CN109406788B - 一种单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种单克隆抗体，其包含轻链和重链，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；本发明将识别寨卡病毒NS1蛋白的多克隆抗体R1和鼠单克隆抗体1F12应用在制备寨卡病毒NS1蛋白双抗夹心ELISA检测试剂中，建立了寨卡病毒NS1蛋白双抗夹心ELISA快速检测方法，能够快速准确的检测寨卡病毒；该技术整合了抗体的特异性和ELISA高灵敏度的特点，具有准确、快速、高效、特异、灵敏且无需进行病毒的分离、RNA的提取的特点，适用于进出口检疫、病人感染寨卡病毒等的现场快速检测，对于疫情的控制，保障国门安全，及时、准确地指导临床药物使用具有重要意义。

Description

一种单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测寨卡病毒NS1蛋白的双抗夹心ELISA。
背景技术
寨卡病毒（ZIKV）属黄病毒科，黄病毒属，单股正链RNA病毒，直径20nm，主要通过埃及伊蚊传播，也可以通过血液、性传播。临床特征主要为发热、皮疹、关节痛或结膜炎，严重会引起死亡。世界卫生组织（WHO）认为，新生儿小头畸形，格林-巴利综合征可能与寨卡病毒感染有关。近期，根据美国心脏病学会的66周年年度学术会议上展示的调查结果显示，新的证据表明寨卡病毒对心脏有潜在不良影响。近年ZIKV在世界各国大规模爆发，其中巴西150万、哥伦比亚31555、萨尔瓦多2500、洪都拉斯3649、委内瑞拉5220、佛得角7801、新加坡158、海地125、美国66、中国13等43个地区共计150多万感染寨卡病毒。
目前检测寨卡病毒的主要检测方法有病原学检测、血清学检测，其中病原学检测主要为核酸检测（荧光定量RT-PCR，LAMP），血清学检测包括：血清特异性IgM抗体（ELISA、免疫荧光）和中和抗体。病原学检测精准性高、检测时间短但是设备昂贵，易出现假阳性。血清学检测简便，快速，发病7天后检出率高，寨卡病毒IgM抗体与登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒等黄病毒有较强的交叉反应，易于产生假阳性；总之，一个简单、快速、灵敏的寨卡病毒感染检测方法在目前的诊断试剂市面上还很匮乏。
发明内容
本发明目的在于提供了一种单克隆抗体1F12，其包含轻链和重链，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明另一目的是提供一组用于检测寨卡病毒NS1蛋白的特异性抗体组，包括捕获抗体R1、标记辣根过氧化物酶（HRP）的鼠单克隆抗体1F12。
所述捕获抗体R1是能识别寨卡病毒NS1蛋白的多克隆抗体，其是从免疫寨卡病毒NS1蛋白的兔子血清中纯化获得。
本发明NS1蛋白双抗夹心ELISA检测试剂还包括常规显色液、PBS-T。
本发明将兔多克隆抗体与鼠单克隆抗体相结合，优化反应条件，建立寨卡病毒双抗夹心ELISA检测技术。
本发明利用兔多克隆抗体与酶标板结合去捕捉样品中的寨卡病毒NS1蛋白，然后加入识别NS1蛋白的标记HRP的鼠单克隆抗体1F12，TMB显色，确认是否存在有寨卡病毒。
本发明寨卡病毒的检测方法具体步骤如下：
（1）将待测样品中添加到包被有抗NS1蛋白的多克隆抗体R1的96孔板中于37℃反应2h，然后弃上清液，加入PBS-T洗涤3次；
（2）加入100μL辣根过氧化物酶标记的小鼠单克隆抗体1F12，37℃反应1h；
（3）弃上清液，然后加入PBS-T洗涤3次，加入100μL显色液，37℃避光反应15min；
（4）直接通过肉眼观察液体是否变蓝，判断是否存在寨卡病毒；检测方法为常规操作。
反应结束后，直接用肉眼观察结果；结果判定：如果出现蓝色，检测结果为阳性，则说明样品中含有寨卡病毒；不出现蓝色，检测结果为阴性，则说明样品中不含有寨卡病毒；采用本发明所公开的寨卡病毒NS1蛋白的双抗夹心ELISA试剂盒在检测寨卡病毒方面具有良好的积极效果。
本发明与现有技术相比具有的积极效果在于：
（1）本发明采用的双抗夹心ELISA技术具有操作简便、快速等特点，适合于基层推广应用；此外，检测结果可以通过肉眼直接观察和判定结果，仅需3h，比传统的病原学检测节省6天，且不需要对病毒进行富集，提取其RNA等，使检测更为便捷、高效；
