CN116790510A - 犬副流感病毒HeN20株及其产品和应用 - Google Patents

犬副流感病毒HeN20株及其产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及兽用生物制品领域，具体涉及犬副流感病毒HeN20株及其产品和应用。本发明提供的犬副流感病毒HeN20株是人工致弱的病毒株，具有稳定的生物学特性和良好的免疫原性，制备的弱毒活疫苗能够明显减轻野毒犬副流感病毒引起的临床症状。与其他病毒抗原联合应用可以降低“犬窝咳”的发生率，阻断病毒感染。

Description

犬副流感病毒HeN20株及其产品和应用
技术领域
本发明涉及兽用生物制品领域，具体涉及犬副流感病毒HeN20株及其产品和应用。
背景技术
犬副流感是由犬副流感病毒(Canine Parainfluenza Virus，CPIV)引起的一种犬传染性疾病，CPIV是引起犬呼吸道疾病混合感染(犬窝咳)的主要传染病的病原，由于CPIV侵害犬呼吸系统，引起犬呼吸道症状，严重影响犬的生活质量，尤其对军犬和警犬的嗅觉有很大影响，所以，针对其进行预防和治疗显得尤为重要。
目前国内外预防和控制犬副流感所用疫苗中涉及的CPIV毒株是上世纪较古老的毒株且免疫持续期较短。而且商品化疫苗毒株由于和国内流行毒株存在基因差异性，不能有效保护国内野毒株的攻击。因此，亟需提供一种针对现有流行犬副流感病毒的疫苗，其能预防犬副流感病毒感染引起的疾病。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种犬副流感病毒HeN20株。
本发明的第二目的在于提供上述犬副流感病毒HeN20株的应用。
本发明的第三目的在于提供一种疫苗组合物。
本发明的第四目的在于提供上述疫苗组合物的制备方法。
本发明的第五目的在于提供上述疫苗组合物的应用。
本发明的第六目的在于提供一种疫苗。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种犬副流感病毒HeN20株，所述犬副流感病毒HeN20株的保藏号为CCTCCNO.V202214。
上述犬副流感病毒HeN20株在如下(a)-(c)任一项中的应用：
(a)制备检测犬副流感病毒或其抗体的产品；
(b)制备预防和/或治疗犬副流感病毒感染的产品；
(c)制备犬副流感病毒抗体；
优选地，(a)中产品包括试剂盒或试剂；
优选地，(b)中产品包括药物。
一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的犬副流感病毒HeN20株抗原，所述犬副流感病毒HeN20株抗原包括上述犬副流感病毒HeN20株或其培养物的活的全病毒抗原。
进一步地，犬副流感病毒HeN20株抗原含量为≥103.0TCID50/头份，优选为103.0～106.0TCID50/头份，进一步优选为104.0～105.0TCID50/头份；
优选地，所述犬副流感病毒HeN20株培养物为1～20代次的培养物。
进一步地，所述疫苗组合物还包括冻干保护剂；
优选地，冻干保护剂包括糖类、蛋白质、缓冲液和含有蛋白质的物质中的至少一种；
优选地，糖类选自山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖，蛋白质选自白蛋白或酪蛋白，所述含有蛋白质的物质为牛血清或脱脂乳，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；
优选地，所述冻干保护剂为10-30w/v％蔗糖和1-3w/v％明胶的水溶液；更优选地；所述冻干保护剂为20w/v％蔗糖和2w/v％明胶的水溶液；
优选地，冻干保护剂和犬副流感病毒HeN20株抗原的比例为体积比1：(0.5-1.5)。
进一步地，所述疫苗组合物还包括免疫量的犬瘟热病毒LT90株抗原、免疫量的犬细小病毒JM35株抗原、免疫量的犬腺病毒2型HL50株抗原和免疫量的灭活狂犬病毒r3G株抗原中的至少一种；
优选地，所述犬瘟热病毒LT90株抗原包括犬瘟热病毒LT90株或其培养物的活的全病毒抗原，犬瘟热病毒LT90株抗原含量为≥103.5FAID50/头份，优选为103.5～105.5FAID50/头份，所述犬瘟热病毒LT90株培养物为1～100代次的培养物；
优选地，所述犬细小病毒JM35株抗原包括所述犬细小病毒JM35株或其培养物的活的全病毒抗原，犬细小病毒JM35株抗原含量为≥105.0FAID50/头份，优选为105.0～106.0FAID50/头份，所述犬细小病毒JM35株培养物为1～100代次的培养物；
优选地，所述犬腺病毒2型HL50株抗原包括犬腺病毒2型HL50株或其培养物的活的全病毒抗原，犬腺病毒2型HL50株抗原含量为≥104.0TCID50/头份，优选为104.0～106.0TCID50/头份，所述犬腺病毒2型HL50株培养物为1～70代次的培养物；
优选地，所述灭活狂犬病毒r3G株抗原含量为灭活前≥108.0FFU/ml，优选为108.0～109.0FFU/ml。
上述疫苗组合物的制备方法，将配方量的组分混匀得到所述疫苗组合物。
上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬腺病毒感染的药物中的应用。
一种疫苗，所述疫苗包括上述疫苗组合物以及任选的兽医学上可以接受的佐剂。
进一步地，所述佐剂包括弗氏完全、不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs、皂苷、矿物油、植物油或Carbopol。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的犬副流感病毒HeN20株与亲本强毒犬副流感病毒HeN11株相比，致病力显著降低，是人工致弱的病毒株。同时，犬副流感病毒HeN20株具有稳定的生物学特性和良好的免疫原性，安全可靠，制备的弱毒活疫苗能够明显减轻野毒犬副流感病毒引起的临床症状。
本发明提供的疫苗组合物免疫犬后，可减轻病毒感染后出现的临床症状，提高犬的生活质量，降低与其它病毒、细菌混合感染引起的“犬窝咳”的发生率，说明该疫苗组合物制备的疫苗针对不同地域的犬副流感感染在临床上可明显减轻临床症状。
具体实施方式
