CN105732777B - 黄热病毒特异性检测抗原及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄热病毒特异性检测抗原及其应用。本发明所提供的黄热病毒特异性检测抗原为如下任一所示多肽：(a1)序列1；(a2)序列1的第166‑320位所示的多肽；(a3)将以上任一限定的多肽的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且功能相同的多肽。本发明所提供的黄热病毒特异性检测抗原在检测黄热病毒血清感染中具有较高的特异性和灵敏度；且与现有方法相比，抗原制备方法简单，且不存在操作者被感染病毒的风险。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测领域，涉及一种黄热病毒特异性检测抗原及其应用。
背景技术
黄热病毒是黄热病的病原体，通过蚊虫的叮咬传播，该病主要发生于非洲和南美洲。症状主要是发热、头痛，严重病例可发展为高热、结膜充血、呕吐等，皮肤及脏器可见出血及瘀斑，可发展为脑膜炎，重症者死亡率达20％-50％。
黄热病毒感染的检测主要依靠核酸及血清学方法。血清学方法主要检测黄热病毒的特异性抗体，不仅可用于病原监测，还可用于监测机体的免疫反应过程，以及评价疫苗的接种效果。目前所用的黄热病毒感染的血清学检测方法，主要还是利用全病毒作为检测抗原的免疫荧光法，将体外培养的黄热病毒固定在玻片上，与样本血清共同孵育后，加入荧光素标记抗体，通过显微镜下观察荧光强弱进行阴阳性判断。该方法以天然病毒作为检测抗原，结果较为准确，但抗原片制备过程复杂，在抗原制备过程中还存在操作者被感染的风险。
目前，急需一种检测结果准确、灵敏度高、特异性强的多肽抗原作为用于黄热感染的血清学检测抗原，因为多肽抗原制备过程简单，易于黄热血清检测试剂盒的大量制备，且不存在操作者被感染的风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄热病毒特异性检测抗原及其应用。
本发明所提供的黄热病毒特异性检测抗原具体可为如下任一所示多肽：
(a1)氨基酸序列如序列表中序列1的第166-320位所示的多肽；
(a2)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；
(a3)将(a1)或(a2)限定的多肽的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且功能相同的多肽。
其中，(a2)所示多肽为分别在(a1)所示多肽上连接了含有6个His标签的片段后形成的多肽。当然，为了便于上述(a1)、(a3)和(a5)所示多肽的纯化，也可在其N端或C端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
编码所述多肽的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因，所述基因是如下任一所述的DNA分子：
(b1)编码序列如序列表中序列4的第496-960位所示的DNA分子；
(b2)编码序列如序列表中序列4所示的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述多肽的DNA分子；
(b4)与(b1)-(b3)中任一限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述多肽的DNA分子。
含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
在本发明中，所述重组载体中启动所述多肽的编码基因转录的启动子具体为T7启动子。更加具体的，所述重组载体具体为将所述多肽的编码基因插入到pET32a(+)载体的酶切位点BamHI和HindIII之间后得到的重组载体。
所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。
所述多肽或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下(a)或(b)中的应用也属于本发明的保护范围：
(a)制备用于检测或辅助检测抗黄热病毒抗体的试剂盒；
(b)检测或辅助检测抗黄热病毒抗体。
所述多肽或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下(c)或(d)中的应用也属于本发明的保护范围：
(c)制备用于检测或辅助检测待测动物是否感染黄热病毒的试剂盒；
(d)检测或辅助检测待测动物是否感染黄热病毒。
