JPS6075284A

JPS6075284A - バクテロイデス・ジンジバリスに対するモノクロ−ナル抗体産生性ハイブリド−マ及びその製造方法

Info

Publication number: JPS6075284A
Application number: JP58183857A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Kato; 哲男加藤; Yuko Naito; 内藤　祐子; Katsuji Okuda; 奥田　克瑰; Ichiro Takazoe; 高添　一郎; Yasuo Kikuchi; 菊池　康夫
Original assignee: Lion Corp
Current assignee: Lion Corp
Priority date: 1983-09-30
Filing date: 1983-09-30
Publication date: 1985-04-27
Also published as: JPH0526463B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はバクテロイデス・ジンジバリス（Ｂ　ａｃｔｃ
ｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、　以　−ト　］
３　。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓと称する）に対する新規モノクロ
ーナル抗体産生性ハイブリドーマ及びその製造方法に関
する。

［３，ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、成人の重症歯周炎、い
わゆる歯槽膿漏症病巣局所で圧倒的多数を占めており、
最近において成人歯周症の有力な原因菌として注目され
ているものである。

従来、血液平板上で黒色集落を形成する偏性嫌気性桿菌
は、全てバクテロイデス・メラニノジニカス（［３ａｃ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ　
、以下３　、　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓと称す
る）として一括されていたが、歯周病原因菌どしては３
１ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが重要であり、本菌種を他の黒
色集落形成性バクテロイデスと区別する必要がある。し
かし、Ｂ。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを他の黒色集落形成性のバクテロ
イデスと区別することは容易でない。即ち、成人の歯周
病がＢ、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの感染によって発病し
、進行することが朗確になって以来、歯周病の予防や治
療及びその予後の状態を知るためにも同菌秤の動態を知
ることが大切になっているが、Ｂ。

ｇｉｏす１ｖａｌｉｓの病巣での存在−１′Ｊ菌数を知
るには嫌気的培養や菌の２０数項目にも亘る性状検査が
必要どされているため、Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
の動態を調べる場合に非常に困りにな問題が多いもので
ある。

この場合、本菌種を免疫したウサギ抗血清を用いてＢ、
　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの動態を調べる方法も考えられ
るが、本菌種に対する免疫血清はＢ。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対し必ずしも特異性の点で十分
でない上、閑の同定や病巣材料での割合を知ろうとして
もその希釈や濃度の決定までにｔよ様々な検討が必要で
、煩雑である。

このため、Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対して特異
性が烏く、しかも力価を損なわない抗体が望まれ、これ
を用いて簡単かつ確実にＢ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
を同定し、その動態を知る方法が望まれる。

本発明者らは、上記事情に鑑み、Ｂ。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対し特異性が高く、しかも力価
を損なわない抗体につき鋭意研究を行なった結果、１３
、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗体産生性細胞どミエローマ
細胞とを融合し、選別づることによって１３゜ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓに対するモノクローナル抗体産生性ハイブ
リドーマが１ηられると共に、この七ツクＩ］　−ナル
抗体が３　、　ｇ１１＋（ＪｆＶａｌ　ｔｓに対する特
異性が高く、同菌種の同定にイＴ効に使用し得ることを
知見し、本発明をなＪ−に至ったものである。

従って、本発明は［３、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する
モノクローナル抗体産生性ハイブリドーマ及びその製造
方法を提供するものである。

以下、本発明につき更に詳しく説明する。

本発明のＢ、　ｇ！ｎｇｆＶａｌｔｓに対する［ツクロ
ーナル抗体産生性ハイブリドーマは、［３，ｇｉｎｇｉ
ｖａｌｉｓ抗体産生性細胞とミエローマ細胞とを融合し
、選別づることによって得られるしのである。

