MX2007015849A - Virus del sindrome respiratorio y reproductivo porcino, clones infecciosos, mutantes de los mismos, y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona polinucleotidos infecciosos aislados, tales como clones infecciosos, que tienen una secuencia de nucleotido con identidad a virus PRRS tales como VR-2332, Lelystad, u otros, y opcionalmente incluye ademas una eliminacion de la region de ORF1 que codifica el polipeptido nsp2.

Description

VIRUS DEL SÍNDROME RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO PORCINO, CLONES INFECCIOSOS, MUTANT?S DE LOS MISMOS, Y MÉTODOS DE USO ANTECEDENTES DE A INVENCIÓN El virus del sindrome respiratorio y reproductivo de porcinos (PRRSV) es el agente que causa la enfermedad caracterizada por trastornos respiratorios en cerdos jóvenes e insuficiencia reproductiva en cerdas (Benfield et al, J. Vet . Diagn. Invest., 4:127-133 (1992); Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest, 4:117-126 (1992); Wensvoort et al., Vet. Q., 13:121-130 (1991)) y es ahora endémica en la mayoria de los paises. El sindrome se reconoció primero como una "enfermedad porana misteriosa" en los Estados Unidos en 1987 y se descubrió en Europa en 1990. Las dos cepas virales prototipo (Lelystad y VR-2332) difieren en secuencia de nucleótido por aproximadamente 40% y representa dos distintos genotipos, referidos como Europeo (EU o Tipo 1, Lelystad; Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993)) y Norteamericano (NA o Tipo 2, VR-2332; Nelsen et al., J. Virol, 73:270-80 (1999)) cepas (Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004); Mardassi et al., J. Gen. Virol, 75:681-5 (1994); Meng et al., Arch. Virol, 140:745-55 (1995); Ropp et al., J. Virol, 78:3684-3703 (2004)). La enfermedad también se ha referido como sindrome Wabash, enfermedad de cerdos misteriosa, sindrome reproductivo y respiratorio porcino, plaga de cerdos, aborto epidémico Ref. :188508 porcino y sindrome respiratorio, enfermedad de aborto azul, enfermedad de oreja azul, abortus blau, y seuchenhafter spatabort der schweine. La enfermedad se caracteriza por insuficiencia reproductiva en cerdas preñadas y problemas respiratorios en cerdos de todas las edades. La enfermedad tiene un impacto negativo importante en la industria del cerdo . El PRRSV es un virus de ARN de sentido positivo, desarrollado, que pertenece a la familia de Arteriviridae del orden Nidovirales (Cavanagh, Arch. Virol, 142:629:633 (1997)). El genoma de PRRSV varia desde 15.1-15.5 kb de longitud (Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Nelsen et al., J. Virol, 73:270-80 (1999)). El primer 75% del genoma codifica la poliproteina replicasa esencial para la replicación del virus y comprende dos estructuras de lectura abierta grandes (ORF) (la y lb) que se procesan cotraduccionalmente en proteinas más pequeñas por proteasas codificadas viralmente (Snijder et al., J Gen. Virol, 79:961-79 (1998)). Las proteinas estructurales se codifican por siete ORF en cadena abajo y se traducen de un conjunto agrupado de co-terminal 3' de los mARN subgenómico (sgmRNA) (Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Pattnaik et al., Cell, 69:1011-1020 (1992)). En la cepa VR-2332, la región codificada del genoma (15,411 bases) se flanquea por regiones no traducidas 5' y 3' de 189 y 151 nucleótidos, respectivamente.

La cepa PRRSV VR-2332 está bien caracterizada en términos de su secuencia de genoma completo (Pattnaik et al., Cell, 69:1011-1020 (1992)), la capacidad de PRRSV para producir constitutivamente especies de ARN subgenómico defectuosos se llama heterocli tes (latin: formas no comunes) (Yuan et al., Virology, 275:158-169 (2000)); Yuan et al., Virus Research, 105:75-87(2004)), y sus propiedades de crecimiento in vitro asi como in vivo (Murtaugh et al., Vet. Immunol. Immunopathol, 102:105-349 (2004)). Además, un clon infeccioso de este genoma NA PRRSV 15.4 kb se ha producido y examinado para su capacidad para provocar enfermedad en cerdos (p VR-HN; Nielsen et al., J. Virol., 77:3702- 3711 (2003)). El PRRSV continua causando pérdidas económicas importantes alrededor del mundo. Están disponibles vacunas, pero estas se basan en una cepa PRRSV, y hay evidencia de que las cepas PRRSV varian en los niveles antigénico y genético. Además, ya que el virus se identificó en Europa y los Estados Unidos, han continuado emergiendo nuevos fenotipos de enfermedad.

BREVE DESCRIPCIÓN D? LA INVENCIÓN Los reportes previos sugieren que las eliminaciones y/o mutaciones de cualquier cepa de virus PRRS son a menudo extremadamente nocivos para el crecimiento viral, específicamente, laboratorios individuales han hecho mutaciones en el extremo 3' del virus, y el virus resultante fue ya sea inestable y rápidamente revertido de nuevo a la secuencia de tipo silvestre, o crece muy pobremente o no todo (Lee et al., Virol., 331 :47-62 (2005); Choi et al., J. Virol., 80:723-736 (2006); Lee et al., Virolog., 346:238-250 (2005) ) . De esta manera, en comparación con las secuencias de nucleótido de Europa (genotipo Tipo 1) y VR-2332 (genotipo Tipo 2), no se conoce hacer mutaciones en VR-2332 NSP2 que no sean extremadamente nocivas. Sin embargo, la alineación de las secuencias de genoma completo de los virus PRRS nuevos de Tipo 2 con VR-2332 comienza a proporcionar discernimiento para donde se harían los mutantes viables. Además la mutagénesis de eliminación muestra que la región entre nsp2 aminoácidos 324-813 no fue necesaria para crecimiento in vi tro . La presente invención proporciona un polinucleótido infeccioso aislado que tiene una secuencia de nucleótido con al menos 88% de identidad con la SEQ ID NO:l y una eliminación de al menos 39 nucleótidos consecutivos seleccionados de nucleótido 2062 al nucleótido 3864 de SEQ ID NO: 1. También se proporciona un polinucleótido infeccioso aislado que tiene una secuencia de nucleótido con al menos 88% de identidad con la SEQ ID NO: 14 y una eliminación de al menos 39 nucleótidos consecutivos seleccionados de nucleótido 2061 al nucleótido 3545 de SEQ ID NO: 14. El polinucleótido aislado puede presentarse en un vector, en una partícula de virus aislada, presentarse en una célula, o una combinación de los mismos. Cuando se presenta en un vector un promotor de polimerasa de ARN puede ligarse operablemente al polinucleótido. El polinucleótido aislado puede ser por un ARN. El polinucleótido aislado puede incluir 2 o más eliminaciones, y cada eliminación puede independientemente ser de al menos 37 nucleótidos consecutivos. El polinucleótido aislado puede además incluir un polinucleótido exógeno presente en la eliminación, y el polinucleótido exógeno puede codificar un polipéptido, tal como un marcador detectable. La presente invención también proporciona un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótido con al menos 88 % de identidad con la SEQ ID NO:l y al menos una eliminación de al menos 39 nucleótidos consecutivos seleccionados de nucleótido 2062 al nucleótido 3864 de SEQ ID NO:l, y en donde el polinucleótido replica y produce partículas de virus infeccioso cuando se introduce en una célula. También se proporciona un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótido con al menos 88 % de identidad con la SEQ ID NO: 14 y al menos una eliminación de al menos 39 nucleótidos consecutivos seleccionados de nucleótido 2061 al nucleótido 3545 de SEQ ID NO: 14, en donde el polinucleótido replica y produce partículas de virus infeccioso cuando se introduce en una célula. El polinucleótido aislado puede presentarse en un vector, en una partícula de virus aislada, presentarse en una célula, o una combinación de los mismos. Cuando se presenta en un vector un promotor de polimerasa de ARN puede ligarse operablemente al polinucleótido. El polinucleótido aislado puede ser por un ARN. El polinucleótido aislado puede incluir 2 o más eliminaciones, y cada eliminación puede independientemente ser de al menos 37 nucleótidcs consecutivos. El polinucleótido aislado puede además incluir un polinucleótido exógeno presente en la eliminación, y el polinucleótido exógeno puede codificar un polipéptido, tal como un marcador detectable. La presente invención proporciona además un clon infeccioso que tiene un polinucleótido con una secuencia de nucleótido que tiene al menos 88 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 y al menos una eliminación de al menos 39 nucleótidos consecutivos seleccionados de nucleótido 2062 al nucleótido 3864 de SEQ ID NO:l. También se proporciona un clon infeccioso que tiene un polinucleótido con una secuencia de nucleótido que tiene al menos 88 % de identidad con la SEQ ID NO: 14 y al menos una eliminación de al menos 39 nucleótidos consecutivos seleccionados de nucleótido 2061 al nucleótido 3545 de SEQ ID NO: 14. El clon infeccioso puede presentarse en una célula. Un promotor de polimerasa de ARN puede ligarse operablemente al polinucleótido. El clon infeccioso puede incluir 2 o más eliminaciones, y en donde cada eliminación es independientemente al menos 37 nucleótidos consecutivos. El polinucleótido aislado puede además incluir un polinucleótido exógeno presente en la eliminación, y el polinucleótido exógeno puede codificar un polipéptido, tal como un marcador detectable. También se proporciona por la presente invención un polinucleótido infeccioso aislado gue comprende una secuencia de nucleótido SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, o SEQ ID NO: 13, y un polipéptido nsp2 codificado por un polinucleótido infeccioso que comprende una secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 9 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, o SEQ ID NO: 13. Los términos "comprende" y variaciones del mismo no tienen un significado limitante donde estos términos aparecen en la descripción y reivindicaciones. Salvo que se especifique de otra manera, "el", "un", "la/el", y "al menos uno" se usan intercambiablemente y significan uno o más de uno.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1, 1A-2, 1A-3, 1A-4. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO:l) de polinucleótido infeccioso VR-V7 (también referida en la presente como V6G7475A) . Figuras 1B-1, 1B-2, 1B-3, 1B-4 y 1B-5. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO:2) de polinucleótido infeccioso VR-V5. Figuras 1C-1, 1C-2, 1C-3, 1C-4 y ÍC-5. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 3) de polinucleótido infeccioso VR-V5G7475A. Figuras 1D-1, 1D-2, 1D-3, 1D-4 y 1D-5. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 4) de polinucleótido infeccioso VR-V6. Figuras 1E-1, 1E-2, 1E-3 y 1E-4. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 5) de polinucleótido infeccioso MN184A. Figuras 1F-1, 1F-2, 1F-3 y 1F-4. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 6) de polinucleótido infeccioso MN184B. Figuras 1G-1, 1G-2, 1G-3 y 1G-4. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 7) de polinucleótido infeccioso Nsp2 ?324-434. Figuras 1H-1, 1H-2, 1H-3 y 1H-4. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 8) de polinucleótido infeccioso Nsp2 ?324-523. Figuras 11-1, 11-2, 11-3 y 11-4. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 9) de polinucleótido infeccioso Nsp2 ?543-632. Figuras U-l, U-2, 1J-3 y 1J-4. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 10) de polinucleótido infeccioso Nsp2 ?633-726. Figuras 1K-1, 1K-2, 1K-3 y 1K-4. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 11) de polinucleótido infeccioso Nsp2 ?543-726. Figuras 1L-1, 1L-2, 1L-3 y 1L-4. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 12) de polinucleótido infeccioso Nsp2 ?727-813. Figuras 1M-1, 1M-2, 1M-3 y 1 -4. Secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 13) de polinucleótido infeccioso Nsp2 ?324-726. Figura 2. Ensamble de clones de longitud completa de cepa PRRSV VR-2332. El genoma 15.4 se amplificó en cuatro secciones (I - IV) que incorpora los sitios de desdoblamiento de enzima de restricción únicos presentes en cADN viral (Fsel, Avrll, BsrGI) o agregados a la secuencia PRRSV en los extremos 5' y 3' por mutagénesis de inserción (Sphl, Pac I respectivamente).

