JP2020517630A - 可溶性および免疫反応性のフラビウイルスns1ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
いくつかのフラビウイルス感染に対するワクチンは、ジカウイルスに対してだけでなく、デング熱、西ナイルウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、黄熱ウイルスおよび日本脳炎ウイルスに利用可能である。しかし、ワクチン接種は必ずしも有効であるとは限らず、例えば、二次的なデング熱感染のような場合、重篤な合併症を招き得る(概説については、CollinsおよびMetz、Clin Therap、2017 Vol. 39、8p. 1519〜1536を参照)。感染後の効果的な医学的処置は不十分である。適時に支持療法を受けるためには、患者がフラビウイルスに感染したかどうか、特にどのような種類のフラビウイルスに感染したかを知ることが大事である。したがって、フラビウイルスによる、特にジカ、デング熱、西ナイルウイルスのいずれかによる患者の感染を確実に確認する、または除外するために、高感度で特異的な血清学的診断法を開発することが求められている。特に、高度に特異的なイムノアッセイが、複数のフラビウイルス感染の罹患率が高い地域において非常に必要とされている。もちろん、例えば、過去に他のフラビウイルス感染、例えばデング熱または黄熱病などに罹患し、その血清がデング熱および黄熱病ウイルスの主要免疫原に対するポリクローナル抗体によって特徴付けられる個体では最近のジカ感染を確実に診断することは非常に難しい仕事である。
成熟NS1タンパク質は、352個のアミノ酸残基(NS1、1−352)を含む。NS1タンパク質内で、ウイングドメインは151個のアミノ酸残基を含み、NS1アミノ酸領域30−180にわたる。したがって、ウイングドメイン位置(1−151)は、29アミノ酸位置を加えることによりNS1ナンバリングへと簡単に変わる。逆に、NS1アミノ酸位置は、29アミノ酸位置を差し引くことによりウイングドメインナンバリングへと簡単に変わる;aa1(ウイング)=aa30(NS1)、aa2(ウイング)=aa31(NS1)、aa3(ウイング)=aa32(NS1)など。同様に、βラダードメイン位置(1−162)は、NS1位置191−352がβラダードメインに相当するので、190アミノ酸位置を加えることによりNS1ナンバリングへと簡単に変わる。
DRYKYHPDSP RRLAAAVKQA WEEGICGISS VSRMENIMWK SVEGELNAIL EENGVQLTVV VGSVKNPMWR GPQRLPVPVN ELPHGWKAWG KSYFVRAAKT NNSFVVDGDT LKECPLKHRA WNSFLVEDHG FGVFHTSVWL KVREDYSLEX D
配列番号2、C55、C143、C179Aを有するジカウイルスNS1ウイングドメインaa30−180
DRYKYHPDSP RRLAAAVKQA WEEGICGISS VSRMENIMWK SVEGELNAIL EENGVQLTVV VGSVKNPMWR GPQRLPVPVN ELPHGWKAWG KSYFVRAAKT NNSFVVDGDT LKECPLKHRA WNSFLVEDHG FGVFHTSVWL KVREDYSLEA D
配列番号3、ジカウイルスNS1の完全長aa1−352;またこの配列は、MR 766株、UniProt ID W8Q7Q3としても公開されている;完全長ジカ前駆体ポリタンパク質内の対応するナンバリングはaa795−1146である
DVGCSVDFSK RETRCGTGVF IYNDVEAWRD RYKYHPDSPR RLAAAVKQAW EEGICGISSV
SRMENIMWKS VEGELNAILE ENGVQLTVVV GSVKNPMWRG PQRLPVPVNG LPHGWKAWGK
SYFVRAAKTN NSFVVDGDTL KECPLKHRAW NSFLVEDHGF GVFHTSVWLK VREDYSLECD
PAVIGTAVKG REAAHSDLGY WIESEKNDTW RLKRAHLIEM KTCEWPKSHT LWTDGVEESD
LIIPKSLAGP LSHHNTREGY RTQVKGPWHS EELEIRFEEC PGTKVHVEET CGTRGPSLRS
TTASGRVIEE WCCRECTMPP LSFRAKDGCW YGMEIRPRKE PESNLVRSMV TA
配列番号4、ジカウイルスNS1 βラダードメインaa191−352
REAAHSDLGY WIESEKNDTW RLKRAHLIEM KTCEWPKSHT LWTDGVEESD LIIPKSLAGP
LSHHNTREGY RTQVKGPWHS EELEIRFEEC PGTKVHVEET CGTRGPSLRS TTASGRVIEE
WCCRECTMPP LSFRAKDGCW YGMEIRPRKE PESNLVRSMV TA
配列番号5、UniProt ID P14336;ヨーロッパ亜型Neudoerfl株によるダニ媒介脳炎(FSME)ウイルスNS1ウイングドメインaa30−180;X=AまたはCまたはS
DNYAYYPETP GALASAIKET FEEGSCGVVP QNRLEMAMWR SSVTELNLAL AEGEANLTVV
VDKFDPTDYR GGVPGLLKKG KDIKVSWKSW GHSMIWSIPE APRRFMVGTE GQSECPLERR
KTGVFTVAEF GVGLRTKVFL DFRQEPTHEX D
配列番号6:ダニ媒介脳炎(FSME)ウイルスNS1完全長aa1−352;またこの配列はヨーロッパ亜型Neudoerfl株、UniProt ID P14336として公開されている;完全長前駆体内の対応するナンバリングはaa777−1128である。
DVGCAVDTER MELRCGEGLV VWREVSEWYD NYAYYPETPG ALASAIKETF EEGSCGVVPQ