（2）基于双抗夹心ELISA的敏感、特异，成本低廉，便于操作等诸多优势，本发明在一定程度上提高了我国寨卡病毒的检测能力，为寨卡病毒疾病的临床实时快速诊断、外来人员的出入境检验检疫中该病毒的快速准确检测提供了新技术来源，对提高我国检验检疫机构寨卡病毒的疫情监控和快速检测水平，以及普及先进技术在基层检验检疫机构的推广应用均具有重要意；特别对于血液等特殊样品的检测，此方法解决了从血液等特殊样品中病毒的获取、富集的难题，有效的解决了由于病毒窗口期短，利用普通检测方法如PCR、多重荧光定量PCR、LAMP等方法检出率低的问题。
附图说明
图1A为构建好的pET-32a-NS1原核表达载体的菌液PCR结果；图1B为表达纯化重组ZIKV-NS1蛋白；
图2A为9株抗ZIKV-NS1小鼠腹水和兔多抗血清的免疫荧光结果；图2B为9株抗ZIKV-NS1小鼠腹水和兔多抗血清的ELISA检测结果；
图3A为兔多抗血清检测重组蛋白表达的WesternBlot结果；图3B为兔多抗血清识别天然的NS1蛋白的WesternBlot结果；图3C为单抗1F12识别天然的NS1蛋白的WesternBlot结果
图4A为9株单抗腹水标记HRP进行ELISA活性检测结果；图4B为兔多抗（R1）与9株标记抗体各自组合配对结果；
图5A为兔多抗R1的效价；图5B为单抗腹水1F12的效价；
图6A为兔多抗R1，鼠单抗1F12亲和力曲线；图6B为兔多抗（R1）和单抗腹水（1F12）纯化后进行SDS-PAGE验证结果；
图7为兔多抗R1最适包被缓冲液的优化结果；
图8为兔多抗R1最适包被温度、时间的优化结果；
图9为兔多抗R1最适工作浓度结果；
图10为鼠单抗1F12最适工作浓度；
图11为抗原最适孵育温度、时间的优化；
图12为信号抗体最适孵育温度、时间的优化；
图13为双抗夹心ELISA的特异性检测结果，曲线1为ZIKV-NS1蛋白，曲线2为ZIKV，曲线 3-6依次为DEN-1、DEN-2、DEN-3、JEV，曲线7为空白对照；
图14为双抗夹心ELISA的灵敏度检测结果，曲线1-13分别代表500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、1.95、0.98、0.49、0.24、0.12μg/mL，曲线14阴性对照；
图15为所建立双抗夹心ELISA的标准曲线。
图16为双抗夹心ELISA检测ZIKV感染Vero、BHK细胞培养上清；A图为双抗夹心ELISA检测Vero、BHK细胞培养上清OD450nm吸光度值，B图为双抗夹心ELISA检测Vero、BHK细胞培养上清中NS1含量结果；
图17为RT-qPCR检测培养上清中树鼩血清中病毒含量，A图为RT-qPCR检测Vero、BHK细胞培养上清中寨卡病毒RNA含量，B图为RT-qPCR检测寨卡病毒树鼩模型血液中RNA含量；
图18为双抗夹心ELISA检测ZIKV感染Vero、BHK细胞裂解液，A图为双抗夹心ELISA检测Vero、BHK细胞裂解液OD450nm吸光度值，B图为双抗夹心ELISA检测Vero、BHK细胞裂解液中NS1含量结果；
图19为WesternBlot检测感染ZIKV的细胞培养上清及裂解液中的NS1蛋白；
图20为双抗夹心ELISA检测树鼩感染ZIKV后血清中的NS1蛋白，A图为双抗夹心ELISA检测树鼩感染ZIKV后血清OD450nm吸光度值，B图为双抗夹心ELISA检测树鼩感染ZIKV后血清中NS1含量。具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
实施例1：抗ZIKV-NS1特异性多克隆抗体及单克隆抗体的制备
1、抗原的制备
1.1、pET-32a (+)-NS1原核表达载体的构建
从-80℃冰箱取出保存的寨卡病毒（ZIKV，SZ-WIV01），接种于Vero细胞用含有1%血清的RMPI-1640培养基，于细胞培养箱中培养72h；收集上清，12,000×g离心10分钟，弃沉淀，上清用viral DNA/RNA Extraction Kit，提取RNA，利用HiScript® II 1st StrandcDNA Synthesis Kit反转录成cDNA。以寨卡病毒的cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行验证，将符合预期结果的目的条带用琼脂糖凝胶电泳DNA胶回收；将胶回收的产物连接到pMD-19T载体，将菌夜涂布于氨苄平板37℃培养过夜，挑取单菌落进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测后，转化到JM109感受态细胞。