CN112980805A

CN112980805A - 一种重组寨卡病毒减毒株及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112980805A
Application number: CN202110214252.4A
Authority: CN
Inventors: 冯立强; 陈凌; 叶贤苗
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2021-02-25
Filing date: 2021-02-25
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2041-02-25
Also published as: CN112980805B

Abstract

本发明涉及一种重组寨卡病毒减毒株，所述重组寨卡病毒减毒株至少存在以下一种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸，还公开了重组寨卡病毒cDNA、重组寨卡病毒表达蛋白、重组表达载体及重组寨卡病毒减毒株在制备重组寨卡病毒疫苗中的应用。本发明所制备得到的重组寨卡病毒减毒株能够在体外细胞水平稳定复制，实验表明其具有明显的减毒特征，同时该重组寨卡病毒减毒株具有良好的免疫原性，其诱导的抗体可抑制寨卡病毒的感染，具有良好的保护作用，预测其可作为减毒活疫苗进行后续临床研究及应用。

Description

一种重组寨卡病毒减毒株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组寨卡病毒减毒株及其制备方法和应用。

背景技术

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是一种蚊媒传播的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科。大多数人感染ZIKV通常是无症状的或仅引起轻微症状，如皮疹，发烧，关节痛和结膜炎。2013年，法属波利尼西亚爆发了大规模的ZIKV感染，随后蔓延至美洲，太平洋，东南亚和非洲的80多个国家和地区。ZIKV的感染与严重的神经系统症状有关，例如婴儿的小头畸形和成人的格林巴利综合症。尽管疫情已逐渐下降，但全球仍有近61个国家散布着埃及伊蚊的有效传播媒介，这些国家仍存在爆发寨卡疫情的巨大隐患。当前，没有临床可用的ZIKV疫苗与药物。几种候选疫苗正在接受临床前和临床试验，但均未获得临床许可。因此，仍需要安全有效的ZIKV疫苗。

ZIKV基因组编码一个大的多聚蛋白，该蛋白被剪切成三个结构蛋白和七个非结构蛋白。包膜蛋白(envelope protein，E)介导病毒附着并进入宿主细胞。大多数候选疫苗主要针对E蛋白，因为E蛋白包含中和抗体的主要表位。然而，由于黄病毒E蛋白在氨基酸序列和结构上的相似性，针对一种黄病毒E蛋白的抗体可能会通过Fcγ受体(FcγR)介导途径增强自身或另一种黄病毒的感染即抗体依赖增强效应(antibody-dependent enhancedeffect,ADE)，特别是当抗体没有中和活性或处于中和浓度以下时。非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)在病毒复制，致病性和免疫逃逸中起着重要作用。靶向NS1的抗体和T细胞已显示具有对ZIKV感染的保护作用。重要的是，NS1不存在于病毒颗粒外壳上，因此NS1特异性抗体不太可能引起ADE效应。因此，理想的ZIKV疫苗应可诱导针对E和NS1蛋白的保护性免疫反应。

减毒活疫苗有可能引发针对多种抗原(包括E和NS1)的保护性免疫。目前，已经使用ZIKV的prM和E基因替换了黄病毒(yellow fever virus,YFV)或日本脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)的相应基因，制备了ZIKV减毒活疫苗，或者将ZIKV的E和NS1的编码序列去优化产生了复制能力减弱的ZIKV。衣壳蛋白中9个氨基酸的缺失或3'非翻译区(untranslation region，UTR)中10个核苷酸的缺失减弱了ZIKV的致病性。敲除E或NS1蛋白的糖基化位点也可导致ZIKV减毒。但是，嵌合YFV或JEV的寨卡疫苗可能无法诱导ZIKV NS1特异性免疫应答，因为它们表达YFV或JEV的NS1蛋白。携带去优化的密码子或序列缺失的ZIKV减毒活疫苗可诱导针对E和NS1蛋白的免疫反应，但它们的生长能力通常在已批准用于疫苗生产的非洲绿猴Vero细胞等细胞系中显著降低。因此，研制可大量扩增的减毒活疫苗至关重要。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种重组寨卡病毒减毒株，该重组寨卡病毒减毒株具有较好的免疫原性，具有明显的减毒特征，且在Vero细胞中高滴度扩增。其可作为减毒活疫苗进行后续临床研究及应用。