Un promotor de polimerasa T7 and 2 residuos G no en plantilla y un residuo T preceden la secuencia viral. El vector pOK12 (24) se modificó para incluir un sitio Pad y una ribozima delta de hepatitis en dirección 3' de un extremo de poli adensina de 50 nucleótidos. Figura 3. Esquemática de cambios de nucleótido de clones infecciosos o progenie de cerdos. El diagrama de la organización del genoma PRRSV se presenta bajo el cual están comparaciones del genoma completo. Los desdoblamientos de proteina no estructural supuesta se describen arriba ORFla y lb, representados por flechas hacia abajo. Las porciones de firma se identifican abajo ORFla y lb, con flechas hacia arriba que indican su colocación en el genoma PRRSV [cisteina proteasa a y ß tipo papaina (PCPa, PCPß); cisteina proteasa (CP) ; serina/3C proteasa (SP/3CP) ; polimerasa (POL) ; rico en cisteina/histidina (C/H) ; helicasa (Hel); endoribonucleasa especifica de poly(U) homólofa de Xenopus laevis (XendoU) ; Ivanov et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 101:12694-12699 (2004); Ziebuhr et al, J. Gen. Virol, 81:853-879 (2000)]. Las diferencias de nucleótido se representan por barras verticales. 1. cepa wt VR-2332 (U87392) comparada con vacuna derivada de VR-2332 (Ingelvac® MLV o RespPRRS, AF066183). 2. cepa wt VR-2332 comparada con pVR-V6G7475A. 3. pVR-V5 comparada con V5-1-P3 pasada in vivo (Sw612). 4. cepa wt VR-2332 comparada con Sw612. Los cambios de nucleótido detallados se enlistan en las Tablas 4 y 5. Figura 4. Seroconversión de cerdo después de infección por PRRSV. Cerdos en crecimiento se infectaron con cepa nativa wt VR-2332 (D) , Ingelvac® MLV (x) , V5-1 P3 (O) o se quedan sin infectar (H) . En los días indicados, las muestras de suero se tomaron y probaron por IDEXX Elisa para indicación de seroconversión por anticuerpos anti-PRRSV a la proteína nucleocapsida . Figura 5A. Ensayos de placa en progenie P3 (primer linaje) de todos los clones infecciosos así como cepa wt VR-2332 que revela diferentes tamaños de plaquetas. Figura 5B. Progenie de V5-1 P3 después de hacerse crecer en cerdos (Sw612) produce plaquetas similares a cepa wt VR-2332. Figura 6A. Ensayos de placa en progenie P3 (segundo linaje) de todos los clones infecciosos así como cepa wt VR-2332 exhiben tamaños de plaquetas que son diferentes de las preparaciones de virus de primer linaje. Figura 6B. Concentraciones de virus P4 que indican progenie de clon infeccioso no se replican como cepa wt VR-2332 o virus Sw612 a pesar de que tiene un tamaño de plaqueta similar. Figuras 7A y 7B. progenie P3 de cepa wt VR-2332 (0) , Sw612 (?) , pVR-HN (D) , pVR-V5 (x), pVR-V5G7475A ( * ) , pVR-V6 (•) , pVR-V6G7475A (O) se examinaron simultáneamente para cinéticos que crecen en una etapa como se resume en el Ejemplo 1. cepa wt VR-2332 y virus Sw612es replican hasta aproximadamente concentraciones 10 veces mayores en todos los puntos de tiempo. pVR-V6G7475A, sin cambios en aminoácido del virus o vacuna nativa, produce virus que replica hasta una concentración mayor en todos los puntos de tiempo que toda la otra progenie de clon infeccioso. La concentración final para cada preparación de virus se enlista en la tabla de comparación. Figura 8. Análisis Northern blot de diferentes pasos de progenie de pVR-V6G7475A así como Sw612 y el transcrito in vitro inicial revela que los heteroclitos se producen como previamente como Pl y, junto con ARN genómico, son más abundantes con el pasaje. Sin embargo, el ARN transcrito (Tx) no contiene especies de heteroclito fácilmente detectables. Figura 9A. Representación en diagrama del genoma PRRSV. Se describen desdoblamiento de proteína no estructural supuestos arriba ORFla y lb, representados por flechas descendentes. Las porciones de firma se identifican abajo ORFla y lb, que indican su colocación en el genoma PRRSV [cisteina proteasa tipo papaína a y ß (PL1); cisteina proteasa (PL2) ; serina/3C proteasa (3CL) ; polimerasa (RdRp) ; helicasa (Hel); endoribunucleasa específica de poly(U) hompóloga de Xenopus laevis (N) ; Ziebuhr et al., 2000; Ivanov et al., 2004; Gorbalenya et al., 2006]. Figura 9B. Diagrama esquemático de la comparación de proteína ORF1 (replicasa) de MN184A y MN184B y procesamiento supuesto. La degeneración apreciada en nsp2 se incluye en la comparación. Figura 9C. Diagrama esquemático de la comparación de proteínas ORF2-7 de MN 184A y MN184B. Figura 10. Alineación de secuencia de aminoácido ORF5 de PRRSV divergente. Los cuadros gris oscuro indican alta conservación de aminoácido (>80%; entre 16 y 19 residuos son idénticos), los cuadros gris medio (>60%; entre 12 y 15 residuos son idénticos), gris más ligero (>40%; entre 8 y 11 residuos son idénticos) y sin sombra (<40%; menos de 8 residuos son idénticos) identifican residuos menos conservados. La región con puntos indica la secuencia de señal supuesta, las regiones en cuadros identifican las regiones de transmembrana propuestas, las regiones en cuadros identifican las regiones de transmembrana propuestas, las regiones hipervariables se indican (HV-1 y HV-2), y la orientación propuesta de la proteína en el virus se identifica en letras cursivas negras. El residuo de cisteína conservado que se propone para interactuar con la proteína M se identifica por la flecha descendente ( - ) . Los dos sitios de N-glicosilación supuestos conservados se identifican por estrilas y la región hipervariable 1 contienen sitios de N-glicosilación específicos de cepa/aislado (NxS/T) . Las siguientes secuencias de longitud completa del GenBank se usaron para comparación: VR-2332 ( U87392) , Ingelvac MLV ( AF066183) , 01NP1.2 ( DQ056373) , PL97-1 (AY58524 ) , PA-8 ( AF1 76348) , SP ( AF184212) , BJ-4 ( AF331831 ) , HN1 ( AY457635) , 16244B ( AF046869) , HB-1 ( AY150312) , HB-2 ( AY262352) , CH-la ( AY032626) , P129 (AF494042) , JA142 ( AY424271 ) , SDPRRS-01-08 ( AY3754 74 ) , EuroPRRSV ( AY366525) , Lelystad (M96262) , IAF-93-653 ( U64931 ) , IAF-Klop ( AY184209) , 98-3298 ( DQ306877) , 98-3403 ( DQ306878) , 99-3584 ( DQ306879) . Figura 11. Alineación de secuencia de aminoácidos Nsplß de PRRSV divergente. La derivación de la figura y el esquema de color se describe en la leyenda de la Figura 10. Los dos residuos catalíticos supuestos completamente conservados se identifican por estrellas y los aminoácidos en cuadros identifican la conservación de secuencia MN184 con auslados del Tipo 1 y EAV. El sitio de desdoblamiento propuesto se identifica por la fecha hacia abajo (F) . Figuras 12A y 12B. Alineación de secuencia de aminoácido Nsp2 de PRRSV divergente. Los residuos catalíticos de cisteína proteasa supuestos completamente conservados (Cys y His) se identifican por estrellas y los aminoácidos en cuadros significan la conservación de secuencia de proteasa dentro de PRRSV y EAV. Los sitios de desdoblamiento propuestos se identifican por flechas rellenas (0) ; los sitios de desdoblamiento posibles adicionales se indican por la flecha con puntos; péptido de señal, cuadro gris sólido; regiones de transmembrana, mostradas en cuadros negros con puntos; sitios de N-glicosilación potenciales, indicados por un asterisco (*) . La derivación de la figura y el esquema de color se describen en la leyenda de la Figura 10.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye clones infecciosos del virus del síndrome reproductivo y respiratorio Porcino (PRRSV) VR-2332. Como se usa en la presente, el término "clon infeccioso" es un polinucleótido que tiene dos componentes; una secuencia de vector que replica en una célula hospedera procariótica, y un segundo polinucleótido referido en la presente como un polinucleótido infeccioso. Cuando se transcribe in vi tro para proporcionar un polinucleótido de ARN e introducirse en una célula permisible, el polinucleótido infeccioso replica (como un ARN) y produce partículas de virus infeccioso. De esta manera, un polunucleótido infeccioso puede presentarse en un vector como un ADN, como un ARN en una partícula de virus, o como un ADN o ARN aislado. El término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos, e incluye ARN y And tanto de hebra doble como sencilla. Salvo que se note de otra manera, un polinucleótido incluye el complemento del mismo. La secuencia de nucleótido del complemento de un polinucleótido puede determinarse fácilmente por una persona de habilidad en el arte. Un polinucleótido puede incluir secuencia de nucleótidos que tiene diferentes funciones, incluyendo por ejemplo secuencias codificadas, y secuencias no codificadas tal como secuencias reguladoras y/o regiones no traducidas. Un polinucleótido puede obtenerse directamente de una fuente natural, o puede prepararse con la ayuda de técnicas recombinante, enzimáticas, o químicas. El polinucleótido puede ser lineal o circular en topología. El polinucleótido puede, por ejemplo, ser una porción de un vector, tal como un vector de expresión o clonación, o un fragmento. Si se presenta naturalmente, un polinucleótido preferiblemente se aisla, más preferiblemente, purifica. Un compuesto "aislado", tal como un polinucleótido, polipéptido, o partícula de virus, es uno que se separa y es discreto de su ambiente natural. Un compuesto "purificado" es uno que es al menos 60% libre, preferiblemente 75% libre, y más preferiblemente 90% libre de otros componentes con los cuales se asocia naturalmente. Los compuestos tales como polinucleótidos y polipéptidos que se producen fuera del organismo en el cual se presentan naturalmente, esto es, a través de medios químicos o recombinantes, se consideran que se aislan y purifican por definición, ya que ninguno se presenta en un ambiente natural. Un ejemplo de un polinucleótido infeccioso de la presente invención incluye el polinucleótido infeccioso VR-V7 (SEQ ID NO:l). VR-V7 también se refiere en la presente como V6G7475A. Otros ejemplos de polinucleótidos infecciosos de la presente invención incluyen VR-V5 (SEQ ID N0:2), VR-V5G7475A (SEQ ID N0:3), y VR-V6 (SEQ ID N0:4). Deberá notarse que aunque SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y otra secuencia de nucleótidos de virus se describen en la presente como una secuencia de ADN, la presente invención contempla la secuencia de ARN correspondiente, y complementos de ARN y ADN de los mismos. Otros polinucleótidos infecciosos de la presente invención tienen un polisecuencia de nucleótido que tiene similitud estructural al polinucleótido de referencia. Los polinucleótidos de referencia incluyen SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, la cepa prototipo Europea del virus PRRS, Lelystad (Genbank número de acceso M96262; SEQ ID NO: 14), y la cepa prototipo Norteamericana del virus PRRS, VR-2332 (Genbank número de acceso U87392; SEQ ID NO: 15). La similitud se refiere como "porcentaje de identidad" y se determina al alinear los residuos de los dos polinucleótidos (esto es, la secuencia de nucleótido del polinucleótido infeccioso candidato y la secuencia de nucleótido del polinucleótido de referencia) para optimizar el número de nucleótidos idénticos a lo largo de las longitudes de estas secuencias; los espacios en cualesquiera o ambas secuencias se permiten para hacer la alineación con objeto de optimizar el número de nucleótidos divididos, no obstante que los nucleótidos en cada secuencia deberán mantenerse sin embargo en su orden apropiado. En algunos aspectos de la presente invención el espacio (también referido como una eliminación) se presenta en la secuencia de polinucleótido infecciosa candidato. Un polinucleótido infeccioso candidato es el polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótido comparada con el polinucleótido de referencia. Un polinucleótido infeccioso candidato puede aislarse de un animal, tal como un cerdo infectado con PRRSV, aislado de una línea celular de cultivo, o puede producirse usando técnicas recombinantes, o sintetizarse químicamente o enzimáticamente. Dos secuencias de nucleótidos pueden compararse usando cualesquiera de los algoritmos de computadora comercialmente disponibles usados rutinariamente para producir alineaciones de secuencias de nucleótidos. Preferiblemente, dos secuencia de nucleótidos se comparan usando el programa GAP del paquete GCG Wisconsin (Accelrys, Inc.) versión 10.3 (2001). El programa GAP usa el algoritmo de Needleman et al. (J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970)) para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximizan el número de alineaciones y minimizan el número de espacios. Preferiblemente, los valores por default para todos los parámetros de búsqueda GAP se usan, incluyen la matraz de marcador = NewsgapDNA. emp, espacio peso = 50, longitud peso = 3, coincidencia promedio = 10, no coincidencia promedio = 0. En la comparación de dos secuencias de nucleótidos usando el algoritmo de búsqueda GAP, la similitud estructural se refiere como "porcentaje de identidad." Preferiblemente, un polinucleótido tiene una similitud estructural con un polinucleótido de referencia de al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad cuando la similitud estructural se determina usando el programa GAP. Si un polinucleótido es un polinucleótido infeccioso puede determinarse al insertarse en un vector un polinucleótido infeccioso candidato, transcribe el polinucleótido infeccioso candidato in vi tro, transfectando una célula permisible con las moléculas de ARN resultante, y detectar el ARN viral de progenie, proteína de nucleocapsida viral de progenie, detectar partículas de virus infecciosas, o una combinación de los mismos. El vector preferiblemente tiene las características de ser de bajo número de copias y mantenerse estable después ed la inserción de insertos grandes (por ejemplo, 15 kb) . Un ejemplo de un vector apropiado es pOK y pOK12 (GenBank Acceso AF223639, Vieira et al., Gene, 100:189-194 (1991)), y otros vectores tienen estas característica se conocen y están disponibles. En el vector el polinucleótido infeccioso candidato está inmediatamente en dirección 3' del promotor. Los promotores útiles son aquellos que pueden inducir a producir altos niveles de transcripción, tales como un promotor de polimerasa T7 ARN, por ejemplo TAATACGACTCACTATA (SEQ ID NO: 16), o los promotores de polimerasa de ARN SP6 y T3. La transcripción del polinucleótido infeccioso incluye típicamente la digestión de endonucleasa de restricción del vector para hacerlo lineal, y producir transcripción de ARN al usar métodos de transcripción in vi tro de rutina y bien conocidos. Los kits para transcripción in vi tro están comercialmente disponible (por ejemplo, mMessage mMachine, disponible de Ambion, Austin, TX) . Después de la transcripción in vi tro el ARN se purifica usando métodos de rutina y luego se usa para transfectar una célula permisible. Los ejemplos de células permisibles incluyen, por ejemplo, BHK-21 (que permite una ronda de producción de partícula de virus), CL-2621, MA-104 (ATCC CRL-2378), MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol, 133:477-483 (1993)), líneas de células clonadas de estas líneas de célula, o macrófagos alveolares porcinos primarios. Los métodos para transfectar eficientemente células incluye el uso de bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxi etil amonio y colesterol (DMRIE-C), y otros productos comercialmente disponibles, preferiblemente, DMRIE-C. Los métodos para transfectar eficientemente los macrófagos alveolares porcinos primarios se conocen en el arte (Groot Bramel-Verheige et al., Virol., 278:380-389 (2000)). Generalmente, 2 a 3 microgramos de ARN pueden usarse para la transfección, pero pueden usarse cantidades menores o superiores. Después de un periodo apropiado de tiempo, la presencia de ARN viral de progenie puede detectarse por, por ejemplo, reacción de cadena de transcriptasa-polimerasa inversa (RT-PCR). Similarmente, la proteína de nucleocapsida viral de progenie puede detectarse por, por ejemplo, anticuerpo específico de nucleocapsida. Además, si las partículas de virus producidas por células transfectadas con un polinucleótido infeccioso candidato infectan otra célula pueden detectarse al exponer células permisibles no infectadas a sobrenadante de células infectadas. Opcionalmente, el efecto citopático (CPE) puede observarse. Un polinucleótido infeccioso candidato se considera que es un un polinucleótido infeccioso cuando produce ARN de progenie viral, proteínas de progenie virales (nucleocapsida, membrana, GP5, y otros), e infecta otras células permisibles. En algunos aspectos de la presente invención un polinucleótido infeccioso incluye una eliminación de nucleótidos que codifican la proteína no estructural 2 (nsp2), uno de varios polipéptidos (12 predichos) presentes en la poliproteína codificada por ORF1. En un virus PRRS, y polinucleótidos infecciosos del mismo, los nucleótidos que codifican el primero aminoácido de nsp2 puede determinarse al identificar el sitio de desdoblamiento de proteasa 1 beta tipo papaína, predicho para estar después de la glicina de aminoácido 0RF1 en la posición 383 en VR-2332. Con respecto a identificar los nucleótidos que codifican el último aminoácido de nsp2, el sitio de desdoblamiento de termina C nsp2 exacto de la poliproteína que codifica ORFla no se ha determinado empíricamente, de esta manera los nucleótidos correspondientes al extremo 3' de la región codificada se desconocen. Sin embargo, dos pedicciones del sitio de desdoblamiento de terminal C se han propuesto, un GlylGly (donde la línea vertical entre los dos residuos de glicina indica la ubicación del desdoblamiento) en el aminoácido 980 en VR-2332, y el otro aminoácido 1197 en VR-2332. En la alineación de todas las secuencias PRRSV variables, hay varios dobletes GlylGly completamente conservados dentro de esta proteína que también pueden estar en el sitio de desdoblamiento de terminal C nsp2 (aminoácidos 646, 980, 1116, 1196, 1197, en VR-2332. Las ubicaciones de los dobletes GlylGly en los otros virus y polinucleótidos infecciosos puede identificarse por comparación a las secuencias de nsp2 y los dobletes GlylGly descritos en las Figuras 12A y 12B. Los estudios actuales sugieren que puede haber al menos 3 sitios de desdoblamiento en nsp2, correspondientes al aminoácido 980, 116, 1196 ó 1197.

El polipéptido nsp2 incluye un dominio de cisteína proteasa tipo quimotripsina altamente conservado (identificado como CP en la Figura 3 y PL2 en las Figuras 9A, 9B y 9C) presente en la terminal N, y los dominios de transmembrana predichos 3-4 cerca de la terminal C de nsp2 (donde el número de dominios de transmembrana varía dependiendo de la ubicación del sitio de desdoblamiento de terminal C) . Típicamente, la eliminación de los nucleótidos que codifican los aminoácidos del dominio PL2 o todos los dominios de transmembrana predichos resulta en un polinucleótido que puede replicar en células permisibles pero no produce partículas de virus infecciosas. De esta manera, un clon infeccioso de la presente invención típicamente no incluye la eliminación del dominio PL2 completo de todos los dóminos de transmembrana predichos. Los nucleótidos que codifican el dominio de cisteína proteasa tipo quimotripsina son los nucleótidos 1474 a 1776 de VR-V7 (SEQ ID NO: 1), nucleótidos 1474 a 1776 de VR-2332 (Genbank número de acceso U87392), y nucleótidos 1482 a 1784 de Lelystad (Genbank número de acceso M96262). La ubicación de un dominio de cisteína proteasa tipo quimotripsina en la secuencia de nucleótido de otros virus PRRS puede identificarse al alinear la secuencia de aminoácido del polipéptido nsp2 codificado por un virus PRRS con la secuencia de aminoácido alineada descrita en la Figura 12, y determinar que nucleótidos codifican aquellos aminoácidos que se alinean con el dominio de cisteína proteasa tipo quimotripsina. Alternativamente, las secuencias de aminoácido de polipéptidos nsp2 de otros virus PRRS pueden identificarse al alinear la secuencia de aminoácido del polipéptido nsp2 codificado por un virus PRRS con la secuencia de aminoácido de los polipéptidos nsp2 producidos por otros arterivirus, tales como virus de arteritis equina (EAV) y virus que eleva la lactato deshidrogenasa (LDV) . Los nucleótidos que codifican los dominios de transmembrana predichos de VR-V7 (SEQ ID NO: 1), VR-2332 (Genbank número de acceso U87392) , y Lelystad (Genbank número de acceso M96262) se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Nucleótidos nsp2 que codifican dominios de transmembrana predichos.

