KR20090119176A - 돼지 호흡기질환용 불활화 혼합백신 및 이것의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 호흡기질환용 불활화 혼합백신 및 이것의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 돼지 글래서병 (Glasser's disease), 돼지 유행성폐렴 (Swine enzootic pneumoniae), 돼지 생식기호흡기증후군 (PRRS)의 3종의 호흡기 질환, WS (이유후 전신성 소모성 질환) 및 육성 비육돈의 PRDC (돼지 복합호흡기질환) 예방을 위한 불활화 혼합백신과 PRRS 중화항체가를 기니픽을 이용하여 측정하는 방법에 관한 것이다. 이에 의하여, 상기 호흡기 질환에 대한 진행을 사전에 예방할 수 있는 실질적인 수단을 제공한다.

돼지 호흡기 질환, 불활화 혼합백신,

Description

돼지 호흡기질환용 불활화 혼합백신 및 이것의 제조방법 {Inactivated mixed vaccine for porcine respiratory disease and the method of manufacturing thereof}

본 발명은 돼지 호흡기질병(질환)용 백신에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 돼지 호흡기질병(질환)을 위한 불활화 혼합백신에 관한 것이다.

돼지 호흡기질병(질환)은 양돈 농가에 막대한 경제적 손실을 가져오는 질병으로서, 특히 이유자돈에서의 폐사, 위축, 일당 증체량의 감소로 인한 PMWS (Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, 이유후 전신성 소모성 질환) 및 육성 비육돈의 PRDC (Porcine Respiratory Disease Complex, 돼지 복합호흡기 질환)로 진행되는 경우에 매우 심각한 피해를 초래하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 돼지 호흡기질병(질환)을 예방 및 치료하기 위한 목적으로 다양한 백신이 제조되어 이용되어 왔다. 그러나 돼지 호흡기질병(질환)은 그 원인이 다양하여 어느 하나의 질병을 대상으로 하는 백신의 적용이 그다지 효과적이지 못한 경우가 많았다. 이에 몇몇 혼합백신이 제조되어 농장에서 적용되어 왔으나, 이것 역시 각 질병의 발생시기가 워낙 다양하여 단독 백신을 사용하는 것 이상의 예방 및 치료 효과를 기대하 기 어려웠다.

대표적인 돼지 호흡기질병(질환)으로는, 헤모필루스 파라수이스 (Haemophilus parasuis)가 원인균인　 돼지 글래서병 (Glasser's disease), 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae)가 원인균인 돼지 유행성폐렴 (Swine enzootic pneumoniae), PRRS바이러스가 원인인 돼지 생식기호흡기증후군 (PRRS: Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome) 등이 있다.

돼지 글래서병은 생후 2 내지 4개월령의 자돈에 감수성이 있으며, 생후 5내지 8주령의 이유 자돈에서 많이 발생하고, 상부 호흡기도에 상재하다가 수송 및 이동 환경변화 등의 스트레스 요인에 의해 면역력이 약화되는 경우에 감염이 일어나는 질병으로서, 마이코플라즈마 하이오뉴모니애와 PRRS등은 글래서병을 촉진시킨다. 돼지 유행성 폐렴은 연중 발생하며 이병율은 높으나 폐사율은 낮으며, 어린 자돈에서 감염이 시작되어 모체이행항체가 소실되는 4 내지 5주령에 많이 발생 하고, 상부 호흡기도에 감염되어 기관의 편모와 상피세포를 파괴하여 1차적인 방어기능을 약화시켜 건성기침과 만성 폐렴을 유발하며, 폐의 탐식기능 세포의 면역력을 저하시켜 특히 다른 호흡기질병 (돼지 글래서병, 흉막폐렴, PRRS, 돼지 인플루엔자 등)을 쉽게 감염되게 하여 육성, 비육돈의 폐사율을 증가시키는 호흡기 질병이다. 돼지 생식기호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스는 피막이 있는 아테리비리데과 (Arteriviridae)의 RNA 바이러스가 원인으로 모돈에서는 번식장애, 자돈에서는 사료 효율의 악화, 높은 이유전 폐사, 간질성폐렴과 관련된 호흡기증상을 특징으로 한다. 또한, 전형적인 임상증상을 보이는 급성의 경우와 달리, 만성의 경우 피해 가 경미하나 2차 감염 (돼지 글래서병, 유행성 폐렴등)에 의해 다양한 증상을 야기시켜 큰 피해를 가져올 수 있는 질환이다.