实现上述目的的具体技术方案如下：

一种重组寨卡病毒减毒株，该重组寨卡病毒减毒株至少存在以下一种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸。

在其中一些实施例中，上述重组寨卡病毒减毒株存在以下三种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸。

在其中一些实施例中，上述重组寨卡病毒减毒株的cDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示，或如SEQ ID NO.18所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，但能编码相同蛋白质的核苷酸序列。

本发明的目的之二在于提供一种重组寨卡病毒cDNA，所述重组寨卡病毒减毒株的cDNA为野生型寨卡病毒cDNA且所编码蛋白中存在以下至少一种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸的核苷酸序列；或所述重组寨卡病毒cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，或如SEQ ID NO.18所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，但能编码相同蛋白质的核苷酸序列。

本发明的目的之三在于提供一种重组寨卡病毒表达蛋白。

实现上述目的的具体技术方案如下：

一种重组寨卡病毒表达蛋白，所述重组寨卡病毒表达蛋白为上述重组寨卡病毒株所表达的蛋白；或其为上述重组寨卡病毒cDNA翻译的蛋白。

本发明的目的之四在于提供一种重组表达载体。

实现上述目的的具体技术方案如下：

一种重组表达载体，所述重组表达载体上插入有上述重组寨卡病毒cDNA；

一种重组表达载体，所述重组表达载体上插入可用于表达上述重组寨卡病毒表达蛋白的基因。

本发明的目的之五在于提供一种重组寨卡病毒减毒株的制备方法。

实现上述目的的具体技术方案如下:

(1)在野生型的寨卡病毒的NS2A和NS5之间插入了NS2A的3'区域到NS5的5'区域的片段，通过体外连接构建寨卡病毒cDNA克隆pVAX-GZ02-Intron；

(2)以pVAX-GZ02-Intron为模板，以序列如SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.15所示的引物对进行PCR获得5’UTR-optE片段，以序列如SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.17所示的引物对进行PCR获得optNS1-NS2A片段；通过overlap PCR融合片段5’UTR-optE和片段optNS1-NS2A，得到5’UTR-NS2A片段，并将其连接得到携带重组寨卡病毒cDNA全长的重组克隆pVAX-GZ02；

(3)将上述重组克隆pVAX-GZ02转染仓鼠肾细胞，拯救获得cDNA序列如SEQ IDNO.18所示的重组寨卡病毒减毒株。

在其中一些实施例中，上述pVAX-GZ02-Intron为通过overlap PCR技术构建了从5'UTR到NS2A的5'区域的片段，以及NS5的3'区域和3'UTR，在NS2A和NS5之间插入了NS2A的3'区域到NS5的5'区域的片段，通过体外连接构建而得；

在其中一些实施例中，上述pVAX-GZ02-Intron的制备包括如下步骤：

(1)以序列如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示核苷酸片段为模板，以序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的引物对进行融合PCR获得插入内含子的optENS1片段；

(2)将序列如SEQ ID NO.5所示的野生型寨卡病毒A片段,序列如SEQ ID NO.6所示B片段与线性化载体pVAX三片段同源重组，形成pVAX-AB质粒；

(3)以pVAX-AB质粒作为模板，以序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示的引物对进行PCR线性化pVAX-AB，通过pVAX-AB与optENS1片段进行两片段重组形成pVAX-optENS1质粒；

(4)通过反转录并进行PCR扩增得到序列如SEQ ID NO.13所示的NS2A-NS5核苷酸片段；通过酶切并连接pVAX-optENS1质粒和NS2A-NS5片段，获得携带寨卡病毒基因组全长的质粒pVAX-GZ02-Intron。

本发明的目的之五在于提供一种重组寨卡病毒减毒株，和/或上述重组寨卡病毒cDNA，和/或上述重组寨卡病毒表达蛋白，和/或上述重组表达载体在制备重组寨卡病毒疫苗中的应用。