La ubicación de los dominios de transmembrana en la secuencia de nucleótido de otros virus PRRS pueden identificarse al alinear la secuencia de aminoácido del polipéptido nsp2 codificado por un virus PRRS con la secuencia de aminoácido alineada descrita en la Figura 12, y determinar que nucleótidos codifican aquellos aminoácidos que se alinean con los dominios de transmembrana. Alternativamente, la ubicación de los dominios de transmembrana pueden identificarse con un algoritmo de computadora, tal como el algoritmo PredictProtein como se describe por Rost et al. (Nucleic Acids Res., 32 (poblicaicón en Servidor de Red) :W321-326 (2004), o el algoritmo TMHMM como se describe por Krogh et al. (J. Mol. Biol., 305: 567-580 (2001)) y que está disponible a través de la red mundial de Internet. La eliminación presentada en polinucleótidos infecciosos de la presente invención es típicamente entre los nucleótidos que codifican el dominio de cisteína proteasa tipo quimotripsina y los nucleótidos que codifican los dominios de transmembrana, y no resulta en un cambio de estructura en la estructura de lectura de ORF1. Como se discute arriba, la eliminación típicamente no incluye todos los nucleótidos que codifican el dominio de cisteína proteasa tipo quimotripsina, todos los nucleótidos que codifican los dominios de transmembrana, o la combinación de los mismos. En algunos aspectos, por ejemplo cuando el polinucleótido infeccioso tiene una similitud estructural con la SEQ ID NO:l, el límite 5' de una eliminación es en el nucleótido 2305, nucleótido 2205, nucleótido 2105, o nucleótido 2062, y el límite 3' de la eliminación es en el nucleótido 3774, nucleótido 3804, nucleótido 3834, o nucleótido 3864. En otros aspectos, por ejerrplo cuando el polinucleótido infeccioso tiene una similitud estructural con SEQ ID NO: 14, el límite 5' de la eliminación es en el nucleótido 2304, nucleótido 2204, nucleótido 2104, o nucleótido 2061, y el límite 3' de la eliminación es en el nucleótido 3455, nucleótido 3495, nucleótido 3525, o nucleótido 3545. La eliminación puede ser al menos 39 nucleótidos, 48 nucleótidos, o 57 nucleótidos. En algunos aspectos, la eliminación puede ser al menos 267 nucleótidos, al menos 276 nucleótidos, o al menos 285 nucleótidos. En algunos aspectos la eliminación no es mayor a 489 nucleótidos, no mayor a 459, no mayor a 429, o no mayor a 402 nucleótidos. Un polinucleótido infeccioso puede tener más de una eliminación en la región nsp2. Los ejemplos de polinucleótidos infecciosos derivados de VR-V7 y que contienen una eliminación se describen en la Tabla 2.

Tabla 2. Polinucleótidos infecciosos derivados de VR- V7 (SEQ ID NO:l) . * la eliminación se refiere a los aminoácidos de nsp2 que se eliminan, por ejemplo, en el virus Nsp2 ?180-323, los aminoácidos 180-323 del nsp2 se eliminan. **el tamaño de placa es en relación a las plaquetas producidas por VR-2332 de tipo silvestre. Un polinucleótido infeccioso que contiene una eliminación puede incluir un polinucleótido exógeno insertado en el lugar de la eliminación. Un polinucleótido "exógeno" se refiere a una secuencia de nucleótido externa, esto es, una secuencia de nucleótido que normalmente no se presenta en un virus PRRS o un clon infeccioso del mismo. El polinucleótido exógeno puede, y preferiblemente codifica el polipéptido. Los polinucleótidos exógenos apropiados incluyen aquellos que codifican un marcador detectable, por ejemplo, una molécula que se detecta fácilmente por varios métodos. Los ejemplos incluyen polipéptidos fluorescentes (por ejemplo, proteínas fluorescentes verde, amarilla, azul, o roja), luciferasa, cloramfenicol acetil transferasa, y otras moléculas (tal como c-myc, flag, ßxhis, péptido enlazado al metal HisGln (HQ) , y epítopo V5) detectables por su fluorescencia, actividad enzimática o propiedades inmunológicas, y típicamente son útiles cuando se detectan en una célula, por ejemplo, una célula cultivada, o una muestra de tejido que se ha removido del animal. Otros polinucleótidos exógenos que pueden usarse son aquellos que codifican polipéptidos expresados por otras entidades, tales como células y patógenos. La expresión de un polinucleótido exógeno resulta en un polinucleótido infeccioso que expresa antígenos externos. Los ejemplos de secuencias de nucleótidos exógenas incluyen aquellos que codifican proteínas expresadas por patógenos, preferiblemente patógenos de porciono, tales como circovirus porcino de tipo 2, Mycoplasma hyopneumoniae (por ejemplo, las proteínas P46 y P65 de M. hyopneumoniae) , Lawsonia in tracellularis (por ejemplo, las proteínas de membrana exterior de L . in tracellularis) , la 0RF5 de diferentes cepas de PRRSV, y Streptococcus suis (por ejemplo, la proteína 38-kDa de S . suis) . El polipéptido nsp2 tiene epítopos de célula B y se espera que sea inmunogénicos. La inclusión de epítopos externos en un polipéptido nsp2 se espera que resulte en una respuesta inmune a los epítopos externos. Los ejemplos adicionales de polinucleótidos exógenos incluyen aquellos modificadores de respuesta biológica codificada, tal como, por ejemplo, IFN-a, IFN-?, IL-12, IL-2, TNF-a, y IL-6. El polinucleótido exógeno se inserta en la región de eliminación de tal manera que está en la estructura con la estructura de lectura abierta que codifica nspla y nsplß, y más de un polinucleótido exógeno puede insertarse en tándem, por ejemplo, secuencias de nucleótido que codifican tres epítopos c-myc pueden presentarse. El tamaño total del polinucleótido infeccioso que contiene un polinucleótido exógeno insertado en el lugar de la eliminación típicamente no es mayor a 16,000 bases, no mayor a 15,800 bases, no mayor a 15,600 bases, no mayor a 15,400 bases, o no mayor a 15,200 bases (incluyendo la cola poly A) . Una inserción puede presentarse en un polinucleótido infeccioso que tiene la eliminación Nsp2 ?324-434, Nsp2 ?324-523, Nsp2 ?543-632, Nsp2 ?633-726, Nsp2 ?543-726, Nsp2 ?727-813, o Nsp2 ?324-726, preferiblemente, la eliminación Nsp2 ?324-434, Nsp2 ?543-632, Nsp2 ?633-726, Nsp2 ?543-726, Nsp2 ?727-813, o Nsp2 ?324-726. Los ejemplos preferidos de clones infecciosos que contienen un polinucleótido exógeno en la ubicación de una eliminación incluyen un polinucleótido infeccioso que tiene la eliminación Nsp2 ?324-434 que contiene una región de codificación que codifica una proteína fluorescente verde de 238 aminoácidos, un polinucleótido infeccioso que tiene la eliminación Nsp2 ?543-632 que contiene una región de codificación que codifica una proteína fluorescente verde de 238 aminoácidos, un polinucleótido infeccioso que tiene la eliminación Nsp2 ?324-434 que contiene una región de codificación que codifica un epítopo c-myc de 10 aminoácidos (EQKLISEEDL, SEQ ID NO: 17), un polinucleótido infeccioso que tiene la eliminación Nsp2 ?324-434 que contiene una región de codificación que codifica un epítopo c-myc de 10 aminoácidos, y un polinucleótido infeccioso que tiene las aliminaciones Nsp2 ?324-726 o Nsp2 ?543-726 cada una contiene una repetición en tándem que codifica la región de codificación del epítopo c-myc de 10 aminoácido . Un polinucleótido infeccioso se presenta típicamente en un vector, y la combinación del polinucleótido infeccioso y el vector se refiere como un clon infeccioso, que se hace a través de genéticos inversos. El vector es un polinucleótido replicado, tal como un plásmido, fago, o cósmido, al cual otro polinucleótido puede enlazarse de manera que se lleva cerca de la replicación del polinucleótido enlazado. La construcción de vectores que contiene el polinucleótido de la invención emplea técnicas de ADN recombinante estándar conocidas en el arte (ver, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) . El vector puede proporcionarse para clonación adicional (amplificación del polinucleótido) , esto es, un vector de clonación, o para la expresión del polipéptido codificado por la región de codificación, esto es, un vector de expresión, o la combinación del mismo. El término vector incluye, pero no se limita a, vectores plásmidos, vectores virales, vectores cósmidos, o vectores de cromosoma artificial. Típicamente, el vector es capaz de la replicación en un hospedero bacteriano, por ejemplo, E. coli . Preferiblemente el vector es un plásmido. La selección de un vector depende de una variedad de características deseadas en el constructo resultante, tal como un marcador de selección, relación de replicación del vector, y similares. Preferiblemente, el vector es apropiado para usarse como parte de un clon infeccioso tanto en un vector de clonación como un vector de expresión. Los vectores útiles tienen un número de copia bajo en la célula hospedera. Las células hospederas apropiadas para clonar o expresar los vectores en la presente son células procariótas o eucarióticas. Preferiblemente la célula hospedera secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Las procariótas apropiadas incluyen eubacteria, tal como organismos gram negativos, por ejemplo, E . coli o S . typhimurium . Las células hospederas ejemplares útiles para hacer, manipular, y mantener un clon infeccioso son DH-5a, DH-1 (ATCC 33849), AG-1, preferiblemente, DH-1 o AG-1. El vector incluye secuencias reguladoras ligadas operablemente al polinucleótido infeccioso. El término "ligado operablemente" se refiere a una yuxtaposición de componentes de tal manera que están en una relación que permite que funcionen en su manera pretendida. Una secuencia reguladora se "liga operablemente" a un polinucleótido infeccioso de la presente invención cuando se une de tal forma que la expresión de la región codificada se realiza bajo afecciones compatibles con la secuencia reguladora. Típicamente, el promotor es uno que proporciona un enlace de alta especificidad de una polimerasa de ARN, y tales promotores incluyen T7, SP6, y T3. Típicamente el promotor se sitúa inmediatamente en dirección 5' del primer nucleótido del polinucleótido infeccioso. Preferiblemente, un GCT se inserta entre el promotor y el primer nucleótido del polinucleótido infeccioso. Opcionalmente y preferiblemente el vector también contiene una ribozima del virus delta de hepatitis en dirección 3' de la región poly A.

El vector opcionalmente, y preferiblemente, incluye una o más secuencias marcadoras de selección, que codifican típicamente una molécula que inactiva o de otra manera detecta o se detecta por un compuesto en el medio de crecimiento. Por ejemplo, la inclusión de una secuencia de marcador de selección puede convertir la célula transformada resistente a un antibiótico, o puede conferir metabolismo específico de compuesto en la célula transformada. Los ejemplos de una secuencia de marcador de selección son secuencias que confieren resistencia a la canamicina, ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina, y neomicina. Cuando se produce una eliminación de nucleótido que codifican un polipéptido nsp2 en un clon infeccioso, las técnicas de ADN recombinante estándar conocidas en el arte pueden usarse (ver, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Como la persona experta reconocerá, es una práctica estándar durante la construcción de un clon infeccioso (y cuando las eliminaciones de construcción en un clon infeccioso) para verificar por análisis de secuencia de nucleótido la presencia de secuencias de nucleótido esperadas, tales como eliminaciones u otras alteraciones y la ausencia de otras mutaciones. Similarmente, cuando un polinucleótido infeccioso candidato se prueba para determinar si está infectado, es una práctica estándar verificar por análisis de secuencia de nucleótido la ausencia de virus de tipo silvestre contaminados . La presente invención también incluye polinucleótidos infecciosos aislados descritos en SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y polinucleótidos infecciosos que tienen similitud estructural a la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. Los métodos para determinar la similitud estructural se describen en la presente. Preferiblemente, un polinucleótido infeccioso de este aspecto de la presente invención tiene una similitud estructural a la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 de al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%. Un polinucleótido que tiene similitud estructural a SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 se considera que es un polinucleótido infeccioso si, cuando se presenta en una partícula de virus y se expone a células permisivas, el polinucleótido replica en las células permisibles y produce partículas de virus infeccioso. La presente invención también incluye partículas de virus aisladas. Como se usa en la presente, los términos "partícula de virus" y "partícula viral" se usan intercambiablemente y se refieren a un polinucleótido de la presente invención rodeado por una envoltura. La partícula de virus de la presente invención pueden, cuando se agrega a la célula de cultivo permisible, pueden replicarse para resultar en la producción de más partículas de virus. Una partícula de virus puede hacerse crecer por pasaje in vivo o en un cultivo celular. El pasaje in vivo incluye inocular un cerdo (Faaberg et al., Patente E.U.A. 7,041,443). El pasaje en cultivos celulares incluye exponer las células cultivadas a la partícula de virus e incubar las células bajo afecciones apropiadas para que el virus se reproduzca y produzca más partículas de virus. Preferiblemente, las células de cultivo no son una línea de célula inmortalizada o transformada (esto es, las células preferiblemente no son capaces de dividirse indefinidamente). Preferiblemente, los macrófagos alveolares de porcino primarios se usan para pasaje en cultivo celular (Faaberg et al., Patente E.U.A. 7,041,443). Un virus de la presente invención puede estar inactivado, esto es, volverse incapaz de reproducirse in vivo y/o en cultivo celular. Los métodos de inactivación se conocen en el arte e incluye, por ejemplo, tratamiento de una partícula de virus de la invención con un agente de inactivación químico estándar tal como un reactivo de aldehido que incluye formalina, acetaldehído y similares; los alcoholes ácidos reactivos incluyen cresol, fenol y similares; los ácidos tales como ácido benzoico, ácido bencen sulfónico y similares; lactonas tales como beta propiolactona y caprolactona; y lactamas activada, cabodiimidas y compuestos de carbonil diheteroaromáticos tales como carbonil diimidazol. La irradiación tal como con irradiación ultravioleta y gamma también puede usarse para inactivar el virus. También se incluye en la presente invención partículas de virus atenuadas (esto es, virus que tienen capacidad reducida para causar los síntomas de enfermedad porcina misteriosa en cerdos), y métodos para hacer una partícula de virus atenuada. Los métodos para producir un virus atenuado se conocen en el arte. Típicamente, el virus de la presente invención se hace en pasaje, esto es, se usa para infectar una célula en cultivo, permitiendo reproducirse, y luego se cosechan. Este proceso se repitió hasta que la virulencia del virus en cerdos se reduce. Por ejemplo, el virus puede pasarse 10 veces en cultivo celular, y luego la virulencia del virus se mide. Si la virulencia no se ha reducido, el virus que no se inyectó en el animal se pasa 10 veces adicionales en el cultivo celular. Este proceso se repite hasta que la virulencia se reduce. En general, la virulencia se mide por la inoculación de cerdos con virus, y se evalúa la presencia de síntomas clínicos y/o LD50 (ver, por ejemplo, Halbur et al, J. Vet. Diagn. Invest, 8:11-20 (1996), Halbur et al, Vet. Pathol, 32:200-204 (1995), y Park et al., Am. J. Vet. Res., 57:320-323 (1996)). Preferiblemente, la virulencia se reduce de manera que el virus atenuado no cuasa la muerte de los animales, y preferiblemente no causa síntomas clínicos de la enfermedad. Típicamente, el cultivo celular útil para producir el virus atenuado de la presente invención incluye células de origen mamífero no de porcino. Los ejemplos de cultivos celulares de mamífero no de porcino incluye, por ejemplo, la línea celular MA-104 (ATCC CRL-2378), la línea celular MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol, 133:477-483 (1993)), y la línea celular CL-2621 (Baustita et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5:163-165 (1993)). Preferiblemente, un cultivo celular mezclado se usa para producir la partícula de virus atenuada de la presente invención. En un cultivo de célula mezclado hay al menos dos tipos de células presentes. Preferiblemente, el cultivo de célula mezclado incluye una línea de célula inortalizada o transformada y un cultivo celular primario. El cultivo celular mezclado es particularmente útil cuando el virus se reproduce lentamente, o no todo, en una línea de célula inmortalizada o transformada. Los ejemplos preferidos de una línea celular ir mortalizada o transformada. Los ejemplos preferidos de una línea de célula inortalizada o transformada para usarse en un un cultivo de célula mezclada incluye, por ejemplo, la línea de célula MARC-145 (Kim et al, Arch. Virol, 133:477-483 (1993)), y la línea celular MA-104 (ATCC CRL-2378) . Preferiblemente, los cultivos de célula primarios para usarse en un cultivo de célula mezclado son de origen porcino. Un ejemplo preferido de un cultivo de célula primario para usarse en un cultivo de célula mezclado es macrófagos alveolares de porcino primarios. La presente invención incluye además los polipéptidos codificados por las regiones que codifican nsp2 presentes en los polinucleótídos descritos en la Tabla 2, incluyendo aquellos que son viables. También se incluyen en la presente invención anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales, que enlazan específicamente un polipéptido codificado por las regiones que codifican nsp2 presente en los polinucleótidos descritos en la Tabla 2. El término "anticuerpo", salvo que se especifique lo contrario, incluye fragmentos de anticuerpos completos que mantienen su actividad de enlace para un antígeno objetivo. Tales fragmentos incluyen fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')2r así como anticuerpos de cadena sencilla (scFv) . Como se usa en la presente, un anticuerpo que puede "enlazarse específicamente" el polipéptido es un anticuerpo que interactúa sólo con el epítopo del antígeno que induce la síntesis del anticuerpo, o interactúa con un epítopo estructuralmente relacionado. Un anticuerpo que se "enlaza específicamente" a un epítopo, bajo afecciones apropiadas, interactúa con el epítopo aún en presencia de una diversidad de objetivos de enlace potenciales. Como se usa en la presente, el término "complejo polipéptido: anticuerpo" se refiere al complejo que resulta cuando un anticuerpo se enlaza específicamente a un polipéptido, o una subunidad o análogo del mismo, en algunos aspecto, un anticuerpo de la presente invención incluye aquellos que no se enlazan específicamente a un polipéptido nsp2 de longitud completa codificado por VR-2332 (por ejemplo, Genbank número de acceso U87392, ORF1 aminoácidos 384-1363 (también ver Allende et al. J. Gen. Virol, 80:307-315 (1999) o 0RF1 aminoácidos 384-1580 (también ver Ziebuhr et al., J. Gen. Virol, 81:853-879 (2000)). Tales anticuerpos pueden identificarse usando métodos de rutina conocidos en el arte. Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse usando el polipéptido intacto. Opcionalmente, un polipéptido nsp2 descrito en la presente puede enlazarse o conjugarse covalentemente a un polipéptido portador para mejorar las propiedades inmunológicas del polipéptido. Los polipéptidos portadores útiles se conocen en el arte. La prparación de anticuerpos policlonales es bien conocida. Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse al inmunizar una variedad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones, hámsters, conejillos de indias y ratas así como animales transgénicos tales como ovejas, vacas, cabras o cerdos transgénicos, con un inmunogeno. Los anticuerpos resultantes pueden aislarse de otras proteínas al usar una columna de afinidad que tiene una porción de enalce Fb, tal como proteína A, o similares. Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse por varias técnicas familiares para aquellos expertos en el arte. Brevemente, las células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado se inmortalizan, comúnmente por fusión con una célula de mieloma (ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse de cultivos de hibridoma por técnicas bien conocidas en el arte.