특히 PRRS와 돼지 유행성폐렴은 발병시에 다른 호흡기질병의 원인체 예를 들어, 돼지 글래서병, 흉막폐렴, PRRS, 돼지 인플루엔자, 스트렙토코커스 (Streptococcus), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis) 등에도 쉽게 감염되어, 돼지 호흡기질병(질환)이 PMWS 및 PRDC로 진행되어 자돈에서의 호흡기증상과 함께 장기간 일당 증체량의 감소, 사료효율의 악화, 성장둔화, 이유 후 급격한 폐사 등을 나타내어 양돈장의 생산성 저하 및 경제적 피해를 일으키고 감수성 약제를 처방하기 곤란한 복합질병으로 발전한다. 따라서 양돈농가의 막대한 경제적 손실을 가져올 수 있는 주요 돼지 호흡기질병(질환)을 동시에 예방하고, 나아가 PMWS 및 PRDC예방하기 위한 방법에 대한 필요성이 증가되어 왔으나, 이에 대한 적절한 백신이 본 발명의 출원 전에 제안된 바 없다.

이에 본 발명자들은 대표적인 돼지 호흡기질병을 동시에 예방 및 치료하기 위한 방법에 대한 연구를 계속하였으며, 그 결과 질병의 감수성 시기가 유사하며, 다른 질병에 쉽게 노출될 수 있는 원인을 제거할 수 있는 3종 불활화 혼합백신을 제조하고 동물안전성 및 항체형성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 3종의 돼지 호흡기질병(질환)을 위한 혼합백신을 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로 돼지 글래서병 (Glasser's disease), 돼지 유행성폐렴 (Swine enzootic pneumoniae) 및 돼지 생식기호흡기증후군 (PRRS)의 예방을 위한 불활화 혼합백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 3종의 돼지 호흡기질환 및 PMWS (이유후 전신성 소모성 질환) 및 육성 비육돈의 PRDC (돼지 복합호흡기질환)로 진행될 수 있는 원인을 최대한 감소시킬 수 있는 불활화 혼합백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 혼합백신을 제조함에 있어 PRRS 중화항체가를 기니픽을 이용하여 측정하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 양돈농가의 자돈 및 육성돈에서 돼지 글래서병, 돼지 유행성폐렴 및 돼지 생식기호흡기증후군의 3종 질병(질환), 및 PMWS (Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, 이유후 전신성 소모성 질환) 및 PRDC (Porcine Respiratory Disease Complex, 돼지 복합호흡기 질환)로 진행될 수 있는 원인을 최대한으로 감소시킬 수 있는 효과적이고 면역력이 우수한 불활화 혼합백신을 고안하였다. 본 발명에서 돼지 글래서병에 대한 백신은, 국내 이환자돈으로부터 분리동정한 헤모필루스 파라수이스 S4 와 S5 균주를 배양하여 포르말린으로 불활화시켜 제조한다. 돼지 유행성폐렴에 대한 백신은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 J/101 균주를 사용하였으며 포르말린으로 불활화시켜 제조한다. 또한, 돼지 생식기호흡기증후군의 경우, MN-HS (입수처 : 미네소타 주립대학, 주한수교수, ATCC No.: VR2509) 또는 CNV-1 [입수처: 국립충남대학교, 김현수교수, Sequence analysis of ORF4 gene of　 porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) Korean isolate CNV-1, Korean J. Vet Res (1999) 39(2): 294~300]를 돼지의 폐 탐식세포, STL (swine testis cell line) 세포,　또는 A-72 (ATCC No.: CRL-1542) 세포에 접종 배양한 후 세포변성효과 (CPE)가 약 80%이상 출현하였을 때 채독하여 배양 감염액을 동결보존 및 동결 건조하여 백신 제조용 독주로 사용한다.

한편, PRRS항체 음성인 돼지에 PRRS 불활화백신을 접종했을 때 일반적인 중화시험(SN)으로는 항체가를 확인할 수 없었으므로, 기니픽과 돼지에서 PRRS 불활화 백신에 대한 항체가의 상관관계를 확인하였고, 기니픽을 이용하여 PRRS 중화항체가를 확인하는 신규한 방법을 고안하고 백신의 제조에 따른 검정방법으로 이용하였다. 기니픽을 이용하는 방법은 PRRS바이러스에 대해 항체음성인 돼지를 구입하는 것이 현실적으로 매우 어렵고 (농장양성율 90.4%, 돼지 양성율 45.1%), 돼지에서 PRRS 바이러스에 대한 중화항체 (IgG)가 늦게 (4 내지 5주 후) 발현되어 기존의 검정방법으로는 PRRS 중화항체가를 정확하게 측정하기 곤란하므로, 이를 극복하기 위해 본 발명자들에 의해 고안된 새로운 PRRS 항체가 검정방법 이다. 본 발명의 혼합백신을 기니픽 및 자돈에 접종한 후 PRRS의 역가변화를 확인한 결과, 중화항체가 확인방법 중 보체 (검정대상 혈청 중 1 중량% 내지 5 중량% 신선한 기니픽 혈청)를 첨가하고 4℃에서 48시간 중화하는 방법이 기니픽 및 자돈에서 PRRS 바이러스에 대한 중화항체가 확인에 가장 적합한 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 혼합백신은 백신 조성물을 구성하는 백신의 총함량이 20 내지 30% (vol/vol)이 되도록 하는 것이 바람직하며, 이때 각각의 백신은 헤모필루스 파라수이스 S4 균체 (410 nm에서 O.D 0.4 ~ 0.5), 헤모필루스 파라수이스 S5 균체 (410 nm에서 O.D 0.4 ~ 0.5), 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 J/101 (410 nm에서 O.D 0. 05 ~ 0.15) 및 PRRS MN-HS (10^5.0 ~ 10⁸ TCID₅₀ /㎖)의 함량으로 혼합된다. 각각의 백신을 충분히 혼합한 후 120목 동망으로 여과한 다음 수산화알루미늄겔 10 내지 20% (vol/vol)를 가하여 충분히 흡착시키고, 오일 애주번트 (IMS 1313 NPR) 5 내지 10 % (vol/vol), EDTA 0.14 % (w/vol)을 첨가하고 혼합하여 제조한다.