本发明提供一种犬副流感病毒HeN20株(Canine Parainfluenza Virus，StrainHeN20)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V202214，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2022年3月1日。
致病性试验表明，犬副流感病毒HeN20株培养1代至20代之间，对犬致病力显著降低。犬在接种20代后观察14天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本强毒犬副流感病毒HeN11株相比，致病力显著降低，是人工致弱的病毒株。
免疫原性试验表明，犬副流感病毒HeN20株培养至第20代，仍具有良好的免疫原性。犬在单剂量重复接种后21日，和接种犬副流感病毒HeN0718株培养物的犬相比，免疫组可明显减轻强毒犬副流感病毒HeN0718株引起的临床症状和减少排毒时间。
毒力返强试验表明，培养1代至20代之间的病毒，接种后在犬体内连续传代5次，不发生返强。因此，病毒接种犬群后，不会重新演变为强毒而引发病症，安全性有保证。
与其犬副流感亲本强毒HeN11株相比，犬副流感病毒HeN20株第1代至第20代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现导致P蛋白N308G氨基酸变异，M蛋白V112A、G188D氨基酸变异，F蛋白D373N氨基酸变异，L蛋白A316S、A1862V氨基酸变异。
犬副流感病毒HeN20株不同代次培养物病毒基因编码的氨基酸出现的共性的特征性变化很有可能是其亲本强毒HeN11株毒力降低的原因，同时这些变化并未导致其免疫原性的变化。
本发明的犬副流感病毒弱毒HeN20株P、M、F、L氨基酸序列发生的点突变，较亲本强毒HeN11株毒性降低，且具有遗传稳定性。
本发明还提供上述犬副流感病毒HeN20株在制备检测犬副流感病毒或其抗体的产品中的应用。其中，产品可以为试剂或试剂盒，例如免疫层析检测试纸条，ELISA试剂盒等。
本发明还提供上述犬副流感病毒HeN20株在制备预防和/或治疗犬副流感病毒感染的产品中的应用。其中，产品可以为药物，例如疫苗等。
本发明还提供上述犬副流感病毒HeN20株在制备犬副流感病毒抗体中的应用。
本发明提供一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的犬副流感病毒HeN20株抗原，犬副流感病毒HeN20株抗原包括本发明的犬副流感病毒HeN20株或其培养物的活的全病毒抗原。
“免疫量”是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
在优选的实施方式中，犬副流感病毒HeN20株抗原含量为≥103.0TCID50/头份，优选为103.0～106.0TCID50/头份，进一步优选为104.0～105.0TCID50/头份。犬副流感病毒HeN20株抗原含量可以选自103.0TCID50/头份、103.1TCID50/头份、103.2TCID50/头份、103.3TCID50/头份、103.4TCID50/头份、103.5TCID50/头份、103.6TCID50/头份、103.7TCID50/头份、103.8TCID50/头份、103.9TCID50/头份、104.0TCID50/头份、104.1TCID50/头份、104.2TCID50/头份、104.3TCID50/头份、104.4TCID50/头份、104.5TCID50/头份、104.6TCID50/头份、104.7TCID50/头份、104.8TCID50/头份、104.9TCID50/头份、105.0TCID50/头份、105.1TCID50/头份、105.2TCID50/头份、105.3TCID50/头份、105.4TCID50/头份、105.5TCID50/头份、105.6TCID50/头份、105.7TCID50/头份、105.8TCID50/头份、105.9TCID50/头份或106.0TCID50/头份。
在优选的实施方式中，犬副流感病毒HeN20株培养物为1～20代次的培养物。具体地，犬副流感病毒HeN20株培养物可以选自1代次、2代次、3代次、4代次、5代次、6代次、7代次、8代次、9代次、10代次、11代次、12代次、13代次、14代次、15代次、16代次、17代次、18代次、19代次或20代次的培养物。
在一种优选的实施方式中，疫苗组合物还包括冻干保护剂，冻干保护剂可以为糖类、蛋白质、缓冲液和含有蛋白质的物质中的至少一种。其中，糖类例如为山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖，蛋白质例如为白蛋白或酪蛋白，含有蛋白质的物质例如为牛血清或脱脂乳，缓冲液例如为磷酸盐缓冲液。优选地，冻干保护剂为10-30w/v％蔗糖和1-3w/v％明胶的水溶液。优选地，冻干保护剂为20w/v％蔗糖和2w/v％明胶的水溶液。
在优选的实施方式中，冻干保护剂和犬副流感病毒HeN20株抗原的比例为体积比1：(0.5-1.5)，优选为1：1。
在一种优选的实施方式中，疫苗组合物还包括免疫量的犬瘟热病毒LT90株抗原、免疫量的犬细小病毒JM35株抗原、免疫量的犬腺病毒2型HL50株抗原和免疫量的灭活狂犬病毒r3G株抗原中的至少一种。例如，可以犬副流感病毒HeN20株抗原、犬瘟热病毒LT90株抗原、犬细小病毒JM35株抗原和犬腺病毒2型HL50株抗原共同制备成四联免疫组合物(选择性添加冻干保护剂)，也可以四联免疫组合物再与灭活狂犬病毒r3G株抗原共同制备五联免疫组合物(选择性添加冻干保护剂)，实现多种病毒的同时预防和/或治疗。
犬瘟热病毒LT90株(Canine Distemper Virus,Strain LT90)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V202030，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2020年5月13日。犬瘟热病毒LT90株为亚洲-1型，能对国内主要流行野毒株进行完全保护，保护率100％(5/5)。