本发明的目的之六在于提供一种重组寨卡病毒减毒活疫苗。

实现上述目的的具体技术方案如下：

一种重组寨卡病毒疫苗，所述重组寨卡病毒疫苗中含有活性成分和辅料，所述活性成分包括上述重组寨卡病毒减毒株，和/或上述重组寨卡病毒cDNA，和/或上述重组寨卡病毒表达蛋白，和/或上述重组表达载体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的发明人在研发中获得了一种重组寨卡病毒减毒株，通过研究发现该重组寨卡病毒减毒株存在以下非同义突变且其决定了该重组寨卡病毒减毒株具有明显的减毒特征：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸。本发明所制备得到的重组寨卡病毒减毒株能够在体外细胞水平稳定复制、并能在Vero细胞中生长至较高滴度。实验表明其具有明显的减毒特征，同时该重组寨卡病毒减毒株具有良好的免疫原性，其诱导的抗体可抵抗寨卡病毒的感染，具有良好的保护作用，预测其可作为减毒活疫苗进行后续临床研究及应用。

附图说明

图1为实施例1中重组寨卡病毒构建模式图。

图2为实施例1中GZ02、rGZ02p和rGZ02a氨基酸序列局部对比图。

图3为实施例1中重组型ZIKVs在细胞水平的特征图，其中A为重组型ZIKVs在Vero细胞中形成噬斑图；B为重组ZIKVs在Vero细胞中的生长曲线图；C为重组ZIKVs在细胞培养上清中的生长曲线图。

图4为实施例2中重组ZIKVs在新生C57BL/6小鼠中的致病性图。其中A为ZIKVs攻毒方案示意图；B为ZIKVs攻毒后新生小鼠的体重变化；C为ZIKVs攻毒后新生小鼠的存活率统计图；D为小鼠的神经系统症状评分统计图；E为攻毒后16天，新生鼠大脑中的病毒基因组拷贝数统计图。

图5为实施例3中减毒株rGZ02a在C57BL/6小鼠中的免疫原性和对新生鼠的保护效果图。其中A为孕妇免疫加新生儿攻毒模型的示意图；B为免疫血清中的E蛋白特异性IgG抗体滴度检测结果统计图和免疫血清中NS1特异性IgG抗体的滴度统计图；C为小鼠血清的IC50滴度统计图；D为减毒株rGZ02a的病毒蚀斑减少实验结果统计图。

图6为实施例3中重组ZIKVs在新生C57BL/6小鼠中的致病性图。其中A为ZIKVs攻毒后新生小鼠的体重变化；B为ZIKVs攻毒后新生小鼠的存活率统计图；C为小鼠的神经系统症状评分统计图；D为攻毒后16天，新生鼠大脑中的病毒基因组拷贝数统计图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

ZIKV基因组全长cDNA在细菌中具有极大毒性，极易造成携带全长cDNA的质粒发生插入或者缺失突变，这严重阻碍了ZIKV的反向遗传系统建立。我们使用了两种策略来克服这种毒性。具体实施方案如下：

方案1：

根据哺乳动物偏爱使用的密码子，优化了ZIKV GZ02(GenBank NO.KX056898.1)的E和NS1编码序列。将一个内含子插入到E的3'末端(在1495位核苷酸之后的位置)。通过overlap PCR技术构建了从5'UTR到NS2A的5'区域的片段，以及NS5的3'区域和3'UTR。将HDVR序列与3'UTR融合，以精确产生3'末端。在NS2A和NS5之间插入了NS2A的3'区域到NS5的5'区域的片段。获得高拷贝质粒pVAX-GZ02-Intron可在大肠杆菌细胞中稳定扩增。将pVAX-GZ02-Intron转染到BHK-21和HEK293中。在Vero细胞中5次传代之后，成功地拯救了1种重组型ZIKV，称为rGZ02p。其具体实验步骤如下所示：

1.以合成哺乳动物偏爱的optE(SEQ ID NO.1)和optNS1(SEQ ID NO.2)编码序列为模板，以optME-F(gtgaagcacggagatctagaagggctgtgaccctgccatc,SEQ ID NO.3)与optNS1-R(tggtccatgtgatcagtggagccagctgtcaccatggac,SEQ ID NO.4)为引物进行融合PCR，获得插入内含子的optENS1片段；其中PCR体系如下：

反应程序：

25cycles

72℃延伸 5min

12℃保存。

2.以合成含有5'UTR到NS2A的5'区域(A片段，SEQ ID NO.5)和NS5的3'区域到3'UTR的片段(B片段，SEQ ID NO.6)；以pVAX-F(tggggaaatccatgggtcttggccggcatggtccc，SEQID NO.7)与pVAX-R(tcacacagatcaacaacttgcatggtgctggagctcg，SEQ ID NO.8)为引物，PCR线性化携带HDVR的pVAX载体(Invitrogen)，通过A,B与pVAX三片段同源重组，形成pVAX-AB质粒；其中重组体系如下：