일구체예에서, 본 발명의 혼합백신의 마우스, 기니픽 및 자돈에 대한 안전성을 실험하였으며, 그 결과 마우스와 기니픽의 경우 관찰한 7일 동안, 자돈의 경우 관찰한 14일 동안 모두 생존한 것으로 나타났다.

다른 일구체예에서, 본 발명에 따른 혼합백신의 면역원성을 실험하였으며, 표 9에 나타낸 바와 같이 매우 우수한 항체형성을 나타냈다.

다른 일구체예에서, 기니픽을 이용한 PRRS 중화항체가 측정을 항체 음성 돼지에서 중화항체가를 측정하는 것과 비교하는 실험을 수행하였다. 기니픽은 돼지를 이용하여 PRRS 항체가를 측정함에 있어 발생하는 여러 문제점을 해결하고, 보다 정확하게 PRRS 바이러스에 대한 중화항체가를 제시할 수 있는 수단임을 제시한다.

다른 일구체예에서, 본 발명의 혼합백신을 냉장보관하면서 장기보존성을 실험하였으며, 3개월 단위로 21개월간 관찰한 결과 장기 보존성에 아무런 문제가 없었다 (표 15, 16, 17 및 18).

다른 일구체예에서, 실제 농장에서 자돈에 대한 안전성 및 면역원성을 실험한 결과 (표 19 및 표 20)는 본 발명의 혼합백신이 우수한 안전성 및 면역원성을 가지고 있음을 제시한다.

다른 일구체에서는 야외 양돈장 3곳을 대상으로 본 발명의 혼합백신 접종군과 기존의 단독백신 또는 혼합백신 접종군에 대해, 출하일령, 일령별 체중변화 및 출하율을 비교 하였다 (표 21, 22, 23, 및 24). 그 결과 11일주령의 경우의 두당 3.1 내지 4.2 kg 정도로 혼합백신 접종군의 체중 증가율이 높았고, 출하율의 경우 기존 백신 접종군과 비교하여 10% 이상 증가된 출하율을 나타냈으며, 평균 출하일령이 약 10일 이상 단축된 것으로 조사되었다.

이상과 같이, 본 발명의 혼합백신은 대표적인 돼지 호흡기질환인 돼지 글래서병 (Glasser's disease), 돼지 유행성폐렴 (Swine enzootic pneumoniae) 및 돼지 생식기호흡기증후군 (PRRS: Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome) 등 3종 질환을 효과적으로 예방할 뿐만 아니라, 이유자돈에서의 폐사, 위축, 일당 증체량의 감소로 인한 PMWS (Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, 이유후 전신성 소모성 질환) 및 육성 비육돈의 PRDC (Porcine Respiratory Disease Complex, 돼지 복합호흡기 질환)로 진행을 사전에 예방할 수 있는 실질적인 수단을 제공한 다.