ここで、Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗体産生性細胞
は、Ｂ。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの全菌体或いはその血球凝集素、
莢ＩＱ１内毒素等の菌体成分及び産生酵素をマウスなど
の動物に免疫し、免疫後その牌臓等を採取することによ
って１；１られる牌Ｗｔｌｌｌ胞等が用いられる。な＋
３、Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓはボストンのＦ　０
ｒＳＶｔｌｌ　Ｄ　（ｊｌｉｔａｉｃ　ｅｎｔｅｒから
分与される菌株、歯周炎の病巣局所から分離し１．：菌
株等が使用される。また、Ｂ。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの血球凝集糸としては、例えば、
Ｔ’　ｒｙｐｔｉｃａｓｃ　（Ｂ　１３　Ｌ　）　、　
Ｙｅａｓｔ　Ｆｘｔｒａｃｔ（１）　Ｈｃｏ）の透析外
液に、ヘミン５μ２／１１およびノナジオン０．５μ２
／厭を添加したものを使用し、Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ３８１株の５日間振盪培養液１２．０００牙を１
５分遠心した上れｔから、凝集因子の精製を行ない、上
清に４０％の硫安を加え、−夜放置摂その沈漬を回収し
、これを滅菌蒸溜水に浮遊させ、遠心にて沈漬を取り除
いた藍、その浮遊液に１０％の硫安を加え、−夜放置棲
、沈漬を回収し、さらにこれを０．１５Ｍ　ＮａＣＲ。

１０’Ｍ　ＣａＣＲ２，１０−４Ｍ　肯ｃＲ２を含むリ
ン酸緩衝液に懸濁し、２時間室温および一夜４℃に放置
後、凝集してくる沈漬を回収し、この標品を０．０２Ｍ
のリン酸緩衝液（ｐ＋ＩＢ、３）に浮遊さ１！１Ｓｅｐ
ｌ）ａｒｏｓｅ　４Ｂを用いてゲル濾過し、血球凝集能
の強い両分を回収し、次いでこの画分を０、　０３Ｍ　
Ｔｒｉｓ−１−１ｃｊ緩１ｊ　’ａ　（を羽８．３　）
に懸１　サセタ後、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　Ｓ、ｅｐｂａｄｅ
ｘ　Δ５０のイオン交換クロマトグラフィーにて、０．
２ＭのＮａＣＲ濃度で溶出させた両分を水で充分透析後
凍結乾燥して精製凝集素としたものを使用すること力〜
できる（この標品１００μ？（ま、１０２４倍に希釈し
て同舟の２％の血球を凝集させる）。

また、１３０ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの全菌体又は菌体成
分を免ｖｔＪる場合、必要によりアジュバン１へを使用
Ｊることができる。これらＢ、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
の全菌体又は菌体成分の免疫に用いる動物として（ま、
マウス、竹にＢ　Ａ　ｌ−１３／　Ｃ系マウスが好まし
く用いられる。

’ｔｒ　＋１）、このようにして４ワられるＢ１ｇｔｎ
ｇｉｖａｌｉｓ抗体産生性細胞は、バラバラにほぐして
使用１？、）ことが好ましい。

このＬ３０ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗体産生性細胞とＦＡ
’ｌｔ合さｉｔ。

るミエローマ細胞として（ま、マウス哲のｆｔ　ｔｌｉ
［ｉ　ｊ＋Ｔ！細胞などが有効に使用され、これら両細
胞を融合ηる場合は、Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗
体産１１ニ性ｆｉｌ　Ｉｌｌ　ＧこＴｈｌ　Ｌ。

てミエローマ細胞２倍１０以−Ｌの割合−ｒイグールの
ＩＩｉ少必須培地（Ｍ　ｉｎｉｍａｌ　Ｅ　５ｓｅｎｔ
ｉａｌ　Ｍ　ｅｄｉｕｒｎ　。

ＭＥＭ）等の適宜な培地中で混合し、遠心して上滑を除
去した後、ポリエチレングリコールで融合する方法が好
適に採用される。なおこの場合、ポリエチレングリコー
ルとしては分子ｆｆ１１０００〜６０００のものが好ま
しく用いられ、ポリエチレングリコールは２０〜６０％
水溶液どして使用することができる。また、反応は３７
℃前後で３〜７分間とすることが好ましく、反応後は、
必要により遠心し、上滑を除去した後、好適にはウシ胎
児血清を１％以」二含むＲ１）Ｍ１１６４０培地等の適
宜な培地を加えて１日程度培養Ｊ−ることが好ましい。