挑取氨苄抗性的LB平板上生长良好的单菌落，以该菌落为PCR模板进行菌落PCR检测。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，将与预期条带大小一致的PCR产物送昆明硕擎生物科技有限公司测序。测序结果为阳性菌落，BLAST序列比对一致。将测序正确的菌液进行扩大培养，然后用质粒小提取试剂盒进行提质粒的提取。用EcoR I 和Xho I同时将测序正确的阳性质粒和pET-32a空载体进行双酶切，然后进行连接构建pET-32a (+)-NS1重组质粒。
结果：琼脂糖凝胶电泳结果表明（图1A），菌液PCR扩增得到了1056bp的条带，菌液PCR结果，证明已经成功构建了NS1蛋白重组表达载体。
1.2、ZIKV-NS1蛋白的诱导、表达、纯化
将上一步构建好的pET-32a-NS1表达载体的的菌液接种于150mL含有氨苄青霉素LB培养基中，37℃，180转/分钟，进行扩大培养至菌液OD600为0.8左右。取上述扩大培养的菌液5mL菌液保存备用，作为对照；然后加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，22℃诱导12h；诱导完成后，13400×g，4℃，离心10min收集菌沉淀；收集的菌体用PBS洗涤3次后，13400×g，4℃，离心10min收集菌沉淀；然后加入适量的PBS重悬菌体，此外以未加诱导剂的pET-32a-NS1/BL21作为对照。将上述菌体进行12%SDS-PAGE电泳验证是否诱导出ZIKV-NS1重组蛋白。将已经诱导成功的菌体，在冰上进行细胞破碎；破碎条件如下：超声工作时间3s，间隙时间5s，总工作时间20min；将破碎后的菌液13400×g，4℃，离心10min收集菌沉淀，用8M尿素在4℃条件下处理4h后，用镍柱纯化系统进行纯化。
结果：SDS-PAGE结果表明，经过IPTG的诱导目的蛋白得到了大量的表达（图1B泳道1），而在未加入ITPG的菌液未能表达出目的蛋白（图1B泳道2）。诱导后的蛋白经过亲和层析柱纯化后得到了分子量为58KD的单一条带（图1B泳道3）。
2、抗ZIKV-NS1兔多克隆抗体的制备
白兔免疫：取出已测好浓度的重组ZIKV-NS1蛋白，按照每只兔子1mg蛋白的量进行免疫；将1mg的蛋白溶于500μL的无菌PBS中然后加入等体积的佐剂，在漩涡震荡器上混匀1h，然后用注射器吹吸混匀后皮下多点注射；14天后重复该实验，多次免疫后，采取耳缘静脉血进行抗血清效价的检测；当抗血清的效价达到实验标准，进行一次加强免疫后颈部动脉大量取血；获得多抗血清用protein A Sepharose柱进行纯化。
结果：新西兰白兔第四次免疫3天后，大量的采取兔子血，分离血清，进行纯化；纯化后的抗体分别进行SDS-PAGE、ELISA、IFA验证；SDS-PAGE结果表明（图6B）多克隆抗体已经被顺利纯化；ELISA表明（图2B）纯化后的多克隆抗体能与重组ZIKV-NS1蛋白反应；IFA结果表明（图2A）所制备的兔多克隆抗体能与天然的ZIKV-NS1蛋白反应；图3A是兔多抗血清检测重组蛋白表达的WesternBlot结果，泳道1为未诱导的菌液蛋白，泳道2位诱导后菌液蛋白，泳道3位纯化后蛋白。
3、小鼠单克隆抗体的制备
3.1、小鼠的免疫
取100μL制备好的抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行混合后进行第一次免疫；第一次免疫14天后进行第二次免疫，取100μL制备好的抗原与等体积的弗氏不完全佐剂进行混合候免疫；第三次免疫与第二次相同，间隔14天。第三次免疫后取100μL制备好的抗原进行尾静脉加强免疫。
3.2、细胞融合筛选阳性克隆
加强免疫3天后，收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合，用含有20%血清的HAT培养基培养融合的细胞，一周后半量更换HT培养基；细胞融合12后天进行第一次ELISA检测，取阳性孔进行第一次亚克隆；第一次亚克隆14天，进行第二次ELISA检测，取阳性孔进行第二次亚克隆；第二次亚克隆14天，进行第三次ELISA检测；如果经过3次亚克隆后，ELISA检测结果均为阳性，则说明已经成为单克隆，扩大培养后冻存于液氮中。