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 상세히 설명하고자 한다. 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 균주의 분리 및 배양

돼지 글래서병의 경우, 국내 이환 자돈으로부터 분리 동정한 헤모필루스 파라수이스 (Haemophilus parasuis S4 및 S5 균주) (입수처: 국립수의과학검역원)를 각각TSB (Tryptic Soy Broth) 배지에 β-NAD (β-Nicotinamide adenine dinucleotide) 45㎍/㎖, 효모추출물 (yeast extract) 0.5% 및 수크로오스 0.5%를 가한 배양한 후 배양 감염액을 채균하여 -80℃에 동결보존 및 동결건조하여 백신 제조용 균주로 사용하였다. 다음 TSB 배지에 β-NAD 45㎍/㎖, 효모추출물 (yeast extract) 0.5% 및 수크로오스 0.5% 를 첨가하여 배양액을 조성한 뒤 헤모필루스 파라수이스 S4, S5 종균을 각각 접종 배양했다. 돼지 유행성폐렴의 원인균인 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae) J/101 균주 (입수처: 국립수의과학검역원)를 마이코플라즈마 배지 (표 1)에 접종배양한 후 배양 감염액을 채균하여 -80 ℃에 동결보존 및 동결 건조하여 백신 제조용 균주로 사용했다. 다음 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 J/101주를 마이코플라즈마 배지 (표 1)에 1/3용량이 되도록 접종하고 7 내지 10일간 배지가 노란색으로 변할 때까지 배양했다.　 돼지 생식기호흡기 증후군의 원인 바이러스인 MN-HS (입수처 : 미네소타 주립대학, 주한 수교수, ATCC No.: VR2509) 또는 CNV-1 (입수처: 국립충남대학교, 김현수교수)를 돼지의 폐 탐식세포, STL (swine testis cell line) 세포,　또는 A-72 (ATCC No.: CRL-1542) 세포에 접종 배양 (표 2 세포증식용 배지)한 후 세포변성효과 (CPE)가 약 80%이상 출현하였을 때 채독하고 배양 감염액을 -80 ℃에 동결보존 및 동결 건조하여 백신 제조용 독주로 사용했다. 다음, 돼지의 폐 탐식세포, STL 세포, 또는 A-72 세포를 세포증식용 배양액 (표 2)으로 부유시켜 배양병에 분주한 후 37 ℃에서 1 내지3 일간 배양했다. 배양세포가 단층을 형성하였을 때 배양액을 제거한 후, 바이러스증식용 배양액 (표 3)에 ㎖당 10^3.0 TCID₅₀의 (tissue culture infective dose, 50% 조직배양감염량) 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스 MN-HS를 접종하고 37 ℃에서 회전배양 했다.

표 1. 마이코플라즈마 배지 조성

표 2. 세포증식용 배양액 조성 (총 용량1,000 ml )

표 3. 바이러스 배양용 배양액 조성성분 (총 용량 1,000 ml)

실시예 2: 채독 및 불활화

돼지 글래서병의 경우, TSB 배지에 β-NAD (β-Nicotinamide adenine dinucleotide) 45㎍/㎖, 효모추출물 (yeast extract) 0.5% 및 수크로오스 0.5%를 가한 배양액에 각각 실시예 1에서 준비한 종균 배양액을 접종하고 37 ℃의 발효조에서 12시간 배양한 다음 후 채균 농축하고 0.3% 포르말린으로 72시간 동안 불활화 시켰다. 돼지 유행성폐렴은 실시예 1에서 준비한 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 J/101 균주를 마이코플라즈마 배지에 접종한 후 37 ℃에서 7 내지 10일간 배양하면서 증식된 배양 감염액을 확인하고 채균한 후 0.2% 포르말린으로 실온에서 72시간 불활화한 후 농축했다. 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스인 MN-HS 또는 CNV-1을　 돼지의 폐 탐식세포, STL (swine testis cell line) 세포, 또는 A-72 세포에 접종한 후 37 ℃에서 3 내지 5일간 회전 배양한 다음 접종 바이러스에 의한 세포변성효과 (CPE)가 약 80% 정도 일어났을 때 감염 배양액을 채독한 후 포르말린의 최종농도가 0.1%되도록 가하고 실온에서 48시간 불활화 했다. 돼지 글래서병과 돼지 유행성폐렴의 경우, 균체의 농도를 측정하기 위해 불활화 수행 전의 균체를 적당히 희석하고 410 nm에서 UV-분광광도계를 이용하여 O.D (optical density) 값을 산출했다. 돼지 생식기호흡기증후군의 경우 실시예 1에 따른 불활화 수행 전 배양 감염액을 10진 희석하여 각 희석액 0.1㎖씩을 돼지의 폐 탐식세포, STL (swine testis cell line) 세포, 또는 A-72 세포에　접종하고, 37 ℃에서 7일간 배양한 후 돼지 생식기호흡기 증후군 바이러스에 의한 세포변성효과 (CPE)가 나타난 것을 감염한 것으로 하여 바이러스 함량을 산출했다. 이때 바이러스의 함유량은 ㎖당 10^6.0 TCID₅₀ 이상이었다.