犬细小病毒JM35株(Canine Parvovirus,Strain JM35)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201965，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2019年10月22日。犬细小病毒JM35株为new CPV-2a型，能对国内主要流行野毒株进行完全保护，保护率100％(5/5)。
犬腺病毒2型HL50株(Canine adenovirus 2，Strain HL50)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V202215，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2022年3月1日。犬腺病毒2型HL50株，能对犬腺病毒1型、犬腺病毒2型国内主要流行野毒株进行完全保护，保护率100％(5/5)。
灭活狂犬病毒r3G株抗原优选为市售的狂犬病灭活疫苗(r3G株)。需要说明的是，当疫苗组合物中含有灭活狂犬病毒r3G株抗原时，采用分开保存，使用时灭活狂犬病毒r3G株抗原稀释其他组分的形式制备疫苗组合物。
四联疫苗组合物能对犬副流感病毒国内主要流行野毒株、犬瘟热病毒国内主要流行野毒株、犬细小病毒国内主要流行野毒株、犬腺病毒1型国内主要流行野毒株、犬腺病毒2型国内主要流行野毒株进行完全保护，且针对现有流行株显示出比现有商品化疫苗更好的免疫保护和安全性。同时，五联免疫组合物可以有效预防犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎、狂犬病的发生，同时减轻犬副流感的临床症状。
在优选的实施方式中，犬瘟热病毒LT90株抗原包括犬瘟热病毒LT90株或其培养物的活的全病毒抗原，犬瘟热病毒LT90株抗原含量为≥103.5FAID50/头份，优选为103.5～105.5FAID50/头份，犬瘟热病毒LT90株培养物为1～100代次的培养物。犬瘟热病毒LT90株抗原含量可以选自103.5FAID50/头份、103.6FAID50/头份、103.7FAID50/头份、103.8FAID50/头份、103.9FAID50/头份、104.0FAID50/头份、104.1FAID50/头份、104.2FAID50/头份、104.3FAID50/头份、104.4FAID50/头份、104.5FAID50/头份、104.6FAID50/头份、104.7FAID50/头份、104.8FAID50/头份、104.9FAID50/头份、105.0FAID50/头份、105.1FAID50/头份、105.2FAID50/头份、105.3FAID50/头份、105.4FAID50/头份或105.5FAID50/头份。犬瘟热病毒LT90株培养物可以选自1代次、2代次、3代次、4代次、5代次、6代次、7代次、8代次、9代次、10代次、11代次、12代次、13代次、14代次、15代次、16代次、17代次、18代次、19代次、20代次、21代次、22代次、23代次、24代次、25代次、26代次、27代次、28代次、29代次、30代次、35代次、40代次、45代次、50代次、55代次、60代次、65代次、70代次、75代次、80代次、85代次、90代次、95代次或100代次的培养物。
在优选的实施方式中，犬细小病毒JM35株抗原包括所述犬细小病毒JM35株或其培养物的活的全病毒抗原，犬细小病毒JM35株抗原含量为≥105.0FAID50/头份，优选为105.0～106.0FAID50/头份，犬细小病毒JM35株培养物为1～100代次的培养物。犬细小病毒JM35株抗原含量为105.0FAID50/头份、105.1FAID50/头份、105.2FAID50/头份、105.3FAID50/头份、105.4FAID50/头份、105.5FAID50/头份、105.6FAID50/头份、105.7FAID50/头份、105.8FAID50/头份、105.9FAID50/头份或106.0FAID50/头份。犬细小病毒JM35株培养物可选自1代次、2代次、3代次、4代次、5代次、6代次、7代次、8代次、9代次、10代次、11代次、12代次、13代次、14代次、15代次、16代次、17代次、18代次、19代次、20代次、21代次、22代次、23代次、24代次、25代次、26代次、27代次、28代次、29代次、30代次、35代次、40代次、45代次、50代次、55代次、60代次、65代次、70代次、75代次、80代次、85代次、90代次、95代次或100代次的培养物。
在优选的实施方式中，犬腺病毒2型HL50株抗原包括犬腺病毒2型HL50株或其培养物的活的全病毒抗原，犬腺病毒2型HL50株抗原含量为≥104.0TCID50/头份，优选为104.0～106.0TCID50/头份，犬腺病毒2型HL50株培养物为1～70代次的培养物。犬腺病毒2型HL50株抗原含量可以选自104.0TCID50/头份、104.1TCID50/头份、104.2TCID50/头份、104.3TCID50/头份、104.4TCID50/头份、104.5TCID50/头份、104.6TCID50/头份、104.7TCID50/头份、104.8TCID50/头份、104.9TCID50/头份、105.0TCID50/头份、105.1TCID50/头份、105.2TCID50/头份、105.3TCID50/头份、105.4TCID50/头份、105.5TCID50/头份、105.6TCID50/头份、105.7TCID50/头份、105.8TCID50/头份、105.9TCID50/头份或106.0TCID50/头份。犬腺病毒2型HL50株培养物可以选自1代次、2代次、3代次、4代次、5代次、6代次、7代次、8代次、9代次、10代次、11代次、12代次、13代次、14代次、15代次、16代次、17代次、18代次、19代次、20代次、21代次、22代次、23代次、24代次、25代次、26代次、27代次、28代次、29代次、30代次、35代次、40代次、45代次、50代次、55代次、60代次、65代次或70代次的培养物。