3.3、制备及纯化腹水
取3只6-7周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL的无菌液体石蜡，一周后每只小鼠腹腔注射108个杂交瘤细胞；一周后，进行腹水的收集；利用protein A Sepharose柱进行腹水中抗体的纯化。
结果：经过3轮亚克隆，成功筛选出9株抗ZIKV-NS1的单抗细胞株命名为2A7、4G6、3F1、1F4、3G12、2C4、1G2、2C9、1F12；所制备的腹水分别进行ELISA和IFA验证；ELISA结果显示（图2B），9株单抗腹水均能与重组ZIKV-NS1反应；IFA结果显示（图2A）所制备的鼠单克隆抗体能与天然的ZIKV-NS1蛋白反应。
实施例2：双抗夹心ELISA检测方法的建立
1、HRP-2A7、4G6、3F1、1F4、3G12、2C4、1G2、2C9、1F12探针的制备
1) 将5mg HRP溶于0.5mL 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5mL 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；
2) 加0.75mL 0.1mol/L Na2CO3混匀；
3) 加入0.75mL小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等 (15mg/mL) ，混匀；
4) 称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5mL注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用 (避光) 3小时或4℃过夜；
5) 用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20体积新鲜配制的5mg/mLNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟; 再加入3/20 NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时 (或4℃过夜) ；
6) 将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B (2.6×50cm) 层析纯化，分管收集；
7)HRP-抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放；
结果：成功制备标记HRP的2A7、4G6、3F1、1F4、3G12、2C4、1G2、2C9、1F12探针，其用ELISA检测其活性结果如图4A所示。
2、寻找配对抗体
将纯化好的抗ZIKV-NS1兔多克隆抗体R1用CBS缓冲液稀释至终浓度为10μg/mL，然后每孔加入100μL，于37℃包被10h；包被完成后，PBS-T洗涤2次后，每孔加入200μL的5%的脱脂奶封闭2h；然后每孔加入2μg重组的NS1蛋白37℃孵育2h；弃上清，每孔加入100μL HRP标记的2A7、4G6、3F1、1F4、3G12、2C4、1G2、2C9、1F12，37℃反应1h；弃上清，每孔用PBS-T洗涤5次后，各加入100μL显色液避光反应15min；最后每孔加入50μL 2M H2SO4，终止反应，在450nm处测吸光度。
结果：成功找到4组配对抗体，其中R1+1F12组合效果最好，配对结果如图4B；抗体R1、1F12被顺利纯化，SDS-PAGE结果如图6B，ELISA对其效价进行测定如图5A和5B，其亲和力曲线如图6A；Western Blot 结果进一步证明抗体R1、1F12能识别天然的NS1蛋白，其结果如图3B、3C。
3、双抗夹心ELISA反应体系的优化
1、捕获抗体最佳工作缓冲液的确定
为了确保捕获抗体的最佳工作环境，分别用PBS、CBS、TBS三种缓冲液对捕获抗体进行稀释，进行ELISA，具体步骤如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
包被捕获抗体：将兔多克隆抗体用PBS、CBS、TBS分别稀释至10μg/mL，然后每孔加入100μL的抗体于37℃包被2h；
Figure DEST_PATH_IMAGE004
封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
