JPS63102697A - シュ−ドモナスアエルギノ−ザ鞭毛に対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、バクテリア感染を診断し治療するのに有用な
新規物質を得るための免疫学的手法の利用に関し、より
詳しくはシュードモナス　アエルギノーザ鞭毛（ｆ　ｌ
ａｇｅｌｌａ）を識別できるモノクローナル抗体の製造
及び適用に関する。本発明は、米国シリアル患９４６．
５５４　（１９８６年１２月２４日）の一部継続出願に
基づき、後者は米国シリアルＮ１８８１．９８４　（１
９８６年７月３日）の一部継続出願に基づく。

（従来の技術） ダラム陰性疾病及びその最も重大な合併症たとえば菌血
症及び外毒素血症は、ヒト患者におけるかなりの疾病率
及び死亡率の原因である。このことは、ダラム陰性生物
であるシェードモナス　アエルギノーザについて特に妥
当し、それは過去５０年間に亘りバクテリア感染、特に
ｎｏｓｏｃｏｍ　ｉａ　ｌ感染とますます結びついてき
ている。

過去二〜三十年間において、抗生物質がダラム陰性疾病
を抑制するために選択される治療法であった。しかしダ
ラム陰性バクテリア疾病に関連するいぜんとして高い疾
病率及び死亡率は、抗生物質治療の限界を示しており、
特にＰ、アエルギノーザに関してそうである。たとえば
アントリオール（Ａｎｄｒｉｏｌｅ）　、Ｖ、Ｇ、、　
　ｒシュードモナス　バクテリア：抗生物質治療は生存
率を改善できるか？」（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｂａ
ｃｒｅｒｉａ：　Ｃａｎ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｔｈ
ｅｒ−ａｐｙ　Ｉｍｐｒｏｖｅ　５ｕｒｖｉｖａｌ　？
　）　Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ＋（１９７８）　
、９４：１９６−１９９参照。このことが、予防及び処
置の代替法の研究を促進してきた。

考えられた一つの方法は、能動免疫化または受動免疫化
による宿主免疫系の増大である。たとえば、Ｐ、アエル
ギノーザからの完全細胞バクテリアワクチン又は精製バ
クテリア内毒素によるヒトまたは実験動物の能動免疫化
は、Ｐ、ナエルギノーザの外細胞膜に位置するリポ多糖
類（Ｌ　Ｐ　Ｓ）分子の繰返しオリゴ糖単位上の決定基
に主として向けられた特異的オプソニン抗体の発生をも
たらすことが観察されている。たとえばボラック（Ｐｏ
ｌ　１ａｃｋ）、パ、免疫グロブリン：静脈内調製物の
特性及び使用、アルピング（Ａｌｖｉｎｇ）、Ｂ、Ｍ、
、およびフィンレイマン（Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ）、Ｊ、
Ｓ、）Ｊ、ｐ７３−７９、Ｕ、　Ｓ。

デパートメント　オプ　ヘルス　アンド　ヒユーマン　
サービシーズ、１９７９参照。そのような抗体は、能動
的に生じたのであれ受動的に移入されたのであれ、種々
の動物モデルにおいて（ボラック、前出）及びヒトにお
けるいくつかの予備的研究において、Ｐ、アエルギノー
ザ感染の致命的効果に対する保護であると示されている
（ヤング（Ｙｏｕｎｇ）、Ｌ、Ｓ、及びボラックｉ、、
シュードモナスアエルギノーザ、サバス（Ｓａｂａｔｈ
）　、Ｌ、［、ｐＨ９−１３２５）ハンス　ツバ−（Ｂ
ａｎｓ　１ｌｕｂｅｒ）、１９８０）。

上述の報文は、たとえば感染株に対する抗体を含有する
プールされたヒト免疫グロブリンを投与することにより
、Ｐ、アエルギノーザによるバクテリア病を予防し処置
するために免疫治療的アプローチを用い得たことを示唆
する。ここでヒト免疫グロブリンは、なかんず＜、Ｐ、
アエルギノーザの株に対する特異的抗体で代表されるよ
うな抗体に冨む画分されたヒト血漿の部分として定義さ
れる。

ヒト免疫グロブリン成分を用いるにおける成る固有の限
界の故に、Ｐ、アエルギノーザによる病気の治療に対す
るこのアプローチは研究段階に留っており（たとえばコ
リンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、Ｍ、Ｓ、及びロビイ　（Ｒ
ｏｂｙ）　　、Ｒ，Ｅ、、　　Ａｍ、　Ｊ、Ｍｅｄ、、
　　７６　　（３Ａ）：１６８−１７４、（１９８４）
）、この成分を用いる市販入手できる製品はまだない。

ヒト免疫グロブリン組成に関連するそのような限界の一
つは、これらが千Å以上の提供者からのサンプルのプー
ルから成り、そのようなサンプルは特定の抗シュードモ
ナス抗体の存在について予備選択されているということ
である。このプール化は、個々の抗体力価の平均化を結
果し、これは精々望む抗体の得られる力価の中庸な増大
をもたらすのみである。

もう一つの限界は、予備選択それ自体が製品の一貫性を
確認するために提供者プールのコストのかかる連続的ス
クリーニングを必要とするということである。これらの
努力にも拘らず免疫グロブリン製品はまだ、バッチ間及
び地域間のかなりのバラつきがありうる。

免疫グロブリン組成物に固有のもう一つの限界は、その
使用が不都合な生物的効果を起す能力を持つ生体外蛋白
性物′１Ｋ（後天性免疫疾陥症候群つまりＡＩＤＳに関
連することが最近判ったようなウィルスを包含する）の
多量の偶然の投与をもたらすということである。望む抗
体の低い力価と生体外物質の高い含量の組合せは、患者
に投与しうる特異的な、従って有利な免疫グロブリンの
量を最適より下のレベルにしばしば制限するかも知れな
い。

１９７５年にコーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルスティン
（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）は、成るマウス細胞系統がマウス
ヒ臓細胞と融合して、各々が単一の特異性の抗体すなわ
ちモノクローナル抗体を分泌するところのハイブリドー
マを作ることができることを報告した（コーラ−〇、と
ミルスティンＣ０、ネイチア、２５６　：　４９５−４
９７．１９７５）。この技術の出現によって、抗原上の
特定の決定基（一つ又は複数）に対する精巧に特異的な
ネズミ抗体の多量を作ることが、いくつかの場合に可能
になった。

従って、後に開発された技術を用いて、ヒトモノクロー
ナル抗体を作ることが可能になった（たとえば米国特許
第４．４６４，４６５号明細書参照）。

ある状況においてマウスモノクローナル抗体またはその
ような抗体の組成物がヒトにおいての使用に問題を有す
ることが認められる。たとえば、成るヒトの疾病の処理
のための試験的研究で用いられたマウスモノクローナル
抗体が、それらを無効果にする免疫反応を誘発しうろこ
とが報告されている（レビイ　（Ｌｅｖｙ）　、ＲｏＬ
、とミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｒ，Ａ、、　Ａｎｎ、　
Ｒｅｖ、、　Ｍａｄ、、　３４　：　１０７　１１６（
１９８３）。しかし、組換えＤＮＡ技術における最近の
進歩、たとえばミメラ的マウス／ヒトモノクローナル抗
体の製造によって、これらの問題は低減しうる。またヒ
トモノクローナル抗体を作る方法が、現在利用できる（
ヒトハイブリドーマとモノクローナル抗体（ｌｌｕｍａ
ｎ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　ａｎｄＭｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、イングルマン（Ｅｎｇｌｅｎ
ａｎ）、ｔ！、Ｇ、ら編、プレナム（Ｐｌｅｎｕｏ＋）
出版社（１９８５）参照）。

ハイブリドーマ及び／又は細胞転換技術を用いて、多（
のグループがＰ、アエルギノーザに対するモノクローナ
ル抗体の製造を報告している。バクテリアのＬＰＳ分子
で見い出されるような単−及び複数血清タイプ特異的表
面エピトープを包含する、Ｐ、アエルギノーザの種々の
エピトープと反応性のモノクローナル抗体が作られた（
たとえば係属中の米国特許出願シリアルｆｆ１７３４，
６２４及び８０７．３９４参照）。また、Ｐ、アエルギ
ノーザ内毒素Ａに特異的な保護的モノクローナル抗体が
作られた（たとえば米国特許出願シリアル患７４２．１
７０参照）。

Ｐ、アエルギノーザのＬＰＳ領域又はこのバクテリアの
内毒素に特異的なモノクローナル抗体の使用は、ある状
況において十分な保護を与えうるが、一般により広い保
護能力を持つことが好ましい。

たとえばヒトにおける潜在的感染に対する予防処置にお
いて、多数のＰ、アエルギノーザ株に対して保護的な抗
体（単数又は複数）を投与することが好ましい。同様に
、感染株の血清タイプが知られていない場合の治療的投
与において、理想的には従来の血清タイプ図全般にわた
って反応的な抗体を備えることにより、臨床的に重要な
Ｐ、アエルギノーザ血清タイプの多く　（もし総てでな
いとしても）に対して保護的な抗体又は抗体の組合せを
投与することが好ましい。

生物体の毒性（ビルレンス）に寄与することが示された
Ｐ、アエルギノーザ生理学の一つの面は、運動性であり
、これは鞭毛の存在より主としてもたらされる能力であ
る（モンテイ　（Ｍｏｎｔｉｅ）　、Ｔ。

ら（１９８２）、インフエクション　アンド　イミユニ
ティ（Ｉｎｆｅｃｔ＋ａｎｄ　Ｉ＋＋ｎｕｎ、）　ｓ　
３８　：１２９６−１２９８）。Ｐ、アエルギノーザは
、その棒状構造の一端に単一の鞭毛を持つことにより特
徴づけられる。火傷を受けたマウスモデルの研究は、非
運動性Ｐ、アエルギノーザ株が実験的火傷に接種された
時に、運動性株が用いられた時よりも多いパーセントの
マウスが生存したことを示した。（マクマナス（ＭｃＭ
ａｎｕｓ）、＾、ら（１９８０）、Ｂｕｒｎｓ、　６　
：　２３５−２３９及びモンテイＴ、ら（１９３２）　
　、　Ｉｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎ、、　　
　３　８　　：１２９６−１２９８）。Ｐ、アエルギノ
ーザの発生病理についての他の研究は、鞭毛抗原調製物
で免疫化された動物が火傷を受け、該バクテリアの運動
性株で感染されたとき保護されたと主張する（ホルダー
（Ｈｏｌｄｅｒ）　、Ｉ、ら（１９８２）、Ｉｎｆｅｃ
ｔ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、、　　３５　：　２７６−
２８０）。

重要なことに、Ｐ、アエルギノーザ鞭毛は、血清学的方
法で研究され、二つの大きな抗原群に分けられると報告
されており、Ｂ、ランイ　（Ｌａｎｙｉ）によりＨｌ及
びＨ２と名付けられ（１９７０、ＡｃｔａＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｈｕｎｇ、、　　１７　
：　３５−４８）、アンソルグ（Ａｎｓｏｒｇ）　、Ｒ
，によりタイプａ及びタイプｂと名付けられた（　１９
７８　、Ｚｂｌ、Ｂａｋｔ。

）！ｙｇ、、　Ｉ、　Ａｂｔ、　Ｏｒｉｇ、　Ａ、　２
４２　：　２２８−２３８）。

両研究室による鞭毛の血清学的タイプ分けは、Ｈ１鞭毛
（ランイ、Ｂ、、上述）すなわちタイプｂ（アンソルグ
、Ｒｏ、上述）は血清学的に均一である、即ちサブグル
ープ（小群）は認められなかったことを示した。この血
清学的に均一な鞭毛タイプは、下記ではタイプｂと云う
。別の主な抗原Ｈ２（ランイ、Ｂ、、上述）すなわちタ
イプａの鞭毛（アンソルグ、Ｒ８，上述）は、五つのサ
ブグループを含んだ。この抗原は、下記では鞭毛タイプ
ａと呼び、五つのサブグループはａ（１、ａＩ）Ｒ２５
）Ｒ３及びＲ４と呼ふ。タイプａの五つのサブグループ
は、抗原ａｔ、を例外として、タイプａを持つＰ、アエ
ルギノーザの種々の株において種々の組合せで発現され
る。ａ０抗原は、タイプａ鞭毛のすべてにおいて見られ
、しかしそれが発現される程度は株によって異る。

Ｐ、アエルギノーザの熱安定な主な体壁抗原に基づく血
′清タイプ分は図は、）ｔａｂｓ図と呼ばれ、これは最
近インターナショナル　アンティゲニソクタイピング　
システム　スキームに組み込まれた（リウ　（Ｌｉｕ）
、Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
＋　　３３：２５６　（１９８３）参照）。Ｐ、アエル
ギノーザ）ｌ　ａ　ｂ　ｓ対照株の鞭毛タイプは、Ｐ、
アンソルグ（１９７８、Ｚｂｌ、　Ｂａｋｔ、　Ｈｙｇ
、、　１．Ａｂｔ、　Ｏｒｉｇ、　Ａ。

２４２　：　２２８−２３８）によるポリクローナル血
清によるイムノ螢光により、又はスライド共同行凝集（
アンソルグ、Ｒｏら、１９８４、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋　　２０　：　８４　８８）に
より特徴づけされた。１ｌａｂｓ株２．３．４．５．７
．１０，１１及び１２は、鞭毛タイプｂを持つ株であり
、Ｈａｂｓ株１．６．８及び９はタイプａ　Ｋ１毛を有
する。すなわち、多数のＰ、アエルギノーザ株が、鞭毛
蛋白質に特異的な少数のモノクローナル抗体によりたぶ
ん認識できた。

従って、鞭毛蛋白質上のエピトープと反応でき、かつあ
る場合にはＰ、アエルギノーザの複数の血清タイプに対
して保護を与えることができる七ツクローナル抗体に対
する大きなニーズがある。また、これら抗体のいくつか
は、Ｐ、アエルギノーザ怒染の予防的及び治療的処置と
しての使用のために、ならびにそのような感染の診断の
ために適してい　　　　　。

なければならない。本発明は、これらのニーズを満す。

（発明の構成） 本発明は、Ｐ、アエルギノーザバクテリアのほとんどの
株に存在する鞭毛に結合できるモノクローナル抗体を産
生できる新規な細胞系統を提供する。

このモノクローナル抗体は、Ｐ、アエルギノーザの鞭毛
蛋白質上のエピトープと特異的に反応し、バクテリアの
タイプａ鞭毛とタイプｂ鞭毛を区別できる。また、Ｐ、
アエルギノーザ株の鞭毛と反応できる少くとも一種のモ
ノクローナル抗体またはその結合性フラグメントを含み
、かつ好ましくは生理学的に許容されるキャリアーも含
む組成物の予防的又は治療的量を投与することにより、
Ｐ、アエルギノーザに感染しやすい又はすでに感染した
ヒトを処置する方法が提供される。この組成物はまた、
下記のもののいずれかを一以上含むことができる：Ｐ、
アエルギノーザ外毒素と反応できる追加のモノクローナ
ル抗体：Ｐ、アエルギノーザのＬＰＳ上の血清タイプ決
定基と反応できるモノクローナル抗体；ヒト血漿からの
ガンマグロブリン画分（ここで血漿は、Ｐ、アエルギノ
ーザと反応性の免疫グロブリンを高められたレベルで示
すヒトから得られたものであることができる）；及び−
以上の抗生剤。更に、診断キットの製作を含めた、モノ
クローナル抗体の８ｎ床的使用が提供される。