按照反应体系混匀，置37℃反应30min，返回冰上放置5min，转化。

3.以pVAX-AB质粒作为模板，以NS2A-F(actgatcacatggaccacttctcc，SEQ IDNO.9)和prM/M-R(tctagatctccgtgcttcacctt，SEQ ID NO.10)为引物，PCR线性化pVAX-AB，通过pVAX-AB与optENS1片段进行2片段重组形成pVAX-optENS1质粒。

4.以NS5-R为反转录引物，反转录寨卡病毒基因组，以NS2A-F’(actgatcacatggaccacttctcc,SEQ ID NO.12)和NS5-R(ttacagcactccaggtgtagaccct,SEQID NO.11)为引物，PCR获得NS2A-NS5(SEQ ID NO.13)片段；其中反转录体系如下：

混匀65℃温浴5min，立即放置冰上1min,短暂离心；

温和颠倒混匀，短暂离心；

55℃60min；70℃15min；12℃∞

5.通过XhoI与KpnI酶切pVAX-optENS1质粒和NS2A-NS5片段，以solution I连接，转化Top 10感受态，获得如图1A所示的携带寨卡病毒基因组全长的质粒pVAX-GZ02-Intron。

6.按细胞数量比例将BHK-21：HEK293＝1:4混合铺至12孔板中，24h后，以pVAX-GZ02-Intron质粒转染到铺好的细胞板中，每5天后收取上清感染vero细胞，成功获得病毒株rGZ02p。

方案2

在方案1获得的质粒pVAX-GZ02-Intron基础上，通过overlap PCR融合片段5’UTR-optE和片段optNS1-NS2A，得到5’UTR-NS2A片段，并将其连接至携带其余ZIKV基因组cDNA，HDVR和BGH poly A信号的片段，形成如图1B所示携带ZIKV基因组全长cDNA的连接产物。将连接产物转染到BHK-21和HEK293中。在Vero细胞中传代之后，获得重组的ZIKV，称为rGZ02a。具体实验步骤如下所示：

1.以pVAX-GZ02-Intron为模板，以CMV-F(aatggcccgcctggctgacc，SEQ ID NO.14)和optE-R(cctcactgtagcctcaaaggccttgc，SEQ ID NO.15)为引物，PCR获得5’端携带NheI酶切位点的5’UTR-optE片段；其中PCR程序、体系同上。

2.以pVAX-GZ02-Intron为模板，以optNS1-F(cctttgaggctacagtgaggggc，SEQ IDNO.16)和NS2A-R(tggtaccggatccctcgagcc，SEQ ID NO.17)为引物，PCR获得3’端携带XhoI酶切位点的optNS1-NS2A片段。

3.以5’UTR-optE片段和optNS1-NS2A片段为模板，以CMV-F(SEQ ID NO.14)和NS2A-R(SEQ ID NO.17)为引物，overlap PCR获得两端分别携带NheI与XhoI酶切位点的5’UTR-NS2A片段；其中PCR程序、体系同上。

4.通过NheI与XhoI酶切5’UTR-NS2A片段和质粒pVAX-GZ02-Intron，以solution I连接，形成如图1B所示的连接产物pVAX-GZ02。

5.按细胞数量比例BHK-21：HEK293＝1:4混合铺至12孔板中，24h后，以连接产物pVAX-GZ02转染到铺好的细胞板中，每5天后收取上清感染vero细胞，成功获得病毒株rGZ02a。

将上述通过方案1和2获得的重组寨卡病毒株rGZ02p和rGZ02a进行测序，通过全基因组测序，得到rGZ02a的cDNA序列如SEQ ID NO.18所示，rGZ02p的cDNA序列如SEQ IDNO.19所示。经进一步氨基酸序列比对，结果如图2所示，在rGZ02a的E，NS1和NS5基因中有3个独特的非同义突变：E(S304F)，NS1(R103K)和NS5(W637R)。