この細胞融合によって得られる反応物中には目的とづる
ハイブリドーマのほか、未融合のＢ。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの抗体産生性細胞、ミエローマ細
胞がン１〜在しているため、ハイブリドーマのみを選択
的に培養り′る。

この場合、このハイブリドーマの選択には、ウシ１１６
児血清を含むＲＰＭ■１６４０培地に７ミノプテリン、
ヒボキサンチン、チミジンを加えた１」ＡＴ培地がイｊ
効に用いられる。このＩ−１Δ丁培地を用いた培養（３
１１１／ｅ　）により、目的とするバイブリド−マノみ
が生存し、未融合のＢ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗体
産生性細胞、ミエローマ郭１胞が死滅するものである。

この場合、Ｉ−Ｉ　Ａ　Ｔ培地を１−１−ｒ培地に徐々
に変換することができる。

このようにして生育されたハイブリドーマは、ミエロー
マ細胞が死滅した後、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰ　
Ｍ　Ｉ　１６４０培地にヒボキサンチン、チミジンを加
えたＩ−Ｉ　Ｔ培地で５〜１０日間程度培養し、更にウ
シ胎児血清を含むＲｌ）　Ｍ　Ｉ　１６４０培地等のハ
イブリドーマ用培地で培養ツることができる。

ＩＪられたハイブリドーマから目的とＪる１３゜ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓに対するモノクローナル抗体産生性ハイ
ブリドーマを選別する方法としては、間接螢光抗体法、
ソリッドフェーズ抗体結合法（ＳへＢΔ）、ビオチン−アビジン−システム（＋３Ａ
ｓ＞、ラジオイムノアッセイ、エンディムイムノアッセ
イ等の方法が有効に使用されるが、１８にＥ　Ｌ　Ｉ　
ＳＡ法（Ｅ　ｎｚｙｍｃ　Ｌ　１ｎｋｅｄ１１１ｍ１Ｊ
ｎＯ５ＯＩ’１）ｌｔ　Ａ　５Ｓａｙ）は感度が高く、
また１１便であるため好適に採用される。

また、限界希釈法を採用することにより、ハイブリドー
マのり［１−ニングを行なうことができる。

この場合、培地としてはトＩＴ培地などを用いることが
できる。

更に、目的どづるハイグリドーマは、インビト［Ｊ　Ｃ
培養、増殖することができ、またマウス腹腔等に投与し
てインビボで増殖することができる。

％　Ｊ）　Ｎこのようにしてｊｑられた３、　ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓに対するＬツクローナル抗１水産生性ハイ
ブリドーマは、ウシ１１６児血清及びジメチルスルホキ
シド（ＤＭＳＯ）’ａ−含ムＲｌ）　Ｍ　Ｉ　１６　／
１．　Ｏ培地等ノＶａ官な培地で凍結保存することがで
きる。

本発明のハイブリドーマは、１３．　ｇｉｎｇｉｖａｌ
ｉｓに対する七ツクローナル抗体を産生ずるもので、下
記Ｊｉ：ｊ地に対重る生育状態は下記の通りである。

１ざＰＭ１１６４０　−＋− ８％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ　ｒ　１６４．０　＋１
０％十コＯ％　〃　１−ＩＴ培地　−１− １０％　Ｉ！＋−１Δ−ｒ’　Ｒ）地　→−ダルベツコ
変法ＭＥＭ　− １１ΔＮ　Ｋ　Ｓ　− ［３７℃、Ｃ０２インキユベーター（５％Ｃ０２，湿度
１００％）］木発明のハイブリドーマが産生ずる［３゜
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対するモノクローナル抗体はＢ
。