本発明に従い、モノクローナル抗体を産生できる新規な
細胞およびそのような抗体を含む組成物が提供され、そ
のような組成物は多数のＰ、アエルギノーザ株に存在す
る鞭毛を選択的に識別することができ、ここで個々の抗
体は典型的にはＰ、アエルギノーザ鞭毛の一つのタイプ
を識別する。この細胞は、それからの胚系統ＤＮＡ又は
前駆体細胞がその中に再配置されていて成るＰ、アエル
ギノーザ株間に共通の鞭毛蛋白質上のエピトープのため
の結合部位を持つ抗体をエンコードするところの同定し
うる染色体を持つ。タイプａ鞭毛蛋白質に対しては、火
攻応性モノクローナル抗体が産生されることができ；タ
イプｂ鞭毛蛋白質に対しては、火攻応性又は鞭毛を持つ
株の少くとも約７０％と反応する抗体が誘発される。こ
れらモノクローナル抗体は、診断及び治療を含む広い用
途で使用できる。

このように提供されるモノクローナル抗体は、Ｐ、アエ
ルギノーザにより起される重大な病気の処置又は予防に
特に有用である。Ｐ、アエルギノーザの鞭毛上の表面蛋
白質は、抗体分子による直接接触に利用することができ
、従ってこの生物の運動を抑制する及び／又は被感染宿
主に有利な他の効果を促進するのであろう。

モノクローナル抗体の調製は、Ｐ、アエルギノーザの複
数の株の鞭毛蛋白質上のエピトープに特異的な抗体をコ
ードする核酸配列を発現できる細胞系統を不死化するこ
とにより達成できる。不死化された細胞系統は、トラン
スフェクション、突然変異などにより腫瘍発生を経て転
換されだ哺乳動物細胞系統であることができる。そのよ
うな細胞としては、ミエローマ系統、リンパ腫系統、又
は免疫グロブリン又はその結合性フラグメントの発現及
び分泌をインビトロで支持できる他の細胞系統が挙げら
れる。この免疫グロブリンまたはフラグメントは、ビー
ルスによりリンパ細胞特にヒ臓細胞を転換することによ
り、又は腫瘍細胞たとえばミエローマとリンパ細胞を融
合してハイブリッド細胞系統を作ることにより作られた
好ましいマウスまたはヒト由来以外の哺乳動物の天然発
生の免疫グロブリンであることができる。ヒ臓細胞は典
型的には、鞭毛抗原又はエピトープ部位を含むそのフラ
グメントに対して免疫化された動物から得られる。免疫
化手法は周知であり、そしてかなり変更することができ
、しかしいぜん効果的でありうる。（ゴルディング（Ｇ
ａｌｄｉｎｇ）、モノクロ−カル　アンチボディ：プリ
ンシプルズ　アンドブラクチス、アカデミツク　プレス
、ニエーヨーク（１９８３）参照）。

ハイブリッド細胞系統は、慣用の手法に従いクローン化
され、スクリーンされることができ、これを検出した細
胞上清中の抗体はＰ、アエルギノーザ鞭毛決定基に結合
できる。適当なハイブリッド細胞系統は、次に大規模培
養基中で生育でき、又は腹水産生のための適当なホスト
の腹腔内の注射できる。

本発明の一実施態様において、細胞は、好ましくは少な
くとも一つの鞭毛蛋白質に特異的な接近しうるエピトー
プに対してインビボで保護的である、ヒトモノクローナ
ル抗体を産生する転換されたヒトリンパ細胞である。こ
のリンパ細胞は、Ｐ。

アエルギノーザの適当な鞭毛所有株にさらされている又
はかつてさらされたヒト提供者から得ることができる。

好ましい細胞転換プロセスは、米国特許第４，４６４，
４６５号明細書に記載される。鞭毛蛋白質に特異的であ
ると知られている本発明の抗体を用いると、ある場合に
は続く実験の上清を、抗鞭毛モノクローナル抗体の別の
サンプルを同定する手段としての本モノクローナル抗体
との競合アッセイにおいてスクリーンすることができる
。

すなわち、ハイブリッド細胞系統は、特定の鞭毛抗原に
特異的な本抗体の人手可能性に基づき種々の源から容易
に作ることができる。

あるいは、主体エピトープ部位に特異的な抗体を産生す
るハイブリッド細胞系統が入手できる場合には、これら
ハイブリッド細胞系統を他の腫瘍Ｂ細胞と融合すること
ができ、ここでそのような他のＢ細胞はレセプターをコ
ードするゲノムＤＮＡのための受容体として働くであろ
う。ケソ歯類、特にネズミの腫瘍Ｂ細胞が最も一般に用
いられるが、他の哺乳動物種たとえばウサギ、ウシ、ヒ
ツジ、ウマ、トリ類などを用いることができる。

モノクローナル抗体は、免疫グロブリンのクラス又はサ
ブクラスのいずれか、たとえばＩｇＭ、ＩｇＤ。

ＩｇＡ、　ＩｇＥ又は各動物種について知られているＩ
ｇＧのサブクラスであることができる。一般にモノクロ
ーナル抗体は、全体として用いるか、又は結合性フラグ
メントたとえばＦｖ、　Ｐａｂ　、　Ｆ（ａｂ　’　）
２として用いることができるが、通常は全体として用い
る。

本発明の細胞系統は、モノクローナル抗体の直接の産生
以外の用途もある。該細胞系統は、他の細胞（たとえば
適当に剤でマークされたヒトミエローマ、マウスミエロ
ーマ、又はヒトリンパ芽球腫細胞）と融合されて、ハイ
プリドーマを作り、そして従ってモノクローナル抗体を
エンコードする遺伝子のトランスファーを備えることが
できる。

あるいは、細胞系統は免疫グロブリンをエンコードする
染色体源として用いられることができ、これは単離され
、融合以外の手法により細胞にトランスファーされうる
。加えて、モノクローナル抗体をエンコードする遺伝子
は単離され、種々の宿主において特異的免疫グロブリン
の生産のために組換Ｄ　Ｎ　Ａ技術に従い用いられうる
。特に、メツセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡライブラリ
ーを作ることにより、免疫グロブリンをコードしかつイ
ントロンを含まない単一のｃＤＮＡクローンを単離でき
、原核又は真核発現ベクター中に置き、続いて最終的多
量生産のための宿主に転換することができる。（一般的
に米国特許第４．１７２．１２４号、４，３５０．６８
３号、４，３６３．７９９号、４．３８１．２９２号及
び４，４２３．１４７号明細書、及びケネソト（Ｋｅｎ
ｎｅｔｔ）ら、モノクローナル　アンチボディーズ、プ
レナム、ニューヨーク（１９８０）参照。） より詳しくは、ハイブリッドＤＮＡ技術に従い、本発明
の免疫グロブリン又はフラグメントは、バクテリアまた
は酵母に導入できる。（ボス（Ｂｏｓｓ）ら、Ｎｕｃｌ
、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、＋　　１２　：　３７９１　
、及びウド（Ｗｏｏｄ）ら、ネイチア３１４：４４６参
照）。

たとえば、本発明の細胞系統により産生されたモノクロ
ーナル抗体のＬ鎖及びＨ鎖をコードする遺伝子から転写
されたメツセンジャーＲＮＡは、本クローン以外のＢＡ
ＬＢ／Ｃリンパ細胞からのｃＤＮＡを用いて判別ｃＤＮ
Ａハイブリッド化により単離されうる。ハイブリッド化
しないｍ　ＲＮ　Ａは、望む免疫グロブリン鎖をコード
するメツセージに冨むであろう。必要なときは、このプ
ロセスは、望むｍ　ＲＮ　Ａレベルまで高めるために繰
返すことができる。次に残ったｍＲＮＡ組成物を逆転写
して、望む配列に富むｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ混合物を得ること
ができる。ＲＮＡは、適当なＲＮ、、、、により加水分
解でき、そして５ｓＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼｌとラ
ンダムプライマーたとえばランダムに切断された子牛胸
腺ＤＮＡにより二重鎖にされる。

得られたｄｓＤＮＡは次に、適当なベクターたとえばラ
ムダベクター又はプラスミドベクター（ｐＢＲ３２２５
）ｐＡｃＹｃ１８４などのような）のようなウィルスベ
クター中への挿入によりクローン化されうる。Ｌ及びＨ
鎖の一定領域のための既知の配列に基づくプローベを開
発することにより、望むＬ鎖及びＨＩＸをコードする遺
伝子を持つｃＤＮＡクローンが、ハイブリッド化により
同定されうる。この後で、遺伝子はプラスミドから切除
され、開始コドンから上流の余分のＤＮＡ又は−尾領域
ＤＮＡを除（ため操作され、そして宿主の転換及び遺伝
子の最終的発現のために適当なベクター中に導入される
ことができる。

便宜には、完全な免疫グロブリンを作るべく鎖を加工す
る（たとえばＨ鎖とＬ鎖を合体する）ために、そして更
にはもし望むなら先導（リーダー）配列のない免疫グロ
ブリンを分泌するために哺乳類宿主（たとえばマウス細
胞）を用いることができる。あるいは、この二つの鎖を
作るために単細胞微生物を用いることができ、その場合
、Ｈ鎖をコー、ドする配列の５′末端に開始コドンを備
えながら、分泌先導シグナル及びプロセシングシグナル
をコードするＤＮＡ配列を除去する操作が更に必要であ
ろう。この手法により免疫グロブリンを作ることができ
、そして哺乳類細胞以外の細胞中に集合されグリコジル
化されるように処理できる。

もし望むなら、鎖の各々を少くとも可変領域を残すよう
に切断し、次に該領域を操作して鞭毛エピトープに特異
的な他の免疫グロブリン又はフラグメントを備えること
ができる。

本発明のモノクローナル抗体は、現在知られているほと
んど総てのＰ、アエルギノーザ変種にわたる抗原に対す
るその特異性の故に特に有用である。

また、該モノクローナル抗体のいくつかは、インビボで
保護的であり、バクテリア感染のための抗体組合せのよ
うな医薬品中に入れることができる。

本発明のモノクローナル抗体はまた、インビトロでも広
い用途がある。たとえばこのモノクローナル抗体は、微
生物のタイプ分け、特定のＰ、アエルギノーザの分離、
細胞の不均質混合物中のＰ、アエルギノーザの選択的除
去などのために用いうる。

診断目的のためには、モノクローナル抗体はラベルされ
ても、されなくても良い、典型的には診断的アッセイは
、Ｐ、アエルギノーザ生物の鞭毛へのモノクローナル抗
体の結合を経るコンプレックスの形成を検出する必要が
ある。ラベルされていない場合、抗体は、凝集アッセイ
において用いられる。また、ラベルされていない抗体は
、このモノクローナル抗体と反応性の他のラベルされた
抗体（第二抗体）たとえば免疫グロブリンに特異的な抗
体と組合せて用いうる。あるいは、モノクローナル抗体
は、直接ラベルされうる。広い種類のラベル、たとえば
放射性核種、螢光体、酵素、酵素基質、酵素補助因子、
抑制酵素、リガンド（特にハブテン）などを用いること
ができる。多数のタイプのイムノアッセイを用いること
ができ、たとえば下記の米国特許明細書に記載されるも
のを挙げることができる：３．８１７．８２７　；３．
８５０，７５２　；３，９０１，６５４；３．９３５，
０７４：３．９８４，５３３　　；３，９９６．３４５
：４．０３４．０７４：及び４，０９８．８７６゜ 一般に、本発明のモノクローナル抗体は、酵素イムノア
ッセイで用いられ、そこでは本抗体又は異る種からの第
二抗体が酵素に接合される。ヒト血液又はその溶解物の
ような成る血清タイプのＰ。

アエルギノーザを含むサンプルが本抗体に結合されると
き、結合は抗体と望むエピトープを示す分子との間に起
る。そのような細胞は次に、結合されなかった反応剤及
び加えられた第二抗体（酵素でラベルされた）から分離
されうる。その後に、細胞に特異的に結合した抗体−酵
素結合体の存在が決定される。当業者に周知の他の慣用
法も用いうる。

溶液中のＰ、アエルギノーザ、又はＰ、アエルギノーザ
鞭毛抗原の存在を検出するために本抗体を用いるキット
を提供することができる。すなわら、本発明の主体たる
モノクローナル抗体組成物を、通常は凍結乾燥した形で
、単独で又は別のダラム陰性バクテリアに特異的な別の
抗体と接合して用意することができる。ラベルに接合さ
れた又は接合されていない抗体が、緩衝剤たとえばＴｒ
ｉｓ、リン酸塩、炭酸塩など、安定剤、殺生物剤、不活
性蛋白質たとえばウシ血清アルブミンなどと共にキット
に含められる。一般にこれら物質は、活性抗体量に対し
て約５重量％未満の量で、かつやはり抗体濃度に対して
少くとも約ｏ、ｏｏｉ重量％の合計量で存在するであろ
う、しばしば、活性成分を希釈するために不活性増量剤
又は賦形剤を含めることが望ましく、賦形剤は全組成物
の約１〜９９重量％で存在しうる。モノクローナル抗体
に結合できる第二抗体を用いる場合、これは通常側のバ
イアル中に入れられる。第二抗体は典型的には、ラベル
に接合され、上述の抗体調製物と同様に処方される。

本発明のモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル
抗体はまた、少くとも一種の本発明のモノクローナル抗
体の治療的量又は予防的量を含む医薬組成物の成分とし
て医薬的に効果的なキャリヤーと共に含められる。医薬
キャリアは、患者にモノクローナル抗体を運ぶのに適す
る任意の相客的な非害性物質でなければならない、殺閏
水、アルコール、脂肪、ワックス、及び不活性固体をキ
ャリアとして用いうる。医薬的に許容されるアジュバン
ト（緩衝剤、分散剤）も医薬組成物に含めることができ
る。そのような組成物は、Ｐ、アエルギノーザの一つの
鞭毛タイプの株に特異的であるように単一のモノクロー
ナル抗体を含むことができる。あるいは医薬組成物は、
二以上のモノクローナル抗体を含んで「カクテル」を形
成することができる。たとえば二つの鞭毛タイプに対す
る又は種々のＰ、アエルギノーザ株（たとえば異る血清
タイプ）の群に対するモノクローナル抗体を含むカクテ
ルは、その特定のバクテリアの臨床的単離物の大多数に
対して反応する刃用製品であろう。

種々のモノクローナル抗体成分のモル比は、通常１０倍
以上は異ならず、より普通には５倍以上は異ならず、通
常他の抗体成分の各々に対して約１：１〜２のモル比で
あろう。