실시예 3: 불활화 혼합백신의 제조

상기 실시예 2에서 3종 항원에 대하여 채균, 채독 및 불활화를 각각의 배양 감염액에 대해 수행했다. 백신의 총함량이 전체 혼합백신 조성물의 30% (vol/vol)이 되도록, 각 백신을 다음과 같은 농도로 혼합했다: 헤모필루스 파라수이스 S4 (410 nm에서 O.D 0.45), 헤모필루스 파라수이스 S5 (410 nm에서 O.D 0.45), 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 J/101 (410 nm에서 O.D 0.1) 및 PRRS MN-HS (10^6.0 TCID₅₀ /㎖). 각 백신을 잘 혼합 후 120목 동망으로 여과한 다음 수산화알루미늄겔 20%(vol/vol)를 가하여 충분히 흡착시킨 후, 오일 애주번트 (IMS 1313 NPR) 5%(vol/vol), EDTA 0.14% (w/vol)을 첨가하고 1,000 rpm에서 30분간 혼합 유제한 다음, 계속 진탕하면서 규정된 용기에 규정량을 분병하고 2 내지7 ℃ 냉실에서 보관했다. 제조한 혼합백신은 정치하면 담홍색의 액체부분과 유백색의 침전 부분으로 분리되었으나 흔들 면 쉽게 균일한 액이 되며, 이물 및 이취가 없었다. 각 lot별 실험백신을 티오글리콜레이트 배지 (Thioglycollate medium) (Thio), 영양한천 (Nutrient agar) (NA), 영양브로스 (Nutrient broth) (NB) 배지에 각각 2개의 시험관에 접종하여, 22 ℃와 37 ℃에서 7일간 배양하면서 잡균의 혼입 여부를 조사한 결과 (표 4), 잡균이 혼입되지 아니한 것 확인할 수 있었으며, 각 lot별 실험백신을 다음 실험에 이용하였다. 또한, 실험백신의 각 lot에서 측정된 포르말린의 함량은 0.19 내지 0.20%(vol/vol) 였다 (표 5).

표 4. 실험백신의 각 lot별 잡균 혼입여부

* －: 배양세균이 없음

표 5. 실험백신의 각 lot별 포르말린 함량

실시예 4: 동물 안전성 실험

(1) 마우스에 대한 안전성 실험

실시예 3에서 제조한 실험백신 각 Lot별로 체중 13 내지15 g의 건강한 마우 스 10마리씩을 각각 공시하여 5마리는 복강, 5마리는 피하에 0.5㎖씩 각각 접종하고, 무처치 대조 5마리와 함께 7일간 관찰하였다. 그 결과 표 6에 나타낸 바와 같이 혼합백신을 주입한 모든 마우스가 관찰기간 동안 생존하였다.

표 6. 마우스에 대한 혼합백신 안전성 실험

(2) 기니픽에 대한 안전성 실험

실시예 3에서 제조한 실험백신 각 Lot별로 체중 300 내지350 g의 건강한 기니픽 12마리씩을 각각 공시하여 4마리는 근육, 4마리는 피하에 1.0㎖씩, 4마리는 피내에 0.1 ㎖씩 각각 접종하고, 무처치 대조 4마리와 함께 7일간 관찰하였다. 그 결과 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 모든 기니픽이 관찰기간 동안 생존하였다.

표 7. 기니픽에 대한 안전성 실험

(3) 자돈에 대한 안전성 실험

헤모필루스 파라수이스, 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 PRRS바이러스에 대한 항체 음성인 생후 1주령의 건강한 돼지 18두를 선정하여 본 발명의 혼합백신 Lot별로 각각 5마리씩 2두분 (2.0 ㎖)을 이근부 근육에 접종하고 무처치 대조 3마리와 함께 14일간 관찰하였다. 그 결과 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, 관찰한 모든 자돈에서 식욕감퇴, 호흡기증상 (기침, 호흡곤란), 설사, 구토, 신경증상 등 어떠한 임상증상도 나타나지 않았으며, 체온이 38.7 내지 39.7 ℃로 정상 유지되는 것이 관찰되었다.

표 8. 자돈에서의 안전성 실험 결과

* －: 이상없음

실시예 5: 면역원성 실험

헤모필루스 파라수이스, 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 PRRS바이러스에 대해 항체 음성인 생후 1주령의 건강한 자돈 18두 (실험백신 Lot별 5두, 대조 3두)를 선정하여, 실험군 15두에 1두분 (1.0 ㎖)씩 이근부 근육에 각각 1차 접종하고, 2주후 1두분 (2.0㎖)씩 이근부 근육에 각각 2차접종한 다음, 2차접종 4주후에 무처치 대조 자돈 2두와 함께 채혈하여 항체가를 측정하였다. 헤모필루스 파라수이스에 대한 ELISA 항체가는 실험돈에서 1차접종 2주후에는 80 내지160배, 2차접종 4주후에는 320 내지1,280배의 항체가를 각각 나타내었으며, 무처치 대조돈에서는 모두 10배 이하 음성이었다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에 대한 ELISA 항체가는 실험돈에서 1차접종 2주후에는 80 내지320배, 2차접종 4주후에는 640 내지2,560배의 항체가를 각각 나타내었으며, 무처치 대조돈에서는 모두 10배 이하 였다. PRRS바이러스에 대한 중화 항체가는 실험돈에서 1차접종 2주후에는 2배이하, 2차접종 4주후에는 4 내지8배의 항체가를 각각 나타내었으며, 무처치 대조돈에서는 모두 2배 이하의 음성이었다 (표 9).