含有所述多肽或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，且具有(1)和/或(2)的功能的试剂盒也属于本发明的保护范围：
(1)检测或辅助检测抗黄热病毒抗体；
(2)检测或辅助检测待测动物是否感染黄热病毒。
在本发明中，所述抗黄热病毒抗体为能够抗所述多肽的抗体；所述抗黄热病毒抗体可为来自于待测动物的能够抗黄热病毒的抗血清。
在本发明的实施例中，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒，其中的包被原为所述多肽。根据需要，所述试剂盒中还可含有酶标抗体、包被液、封闭液、洗涤液、显色液、和/或终止液；所述酶标抗体为抗待测动物IgG的抗体；所述待测动物可为人或小鼠等哺乳动物。
所述多肽或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在作为免疫原制备抗黄热病毒的抗体中的应用，以及在制备用于治疗和/或预防黄热病毒引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明选取黄热病毒表面糖蛋白G作为候选检测抗原，分段进行了重组表达，然后利用ELISA方法评价了抗原的特异性和灵敏性，确定序列1所示的YF1-1这个抗原片段可作为黄热病毒血清感染的诊断抗原。
附图说明
图1为黄热病毒特异性检测抗原的表达结果。其中，泳道1为YF1-1BL21 16℃诱导包涵体(36KD)；泳道2为YF1-1BL21 16℃诱导可溶性蛋白；泳道3为YF1-2BL2116℃诱导包涵体(36KD)；泳道4为YF1-2BL21 16℃诱导可溶性蛋白；泳道5为YF2BL21 16℃诱导包涵体(30KD)；泳道6为YF2BL21 16℃诱导可溶性蛋白；泳道9为蛋白marker，(由大到小各条带依次为170、130、95、72、55、43、30、17KD)。箭头所示为目的蛋白条带。
图2为黄热病毒特异性检测抗原的纯化结果。其中，泳道1为蛋白maeker，由大到小各条带依次为170、130、95、72、55、43、30、17、10KD；泳道2为黄热病毒抗原YF1-1，36kd；泳道3为黄热病毒抗原YF1-2，36kd；泳道4为黄热病毒抗原YF2，大小为30kd。
图3为黄热病毒特异性检测抗原的效果检测结果。血清稀释度是1:200。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用到的各免疫血清的制备方法具体如下：
1、兔免疫血清的制备：
参照常规方法，在8-10g(2周龄)小白鼠脑内分别接种乙型脑炎病毒(JBEV)、西尼罗病毒(WNV)、登革病毒2型、登革病毒3型和登革病毒4型，在小白鼠濒死前取脑，研磨后用含5％(体积分数)正常兔血清的生理盐水制成10～20％(％表示g脑组织/100ml)的病毒悬液，以此作为免疫抗原。然后以1ml病毒悬液加入等量完全弗氏佐剂完全乳化后，分别于第1、10、20d，皮下多点注射日本大耳白兔，每种抗原分别注射两只兔，注射前采血作为阴性对照。最后一次免疫10d后，颈部静脉采全血并分离血清，以0.01M PBS按照1：10(体积比)稀释兔免疫血清，56℃灭活30min，分装冻存于-20℃备用。(参考文献：林方博士论文，六种虫媒病毒蛋白芯片检测方法的建立)
2、鼠免疫血清的制备：
用100TCID50/100μL的黄热病毒17D(简称YF-17D)，腹腔免疫注射SPF级6～8周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠注射0.2mL，免疫后第10天，乙醚麻醉小鼠，摘眼球采血以0.01MPBS按照1：10(体积比)稀释鼠免疫血清，56℃灭活30min，分装冻存于-20℃备用。血样于室温放置2h，3 000rpm离心15min，收取血清。
黄热病毒17D(简称YF-17D)：记载于“彭文明,邓永强,于曼,范保昌,祝庆余,秦鄂德.黄热病毒的一步RT-PCR法检测.微生物学杂志,2003,23,8-10”一文，公众在符合生物安全相关规定的情况下，可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。
乙型脑炎病毒(JBEV)、西尼罗病毒(WNV)、登革病毒2型、登革病毒3型和登革病毒4型：记载于“林方.六种虫媒病毒蛋白芯片检测方法的建立.中国人民解放军军事医学科学院，2012博士”一文，在满足生物试验安全要求的情况下，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明试验使用。
pET32a(+)载体：为Promega公司产品。