本発明のモノクローナル抗体はまた、現存する血漿製品
、たとえばヒトにおけるＰ、アエルギノーザ病の予防又
は治療処置で用いられる市販入手できるガンマグロブリ
ン及び免疫グロブリンと組合せて用いることができる。

好ましくは、免疫グロブリンの場合、血漿は、Ｐ、アエ
ルギノーザに反応性の免疫グロブリンの高いレベルを示
すヒト提供者から得られるであろう。（一般に、概説「
イントラビナス　イミュン　グロブリン　アンド　ザコ
ンプロミスド　ホストＪ　、Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｍｅｄ
、、　７６（３ａ）、１９８４年３月３０日、ｐｐｌ−
２３１参照）。

本モノクローナル抗体は、抗生物質又は抗微生物剤と共
に与えられる、別途に投与される組成物として用いるこ
とができる。典型的には、抗微生物剤としてはアミノグ
リコシド（たとえばゲンタマイシン、トブラマイシンな
ど）と共に抗シュードモナスペニシリン（たとえばカル
ベニシリン）を挙げることができ、しかし当業者に周知
の多数の追加的剤（たとえばセファロスポリン）をも用
いうる。

本発明のモノクローナル抗体及びその医薬組成物は、経
口又は非経口投与のために特に有用である。好ましくは
、該医薬組成物は、非経口的に、すなわち皮下に、筋肉
内に又は静脈内に投与できる。すなわち本発明は、許容
されるキャリア、好ましくは水性キャリアに溶解された
モノクローナル抗体又はそのカクテルの溶液を含む、非
経口投与のための組成物を提供する。種々の水性キャリ
ア、たとえば水、緩衝された水、０．４％食塩水、０．
３％グリシンなどを用いうる。これら溶液は無菌であり
、一般に粒状物質を含まない。これら組成物は、慣用の
周知の殺菌法で殺菌できる。組成物は、はぼ生理的な条
件に必要とされるような医薬的に許容される補助物質た
とえばｐＨ調節剤及び緩衝剤、毒性調節剤など例えば酢
酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カ
ルシウム、乳酸ナトリウムなどを含むことができる。こ
れら処方における抗体の濃度は広く変ることができ、即
ち約０．５％未満、通常少くとも約１％から、１５又は
２０重量％までの多量までであることができ、選択され
た投与の特定の態様に好ましい液体体積、粘度などに主
に基づいて選ばれるであろう。

即ち、筋肉内注射のための典型的医薬組成物は、１ｍｆ
の殺菌緩衝水及び５０ｍｇのモノクローナル抗体を含ん
で作られることができる。静脈内注入のための典型的組
成物は、２５０一の殺菌リンゲル液及び１５０ｍｇのモ
ノクローナル抗体を含んで作られることができる。非経
口投与組成物を調製する実際の方法は、当業者にとって
明らかであり、より詳しくはたとえば、レミントンズ　
ファーマシニーティカル　サイエンス、第１５編、マツ
クハフリシング　カンパニー、イーストン、ペンシルベ
ニア（１９８０）に記載されている。

本発明のモノクローナル抗体は、貯蔵のために凍結乾燥
でき、使用前に適当なキャリア中で戻すことができる。

この手法は、慣用の免疫グロブリンについて有効である
ことが判っており、周知の凍結乾燥と再構成技術を用い
ることができる。凍、結乾燥及び再構成が種々の程度の
抗体活性損失をもたらしうろこと（たとえば慣用の免疫
グロブリンにおいてＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体より大きな
活性損失の傾向を持つ）、そして使用レベルは補償すべ
く調節しなければならないことを当業者は理解するであ
ろう。

本モノクローナル抗体又はそのカクテルを含む組成物は
、Ｐ、アエルギノーザ感染の予防及び／又は治療処置の
ために投与できる。治療利用において、組成物は一以上
のＰ、アエルギノーザ血清タイプにすでに感染した患者
に、感染及びその合併症を治ゆする又は少くとも軽減す
るのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分
な量は、「治療的有効量」と定義される。この使用のた
めに有効な量は、感染のはげしさ及び患者自身の免疫系
の一般的状態に依存し、しかし一般に体重１ｋｇ当り約
１〜約２００＋＋ｇの抗体の範囲であり、１ｋｇ当り５
〜２５ｍｇの投与量がよりＪｌｌＰ通に用いられる。本
発明の物質が一般にＰ、アエルギノーザによる重大な病
的状態、すなわち生命を脅す又は潜在的に生命を脅す状
況、特に菌血症及び内毒素血症において用いうろことを
銘記すべきである。

予防的利用において、本発明の抗体又はそのカクテルを
含む組成物は、まだＰ、アエルギノーザに感していない
患者に、そのような潜在的感染に対する患者の抵抗を高
めるために投与される。そのような量は、「予防的有効
量」と定義される。この用途において、正確な量はやは
り患者の健康状態及び一般的免疫レベルに依存し、しか
し一般に１　ｋｇ当り０．１〜２５ｍｇ、特に１　ｋｇ
当り０．５〜２．５鱈の範囲である。

組成物の一回又は複数投与は、処置する医者により選ば
れた投与量レベル及びパターンで実施できる。いずれに
せよ本医薬処方物は、患者を有効に処置する又は予防す
るのに十分な本発明の抗体量を備えなければならない。

実　　験 実施例１ 実施例１は、Ｐ、アエルギノーザ鞭毛に特異的に結合す
るネズミモノクローナル抗体を調製するのに用いられる
方法論を示す。

３月齢のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを、生育しうる
Ｐ。

アエルギノーザ　フィッシャー　イムノタイプ１及びフ
ィッシャー　イムノタイプ２　（Ａ．Ｙ．Ｃ．Ｃ．＃２
７３１２及び２７３１３）バクテリアを用いて各１又は
２週ごとに合計９週間、９度腹膜内的に免疫化した。バ
クテリアの当初投与量は、Ｐ、アエルギノーザ　フィッ
シャー　イムノタイプｌ及びフィッシャー　イムノタイ
プ２の各々をマウス当り８Ｘ１０’及びｌＸｌ０’生物
個数であり、投与量は免疫化の経過において３０〜６０
倍増加された。

最後の注射の３日後に、−匹のマウスからヒ臓を無菌的
に取出し、二つの無菌ガラススライドのつや消しした端
の間で組織をおだやかに回転させて単一細胞懸濁物を調
製した。ヒ臓単核細胞を、対数期マウスミエローマ細胞
（ＮＳ　Ｉ−１、Ｃ，ミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
）博士、モレキュラー　リサーチ　カランシル、ケンブ
リッジ、イングランドより入手）と４：１の比で一緒に
し、タム（Ｔａｎ）ら（１９８２５）Ｉｎｆｅｃｔ、　
Ｉｍ＋ｓｕｎ、　　３６　：１０４２−１０５３）の方
法に従って融合してハイブリドーマを作った。８来たハ
イブリッド細胞懸濁物を、ＲＰＭＩ−ハイブリッド−Ｈ
ＡＴ（１５％の熱不活性化胎児つン血清、１ｍＭのピル
ビン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのペニシリン及び
ストレプトマイシン、１．０Ｘ１０−’Ｍのハイポキサ
ンチン、４．０　Ｘ　１０−７Ｍのアミノプテリン及び
１．６　Ｘ　ｌ　０−５Ｍのチミジンを含む（ＲＰＭＩ
２６４０　（Ｇｉｂｃｏ　、グランド　アイランド、ニ
ューヨーク〕）（これは飼育細胞として新鮮に調製され
たＢ　、Ａ、　Ｌ　Ｂ　／　ｃ胸腺細胞２．０ＸｌＯ’
／ｍ１を含んだ）中の１．５Ｘ１０’細抱濃度に希釈し
た。

混合物を、９６穴プレート（％３５９６、Ｃｏ５ｔａｒ
、ケンブリッジ、マサチューセッツ）中に置いた（大当
り２００μβ）。２〜３日ごとに新鮮なＲＰＭＩ−ハイ
ブリッドＨＡＴを各大体積の５０％の除去と置き代えに
よって培養物に栄養補給した。細胞生長がくぼみ中で約
４０％コンフルエンシ、（（ｃｏｎｆＬＵｅｎｃｙ）に
達したときく通常７〜ｌＯ日以内）に、酵素結合イムノ
ツルハント　アッセイ　（ＥＬＩＳＡ）により抗Ｐ、ア
エルギノーザ抗体の存在について培養物上清を評価した
。

ハイブリッド細胞の培養上清は、二つの免疫化バクテリ
アの各々からの外膜調製物について同時にアッセイされ
た。外膜調製物は、タム（Ｔａｍ）らの方法の変形によ
って分離された（１９８２５）Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｒｎ
ｕｎ、、　　３６　：１０４２−１０５３）。

バクテリア（Ｐ、アエルギノーヂフィッシャーイムノタ
イブ１及びフィッシャーイムノタイプ２）を、トリブテ
ィカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ）中に接種し１回転振動浴
中でエアレージしながら３４℃で１６〜１８時間生育さ
せた。バクテリアを遠心分離で集め、１ｍｌ当り１５０
）’Ｊプシン抑制単位（Ｔ、１．　Ｕ、　）のアブロテ
ィニンを含むリン酸塩緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ、　０．
１４　Ｍ　　ＮａＣｊｌ！、３ｍ？、ｌ　　ＫＣｊｌ’
、３ｍＭ　　Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２０，１，５ｍＭ　
　ＫＩｌ、ＰＯ，、ｐＨ７，２）（シグマ社、セントル
イス、ミズリー）で二度洗った。

最後の遠心分離からのベレットを０．１７　Ｍ　ト！Ｊ
エタノールアミン、２０ｍ！Ｊエチレンジアミン四酢酸
二ナトリウム（ＥＤＴＡ）に再懸濁し、次に氷上で１０
分間ホモゲナイズした。デブリー（ｄｅｂｒｉｓ）を、
均質化物から１４９００ｘｇでペレット化し、棄てそし
て上清を再び上述のように遠心分離した。ベレットを再
び棄て、 １４１０００ｘｇでの１時間の遠心分離により上清から
膜をペレット化した。上清を棄て、膜ペレットを、１〜
Ｉ当り７５Ｔ、１．Ｌｌ、のアプロチニンを含む１０ｍ
１のＰＢＳ中に４℃で一夜貯蔵した。翌日、ペレットを
かきまわして再懸濁し、次に小分けして、−７０℃で貯
蔵した。各々の蛋白質含量を、ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）
ら（１９５１、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

１９３：２６５−２７５）の方法により測定した。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡのための抗原プレートを下記のように調
製した。細胞外膜調製物をＰＢＳ中の蛋白質が５μｇ／
ｍｌとなるまで希釈し、溶液５０μｌを９６穴プレー）
　（Ｌｉｎｂｒｏ　　＃７６−０３１−０５、フローラ
ボラドリープ社、マクリーン、バージニア）の各穴に置
き、シールし、３７℃で一夜インキエベートした。非結
合抗原をプレートから払い落し、ＰＢＳ中の５％（ｗ　
／　ｖ　）ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）の１００
μｌを各穴に加え、プレートを３７℃で１時間インキエ
ベートした。

非吸着ＢＳＡを払い落した後に、融合プレートの各穴か
らの培養上清く５０μりを抗原プレートの対応する穴へ
レプリカ法で移し、３７℃で３０分間インキュベートし
た。非結合抗体を穴から払い落し、プレートを穴当り１
００μ１０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−ＰＢＳで三度洗った
。次に、おおよそに希釈されたビオチニル化（ｂｉｏｔ
ｉｎｙｌａ−ｔｅｄ）ヤギ抗マウスＩｇＧ　（Ｔａｇｏ
社、バーリンガム、カリフォルニア）の５０μｌ／穴を
各穴に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。プ
レートを上述のように三度洗い、次に製造５者の指示書
に従って調製された、予め形成されたアビジン：ビオチ
ニル化ホースラディツシュ　パーオキシダーゼコンプレ
ックス（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣＫｉｔ＋　ベク
ターラボラトリーズ社、バーリンガム、カリフォルニア
）の５０μｌを穴に加えた。室温で３０分間後に、Ｖｅ
ｃｔａｓｔａｉｎ剤を穴から払い落し、穴を上述のよう
に洗い、次に穴当り１００ＩＪＩ！の基質〇−フェニレ
ンジアミン（０，１Ｍクエンｅｌ！　塩１１１　衝剤中
の０．８ｍｇ／　ｍｅ　５ｐｉ１５．０　、同体積の０
．０３％（ｖ　／　ｖ　）　Ｉｌ＊Ｏｔを混合されてい
る）を加えた。基質を、暗中で室温で３０分間インキュ
ベートし、次に３　Ｎ　Ｈ２ＳＯ，を５０μＩｔ／穴加
えて反応を停止した。

二つの抗原調製物のどちらかに結合したモノクローナル
抗体を分泌するハイブリドーマ細胞は、ダイナチックモ
デル５８０マイクロエライザリーダー（アレキサンドリ
ア、バージニア）で各穴中の呈色反応の４９０ｎｍでの
吸収を測定することにより位置を決めた。Ｐａ３１ＶＣ
２と名付けられた一つの大中の細胞は、フィッシャーイ
ムノタイプ２抗原プレートのみに結合した抗体を産生じ
た。この穴を下記のように更に研究した。この穴からの
モノクローナル抗体及びクローナル細胞系統の両者は、
下記においてＰａ３１ＶＣ２と呼ぶ、マスター穴からの
Ｐａ３１ＶＣ２細胞は、タムら（１９８２５）Ｉｎｆｅ
ｔ。

ｌｍ５ｕｎ、、３６：１０４２　１０５３）により記載
される限界希釈法によりミニクローン及びクローンされ
た。

タムら（１９８２５）Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｎ＋ｓｕｎ、
、　　３６　：１０４２−１０５３）により記載される
手順に従いＣＢ６Ｆ＋　マウス（ＢＡＬＢ／ｃ　　（メ
ス）×Ｃ５７ＢＬ／６　（オス）Ｆｌ）において、高力
価モノクローナル抗体を含む腹水を調製した。２〜３月
齢のオスＣＢ６Ｆ、マウスに、ＲＰＭＩ中の対数期Ｐａ
３１ＶＣ２細胞を腹膜内注射する１０〜２１日前に、０
．５ｍｌプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチ
ルペンタデカン、アルトリフチケミカル社、ミルウォー
キー、ライスコンシン）を腹膜内注射した。各マウスに
０．５ｔａｌ中０．５〜Ｉ　Ｘ　１０’細胞を注射した
。約２週間後に、蓄積した液を各２〜３日ごとにマウス
から取出した。

アガロース　ゲル電気泳動（Ｐａｒａｇｏｎ　、ペック
マン　インストルメンツ社、ブレア、カリフォルニア）
により、腹水中の抗体濃度を測定し、５ｍｇ／ｖｉｅ以
上の抗体を含む腹水をすべてプールし、小分けし、−７
０℃で凍結させた。