표 9. 자돈에 대한 면역원성실험

실시예 6: 기니픽을 이용한 돼지 호흡기생식기증후군 ( PRRS )의　 역가 측정

300 내지 350g의 기니픽 12마리 중에서 10마리에는 근육으로 본 발명의 혼합백신을 1ml씩 접종하고 다시 3주후에 동량을 2차 접종하였고, 2마리는 대조군으로 하였다. 2차 접종 2주후에 각각 채혈하여, PRRS 바이러스에 대한 중화항체가를 기존의 방법과 새로운 방법으로 비교 측정하였다. 항체음성농장으로 판명된 종돈장에서 항체음성인 3주령 자돈 8마리를 구입하여 6마리는 이근부 근육에 실험백신을 2 ml씩 접종하고 다시 3주후에 2차 접종하였고, 2마리는 대조군으로 하였으며, 채혈은 접종전 채혈 (1차접종), 1차접종 3주후 (2차접종), 2차접종후 2주후, 2차접종 후 4주후에 각각 채혈하여, PRRS 바이러스에 대한 중화항체가를 기존의 방법과 새로운 방법으로 비교 측정하였다. 일반적인 중화항체가 측정은, 시험혈청을 56 ℃에서 30분간 비동화하고, 96-웰 마이크로플레이트(96 well microplate)에 실시예 1 표 3에 기재된 조성의 세포배양액 배지 (α-MEM)를 50㎕씩 넣고 시험혈청을 2진 희석한 후, 희석된 각각의 혈청에 200 TCID₅₀/0.1ml의 PRRSV 배양액을 50㎕를 넣어 혼합한 다음, 37 ℃에서 1시간 중화한 후, PRRSV에 감수성이 있는 세포 (MARC-145, MA-104) 25만개를 함유하는 50㎕ 배지(3% FBS 함유)를 혼합한 다음 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 5일간 배양 배양하고 세포변성효과(CPE)를 관찰하여 중화항체역가를 결정하는 단계로 수행했다. 반면에 기니픽 및 돼지의 중화항체역가 측정은 중화시간을 37 ℃에서 1시간 중화하는 방법과 4℃에서 48시간 중화하는 방법으로 나누어서 실험하고 그 결과를 비교하였다 (표 10 및 표 11). 또한 4 ℃에서 48시간 중화하는 방법을 사용하면서, 보체로서 신선한 기니픽 혈청 (fresh-serum) 함유량을 달리하는 배지 (혈청 없음, 혈청 1 중량%, 혈청 5 중량%)를 혼합하여 실험하였다. 또한, 보체 (1% 신선한 기니픽혈청)를 첨가하고, 4 ℃에서 48시간 중화하여 중화항체가를 확인하는 방법으로 재현성 확인하였다. 　또한 항체음성인 자돈을 사용하여 중화항체역가를 측정하되 일반적인 측정방법과 달리 보체 (1 중량% 신선한 기니픽 혈청)를 가하고 4 ℃에서 48시간 중화하는 방법을 통해 중화항체가를 확인하였다. 하기 표 10 내지 표 14는 본 실시예의 결과를 나타내며, 이들 결과는 PRRS 중화항체역가를 측정함에 있어 기니픽이 매우 효율적으로 이용될 수 있음을 제시한다.