NRLEMAMWRS SVTELNLALA EGEANLTVVV DKFDPTDYRG GVPGLLKKGK DIKVSWKSWG
HSMIWSIPEA PRRFMVGTEG QSECPLERRK TGVFTVAEFG VGLRTKVFLD FRQEPTHECD
TGVMGAAVKN GMAIHTDQSL WMRSMKNDTG TYIVELLVTD LRNCSWPASH TIDNADVVDS
ELFLPASLAG PRSWYNRIPG YSEQVKGPWK YTPIRVIREE CPGTTVTINA KCDKRGASVR
STTESGKVIP EWCCRACTMP PVTFRTGTDC WYAMEIRPVH DQGGLVRSMV VA
配列番号7、デングウイルス1型NS1ウイングドメインaa30−180;X=AまたはCまたはS
EQYKFQADSP KRLSAAIGKA WEEGVCGIRS ATRLENIMWK QISNELNHIL LENDMKFTVV VGDVAGILAQ GKKMIRPQPM EHKYSWKSWG KAKIIGADVQ NTTFIIDGPN TPECPDDQRA WNIWEVEDYG FGIFTTNIWL KLRDSYTQVXD
配列番号8、デングウイルス1型NS1完全長aa1−352;またこの配列はUniProt ID W8FUV0の下で公開されている;完全長前駆体内の対応するナンバリングはaa776−1127である。
DSGCVINWKG RELKCGSGIF VTNEVHTWTE QYKFQADSPK RLSAAIGKAW EEGVCGIRSA
TRLENIMWKQ ISNELNHILL ENGMKFTVVV GEVNGILAQG KKMIRPQPME HKYSWKSWGK
AKVIGADVQN TTFIIDGPNT PECPDDQRAW NIWEVEDYGF GIFTTNIWLK LRDSYTQVCD
HRLMSAAIKD SKAVHADMGY WIESEKNETW KLARASFIEV KTCIWPKSHT LWSNGVLESE
MIIPKIYGGP ISQHNYRPGY FTQTAGPWHL GKLELDFELC EGTTVVVDEH CGNRGPSLRT
TTVTGKIIHE WCCRSCTLPP LRFKGEDGCW YGMEIRPVKE KEENLVKSMV SA
配列番号9、デングウイルス2型NS1ウイングドメインaa30−180;X=AまたはCまたはS
EQYKFQPESP SKLASAIQKA HEEGICGIRS VTRLENLMWK QITPELNHIL SENEVKLTIM TGDIKGIMQA GKRSLRPQPT ELKYSWKTWG KAKMLSTESH NQTFLIDGPE TAECPNTNRA WNSLEVEDYG FGVFTTNIWL KLKEKQDVFX D
配列番号10、デングウイルス2型NS1完全長aa1−352;またこの配列はUniProt ID P29990によるタイ/16881/1984株として公開されており、完全長前駆体内の対応するナンバリングはaa776−1127である。
DSGCVVSWKN KELKCGSGIF ITDNVHTWTE QYKFQPESPS KLASAIQKAH EEGICGIRSV
TRLENLMWKQ ITPELNHILS ENEVKLTIMT GDIKGIMQAG KRSLRPQPTE LKYSWKTWGK
AKMLSTESHN QTFLIDGPET AECPNTNRAW NSLEVEDYGF GVFTTNIWLK LKEKQDVFCD
SKLMSAAIKD NRAVHADMGY WIESALNDTW KIEKASFIEV KNCHWPKSHT LWSNGVLESE
MIIPKNLAGP VSQHNYRPGY HTQITGPWHL GKLEMDFDFC DGTTVVVTED CGNRGPSLRT
TTASGKLITE WCCRSCTLPP LRYRGEDGCW YGMEIRPLKE KEENLVNSLV TA
配列番号11、デングウイルス3型NS1ウイングドメインaa30−180;X=AまたはCまたはS
EQYKFQADSP KRLATAIAGA WENGVCGIRS TTRMENLLWK QIANELNYIL WENNIKLTVV VGDIIGILEQ GKRTLTPQPM ELKYSWKTWG KAKIVTAETQ NSSFIIDGPN TPECPNASRA WNVWEVEDYG FGVFTTNIWL KLREMYSQLXD
配列番号12、デングウイルス3型NS1完全長aa1−352;またこの配列はUniProt ID W8FRG8の下で公開されている;完全長前駆体内の対応するナンバリングは、aa774−1125である。
DMGCVINWKG KELKCGSGIF VTNEVHTWTE QYKFQADSPK RLATAIAGAW ENGVCGIRST
TRMENLLWRQ IANELNYILW ENNIKLTVVV GDIIGILEQG KRTLTPQPME LKYSWKTWGK
AKIVTAETQN SSFIIDGPNT PECPNASRAW NVWEVEDYGF GVFTTNIWLK LREMYSQLCD
HRLMSAAVKD ERAVHADMGY WIESQKNGSW KLEKASLIEV KTCTWPKSHT LWSNGVLESD
MIIPKSLAGP ISQHNYRPGY HTQTAGPWHL GKLELDFNYC EGTTVVITEN CGTRGPSLRT
TTVSGKLIHE WCCRSCTLPP LRYMGEDGCW YGMEIRPINE KEENMVKSLV SA
配列番号13、デングウイルス4型NS1ウイングドメインaa30−180;X=AまたはCまたはS
EQYKFQPESP ARLASAILNA HKDGVCGIRS TTRLENIMWK QITNELNYVL WEGGHDLTVV AGDVKGVLTK GKRALTPPVN DLKYSWKTWG KAKIFTPEAR NSTFLIDGPD TSECPNERRA WNFFEVEDYG FGMFTTNIWM KFREGSSEVXD