Figure DEST_PATH_IMAGE006
加入抗原：封闭完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用PBS稀释至10μg/mL重组ZIKV-NS1蛋白，于37℃反应2h；
Figure DEST_PATH_IMAGE008
加入酶标抗体：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用封闭液稀释的HRP-1F12（1:1000），于37℃反应1h；
Figure DEST_PATH_IMAGE010
显色：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL TMB，于37℃反应20min；
Figure DEST_PATH_IMAGE012
终止：每孔加入50μL 2M H2SO4终止，然后在酶标仪上读取OD450；
结果：ELISA的结果表明，当包被液为CBS是同等浓度下R1的工作效果最高，如图7所示。
2、捕获抗体最佳包被温度、时间的确定
为了确保捕获抗体的最佳包被温度、包被时间，包被温度分采用37℃、4℃进行优化；包被时间0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h，具体步骤如下：
Figure 546948DEST_PATH_IMAGE002
包被捕获抗体：将兔多克隆抗体用CBS稀释至10 μg/mL，然后每孔加入100μL的抗体于37、4 ℃包被0.25-3h；
Figure 870613DEST_PATH_IMAGE004
封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
其余步骤同上；
结果：根据不同包被温度，不同包被时间的ELISA结果发现，捕获抗体的最佳包被温度为37℃，最佳孵育时间为2h（图8）。
3、捕获抗体、标记抗体最佳工作浓度的确定
考虑到试剂盒的成本，分别对捕获抗体、标记抗体最佳工作浓度进行确定，具体步骤如下：
Figure 181508DEST_PATH_IMAGE002
包被捕获抗体：将兔多克隆抗体用CBS稀释至（150 μg/mL -0.015 μg/mL），然后每孔加入100μL的抗体于37℃包被2h；
Figure 842297DEST_PATH_IMAGE004
封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
Figure 813926DEST_PATH_IMAGE006
加入抗原：封闭完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用PBS稀释至10μg/mL重组ZIKV-NS1蛋白，于37℃反应2h；
Figure 167547DEST_PATH_IMAGE008
加入酶标抗体：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用封闭液稀释的HRP-1F12（300μg/mL-0.146 μg/mL），于37℃反应1h；
其余步骤同上；
结果：根据双抗夹心ELISA结果显示捕获抗体（R1）的最适包被量为10μg/mL（图9），信号抗体的最适工作浓度为15μg/mL（图10）。
4、抗原最佳孵育温度、时间的确定
系统优化抗原的最佳孵育温度、时间是提高双抗ELISA的灵敏度与效率的关键。因此，孵育温度分别采用37℃、4℃；孵育时间分别采用0.5h、1h、1.5h、2h、3h进行优化，具体步骤如下：
Figure 575526DEST_PATH_IMAGE002
包被捕获抗体：将兔多克隆抗体用CBS稀释至10μg/mL，然后每孔加入100μL的抗体于37℃包被2h；
Figure 305584DEST_PATH_IMAGE004
封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
Figure 630255DEST_PATH_IMAGE006
加入抗原：封闭完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用PBS稀释至10μg/mL重组ZIKV-NS1蛋白于37℃、4℃；孵育时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、3h。其余步骤同上；