표 10. 중화시간에 따른 중화항체가 확인 실험

표 11. 보체첨가량에 따른 중화항체가 확인 실험

* 혈청 없음, **　 1% 혈청, *** 5% 혈청

표 12. Complement (1% serum)첨가, 4 ℃ 48시간 중화방법 재현성실험

* 중앙백신연구소 제조관리부 바이러스팀장 유성식 실험

** 중앙백신연구소 제조관리부 바이러스팀 PRRS 담당 이연실 실험

*** 중앙백신연구소 연구개발본부 연구개발팀 권혁진박사 실험

표 13. 항체음성인 돼지에서 PRRS에 대한 일반적인 중화항체가 확인실험

표 14. 항체음성인 돼지에서 보체 (1중량% 혈청) 첨가, 4 ℃에서 48시간 중화방법을 통한 중화항체가 확인실험

실시예 7: 장기 보존성 실험

본 발명의 혼합백신을 냉장 보관하면서 장기 보존성을 관찰하였다. 실험백신을 2 내지 7 ℃ 냉암소에 보존하면서 제조일로 부터 3개월간격으로 21개월까지 헤모필루스 파라수이스, 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 및 PRRS바이러스에 대한 항체 음성인 1주령의 건강한 자돈을 선정하여, 1두분 (1.0㎖)씩 이근부 근육에 각각 1차 접종하고, 2주후 1두분 (2.0㎖)씩 이근부 근육에 각각 2차접종, 2차접종 4주후에 채혈하여 ELISA 항체가 (H. parasuis , M. hyopneumoniae) 및 중화항체가 (PRRS)를 측정한 결과 21개월까지 면역원성이 유효하였고 보존성도 양호하였다 (표 15, 16, 17 및 18 참조).

표 15. 혼합백신의 보존성 실험 ( ~ 3개월)

표 16. 혼합백신의 보존성실험 (6 ~ 9개월)

표 17. 혼합백신의 보존성 실험 (12 ~ 15개월)

표 18. 혼합백신의 보존성 실험 (18 ~ 21 개월)

실시예 8: 야외 실험

(1) 자돈에 대한 안전성실험

자돈에 대한 안전성을 확인하기 위하여, 각 Lot별 혼합백신을 생후 1주령의 건강한 자돈 330두 (실험 300두, 대조 30두)를 선정하고 실험 자돈에 본 발명의 혼합백신 2두분 (2.0 ㎖)을 이근부 근육에 각각 접종하고 무처치 대조 자돈과 함께 14일간 임상관찰 하였다. 그 결과 관찰한 모든 자돈에서 식욕감퇴, 호흡기증상 (호흡곤란, 기침), 설사, 구토, 및 신경증상 등이 나타나지 않았다. 또한 실험 자돈의 체온을 측정하였다. 자돈의 체온을 측정하기 위하여 실험군 자돈 30두 (실험백신별 10두), 대조군 자돈 10두를 선정하고 측정하였으며, 그 결과 모두 정상체온을 유지하는 것으로 나타났다 (표 19 참조). 이러한 결과는 본 발명의 혼합백신의 안전성을 입증한다.

표 19. 자돈에 대한 안전성실험

(2) 자돈에 대한 면역원성실험

생후 1주령의 건강한 자돈을 31두 (실험 28두, 대조 3두)를 선정하여 각 lot별 혼합백신을 실험 자돈 28두에 1두분 (1.0 ㎖)씩 이근부 근육에 각각 1차 접종하고, 2주후 1두분 (2.0 ㎖)씩 이근부 근육에 각각 2차접종한 후, 2차접종 4주후에 무처치 대조 자돈 3두와 함께 채혈하여 헤모필루스 파라수이스 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니애는 ELISA 항체가를 측정하고, PRRS바이러스는 중화항체가를 측정하였다. 그 결과 헤모필루스 파라수이스에 대한 ELISA 항체가는 실험돈에서 1차접종 2주후에는 80 내지160배, 2차접종 4주후에는 320 내지1,280배의 항체가를 각각 나 타내었으며, 무처치 대조돈에서는 10배를 나타냈다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니애에 대한 ELISA 항체가는 실험돈에서 1차접종 2주후에는 80 내지 320배, 2차접종 4주후에는 640 내지 2,560배의 항체가를 각각 나타내었으며, 무처치 대조돈에서는 10배를 나타냈다. PRRS바이러스에 대한 중화항체가는 실험돈에서 1차접종 2주후에는 2배이하, 2차접종 4주후에는 4 내지 8배의 항체가를 각각 나타내었으며, 무처치 대조돈에서는 모두 2배 이하 음성이었다.

표 20. 자돈에 대한 면역원성실험

비교 실시예

본 발명의 혼합백신을 단독백신 또는 다른 혼합백신을 사용중인 야외 양돈장 3곳에 적용하여 6개월간 기존 백신과 비교실험을 수행하였다. 비교를 위한 지표로 서 출하일령과 일령별 평균체중 및 출하율을 측정하였다.