配列番号14、デングウイルス4型NS1完全長aa1−352;またこの配列は、フィリピン/H241/1956株、UniProt ID Q58HT7としても公開されている;完全長前駆体内の対応するナンバリングは、aa775−1126である。
DTGCAVSWSG KELKCGSGIF VIDNVHTWTE QYKFQPESPA RLASAILNAH EDGVCGIRST
TRLENIMWKQ ITNELNYVLW EGGHDLTVVA GDVKGVLSKG KRALAPPVND LKYSWKTWGK
AKIFTPEAKN STFLIDGPDT SECPNERRAW NFLEVEDYGF GMFTTNIWMK FREGSSEVCD
HRLMSAAIKD QKAVHADMGY WIESSKNQTW QIEKASLIEV KTCLWPKTHT LWSNGVLESQ
MLIPKAYAGP FSQHNYRQGY ATQTVGPWHL GKLEIDFGEC PGTTVTIQED CDHRGPSLRT
TTASGKLVTQ WCCRSCTMPP LRFLGEDGCW YGMEIRPLSE KEENMVKSQV SA
配列番号15、西ナイルウイルスNS1ウイングドメインaa30−180;X=AまたはCまたはS
DRYKFYPETP QGLAKIIQKA HAEGVCGLRS VSRLEHQMWE AIKDELNTLL KENGVDLSVV VEKQNGMYKA APKRLAATTE KLEMGWKAWG KSIIFAPELA NNTFVIDGPE TEECPTANRA WNSMEVEDFG FGLTSTRMFL RIRETNTTEXD
配列番号16、西ナイルウイルスNS1完全長aa1−352;またこの配列はUniProt ID P06935の下で公開されている;完全長前駆体内の対応するナンバリングは、aa788−1139である。
DTGCAIDIGR QELRCGSGVF IHNDVEAWMD RYKFYPETPQ GLAKIIQKAH AEGVCGLRSV
SRLEHQMWEA IKDELNTLLK ENGVDLSVVV EKQNGMYKAA PKRLAATTEK LEMGWKAWGK
SIIFAPELAN NTFVIDGPET EECPTANRAW NSMEVEDFGF GLTSTRMFLR IRETNTTECD
SKIIGTAVKN NMAVHSDLSY WIESGLNDTW KLERAVLGEV KSCTWPETHT LWGDGVLESD
LIIPITLAGP RSNHNRRPGY KTQNQGPWDE GRVEIDFDYC PGTTVTISDS CEHRGPAART
TTESGKLITD WCCRSCTLPP LRFQTENGCW YGMEIRPTRH DEKTLVQSRV NA
配列番号17、黄熱ウイルスNS1ウイングドメインaa30−180;X=AまたはCまたはS
NKYSYYPEDP VKLASIVKAS FEEGKCGLNS VDSLEHEMWR SRADEINAIF EENEVDISVV
VQDPKNVYQR GTHPFSRIRD GLQYGWKTWG KNLVFSPGRK NGSFIIDGKS RKECPFSNRV
WNSFQIEEFG TGVFTTRVYM DAVFEYTIDX D
配列番号18、黄熱ウイルスNS1完全長aa1−352;またこの配列は、17Dワクチン株、UniProt ID P03314として公開されている;完全長前駆体内の対応するナンバリングは、aa779−1130である。
DQGCAINFGK RELKCGDGIF IFRDSDDWLN KYSYYPEDPV KLASIVKASF EEGKCGLNSV
DSLEHEMWRS RADEINAIFE ENEVDISVVV QDPKNVYQRG THPFSRIRDG LQYGWKTWGK
NLVFSPGRKN GSFIIDGKSR KECPFSNRVW NSFQIEEFGT GVFTTRVYMD AVFEYTIDCD
GSILGAAVNG KKSAHGSPTF WMGSHEVNGT WMIHTLEALD YKECEWPLTH TIGTSVEESE
MFMPRSIGGP VSSHNHIPGY KVQTNGPWMQ VPLEVKREAC PGTSVIIDGN CDGRGKSTRS
TTDSGKVIPE WCCRSCTMPP VSFHGSDGCW YPMEIRPRKT HESHLVRSWV TA
配列番号19、日本脳炎ウイルスNS1ウイングドメインaa30−180;X=AまたはCまたはS
DRYKYLPETP RSLAKIVHKA HKEGVCGVRS VTRLEHQMWE AVRDELNVLL KENAVDLSVV
VNKPVGRYRS APKRLSMTQE KFEMGWKAWG KSILFAPELA NSTFVVDGPE TKECPDEHRA
WNSMQIEDFG FGITSTRVWL KIREESTDEX D
配列番号20、日本脳炎ウイルスNS1完全長aa1−352;またこの配列はUniProt ID Q9YJ16で公開されている;完全長前駆体内の対応するナンバリングは、aa795−1146である。
DTGCAIDITR KEMRCGSGIF VHNDVEAWVD RYKYLPETPR SLAKIVHKAH KEGVCGVRSV
TRLEHQMWEA VRDELNVLLK ENAVDLSVVV NKPVGRYRSA PKRLSMTQEK FEMGWKAWGK
SILFAPELAN STFVVDGPET KECPDEHRAW NSMQIEDFGF GITSTRVWLK IREESTDECD
GAIIGTAVKG HVAVHSDLSY WIESRYNDTW KLERAVFGEV KSCTWPETHT LWGDGVEESE
LIIPHTIAGP KSKHNRREGY KTQNQGPWDE NGIVLDFDYC PGTKVTITED CGKRGPSVRT