モノクローナル抗体により結合された分子ターゲットの
特徴付げ クローンされたＰａ３１ＶＣ２細胞系統からの培養上清
を、すべて上述のように調製された、Ｐ、アエルギノー
ザフィフシャーイムノタイプ株（＾、Ｔ、Ｃ，Ｃ。

２７３１２−２７３１８）の七つ総て、Ｐ、アラレオフ
ァシェンス（Ａ、Ｔ、Ｃ０Ｃ，１３９８５）及びタレブ
シエア　ニューモニアエ（Ａ．Ｙ．Ｃ．Ｃ．８０４７）
からの細胞外膜について上述のようにＥＬ　Ｉ　ＳＡに
よりアッセイした。抗体Ｐａ３１ＶＣ２は、Ｐ、アエル
ギノーザフィフシャーイムノタイプ２．６及び７の外膜
調製物に結合し、他のフィンシャーイムノタイプ、Ｐ、
アラレオファシェンス及びに、ニューモニアエには結合
しなかった。

抗体Ｐａ３　ＩＶＣ２により同体された特異的抗原は、
ラジオイミューン沈澱により同定された。簡単に云えば
、この分析は、放射ラベルされた抗原をＰａ３１ＶＣ２
抗体及び蛋白質Ａの粒状源と共にインキュベートするこ
とを要し、これは不溶性抗体：抗原コンプレックスの形
成を結果する。これらコンプレックスは、何らかの非特
異的に結合した抗原を除去するため洗われ、次にコンプ
レックスは解離され、ポリアクリルアミドゲル中で分離
される。

これによりゲル中で見られる主な放射活性種は、抗体Ｐ
ａ３１ＶＣ２が結合する対応する抗原として同定される
。

可溶性Ｐ、アエルギノーザフィッシャーイムノタイプ２
．３．４及び５外膜調製物の小分けしたもの（２５Ｍｇ
）を固相中で１２５１を用いるヨウ素源（ピアスケミカ
ル社、ロックフォード、イリノイ）を用いて放射ラベル
した（フレカー（Ｆｒａｋｅｒ）とスペック（Ｓｐｅｃ
ｋ）、１９７８、ＢＬｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｓａ＋ｕｎ、、　　８０　：　８４９
　８５７　；マークウェル（Ｍａｒｋｗｅｌｌ）とフォ
ー／ジス（Ｆａｘ）、１９７８、バイオケミストリー、
１７：４８０７−４８１７）。

この手順は、外膜調製物に含まれた殆どのくもし総てで
なくとも）蛋白質のさらされたチロシン残基のヨウ素化
を結果した。

外膜抗原の抗体Ｐａ３１ＶＣ２への非特異的結合を減少
させるために、放射ラベルされた調製物（アッセイ当り
５Ｘ１０’力ウント／分）は最初にＢＡＬＢ／Ｃ正常マ
ウス血清（１：４０最終希釈）と共に４℃で１時間イン
キュベートした。Ｐａ３１ＶＣ２抗体を含むＰａ３１Ｖ
Ｃ２培養上清（０，５＋＊ｊりを次に、各外膜サンプル
に加えた。４℃で１時間の抗原と抗体のインキュベーシ
ョン後に、蛋白質Ａ源１ｇＧ５０ＲＢ（０，０９５ｍｊ
２／サンプル）（ジ　ェンザイムセンター社、ボストン
、マサチューセッツ）を加え、４℃で更に３０分間イン
キュベートした（ケスラー（Ｍｅｓｓ　１ｅｒ）、Ｓ、
Ｗ、、　　１９７５、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、＋１１５：１６
１７−１６２２）、ＩｇＧＳＯＲＢは製造業者の措示書
に従って調製され、使用の直前にＩｇＧＳＯＲＢをＲＰ
ＭＩ−ハイブリッド（ＨＡＴを除いたＲＰＭＩ−ハイプ
リッ）−ＨＡＴ媒体）で二度洗うことにより、反応能力
のある部位を培養媒体によりブロックして非特異的反応
を抑制した。

抗原−抗体−Ｉ　ｇＧｓＯＲＢコンプレックスを４℃で
１０分間１５０　ＱＸｇでペレット化し、リン酸塩−Ｒ
ＩＰＡ緩衝液（１０１ｍＭリン酸塩、ｐＨ７，２，０，
１５Ｍ　　ＮａＣｊ！、　　１．０％　（ｖ　／ｖ）　
Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００，１，０％（ｗ／ｖ）デオ
キシコール酸ナトリウム、０．１％（Ｗ／Ｖ）　　ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び１．０％（ｖ　／
　ｖ　）アプロチニン）で二度洗い、高塩緩衝液（０，
１Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ、ｐＨ８，０，０，５ＭＬ
ｉＣｌ！、１％（Ｖ／Ｖ）ベーターメルカプトエタノー
ル）で二度洗い、溶解緩衝液（０，０２Ｍ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ　、　ｐＨ７，５，０，０５Ｍ　　ＮａＣ１，
０，０５％（ｖ　／　ｖ　）　Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ　−
４０（ロールシュナイダー（Ｒｏｈｒｓｃｈｎｅｉｄｅ
ｒ）ら、１９７９、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、＋　ＵＳ＾、７６：４４７９−４４８３）
で一度洗った。コンプレックスに結合した抗原を、サン
プル緩衝液（０，１２５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐｌ
Ｊ６．８．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２％（Ｖ／Ｖ）　ベ
ーターメルカプトエタノール、及び２０％（Ｖ／Ｖ）グ
リセロール）と共に９５℃で１０分間インキュベートす
ることにより解放し、１５００Ｘｇで１０分間の遠心分
離後に上滑中に集めた。

上清サンプルを次に、Ｂ、ルーテンベルク（Ｌｕｇ　ｔ
ｅｎｂｅｒｇ）ら（１９７８、Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　Ｌｅｔ
ｔ、。

５８　：　２５４−２５８）の方法を用いて、ハンコノ
ク　（Ｈａｎｃｏｃｋ）とカルイ　（Ｃａｒｅｙ）　（
１９７９、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　１４０　：　９０２　９１
０）により変更されたようにして調製されたＳＤＳを含
む１４％ポリアクリルアミドゲルに施与し、抗原を５０
■一定電圧で一夜電気泳動してゲル中で分離した。

４０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸、
及び５％（ｖ　／　ｖ　）グリセロール中で一夜ゲルの
固定化に続いて、それを、旧ｏｒａｄゲルドライヤー（
リッチモンド、カリフォルニア）を用いて−ｈａ　ｔｏ
＋ａｎ　３　Ｍ　Ｍ紙上で乾燥した。乾いたゲルをプラ
スチックラップで被い、室温で１８時間コダソクＸ−Ａ
Ｒフィルムに曝露した。

この実験の結果は、Ｐａ３１Ｖｃ２がＰ、アエルギノー
ザフィノシャーイムノタイプ２のみの外膜調製物中の唯
一つの抗原に結合し、他の外膜調製物中に存在するいか
なる抗原にも結合しなかったことを示した。ゲル中の抗
原の分子量（ＭＷ）は、同じゲル中で分離した１４Ｃラ
ベルした蛋白質標品（ホスホリラーゼＢ、９２５００Ｍ
Ｗ；ＢＳＡ。

６９０００ＭＷ、オバルブミン、４６０００ＭＷ。

カーボニック　アンバイトラーゼ、３００００ＭＷ；チ
トクロームＣ，１２０００ＭＷ）にューイングランド　
ニュクリアー、ボストン、マサチューセソツ）と移動性
を比較することにより測定すると、約５３０００ダルト
ンであった。この抗原の分子量は、Ｐ、アエルギノーザ
の鞭毛を成す蛋白質であるフラゲリン（ｆｌａｇｅｌｌ
ｉｎ）　（モンティー（Ｍｏｎｔｉｅ）　　ら、１９８
２５）Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、　　３５：２８
１−２８８が報告するような）の分子量と相互に関連し
た。

また、９６穴微小力価プレート、にエタノールで固定さ
れたＰ、アエルギノーザＨａｂｓ株１〜１２（Ａ．Ｙ．
Ｃ．Ｃ．３３３４８〜３３３５９）を用いてＥＬＩＳＡ
によりＰａ３１ＶＣ２を調べた。

各生物体の一夜ブロス培養物をベレット化し、ＰＢＳで
二度洗い、そして０．２０．Ｄ、単位のＡ６＆。

までＰＢＳ中に再懸濁した。希釈されたバクテリアを穴
（５０μβ／穴）中に置き、室温で１５分間１５００Ｘ
ｇで遠心分離した。ＰＢＳを吸引し、室温で１５分間エ
タノール（９５％）を穴に加えた。エタノールを穴から
払い落した後に、プレートを空気乾燥し、次に被い使用
まで４℃で保存した。

上述のように実施したＥＬ　Ｉ　ＳＡテストの結果は、
Ｐａ３１ＶＣ２がエタノール固定Ｈａｂｓ株２．３．４
．５．７．１０．１１及び１２に結合したことを示した
。特異性のこのパターンは、Ｐａ３１ＶＣ２がＰ、アエ
ルギノーザのタイプｂ鞭毛に結合したことを示した（ア
ンソルグ（Ａｎｓｏｒｇ）　、Ｒ，、１９７８、Ｚｂｌ
、　　Ｂａｋｔ、　　）ｌｙｇ、、　　１．　　Ａｂｔ
、　　Ｏｒｉｇ、　　八、　　２４　２　：２２８−２
３８；アンソルグＲ０ら、１９８４、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　２０　：　８
４−８８）　＊モノクローナルＰａ３１ＶＣ２に対する
特異性のこの振り分けによると、Ｐ、アエルギノーザ参
照株、フィンシャーイムノタイプ２５）フィンシャーイ
ムノタイプ６、及びフィンシャーイムノタイプ７は、タ
イプｂ鞭毛を有する。上述の実験データから、Ｐａ３１
ＶＣ２はＰ、アエルギノーザフラジエリンクイプｂに特
異的に結合すると結論された。

Ｐａ３１ＶＣ２のインビボ保護活性 モノクローナル抗体Ｐａ３１ＶＣ２が、生きたＰ、アエ
ルギノーザバクテリアの多重ＬＤ、。で攻撃されたマウ
スを保護するかどうかを調べるために、動物実験を行っ
た。選ばれたモデルは、火傷を受けたマウスモデルであ
った（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、Ｍ、Ｓ、、及びロ
ビイ　（Ｒｏｂｙ）　、Ｒ，Ｅ、、　　１９８３　、Ｊ
。

Ｔｒａｕｍａ、２３　：　５３０−５３４）、マウスの
グループは、著者のプロトコールに従い重大な火傷を与
えられ、次に直ちにフィッシャーイムノタイプ７の５−
１０ｔ、ＤＳ、で攻撃された。火傷及び攻撃の前にモノ
クローナル抗体を高力価腹水（０，２ｎ＋ｊ！腹膜内）
として腹膜内投与した。抗体を受けなかったものと比べ
て、Ｐａ３１ＶＣ２処置された動物において生存数の増
加は見られなかった。

実施例２ 実施例２は、インビボで保護的であるＰ、アエルギノー
ザ鞭毛タイプｂに対するネズミモノクローナル抗体を産
生ずるネズミハイブリドーマ細胞系統の調製の方法論を
示す。

成熟したメスＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに先ず、生
育しうるＰ、アエルギノーザフィンシャーイムノタイプ
６　（ＡＴＣＣ階２７３１７）（８Ｘ１０’個生物）を
腹膜注射し、２週間後に生育しうるＰ、アエルギノーザ
フィッシャーイムノタイプ５（ＡＴＣＣ！Ｖｈ２７３１
６）（４Ｘ１０’個生物）を注射した。続く２週間の間
に、生育しうるＰ、アエルギノーザフィフシャーイムノ
タイプ５及びフィンシャーイムノタイプ６を一緒に週１
回（計２回）注射した。各生物の投与量は、最終投与量
が当初投与量の１０倍になるように増加された。

Ｒ，Ｅ、Ｗ、ハンコソク及びＨ，ニカイド（Ｎｉｋａｉ
ｄｏ）（１９７８、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１
３６　：　３８１−３９０）の方法に従い調製されたＰ
、アエルギノーザフィソシャーイムノタイプ６外膜調製
物（５０μｇ蛋白質）の最後の注射は、最後の生育しう
るバクテリア注射の４日後に与えられた。最後の免疫化
の３日後に、１匹のマウスからヒ臓を取出し、実施例１
で記述したようにハイブリッド化のためにヒ臓細胞を調
製した。

ハイブリドーマ細胞の培養上清を、実施例１記載の手順
で、１０日後の融合（ｄａｙ　１０　ｐｏｓｔ　−ｆｕ
ｓｉｏｎ）　ヘのＥＬ、Ｉ　ＳＡにより、抗Ｐ、アエル
ギノーザ抗体の存在についてアッセイした。但し、ＥＬ
　Ｉ　ＳＡプレート用の抗原は、９６穴微小力価プレー
トの穴に固定化された生育しうるバクテリアであった。

プレートは下記のように調製された。

５０μｌのポリーＬ−リジン（Ｐ　Ｌ　Ｌ）（Ｐ　Ｂ　
Ｓ中１　、ＩＪ　ｇ／　ｖａｎ＞　　（Ｓｉｇｍａ　＃
Ｐ　−１５２４、セントルイス、ミズリー）を、９６穴
プレート（Ｌｉｎｂｒｏ）の各穴に加え、室温で３α分
間インキュベートした。吸着されなかったＰＬＬを払っ
て落し、穴をＰＢＳで三度洗った。ＴＳＢ中で一夜生育
されたバクテリア培養物をＰＢＳで一度洗い、次に０．
０゜６６０ｒ＋ｏ＋＝０．２までＰＢＳに再）Ｕ濁した
。５０μｌのバクテリア懸濁物をプレートの各穴に加え
、３７℃で１時間結合を許した。結合しなかったバクテ
リアは、プレートを振り次に食塩水−Ｔｗｅｅｎ（０，
９％（ｗ／ｖ）ＮａＣＪ、０．０５％（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅ
ｅｎ　−２０）で穴を三度洗うことによって除いた。

抗体の非特異的結合は、ブロック化緩衝液（５％（Ｗ／
Ｖ）脱脂ドライミルク、０．０１％（Ｖ／Ｖ）アンチフ
オームＡ（シグマ社、セントルイス、ミズリー）、及び
０．０１％（Ｗ／Ｖ）チメロサールを含むＰＢＳ）の２
００μβ／穴を穴に加え、室温で１時間インキュベーシ
ョンすることによりブロックされた。過剰のブロック化
緩衝液を除去し、穴を上述のように食塩水−Ｔｗｅｅｎ
で三度洗った。

培養物上清（５０μＩｌ）をアッセイプレートの対応す
る穴へレプリカ法で移し、室温で３０分間インキュベー
トした。プレートを振り、穴を食塩水−Ｔｗｅｅｎで五
度洗うことにより、培養物上清を除去した。