９１１１す１ｖａｌｉｓに対づ−る特異性が高く、池の
黒色集落形成性バクテロイデス群どは反応しデ［いため
、１３、（ｌｉｎｇｉνａｌｉｓを他のバクテロイデス
群と区別して確実に同定し、菌数を知ることができ、歯
周病原因菌であるＢ　０ｇ＋ｎｇｒｖａ＋ｒｓの病ａと
局所におｔ〕る局在、動態を容易に調べることができる
。従って、歯周病の診断を確実に行なうことができ、歯
周病冶隙後の状態等を６「実に知ることができるもので
ある。即ち、従来は病巣局所の＋Ｊ　１’ｉｌを嫌気培
養し、その菌梗の性状検査を行なって同定していたちの
であり、この方？人は時間的にも内容的にも非常に多く
の問題が６５す、結果も不確かなものであっ１こが、本
発明モノクローナルｊｉ’ｃ体を用いることにより、こ
のモノクローナル抗ｆ本の［３，ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
に対する特異性が高いので、このような高い特異性を仔
Ｊ゛る抗体を必要とする螢光抗体法を利用し、或いは鋭
敏度の高い抗体測定法であるＥＬＩＳＡ法を利用Ｊ−る
なとして、歯周病局所のＢ。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの存在を簡便かつ迅速にしかも正
確に知ることができ、歯周病の診断に利用することがで
きる。

このように本発明のハイブリドーマが産生りる３、ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓに対するモノクローナル抗体は極めて
特異性が高く、木Ｖ１種に共通する抗原と反応し得るも
のであり、　Ｂ、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの同定力）ら
病巣祠料中での木菌秤の割合を正確に把握りるための有
用な免疫血清である。

また、［３、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対しテ商イ特異性
ヲイ１する本発明モノクローナル抗体を用いることによ
り、アフィニイティクロマトグラフィーを用いて３、　
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの表層物質を純度高く取り出りこ
とができるものである。

次に、Ｂ、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対りるモノクロ−
ナル抗体を利用して歯周病を診断づる方法につき更に述
べると、このモノクローナル抗体を歯周病の病巣かＩう
取り出した菌と反応させ、この菌叢中にお（〕るＢ、　
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの存在を調ｌくるものである。

この場合、調べるべき菌は、これをマイクロチタープレ
ート等にコーディングし、これにモノクローナル抗体（
ハイブリドーマ培養上清など）を加え、ベルオキシダー
げを用いてＥＬＩＳＡ法によりその吸光度を測定する方
法、モノクローナル抗体と調べるべき菌とを御粘に１８
養し、これをマイクロチタープレート等に加え、ＥＬＩ
ＳＡ法Ｊ：りでの吸光度を測定して抑制率をめる方法、
モノクローナル抗体に直接ベルオキシダーＵを結合し、
このベルオキシダーじ活性を測定してめる方法、間接螢
光抗体法など、適宜な方法を採用して、調べる。べき菌
叢中の３０ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのｒ４数をめ、これに
より歯周病の進行３！度、冶痣程度を診断することがで
きる。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明り−る。

［実施例］（３、ｇｉ＋）ｇｉｖａｌｉｓ３　Ｂ　１株を用い、こ
れをトリプチケースソイの透析外液にヘミン５μ７／′
厭、メチジＡン０．５μ２／πノを加えた培地で３日間
培養した菌体を供した。

仝菌体をフ［］イント不完全アジコバントに懸濁し、１
３Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系マウス腹腔内に２回免疫した。

血中抗体価をＥＬＩＳＡ払により測定し、抗体価の上２
７したマウスに１回追加免疫し、３日後に稗職と１腺を
無菌的に採取した。採取したＢｄ／職と胸腺とは別々に
１１ＡＮ　Ｋ　Ｓ中でほぐして細胞浮）ＩＩ液をつくり
、ｌ−Ｉ　Ａ　Ｎ　Ｋ　Ｓぐ２回洗った後、トリバンブ
ル−液で細胞数を力ｔンントしＩこ。得られた肪１細胞
は細胞８１！合に使用し、　ｐ；１腺細胞はＩＪｔ給細
胞に使用した。