TTDSGKLITD WCCRSCSLPP LRFRTENGCW YGMEIRPVRH DEATLVRSQV DA
配列番号21、タンデムの大腸菌SlyDとジカウイルスNS1ウイングドメインaa30−180の融合タンパク質
MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
SGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE
VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE
DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGS
GGGSGGGSGG GSGGGDRYKY HPDSPRRLAA AVKQAWEEGI CGISSVSRME NIMWKSVEGE
LNAILEENGV QLTVVVGSVK NPMWRGPQRL PVPVNELPHG WKAWGKSYFV RAAKTNNSFV
VDGDTLKECP LKHRAWNSFL VEDHGFGVFH TSVWLKVRED YSLEADLEHH HHHH
配列番号22、タンデムの大腸菌SlyDとジカウイルスNS1βラダードメイン(aa191−352、Mr766株)の融合タンパク質
MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
SGGGSGGGKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE
VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE
DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGS
GGGSGGGSGG GSGGGREAAH SDLGYWIESE KNDTWRLKRA HLIEMKTAEW PKSHTLWTDG
VEESDLIIPK SLAGPLSHHN TREGYRTQVK GPWHSEELEI RFEECPGTKV YVEETCGTRG
PSLRSTTASG RVIEEWCCRE CTMPPLSFRA KDGCWYGMEI RPRKEPESNL VRSMVTALEH
HHHHH
配列番号23、大腸菌SlyDとジカウイルスNS1βラダードメイン(aa191−352、Mr766株)の融合タンパク質
MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV
AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD
GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG
SGGGSGGGRE AAHSDLGYWI ESEKNDTWRL KRAHLIEMKT AEWPKSHTLW TDGVEESDLI
IPKSLAGPLS HHNTREGYRT QVKGPWHSEE LEIRFEECPG TKVYVEETCG TRGPSLRSTT
ASGRVIEEWC CRECTMPPLS FRAKDGCWYG MEIRPRKEPE SNLVRSMVTA LEHHHHHH
配列番号24、デングウイルス1型NS1βラダードメインaa191−352
SKAVHADMGY WIESEKNETW KLARASFIEV KTAIWPKSHT LWSNGVLESE MIIPKIYGGP ISQHNYRPGY FTQTAGPWHL GKLELDFDLC EGTTVVVDEH CGNRGPSLRT TSVTGKIIHE WCCRSCTLPP LRFRGEDGCW YGMEIRPVKE KEENLVKSMV SA
配列番号25、デングウイルス2型NS1βラダードメインaa191−352
NRAVHADMGY WIESALNDTW KIEKASFIEV KNAHWPKSHT LWSNGVLESE MIIPKNLAGP VSQHNYRPGY HTQIAGPWHL GKLEMDFDFC DGTTVVVTED CGNRGPSLRT TTASGKLITE WCCRSCTLPP LRYRGEDGCW YGMEIRPLKE KEENLVNSLV TA
配列番号26、デングウイルス3型NS1βラダードメインaa191−352
ERAVHADMGY WIESQKNGSW KLEKASLIEV KTATWPKSHT LWSNGVLESD MIIPKSLAGP ISQHNYRPGY HTQTAGPWHL GKLELDFNYC EGTTVVITEN CGTRGPSLRT TTVSGKLIHE WCCRSCTLPP LRYMGEDGCW YGMEIRPINE KEENMVKSLV SA
配列番号27、デングウイルス4型NS1βラダードメインaa191−352
QKAVHADMGY WIESSKNQTW QIEKASLIEV KTALWPKTHT LWSNGVLESQ MLIPRSYAGP FSQHNYRQGY ATQTAGPWHL GKLEIDFGEC PGTTVTIQED CDHRGPSLRT TTASGKLVTQ WCCRSCTMPP LRFLGEDGCW YGMEIRPLSE KEENMVKSQV TA
配列番号28〜35の配列は電子配列表に示す。アミノ酸Xは、この位置にアラニン、システインまたはセリンを入れることができることを示す(X=AまたはCまたはS)。
配列番号29、タンデムの大腸菌SlyDとデングウイルス2型NS1ウイングドメインaa30−180の融合タンパク質
配列番号30、タンデムの大腸菌SlyDとデングウイルス3型NS1ウイングドメインaa30−180の融合タンパク質
配列番号31、タンデムの大腸菌SlyDとデングウイルス4型NS1ウイングドメインaa30−180の融合タンパク質
配列番号32、タンデムの大腸菌SlyDとデングウイルス1型NS1βラダードメインaa191−352の融合タンパク質