酵素と接合した第二段階抗体（ホースラディツシュ　パ
ーオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ　＋１ｇＭ　）
　　（Ｔａｇｏ社、バーリンガム、カリフォルニア）を
、０．１％（ｖ　／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ　−２０と０．２
％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ中に予め求めた力価測
定に従って希釈し、次に５０μＥの反応剤を各穴に加え
、室温で３０分間インキュベートした。過剰の反応剤を
除去した。穴を食塩水−Ｔｗｅｅｎで五度洗った。

そしてＯ−フェニレンジアミン基質の１００μｌ／穴を
加え、実施例１記載のように３０分間インキュベートし
た。実施例１記載のように反応を停止させ、次にＢｉｏ
−Ｔｅｋ　　ＥＬ−３１０自動化ＥＩＡプレートリーダ
ー上でＡ４９０ｎｍで読み取った。

上述の方法により、融合からの培養上清は、Ｐ。

アエルギノーザフィッシャーイムノタイプ１，２．３又
は４に結合し、しかし同じＰＬＬ及びブロック化手順に
より但しバクテリアなしで調製された対照プレートに結
合しなかった抗体の存在をアッセイされた。これら四つ
のフィッシャーイムノタイプのいずれかに結合した抗体
を含む上清は二度目に七つのフィッシャーイムノタイプ
バクテリアの各々を用いて別々にアッセイされた。一つ
の穴ＰａＦ４１ＶＥ８からの上清中に存在した抗体は、
Ｐ、アエルギノーザフィンシャーイムノタイブ２．６及
び７にのみ結合した。穴ＰａＦ４１ＶＥ８からの細胞は
、実施例１記載のように限界希釈法によりクローンされ
た。この穴からのモノクローナル抗体及びクローナル細
胞は両者とも、下記ではＰａＦ４１ＶＥ８という表示で
呼ぶ。高力価モノクローナル抗体含有腹水を、実施例１
記載のように、但しｃＢ６Ｆ＋の代りにＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ
　／　ｃマウスを用いて生じさせた。

ＰａＦ４１ＶＥ８の特異性 モノクローナル抗体ＰａＦ４１ＶＥ８により結合された
抗原を同定するために行われた一つのアッセイは、バク
テリア生物上の直接イムノフルオレ、センスであった。

Ｐ、アエルギノーザの七つの参照フィンシャーイムノタ
イプの各々ならびにＰ、アエルギノーザの非鞭毛株（Ｐ
Ａ１０３、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ。

２９２６０、レイフソン（Ｌｅｉｆｓｏｎ）、１９５１
、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　６２　：　３７７−
３８９）　、及びエシェリヒア　コリ　（Ｇ、Ｓ、Ｃ，
Ａ　２５　）をＴＳＢ中で３７℃で一夜生育させた。遠
心分離によりバクテリアをベレー／　）化し、次にＰＢ
Ｓ中で二度洗った。

各株をＰＢＳ中に０．０．６６０　ｎ曽＝　２．２まで
再懸濁した。

バクテリア懸濁物を次に更に１：１５０で希釈し、サン
プル２０ｕｌをＣａｒｌｓｏｎスライド（カールソン　
サイエンティフィック社、ピートン、イリノイ）の個々
の穴に入れ、スライド上で４０℃で乾燥させた。ＰａＦ
４１ＶＥ８の培養上清（２５μｌ）を、スライド上の乾
燥したバクテリアサンプル上で、加湿チャンバー中室温
で３０分間インキュベートした。結合しなかった抗体は
、蒸留水中にスライドを浸すことによりスライドから洗
い落した。

スライドが乾いてから、フルオレセイン　イソチオシア
ネート（Ｆ　Ｉ　ＴＣ）接合ヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｉｇ
Ｍ　（Ｐ　Ｂ　Ｓ中の１：４０希釈の２５μｌ／穴）（
タボ社、バーリンガム、カリフォルニア）をこのスライ
ド上で加湿チャンバー中暗中室温で３０分間インキュベ
ートした。スライドを再び蒸留水中で洗い、乾燥し、次
゛にＰＢＳ中のグリセロール（９：　１）でコーティン
グしたカバースリップで被った。スライドを螢光顕微鏡
で見た。

螢光着色は、Ｐ、アエルギノーザフィッシャーイムノタ
イプ２．６及び７でのみ観察され、微生物の一端からの
み発する正弦パターン（線）であった。このことは、こ
れらバクテリアの単一の掻鞭毛の形態及び位置と一敗す
る。

ＰａＦ４１ＶＥ８と鞭毛との反応は、イムノプロット分
析により確認された。Ｐ、アエルギノーザフィッ・シャ
ーイムノタイプ６からの外膜抗原（実施例１参照）を、
実施例１と同様にＳＤＳを含む１４％ポリアクリルアミ
ドゲル中での電気泳動により分離した。但し、電気泳動
は、８０＋Ａの一定アンペア数で５時間行った。予め着
色した分子量マーカー（リゾチーム、１４３００ＭＷ　
；ヘ−タラク）グロブリン、１８４００ＭＷ；アルファ
キモトリプシノーゲン、２５７００ＭＷ；オバルブミン
、４３０００ＭＷ、ウシ血清アルブミン、６８０００Ｍ
Ｗ；ホスホリラーゼＢ、３７４００；及びミオシン、２
０００００ＭＷＨＢＲＬＪ／イサーブルク、ミズリー）
を、同じポリアクリルアミドゲル中に含めた。

抗原をポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース
膜（ＮＣＭ）（０，４５μｍ、シュライヒャー　アンド
　シュニル社、ケーン、ニューハンプシャー）ヘト、０
．０５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含むＴｒｉｓ−グリシン−
メタノール緩衝液（トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）　　ら、
１９７９、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　ＩＪＳＡ、７６　：　４３５０−４３５４
）中で２００ｍＡの一定アンペア数で４℃で一夜かけて
移した。移動後に、ＮＣＭをＰＢＳ中の０．０５％（ｖ
　／　ｖ）　Ｔｗｅｅｎ　−２０（Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗ
ｅｅｎ）　（ハチイガ−（Ｂａｔｔｅｉｇｅｒ）、Ｂ、
ら、１９８２　、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈ、、５５　：　２９７−３０７）中で室温で１
時間インキュベートした。この段階及び続く段階のたメ
ニ、ＮＣＭを含むトレイを振動プラットフォーム上に置
いて、全ＮＣＭに亘る溶液の分布を確実にした。

１時間後に、ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎ液を注ぎ去り、Ｐ
ａＦ４１ＶＥ８腹水（Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎ中１　：
　１０００希釈）を加え、ＮＣＭと共に室温で１時間イ
ンキュベートした。次にＮＣＭをＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅ
ｎで五度、各５分間洗って、結合していない抗体を除去
した。アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ　＋　ＩｇＭ　　（ダボ社）を製造業者の指示書に従
い希釈し、ＮＣＭと共に室温で１時間インキエベートし
た。ＮＣＭを上述のように互変洗い、レアリー（Ｌｅａ
ｒｙ）ら（１９８３、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　、８０　：　４０４５−４０４９
）記述のように調製されたブロムクロルインドリルホス
フェート及びニトロブルーテトラゾリウム（シグマ社、
セントルイスミズリー）含有基質を加え、室温で１０〜
２０分間インキュベートした。蒸留水で基質を洗い去る
ことにより反応を停止した。

この実験の結果は、ＰａＦ４１ＶＥ８が外膜調製物中の
分子ｉｉ５３０００ダルトンの単一抗原に特異的に結果
したことを示した。間接イムノフルオレセンスアッセイ
及びイムノブロッティングは、ＰａＦ４１ＶＥ８がＰ、
アエルギノーザの鞭毛に結合することを示す。

ＰａＦ４１ＶＥ８が認識した鞭毛タイプは、ＥＬＩＳＡ
により決定された。）ｔａｂｓ株１〜１２　（Ａ、Ｔ、
Ｃ，Ｃ。

＃３３３４８〜３３３５８）を各々ＰＬＬで９６穴微小
力価プレー）　（Ｌｉｎｂｒｏ）の穴に結合させ、本実
施例で上述したようにＥＬ　Ｉ　ＳＡを行った。

ＰａＦ４１ＶＥ８の源は、培養上清であった。陽性反応
は、ｌｌａｂｓ株２．３．４．５．７．１０．１１及び
１２を含む穴で認められ、従ってＰａＦ４１ＶＥ８がタ
イプｂ鞭毛に結合することを示している。インビボ保護
データは、後述の実施例４に示す。

実施例３ 実施例３は、抗Ｐ、アエルギノーザ鞭毛タイプａと反応
性でインビボで保護的であるモノクローナル抗体を産生
ずるネズミハイブリドーマ細胞系統の調製のための方法
論を示す。

融合のためのリンパ球細胞源は、ｌｌ　ａ　ｂ　ｓ株６
及び８　（Ａ．Ｙ．Ｃ．Ｃ．＃　３３３５３及び３３３
５５）からの精製した鞭毛（１０〜２０μｇ蛋白質）を
６週間に亘って腹膜内的に四度注射した免疫化ＢＡＬＢ
／ｃマウスからのヒ臓であった。鞭毛は、Ｔ、Ｃ，モン
ティ（Ｍｏｎｔｉｅ）　　らの方法（１９８２５）Ｌｎ
ｆｅｃｔ。

ｌｍ５ｕｎ、、３５：２８１　２８８）に従い精製され
た。但し、鞭毛の最後の遠心分離は、４００００×ｇで
３時間の代りに１１０００００ｘで１時間とした。い（
つかの手順で用いられた二つ目の変更点は、ブレングー
中で３分間でなく３０秒間、バクテリアから鞭毛を剪断
したことである（アリソン（Ａｌｌｉｓｏｎ）ら、１９
８５、Ｉｎｆｅｃｔ、　ｌｍ５ｕｎ、。

４９ニア７Ｏ−７７４）。

各調製物の蛋白質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセ
イ　（バイオラド社、リッチモンド、カリフォルニア）
で決定され、夾雑するリボ多糖類（ＬＰＳ）の存在は、
ＫＤＯ含量を測定して評価された（カークハニス（にａ
ｒｋｈａｎ　ｉｓ）、Ｙ、Ｄ、ら、１９７８、Ａｎａｌ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　８５　：　５９５　６０１
）の鞭毛蛋白質の分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル中でのそれらの移行を種晶蛋白質マーカー（Ｂ　Ｒ
Ｌ）の移行と比べることにより決定された〈実施例２参
照）　、　Ｈａｂｓ　６鞭毛の分子量は５１７００ダル
トル、１（ａｂｓ　８の分子量は４７２００ダルトンで
あった。これらの数値は、Ｊ、Ｓ、アリソンら（１９８
５、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉａ＋ｍｕｎ、。

４９ニア７Ｏ−７７４）により得られた数値と一致する
。

鞭毛免疫化されたマウスからのヒ臓細胞とＮ５−１ミエ
ローマ細胞の融合は、実施例１及び２記載のように最後
の免疫化の三日後に行った。ハイブリドーマ細胞が約４
０％のコンフルエンシイ−に生育したとき（第７日）、
細胞上清を三つの異る抗原プレート、すなわちＰＵ結合
Ｐ、アエルギノーザフィソシャーイムノタイプ１　（調
製は実施例２参照）及びホルマリン固定Ｈａｂｓ　６及
びＨａｂｓ　９の対応する穴にレプリカ法で移した。

ホルマリン固定した抗原プレートのバクテリアをＰＬＬ
結合抗原プレートについて述べたように生育し、洗い、
そして希釈した。希釈したバクテリア（Ａ６６０で０．
２０．０．単位）をＬｉｎｂｒｏ９６穴微小プレートの
個々の穴（５０μｌ／穴）に入れ、次に室温で２０分間
１２００Ｘｇで遠心分離した。

振って上滑を穴から落し、ＰＢＳ中の０．２％（Ｖ／Ｖ
）ホルマリン７５μｌを各人に加え、室温で１５分間イ
ンキュベートした。振ってホルマリンを穴から落した後
にプレートを空気乾燥し、使用まで４℃で保管した。ホ
ルマリン処理された微生物を凝集させる抗鞭毛抗血清の
能力により判ったように、ホルマリンは鞭毛の抗原性を
変えなかった（ランイ　（Ｌａｎｙｉ）、Ｂ、、１９７
０．＾ｃｔａ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ｔｌ
ｕｎｇ、＋　　１７　：　３５−４８）。Ｐ、アエルギ
ノーザフィフシャーイムノタイプ１株は、この株が媒染
剤着色（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＣＩｉｎ、　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、＋　　１９８５、レネソテ編、Ａｎｇｅｒ。

Ｓｏｃ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋ワシントンＤ、Ｃ，
，ｐ　１０９９）により示されるように非鞭毛化されて
いる故に、対照として含められた。ＦＡ６ＩＩＧ５と呼
ばれた大中のハイブリッド細胞は、Ｈａｂｓ　６とｌ１
ａｂｓ　９　（両者とも鞭毛タイプａを持つ株）に結合
するがフィンシャーイムノタイプ１には結合しない抗体
を産生じた。

穴ＦＡ６ＩＩＧ５からの細胞を継代培養し、上述の例の
ようにクローン化した。この穴からのモノクローナル抗
体及びクローナル細胞系統は共に、下記でＦＡ６ＩＩＧ
５と呼ばれる。実施例２記載のようにＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　
／　ｃマウスで腹水を作った。

ＦＡ６ＩＩＧ５の特異性 抗体ｐＡ６ＩＩＧ５の特異性を、間接イムノフルオレセ
ンス及びイムノブロッティングにより測定した。

間接イムノフルオレセンスは、下記の変更点の他は本質
的に実施例２記載のように行った。

トリブチカーゼ大豆アガー上で３０℃で一夜生育させた
バクテリア培養物を、綿ガーゼでプレートから移し、０
．２０．Ｄ、単位のＡｓ２ＯまでＰＢＳ中に再懸濁した
。ホルマリン（ＰＢＳ中最中温終濃度０７％（Ｖ／Ｖ）
）を渦動下に懸濁物に加えた。

室温で１５分間のインキュベーション後に、バクテリア
をＰＢＳに１：１２で希釈し、この懸濁物２０μｌをカ
ールソン（Ｃａｒｌｓｏｎ）スライドの個々の穴に入れ
た。乾燥後、スライドを、実施例２のように観察のため
に調製した。抗体源は、Ｆ＾６１１０５細胞系統からの
培養上清であった。

ＦＡ６ＩＩＧ５抗体による螢光着色は、タイプａ鞭毛を
持つＰ、アエルギノーザについてのみ観察され、タイプ
ｂを持つものでは観察されなかった。観察された螢光パ
ターンは、正弦線パターンであり、ＦＡ６ＩＩＧ５が鞭
毛に結合したことを示す。螢光シグナルは、バクテリア
をホルマリンで処理することにより強められるが、処理
は抗体による鞭毛着色を可視化するためには必要でなか
った。