在优选的实施方式中，灭活狂犬病毒r3G株抗原含量为灭活前≥108.0FFU/ml，优选为108.0～109.0FFU/ml。灭活狂犬病毒r3G株抗原含量可以选自灭活前108.0FFU/ml、108.1FFU/ml、108.2FFU/ml、108.3FFU/ml、108.4FFU/ml、108.5FFU/ml、108.6FFU/ml、108.7FFU/ml、108.8FFU/ml、108.9FFU/ml或109.0FFU/ml。
本发明提供疫苗组合物的制备方法，按照配方量，犬副流感病毒HeN20株抗原可以单独作为疫苗组合物的有效成分，也可以加入冻干保护剂混匀得到疫苗组合物，也可以与犬瘟热病毒LT90株抗原、犬细小病毒JM35株抗原、犬腺病毒2型HL50株抗原和灭活狂犬病毒r3G株抗原中的至少一种以及任选的冻干保护剂混匀得到疫苗组合物。
本发明提供疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬腺病毒感染的药物中的应用。本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制犬副流感病毒和/或犬瘟热病毒和/或犬细小病毒和/或犬腺病毒和/或狂犬病毒感染或推迟疾病发作，减少感染后排毒的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使犬副流感病毒和/或犬瘟热病毒和/或犬细小病毒和/或犬腺病毒和/或狂犬病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
本发明还提供一种疫苗，该疫苗包括本发明提供的疫苗组合物以及任选的兽医学上可以接受的佐剂。根据本发明的活的减毒的犬副流感病毒不一定需要这种佐剂来实现功效，但是特别对应包含根据本发明的活的减毒的犬副流感病毒和来自另一致病病毒或微生物的抗原性物质的组合疫苗，将值得加入佐剂。佐剂是免疫系统的非特异性刺激剂，它们增强宿主对疫苗的免疫应答。本领域中已知的佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs(免疫刺激复合体，参考例如欧洲专利EP109942)、皂苷、矿物油、植物油，和Carbopol(卡波姆)等。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1犬副流感病毒HeN20株的获得
1.取生长良好的Vero细胞，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，以含有90％～98％体积比的DMEM培养液和2％～10％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)，用于接种病毒。
2.将犬副流感病毒HeN11株同步接种Vero细胞悬液，用含有95％～99％体积比的DMEM培养液和1％～5％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下继续培养，于72h～96h后，当细胞80％以上发生病变时，收获细胞培养病毒液.
3.重复上述步骤连续传代培养获得犬副流感病毒弱毒株，将获得的犬副流感病毒弱毒株进行测序，结果显示P蛋白N308G氨基酸稳定变异，M蛋白V112A、G188D氨基酸稳定变异，F蛋白D373N氨基酸稳定变异，L蛋白A316S、A1862V氨基酸稳定变异。将该犬副流感病毒弱毒株命名为犬副流感病毒HeN20株。
实施例2犬副流感病毒HeN20株生物学特性研究
1.致病性试验
2～3月龄的健康易感抗原抗体阴性犬15只随机分成3组，每组5只，分组和攻毒情况见表1。
表1致病性试验动物分组
组别 接种用毒株 接种剂量
1 HeN20株 滴鼻2ml(104.0TCID50/ml)
2 HeN11株 滴鼻2ml(104.0TCID50/ml)
3 DMEM培养基 滴鼻2ml
病毒接种后观察10日，每日上、下午对犬的体温、精神、食欲、眼鼻分泌物及是否打喷嚏和咳嗽等进行观察记录，具体结果见表2。
表2HeN20株对犬的致病性
结果显示，犬副流感病毒HeN11株可以导致犬100％发病(5/5)，而犬副流感病毒HeN20株体温正常，无临床症状，剖检组织器官无变化。
致病性试验表明，犬副流感病毒HeN20株与亲本强毒株HeN11株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株。
同时，为验证犬副流感病毒HeN20株不同代次致病力的稳定性，用第1代、5代、10代、15代、20代的犬副流感病毒HeN20株培养物，各接种一组犬副流感病毒抗原抗体阴性犬(5只)，滴鼻2ml(104.0TCID50/ml)/只，5只犬作为对照组。每日观察、记录犬的临床变化，直至接种14天。
结果显示，第1代、5代、10代、15代、20代的犬副流感病毒HeN20株培养物，接种后观察14天，体温正常，无临床症状，剖检组织器官无变化。
不同代次致病性试验表明，犬副流感病毒HeN20株不同代次培养物致病力显著降低，是致弱的病毒株。
2.免疫原性试验
2～3月龄的健康易感抗原抗体阴性犬10只随机分成2组，每组5只，分组和免疫情况见表3。
表3免疫原性试验动物分组
组别 接种用毒株 接种剂量
4 HeN20株 皮下1ml(104.0TCID50/ml)
5 DMEM培养基 皮下1ml
在首次免疫后21天，进行二次免疫。二免后21天，对犬副流感病毒HeN20株接种的犬5只，以及对照组5只，均用犬副流感病毒HeN0718株以滴鼻2ml(104.0TCID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日上、下午对犬的体温、精神、食欲、眼鼻分泌物及是否打喷嚏和咳嗽等进行观察记录，并按照“出现眼分泌物、鼻分泌物分别计0.5分，出现打喷嚏、咳嗽分别计1分”的评分标准进行累计评分，统计每只犬攻毒后10日内的总评分，采用SPSS软件用T检验方法进行统计学分析，判定免疫组犬的临床症状评分是否显著低于攻毒对照组临床症状评分(P<0.05)，具体结果见表4。
表4HeN20株对犬的免疫原性
结果显示，犬副流感病毒HeN20株接种过的犬的临床症状评分显著低于攻毒对照组临床症状评分。