配列番号33、タンデムの大腸菌SlyDとデングウイルス2型NS1βラダードメインaa191−352の融合タンパク質
配列番号34、タンデムの大腸菌SlyDとデングウイルス3型NS1βラダードメインaa191−352の融合タンパク質
配列番号35、タンデムの大腸菌SlyDとデングウイルス4型NS1βラダードメインaa191−352の融合タンパク質
a)フラビウイルスNS1ウイングドメイン抗原をコードする遺伝子を含む上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップと、
b)前記フラビウイルスNS1ウイングドメイン抗原をコードする遺伝子を発現させるステップと、
c)前記フラビウイルスNS1ウイングドメイン抗原を精製するステップ
とを含む。
本発明のさらなる態様は、分離されたヒト試料中の抗フラビウイルス抗体を検出する方法であって、本発明によるフラビウイルスNS1ウイングドメイン抗原が抗体の結合パートナーとして使用される、方法に関する。したがって、本発明は、分離された試料中のフラビウイルス、特に第1のフラビウイルス種に特異的な抗体を検出する方法であって、a)本発明によるフラビウイルスNS1ウイングドメイン抗原と体液試料を混合することにより免疫反応混合物を形成するステップと、b)前記フラビウイルスNS1ウイングドメイン抗原に対する体液試料中に存在する抗体を、前記フラビウイルスNS1ウイングドメイン抗原と免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、c)前記免疫反応生成物のいずれかの存在および/または濃度を検出するステップとを含む、方法を包含する。
以下の実施形態もまた本発明の一部である。
1.分離された生体試料中のフラビウイルスに対する抗体を検出するのに適したポリペプチドであって、フラビウイルスNS1ウイングドメイン特異的アミノ酸配列を含み、前記フラビウイルスのNS1βラダードメイン由来のアミノ酸配列が前記ポリペプチド中に存在しない、ポリペプチド。
3.前記フラビウイルスが、ジカウイルス(ZIKV)、西ナイルウイルス(WNV)、デングウイルス1〜4型(DENV1〜4)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、黄熱病ウイルス(YFV)および日本脳炎ウイルス(JEV)からなる群から選択される、実施形態1または2のいずれかに記載のポリペプチド。
6.前記シャペロンが、SlyD、SlpA、FkpAおよびSkpからなる群から選択される、実施形態1から5のいずれかに記載のポリペプチド。
a)実施形態1から7のいずれかに記載のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドをコードする、作動可能に連結された組換えDNA分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップと、
b)前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドを発現させるステップと、
c)前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドを精製するステップと
を含む、方法。
a)実施形態1から7のいずれかに記載の前記第1のフラビウイルス種のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドと体液試料を混合することにより免疫反応混合物を形成するステップと、
b)前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドに対する体液試料中に存在する抗体を、前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、
c)前記免疫反応生成物のいずれかの存在および/または濃度を検出するステップと
を含む、方法。
12.実施形態9から11に記載の分離された試料中の第1のフラビウイルス種に特異的な抗体を検出する方法であって、前記免疫反応が、
a)固相に直接または間接的に結合することができる実施形態1から7のいずれかに記載の第1のフラビウイルス種の第1のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドであって、生体親和性結合対の一部であるエフェクター基を有する第1のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドと、実施形態1から7のいずれかに記載の前記第1のフラビウイルス種の第2のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドであって、検出可能な標識を有する第2のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドとを、前記試料に添加するステップであって、ここで、前記第1および第2のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドが、前記抗フラビウイルス抗体に特異的に結合する、ステップと、
b)前記第1のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチド、前記試料抗体、および前記第2のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドを含む免疫反応混合物を形成するステップであって、ここで、前記生体親和性結合対の対応するエフェクター基を有する固相が、免疫反応混合物を形成する前、間または後で添加される、ステップと、
c)体液試料中の前記第1および第2のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドに対するフラビウイルス抗体を、前記第1および第2のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、