イムノブロッティングは、実施例２記載のように実施さ
れた。鞭毛タイプａ抗原の源は、精製した鞭毛調製物（
本実施例を見よ）であった。抗原は、ＳＤＳ含有１０％
ポリアクリルアミドゲル（ラエムリ　（Ｌ（１６）ｍｍ
ｌｉ）、Ｕ、に、、１９７０、ネイチア（ロンドン）、
２２７　：６８０−６８５）中で分離され、ＮＣＭに移
された。ＦＡ６ＩＩＧ５の調製物（培養上清又は１：１
０００希釈腹水）をＮ　ＣＭと反応させ、反応は実施例
２記戴のように適当な酵素接合反応剤及び酵素基質を用
いて検出された。

イムツブＤ−）トは、ＦＡ６ＩＩＧ５がＨａｂｓ　６の
５１７００ＭＷフラゲリン及び１（ａｂｓ　８の４７２
００ＭＷフラゲリンに特異的に結合したことを示した。

ＦＡ６ＩＩＧ５が鞭毛タイプａとのみ反応し、タイプｂ
と反応しないことの確認は、ＥＬＩＳＡにより得られ、
そこでは！ｌ　ａ　ｂ　ｓ株１−１２がＬｉｎｂｒｏ９
６穴微小力価プレートの穴にＰＬＬを用いて個々に結合
された。抗体はＨａｂｓ株１．６．８及び９にのみ結合
し、これらは１２の株のうちの鞭毛タイプａのみを所含
する株である（アンソルグ、Ｒｏら、１　９　８　４　
、Ｊ、　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋　　
２　０　　：　　８　４　−８８）。インビボ保護研究
は、次の実施例４に示される。

実施例４ 実施例４は、火傷したマウスモデルにおいてＰ。

アエルギノーザによる攻撃に対する抗体ＰａＰ４１ＶＥ
８及びＦＡ６　ｌｌＧ５により受動的免疫化されたマウ
スの保護を示す。

抗鞭毛モノクローナル抗体は、Ｍ、Ｓ、コリンズとＲ，
Ｅ、ロビイ　（１９８３、Ｊ、　Ｔｒａｕｍａ、２３　
：　５３０−５３４）の方法に従って、火傷したマウス
モデルにおいてテストされた。保護研究のために、総て
の抗体は、蛋白質Ａ−セファローズ　りロマトグラフィ
　（アイ　（Ｂｙ）　、Ｐ、Ｌ、ら、１９７８、イムノ
ケミストリー、１５　：　４２９−４３６）により精製
され、ＰＢＳ緩衝液中に透析された。動物実験で用いら
れた鞭毛タイプａ所有株は、Ｐ、アエルギノーザＰＡ２
２０　（ジェームス　ペニントン（Ｊａｍｅｓ　Ｐｅｎ
ｎｉｎｇｔｏｎ）博士、ボストン、マサチューセソツよ
り）であり、鞭毛タイプ５株は、参照Ｐ、アエルギノー
ザフィンシャーイムノタイプ２（Ａ．Ｙ．Ｃ．Ｃ．＃　
２７３１３　）であった。

精製したモノクローナル抗体の４０μｇを各マウスに静
脈内的に、火傷及び攻撃の１〜２時間前に与えた。火傷
の直後に動物は、攻撃バクテリアを含む０．５ｎ＋Ｉｔ
冷ＰＢＳを焼か下に（Ｓｕｂｅｓｃｈ（１６））受けた
。攻撃投与量は、各微生物体について約１０ＬＤ、。で
あった。動物実験の結果を表１及びＨに示す。

抗ａ抗体又は抗す抗体で処置され、次に対応する抗原で
攻撃されたマウスにおいて、極めて顕著な生存率が見ら
れた。逆に、非処置で攻撃されたマウスまたは対応しな
い抗鞭毛モノクローナル抗体又は非特異的抗ＬＰＳ抗体
で処置されたマウスの８０〜９０％は死んだ、鞭毛タイ
プｂ所有Ｐ、アエルギノーザフィソシャーイムノタイプ
２の致死的攻撃からマウスを保護するについての抗鞭毛
タイプａ抗体の能力欠除およびタイプａの所有Ｐ、アエ
ルギノーザＰＡ２２０の致死的攻撃からマウスを保護す
るについての抗鞭毛タイプｂ抗体の能力欠除は、インビ
トロで観察された抗体の特異性をインビボで確認するも
のである。火傷したが感染されなかったマウスの生存率
は、火傷自体が致死的でなかったことを示した。

実施例５ 実施例５は、ＰａＦ４１ＶＥ８及びＦＡ６ＩＩＧ５とＰ
、アエルギノーザ臨床分離体との広い交叉反応性を例示
し、これはＰ、アエルギノーザ感染の免疫治療における
これら抗体の臨床的実用性を示す。

臨床分離体は、病院及び診療所から得た。分離体は、血
、傷、呼吸路、尿及び耳を含む種々の分離部位からのも
のであった０合計１５７の分離体を調べた。

ＰａＦ４１ＶＥ８は３４の臨床分離体（２２％）に特異
的に結合し、鞭毛タイプａ抗体（ＦＡ６ＩＩＧ５）は１
０２の臨床分離体（６５％）に結合し、合計すると１５
７のうちの１３６（８７％）であった。

どちらの抗体でも認識されなかった２１株のうち１９は
、媒染染料着色によると非鞭毛であった。

従って、両抗体の組合せは、鞭毛所有臨床分離物１３８
のうち１３６（９８％）に結合し、先の報文（Ｒ，アン
ソルグ、１９７　Ｂ　、Ｚｂｌ、　Ｂａｋｔ、　Ｈｙｇ
、。

ＩＡｂｔ、Ｏｒｉｇ、Ａ、　　２４２：２２８−２３８
）を確認した。

実施例６ 実施例６は、Ｐ、アエルギノーザタイプｂ鞭毛に結合す
るヒトモノクローナル抗体の産生のための方法を示す。

高分子量多糖類調製物（ピア（Ｐｉｅｒ）ら、１９８４
、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、　　４５　：　３０
９）で免疫化された個体からの末梢血サンプルを、Ｂ細
胞源として用いた。単核細胞は、フィコルーバク（Ｆｉ
ｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）の標準遠心分離法（ボユム（Ｂ
ｏｙｕｍ）、１９６８．５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ
、　Ｌａｂ。

Ｉｎｕｅｓｔ、、　２１　：　７７）により血から分離
され、カルシウム／マグネシウム不含リン酸塩緩衝食塩
水（ＰＢＳ）中で二度洗われた。

この単核細胞は、修正したＥロゼソティング法を用いて
Ｔ細胞を除かれた。簡単に云えば、細胞を先ず、２０％
胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むＰＢＳ中に１×１０？細
胞／ｖａｌｌの濃度に４℃で再懸濁した。この懸濁物ｌ
　ｒａｇを次に、１７×１００ｒｖ＋ポリスチレン丸底
試験管に入れ、これにイスコベ（ｌ５ｃｏｖｅ）の修正
デュルベソコ媒体（イスコベ媒体）中の１０％（ｖ／ｖ
）？９液からの１×１０９個の２−アミノーイソチオウ
ロニウムプロマイド（ＡＥＴ）処理ヒツジ鼻血細胞を加
えた（マドセン（Ｍａｄｓｅｎ）とジョーンソン（Ｊｏ
ｈｎｓｏｎ）、１９７９、Ｊ、　Ｉｍ＋ｓｕｎ、　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ、　２７　：　６１　）　、懸濁物を４℃で
５〜１０分間極めておだやかに混合し、次にＥロゼツト
化細胞をフィコルーバクを用いて２５００Ｘｇで８分間
、４℃で遠心分離により除去した。内面に付着している
Ｅロゼツト陰性末梢血単核細胞（Ｅ−ＰＢＭＣ）を集め
、イスコベ媒体中で一度洗い、１５％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳ
、し−グルタミン（２ｍモル／ｌ）、ペニシリン（１０
０ＩＵ／ＩＩｉり、ストレプトマイシン（１００μｇ／
１１）、ヒボキサンチン（１×１０−’Ｍ）　、アミノ
プテリン（４Ｘ　１０−７Ｍ）及びチミジン（１，６ｘ
　１０−’Ｍ）を含む同媒体に再Ｑ　ｉｆａした。この
媒体を以下では、ＨＡＴ媒体と呼ぶ。

Ｅ−ＰＢＭＣの細胞推進転換は、これら細胞を転換性細
胞系統と共培養することにより行われた。

転換性細胞系統は、０Ｍ１５００リンフオブラスレイド
細胞系統のエチルメタン−スルホネート（ＥＭＳ）突然
変異誘発及び続＜３０ｐｇ１ｍ１６−チオグアニンの存
在下での選別により細胞をヒポキサンチン−グアニン　
ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠陥
すなわちＩＩＡＴ感受性にすることにより誘導されたニ
ブスティン−パール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）核抗
原（ＥＢＮＡ）陽性ヒト　リンフォブラストイド細胞系
統であった。

この細胞系統は、ｌＡ２１１１胞系統と呼ばれ、１９８
２年３月２９日にアメリカンタイプカルチア　コレクシ
ョン（Ａ．Ｙ．Ｃ．Ｃ．）に八．Ｙ．Ｃ．Ｃ．隘ＣＲＬ
８１１９として寄託された。対数成長期のＩＡ２細胞を
ＨＡＴ媒体に懸濁し、次にＰＢＭＣ当り１５個のＩＡ２
細胞の比でＥ−ＰＢＭＣと一緒にした。細胞混合物を、
２００μｌ／穴の容積の３０枚の丸底９６穴微小力価プ
レー）　（Ｃｏｓｔａｒ３７９９）中に３２０００細胞
／゛大の濃度で入れ、６％ＣＯ□を含む加湿雰囲気中で
３７℃でインキュベートした。培養物は、プレートに入
れてから第５及び８日に新鮮なＨＡＴ媒体で上清の半分
を置き換えることにより栄養補給した。プレートに入れ
てから１６日後に、増殖する細胞を含んだ穴の１００％
及び穴の殆どにおいて、細胞は抗Ｐ、アエルギノーザ抗
体のための上清の除去及びテストのために十分の密度を
持っていた。

上清を、下記の変更点の他は実施例２記載のようにＥＬ
ＩＳＡ法を用いて抗Ｐ、アエルギノーザ抗体の存在につ
いてスクリーンした。七つのフィッシャーイムノタイプ
参照株（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ。

隘２７３１２−２７３１８）のプール（Ａ６６０＝０．
２０．Ｄ、単位）を、ポリーＬ−リジンで予め処理した
平底９６穴微小力価プレート（Ｉｍ＋ｍｕｌｏｎｌ［、
グイナテソク）に結合し、インキュベーター、実施例２
のように洗った。非特異的結合部位をブロックし、プレ
ートを洗った後に、０．１％（ｖ　／　ｖ　）Ｔｗｅｅ
ｎ−２０と０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ５０
μｍ／穴を加えた。培養上清（５０μｌ）を次に、アッ
セイプレート、及びＰＬＬで処理し、ブロックし、しか
しバクテリアを含まない対照プレートの対応する穴にレ
プリカ法で移した。インキュベーション及び洗いの後に
、酵素接合第二段階抗体（５０ｍｊｌ！／穴）、つまり
ホースラディツシュ　ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ヒト
ＩｇＧ及びヤギ抗ヒトＩｇＭ　　（０，１％（ｖ／ｖ）
　Ｔｗｅｅｎ−２０と０．２％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む
ＰＢＳ中におよその希釈）を穴に加え、実施例２記載の
ようにアッセイを行った。

フィンシャーイムノタイプのプールに結合し、しかし対
照プレートに結合しなかった抗体を含む上清は、二度目
に、七つのフィンシャーイムノタイプバクテリアの各々
を用いて別々にアッセイした。一つの穴２０Ｈ１１から
の上清に存在した抗体は、Ｐ、アエルギノーザフィッシ
ャーイムノタイプ２．６及び７にのみ結合した。この細
胞を、生育する総ての穴が抗体を分泌するまで低い細胞
密度を下げて繰返し継代培養した。この細胞系統及びモ
ノクローナル抗体（１ｇＭアイソタイプ）は両者とも、
下記で２０Ｈ１１と呼ぶ。

第二〇転換は、Ｂ細胞源として慢性Ｐ、アエルギノーザ
惑感染持つと判っていたのう胞線維腫（Ｃｙｏｔｉｃ　
ｆｉｂｒｏＳｉｓ）患者の末梢血を用いて行った。

Ｅ−ＰＢＭＣは、上記のように調製し、Ｅ−ＰＢＭＣ当
り７２のＩＡ２細胞の割合で転換性細胞系統ＩＡ２と共
培養した。細胞混合物を穴当り７．４Ｘ１０’細胞の濃
度で１５枚の丸底９６穴微小力価プレートに入れ、上記
のように培養した。

上清は、転換をプレートしてから１６日後に抗Ｐ、アエ
ルギノーザ抗体の存在についてＥＬ　Ｉ　ＳＡによりア
ッセイした。アッセイは、先の転換について述べたよう
に行ったが、但し当初のスクリーンに用いられたＰ、ア
エルギノーザ株のプールはフィッシャーイムノタイプ参
照株Ｆ２５）Ｆ４、Ｆ６及びＦ　７　　（Ａ．Ｙ．Ｃ．
Ｃ．阻２７３１３．２７３１５．２．７３１６及び２７
３１　？）及びジェネテインクシステムズ　コーポレー
ション　オーガニズムバンク（ＧＳＣＯＢ）からの三つ
の臨床分離物（異るＬＰＳイムノタイプ及び鞭毛タイプ
を持つ）より成った。臨床分離物ＰＳＡ　　１２７７（
ＧＳＣＯＢ）はタイプａ鞭毛とフィッシャーイムノタイ
プＩ　　ＬＰＳを有し、第二分離物ＰＳＡＧ９８　（Ｇ
ＳＣＯＢ）はタイプａ鞭毛とフィンシャーイムノタイプ
３　　ＬＰＳを有し、第三のものＰＳＡ　　Ｆ６２５　
（ＧＳＣＯＢ）はタイプｂ鞭毛とフィッシャーイムノタ
イプ５ＬＰＳを持つ。

参照株と臨床分離物のこの混合物は、Ｐ、アエルギノー
ザ鞭毛ブールと呼ばれる。Ｐ、アエルギノーザ鞭毛プー
ルを含むプレートに結合し、しかしＰＬＬコートした対
照プレートに結合しなかった抗体を含む上清は、二度目
にはプールの個々の株についてＥＬ　Ｉ　ＳＡによりア
ッセイされた。一つの穴３Ｃ１は、参照株Ｆ２５）Ｆ６
及びＦ７、及び臨床分離物Ｆ６２５に結合した。