En algunas modalidades, el anticuerpo puede producirse recombinantemente, por ejemplo, por los métodos de exhibición de fagos o de combinación. Los métodos de exhibición de fagos y de combinación pueden usarse para aislar anticuerpos recombinantes que se enlazan a un polipéptido descrito en la presente, o una subunidad biológicamente activa o análogo de la misma (ver, por ejemplo, Ladner et al., Patente E.U.A. No. 5,223,409). Tales métodos pueden usarse para generar anticuerpos monoclonales humanos. La presente invención también proporciona composiciones que incluyen un polinucleótido infeccioso, polinucleótido PRRS polinucleótido, partícula de virus, o anticuerpo de la presente invención. Tales composiciones incluyen típicamente un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente "portador farmacéuticamente aceptable" incluye solución salina, solventes, medio de dispersión, recubiertas, agentes antibacteriales y antifúngicos, agentes isotónicos y que retardan la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los compuestos activos adicionales también pueden incorporarse en las composiciones.

La composición puede prepararse por métodos bien conocidos en el arte de la farmacia. En general, la composición puede formularse para ser compatible con su ruta pretendida de administración. Los ejemplos de rutas de administración incluyen perfusión y parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), y transmucosal. Las soluciones o suspensiones pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para administración, solución salina, aceites fijos, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfato de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; soluciones amortiguadoras tales como acetatos, citratos o fosfatos; electrolitos, tales como ion de sodio, ion de cloro, ion de potasio, ion de calcio, y ion de magnesio, y agentes para el ajuste de tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La composición puede encerrarse en ampolletas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico. Las composiciones pueden incluir soluciones acuosas estériles (donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles. Para administración intravenosa, los portadores apropiados incluyen solución salina fisiológica, agua bacterioestática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ. ) o solución salina amortiguada en fosfato (PBS). La composición típicamente es estéril y, cuando es apropiado para uso inyectable, deberá ser fluida de manera que existe en forma fácilmente inyectable. Deberá ser estable bajo las afecciones de fabricación y almacenamiento y conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El protador puede ser un solvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol, y polietilen glicol líquido, y similares), y mezclas apropiadas de los mismos. La prevención de la acción de microorganismo puede alcanzarse por varios agentes antibacteriales y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede traerse al incluir en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones estériles pueden prepararse al incorporar el compuesto activo (esto es, un polinucleótido infeccioso o virus PRRS de la presente invención) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados arriba, como se requiere, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados arriba, en el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelado que proporciona un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada estéril de la misma. Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Para propósitos de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en la forma de tabletas, trocitos, o cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina. Estas composiciones también se forman en un polvo o se suspenden en una solución acuosa de tal manera que estos polvos y/o soluciones pueden agregarse al alimento animal o al agua que bebe el animal. Estas composicones pueden endulzarse o saborizarse apropiadamente por varios agentes conocidos para promover la absorción de la vacuna oralmente por el cerdo. Los compuestos activos se pueden también administrar por cualquier método adecuado para la administración de agentes polinucleótidos, por ejemplo, usando pistolas de genes, bio inyectores, y parches para la piel así como métodos libres de agujas tal como las vacunas de ADN de micro-partícula tecnología descrita por Johnston et al. (Patente de E.U.A. No. 6,194,389). Adicionalmente, la liberación intranasal es posible, como se describe en, por ejemplo, Hamajima et al., Clin. Immunol. Immunopathol . , 88:205-210 (1998). Las liposomas y la microencapsulación se pueden también usar. Los compuestos activos se pueden preparar con portadores que protegen el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes. Polímeros biodegradables, biocompatibles se pueden usar, tal como etilen vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Tales formulaciones se pueden preparar usando técnicas estándar. Los materiales se pueden también obtener comercialmente de, por ejemplo, Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales se pueden también usar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estas se pueden preparar de conformidad con los métodos conocidos por aquellos expertos en el arte. La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos activos se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el LD50 (la dosis letal a 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) . La relación de dosis entre efectos tóxicos o terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD5o/ED50. Los compuestos que exhiben altos índices terapéuticos son preferidos. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios animales se pueden usar en formular un rango de dosis para usar en el campo. La dosis de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulatorias que incluyen el ED50 con poca o sin toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosis empleada y la ruta de administración usada. Las composiciones se pueden administrar una o más veces por día a una o más veces por semana, incluyendo una vez cada dos días. El técnico experto apreciará que ciertos factores pueden influir la dosis y tiempos requeridos para tratar efectivamente un sujeto, que incluye pero no se limita a la severidad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad efectiva de un polipéptido puede incluir un tratamiento sencillo o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. La presente invención incluye métodos para usar las composiciones descritas en la presente. En un aspecto la invención incluye métodos para tratar uno o más síntomas de enfermedad porcina misteriosa en un animal que se puede causar por infección por un virus PRRS. El método incluye administrar una cantidad efectiva de una composición de la presente invención a un animal que tiene o está en riesgo de tener enfermedad porcina misteriosa, o síntomas de enfermedad porcina misteriosa. El tratamiento de enfermedad porcina misteriosa, o síntomas de enfermedad porcina misteriosa, puede ser profiláctica o, alternativamente, se puede iniciar después del desarrollo de enfermedad o síntomas del mismo. Como se usa en la presente, el término "síntoma" se refiere a evidencia objetiva en un sujeto de enfermedad porcina misteriosa. Los síntomas asociados con la enfermedad porcina misteriosa y las evaluaciones de tales síntomas son rutina y conocidos en el arte. Los ejemplos de los síntomas incluyen absorción, anorexia, fiebre, letargo, neumonía, decoloración rojo/azul de orejas, respiración trabajosa (dispnea), y aumento en la frecuencia respiratoria (taquipnea) . El tratamiento que es profiláctico, por ejemplo, iniciado antes de que un sujeto manifieste síntomas de una afección causada por un virus PRRS, se refiere en la presente como tratamiento de un sujeto que está "en riesgo" de desarrollar la enfermedad o síntomas del mismo. Típicamente, un animal "en riesgo" es un animal presente en un área donde los animales que tienen la enfermedad o síntomas del mismo se han diagnosticado y/o es probable que se exponga a un virus PRRS. En consecuencia, la administración de una composición se puede realizar antes de, durante, o después de la presencia de las afecciones descritas en la presente. El tratamiento inicial después del desarrollo de una afección puede resultar en la disminución de la severidad de los síntomas de una de las afecciones, o eliminar completamente los síntomas. En algunos aspectos, los métodos típicamente incluyen administrar a un animal una composición que incluye una cantidad efectiva de un virus particular de la presente invención. Una "cantidad efectiva" es una cantidad efectiva para prevenir la manifestación de síntomas de enfermedad porcina misteriosa, disminuir la severidad de los síntomas de la enfermedad, y/o eliminar completamente los síntomas. Típicamente, la cantidad efectiva es una cantidad que resulta en una respuesta inmune humoral y/o celular que protege al animal durante futuras exposiciones a un virus PRRS. La partícula de virus usada en la composición puede contener un polinucleótido infeccioso que tiene una supresión como se describió en la presente. Opcionalmente, el polinucleótido infeccioso también incluye un polinucleótido exógeno presente en la locación de la eliminación. Una ventaja de utilizar una partícula de virus que tiene una eliminación (o un polinucleótido exógeno presente en la locación de la eliminación) es que puede distinguirse fácilmente de otros virus PRRS, incluyendo virus PRRS de tipo silvestre presente en el campo. La partícula de virus se puede identificar por el aislamiento del virus de un animal seguido, por ejemplo, mediante la secuencia, digestión de enzima de restricción, o amplificación con base en PCR de nucleótidos específicos. Tal particular de virus "marcador" frecuentemente se refiere en el arte como una vacuna marcador. En otros aspectos de la presente invención los clones infecciosos y/o polinucleótidos infecciosos descritos en la presente se pueden usar para investigar inserciones de genes viables, para investigar alternativas ARN expreso o proteínas diferentes a virus de longitud completa, para investigar la recombinación viral, y para investigar características inmunológicas de nsp2 de longitud completa con relación a nsp2 truncado.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Los clones de cADN de longitud completa de cepas VR-2332 prototipo de virus (PRRSV) de síndrome reproductivo y respiratorio de porcino Norte Americano se desarrollaron, con cada versión progresiva que posee menos cambios de nucleótido que las versiones anteriores cuando se compara con cepa wt VR-2332. El virus de progenie de cada clon infeccioso se recuperó y analizó por la verificación de secuencia de nucleótido, relación de crecimiento in vi tro y tamaño de placa. La progenie de un clon infeccioso confirma replicación in vivo robusta, visto por la aparición de anticuerpos a-PRRSV en la misma relación como virus wt . El análisis northern blot de la progenie in vivo también revela que especies de ARN subgenómicas defectuosas, denominadas heteroclitos (formas no comunes), se presentaron junto con los genomas de longitud completa. Los análisis northern blot concurrentes de una serie de pasos de cultivos celulares MA-104 infectados revelaron que los virus recombinantes solo gradualmente adquieren un perfil de ambos ARN de longitud completa y heteroclito similar a las especies de ARN vistas en la infección in vivo .

Materiales y Métodos Células y cepas virales. Células MA-104 o sus células MARC-145 descendientes (ATCC CRL-11171), una línea celular epitelial de riñon de mono ver Africano que soporta replicación PRRSV (Meng et al., J. Vet. Diagn. Invest, 8:374-81 (1996)), se mantuvieron en medio esencial mínimo Eagle (EMEM) (JRH Biosciences 56416) , complementado con 1 mg/ml NaHC03 y suero de bovino fetal al 10% (FBS), a 37°C con C02 al 5%. Las células de cultivo se transfectaron con ARN o infectaron con virus cuando el crecimiento de monocapa había alcanzado 70-80% de confluencia. Las cepas VR-2332 prototipo Norte Americanas PRRSV y Ingelvac® MLV se han descrito anteriormente (Yuan et al., Virus Res., 79:189-200 (2001)). Cepas VR-2332 crecen hasta títulos equivalentes en ambas líneas celulares. Purificación de ARN viral. El ARN viral (vARN) se purificó como se describió. (Chen et al., J. Gen. Virol., 75:925-930 (1994); Yuan et al., Virus Res., 79:189-200 (2001) ) . Brevemente, el sobrenadante de las células MARC-145 infectadas con VR-2332 se cosechó en el día 4 posterior a la infección (p.i.). Después de la eliminación de desechos celulares por centrifugación a 12,000 rpm, los sobrenadantes se hicieron en capas en un amortiguador de sacarosa 2 mL 0.5 M y se centrifugó a 76,000 x g durante 4 horas. Los viriones peletizados se volvieron a suspender en 0.5 ml LES (0.1 M LiCl/5 mM EDTA/1.0% SDS) y además se digirieron por adición de proteinasa K 100 µg a 56°C para eliminar todas las proteínas. Después de 10 minutos de incubación, vARN se extrajo varias veces con fenol ácido y fenol/cloroformo y luego se precipitó en 70% v/v etanol. El vARN peletizado se volvió a suspender inmediatamente en 50 µl H20 o solución amortiguadora TE libre de RNasa (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) y se almacenó a -80°C. La construcción de cADN viral de longitud completa. Síntesis de cADN se realizó con Kit Enhanced Avian HS RT-PCR (Sigma, HSRT-100) . Ocho cebadores PCR (Tabla 3) se usaron para amplificar cuatro fragmentos de cADN traslapados que cubren el genoma VR-2332 completo (Figura 2) . Las afecciones cíclicas fueron 9 °C durante 2 minutos, luego 35 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, 68 °C durante 4-5 segundos, seguido por 68 °C durante 5 minutos. Cada fragmento PCR se purificó con el kit de extracción de gel QIAEX II (Qiagen) y clonado en vector pCR®2.1-TOPO® con Kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen K450001) . Los plásmidos que representan cada fragmento se presentaron para el análisis de secuencia de nucleótido. Los fragmentos con las mutaciones de nucleótido mínimas comparadas con secuencia VR-2332 parenteral (presentación GenBank número U87392) se usaron para ensamblar el cADN de longitud completa, como se muestra en la Figura 2. En cada región traslapada, un sitio de enzima de restricción único se utilizó para enlazar fragmentos de franqueo. Cuatro fragmentos de digestión, que representan secuencia genómica de longitud completa, se ensamblaron precisamente en etapas dentro de un un vector plásmido de copia baja modificado (pOK12HDV-Pacl) . El vector se modificó para incluir la ribozima HDV al insertar un fragmento 244 bp Smal a Sacll que contiene la ribozima antigenoma HDV y una secuencia terminadora de polimerasa T7 ARN del vector de transcripción 2.0 (Johnson et al, J. Virol, 71 : 3323-3327 (1997) ; Pattnaik et al. , Cell, 69 : 1011-1020 (1992) ) en los sitios correspondientes en pOK12 (Vieira et al . , Gene, 100 : 189-194 (1991) ) . El sitio de enzima de restricción Ncol en este fragmento pb 244 se remplazó con un sitio Pací único por mutación de oligonucleótido con conjuntos cebadores 5 'pOK12HDV-2157/3 'pOK12HDV-257 y 5 'pOK12HDV-257/polyA-modificados (Tabla 3) , seguidos por fusión PCR. En los clones de cADN de longitud completa , la secuencia genómica viral se precedió por el promotor de polimerasa T7 ARN , 1 ó 2 residuos G y un residuo T , y seguido por una cola de ácido poliadenílico de 50 nucleótidos . Los clones ensamblados se propagaron en la cepa DH5a de Eschericia coli y luego se presentaron para confirmación de secuencia de nucleótido de genoma completo .

Tabla 3. Cebadores de oligonucleótido usados en este estudio. Los cebadores delanteros se indicaron con una barra (/) después de la designación, cebadores inversos son precedidos por una barra. Los sitios de enzima de restricción insertados se muestran subrayados en cursiva.

TABLA 3 Cebador Posición de Genoma* Secuencia Clonación: 5'-ACATGC^GGCTTAATACGACTCACGATAGTATGACGTATAGGTGTTGGCTCTATGCCTTGG T7Lider-V largo/ 1-31 (SEQ ID NO:18) /-V-4300 4617-4635 5'-CTGGGCGACCACAGTCCTA (SEQ ED NO: 19) 5'-40$6-Asdl 4055-4080 5'-CITCTCgGCsCgCCCGAATGGGAGT (SEQ ID NO:20) /3'-7579 7578-7603 5'-TCATCATA£CSí?=GCCTGCTCCACG (SEQ ID NO:21) 5*-7579/ 7578-7603 5'-CGTGGAGCAGGCCjC7 £TATGATGA (SEQ ID NO:22) /P32 13293-13310 5'-TGCAGGCG AACGCCTGAG (SEQ ID NO:23) V 1509/ 11938-11958 5'-GTGAGGACTGGGAGGATTACA (SEQ ED NO:24) /extremo 3'-FL 15405-15411 5'-GTCTp?42TAiCTAGCn„AATTrCG (SEQ ID NO:25) 10 Ui Mutagenesis: 5'-pOK12HDV-257/(Spi-I, Pací) pOK12HDV-Pad 257-282 y-GAtGCATGCCATTAATTAAGGGTCGGC (SEQ ID NO:26) /3'-pOK12HDV-257(SphI, Pací) pO 12 HDV-PacI 257-282 5'-GCCGACCC22. i-eááTGsC4ZS£ATC (SEQ ID NO:27) T7lider-V -2G/ 1-5 5,-ACATGCATGCTTAATACGACTCACTATAGGTATGAC (SEQ ID NO:28) 7475G2A/ 7453-7477 5'-5Phos CTGTGTGGACATGTCACCATTGAAA (SEQ ID NO:29) 13860C2T/ 13843-13867 5'-5Phos GTGTATCGTGCCGTTCTGTTrTGCT (SEQ ID NO-.30) 14979A2G/ 14958-14982 5'-5Phos/CAGATGCTGGGTAAGATCATCGCTC (SEQ ID NO:31) Análisis Northem Blot : ß'-UTR 15298-15336 S'-GCACAATGTCAATCAGTGCCATTCACCACACATTCTTCC (SEQ ID NO:32) /la-p222 221-261 5'-TAGACTTGGCCCTCCGCCATAAACACCCTGGCATTGGGGGT (SEQ ID NO:33) * La posición del genoma se basa en la presentación del GenBank U87392 La modificación y análisis de secuencia de clones de cADN de longitud completa. Kit de Mutagenesis dirigido a múltiples sitios QuikChange® (Stratagene) se usó para modificar todos los clones cADN de pVR-V4 hasta pVR-V6G7475A. Los insertos de plásmido de cADN genómico completo se presentaron luego en el Centro de Análisis Genético Avanzado de la Universidad de Minesota (AGAC) por análisis de secuencia de nucleótido con cebadores de secuencia adecuados (Tabla 3) . Las diferencias de secuencia entre pVR-V4 a través de pVR-V6G7 75A, así como a aquellos de VR-2332 parental, su correspondiente cepa de vacuna atenuada, Inglevac MLV, y pVR-HN, el primer clon infeccioso de VR-2332, se enlistan en la Tabla 4 (Nelsen et al, J. Virol., 73:270-80 (1999); Yuan et al., Virus Res., 79:189- 200 (2001); Nielsen et al., J. Virol., 77:3702-3711 (2003)).