d)液相を固相から単離するステップと、
e)固相もしくは液相またはその両方における前記免疫反応生成物のいずれかの存在を検出するステップと
を含む二重抗原サンドイッチフォーマットで実施される、方法。
16.前記第1のフラビウイルス種がダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV)である、実施形態9から13のいずれかに記載の第1のフラビウイルス種に特異的な抗体を検出する方法。
18.前記第1フラビウイルス種が日本脳炎ウイルス(JEV)である、実施形態9から13のいずれかに記載の第1のフラビウイルス種に特異的な抗体を検出する方法。
21.前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドが多量体形態で使用され、一実施形態において前記ポリペプチドが少なくとも二重の形態で、一実施形態においては3〜10重で存在する、実施形態20に記載のIgMクラスの第1フラビウイルス種に特異的な抗体を検出する方法。
23.実施形態20から22のいずれかに記載の分離された試料中の第1のフラビウイルス種に特異的なIgM抗体を検出する方法であって、前記免疫反応が、
a)固相に直接または間接的に結合することができるμ捕獲結合パートナーであって、生体親和性結合対の一部であるエフェクター基を有するμ捕獲結合パートナーと、実施形態1から6のいずれかに記載のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドであって、検出可能な標識を有するフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドとを、前記試料に添加するステップであって、
ここで、前記μ捕捉結合パートナーがヒトIgM抗体のFc部分に特異的に結合し、前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドが前記抗フラビウイルス抗体に特異的に結合する、ステップと、
b)前記μ捕獲結合パートナー、前記試料抗体、および前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドを含む免疫反応混合物を形成するステップであって、ここで、前記生体親和性結合対の対応するエフェクター基を有する固相が、免疫反応混合物を形成する前、間または後で添加される、ステップと、
c)体液試料中の前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドに対するIgM抗体を、前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、
d)液相を固相から単離するステップと、
e)固相もしくは液相またはその両方における前記免疫反応生成物のいずれかの存在を検出するステップと
を含む、μ捕獲フォーマットで実施される、方法。
33.個別の容器にまたは単一の容器ユニットの個別の区画に、少なくともアビジンまたはストレプトアビジンで被覆された微粒子、およびビオチンに共有結合されたμ捕捉結合パートナーを含む、実施形態29に記載の試薬キット。
35.特異的結合パートナーとしてβラダードメインの完全配列または部分配列を含むフラビウイルスNS1ポリペプチドを使用することによって、第1のフラビウイルスとは異なる少なくとも1つの第2のフラビウイルスに対する抗体を含有することが推定される分離された生体試料中の第1のフラビウイルスに対する抗体を検出する方法であって、非標識形態の前記フラビウイルスのNS1βラダードメインを含むポリペプチドを添加することによって、一実施形態においては、クエンチャーとしてβラダードメインを含む前記ポリペプチドを添加することによって、前記第1のフラビウイルスとは異なる少なくとも1つの第2のフラビウイルスに対する交差反応性が除去される、方法。
37.前記βラダードメインポリペプチドが配列番号4、24、25、26および27からなる群から選択される、実施形態36に記載の使用。
実施例1:ジカIgGイムノアッセイにおける異なるジカNS1抗原変異体の免疫学的反応性(すなわち抗原性)
NS1抗原および変異体は、WO2014054990A1に、またはScholzら、J. Mol. Biol. (2005) 345、1229〜1241により開示されているように、本質的にクローン化、発現、精製および標識された。精製および可溶化された遺伝子産物は、続いてビオチンまたは電気化学発光ルテニウム標識に結合させた。
回避不可能な系固有のシグナルは約500カウントである。ジカIgG抗体およびデング熱IgG抗体が陰性であるヒト血清試料の低いバックグラウンドシグナルは、それぞれの抗原ルテニウムコンジュゲートの高い溶解性および一般に良性の物理化学特性を示している。疎水性、または一般に言われている「粘着性」の抗原−ルテニウムコンジュゲートは、ビーズ表面と相互に作用し、それによりバックグラウンドシグナルが増加する傾向にある。表1から、本発明者らは、ジカNS1「ウイング」の物理化学的特性が優れていると推論することができる(第1列)。これは、同様にジカNS1「βラダー」にも該当する(データ第2列)。ジカNS1「ウイング」(配列番号21)がDAGSフォーマットでビオチン化形態およびルテニル化形態で抗原対として使用される場合、またはジカNS1「βラダー」(配列番号22)がDAGSフォーマットのビオチン化形態およびルテニル化形態の抗原対として使用される場合、両抗原対は、陰性ヒト血清で約600〜900カウントのシグナルバックグラウンドを生じ、抗原コンジュゲートの良好な溶解特性を明白に示す。しかし、一見したところ、ジカNS1「ウイング」およびジカNS1「βラダー」は抗ジカ抗体を検出するそれらの能力は等しいが、表1に示したように、抗デング熱抗体との交差反応性では著しく異なることが明らかになった。