免疫原性试验表明，犬副流感病毒HeN20株具有良好的免疫原性，能显著减轻对犬副流感病毒HeN0718株攻击产生的临床症状。
同时，为验证犬副流感病毒HeN20株不同代次免疫原性的稳定性，对分别首次免疫后21天，进行二次免疫第5代、10代、15代、20代的犬副流感病毒HeN20株培养物后第21天，各免疫组连同对照组均用犬副流感病毒HeN0718株以滴鼻2ml(104.0TCID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日上、下午对犬的体温、精神、食欲、眼鼻分泌物及是否打喷嚏和咳嗽进行观察记录。
结果显示，第5代、10代、15代、20代的犬副流感病毒HeN20株培养物接种过的犬的临床症状评分显著低于攻毒对照组临床症状评分，对照组犬全部发病。
不同代次免疫原性试验表明，犬副流感病毒HeN20株不同代次培养物均具有良好的免疫原性，能显著减轻对犬副流感病毒HeN0718株攻击产生的临床症状。
3.病毒返强安全性试验
将犬副流感病毒HeN20株第1代病毒液(107.5TCID50/ml)通过滴鼻2ml接种3只健康易感犬。接种后每日上、下午测温和观察临床表现并采集鼻拭子，接种后第5日剖杀，观察病变，并对肺脏、气管、喉头等采样进行组织病学HE染色和免疫组化检测，对肺脏、气管、喉头研磨液和鼻拭子进行犬副流感病毒核酸测定，挑选病毒含量高的鼻拭子适当处理后作为下一代毒力返强用接种物，如此在犬体内传至第4代。
取第4代毒力返强试验获得鼻拭子再经滴鼻2ml接种3只健康易感犬。接种后每日上、下午测温和观察临床表现，接种后第21日剖杀，观察病变，并对肺脏、气管、喉头采样进行HE和免疫组化检测，并进行病毒核酸测定。
如在第1～4代毒力返强继代试验中，如果出现某代试验中，鼻拭子中检测不到犬副流感病毒核酸，则应适当加大接种量，同样方式接种6只犬，以提高病毒核酸检出率，如果进一步试验确证继代后不能重新在鼻拭子检测到犬副流感病毒核酸，表明该毒力返强试验结果可判成立，该毒株没有毒力返强可能。
结果显示，第1代～第5代接种犬体温和临床表现均未见异常，剖杀后各脏器未见明显病变，HE染色均未见异常，免疫组化检测第1代肺脏和气管疫组化可检测到阳性，第2代个别犬气管免疫组化可检测到阳性，第3代～第5代免疫组化检测均为阴性，鼻拭子和脏器病毒载量随着代次升高，逐渐降低，第4代脏器中已检测不到CPIV核酸，第5代毒力返强鼻拭子已检测不到CPIV核酸。毒力返强试验时同居饲养的试验犬，临床观察也未见异常，同居饲养21日后血清CPIV抗体转阳，可见犬副流感病毒HeN20株没有毒力返强能力，但存在水平传播，是一株安全性良好的弱毒株。
分别将犬副流感病毒HeN20株第5代、10代、15代、20代病毒液参照上述病毒返强试验步骤进行验证，结果显示第1代～第5代接种犬体温和临床表现均未见异常，剖杀后各脏器未见明显病变，HE染色均未见异常，免疫组化检测第1代肺脏和气管疫组化可检测到阳性，第2代个别犬气管免疫组化可检测到阳性，第3代～第5代免疫组化检测均为阴性。荧光定量PCR检测结果也显示传代过程中鼻拭子和脏器中病毒载量逐渐下降，分别传至第5代和第4代，已检测不到病毒载量。
因此，犬副流感病毒HeN20株不会重新演变为强毒而引起发病，安全性有保证。
4.基因序列分析
将犬副流感病毒HeN20株第1代至第20代的培养物，用RT-PCR方法，进行基因组扩增(不同代次培养物分别扩增)。将获得的基因扩增产物回收、纯化，连接到测序质粒载体中，测定病毒基因的核苷酸序列，并用计算机软件转化成病毒的氨基酸序列。用序列分析软件，将获得氨基酸序列与亲本强毒株HeN11株氨基酸序列进行比较，描述病毒氨基酸序列特征。
结果显示，犬副流感病毒HeN20株第1代至第20代的培养物，病毒各基因编码的氨基酸共性出现导致P蛋白N308G氨基酸变异，M蛋白V112A、G188D氨基酸变异，F蛋白D373N氨基酸变异，L蛋白A316S、A1862V氨基酸变异。
表明，犬副流感病毒HeN20株不同代次培养物病毒基因编码的氨基酸出现的共性的特征性变化很有可能是其亲本强毒株毒力降低的原因。
实施例3犬副流感病毒HeN20株弱毒活疫苗的制备
1.病毒的增殖
将实施例1制备的犬副流感病毒HeN20株毒种同步接种Vero细胞悬液，加入含2％新生牛血清的DMEM培养液，置37℃、5％CO2培养。待80％细胞病变后，收获病毒，测定病毒滴度，置低温保存。
2.保护剂的配制
每100ml去离子水中加蔗糖20g，明胶2g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃30min)。
3.疫苗的制备
将上述制备并保存的病毒液与保护剂按1:1(体积比)混合，冻干。疫苗含量具体配比见表5。
表5犬副流感病毒HeN20株弱毒活疫苗含量配比
组分 疫苗1 疫苗2 疫苗3
HeN20株抗原(TCID50)/头份 103.0 104.0 106.0
保护剂(V/V) 50％ 50％ 50％
实施例4犬副流感病毒HeN20株弱毒活疫苗的免疫原性试验
28日龄以上的犬副流感病毒抗原抗体阴性犬20只随机分成4组，每组5只，免疫实施例3制备的犬副流感病毒HeN20株弱毒活疫苗。第6组免疫疫苗1，第7组免疫疫苗2，第8组免疫疫苗3，第9组为对照组。皮下注射，两次免疫，间隔21日，二免后21日后攻毒，均用犬副流感病毒HeN0718株以滴鼻2ml(104.0TCID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日上、下午对犬的体温、精神、食欲、眼鼻分泌物及是否打喷嚏和咳嗽等进行观察记录，并按照“出现眼分泌物、鼻分泌物分别计0.5分，出现打喷嚏、咳嗽分别计1分”的评分标准进行累计评分，统计每只犬攻毒后10日内的总评分，采用SPSS软件用T检验方法进行统计学分析，判定免疫组犬的临床症状评分是否显著低于攻毒对照组临床症状评分(P<0.05)，具体结果见表6。
表6犬副流感病毒HeN20株弱毒活疫苗的免疫原性试验结果
组别 数量 临床症状 临床症状得分
6 5 3只犬喷嚏，2只犬水样鼻液 5.300±0.663*
7 5 3只犬喷嚏，2只犬水样鼻液 4.800±0.875*
8 5 2只犬喷嚏或眼鼻分泌物 3.700±0.943*
9 5 4只犬喷嚏，2只犬眼鼻分泌物 10.10±1.833