一方、予めＪａ養しておいた５ｔ）−２１０マウス骨髄
腫細胞を２回ＨへＮ　Ｋ　Ｓで洗った後、トリバンブル
ー液で細胞数をカウントした。

コノ（ｔ　Ｉｔｉｌ　Ｒｉ１！細胞（約１０　？　ＩＩ
　）　ニ１０１１：ｔｆｌ）Ｉｌｆｆ柵胞を和え、ｔｖ
ｌ　Ｅ　Ｍ中でよく開用し、１０００ｒｌｌｌｌｌで５
分間）ＳＩ心した。その上清を吸引除去し、ベレンｌ−
をよく解きほぐし、３７°Ｃに閤めてａ３いた５０％ポ
リエチレングリコール４０００溶液を約１分間で遠沈管
壁に伝わらせで加えた。これを３７℃の温湯中ぐときど
き振りまぜながら４分間ｂ’Ｉ　ｎ　シた後、ＭＥＭを
加えて反応を止めた。次に、８、５　Ｏｒｐｍで５分間
遠心した蛋、−上清を吸引除去し、３７℃に）晶めてお
いた１０％ウシ１八児血清を含むＲ１３Ｍ１１６／ｌｏ
培地を加え、９Ｇ穴平底マイクロプレ一ト４〜６枚に胸
腺細胞とともに分注し、培養した。

翌日、ｌ−Ｉ　Ａ　−’Ｊ　（ｉ：Ｓ地（１０％ウシ胎
児血清を含む１又ＰＭ１１６４０培地にヒボキリ−ンチ
ン１０−４Ｍ、アミツブゾリン４Ｘ１０−７Ｍ、チミジ
ン１．６×１０″′５Ｍを加えたもの）を加え、２日目
、４［１目、７［１０には培地の１／３（上清部分）を
１１Δ１゛培地で交換し、ハイブリドーマを選択した。

１０日目頃からＨＴ　Ｊ８地（１０％ウシ胎児血清を含
むＲｌ）　Ｍ　ｒ　１　（３４０Ｊｓ地にヒボキサンチ
ン１Ｃ）−４Ｍ、デミジン１．６ｘ　１０’ｉＭを加え
たもの）に交換し、約２週間口にＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ法
によりめる８、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗体産生性ハイ
ブリドーマをスクリーニングした。イの結果、５１１合
細胞は５０〜７０％のつ１ルに認められ、そのうちの１
０〜２０％がめる抗体産生性ハイブリドーマであった。

スクリーニングされたハイブリドーマは２４穴マルチウ
１ルプレートに移し、ＨＴ培地′ｃ５日間培養した後、
再度Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ法により抗体産生性の確認を行
なってから限界希釈法によってクローニングした。

限界希釈法は、ｌ−Ｉ　Ｔ　Ｊａ地で融合細胞が５　＋
ＩＭ！　／浦となるＪζうに希釈し、９６穴フィクロプ
レー１−に供給細胞（正常なりΔＬ　Ｂ　／　ｃ系マウ
スの胸■ε目ｍ胞）とともに分注しｌζ。２週間後、Ｅ
ＬＩＳＡ法により［３，ｇｉｎｇｉｖａｌｔｓ抗体産生
性ハイブリドーマのクローンをスクリーニングし、２４
穴マルチウエルプレートに移し、５０間培養後、培養−
クラス」に移した。なｄ３、培地は通常培地（８％ウシ
胎児血清を含むＲＰＭ１１６／１０培地）へと交換して
いった。

更に、抗体価の高いモノクローナル抗体を得るため、［
１的とり−るハイブリドーマ１０Ｇ〜１０７個をＢＡＩ
−Ｂ／Ｃ系マウス腹腔内に注射し、１０〜１４日後に腹
水を採取した。