大肠杆菌BL21(DE3)：为康为世纪生物科技有限公司产品。
实施例1、黄热病毒特异性检测抗原的制备
一、黄热病毒重组蛋白序列信息
黄热病毒为单股正链RNA病毒，病毒颗粒含有三种结构蛋白，大表面糖蛋白G，核外壳蛋白C，及表面蛋白M。发明人根据黄热病毒胞膜糖蛋白G的结构特点，将G蛋白分为3个不同的抗原片段进行分段表达，并设计了特异的扩增引物。片段长度、引物序列及酶切位点信息如表1所示。
表1 3个不同的抗原片段的片段长度、引物序列及酶切位点信息
注：表中上游引物中下划线部分为酶切位点BamHI的识别序列；下游引物中下划线部分为酶切位点HindIII的识别序列。
二、重组表达载体的构建
委托上海生工公司对YF1-1，YF1-2和YF2的基因序列进行全基因合成，上游加上限制性内切酶BamHI的识别序列及保护碱基(ATCGGGATCC)，下游加上限制性内切酶HindIII的识别序列及保护碱基(ATCGAAGCTT)。最终合成如下三个DNA片段：
(1)含有YF1-1基因序列的DNA片段：“ATCGGGATCC+序列4的第496-960位+CAAGCTTCGAT”；
(2)含有YF2基因序列的DNA片段：“ATCGGGATCC+序列5的第496-786位+CAAGCTTCGAT”；
(3)含有YF1-2基因序列的DNA片段：“ATCGGGATCC+序列6的第496-957位+CAAGCTTCGAT”。
分别利用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切如上三个DNA片段，回收酶切产物，分别与经过同样双酶切的pET32a(+)载体骨架大片段相连，得到重组质粒。
将经测序表明将pET32a(+)载体的酶切位点BamHI和HindIII之间的小片段替换为序列表中序列4的第496-960位所示DNA片段的重组质粒命名为pET32a-YF1-1。
将经测序表明将pET32a(+)载体的酶切位点BamHI和HindIII之间的小片段替换为序列表中序列5的第496-786位所示DNA片段的重组质粒命名为pET32a-YF2。
将经测序表明将pET32a(+)载体的酶切位点BamHI和HindIII之间的小片段替换为序列表中序列6的第496-957位所示DNA片段的重组质粒命名为pET32a-YF1-2。
重组表达载体pET32a-YF1-1可表达序列表中序列1所示的蛋白质，其中序列1的第166-320位为来自于黄热病毒17D的E抗原片段(记为YF1-1)，6His标签的序列来自于pET32a(+)载体，是为了便于抗原片段的纯化。
重组表达载体pET32a-YF2可表达序列表中序列2所示的蛋白质，其中序列2的第166-262位为来自于黄热病毒17D的E抗原片段(记为YF1-2)，6His标签的序列来自于pET32a(+)载体，是为了便于抗原片段的纯化。
重组表达载体pET32a-YF1-2可表达序列表中序列3所示的蛋白质，其中序列3的第166-319位为来自于黄热病毒17D的E抗原片段(记为YF2)，6His标签的序列来自于pET32a(+)载体，是为了便于抗原片段的纯化。
三、重组蛋白的表达
将步骤二构建的3个重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆菌株，在LB培养液中培养至OD600＝0.8，加IPTG至终浓度为1mM，16℃诱导表达过夜(12h)。离心收集菌体，超声破碎后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，鉴定蛋白的表达情况。
结果如图1所示，可见3个重组蛋白均为包涵体表达，16℃诱导表达过夜，在目的条带位置可见到一条较粗的蛋白条带，为目的蛋白。
四、重组蛋白的纯化
将步骤三诱导表达的菌，经过离心、重悬、超声等步骤后，加入包涵体溶解液(康为试剂，CW0893)，再次离心取包涵体溶解的上清液，采用康为世纪公司的Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒，用Binding Buffer将菌体上清液等倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。使用Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。对洗脱峰进行蛋白浓度的测定，然后将蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋置于PBS内，4℃过夜，期间换3～4次PBS溶液，最后取出部分蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后将胶块用考马斯R-25溶液室温染色3～4h后，用脱色液脱色2～3次，拍照分析。