ジカIgG陽性試料で詳しく見てみた場合、本発明者らは、ジカNS1「ウイング」およびジカNS1「βラダー」の両方が、すべてのジカIgG試料を陽性として(>2000カウント)検出することを見出した。重要なことには、ジカNS1「ウイング」はデング熱IgG陽性試料と交差反応しないが、それはすべてのデング熱IgG試料がジカNS1ウイング抗原で陰性であると確認される(≪2000カウント)からである。好対照において、ジカNS1「βラダー」は、20のデング熱IgG試料のうち9つの試料を反応性として検出し(>2000カウント)検出し、これは程度の顕著な交差反応性を示す。ジカIgGおよびデング熱IgGの陽性試料と非常に類似した反応性パターンが、Huzlyら(Euro Surveill. 2016; 21(16)、pii=30203、1〜4)によって開示された市販のジカIgGアッセイで観察されるが、市販のジカIgGアッセイは、デング熱IgG陽性試料と顕著な免疫学的交差反応性を有する(すなわち、市販のジカIgGアッセイはかなり多数の偽陽性ジカ結果をもたらす)という難点を有する。結論として、ジカNS1抗原(ジカNS1「ウイング」およびジカNS1「βラダー」)の操作された両変異体は、顕著な物理化学的特性と抗原特性を有する。しかし、ジカNS1「ウイング」抗原は、ジカIgG抗体に対する優れた特異性を示すとともに、デング熱陽性血清との免疫学的交差反応性を著しく低下させるという点で、βラダードメインより優れている。
ジカNS1抗原のポリペプチド融合変異体の免疫学的反応性(すなわち抗原性)を、実施例1に記載したように自動化Elecsys(登録商標)2010およびcobas e 411アナライザー(Roche Diagnostics GmbH)で評価した。
試料は、ブロッキング実験に必要とされる反応性レベル(力価)に予備希釈した。ブロッキング実験用に調製したフラビウイルスNS−1調製物の濃度および試料中の抗体の量が明確なブロッキング結果を得るために合理的な濃度比内であることが必要とされるので、このステップが必要であった。次いで、予備希釈したヒト抗ジカIgG陽性試料反応性を、TBEV、またはDENV1−4、またはWNV、またはYFV、またはJEVまたはZIKVのいずれかの完全長フラビウイルスNS−1でスパイクした場合の同じ試料で得られたシグナルと比較した。TBEV、DENV1〜4、WNV、YFV、JEVおよびZIKVの異なる完全長フラビウイルスNS−1調製物による競合によってシグナル減少の程度を計算した。ブロッキングのシグナル減少の程度は、完全長ジカNS1で達成される最大ブロッキングに標準化されたが、これは予想通り、両アッセイで(ジカNS1「ウイング」またはジカNS1「βラダー」のいずれを使用することに関係なく)シグナルの最も強い消光を示す。競合する能力の程度は、すべての他の完全長フラビウイルスNS1調製物(TBEV、DENV1〜4、WNV、YFV、JEV)について計算した。ジカNS1「ウイング」抗原に基づくアッセイのシグナルは、非ジカNS1抗原によって消光が弱くなるだけであるが、ジカNS1「βラダー」抗原に基づくアッセイのシグナルは、TBEV、DENV1〜4、およびJEVによって顕著に低減されることは一目したところ明白である。この発見は、NS1ウイングドメインとNS1βラダードメインがアルボウイルスNS1相同体の中でそれらの構造の独自性が大きく異なることを強く力説するように示している。明らかに、非ジカNS1抗原のウイング部分は、抗ジカ分析物抗体への結合について、操作されたジカウイング抗原と効率的に競合され得ない。反対に、非ジカNS1抗原のβラダー部分は、抗ジカ分析物抗体への結合について、操作されたジカβラダー抗原と完全に効率的に競合され得る。
ZIKV=ジカウイルス
DENV1=デングウイルス1型
DENV2=デングウイルス2型
DENV3=デングウイルス3型
DENV4=デングウイルス4型
WNV=西ナイルウイルス
JEV=日本脳炎ウイルス
YFV=黄熱ウイルス
TBEV=ダニ媒介脳炎ウイルス(=FSMEウイルス)
実施例3:デング熱IgGイムノアッセイにおけるデング熱NS1抗原変異体の免疫反応性
デング熱NS1抗原および変異体のクローニング、発現、精製および標識は、本質的には実施例1のように実施した。デング熱NS1抗原のポリペプチド融合変異体の免疫学的反応性(すなわち抗原性)は、自動化cobas e 601分析器(Roche Diagnostics GmbH)で評価した。Elecsys(登録商標)は、Rochグループの登録商標である。測定は、実施例1でも記載した二重抗原サンドイッチフォーマットで実施した。
4つのすべてのデングウイルス血清型のNS1ウイングドメインが大腸菌で過剰発現され得ること、またこれらの組換え抗原が高収率で得られ得ることを明らかにすることができた。抗原は、精製後にリフォールディングさせ、可溶性の天然様で免疫反応性の立体構造にすることができる。免疫蛍光アッセイによりデング熱陽性と予備試験された血清が、本発明者らのアッセイのセットアップで陽性と正確に同定されたことを示すことができた。DENV1〜4ウイングドメインおよびDENV2βラダードメインは、実際、推測上デング熱陽性の血清と反応する。しかし、DENV1〜4の個々のデング熱ウイングドメインが事前に特徴付けられた市販のデング熱陽性血清とは異なる反応を示すという証拠を本発明者らは発見した。その結果は、デングウイルス血清型の免疫学的識別が、イムノアッセイにおける抗原としてのデング熱NS1ウイングドメインに基づいて可能であり得ることを示唆しているようである。
Claims (17)
- 分離された生体試料中のフラビウイルスに対する抗体を検出するのに適したポリペプチドであって、フラビウイルスNS1ウイングドメイン特異的アミノ酸配列を含み、前記フラビウイルスのNS1βラダードメイン由来のアミノ酸配列が前記ポリペプチド中に存在しない、ポリペプチド。