なお、目的とするハイブリドーマの凍結保存は３０％ウ
シ胎児血清及び７％ｌ）　ＩＶＩ　Ｓ　Ｏを含むＲＰＭ
ＩＩ（５４０培地で（ｊなった。

次に、上記の培養フラスコ中のハイブリドーマ細胞の培
養上清及びマウス腹水をそれぞれ使用し、以下の実験を
行なった。

４ｒｉられたモノクローナル抗体の、Ｕ３　、　ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ３８１の３ＯｎｉＣａｔｅ抗原、同菌体
をガラスピーズ振揺によって抽出した表層抗原、ＫＯ＋
−１で抽出した莢膜抗原、加熱フェノール−水沫で抽出
し／、：リボ多糖体（ＬＰＳ）をそれぞれ１０μ？／厭
の濃磨でマイクロチタープレートにコーディングし、」
１“１養上滑及び腹水をＥＬＩＳＡ法ににってどの抗原
と反応づるか測定した。

その結果、Ｎｏ、１〜Ｎ０．６の６種類の全てのモノク
ローナル抗体（培養上清、腹水）は、強弱はあるものの
５ｏｎｉｃａｔｃ抗原、表層抗原に対し反応した。

また、第１表及び第１図に示したようにモノクローナル
抗体の中でも、Ｎｏ、１などの３種類は莢膜抗原に対応
し、ＮＯ，４などの３秤類はＬＰＳに対応することが認
められ、このことは第２図に示した吸収試験結果からも
ｉｌだめられた。

ＰＳに・する七ツク１」−ナル抗体Ｎｏ、４の培１を上清を使用し、ＬＰＳに対づるモノク
ローナル抗体がｓ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のＬ
ＰＳにしか反応しないか否かを調べるため、吸収試験を
行なった。なおこの場合、Ｌ　ｌ）　ＳはＢ。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のもの（第３図Ａ＞　、Ｅ、
　Ｃｏ１１山来のもの（Ｂ　）　、［３、ｍｅｌａｎｉ
ｎｏｇｅｎｉｃｕｓｓｕｂｓｐ　、ＩＩｌｅｌａｎｉｎ
ｏｇｅｎｉｃｕｓ　由来のもの（Ｃ）、［３，ｍｃｌａ
ｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ　５ｕｂｓｌ）、　ｉｎｔｃｒ
ｍａｄｉｕｓ山来のもの（Ｄ）ＩＯｕ？／厭を用いた。

その結果、第３図に示したように、培養」−清はＢ　、
　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ山来のＬＰＳとしか反応Ｕず、
特異性を示すことが認められｔ、：。

寄られたモノクローナル抗　のクラス培養上滑を５０％飽和硫安で塩析後、１０倍に濃縮した
。これをオクチルＤ　、：、　−（Ｑ　ＬＩＣｌｌｔｅ
ｒｌＯｌｌｙ）法にかけ、クラスを決定した。なおこの
場合、抗面清アンヂマウス１ｇＧ＋　、Ｉ！Ｊ　Ｇ２　
＊　Ｉ（ｌ　Ｇ３　。

ＩｇｔｖｌはＢ　１ｏｕｅｔｔｃｓ）ものを使用した。

その結果、１７られた抗体のうち、ＮＯ，４，，５のも
のはＩＱ　Ｇ２で、他のもの１よＩＱＧ＋であることが
認められた。

以上の結果を第１表に示す。

更に、［３、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ３８１に対りるモノ
クロ−ナル抗体を用いて下記の実験を行なった。

マイクロチタープレートにＢ、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
３８１、＃１０２１．０１’−６．Ｂ。

ｍｃｌａｎｉ＋＋ｏ（１ａ＋＋１ｃｕｓ　５ｕｌＪｓｐ
　、ｉｎｔｃｒｍｃｄｉｕｓ　４０　。

２４、Ｋ１−８　、　３　、　ｍｅｌａｎｉ＋＋ｏｇｅ
ｎｉｃｕｓ　５ｕｌ）ｓｐ　。

ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ　１５９３０　、　Ｓ
−１。

１−１３　Ｋ　−２の各国の５ｏｎＩｃａｔｃ抗原をコ
ーディングした。

これに上記のｊ８養上清６種類どウリーギ抗１３゜ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ血清を各つＩル加え、抗マウスＩ（＋
５複合ペルオキシダーゼ（１：　５００．　Ｃａｐｐｅ
１社）を用いてＥＬＩＳＡ法により各つ１ルの吸光度を
測定しｌｃｏ第２表にその結果を示す。