3个黄热重组抗原的纯化结果如图2所示。纯化后的3种重组蛋白即为候选的黄热病毒特异性检测抗原。
实施例2、黄热病毒特异性检测抗原的效果检测
分别以实施例1制备的3个不同的黄热病毒G蛋白片段(YF1-1，YF1-2和YF2)作为检测抗原，用YF-17D病毒感染的小鼠阳性血清及黄病毒其他成员乙型脑炎病毒(JBEV)、西尼罗病毒(WNV)、登革病毒(DV)2型、登革病毒3型和登革病毒4型感染的兔血清，以及正常小鼠及正常兔血清进行ELISA检测，从而评价重组抗原的结合特异性和灵敏性。操作步骤如下：
(1)将实施例1制备的3个黄热病毒抗原YF1-1，YF1-2和YF2分别稀释为5μg/ml，100μl/孔包被ELISA微孔板，4℃过夜。其中，包被液为0.1M的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，pH9.6。
(2)用洗涤液(配方：含体积百分含量为0.5‰的Tween-20的磷酸盐缓冲液，简称PBST洗液)洗涤一遍，然后用封闭液(配方：含3％(3g/100ml)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)封闭，37℃封闭1h。
(3)用样本稀释液(配方：含0.1％(0.1g/100ml)BSA的PBS)对血清样本进行体积比1:200稀释，100μl/孔，加入检测孔中，进行ELISA检测(加样顺序如表2所示)。以鼠源的黄热病毒血清，登革病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒感染的兔血清作为检测样本，以正常兔血清和鼠血清作为阴性样本同时进行检测。37℃震荡孵育1h，使抗体与抗原充分结合后，PBST洗涤3次。
(4)加入HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG(效价1：2000，康为世纪公司产品)，100μl/孔，37℃震荡孵育30min，然后用PBST洗液洗涤3次，洗去未结合的抗体。
(5)加入TMB底物显色液(天根公司产品，其产品目录号为PA107-01)，100μl/孔，室温下避光放置5-20min，然后加入终止液(2M H2SO4)，利用酶联检测仪测450nm处的吸光值，根据OD450值进行结果判断。实验设置2次重复，结果取均值。
以阴性样本检测OD450的2倍作为阳性结果判断的阈值，高于该阈值结果ELISA检测结果将被判为阳性，否则将被判为阴性。
结果如表2和图3所示，该ELISA实验的兔血清的阳性阈值为0.603，小鼠血清的阳性阈值为0.608。结果表明，以上3个黄热病毒重组抗原，与黄热抗体鼠血清检测均为阳性结果，同时用其检测黄病毒属其它成员的阳性血清(登革病毒2型、登革病毒4型、西尼罗病毒、乙型脑炎病毒)结果均低于阳性阈值。表明3个重组抗原可与黄热血清特异结合。但3个抗原的结合特异性存在明显差异，YF2抗原和YF1-2抗原与登革3型阳性血清检测的OD450明显高于YF1-1抗原的检测值，且超过了对应阈值(0.603)，说明YF2和YF1-2两个抗原与登革3型病毒的血清存在交叉反应，表明YF1-1与黄热血清结合更为特异，最适合作为黄热病毒感染血清检测的候选抗原。
表2黄热病毒特异性检测抗原的效果检测
Claims (8)
1.多肽，为序列表中序列1所示的多肽。
2.编码权利要求1所述多肽的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述多肽的基因；所述基因为序列表中序列4所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备用于检测或辅助检测抗黄热病毒抗体的试剂盒中的应用。
6.权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备用于检测或辅助检测待测动物是否感染黄热病毒的试剂盒中的应用。
7.试剂盒，含有权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述试剂盒具有（1）和/或（2）的功能：
（1）检测或辅助检测抗黄热病毒抗体；
（2）检测或辅助检测待测动物是否感染黄热病毒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为酶联免疫试剂盒，其中的包被原为权利要求1所述的多肽。
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