结果：根据不同温度下不同孵育时间的ELISA结果发现，抗原最佳孵育温度为37℃，最佳孵育时间为2h（图11）。
3.5、信号抗体（1F12-HRP）最佳孵育温度、时间的确定
信号抗体充分与抗原结合形成双抗夹心的“三明治”结构，是保证双抗夹心ELISA的阳性的前提。因此，摸索信号抗体与抗原完全结合的条件是充分必要的。本实验从温度及孵育时间进行优化。优化的条件如下：孵育温度分别采用37℃、4℃；孵育时间分别采用0.5h、1h、1.5h、2h、3h进行优化，具体步骤如下：
Figure 889198DEST_PATH_IMAGE002
包被捕获抗体：将兔多克隆抗体用CBS分别稀释至10μg/mL，然后每孔加入100μL的抗体于37℃包被2h；
Figure 174686DEST_PATH_IMAGE004
封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
Figure 318223DEST_PATH_IMAGE006
加入抗原：封闭完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用PBS稀释至10μg/mL重组ZIKV-NS1蛋白于37℃孵育2h；
Figure 107187DEST_PATH_IMAGE008
加入信号抗体：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL，终浓度为15μg/mL用封闭液稀释的HRP标记的抗ZIKV-NS1鼠单抗，于37℃、4℃分别反应0.5h、1h、1.5h、2h、3h；
其余步骤同上；
结果：根据不同孵育温度及孵育时间的ELISA结果可以看出，信号抗体（1F12-HRP）的最适孵育温度为37℃，孵育时间为1h（图12）。
实施例3：双抗夹心ELISA的特异性、灵敏度评价
1、包被
将兔多克隆抗体用CBS分别稀释至终浓度为10 μg/mL，然后每孔加入100μL的抗体于37℃包被2h；
2、封闭
包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
3、加入抗原
将重组NS1蛋白或者灭活的病毒培养上清于37℃孵育2h。
3、加入酶标抗体
反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL用封闭液稀释的HRP-1F12单抗（1:1000），于37℃反应1h；
4、显色
孵育结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL TMB，于37℃反应20min；
5、终止
每孔加入50μL 2M H2SO4终止，然后在酶标仪上读取OD450；
6、特异性检测
分别将加入100μL ZIKV-NS1蛋白、ZIKV、DEN-1、、DEN-2、DEN-3、JEV按照实施例3步骤3进行；
结果：从双抗夹心ELISA结果可以看出，建立的双抗夹心ELISA能特异的与ZIKV-NS1蛋白、ZIKV反应，其特异性的可视化结果及全波长扫描结果如图13所示；
7、灵敏度检测
分别将重组的ZIKV-NS1蛋白用ddH2O从500μg/mL-0.12 μg/mL进行梯度稀释，然后，各取100μL用于双抗夹心ELISA测试；从图14可以看出双抗夹心ELISA的最低检测线为12ng；图15为双抗夹心ELISA检测ZIKV-NS1的标准曲线。
实施例4：双抗夹心ELISA检测模拟临床样本
1、模拟样本的制备
1.1体外样本的制备
利用寨卡病毒按照MOI=1分别感染Vero、BHK细胞。Vero、BHK细胞分别维持在含1%血清的RMPI-1640培养基中；同时设置对照细胞除了不加病毒其余均相同，然后分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h收集培养上清、细胞裂解液；分别进行双抗夹心ELISA、WesternBlot检测；同时利用RT-qPCR用于检测不同感染时间Vero、BHK细胞上清病毒RNA含量；
1.2ZIKV感染树鼩，制备临床样本
因为树鼩其亲缘关系与灵长类最接近（约93.4%），在组织解剖学、生理学、生物化学、神经系统（脑功能）、代谢系统和免疫系统等方面与人类近似。利用本实验所建立的ZIKV树鼩动物模型，进一步验证本实验所建立的双抗夹心ELISA的实际应用能力。取健康的树鼩2只，分别在皮下接种2×106pfu ZIKV，然后分别在1-12d进行尾静脉取血，分别取血清进行双抗夹心ELISA、RT-qPCR检测。
