测度量中发现的引起标准差的必要范围。
除非另有说明，否则所有标题都是为了方便读者，而不应当用于将文本限制在按照标题的含义。

Claims (12)

1.一种感染性多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQIDNO：1(图1A)具有至少88％同一性的核苷酸序列，并具有对应于SEQIDNO：1的核苷酸2305至核苷酸2637的连续核苷酸的缺失、对应于SEQIDNO：1的核苷酸2305至核苷酸2904的连续核苷酸的缺失、对应于SEQIDNO：1的核苷酸2962至核苷酸3231的连续核苷酸的缺失、对应于SEQIDNO：1的核苷酸3232至核苷酸3513的连续核苷酸的缺失、对应于SEQIDNO：1的核苷酸2962至核苷酸3513的连续核苷酸的缺失、对应于SEQIDNO：1的核苷酸3514至核苷酸3774的连续核苷酸的缺失。
2.权利要求1的多核苷酸，其中当引入细胞中时所述多核苷酸复制并产生感染性病毒颗粒。
3.权利要求1的多核苷酸，还包含在原核宿主细胞中复制的载体序列。
4.权利要求1、2中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸存在于载体中。
5.权利要求1、2中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸存在于病毒颗粒中。
6.权利要求1、2中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA多核苷酸。
7.权利要求1、2、3中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸存在于细胞中。
8.权利要求1、2、3中任一项的多核苷酸，其中RNA聚合酶启动子与所述多核苷酸操作性连接。
9.权利要求1、2、3中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包括存在于缺失中的外源多核苷酸。
10.权利要求9的多核苷酸，其中所述外源多核苷酸编码可检测标记。
11.一种分离的感染性多核苷酸，所述多核苷酸包含核苷酸序列SEQIDNO：5(图1E)、SEQIDNO：6(图1F)、SEQIDNO：7(图1G)、SEQIDNO：8(图1H)、SEQIDNO：9(图1I)、SEQIDNO：10(图1J)、SEQIDNO：11(图1K)、SEQIDNO：12(图1L)或SEQIDNO：13(图1M)。
12.一种由感染性多核苷酸编码的nsp2多肽，所述感染性多核苷酸包含核苷酸序列SEQIDNO：7(图1G)、SEQIDNO：8(图1H)、SEQIDNO：9(图1I)、SEQIDNO：10(图1J)、SEQIDNO：11(图1K)、SEQIDNO：12(图1L)或SEQIDNO：13(图1M)。
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