结果显示，采用实施例3制备的犬副流感病毒HeN20株弱毒活疫苗免疫犬后，能显著减轻强毒株引起的临床症状。
证明了三个试验组犬副流感病毒HeN20株弱毒活疫苗具有良好的保护力，显示出很好的免疫保护和和安全性。
实施例5犬副流感病毒HeN20株弱毒活疫苗的免疫原性对比试验
将45日龄犬副流感病毒抗原抗体阴性犬15只随机分成3组，5只/组。第10组免疫实施例3制备的犬副流感病毒HeN20株弱毒活疫苗疫苗1；第11组免疫商品化犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感四联活疫苗(Cornell株)；第12组为对照组。间隔21日，两次免疫，二免21日后攻毒，均用犬副流感病毒HeN0718株以滴鼻2ml(104.0TCID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日上、下午对犬的体温、精神、食欲、眼鼻分泌物及是否打喷嚏和咳嗽等进行观察记录，并按照“出现眼分泌物、鼻分泌物分别计0.5分，出现打喷嚏、咳嗽分别计1分”的评分标准进行累计评分，统计每只犬攻毒后10日内的总评分，采用SPSS软件用T检验方法进行统计学分析，判定免疫组犬的临床症状评分是否显著低于攻毒对照组临床症状评分(*P<0.05)，具体结果见表7。
表7犬副流感病毒HeN20株弱毒活疫苗的免疫原性对比试验结果
结果显示，采用实施例3制备的犬副流感病毒HeN20株弱毒活疫苗免疫犬后，能显著减轻临床症状；对照组犬攻毒后全部发病；而现有商品化的疫苗不能明显减轻临床症状。需要说明的是，第10组和第11组临床症状虽然相同，但是持续时间的长短并不一样，本发明提供的疫苗可显著缩短临床症状的持续时间，所以得分低于第11组的商品化疫苗。
证明了犬副流感病毒HeN20株弱毒活疫苗具有很好的保护力，针对现有流行株显示出比现有商品化疫苗更好的免疫保护和安全性。
实施例6犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感四联活疫苗的制备
1.病毒的增殖
将犬瘟热病毒LT90株毒种同步接种Vero细胞悬液，加入含95％～99％体积比的DMEM培养液和1％～5％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下继续培养，于72h～96h后，当细胞80％以上发生病变时，冻融收毒，并进行病毒含量测定，置低温保存。
将犬细小病毒JM35株毒种同步接入F81细胞悬液，加入含有90％～98％体积比的RPMI 1640培养液和2％～10％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)于33℃～37℃条件下培养。待细胞病变达到80％左右时冻融收毒，并进行病毒含量测定，置低温保存。
将犬腺病毒2型HL50株毒种同步接种MDCK细胞悬液，加入含95％～99％体积比的DMEM培养液和1％～5％体积比的新生牛血清的细胞生长液(pH调整为6.8～7.2)置33℃～37℃条件下培养。待80％细胞病变后，收获病毒，测定病毒滴度，置低温保存。
2.保护剂的配制
每100ml去离子水中加蔗糖20g，明胶2g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃，30min)。
3.疫苗的制备
将上述制备并保存的犬瘟热病毒LT90株病毒液、犬细小病毒JM35株病毒液、犬腺病毒2型HL50株病毒液、实施例3制备并保存的犬副流感病毒HeN20株病毒液按比例混合，并与保护剂按1:1(体积比)混合，冻干。疫苗含量具体配比见表8。
表8犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感四联活疫苗含量配比
实施例7犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感四联活疫苗的免疫原性
28日龄以上的犬瘟热、犬细小病毒、犬腺病毒、副流感抗原抗体阴性犬75只随机分成15组，每组5只，免疫实施例6制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感四联活疫苗。第13～14组单剂量免疫疫苗4，第18～19组单剂量免疫疫苗5；15～17组单剂量重复免疫疫苗4，第20～22组单剂量重复免疫疫苗5，间隔21日。第23～27组为对照组。
第13组、第18组和第23组免疫21日后攻毒，均用犬瘟热病毒C/HN/001株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日上、下午对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表9。
表9犬四联活疫苗犬瘟热部分免疫原性试验结果
结果显示，采用实施例6制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感四联活疫苗免疫犬后，可阻断犬瘟热病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
第14组、第19组和第24组免疫14日后攻毒，均用犬细小病毒S0425株以皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录。具体结果见表10。
表10犬四联活疫苗犬细小部分免疫原性试验结果
结果显示，采用实施例6制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感四联活疫苗免疫犬后，可阻断犬细小病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
第15组、第20组和第25组二免14日后攻毒，均用犬腺病毒1型YT-2株(Canineadenovirus 1，Strain YT-2,中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V202216，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2022年3月1日)以静脉注射1ml(104.0TCID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的体温、精神、食欲、腹部和眼部等临床表现进行观察记录；第16组、第21组和第26组二免14日后攻毒，均用犬腺病毒2型HL006株以滴鼻2ml(104.0TCID50/ml)/只剂量攻毒；攻毒后每日上、下午对犬的体温、精神、食欲粪便、眼鼻分泌物、是否打喷嚏等进行观察记录。具体结果见表11。