표 21.　적용농장 및 종래 사용중인 백신

표 22. 혼합백신 접종군과 기존백신 접종군의 주령별 평균체중 변화

표 23. 혼합백신 접종군과 기존백신 접종군의 출하두수 및 평균 출하일령

표 24. 혼합백신 접종군와 기존백신의 접종군의 도체검사시 폐병변 지수

그 결과 상기 표 21에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 혼합백신을 사용한 자돈의 경우기존의 백신을 사용한 자돈과 비교하여, 7주령부터 두당 평균 1.5 내지 2 kg 정도의 차이를 보였고, 11주령에서는 두당 평균 3.1 내지 4.2 kg의 체중 차이를 나타냈다. 표 22의 출하율의 경우, 기존백신 접종군은 83.6 내지 84.4% 출하된 반면에, 본 발명의 혼합백신 접종군은 92.2 내지 94.9%의 증가된 출하율을 나타냈으며, 평균 출하일령이 8 내지 13일 단축되었다. 실험백신 접종군와 기존백신의 접종군의 도체검사시 폐병변지수 측정 결과를 나타낸 표 23에 따르면, 기존백신 접종군에서는 30.4 내지 33%의 폐병변이 관찰된 반면에, 본 발명의 혼합백신 접종군에서는 단지 5.5 내지 8.2%의 폐병변만이 관찰되었다. 폐병변지수의 측정은 문헌 (STRAW, B.E. et al. Clinical assessment of pneumonia levels in swine through measurement of the amount of coughing. In: International Pig Veterinary Society Congress, 8, 1986, Barcelona. Proceedings... Barcelona: IPVS, 1986. p.275.)에 따라 수행했다 (도 1 내지 도 3참조).

도 1 내지 도 3은 뉴모니아 (pneumonia) 스코어의 예에 관한 것이다.

도 1은 뉴모니아 스코어의 예: 정상 폐에서 전체에 대한 각 엽 (lobe)의 퍼센트를 도시한 것이다.

도 2는 뉴모니아 스코어의 예: 12%의 엽 스코어를 갖는 폐병변을 도시한 것이다.

도 3은 뉴모니아 스코어의 예: 20%의 엽 스코어를 갖는 폐병변을 도시한 것이다.

Claims (4)

1. 헤모필루스 파라수이스 S 4 및 S 5 (Haemophilus parasuis S4 & S5) (입수처: 대한민국 국립수의과학검역원)를 포르말린으로 불활화시킨 것 (410 nm에서 O.D 0.4 ~ 0.5); 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae) J/101 주 (입수처: 대한민국 국립수의과학검역원)를 포르말린으로 불활화시킨 것 (410 nm에서 O.D 0.05 ~ 0.15); MN-HS (ATCC No.: VR2509) 또는 CNV-1 (입수처: 대한민국 국립충남대학교, 김현수 교수)를 돼지 폐탐식세포, STL (swine testis cell lines) 세포 또는 A-72 세포 (ATCC No.: CRL-1542)에 배양한 다음 바이러스에 의한 세포변성효과가 80% 이상 발생했을 때 배양액을 채독한 후 포르말린으로 불활화시킨 것 (10^5.0 ~ 10^8.0 TCID₅₀ /㎖); 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 돼지 글래서병 (Glasser's disease), 돼지 유행성폐렴 (Swine enzootic pneumoniae) 및 돼지 생식기호흡기증후군 (PRRS: Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome)을 예방하고, 돼지 호흡기질환이 PMWS (Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, 이유후 전신성 소모성 질환) 및 육성 비육돈의 PRDC (Porcine Respiratory Disease Complex, 돼지복합호흡기질환)로 진행되는 것을 예방하기 위한 돼지 호흡기용 불활화 혼합백신 조성물.
2. 돼지 글래서병, 돼지 유행성폐렴 및 돼지 생식기호흡기증후군을 예방하고 돼 지 호흡기질환이 PMWS 및 PRDC로 진행되는 것을 예방하기 위한 돼지 호흡기용 불활화 혼합백신을 제조하는 방법으로서, 헤모필루스 파라수이스 S 4 및 S 5, 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 J/ 101를 배양한 후 포르말린으로 불활화시키고; MN-HS 또는 CNV-1 바이러스를 돼지 폐탐식세포, STL (swine testis cell lines) 세포 또는 A-72 세포에 배양한 다음 바이러스에 의한 세포변성효과가 80% 이상 발생했을 때 배양액을 채독한 후 포르말린으로 불활화시키며; 헤모필루스 파라수이스 S 4 및 S 5, 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 J/101 균주에 대한 ELISA 항체가를 측정하고, MN-HS 또는 CNV-1 바이러스에 대한 중화항체가를 신선한 기니픽 혈청을 보체로서 사용 측정한 후, 각각의 불활화백신을 약제학적을 허용되는 부형제와 함께 혼합하여 혼합백신 조성물을 제조하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 기니픽 혈청을 사용한 바이러스에 대한 중화항체가 측정이 기니픽 또는 자돈을 사용하여 수행되며, 보체로서 신선한 기니픽 혈청 1내지 5 중량%를 첨가하고, 4℃에서 48시간 중화시킴을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, MN-HS 또는 CNV-1를 원숭이유래세포가 아닌 STL (Swine testis cell line) 세포 또는 A-72 세포에서 계대배양함을 특징으로 하는 방법.

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