2、模拟样本的捕获
将包被上兔多克隆抗体R1的96孔板，加入步骤11.1中预处理好的样品，轻轻混匀后于37℃，100转/分钟反应2h；然后进行弃上清，用PBS-T洗涤3次；
3、加入HRP-1F12探针
每孔加入100μL的HRP-1F12探针（1:1000）于37℃反应1h；
4、显色反应
弃上清，用PBS-T洗涤5次后，加入100μL的TMB显色液，37℃反应15分钟；
5、终止反应
每孔加入50μL的终止液（2M H2SO4），在450nm处测其吸光值；
6、双抗夹心ELISA结果分析
从图16A、16B、18A、18B检测结果可以看出，在感染24h后，所建立的双抗夹心ELISA能快速的检测出感染ZIKV细胞上清及细胞裂解液中的NS1蛋白。WesternBlot结果验证了在细胞上清及细胞裂解液中的NS1蛋白（图19）；RT-qPCR也进一步证明细胞上清中的ZIKV的存在（图17A）；此外，为了进一步模拟临床检测寨卡病毒。本实验利用最小的类人灵长类-树鼩建立寨卡动物模型，分别对不同感染时期树鼩的血清中的NS1蛋白进行检测。通过对不同感染时期树鼩的血清中的NS1蛋白进行检测，发现当树鼩感染寨卡病毒2天后就可以在血清中检测出NS1蛋白，血清中的NS1蛋白直到第9天才不能被检测出来（图20A、B）。同时RT-qPCR也用于寨卡病毒的检测，核酸检测结果发现血清中的寨卡病毒RNA，只能在1-3天被检测出来（图17B）；通过比较我们发现，本实验建立的双抗夹心ELISA能够在2-8天内检测出感染寨卡病毒的树鼩血清中的寨卡病毒，而RT-qPCR只能检测出1-3天。因此，所建立的双抗夹心ELISA更能准确快速的检测寨卡病毒。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种单克隆抗体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 110
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Val Trp Thr Gly Ala Ala Asp Ser Ser
20 25 30
Leu Phe Gln Gly Ala Leu Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Leu Glu Asn Ser Gln Val Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Trp Ile
85 90 95
Thr Thr Ser Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Tyr Leu
100 105 110
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Leu Leu His Tyr Asn
20 25 30
Ser Asn Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ile Trp Gly Cys Ser Asn Val Ala Ala Thr Ser Asp Phe Gln Ile Tyr
50 55 60
Asp Phe Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Gly Tyr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115

Claims (3)

1.一种单克隆抗体1F12，包含轻链和重链，其特征在于：轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，该单克隆抗体1F12能够特异性地 识别寨卡病毒的NS1蛋白。
2.一种寨卡病毒NS1蛋白双抗夹心ELISA检测试剂，其特征在于：包括识别寨卡病毒NS1蛋白的多克隆抗体R1、标记辣根过氧化物酶的权利要求1所述的鼠单克隆抗体1F12。
3.根据权利要求2所述的寨卡病毒NS1蛋白双抗夹心ELISA检测试剂，其特征在于：多克隆抗体R1是从免疫寨卡病毒NS1蛋白的兔子血清中纯化获得。
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