表11犬四联活疫苗犬腺病毒部分免疫原性试验结果
结果显示，采用实施例6制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感四联活疫苗免疫犬后，可阻断犬腺病毒1型、犬腺病毒2型感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
第17组、第22组和第27组二免21日后攻毒，均用犬副流感病毒HeN0718株以滴鼻2ml(104.0TCID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的体温、精神、食欲、眼鼻分泌物及是否打喷嚏和咳嗽等进行观察记录，并按照“出现眼分泌物、鼻分泌物分别计0.5分，出现打喷嚏、咳嗽分别计1分”的评分标准进行累计评分，统计每只犬攻毒后10日内的总评分，采用SPSS软件用T检验方法进行统计学分析，判定免疫组犬的临床症状评分是否显著低于攻毒对照组临床症状评分(P<0.05)。具体结果见表12。
表12犬四联活疫苗犬副流感病毒部分免疫原性试验结果
组别 数量 临床症状 临床症状得分
17 5 3只犬喷嚏，2只犬水样鼻液 3.400±0.927*
22 5 3只犬喷嚏，2只犬水样鼻液 2.000±1.049*
27 5 所有犬有眼鼻分泌物，4只犬打喷嚏 11.10±1.355
结果显示，采用实施例6制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感四联活疫苗免疫犬后，可显著减轻CPIV强毒引起的临床症状，且对照组犬攻毒后全部发病。
证明了本发明提供的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感四联活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性，有效预防犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎的发生，同时减轻犬副流感的临床症状。
实施例8犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感、狂犬病(灭活)五联疫苗的免疫原性
将实施例6制备的疫苗4溶解于狂犬病灭活疫苗(r3G株)(108.2FFU/ml)制备犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感、狂犬病(灭活)五联疫苗。
28日龄以上的犬瘟热、犬细小病毒、犬腺病毒、副流感、狂犬抗原抗体阴性犬55只随机分成11组，每组5只，免疫犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感、狂犬病(灭活)五联疫苗。第28～33组为免疫组，其中第30～32组为两次免疫，间隔21日，第28组、第29组、第33组为单次免疫。第34～38组为对照组。
第28组免疫后21日连同第34组攻毒，均用犬瘟热病毒C/HN/001株以滴鼻2ml、腹腔4ml(105.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日上、下午对犬的体温、精神、食欲、粪便、眼鼻分泌物进行观察记录，具体结果见表13。
表13犬五联疫苗犬瘟热部分免疫原性试验结果
结果显示，采用本发明制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感、狂犬病(灭活)五联疫苗免疫犬后，可阻断犬瘟热病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
第29组免疫后14日连同第35组攻毒，均用犬细小病毒S0425株以皮下注射4ml(106.5FAID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的精神、食欲、粪便等临床表现进行观察记录。具体结果见表14。
表14犬五联疫苗犬细小部分免疫原性试验结果
结果显示，采用本发明制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感、狂犬病(灭活)五联疫苗免疫犬后，可阻断犬细小病毒感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
第30组二免后14日连同第36组攻毒，均用犬腺病毒1型YT-2株以静脉注射1ml(104.0TCID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的体温、精神、食欲、腹部和眼部等临床表现进行观察记录；第31组二免后14日连同第37组攻毒，均用犬腺病毒2型HL006株以滴鼻2ml(104.0TCID50/ml)/只剂量攻毒；攻毒后每日上、下午对犬的体温、精神、食欲粪便、眼鼻分泌物、是否打喷嚏等进行观察记录。具体结果见表15。
表15犬五联疫苗犬腺病毒部分免疫原性试验结果
结果显示，采用本发明制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感、狂犬病(灭活)五联疫苗免疫犬后，可阻断犬腺病毒1型、犬腺病毒2型感染(出现临床症状)，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)，而对照组犬攻毒后全部发病。
第32组二免后21日连同第38组攻毒，均用犬副流感病毒HeN0718株以滴鼻2ml(104.0TCID50/ml)/只剂量攻毒，攻毒后每日对犬的体温、精神、食欲、眼鼻分泌物及是否打喷嚏和咳嗽等进行观察记录，并按照“出现眼分泌物、鼻分泌物分别计0.5分，出现打喷嚏、咳嗽分别计1分”的评分标准进行累计评分，统计每只犬攻毒后10日内的总评分，采用SPSS软件用T检验方法进行统计学分析，判定免疫组犬的临床症状评分是否显著低于攻毒对照组临床症状评分(P<0.05)。具体结果见表16。