- 前記フラビウイルスのさらなるアミノ酸配列が前記ポリペプチド中に存在しない、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記フラビウイルスが、ジカウイルス(ZIKV)、西ナイルウイルス(WNV)、デングウイルス1〜4型(DENV1〜4)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、黄熱病ウイルス(YFV)、日本脳炎ウイルス(JEV)からなる群から選択される、請求項1または2のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記フラビウイルスNS1ウイングドメイン特異的アミノ酸配列が、配列番号1、2、5、7、9、11、13、15、17および19からなる群から選択されるポリペプチドから本質的になる、請求項1から3のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドがシャペロンに融合している、請求項1から4のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記シャペロンが、SlyD、SlpA、FkpAおよびSkpからなる群から選択される、請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチド。
- 配列番号21(ジカ)、28(DENV1)、29(DENV2)、30(DENV3)および31(DENV4)からなる群から選択される、請求項6に記載のポリペプチド。
- 可溶性および免疫反応性のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドを産生する方法であって、
a)請求項1から7のいずれかに記載のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドをコードする、作動可能に連結された組換えDNA分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップと、
b)前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドを発現させるステップと、
c)前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドを精製するステップと
を含む、方法。 - 分離された試料中の第1のフラビウイルス種に特異的な抗体を検出する方法であって、請求項1から7のいずれかに記載の前記第1のフラビウイルス種のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドが前記抗フラビウイルス抗体の捕捉試薬および/または結合パートナーとして使用される、方法。
- 分離された試料中の第1のフラビウイルス種に特異的な抗体を検出する方法であって、
a)請求項1から7のいずれかに記載の前記第1のフラビウイルス種のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドと体液試料を混合することにより免疫反応混合物を形成するステップと、
b)前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドに対する体液試料中に存在する抗体を、前記フラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドと免疫反応させて免疫反応生成物を形成するのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持するステップと、
c)前記免疫反応生成物のいずれかの存在および/または濃度を検出するステップと
を含む、方法。 - 検出された抗体がIgGまたはIgM抗体である、請求項9または10に記載の分離された試料中の第1のフラビウイルス種に特異的な抗体を検出する方法。
- 前記第1のフラビウイルス種がデングウイルス1〜4型である、請求項9から11のいずれかに記載の分離された試料中の第1のフラビウイルス種に特異的な抗体を検出する方法。
- 抗フラビウイルス抗体を検出するためのインビトロ診断試験における、請求項1から7のいずれかに記載のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドの使用。
- 請求項1から7のいずれかに記載のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドを含む、抗フラビウイルス抗体を検出するための試薬キット。
- 個別の容器にまたは単一の容器ユニットの個別の区画に、少なくともアビジンまたはストレプトアビジンで被覆された微粒子、およびビオチンに共有結合された請求項1から7のいずれかに記載のフラビウイルスNS1ウイングドメインポリペプチドを含む、請求項14に記載の試薬キット。
- 特異的結合パートナーとしてβラダードメインの完全配列または部分配列を含むフラビウイルスNS1ポリペプチドを使用することによって、第1のフラビウイルスとは異なる少なくとも1つの第2のフラビウイルスに対する抗体を含有することが推定される分離された生体試料中の第1のフラビウイルスに対する抗体を検出する方法であって、非標識形態の前記フラビウイルスのNS1βラダードメインを含むポリペプチドを添加することによって、一実施形態においては、クエンチャーとしてβラダードメインを含む前記ポリペプチドを添加することによって、前記第1のフラビウイルスとは異なる少なくとも1つの第2のフラビウイルスに対する交差反応性が除去される、方法。
- 抗フラビウイルス抗体を検出するためのイムノアッセイにおける干渉を低減する試薬としての、フラビウイルスNS1βラダードメインポリペプチドの使用。
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