Tabla 4. Las diferencias de nucleótido entre cepas PRRSV y clones infecciosos VR-2332. Sólo en las posiciones donde las diferencias de nucleótido se notaron se muestran. Los nucleótidos que se representan en cepa VR-2332 se muestran en cuadros sin sombra. Cuadros de sombreado ligero representan diferencias de nucleótido que son únicas del clon infeccioso, cuadros de sombreado medio destacan aquellos nucleótidos que también se ven en Ingervac® MLV, y cuadros que son sombras negras indican nucleótidos únicos de cerdos. Las regiones que no fueron secuenciadas se indican por una barra. ^r PQ < En LD LD LT) LT) D * Las bases negativas se refieren a aquellos nucleótidos presenten en el ARN después de la transcripción y derivados del promotor de polimerasa ARN inmediatamente en dirección 5' del polinucleótido infeccioso. Estos nucleótidos derivados de promotor son tipicamente no se presentan más en un polinucleótido infeccioso después de que se haya pasado 9 veces . Transcripción ín vi tro. El clon cADN de longitud completa se linearizó por desdoblamiento con Pací, que corta en dirección 3' de la cola poly (A). Transcritos de ARN tapados [análogo de tapa m7G ( 5 ' ) ppp ( 5 ' ) G] se produjeron usando el kit mMESSAGE MACHINE™ (Ambion) y una relación 2:1 optimizada de análogo de tapa metilada a GTP. Aproximadamente 50 hasta 60 µg de ARN se generó de 2 µg de plantilla ADN en 20-µl de mezcla de reacción. El aumento de la relación de análogo de tapa a GTP substancialmente reduce el rendimiento de ARN. El ARN se purificó posteriormente por cloroformo fenol ácido seguido por precipitación de isopropanol y se vuelve a suspender en solución amortiguadora libre de nucleasa (pH 8.0) . El ARN se evaluó para calidad por comparación de tamaño con ARN viral VR-2332 tipo silvestre en un gel de agarosa desnaturalizado glioxal 1%, y cuantificó por espectrofotometria a OD26o- Transfección celular MARC-145. Un procedimiento de transfección modificado se generó con base en el acercamiento descrito por Nielsen (Nielsen et al., (J. Virol, 77:3702-3711 (2003) ) . Para la transfección, células MARC-145 se sembraron sobre placas de seis pozos (2-3 x 105 células/pozo) en 3 ml de medio completo [EMEM complementado con suero de bovino fetal al 10% (FBS)] y luego incubaron a 37°C, C02 5% durante 20-24 horas hasta aproximadamente 80% confluente (Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126 (1992)). 4 µg de ARN transcrito in vi tro diluido en Medio de Suero Reducido 500 µl Opti-MEM® I (Invitrogen) y 2 µl de 1, 2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxi etil amonio bromuro y colesterol (DMRIE-C; Invitrogen) diluido en 1 ml medio Opti-MEM® se combinaron y pusieron en vórtice brevemente. Las células MARC-145 se lavaron una vez con 2 ml medio Opti-MEM® y luego traslaparon inmediatamente con la solución de complejo lipido:ARN. El DMRIE-C sin ARN (2 µl) se usó como un control negativo y DMRIE-C con cepa 10 -100 ng (tipo silvestre) wt VR-2332 ARN viral purificado se usó como un control positivo. Después de 4 horas de exposición a los complejos lipido:ARN, las monocapas se lavaron y el medio fresco completo (EMEM con 10% FBS) se agregó. Los sobrenadantes de células transfectadas se monitorearon diariamente para la aparición de efecto citopático (CPE) y pasaron sobre MARC-145 fresco a 72-96 horas después de la transfección. Detección de ARN viral de la progenie. Para detectar ARN viral de la progenie, el sobrenadante de cultivo celular de células MARC-145 transfectadas e infectadas se cosecharon. El ARN se aisló con Kit de ARN viral QiaA p (Qiagen) . El RT-PCR se realizó con pares de cebador seleccionado, especifico a los nucleótidos de cepa VR-2332 que son indicativos de residuos mutados de clon infeccioso (Tabla 3) . La confirmación de progenie de clon infeccioso se obtuvo por verificación de secuencia de nucleótido de nucleótidos específicos de clon presentes en los productos RT-PCR. Detección de proteína nucleocapsida viral de la progenie. Los ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA) se usaron para detectar expresión de proteína viral en ARN transcrito in vi tro transfectado, o virus de progenie infectado, células MARC-145 preparadas en cubiertas deslizables. Las células infectadas se fijaron en paraformaldehído 3.7% con solución salina amortiguada con fosfato (PBS), pH 7.5, a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las células fijadas se lavaron con PBS, incubaron a 37 °C durante 45 minutos en anticuerpo monoclonal SDOW17 específico de proteína núcleo-cápsida PRRSV (Magar et al, Can. J. Vet Res., 59:232-234 (1995)) y además incubaron con inmunoglobulina G de cabra anti-ratón (IgG) conjugada con isotiocianato de fluoresceina a 37 °C durante otros 45 minutos (1:100 dilución) (Sigma). Las cubiertas deslizables se lavaron con PBS, montadas en una diapositiva usando aceite para montar gel, y observaron bajo un microscopio fluorescente. Ensayo de placa viral. Las monocapas de célula MARC-145 en placas de seis pozos se infectaron con sobrenadante de célula (en diluciones 10 veces) de células MARC-145 transfectadas o infectadas por incubación a temperatura ambiente durante 1 hora. Las monocapas infectadas se lavaron posteriormente una vez con FBS EMEM/10% fresco, inmediatamente se sobreponen con Agarosa SeaPlaque 1% estéril (Bio hittaker Molecular Applications, Rockland, Maine) en MEM IX (Sigma M4144)/10% FBS/2% (p/v) NaHC03AX glutamina/lX aminoácidos no esenciales/10 mM HEPES/2% (v/v) gentamicina, e incubaron a 37°C/5% C02, invertido, durante 5 días. Después de la eliminación cuidadosa de la agarosa, las células se tiñeron con violeta cristal 5% en etanol 20% durante 10-30 minutos para la visualización del tamaño de placa. Curva de crecimiento viral. Las monocapas MARC-145 en matraces T-75 se inocularon con ya sea PRRSV parental o recombinante diluido en EMEM libre de suero a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.001. Después de 1 hora enlazado a temperatura ambiente con mezclado suave, los inóculos se removieron y las monocapas se lavaron tres veces con EMEM libre de suero. Después del lavado, medio completo 4 ml se agregó y los matraces se incubaron posteriormente durante hasta 5 días a 37°C, 5% C02. Las alícuotas (0.5 ml) se cosecharon inmediatamente después de la adición de medio (punto de tiempo hora 0) y a 24, 48, 72, 96 y 120 horas y almacenado a -80°C. Las diluciones en serie de las muestras se usaron para infectar células MARC-145 frescas y las células luego se procesaron como se describió arriba. Después de la eliminación de la agarosa, las placas se visualizaron y contaron. Los resultados de la curva de crecimiento se expresaron como PFU/ml. Inoculación ín vivo de virus de progenie. Diez cerdos de 4 semanas de edad de camada y sexo mezclados de una manada seronegativa PRRSV se dividieron en tres grupos, cada uno consiste de dos animales. El primer grupo recibió 103"5 dosis infecciosa de cultivo de tejido al 50% (TCID50) de virus clonados (pVR-V5, tercero pasa en células MARC-145) por ml, el segundo grupo recibió 105'4 TCID50 por ml de la cepa VR-2332 de virus parenteral (cuarto pasa en células MARC-145) , y el tercer grupo se inoculó por imitación con EMEM. Todos los animales recivieron 2 ml de inoculo por inyección intramuscular. Los animales se mantuvieron en cuartos separados en todo el experimento y observaron diariamente de los signos clínicos. A todos los cerdos se les aplicó la eutanasia en el día 28 posterior a la infección. Para recuperar el virus, las muestras de suero individual se diluyeron 5 veces con EMEM incompleto y colocaron en monocapas MARC-145 frescas durante 1 hasta 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Los inóculos se removieron luego y EMEM completo se agregó. Las células infectadas se incubaron a 31 ° , 5% C02 y observaron diariamente. Una vez que CPE fue evidente, los sobrenadantes de célula infectada se congelaron a -80°C hasta que además se caracterizó. Análisis Northern Blot. Los transcritos pVR-V6G7475A se transfectaron en células MA104 y luego se pasaron sobre células frescas durante varios pasos. Para análisis posterior northern blot, los sobrenadantes del paso 1 (Pl) , P3, P6, P8 y PÍO se diluyeron 1:50 y luego se usaron para infectar células (1 ml/T75 matraz) en el mismo día. Al mismo tiempo, el suero de credos infectado se diluyó 10 veces y luego se usó (1 ml) para infectar un matraz T75 separado. El efecto citopático se vio en el día 3 p.i. para todos los matraces. El ARN intracelular se extrajo usando un kit RNeasy Midi (Qiagen) y procesó por electroforesis (15 µg/muestra) en un gel desnaturalizado glioxal como se describió previamente (Nelsen et al., J. Virol, 73:270-80 (1999)). El ARN transcrito pVR-V6G7475A (100 ng) se corrió como un control. Después de transferir ARN a Membrana de Transferencia de Nylon MagnaGraph de 0.45 micrones (Osmonics), la membrana se probó con oligonucleótido / la-p222 etiquetado, extremo etiquetado con ?-32P-ATP (Amersham) usando cinasa de polinucleótido (Promega) como se describió previamente (Nelsen et al., J. Virol, 73:270-80 (1999)).

Análisis de secuencia de ácido nucleico de virus de progenie.

La amplificación rápida de 5 ' y 3' de extremos de cADN (RACE) se realizó con Kit de Amplificación de cADN SMART™ RACE (BD Bioscience) o Conjunto de Núcleo de Carrera Completa 5' o 3' (TaKaRa Bio Inc) en ARN viral aislado con el Mini Kit de ARN QIAmp®Viral (Qiagen) . La secuencia de nucleótido restante se determinó de los productos RT-PCR de los pares de cebador desarrolados para cubrir la totalidad del genoma de la cepa VR-2332 (Tabla 3), como se describió previamente (Yuan et al., Virus Res., 79:189-200 (2001)). Los productos se presentaron para determinación de secuencia de ácido nucleico en el Centro de Análisis Genético Avanzado de la Universidad de Minesota. La secuencia viral completa con al menos una cobertura de tres veces se ensambló inicialmente con el conjunto SeqMan del software de análisis de secuencia Lasergene® (ADNSTAR, Inc.), y además analizó usando software de paquete Versión 10.3 GCG Wisconsin (Accelrys Inc.). La cepa VR-2332 (Acceso al GenBank U87392) cepa Ingelvac® MLV (Acceso GenBank AF066183) y clon cADN pVR-HN (Acceso al GenBank AY150564; Nielsen et al., J. Virol., 77:3702-3711 (2003)) se usaron en todas las comparaciones de nucleótido para cepas de virus recombinante.

Resultados Modificación de vector pOK12. El pOK12 (Acceso al GenBank AF223639; Vieira et al., Gene, 100:189-194 (1991)), un vector de clonación de copia baja, se modificó por digestión con Smal (sitio de enzima a 273 pb en pOK12) y Salí (sitio a 307 pb) e insertando el fragmento 244 pb Smal-Sall del Vector 2.0 (7) que contiene la ribozima (HDV) del virus de hepatitis delta. El vector (pOK12HDV) se modificó además por mutagenesis de un sitio Kpnl existente (sitio pOK12HDV en 273 pb) para insertar un sitio de enzima de restricción Pací a través del uso del par cebador 5'-pOK12HDV-257SphIPacI/3'-pOK12HDV-257SphIPacI. La ribozima HDV se agregó para proporcionar por el desdoblamiento efectivo precisamente en el extremo 3' del tracto polyA. Los estudios revelaron que la modificación no fue necesaria para obtener virus de progenie infeccioso. Construcción de clones de cADN de longitud completa. La estrategia de clonación se describe en la Figura 2. Cuatro fragmentos de genoma traslapados se amplificaron de ARN viral VR-2332 purificado por RT-PCR usando los pares de cebador indicados (Figura 2, Tabla 3) . Cada fragmento se clonó individualmente en el vector pCR®2.1-TOPO® para generar el clon intermediario pCR-Sphl-Fsel (segmento I), pCR-Fsel-AvrlI (segmento II), pCR-AvrlI-BsrGI (segmento III) , y pCR-BsrGI-Pací (segmento IV) . Los clones cADN se digirieron luego con dos enzimas de restricción únicas, como se indica por el nombre del clon. Cuatro fragmentos se purificaron con gel y ligaron en etapas al vector pOK12HDV-PacI para generar un clon de cADN de longitud completa de PRRSV (pVR-V4). En el clon cADN de longitud completa, la secuencia genómica viral se impulsó por promotor de polimerasa T7 ARN y seguido por cola de ácido poliadenílico de 50 nucleótidos. Los transcritos de ARN de clon pVR-V4 no exhiben infectividad PRRSV típica cuando se transfectan en células permisivas, aunque el ARN viral se puede detectar durante los diversos pasos. Cuando se compara con la cepa VR-2332, un total de 45 mutaciones de nucleótido (Tabla 4) conducidas a 21 cambios de aminoácido se detectaron (Tabla 5) , a través de diversas mutaciones son los mismos como se identificó previamente en Ingelvac® MLV (Yuan et al., Virus Res., 61:87-98 (1999)).

Tabla 5. Las diferencias de aminoácido entre cepas PRRSV y clones infecciosos VR-2332. Solo en las posiciones donde las diferencias de nucleótido se notaron se muestran con posición de aminoácido correspondiente dentro de la región genómica identificada. Los aminoácidos que se representan en cepa VR-2332 se muestran en cuadros sin sombra y las identidades de aminoácido de clon infeccioso con VR-2332 se representan por cuadros en blanco. El texto en cada cuadro individual representa cambios silentes o de aminoácido debido a las diferencias de nucleótido mostradas en la Tabla 2. Los cuadros de sombreado ligero representan diferencias de nucleótido que son únicas al clon infeccioso, cuadros de sombreado medio destacan aquellos nucleótidos que también se ven en Ingelvac® MLV, y los cuadros que están sombreados en negro indican nucleótidos únicos de cerdos. Los aminoácidos separados por barras indican números de aminoácido ORF2a/ORF2b. Las regiones que no fueron secuenciadas se indican por una barra.