３Ｃ１細胞系統のクローニングは、まず低密度継代培養
の２ラウンド（初めに９６穴プレートの穴当り２０細胞
、次に穴当り２細胞）で細胞を継代培養して行われた。

特異的抗体産生細胞の正式のクローニングは、アミノプ
テリン成分を欠くＨＡＴ媒体（ＨＴ媒体）のＬＯｐＨｌ
穴容積で７２穴テラサキプレート（Ｎｕｎｃ＃　１　３
６５３８）を用いて約１細胞／穴の密度で細胞をプレー
トして行った。プレートをインキュベーターの中に２〜
３時間置いて細胞を穴の底に沈降させ、次に単一の細胞
を含んだ穴について二人で顕微鏡により数えた。穴は毎
日ＨＴ媒体を供給され、自然生育が十分になった時に細
胞を９６大丸底プレートに移した。自然生育のある総て
の穴は、タイプｂ鞭毛所有Ｐ、アエルギノーザ株でＥＬ
　Ｉ　ＳＡによりアッセイし、総てが適当な抗体を産生
ずることが見られた。この細胞系統及びモノクローナル
抗体（１ｇＭアイソタイプ）は両者とも、下記で３Ｃ１
と呼ばれる。

２０Ｈ１１及び３Ｃ１により同定される抗原は、間接イ
ムノフルオレセンス及びイムノブロッティングによると
鞭毛であった。方法は、基本的に実施例２及び３記載の
ように行われた。間接イムノフルオレセンスアッセイの
ためにタイプｂ鞭毛を持つＰ、アエルギノーザすなわち
参照フィンシャーイムノタイプＦ２５）Ｆ６及びＦ　７
　　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ。

隘２７３１３．２７３１７及び２７３１８）、及びタイ
プａ鞭毛を持つ株すなわち参照フィンシャーイムノタイ
プ４　（Ａ．Ｙ．Ｃ．Ｃ．阻２７３１５）を実施例３の
ように調製した。参照株の鞭毛タイプは、ネズミモノク
ローナル抗体ＰａＦ４１ＶＥ８及ｄＦＡ６ＩＩＧ５によ
りタイプ分けして決定された。実施例２記載のように観
察のためにスライドを調製した。両抗体の源は培養上清
であり、Ｆ　ＩＴＣ接合を反応剤は、０．５％（Ｗ／Ｖ
）ウシガンマグロブリンくマイルス　サイエンティフィ
ック　カタログ隘８２−（１４）−２５）ナパービル、
イリノイ）及び保存剤として０．１％（ｗ／ｖ）アジド
ナトリウムを含むＰＢＳ中に１：１００希釈されたＦＩ
ＴＣ接合ヤギ抗ヒ）Ｉｇ（多価）　（タボ、バーリンガ
ム、カリフォルニア）であった。

２０Ｈ１１及び３Ｃ１抗体による螢光着色は、タイプｂ
Ｈ毛を持つＰ、アエルギノーザ株でのみ観察され、鞭毛
タイプａ所有株、参照フィンシャーイムノタイプ４では
観察されなかった。観察された螢光パターンは、バクテ
リアの一端から発する正弦線パターンであり、抗体がバ
クテリアの鞭毛に結合したことを示す。

町田♂の汀ｉ　’；Ｆ：：　（白書に変更なし）　　　
＜５３ｒ〜／シフ？）イムノブロッティングは、実施例
２記載のように行われた。Ｐ、アエルギノーザ参照株フ
ィフシャー　イムノタイプ２　（Ａ．Ｙ．Ｃ．Ｃ．Ｐｋ
Ｌ２７３１３　）からの精製したタイプｂ鞭毛、及び参
照株Ｈａｂｓ　６及びＨａｂｓ８　　（八．Ｙ．Ｃ．Ｃ
．１１ｈ３３３５３及び３３３５５　）からの精製した
鞭毛タイプａを実施例３記載のように調製した。抗原は
、１０％ポリアクリルアミドゲル中で分離し、ＮＣＭに
移した。２０Ｈ１１又は３Ｃ１抗体を含む培養上清、非
特異的ヒト抗体を含む培養上清及び培養媒体をＮＣＭと
共にインキュベートし、反応を、０．０５％（ｖ　／　
ｖ　）　Ｔｈｅｅｎ−２０含有ＰＢＳに希釈したアルカ
リ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇ　（多価）（タ
ボ、バーリンガム、カリフォルニア）で検出した。酵素
基質は、実施例２記載のように調製した。イムノプロッ
トは、両抗体がフィンシャー　イムノタイプ２の５３０
００ＭＷフラゲリン蛋白質に結合し、Ｈａｂｓ６の５１
７００ＭＷフラゲリン蛋白質及びＨａｂｓ　８の４７２
００ＭＷフラゲリン蛋白質に結合しなかったことを示し
た。非特異的ヒト抗体及び培養媒体との反応は観察され
なかった。

抗体２０Ｈ１１及び３Ｃ１がタイプｂ鞭毛のみに結合し
、タイプａに結合しなかったことの逼加的確認は、ＥＬ
ＩＳＡにより得られ、そこでは１１ａｂｓ株１〜１２が
各々ＰＬＬでＩｍｍｕｌｏｎ　９６穴微小力価プレート
の穴に結合された。抗体は、タイプｂ含有株である１ｌ
ａｂｓ株２．３．４．５．７．１０．１１及び１２にの
み結合した（アンソルグら、１９８４、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　２０　：　８４）。

実施例７ 実施例７は、Ｐ、アエルギノーザタイプａ鞭毛に結合す
るヒトモノクローナル抗体の産生のための方法を示す。

高分子量子ｖＭ類調製物（ピアら、１９８１、Ｉｎｆｅ
ｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、＋　　３４　：　４６１　）で免
疫化した個体からの末梢血サンプルを、Ｂｍ胞の源とし
て用いた。単核細胞を血から分離し、実施例６のように
Ｔ細胞を除いた。次に細胞を、液体窒素蒸気タンク中で
、１０％ジメチルスルホキシドを含むＦＣ３中で凍結し
た。後日に細胞を３７℃で急速に解凍し、イスコベ媒体
中で一度洗い、ＨＡＴ媒体に再懸濁した。細胞推進転換
は、Ｅ−ＰＢＭＣ当り３０個のＩＡ２細胞の割合でＥ−
ＰＢＭＣをＩＡ２細胞と共に共培養して達成した。細胞
混合物を、穴当り６２０００細胞の濃度で３０枚の９６
穴組織培養プレート中で平板培養した。培養物は、ブレ
ーティング後第７日に、体積の半分をＨＡＴ媒体で置き
換えることにより栄養補給された。細胞増殖は、ブレー
ティング後第１４日後に穴の１００％で観察され、上清
を穴から除去して、この時点でアッセイした。

上清を、有鞭毛Ｐ、アエルギノーザブール及び実施例６
記載のように対照としてＰＬＬ処置プレートを用いて、
抗Ｐ、アエルギノーザ抗体の存在についてＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａによりアッセイした。有鞭毛プールに結合し、しかし
ＰＬＬ対照プレートに結合しなかった抗体を含む上清を
、有鞭毛プールの個々のバクテリア株について再びアッ
セイした。

一つの穴２１Ｂ８は、ＰＳＡ　　１２７７、ＰＳＡＧ９
８及び参照フィンシャー　イムノタイプ４（これらはタ
イプａ鞭毛を持つ有鞭毛プールの三つの株である）に結
合した抗体を含んだ。

２１８８細胞系統のクローニングは、正式のクローニン
グ段階における下記の変更点を除き３Ｃ１細胞系統につ
いての実施例６と同様に行われた。唯一つの細胞の存在
についてのテラサキプレートの穴を数えた後に、各細胞
をテラサキプレートから、アミノプテリン成分を欠＜Ｈ
ＡＴ媒体（ＨＴ媒体）１００μβの９６穴丸底培養プレ
ートの個々の穴に移した。非転換のＨＡ　Ｔ感受性リン
フォブラストイド細胞が、飼育（ｆｅｅｄｅｒ）細胞と
して５００細胞／穴の密度で総ての穴に含まれた。

ブレーティングの５日後に、ＨＡ−Ｔ媒体１００μｌを
穴に加えて、飼育細胞を選択的に殺した。

ＨＡＴ媒体で上清の半分を置換えることにより、ブレー
ティング後筒７及び９日後に穴に再び栄養補給した。次
に細胞は、細胞がＥＬＩＳＡにより抗体の存在を検出す
るのに十分の密度となるまでＨＴ媒体で栄養補給された
。自然生育のある総ての穴は、鞭毛タイプａ所有Ｐ、ア
エルギノーザ株に結合した抗体を産生じた。この細胞系
統及びモノクローナル抗体（ＩｇＧ＋アイソタイプ）の
両者とも、下記で２１Ｂ８と呼ぶ。

２１Ｂ８により同定された抗原は、間接イムノフルオレ
センス及びイムノブロッティング（方法については実施
例６を見よ）により示されたように鞭毛であった。２１
Ｂ８抗体による螢光着色は、タイプａ鞭毛を持つＰ、ア
エルギノーザ参照株フィッシャー　イムノタイプ４　　
（Ａ．Ｙ．Ｃ．Ｃ．阻２７３１５）にのみ観察され、タ
イプａ鞭毛を持つＰ、アエルギノーザ参照株フィッシャ
ーイムノタイプ２（Ａ．Ｙ．Ｃ．Ｃ．患２７３１３）で
は観察されなかった。

観察された螢光パターンは、バクテリアの一端から発す
る正弦線パターンであり、バクテリアの鞭毛へ抗体が結
合したことを示した。

イムノブロッティングは、実施例２記載のように行われ
た。Ｐ、アエルギノーザ参照株１１ａｂｓ６（Ａ．Ｙ．
Ｃ．Ｃ．患３３３５３）からの精製したタイプａ鞭毛、
及びＰ、アエルギノーザ参照株フィッシャー　イムノタ
イプ２　（Ａ．Ｙ．Ｃ．Ｃ．隘２７３１３）からの精製
した鞭毛タイプｂは、実施例３記載のように調製した。

抗原は、１０％ポリアクリルアミドゲル（実施例３参照
）中で分離され、ＮＣＭに移された。２１Ｂ８又は非特
異的ヒト抗体のどちらかを含む培養上清及び培養媒体を
ＮＣＭと反応させ、反応を、実施例２及び６記載のよう
にアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇ　　（
多価）と酵素基質により検出した。イムノプロットは、
２１Ｂ８抗体がＨａｂｓ　６の５１７００ＭＷフラゲリ
ン蛋白質にのみ結合し、フィッシャー　イムノタイプ２
の５３０００ＭＷフラゲリン蛋白質に結合しないことを
示した。非特異的ヒト抗体及び培養基のどちらでも、反
応は観察されなかった。

実施例８ 実施例８は、ヒト抗鞭毛抗体２０Ｈ１１，３Ｃ１及び２
１Ｂ８により受動的免疫化されたマウスの、Ｐ、アエル
ギノーザによる攻撃に対する保護を火傷マウスモデルに
おいて示す。

ヒト抗鞭毛モノクローナル抗体は、火傷したマウスモデ
ルにおいてテストされた〈実施例４参照）。

２１Ｂ８及び２０Ｂ１１抗体は、各々の細胞系統から発
生した培養上清を硫酸アンモニウム（５０％最終濃度）
で沈澱して調製された（グツド（Ｇｏｏｄ）ら、セレク
テッド　メソッド　イン　セルラー　イムノロジー、ミ
シエル（Ｍｔｓｈｅｌｌ）　ＩＢ、Ｂ、及びシイギ（Ｓ
ｈｉｉｇｉ）＋　Ｓ、Ｍ、＋編、岨Ｊ、フリーマン社（
Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、）、サンフランシスコ、カ
リフォルニア、１９８０．２７９−２８６）。沈澱物を
ＰＢＳに可溶化し、ＰＢＳに対して４℃で透析し、次に
動物への投与前に滅菌濾過した。抗体３Ｃ１、及びこの
研究で陰性対照として用いられた非特異的抗ＬＰＳ抗体
の源は、培養上清であった。各研究における陽性対照と
して、適当な精製されたネズミモノクローナル抗体Ｐａ
Ｆ４１ＶＥ８又はＦＡ６　１１Ｇ５が含められた。

動物テストで用いられた鞭毛タイプａ所有株は、フィッ
シャー　イムノタイプＩ　　ＬＰＳを発現するしｎ未分
離物ＰＳＡ　　Ａ５２２　（ＧＳＣＯＢ）　であり、鞭
毛タイ１５株はフィッシャー　イムノタイプ６　　ＬＰ
Ｓを発現する臨床分離物ＰＳＡＡ４４７　（ＧＳＣＯＢ
）であった。ヒト抗体（０，４５＋＋１１）は、バクテ
リア（０，０５ｍｆ中５ＬＤ、。。より多い）と予め混
合され、火傷を負わせた直後に焼か下に接種された。動
物試験の結果を表■、■及び■に示す。

抗鞭毛タイプａ抗体又は二つの抗鞭毛タイプｂ抗体の一
つで処理され、次に対応する抗原で攻撃されたマウスに
おいて、極めて著しい生存率が見られた。逆に、処置さ
れずしかし攻撃されたマウス、又は対応しない抗鞭毛モ
ノクローナル抗体又は非特異的抗ＬＰＳ抗体で処置され
たマウスの８８〜１００％が死んだ。ネズミモノクロー
ナル抗体で観察されたように（実施例４参照）、ヒト抗
鞭毛抗体は対応する鞭毛タイプを持つ微生物のみで致死
的攻撃に対して特異的に保護した。すなわちヒト抗鞭毛
タイプａ抗体は、鞭毛タイプａ所有微生物での致死的攻
撃に対して保護を与え、しかしタイプｂに対しては保護
を与えず、抗鞭毛タイプｂ抗体は、鞭毛タイプｂ所有株
で攻撃されたマウスを保護し、しかしタイプａ所有微生
物に対して保護しなかった。

実施例９ 実施例９は、ヒト抗鞭毛抗体２０Ｈ１１，３Ｃ１及び２
１Ｂ８のＰ、アエルギノーザ臨床分離物との交叉反応性
を示す。

病院及び診療所から得られ、主として火傷の傷及び血か
ら分離されたＰ、アエルギノーザ臨床分離物（１１５）
は、ネズミモノクローナル抗体ＦＡ６　１１Ｇ５又はＰ
ａＦ４　１ＶＥ８（実施例２．３及び５）でのタイプ分
けにより鞭毛タイプａ又はタイプｂとして同定された。

臨床分離物の５５は、ネズミモノクローナル抗体ＦＡ６
ＩＩＧ５との応によりタイプｂ所有と同定された。

抗鞭毛タイプａヒトモノクローナル抗体２１Ｂ８の交叉
反応性は広く、該抗体は５６の鞭毛タイプａ所有臨床分
離物のうち５４（９６％）を識別した。タイプｂ鞭毛を
持つ分離物との２０Ｈ１１の交叉反応性はまた広く、２
０Ｈ１１は５９の分離物置て（１００％）を認識した。

対照的に、他の抗鞭毛タイプｂモノクローナル抗体３Ｃ
１は、５９の分離物の僅か４３（７３％）に結合した。

これらの結果は、２０Ｈ１１が火攻応性エピトープ（す
なわちＰ、アエルギノーザ株の少くとも約９５％に存在
するエピトープ）に結合し、一方、３ＣＩは総てのタイ
プｂフラゲリン分子上に存在しないエピトープに結合す
る。鞭毛タイプｂ抗原はポリクローナル抗血清で分析さ
れたときに血清学的に均一であるけれども（ランビ（Ｌ
ａｎｖｉ）、Ｂ、。