表16犬五联疫苗犬副流感病毒部分免疫原性试验结果
组别 数量 临床症状 临床症状得分
32 5 2只犬喷嚏，2只犬水样鼻液或眼分泌物 4.625±1.519*
38 5 所有犬有眼鼻分泌物，4只犬打喷嚏 11.50±1.696
结果显示，采用本发明制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感、狂犬病(灭活)五联疫苗免疫犬后，可显著减轻CPIV强毒引起的临床症状，且对照组犬攻毒后全部发病。
第33组免疫0日和免疫后60日采血，测定狂犬病毒中和效价，中和效价不低于0.5IU/ml时，判为合格。具体结果见表17。
表17犬五联疫苗狂犬病毒部分免疫原性试验结果
时间 中和效价(IU/ml)
免疫0日 0、0、0、0、0
免疫后60日 2.60、1.14、1.50、0.87、3.41
结果显示，采用本发明制备的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感、狂犬病(灭活)五联疫苗免疫犬后，中和效价均不低于0.5IU/ml，能为犬提供100％(5/5)保护(预防)。
证明了本发明提供的犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎、副流感、狂犬病(灭活)五联疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性，有效预防犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎、狂犬病的发生，同时减轻犬副流感的临床症状。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种犬副流感病毒HeN20株，其特征在于，所述犬副流感病毒HeN20株的保藏号为CCTCC NO.V202214。
2.权利要求1所述的犬副流感病毒HeN20株在如下(a)-(c)任一项中的应用：
(a)制备检测犬副流感病毒或其抗体的产品；
(b)制备预防和/或治疗犬副流感病毒感染的产品；
(c)制备犬副流感病毒抗体；
优选地，(a)中产品包括试剂盒或试剂；
优选地，(b)中产品包括药物。
3.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的犬副流感病毒HeN20株抗原，所述犬副流感病毒HeN20株抗原包括权利要求1所述的犬副流感病毒HeN20株或其培养物的活的全病毒抗原。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，犬副流感病毒HeN20株抗原含量为≥103.0TCID50/头份，优选为103.0～106.0TCID50/头份，进一步优选为104.0～105.0TCID50/头份；
优选地，所述犬副流感病毒HeN20株培养物为1～20代次的培养物。
5.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括冻干保护剂；
优选地，冻干保护剂包括糖类、蛋白质、缓冲液和含有蛋白质的物质中的至少一种；
优选地，糖类选自山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖，蛋白质选自白蛋白或酪蛋白，所述含有蛋白质的物质为牛血清或脱脂乳，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；
优选地，所述冻干保护剂为10-30w/v％蔗糖和1-3w/v％明胶的水溶液，更优选地，所述冻干保护剂为20w/v％蔗糖和2w/v％明胶的水溶液；
优选地，冻干保护剂和犬副流感病毒HeN20株抗原的比例为体积比1：(0.5-1.5)。
6.根据权利要求3-5任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括免疫量的犬瘟热病毒LT90株抗原、免疫量的犬细小病毒JM35株抗原、免疫量的犬腺病毒2型HL50株抗原和免疫量的灭活狂犬病毒r3G株抗原中的至少一种；
优选地，所述犬瘟热病毒LT90株抗原包括犬瘟热病毒LT90株或其培养物的活的全病毒抗原，犬瘟热病毒LT90株抗原含量为≥103.5FAID50/头份，优选为103.5～105.5FAID50/头份，所述犬瘟热病毒LT90株培养物为1～100代次的培养物；
优选地，所述犬细小病毒JM35株抗原包括所述犬细小病毒JM35株或其培养物的活的全病毒抗原，犬细小病毒JM35株抗原含量为≥105.0FAID50/头份，优选为105.0～106.0FAID50/头份，所述犬细小病毒JM35株培养物为1～100代次的培养物；
优选地，所述犬腺病毒2型HL50株抗原包括犬腺病毒2型HL50株或其培养物的活的全病毒抗原，犬腺病毒2型HL50株抗原含量为≥104.0TCID50/头份，优选为104.0～106.0TCID50/头份，所述犬腺病毒2型HL50株培养物为1～70代次的培养物；
优选地，所述灭活狂犬病毒r3G株抗原含量为灭活前≥108.0FFU/ml，优选为108.0～109.0FFU/ml。
7.权利要求3-6任一项所述的疫苗组合物的制备方法，其特征在于，将配方量的组分混匀得到所述疫苗组合物。
8.权利要求3-6任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬腺病毒感染的药物中的应用。
9.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求3-6任一项所述的疫苗组合物以及任选的兽医学上可以接受的佐剂。
10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂包括弗氏完全、不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs、皂苷、矿物油、植物油或Carbopol。
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