LO LO LO líl Debido a que muchas mutaciones en el pVR-V4 se presentan en la región critica codificada de la helicasa supuesta, polimerasa y otras porciones de Nidovirus (Figura 3, Tabla 4), los clones adicionales del segmento genómico III (pCR-AvrlI-BsrGI) se generaron y se secuenciaron en su totalidad. Después de reemplazar el segmento III de pVR-V4 con la secuencia más exacta del fragmento obtenido, nuevamente se determino que la secuencia de nucleótido del clon de longitud completa genómico completo (pVR-V5) . Excepto por la región reemplazada y por cuatro mutaciones espontáneas (nucleótidos 1595, 13860, 14336, y 14404), estos dos clones genómicos fueron idénticos (Tabla 4) . El análisis de la secuencia de pVR-V5 mostró que este clon contiene un total de 23 mutaciones comparada a la cepa VR-2332. De estos 23 cambios, solamente 8 mutaciones de nucleótidos codificados por un cambio en el aminoácido de cinco de las mutaciones de los residuos de aminoácido fueron idénticos a Ingelvac® MLV y asi no se predice que afecte adversamente la replicación in vi tro (Tabla 4). El clon pVR-V6 se deriva de la mutagénesis dirigida al sitio del segmento de genoma IV para reparar los nucleótidos 13860 y 14979 usando los cebadores 13860C2T/ y 14979A2G/, respectivamente. La mutación de estos dos nucleótidos deberá corregir el residuo de aminoácido 25 de GP5 (L~F) y el residuo 31 de la proteina nucleocapsida (T"*A) . El análisis del clon pVR-V6 confirma que los nucleótidos que se vuelven a corregir hasta nucleótidos de tipo silvestre (wt) y no resultan en cualquiera de otros cambios de nucleótido en otros lugares en donde el genoma se compara al pVR-V5 (Tablas 4 y 5) . Finalmente, la mutagénesis dirigida al sitio en el segmento de genoma III usando un oligómero 7475G2A se completa en ambos pVR-V5 y pVR-V6 con objeto de corregir una alteración de wt VR-2332 en nt 7475. El cambio de G?A en nt 7475 resulto en una glicina (G) en el 0RF1 aminoácido 2429 en los dos clones recombinantes al ácido glutámico (E) observado en la cepa viral VR-2332 parenteral. Los dos clones finales, pVR-V5G7475A y pVR-V6G7475A se secuenciaron nuevamente en su totalidad y se encontró que tiene solamente (nt 7475) alterado de los plásmidos pVR-V5 y pVR-V6, respectivamente (Tabla 5) . El pVR-V6G7475A asi contiene el nucleótido 11 y no tiene cambios de aminoácidos de la cepa VR-2332, además estos también se observan en Ingelvac® MLV. Como puede observarse esquemáticamente en la figura 3 para el constructo final (pVR-V6G7475A) , y se detalla en las Tablas 4 y 5, todos los clones de longitud completa todavia poseen cambios de nucleótidos dispersos a través del genoma, primariamente en las regiones equivocadamente definidas de ORF1. Sin embargo, el grupo grande de los cambios del nucleótido ORFIb que presumiblemente previene el pVR-V4 de la replicación viral completa se reparan en las últimas versiones de los clones de genoma de longitud completa. Solamente una mutación de nucleótido (nt 11329 codificado por la mutación G3739A) se mantuvo en ORFlb del pVR-V5 y los últimos clones y esta mutación no previene el Ingelvac® MLV de infectar y replicar eficientemente en las células cultivadas. Las tablas 4 y 5 también exhiben la información del residuo para el clon infeccioso publicado previamente, pVR-HN (Nielsen et al., J. Virol, 77:3702-3711 (2003)), mostrado para la replicación en animales. Esto es un incremento substancial en el número de residuo en pVR-HN (15 nucleótidos) que directamente exhiben la secuencia de Ingelvac® MLV sobre el constructo final, pVR-V6G7475A (7 nucleótidos) . La caracterización del virus recombinante. Los transcritos de ARN de longitud completa de cada clon de ADNc se producen. La transfección de la célula MARC-145 con los transcritos de ADNc o ARN viral wt VR-2332 (vARN) resultan en CPE, la caracterización por el agrupamiento de células seguido por lisis, a 48 hasta 72 horas después de la transfección. El CPE causado por los transcritos recombinantes se retrasa y de alguna manera distinta comparada a aquélla inducida por wt VR-2332 vARN en la cual CPE se presenta como una agregación vigorosa, separación y disrupción. 96 horas después de la transfección, más de las células transfectadas con VR-2332 vARN se someten a lisis y se separan de la placa, mientras que menos CPE severo se apareció en las células transfectadas con el clon in Vi tro derivado de transcritos de ARN.

Los virus (PO) s- cosecharon de las células transfectadas y una alicu. ta (10 µl diluida hasta 1 ml en el medio de cultivo) se usó para infectar las células MARC-145 por amplificación del virus de progenie. Después deque el CPE se detecto, el virus (Pl) se cosecho nuevamente y una alícuota se usó para la reinfección de las células MARC-145. Los virus recombinantes en el sobrenadante de la célula (P2) se utilizo para la purificación del ARN viral, el cual luego se uso para obtener los fragmentos de RT-PCR con pares cebadores 5 ' -6800/3 ' -ORFlb (nt 6796-7614) y P51/05P4 (nt 13757-14341) . Los fragmentos PCR obtenidos se someten por análisis de secuencia de nucleótido para confirmar que la infección observada fue debido a los transcritos de ARN de longitud completas transfectados del constructo infeccioso y no un resultado de la contaminación debido al virus wt . Las mutaciones del nucleótido en los diferentes residuos de nucleótidos 7329, 7475, 7554, y 13860 se observaron en el virus de progenie del pVR-V5, y 7329, 7554, y 13860 se detectaron en el virus de pVR-V5G7475A. Similarmente, las mutaciones en los residuos 7329, 7475, y 7554 se detectaron en la progenie pVR-V6 y mutaciones en 7329 y 7554 se detectaron en el virus resultante de pVR-V6G7475A (Tablas 4 y 5) . Las mutaciones correspondientes no se observaron en los virus P2 a partir de las transfecciones de wt vARN .

Análisis de inmunofluorescencia del virus recombinante. Los ensayos de inmunofluorescencia directos se usaron para detectar la expresión de la proteina nucleocapsida PRRSV en células MARC-145 infectadas. Todas las células infectadas por transcritos del virus recombinante (P2 y en) asi como el vARN fueron positivos por este método. La acumulación nucleolar masiva de la proteina nucleocapsida fue fácilmente aparente, como se reporta previamente por Rowland et al. (Virus Res., 64:1-12 (1999) ) . La infección in vivo con el virus recombinante derivado pVR-V5. Los virus recombinantes recuperados de P3 de las células MARC-145 transfectadas con los transcritos de ARN del clon ADNc pVR-V5 se inocularon en cerdos jóvenes en paralelo con wt VR-2332, virus de vacuna Ingelvac® MLV y salina (control negativo) . Las muestras sanguíneas se colectaron en los dias 0, 3, 5, 7, 14, 21 y 28 p.i. y se analizaron por seroconversión por HerdChek PRRS 2XR ELISA (IDEXX) y por recuperación de virus. En el dia 28, todos los animales infectados se seroconvirtieron con aproximadamente los mismos cinéticos, revelando que los virus recombinantes pVR-V5 se replican bien in vivo (Figura 4). Las señales clinicas se ausentaron de todos los animales durante el curso del experimento, pero este no es inesperado como la cepa wt VR-2332 después de que no se produce la enfermedad abierta en cerdos jóvenes y resulta en ganglios linfáticos ampliados solamente transitoriamente, tipicamente en el dia 14 p.i. Una muestra de suero de un animal infectado con progenie de pVR-V5 (Sw612), tomado en el dia 14 p.i., se usó para infectar las monocapas MARC-145 frescas para la recuperación del virus recombinante pasajero in vivo . Como se describe previamente, el virus derivado de la transfección ín vi tro del transcrito pVR-V5 ARN del clon causado solamente en CPE minimo (evidenciado por el agregado de células infectadas) mientras los virus recuperados a partir del suero del dia 14 de los animales probados causado por CPE tipico (agregado de células, separación y disrupción) en la 96 horas después déla infección. Esto sugiere que un cambio en el genotipo o fenotipo viral se presenta mientras el pVR-V5 se replica in vivo . Con objeto de aclarar la razón para el cambio aparente en el fenotipo, el análisis de secuencia del genoma completo se completó en el virus recuperado de un cerdo (Sw612) y luego se pasa una vez en las células MARC-145 para amplificar la progenie Sw612 (Figura 3, Tablas 4 y 5) . Cuando se compara al virus usado para infectar cerdos, pVR-V5, los cambios de nucleótidos específicos del clon del ADNc infeccioso 17 se retienen en Sw612, alguno de los cuales también se observa en Ingelvac® MLV (7/17 nucleótidos). Los dos residuos G no virales seguidos por un residuo T en el extremo 5' y del transcrito del clon pVR-V5 original no se observaron en el virus derivado de la infección in vivo . La degeneración se observó en las posiciones del nucleótido 9958 (R), 14336 (Y) y 15411 (Y). El nucleótido tipo wt VR2332 (G) en la posición 9958 muestra degeneración con un nucleótido tipo Ingelvac® MLV (A) . Este cambio resulta en una mutación de un residuo de glicina a un residuo de ácido glutámico, respectivamente (Tabla 2) . En la posición 14336, la degeneración se detectó como una base especifica del clon infecciosa (C) y una base especifica wt VR-2332- (T) , la cual refleja una mutación silenciosa. Otra mutación (nt 7475) se presenta en un residuo G que se reduce al residuo wt A. Sin embargo, estos fueron otros 5 nucleótidos diferentes (nt 102, 827, 1379, 14686 y 15411) que no se observaron en cualquiera de los otros virus en este estudio. El nucleótido 102 se localiza en la secuencia lider, no obstante no se translada. Sin embargo, si la secuencia lider se translada, el ORF codificado (VR-2332 nucleótidos 1-100) deberá extenderse por un residuo de aminoácido (W) . Las mutaciones en los residuos 827 y 1379 llevan a las mutaciones en ORFla, en ambos casos resultando en un cambio de aminoácido de wt VR-2332 codificado de alanita hasta una Sw612 valina. El residuo de guanina en nt 7475 de pVR-V5 ha mutado hasta wt adenina. Este resulta en una mutación de aminoácido no conservado G3294A, que se extiende en un producto de desdoblamiento de proteasa predicha ORFla NSP7 y esta región genomita no tiene definida la función a la fecha. El nucleótido 14686, localizado en 0RF6, mostró un cambio de una wt VR-2332 guanina hasta una alanita en Sw612, el cual todavia codifica el aminoácido de glicina. El otro cambio de nucleótido único se presenta en el extremo muy 3' de la secuencia viral (nt 15411), antes del inicio de la cola polyA. En este caso, un residuo de timina previamente conservado revela la degeneración con un residuo de citosina. Estos cambios genéticos, aunque sean informativos, no revelan inmediatamente las causas del cambio en el crecimiento del fenotipo observado. Sin embargo, esto se revela que la naturaleza errante de la replicación PRRSV in vivo y sugiere que una secuencia genomica viral moderadamente diferente de wt VR-2332 fue capaz de replicar la eficiencia (Figura 3) . Comparación del tamaño de placa viral. Las determinaciones del tamaño de la placa del virus recombinante asi como el wt VR-2332 se completaron en paralelo en células MARC-145 en 120 horas p.i. (Fig. 5A) . Las placas formadas de la cepa VR-2332 que promedian 3 mm en tamaño, mientras la progenie del conducto 3 del clon de pVR-HN ADNc formó placas ligeramente pequeñas (2.5 mm promedio) . En contraste, solamente las placas localizadas se obtuvieron de los virus recombinantes derivados de pVR-V5 y pVR-V6, y estos fueron solamente fácilmente aparentes a través del examen del microscopio (Fig. 5A) . El v-rus recombinante recuperado de los clones pVR-V5G7475A y pVR-V6G7475A formados, en promedio, 1.5 mm y 2mm placas respectivamente. Sin embargo, en otro ensayo, las placas producidas por la progenie viral (Sw612) recuperadas de la infección in vivo del virus recombinante derivado VR-FLV5 fueron muchos más grandes, aproximadamente igual en ambos tamaños y número como aquellos derivados de wt VR2332 (Fig 5B) . Solamente los volúmenes mínimos de los sobrenadantes de la célula contienen cada uno virus recombinante restante. Por lo tanto, con objeto para examinar completamente el papel del cambio de nucleótido en el tamaño de placa determinado, se transfectaron en transcritos de ARN frescos producidos a partir de pVR-V5, pVR-V6, pVR-V5G7475A y pVR-V6G7475A en células MARC-145 (segundo linaje denominado) . El virus de la progenie del pasaje 3 de cada clon infeccioso en el dia 5 después de infección se analizo nuevamente para el tamaño de placa en comparación a wt VR-2332, VR-HN y virus Sw612es. En contraste al ensayo de la placa previa, todos los tamaños de la placa parecieron similares, con el virus recombinante obtenido de pVR-V5, pVR-V6, pVR-V5G7475A solamente ligeramente más pequeño que el derivado in vivo wt VR-2332, Sw612 y virus pVR-V6G7475A (Fig. 6A) . El virus recombinante, sin embargo, aun no han imitado directamente a la infección viral auténtica como se muestra por aproximadamente las concentraciones 10 veces menores cuando se comparan a wt VR-2332 o al virus recombinante pVR-V5 que se pasa a través del cerdo (Sw612) (Fig. 6B) . Análisis de la secuencia de nucleótido de la primera y segunda preparación del virus de linaje. El análisis de secuencia de nucleótido limitada (debido a limitación de solución de reserva del virus) del virus derivado de pVR-V5 del pasaje 3 inoculado en cerdos (V5-1-P3) y análisis de secuencia de nucleótido completo de del virus derivado de pVR-V5 del pasaje 3 obtenido arriba (V5-2-P3) se completaron con objeto de revelar la razón genética para las discrepancias de tamaño de placa. Tales análisis revelaron que dos virus V5 preparados independientemente definidos en la secuencia en el extremo 5' (tabla 4) . El virus que tiene placas puntiformes producidas (V5-1-P3) no tiene nucleótidos en el extremo 5' ajenos, como se muestra en la secuencia del nucleótido de la cepa wt VR-2332, mientras que producen placas más largas (V5-2-P3) que poseen 4 residuos de timidina sin plantilla en la terminal 5' (Tabla 4). La secuencia de nucleótido V5-1-P3 viral restante podrá obtenerse coincidentemente de manera que el virus V5-2-P3, asi como aquel del clon precursor. Sin embargo, el análisis de secuencia completa del virus V5-2-P3 revela que el virus exhibe la degeneración del nucleótido en diversos sitios genómicos. Se obtienen hallazgos similares cuando se analizan la regiones limitadas del virus del segundo linaje VR-FLV5G7475A-P3 y VR-FLV6G7475A-P3. Al menos dos progenies de clon infeccioso exhiben diferentes terminales 5' asi como exhiben la degeneración en la secuencia. Curvas de crecimiento viral. Las determinaciones de la curva del crecimiento viral en una etapa simultánea se contemplaron usando las células MARC-145 y virus de pasaje 3 (segundo linaje) (Fig. 7). El virus recombinante recuperado de pVR-V5, pVR-V5G7475A, pVR-V6, y pVR-V6G7475A y pVR-HN exhiben rangos de crecimiento viral en una etapa similar, pero sus picos de la replicación fueron todos significativamente inferiores a la cepa wt VR-2332 y Sw612, la progenie in vivo de pVR-V5. También, los rangos de replicación de las preparaciones del virus recombinante derivadas de pVR-V5, pVR-V6 y pVR-HN de alguna manera se reducen en comparación al virus derivado del pVR-V5G7475A y pVR-V6G7475A. Al menos dos clones infecciosos codifican poco como 13 y 11 nucleótidos diferentes, respectivamente, resultando en 2 y cero cambios de aminoácido, de la secuencia wt VR-2332 además de los cambios observados en Ingelvac® MLV. Estos datos luego revelaron que los virus con poco como 11 cambios de nucleótidos de wt VR-2332 y su descendencia aminorada Ingelvac® MLV de alguna manera fallan en la replicación. Correspondientemente, las concentraciones resultantes de los virus wt VR-2332 y Sw612es fueron aproximadamente 6-15 veces mayor que los virus recombinantes que no se observan en los cerdos (Figs. 7A y 7B) . Análisis Northern de vARN . Las especies de ARNsg de los PRRSV defectuosos, se identificaron previamente como ARN subgenómicos de heteroclito (latin: formas no comunes), se muestran que son un constituyente de la infección PRRSV y no pueden prepararse de los genomas virales de longitud completa por los métodos estándar tales como cultivo de pasaje celular en multiplicidades bajos de infección o centrifugación de gradiente de sucrosa (Yuan et al., Virology, 275:158-169; 30 (2000); Yuan et al., Virus Res., 105:75-87 (2004)). Para explorar si o no los heteroclitos PRRSV se producen durante la transcripción in Vi tro de los clones de genoma de ADNc de longitud completa o aparecen después de la transfección/infección subsecuente, el análisis northern blot se completó. El transcrito de ARN de longitud completa y pasajes 1, 3, 6, 8 y 10 del virus producido a partir de las células MA-104 transfectadas se usaron para inocular los matraces T-75 frescos de las células MA-104 con 10 µl del sobrenadante diluido 1:100, asi como suero Sw612 diluido 1:10 (2 ml total/matraz). Después de 4 dias, el ARN intracelular PRR?V se cosechó y 15µg de cada preparación se separó por electroforesis a través de un gel de agarosa desnaturalizado y se transfirió a una membrana de nylon. Después de reticular el ARN, la membrana se hibridizó con una sonda radioetiquetada 32P complementaria para el extremo 5' del ORFla que se selecciona por el genoma VR-2332 de longitud completa asi como heteroclitos (/la-222; 29). Como se muestra en la figura 8, el transcrito de ARN es principalmente una banda sencilla, migrando como vARN de longitud completa, mientras las especies de ARN PRRSV de pasaje 1 y por último emigra como especies tanto de longitud completa y subgenomica previamente identificada como heteroclitos. Además, la fuerza de hibridización se incremente durante el pasaje. Ya que el virus se cosechó de un volumen igual del sobrenadante de célula infectada en el mismo punto de tiempo, esta observación sugiere que el vARN se volvió más eficiente en la replicación durante el tiempo. Últimamente, cuando se compara el virus generado de Sw612 con el virus generado del cultivo celular, el patrón de banda de ARN es indistinguible, lo que sugiere fuertemente que las especies de ARN defectuosas se forma fácilmente y se replican in Vi tro asi como in vivo y asi son un parte natural de la infección PRRSV.