前出、及びアンソルグ、Ｒ０前出）、２０Ｈ１１及び３
Ｃ１の交叉反応性パターンは驚くべきことに、タイプｂ
鞭毛がモノクローナル抗体により同定されうる少くとも
二つの別々のエピトープを持つ事を示す。

Ｐ、アエルギノーザ臨床分離物の抗体２１８８及び２０
Ｈ１１の広い交叉反応性は、Ｐ、アエルギノーザ感染の
免疫治療における、これら抗体の特別の臨床的利用性を
示す。

実施例１０ 実施例１０は、Ｐ、アエルギノーザタイプｂ鞭毛に結合
する別の例としてのヒトモノクローナル抗体の産生のた
めの方法、ならびに火傷したマウスモデルにおけるＰ、
アエルギノーザでの攻撃に対するこの抗体の保護活性を
示す。

実施例７記載と実質的に同様にして転換した細胞系統を
作り、クローンした。但し、転換された細胞混合物を、
穴当りめ２２５０Ｅ−ＰＢＭＣの濃度で２０枚の９６穴
組織培養プレート上にプレートした。上滑をまず実施例
６記載のように有鞭毛プールでＥＬＩＳＡによりアッセ
イしたが、但し、フィッシャー　イムノタイプ２及び４
参照株はプールに存在しなかった。陽性の穴を次に、フ
ィッシャー　イムノタイプ２及び４を含む有鞭毛ブール
中の株の各々でアッセイした。最終的に分離された細胞
系統及びモノクローナル抗体（ＩｇＧアイソタイプ）は
共に、下記で１２Ｄ７と呼ぶ。

１２Ｄ７ヒトモノクロ一ナル抗体は、抗鞭毛タイプａア
イソタイプとの広い交叉反応性を示し、テストした５６
の鞭毛タイプａ所有臨床物の５４（９６％）を識別した
。１２Ｄ７モノクロ一ナル抗体の保護活性は表■に示さ
れる。保護の研究は木質的に実施例４記載のように行っ
たが、但し、攻撃投与量はＩＬＤ、、。であり、攻撃株
はｌ６２４す７へわちフィッシャー　イムノタイプ２Ｌ
ＰＳ及びタイプａ鞭毛を発現する臨床骨］であった。

実施例１１ 実施例１１は、鞭毛ｂタイプＰ、アエルギノーザと反応
性のヒトモノクローナル抗体の産生、及びこの抗体で受
動的免疫化されたマウスのＰ、アエルギノーザによる攻
撃に対する保護（火傷したマウスモデルで）を示す。

転換した細胞系統は、実施例１０記載に実質的に従って
調製され、クローンされた。但し、ＩＡ２対Ｂ細胞転換
比は約６０：１であり、転換された細胞混合物は穴当り
約１９３０Ｅ−ＰＢＭＣの濃度で１５枚のプレートにプ
レートした。また細胞は、Ｇ９８　（フィッシャー３イ
ムノタイプ、鞭毛タイプａ）及び１７３９　（フィッシ
ャー５イムノタイプの臨床分離物、鞭毛タイプｂ）を含
むＰ。

アエルギノーザ株のプールでアッセイされ、Ｐ。

アエルギノーザ株の別のプール：１２７７、Ｇ９８、ｌ
７３９及びフィッシャー　イムノタイプＦ２５）Ｆ４、
Ｆ６及びＦ７で確認された。最終的に分離された細胞系
統及び分泌さたモノクローナル抗体（ＩｇＧ＋アイソタ
イプ）は共に、下記で２Ｂ８と呼ばれる。

２８８で行われたイムノフルオレセンス　ア・ノセイは
、鞭毛タイプｂ、フィッシャ−２イムノタイプ株で陽性
であり、しかし鞭毛タイプａ、フィッシャー　イムノタ
イプ４参照株では陰性であった。臨床分離物のテストに
おいて、有鞭毛タイプｂ分離物の５９１５９　（１００
％）が陽性であった。

２Ｂ８の保護活性は、表■に示す。保護の研究は実施例
１０記載のように行ったが、但し臨床分離物Ｆ１６４　
（フィッシャー　イムノタイプ４、鞭毛タイプｂ）が攻
撃のために用いられた。

実施例１２ 実施例１２は、鞭毛ｂタイプＰ、アエルギノーザと反応
性の別のヒトモノクローナル抗体の産生、及び火傷した
マウスモデルにおけるこの抗体で受動的免疫化されたマ
ウスのＰ、アエルギノーザでの攻撃に対する保護を示す
。

転換された細胞系統は、下記の変更点を除いて実質的に
実施例７に記載のように調製され、クローンされた。−
匹の別の個体を免疫化しくピアら、１９８４．４５　：
　３０９）　、Ｂ細胞源として用い、Ｅ−ＰＢＭＣのブ
レーティングレベルは穴当り約２０００細胞であった。

スクリーニングは、プールされたフィッシャー１〜フイ
ムツタイプにおいて行われた。最終的に分離された細胞
系統及び分泌されたモノクローナル抗体（ＩｇＧ＋　ア
イソタイプ）の両者は、下記で１４０１と呼ぶ。

臨床テストにおいて、有鞭毛タイプｂ単離物の５９１５
９　（１００％）が１４０１で陽性であった。保護研究
は、上記の実施例１１のように行い、結果を表■に示す
。

以上から、本発明の細胞系統が、Ｐ、アエルギノーザ鞭
毛と反応性でありかつ種々のＰ、アエルギノーザ株に対
して交叉保護的なモノクローナル抗体及びそのフラグメ
ントを産生ずる手段を与えることが判る。驚くべきこと
に、鞭毛の各タイプ上の異るエピトープと反応性である
多数のモノクローナル抗体が分離された。本発明の抗体
は、殆んどのＰ、アエルギノーザ株による感染に対して
の使用のために、予防的及び治療的組成物をより経済的
にかつ容易に作ることを可能とする。加えて、本細胞系
統は、イムノアッセイ及び他の周知の方法で用いられる
抗体を提供する。

本発明は、理解の容易性のために例示及び実施例として
、いく分詳しく説明したが、特許請求の範囲内で変更及
び修正ができることは自明である。

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュードモナスアエルギノーザバクテリア鞭毛と
   特異的に反応することのできるモノクローナル抗体又は
   その結合性フラグメントを含む組成物。
2. （２）モノクローナル抗体又はその結合性フラグメント
   がバクテリアの運動を抑制するものである特許請求の範
   囲第（１）項記載の組成物。
3. （３）モノクローナル抗体又はその結合性フラグメント
   がインビボで保護的である特許請求の範囲第（１）項記
   載の組成物。
4. （４）シュードモナスアエルギノーザの鞭毛蛋白質エピ
   トープと特異的に反応することのできるモノクローナル
   抗体を含む組成物。
5. （５）モノクローナル抗体が、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番
   号ＨＢ９１２９、ＨＢ９１３０、ＣＲＬ９３００、ＣＲ
   Ｌ９３０１、ＣＲＬ９４２２、ＣＲＬ ９４２３及びＣＲＬ９４２４を与えられた細胞系統によ
   り産生されるモノクローナル抗体のエピトープへの結合
   を妨害できるものである特許請求の範囲第（４）項記載
   の組成物。
6. （６）タイプａ又はタイプｂシュードモナスアエルギノ
   ーザ鞭毛と特異的に反応できるモノクローナル抗体を産
   生する細胞系統。
7. （７）モノクローナル抗体がシュードモナスアエルギノ
   ーザに対してインビボで保護的である特許請求の範囲第
   （６）項記載の細胞系統。
8. （８）ハイブリッド細胞系統である特許請求の範囲第（
   ７）項記載の細胞系統。
9. （９）ヒトモノクローナル抗体を産生する特許請求の範
   囲第（６）項記載の細胞系統。
10. （１０）Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ９１２９、ＨＢ
    ９１３０、ＣＲＬ９３００、ＣＲＬ９３０１、ＣＲＬ９
    ４２２、ＣＲＬ９４２３及びＣＲＬ９４２４のうちの一
    つである特許請求の範囲第（６）項記載の細胞系統。
11. （１１）シュードモナスアエルギノーザの鞭毛蛋白質に
    対して特異的でありかつシュードモナスアエルギノーザ
    感染を処置する又は防ぐことのできるモノクローナル抗
    体を作る方法において、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ
    ９１２９、ＨＢ９１３０、ＣＲＬ９３００、ＣＲＬ９３
    ０１、ＣＲＬ ９４２２、ＣＲＬ９４２３及びＣＲＬ９４２４の細胞系
    統の少くとも一つを培養し、上記抗体を回収することを
    含む方法。
12. （１２）菌血症及び／又は敗血症にかかりやすいヒトを
    処置する方法において、特許請求の範囲第（１１）項に
    従い作られたモノクローナル抗体の予防的又は治療的量
    をヒトに投与する方法。
13. （１３）Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＨＢ９１２９、ＨＢ
    ９１３０、ＣＲＬ９３００、ＣＲＬ９３０１、ＣＲＬ ９４２２、ＣＲＬ９４２３及びＣＲＬ９４２４の細胞系
    統の少くとも一つを培養し、そして回収することにより
    作られた、シュードモナスアエルギノーザの鞭毛蛋白質
    に対して特異的でありかつシュードモナスアエルギノー
    ザ感染を防ぐことのできるモノクローナル抗体に結合で
    きるエピトープに反応性のモノクローナル抗体又はその
    フラグメントを含む組成物。
14. （１４）少くとも二つのモノクローナル抗体を含み、各
    々はシュードモナスアエルギノーザ鞭毛蛋白質の異る一
    タイプと特異的に反応し、かつシュードモナスアエルギ
    ノーザ感染を処置又は防止できるものであるところの医
    薬組成物。
15. （１５）モノクローナル抗体の少くとも一つがヒトモノ
    クローナル抗体である特許請求の範囲第（１４）項記載
    の組成物。
16. （１６）シュードモナスアエルギノーザのリポ多糖類分
    子上の少くとも一つの血清タイプ決定基と反応できる少
    くとも一のヒトモノクローナル抗体及び／又は外毒素Ａ
    に反応性のモノクローナル抗体を更に含む特許請求の範
    囲第（１４）項記載の組成物。
17. （１７）菌血症及び／又は敗血症にかかりやすいヒトを
    処置する方法において特許請求の範囲第（１）、（６）
    、（８）、（１２）、（１４）又は（１５）項のいずれ
    かに従う組成物の予防的又は治療的量をヒトに投与する
    方法。
18. （１８）タイプａ又はタイプｂシュードモナスアエルギ
    ノーザ鞭毛と特異的に反応できるモノクローナル抗体を
    産生する細胞系統。
19. （１９）モノクローナル抗体がシュードモナスアエルギ
    ノーザに対してインビボで保護的であるところの特許請
    求の範囲第（１８）項記載の細胞系統。
20. （２０）ハイブリッド細胞系統である特許請求の範囲第
    （１９）項記載の細胞系統。
21. （２１）ヒトモノクローナル抗体を産生する特許請求の
    範囲第（１８）項記載の細胞系統。
22. （２２）Ａ．Ｙ．Ｃ．Ｃ．預託番号ＨＢ９１２９、ＨＢ
    ９１３０、ＣＲＬ９３００及びＣＲＬ９３０１の一つで
    ある特許請求の範囲第（１８）項記載の細胞系統。
23. （２３）シュードモナスアエルギノーザの鞭毛蛋白質に
    対して特異的でありかつシュードモナスアエルギノーザ
    感染を処置する又は防ぐことのできるモノクローナル抗
    体を作る方法において特許請求の範囲第（２２）項の細
    胞系統の少くとも一つを培養し、上記抗体を回収するこ
    とを含む方法。
24. （２４）菌血症及び／又は敗血症にかかりやすいヒトを
    処置する方法において、特許請求の範囲第（２３）項に
    従い作られたモノクローナル抗体の予防的又は治療的量
    をヒトに投与する方法。
25. （２５）特許請求の範囲第（２３）項に従い作られたモ
    ノクローナル抗体に結合できるエピトープに反応性のモ
    ノクローナル抗体又はそのフラグメント。
26. （２６）シュードモナスアエルギノーザ鞭毛上に存在す
    るエピトープと特異的に反応するヒトモノクローナル抗
    体を含む組成物。
27. （２７）エピトープがタイプａ鞭毛かタイプｂ鞭毛の一
    方に存在し、両方には存在しない特許請求の範囲第（２
    ６）項記載の組成物。
28. （２８）エピトープがタイプｂ鞭毛の少くとも約７０％
    により表わされる特許請求の範囲第（２６）項記載の組
    成物。
29. （２９）エピトープがタイプｂ鞭毛のみにより表わされ
    る特許請求の範囲第（２６）項記載の組成物。
30. （３０）抗体が汎反応性である特許請求の範囲第（２９
    ）項記載の組成物。
31. （３１）バクテリア感染を受けやすいヒトを処置する方
    法において、シュードモナスアエルギノーザの鞭毛に結
    合できるモノクローナル抗体の予防的又は治療的量を、
    下記のものの一以上と組合せてヒトに投与する方法： シュードモナスアエルギノーザ外毒素Ａと 反応できるモノクローナル抗体の予防的又は治療的量、
    シュードモナス　アエルギノーザのリポ多糖類分子上の
    少くとも一の血清タイプ決定基と反応できるモノクロー
    ナル抗体、ヒト血漿からのガンマグロブリン画分、シュ
    ードモナスアエルギノーザに反応性の免疫グロブリンの
    高められたレベルを示すヒト血漿からのガンマグロブリ
    ン画分及び／又はその製品、及び抗生物質。
32. （３２）ＦＡ６ＩＩＧ５、Ｐａ３ＩＶＣ２、ＰａＦ４Ｉ
    ＶＥ８、２０Ｈ１１又は２１Ｂ８と名付けられたモノク
    ローナル抗体のいずれか一つと同じ結合特異性を持つモ
    ノクローナル抗体組成物。
33. （３３）検出しうるシグナルを与えうるラベルに接合さ
    れた特許請求の範囲第（３２）項記載のモノクローナル
    抗体。
34. （３４）ラベルが蛍光体又は酵素である特許請求の範囲
    第（３３）項記載のモノクローナル抗体。
35. （３５）試料中のシュードモナスアエルギノーザの存在
    を決定する方法において、シュードモナスアエルギノー
    ザ鞭毛に反応性のモノクローナル抗体と試料を一緒にし
    、コンプレックスの形成を検出することを含む方法。
36. （３６）シュードモナスアエルギノーザバクテリアの存
    在を検出するためのキットにおいて上記バクテリアのタ
    イプ特異的な鞭毛蛋白質と反応する少くとも一のモノク
    ローナル抗体を含むモノクローナル抗体組成物及び該抗
    体に共有結合された又は該モノクローナル抗体の各々に
    反応性の第二の抗体に結合された検出しうるシグナルを
    与えるところのラベルを含むキット。