第２表の結果より、培養上清は１３　、　ｇｉｎｇｉｖ
ａｌ　ｔｓの３１！トの抗原とは反応したが、１３゜ｍ
ｃｌａｎｉｎｏｇｃｎｉｃｕｓ等どは反応せず、本発明
のモノクローナル抗体の特異性が認められた。

インヒビシコン・アッセイ（Ｅ　Ｌ　Ｉ　ＳΔ−上記の
Ｊ１４養上清と各国の５ｏｎｔｃａｔｅ抗原（Ｂ、　ｇ
ｉｎｇｉｖａｌｉｓ３８１　、　Ｂ　、　ｍｅｌａｎｉ
ｎｏｇｃｎｉｃｕｓｓｕｂｓｐ　、　ｉｎｔｅｒｍｅｄ
ｉｃｕｓ　２４　、　Ｂ　、　ｍａｌａｎｉｎｏ　−ｇ
ｃｎｉｃｕｓ　５ｕｂｓｐ　０ｍｅｌａｎｉｎｏｇｃｎ
ｉｃｕｓ　１５９３０　）１００’ｍ１ｇ／１７１．．
１０Ｔｎｇ／厭を３７℃？−１１．１間」γ１許したの
ち、４０００ｒｐｎ＋で遠沈し、上清だ（プ庖取り出し
、濾過減菌後、Ｂ、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの５ｏｎｉ
ｃａｔｅ抗原をコーティングしたマイクロチタープレー
ト上に加え、Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　ｒｈぐ測定を行なっ
た。

結果を第３表に示す。なお、結果は何も処置していない
培養上清の吸光度（ＯＤ４９０ｎｍ＝１．１７＞を１０
０としたときの抑制率（％）で表わした。

第３表の結果より、１３　、　ｏｉｎｇｉｖａｌｉｓど
Ｊ８養した七ツクローナル抗体（培養上清）は８０％の
抑制率を示したが、［３、ｍｅｌａｌｌｉｌｌＯｇＯｎ
ｉｃＵｓど培養したものの抑制率は３０％以下であり、
このことからも本発明モノクローナル抗体の特異性が認
められた。

従って、本発明モノクロール抗体を用いることにより、
３　、　（ｌｉｌｌｇｉＶａｌｉＦｉの病巣での存在や
菌数を簡単かつ確実に調べることができ、歯周病の診断
が確実になされることが知見される。

【図面の簡単な説明】

第１図はモノクローナル抗体の１３　、　ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓに対づる反応性をＥＬ、ＩＳＡ法で測定した場
合の結果を示づグラフで、第１図（１）【よ［３゜ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓの莢膜抗原を用いた場合の結果、第１
図（２）はｔ−１：）　Ｓを用いた揚台の結果を示し、
第２図は同反応性を吸収試験により測定した場合の結果
を示Ｊグラフで、第２図（１）は莢膜抗原、第２図（２
）はＬＰＳを用いた場合の結果、第３図はモノクローナ
ル抗体の各秤菌体り、　Ｐ　Ｓに対りる反応性を吸収試
験により測定した場合の結果を示リグラフである。出願人　ラ　イ　Ａ　ン　株式会ネ」

Claims

【特許請求の範囲】１、バクテロイデス・ジンジバリスに対する抗体産生性
細胞とミエローマ細胞とを融合し、選別することによっ
て得られ、バクテロイデス・ジンジバリスに対するモノ
クローナル抗体を産生ずることを特徴とするハイブリド
ーマ。２、バクテロイデス・ジンジバリスに対する抗体産生性
細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールで融
合し、次いで得られた融合細胞からバクテロイデス・ジ
ンジバリスに対するモノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマを選別することを特徴とするハイブリドーマ
の製造方法。