Discusión En la teoria, un clon de ADNc infeccioso de un virus deberá ser idéntico a la secuencia parenteral con objeto de generar un sistema genético inversos que imita la infección del tipo silvestre. El esfuerzo considerable se ejerció para reproducir un genoma VR-2332 de la cepa PRRSV completamente confiable, debido a que una mutaciones espontánea impredecible en diversos sitios, aun no ha tenido éxito para derivar un clon infeccioso que no difiere de la cepa wt VR-2332 secuenciada en nuestro laboratorio. Las polimerasas de ADN de fidelidad alta, se usan en este estudio, son disponibles para disminuir las mutaciones artificiales, pero tal mutación no puede ser disponible durante la transcripción inversa (Malet et al., J. Virol. Methods, 109:161- 70 (2003)). Además, el hecho de que el PRRSV exhibe evolución viral sorprendente y variación de la cepa (Chang et al., J. Virol, 76:4750-6 (2002); Murtaugh et al., Adv. Exp. Med. Biol, 440:787-94 (1998); Yoon et al., Adv. Exp. Med. Biol, 494:25-30 (2001)) que fácilmente recombinan una frecuencia alta para resultar en recombinaciones intergénicas entre las cepas (Yuan et al., Virus Res., 61: 87-98 (1999)), bajo recombinación intergénica para formar ARN subgenómico PRRSV y heteroclitos (Nelsen et al., J. Virol, 73:270-80 (1999); Yuan et al., Virology, 275:158-169 (2000); Yuan et al., Virus Research, 105:75- 87 (2004)) y después exhibe degeneración del nucleótido en sitios de nucleótido no predecibles en campos aislados que sirven para hacer este consumo de tiempo de meta inicial y de aumento insignificante. Un constructo de ADN infeccioso posee tan poco como 11 mutaciones de nucleótido, al comparar a la cepa VR-2332, fuera de los dominios conocidos en involucrar la replicación viral (extremos 5' y 3' , ORFIb) fue suficiente a través de la producción del virus wt y metas en dirección 3' del clon infeccioso se uso para cuestiones de patogénesis y estructura: estudios de función. El pVR-HN es más similar a Ingelvac® MLV en la región del virus que codifica la porción de helicasa (NSP 10). La comparación patogénica además de estos dos clones infecciosos puede esparcir luz en las diferencias entre la cepa parenteral, VR-2332, y su camada de la cepa de vacuna, Ingelvac® MLV. La información valiosa puede derivarse de la construcción y evaluación de los clones infecciosos para la cepa PRRSV VR-2332. El primero de todos, la cepa PRRSV VR-2332 no puede tolerar todas las mutaciones para sobrevivir. Las mutaciones de aminoácido o nucleótido particular pueden auxiliar o obstaculizar la replicación viral y la estimulación se asegura que sea letal para el sobreviviente. En el clon pVR-V4, el cual no puede producir variaciones infecciosas, donde el total de los cuarenta y dos nucleótidos diferentes de la cepa parenteral wt VR-2332. En estos cuarenta y dos cambios de nucleótidos, diversos nucleótidos resultan en mutaciones silentes (20 residuos) o existen en otras cepas conocidas PRRSV (9 mutaciones del residuo de aminoácido directamente imitados Ingelvac® MLV) permitiendo la predicción que estos cambios puede no ser letales para la replicación del virus. Once cambios de nucleótido lider hasta 12 cambios de aminoácidos y dos mutaciones de nucleótido 3 'UTR, cada uno no se observa en Ingelvac® MLV, esto asi se presiden para ser letales a la cepa PRRSV VR-2332. En el pVR-V5 y último constructo, 19 cambios se corrigieron, incluyendo diversas mutaciones silentes y 9 cambios de aminoácidos aberrantes no se observan en el genoma de Ingelvac® MLV y 8 otros cambios se observan en la cepa de vacuna. Esto se carga a la primera evidencia de que los constructos fueron infecciosos, aunque en las dos mutaciones de aminoácido pVR-V5 fueron todavia presentes, uno de los cuales se alteró a través de la mutagenesis dirigida al sitio para producir pVR-V6. El cambio de aminoácido restante se repitió en pVR-V5G7475A y pVR-V6G7475A, aunque estos clones todavia presentan mutaciones silentes que no se encuentran en la cepa VR-2332 y la cepa de la vacuna derivada. Diversas únicas observaciones se obtienen de este estudio. Primero de todas, cada uno de los linajes del virus producido puede resultar en una secuencia de terminal 5' única que no se detecta en la cepa wt VR-2332. También no pueden aun correlacionarse el tamaño de la placa con la secuencia de nucleótido. En segundo lugar, se dice que los cambios de nucleótidos únicos después de la replicación en los cerdos, los cuales pueden reflejar la naturaleza inherente de la polimeraza PRRSV. Todos los cambios del nucleótido fueron transitorios en la naturaleza y no exhiben una inclinación (5 A/G y 4 C/T) . Aunque la regresión G A en el nucleótido 7475 se observó después del pasaje in vivo, podria no correlacionarse en este sitio con el tamaño de la placa incrementado subsecuentemente debido a los otros cambios no en plantilla se presentan. Además, el análisis de secuencia de longitud completa del pasaje 3 de un virus derivado V5 que produce placas grandes (V5-2-P3) que revelan una secuencia terminal 5' diferente del virus V5 producido en la placa puntiformes usadas para infectar a los cerdos (V5-1-P3). Sin embargo, pueden concluir que las mutaciones no son letales para la replicación del virus debido a este virus, después del pasaje en los cerdos, producidos por placas de tamaño wt en las células MARC-145 agrega crecimiento en al menos la misma relación como el virus precursor (Figs. 5A, 6A , 6B , 7A y 7B) . De interés considerable es el hecho de que el análisis de la secuencia del tercer pasaje in Vi tro de V5, V5G7475 A y V6G7475 A sugiere que el complejo de la replicasa PRRSV permite la transiciones frecuentes, y transversiones no frecuentes se presentan mientras se experimenta la replicación viral. Esto puede reflejar una replicasa viral que evoluciona de manera que esto puede generar nuevas formas genéticas de un genoma PRRSV y luego evalúan su competencia en medio de otras variantes, resultante en un virus óptimamente "colocado". Estas observaciones también se observan durante el pasaje secuencial PRRSV in vivo (Chang et 1., J. Virol., 76:4750-63 (2002) ) . Los esfuerzos para el proceso de secuencia actual son para examinar los genomas de longitud completa de los últimos pasajes, cuando una remplicación más robusta se detecta. Finalmente, esto es ahora más claro que la replicasa VR-2332 de la cepa PRRSV sintetiza rápidamente los heteroclitos en el mismo tiempo que se produce el vARN de longitud completa. Esta cepa de prototipo, el aislado y caracterización en 1992, puede ser único en la adquisición gradual de la aptitud de la replicación, como otras investigaciones producen clones infecciosos de las cepa más reciente no se observó el mismo efecto (Truong et al., Virology, 325:308-319 (2004)). El papel de la formación de heteroclito y la apariencia concomitante de la replicación viral vigorosa sugieren que esto es un papel ventajoso para los heteroclitos en la evolución PRRSV.

Ejemplo 2 Muchos aislados virulentos de un PRRSV novedosos aparentemente se identifican recientemente en el estado de Minnesota, USA. El análisis de secuencia de nucleótido PRF5 y la comparación a la base de datos de PRRSV University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory (>5000 aislados) revela que los aislados fueron del linaje de tipo 2, pero fueron significativamente diferentes que los aislados previos. Además, estos se relacionan más cercanamente a aquellos aislado previamente observados en Canadá en el principio de los 1990 (Mardassi et al., J. Gen. Virol, 75:681-685 (1994)) y en el estado de Minnesota en 1998. El análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) del ORF5 también demuestra que estos pertenecer al mismo grupo del virus como estos casos previamente conocidos como los aislados 1-8-4 (Wesley et al., J Vet. Diagn. Invest, 10:140-144 (1998)) y asi los nombrados MN184 aislados. Debido de la disimilitud sorprendente con todos pero un aislado MN PRRSV previamente aislado, dos de estos nuevos aislados se amplifican junto una vez en los macrófagos alveolares del porcino (PAM), la célula hospedera, y análisis del genoma de longitud completa se completó en el virus, designado como MN184A y MN184B. Estos dos aislados se colectan en diferentes tiempos de dos granjas separadas.

Materiales y Métodos A la secuencia los aislados MN184, el ARN viral (vARN) se extrajo del sobrenadante de la célula infectada PRRSV con el mini kit QIAmp® Viral ARN (Qiagen, Valencia, CA) ) y el RT-PCR se realizo (Qiagen® OneStep RT-PCR Kit) . Los cebadores (disponible al pedir) se designaron basados en las secuencias publicadas de diferentes cepas del PRRSV depositado en el GenBank asi como la secuencia MN184 nuevamente generada. La secuencia del nucleótido í ' de los dos aislados PRRSV se derivó usando el kit 5' completo RACE core (TaKaRa Bio, Madison, Wl) . El 3' RACE se realizó con un kit de amplificación de ADNc SMART™ RACE (Clontech, Mountain View, CA) . Los productos RT-PCR fueron gel purificado (QIAquick®, Qiagen) , se clonaron en el vector pGEM-T (Promega, Madison, Wl) y 3 hasta 5 clones para cada producto RT-PCR se eligieron por el procesamiento por secuencia. La determinación de la secuencia de nucleótido se completó en ambas direcciones con los cebadores específicos PCR o el vector codificado de los cebadores promotores SP6 y T7. Los productos se presentaron en el centro de análisis genético avanzado en la universidad de Minnesota para la determinación de la secuencia con un analizador del fragmento de ADN automatizado ABI377. Una secuencia de calidad representa al menos una cubiertas de genoma de tres veces se obtuvo. Los datos de la secuencia se ensamblaron y analizaron por usar el programa de análisis de secuencia GeneTool (BioTools Inc., Edmonton, Alberta CA) y Lasergene (DNASTAR, Madison, Wis.). Las alineaciones de secuencia múltiples se generaron con CLUSTALX (Thompson et al., Nucleic Acids Res., 24:4876-4882 (1997)) o Versión empaquetada Wisconsin 10.3 (Accelrys Inc., San Diego, CA) . Las secuencias PRRSV de longitud completa se alinearon usando ClustalX (versión 1.83.1; matriz de peso de ARN IUB, penalización de espacio 15.00, penalización de longitud de espacio 6.66). El alineamiento resultante se analizó además usando el programa de distancias Wisconsin Package Versión 10.3 (método de distancias Jukes-Cantor, coincidencias parciales debido a la consideración de símbolos generados) . Para la figura 10, las secuencias se alinearon con el programa Pileup del paquete Wisconsin (matriz de registro Blosum62, peso de espacio = 8, peso de longitud = 2, extremos pesados). El alineamiento se registró por la redundancia y coloreado por el porcentaje de identidad usando Jalview (Clamp et al., Bioinformatics, 12:426-427 (2004)) y luego la transferencia a Adobe® Photoshop® CS, versión 8.0, para la transformación en escala gris. Para la figura 11, las secuencias se alinearon con el programa Pileup del paquete Wisconsin (matriz de registro Blosum62, peso de espacio = 8, peso de longitud = 2, extremos pesados) . Para la figura 12, un péptido de señal se predice usando el servidor (Bendtsen et al., J. MoL Biol., 340:783-795 (2004)). Las regiones de la transmembrana se derivaron por PHDhtm (Rost et al., Protein Sd., 5:1704- 1718 (1996)) y los sitios de N-glicosilación se identificaron por PROSITE (Bairoch et al., Nucleic Acids Res., :217-221 (1997)) usando el serivador de la proteina predicha (Rost et al., Nucleic Acids Res., 32:W321-W326 (2003)). Las secuencias se alinearon con el programa Pileup del paquete Wisconsin (Matriz de registro Blosum62, peso de espacio = 8, peso de longitud = 2, extremos pesados) .

Resultados La alineación genómica demostró que estos dos PRRSV fueron muy distintos (>14.5% de la disimilitud del nucleótido) de otros genomas secuenciados de longitud completa de tipo 2 norte americanos, todavia en comparación con las secuencias de longitud completa tipo 1 (Europeo) confirman que los aislados fueron solamente del genotipo de tipo 2 que se origina solamente aproximadamente 59% similar al nivel del nucleótido en ambas cepas EuroPRRSV y Lelystad. Sorprendentemente, estos aislados MN184 de tipo 2 representan los genoma PRRSV más cortos detectados a la fecha (15019 nucleótidos, no incluyen la cola poly A) . Además, el área no especifica se discierne que sugiere que estos aislados se derivan de la recombinación viral entre las cepas de tipo 1 y tipo 2. El análisis de secuencia de longitud completa revela que estos dos aislados MN184 fueron distintos genéticamente actualmente. Estos comparten 98.0% de similitud del nucleótido ó 2% de diferencia. Este porcentaje de disimilitud no se esperaba debido a su aparición simultánea súbita en Minnesota, no han observado aislado relacionado reciente claro en la base de datos PRRSV en este tiempo. La tabla 6 presenta el nucleótido cetallado y la comparación del aminoácido entre los oos aislados y la figura 9 detalla las diferencias de los aminoácidos observados entre estas dos cepas. Ambos de estos aislados poseen degeneración de nucleótido en diversas regiones del genoma, predominantemente en la región nsp2 predicha de ORF1 (Tabla 6) . El hecho de que la degeneración del nucleótido se observa en estos aislados sugiere que el PRRSV puede hacerse hasta de diversas especies individuales, a menudo se refiere como una multitud de secuencia virales distintas pero relacionadas, dentro de animales infectados. Tabla 6. Análisis detallado de las regiones genómicas PRRSV individuales y proteinas traducidas y el número de bases degeneradas detectadas en cada región. La degeneración se define como más de un nucleótido detectado por una base particular en los archivos de rastros separados de tres o más archivos de rastros.

TABLA 6 <_n Número de % de Región Bases Longitud de % de % de bases Longitud del % de similaridad laridad identidad del nucleótido simi identidad degeneradas aminoácido del aminoácido de nucleótido aminoácido de nucleótido (184A/184B) 5' UGR 1-190 190 99.5 98.9 1/0 - - - ORF1A 191-7309 7119 98.5 96.7 16/109 2372 96.8 96.5 NSPla 191-688 498 98.8 98.5 1/0 166 97.6 97.6 NSPlb 689-1339 651 98.3 97.5 2/3 217 97.2 95.9 NSP2 1340-3886 2547 98.0 94.6 10/76 849 94.2 94.2 NSP3 3887-5224 1338 98.7 98.7 0/0 446 99.3 98.9 NSP4 5225-5836 612 98.5 96.4 0/13 204 97.1 97.1 NSP5 5837-6346 510 99.2 95.3 3/17 170 97.1 97.1 10 NSP6 6347-6394 48 100.0 100.0 0/0 16 100 100 NSP7 6395-7171 777 99.3 99.3 0/0 259 99,6 99.2 NSP8 7172-7309 138 99.3 99.3 0/0 46 97.6 97.6 ORF1B 7306-11679 4374 99.2 98.9 5/4 1457 99.5 99.2 £> NSP9 7288-9225 1938 98.9 98.8 1/1 646 99.4 98.9 NSP 10 9226-10548 1323 99.3 98.9 3/3 441 99.8 99.3 NSP11 10549-11217 669 99.3 99.3 0/0 223 99.5 99.5 NSP12 11218-11679 462 99.6 99.4 1/0 153 99.3 99.3 ORF2a/GP2 11681-12451 771 99.0 98.3 1/0 222 98.0 97.3 ORF2b/E 11686-11907 222 99.6 99.6 0/0 73 100 100 ORF3/GP3 12304-13068 765 98.6 98.6 0/0 254 97.6 97.6 OKF4/GP4 12849-13385 537 98.5 98.5 0/0 178 98.9 98.9 OKF5/GP5 13396-13998 603 97.8 97.7 1/0 200 96.5 96.5 ORF6/M 13983-14507 525 99.6 97.4 0/0 174 100 100 ORF7 N 14497-14868 372 98.9 98.9 0/0 123 97.6 97.6 3' UTR 14869-15019 151 100 98.0 1/1 - - - 15 Con objeto de señalar más cercanamente las regiones individuales de estos aislados MN184 que mostraron la mayor diferencia de otras cepas PARRSV y asignar las regiones que representan la diferencia en la longitud del genoma viral de tipo 2, se compararon estos dos aislados a la secuencia del prototipo VR-2332. De la cepa tipo dos. Las diferencia entre los dos aislados se pueden discriminar nuevamente con el aislado MN184B que posee una similitud ligeramente aumentada para la cepa VR-2332 que es aislado MN184A. Las comparaciones del nucleótido y aminoácido para VR-2332 mostraron al aislado individual MN184 en sus regiones que varia de 81.5-94.7% y 78.4-100% respectivamente pero las regiones que corresponden a 0RF5 (86.4-86.7% y 87.0-87.5%, respectivamente) predijeron nsplß (83.8-84.0% y 84.8-95.4%, respectivamente y nsp2 (81.5-85.5% y 78.4-79.5%, respectivamente) que fueron las más variables. Lo más interesante fue que solamente la región genómica predicha nsp2 mostró una diferencia en la longitud del nucleótido y que ambos aislados MN184 poseen la misma eliminación nsp2 abajo detallada. La comparación también revelo que las 5' y 3' UTR' s fueron las regiones más conservadas del genoma (94.7% y 94.0% respectivamente) lo que indica la conservación de secuencias en las regiones importantes para la replicación y transcripción viral. ORF5 codifica una proteina estructural heterogénea PRRSV (GP5) y se usa a menudo para la identificación de diagnóstico PRRSV (Kapur et al., J. Gen. Virol., 77:1271-1276 (1996)). GP5 es una proteina predicha de tres trasmembranas con un endodominio y un ectodominio. El ectodominio de 30 aminoácidos esta compuesto de un dominio corto altamente conservado que contiene usualmente al menos dos sitios de N-glicosilación enlazados por dos regiones hipervariables. El dominio altamente conservado de esta región de 30 aminoácidos, se ha demostrado que codifica el epitopo de enlace viral en las cepas de tipo 2 (Plagemann, Virology, 290:11-20 (2001); Ostrowski et al.,J. Virol., 79:4241-4250 (2002); Plagemann et al., Arch. Virol., 147:2327-2347 (2002)). GP5 del mismo conjunto de genomas de longitud completa, asi como los aislados originales RFLP184 identificados en Canadá (IAF-93-653, OAF-Klop) y en 1998-1999 en Minnesota (98-3298-3403, 99-3584) se alinearon (fig. 10) . La alineación de PRRSV GP5 revelo identidades de aminoácidos en el intervalo desde 82.5% hasta 87.7% entre los nuevos aislados MN184 y otras cepas de tipo 2 que no son RFLP184. De manera interesante, las diferencias de aminoácidos entre los nuevos aislados MN184 y los viejos aislados RFLP184 fueron bastantes grandes (5.7% -12.2%) y asi no se detectó un origen claro del nuevo virus RFLP184. La alineación limitada muestra que la mayoria de las diferencias de aminoácidos observadas se encontraron en las regiones hipervariables (fig. 10). Los dos sitios de N-glicosilación conservados se mantuvieron en los aislados MN184 excepto por la codificación de degeneración detectada del nucleótido para el aminoácido 44 en el aislado MN184B. Nsplß codifica una cisteina proteasa del tipo de la papaina (den Boon et al., J. Virol., 69:4500-4505 (1995)). Una alineación de aminoácidos de los aislados MN184 con un conjunto no redundante de las secuencias disponibles de tipo 2 nsplß asi como las cepas ae tipo 1 Euro PRRSV y Lelystad se completo (fig. 11) . La proteina nsplß posee un número de aminoácidos completamente conservados, y los residuos catalíticos propuestos se mantuvieron en todos los genomas de la secuencia (den Boon et al., J. Virol., 69:4500-4505 (1995)). La alineación, ordenada por similitud de aminoácidos indica que los aislados MN184 son más similares a las cepas de tipo 1 que las otras secuencias de tipo 2 de longitud completa que forman secuencias. En particular, 5 aminoácidos (en el recuadro de la figura 11) imitan directamente las cepas de tipo 1. Sin embargo, los aminoácidos que se conservaron en las otras secuencias no redundantes de tipo 2 también fueron mayormente conservados en los aislados MN184 pero los aminoácidos dispersos y las similitud de aminoácidos (84.8-85.4%) revelo una proteina de tipo 2 más divergente que habia sido evidente a la fecha. Asi, la alineación define además residuos mantenidos de nsplß que pueden ser críticos para el ciclo de replicación de PRRSV. Una alineación de aminoácidos de las secuencias no redundantes de nsp2 ordenadas por identidad en pares se muestra en las figuras 12A y 12B. Un dominio de cisteina proteasa de tipo quimiotripsina altamente conservado (PL2) está presente en la terminación N previamente predicha por la alineación con el virus de la arteritis equina (EAV) (Snijder et al., J. Gen. Virol., 79:961-979 (1998); Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)). Existen 3-4 dominios de transmembrana predichos cercanos a la terminación C de esta proteina (McGuffin et al., Biolinformatics, 16:404-405 (2000)), pero el sitio de desdoblamiento exacto en la Terminal C no se ha determinado empíricamente. Se han propuesto dos predicciones en sitios de desdoblamiento en la Terminal C, un G/G en el VR-2332 nsp2 aminoácido 980 (Allende et al., J. Gen. Virol., 80:307-315 (1999)) y el otro en el aminoácido 1197 (Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)), pero existen diversos dobletes completamente conservados G/G dentro de estas proteina (VR-23332 nsp2 aminoácidos 646, 980, 116, 1196, 1197; flechas hacia abajo en las figuras 12A y 12B) . El trabajo previo también habia mostrado que la proteina predicha nsp2 está rica en prolina y contiene epitopos de células B potenciales múltiples (Olekisiewicz et al., J. Virol., 74:3277-3290 (2001); Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004); Ropp et al., J. Virol, 78:3684-3703 (2004)). La región intermedia grande de PRRSV nsp2 (VR-2332nsp2 aminoácidos 148-880) no tiene una función asignada pero es altamente variable en longitud. Adicionalmente, la diferencia de longitud entre las cepas que forman secuencias de tipo 1 y de tipo 2 de PRRSV se ha mapeado para esta región intermedia variable nps2 (fig. 12). Hasta ahora, los genomas que forman secuencias de tipo 1 han demostrado ser 313-364 de bases más cortos que la mayoria de los PRRSV de tipo 2 (Meuienberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004), Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)). Sin embargo, la alineación múltiple de secuencias estableció que el genoma MN184 contiene el nsp2 predicho más corto a la fecha (2547bp) , 393bp más corto que la cepa de tipo 2 de prototipo VR-2332. Además, contenia tres eliminaciones discontinuas en la proteina traducida con tamaño de eliminación que consisten de 111,1 y 19 aminoácidos respectivamente, que corresponden a las posiciones de aminoácidos en la cepa PRRSV, VR-2332 nsp2 a 324-434, 496 y 505-523, respectivamente (figs. 12A y 12B) . Las tres eliminaciones resultaron en la perdida de3 varios residuos de prolina y los epitopos predichos de células B. además de estas eliminaciones, también se observaron alteraciones importantes en la secuencia de aminoácidos nsp2 de otras cepas de tipo 2, que corresponden algunas veces al aminoácido de tipo 1 observado en la misma posición relativa (figs. 12A y 12B) . La comparación de la proteina predicha nsp2 de los dos genotipos PRRSV demostró que la identidad de aminoiácidos dentro de los virus de tipo 2 esta en el intervalo desde 66% a 99% y desde 88-90% dentro de los virus de tipo 1, pero difirió ampliamente entre los genotipos (<45% similitud) . En particular, los aislados MN184 desplegaron 66-80% de identidad de aminoácidos para todas las proteinas predichas nsp2 de tipo 2 y solamente 43-45% de identidad para las cepas de tipo 1. Cuando se investiga la alineación múltiple de secuencias en las figs. 12A y 12B, también se señaló que todos los casos de inserción o eliminación en ambos genotipos sucedió en esta región intermedia hipervariable. Hasta este punto, Shen et al. (Arch. Virol., 145:871-883 (2000)) primero reporto que la cepa SP de tipo dos Norte Americana PRRSV tiene una inserción única de 36 aa con relación a la posición entre 813 aa de PRRSV VR-2332 nsp2.

Otro investigador encontró una eliminación única 12 aa en la posición 466-477 en el aislado PRRSV HB-2 (sh) /2002 nsp2 (Gao et al., Arch. Virol., 149:1341-1351 (2004)). Una eliminación de 17 aa sucedió en los aislado PRRSV de tipo Europeo recientemente identificados cuando se separan con la cepa LV (Fang et al., Virus Res., 100;229-235 (2004); Ropp et al.,m J. Vitrol., 78:3684-3703. (2004)). Los ejemplos de la mutación no se presentan consistente a lo largo de la misma extensión de aminoácidos, aunque las eliminaciones observadas entre los aislados MN184 y otros virus de tipo 2 abarcan la mayoria de la eliminación más grande detectada entre el PRRSV de tipo 1 y otro de tipo 2. Todos estos datos sugieren que el nsp2 ORF contiene una porción conservada de proteasa y regiones que abarcan la transmembrana predichas que pueden ser necesarias para la replicación de PRRSV pero es altamente susceptible a la mutación en la sección grande intermedia. La aparición repentina de aislados de campo de PRRSV en Minnesota refleja que el patrón 184 RFLP es todavia un misterio, pero las consecuencias de este evento se están realizando incluso ahora. El Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de Minnesota efectúa ahora la formación de secuencias de rutina en aislados similares 184 RFLP a partir de aproximadamente una cuarta parte del número total de peticiones de secuencia ORF5. Además, el patrón se ha detectado no solamente en Minnesota sino también en Iowa, Wisconsin, South Dakota, Kansas, Missouri, Illinois, Nebraska, Kentucky, Oklahoma y Wyoming. Se elige derivar las secuencias de longitud completa a partir de dos aislados debido as la necesidad de entender si esto pede ser más que un tipo sencillo de virus y el hecho de que las manadas de cerdos diagnosticadas con el aislado MN184A presentaron un caso más moderado de PRRS que la manada infectada con el aislado MN184B, como se reporta por el patólogo que atiende. Las cepas no han sido inoculadas en animales sin tratar para verificar las presentaciones del caso, pero es interesante señalar que el aislado MN184B tuvo muchas más degeneraciones de nucleótidos detectadas cuando se analiza el genoma y esto pudiera reflejar la seguridad de la enfermedad reportada. Este análisis de genomas incrementó el entendimiento de la inmensa variación de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos que existe en el campo. Los factores que impulsan esta variación se pueden relacionar con la forma en que lo cerdos se manejan ahora, el transporte interestatal e internacional de semen de cerdos y jabalíes, la mezcla entre los diferentes aislados de PRRSV dentro de las manadas y la naturaleza de los virus mismos. La generación de secuencias del genoma completas también no permite observar en donde se tolera la variación del genoma y cuales regiones son más conservadas. Como resultado de este estudio, asi como una publicación previa (Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)), aparece una imagen e indica que nsp2, nsplß y 0RF5 son proteinas extraordinariamente versátil. Este estudio también proporcionó una evidencia clara de que el tamaño de nsp2 ya no se puede usar para diferenciar entre los dos genotipos PRRSV. El hallazgo novedoso de que nsp2 evoluciono para desplegar un genoma de tipo 2 con tres eliminaciones discontinuas, conduce al genoma más corto la fecha (15,019 kb) lo que sugiere que PRRSV puede estar evolucionando para eliminar regiones genómicas dispensables y hace más compacto al genoma. Finalmente, aunque la importancia de las variaciones genéticas PRRSV solamente se puede asegurar en la actualidad, el cambio evolutivo observado en OSF5, nsplß y nsp2 debe relacionarse razonablemente con el ajuste biológico de PRRSV durante la presión de selección. La descripción completa de todas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones y material electrónicamente disponible (incluyendo por ejemplo, las propuestas de secuencias de nucleótidos y por ejemplo, GenBank y RefSeq, y las pospuestas de secuencias de aminoácidos en por ejemplo, SwissProt, PIR, PRF, PDB, y las traducciones de las regiones de codificación anotadas en GenBanck y RefSeg) aqui citadas se incorporan como referencia. La descripción y ejemplos, detallados anteriores se han dado por claridad de entendimiento solamente. No se entenderán limitaciones innecesarias de los mismos. La invención no se limita a los detalles exactos mostrados y descritos para variaciones obvias y par alguien experto en el arte se incluirán dentro de la invención definida por las reivindicaciones. A menos que se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de componentes, pesos moleculares y asi sucesivamente usados en la especificación y en las reivindicaciones se entenderá como que se modifican en todos lo casos por el término "alrededor". De esta manera, a menos que se indique de otra manera por el contrario, los parámetros numéricos establecidos en la especificación y las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener por la presente invención. Al final, y no como un intento de limitar la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico que debe construir al menos a la luz del número de dígitos importantes reportados y al aplicar técnicas de redondeo ordinarias. Independientemente de que los rangos y parámetros numéricos que establecen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se reportan como tan precisamente como son posibles. Todos los valores numéricos sin embargo, contienen inherentemente un rango que resultan necesariamente de la desviación estándar que se encuentra en sus mediciones de prueba respectiva. Todos los encabezados son para conveniencia de lector y no se deben usar para limitar el significado del texto que sigue al encabezado a menos que asi se especifique. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polinucleótido infeccioso aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos 88% de identidad de la SEQ ID NO:l y una eliminación de al menos 39 nucleótidos consecutivos correspondientes al nucleótido 2062 hasta el nucleótido 3864 de la SEQ ID NO:l.
2. 2. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos 88 % de identidad de la SEQ ID NO:l y al menos una eliminación de al menos 39 nucleótidos consecutivos correspondientes al nucleótido 2062 hasta el nucleótido 3864 de la SEQ ID NO:l, y en donde el polinucleótido se replica y produce partículas de virus infeccioso cuando se introducen en una célula.
3. 3. Un clon infeccioso, caracterizado porque comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido que tiene al menos 88 % de identidad de la SEQ ID NO:l y al menos una eliminación de al menos 39 nucleótidos consecutivos correspondientes al nucleótido 2062 hasta el nucleótido 3864 de la SEQ ID NO:l.
4. 4. Un polinucleótido infeccioso aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos 88% de identidad de la SEQ ID NO: 14 y una eliminación de al menos 39 nucleótidos consecutivos correspondientes al nucleótido 2061 hasta el nucleótido 3545 de la SEQ ID NO: 14.
5. 5. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 88 % de identidad de la SEQ ID NO: 14 y al menos una eliminación de al menos 39 nucleótidos consecutivos correspondientes al nucleótido 2061 hasta el nucleótido 3545 de la SEQ ID NO: 14, y en donde el polinucleótido se replica y produce partículas de virus infeccioso cuando se introducen en una célula.
6. 6. Un clon infeccioso, caracterizado porque comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido que tiene al menos 88 % de identidad de la SEQ ID NO: 14 y al menos una eliminación de al menos 39 nucleótidos consecutivos correspondientes al nucleótido 2061 hasta el nucleótido 3545 de la SEQ ID NO: 14.
7. 7. El polinucleótido aislado de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 4, ó 5, caracterizado porque el polinucleótido está presente en un vector.
8. 8. El polinucleótido aislado de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 4, ó 5 o el clon infeccioso de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 6, caracterizado porque el polinucleótido comprende 2 ó más eliminaciones, y en donde cada eliminación es independientemente al menos de 37 nucleótidos consecutivos.
9. 9. El polinucleótido aislado de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 4, ó 5, caracterizado porque el polinucleótido está presente en una partícula de virus aislada .
10. 10. El polinucleótido aislado de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 4, ó 5, caracterizado porque el polinucleótido es un polinucleótido ARN.
11. 11. El polinucleótido aislado de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 4, ó 5 o el clon infeccioso de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 6, caracterizado porque el polinucleótido está presente en una célula.
12. 12. El polinucleótido aislado de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 4, ó 5 o el clon infeccioso de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 6, caracterizado porque un promotor de polimerasa ARN es ligado operablemente al polinucleótido.
13. 13. El polinucleótido aislado de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 4, ó 5 o el clon infeccioso de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 6, caracterizado porque el polinucleótido además comprende un polinucleótido exógeno presente en la eliminación.
14. 14. El polinucleótido aislado o el clon infeccioso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque un polinucleótido exógeno codifica un marcador detectable.
15. 15. Un polinucleótido infeccioso aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido de la SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:12, o SEQ ID NO:13.
16. 16. Un polipéptido nsp2 codificado por un polinucleótido infeccioso, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:12, o SEQ ID NO:13.