进一步地，针对上述2株重组寨卡病毒进行重组病毒噬斑筛选实验，并以野生型寨卡病毒株GZ02作为对照。具体病毒噬斑实验步骤如下：

1)准备Vero细胞，消化均匀后调节细胞浓度，以适宜的浓度接种于六孔板中，待细胞长成单层后吸弃培养液。

2)配置稀释液：500ml的1×DMEM+15ml的10％BSA+5.2mlPBS，十倍稀释，五个浓度的病毒液，每孔滴加(600μl)病毒液，37℃下吸附2小时，隔15min晃一下。

3)制备1.2％的低熔点琼脂糖溶液，置40～50℃水浴中待用；

4)弃掉2中病毒液，PBS清洗2遍，将上述琼脂糖溶液与2×细胞维持液按1：1的比例混匀后，加入各培养孔中，3mL/孔，冷却后凝固成覆盖层(避免气泡)；

5)倒置培养板，置于37℃,5％CO2培养箱中培养6天；

6)拿出6孔板，放置于4℃30min，用注射器针头挑掉胶；

7)细胞固定(4％甲醛，500μl/孔)，室温固定15min,PBS清洗(1ml/孔)2-3遍；

8)加入0.5％Trition-X100裂解液(500μl/孔)，室温作用15min,PBS清洗(1ml/孔)3遍；

9)加入一抗8D10(3ug/ml)，500μl/孔)，在摇床上轻摇至少3h(可过夜),回收一抗，PBS清洗(1ml/孔)5遍，3min/遍；

10)加入二抗(HRP鼠抗人以1:1000稀释，500μl/孔)，在摇床上轻摇至少4h,PBS清洗(1ml/孔)5遍，3min/遍；

11)避光加入显色液AEC(500μl/孔)，室温孵育15-30min；

12)回收显色液，PBS洗板2遍。

上述筛选结果如图3A所示，在Vero细胞中，rGZ02p和rGZ02a与野生型毒株GZ02形成了大小相似的噬斑；并且通过跟踪检测病毒株的生长情况，绘制如图3B和C所示的增殖曲线可知，rGZ02p和rGZ02a在Vero细胞中显示出与GZ02类似的增殖曲线，表明它们在该IFN缺陷细胞系中均具有与野生型GZ02相当的繁殖能力。

实施例2

为研究重组ZIKVs在新生C57BL/6小鼠(购买于北京维通利华实验动物技术有限公司)中的致病性，以图4A中ZIKVs攻毒方案示意图所示进行实验。用1.2×10⁴PFU野生型GZ02(n＝14)，重组型rGZ02p(n＝13)或重组型rGZ02a(n＝14)对1日龄的C57BL/6新生仔鼠进行腹腔注射(IP)攻毒。注射PBS的新生鼠作为健康对照(n＝13)。并采用病毒基因组拷贝数检测方法对新生鼠大脑中的病毒含量情况进行进一步检测，具体步骤如下：

使用RNeasy lipid tissue mini kit(Qiagen)提取小鼠脑组织中的寨卡病毒基因组。使用QuantiTect SYBR Green RT-PCR试剂盒(Qiagen)进行一步qRT-PCR。正向引物(NS5F：5'-TGGAGGCTGAGGAAGTTCTAG-3'，SEQ ID NO.20)和反向引物(NS5R：5'-CTTCACAACGCAATCATCTCCACTG-3'，SEQ ID NO.21)。扩增程序设置为：在95℃初始变性10分钟；在95℃,30s，55℃,30s，72℃,30s，进行40个循环；在65℃到95℃时产生熔解曲线，每个循环每5s升高0.5℃。通过体外转录产生的NS5区的ZIKV RNA片段的系列稀释液构建标准曲线。检测线是每克脑组织1×10⁴拷贝。病毒载量计算为每克脑组织的ZIKV基因组拷贝数。

我们的数据表明，在1.2×10⁴PFU每只仔鼠的剂量下，三种寨卡病毒株GZ02、rGZ02p或rGZ02a以腹腔注射方式攻毒1日龄的新生鼠，攻毒后每天称仔鼠体重与观察仔鼠的症状，其中将严重体重减轻(＜健康对照体重的75％)的新生鼠认定为死亡。结果如图4B所示rGZ02a攻毒的仔鼠与健康新生鼠具有相似的生长能力，而rGZ02p或GZ02感染的新生鼠出现严重的生长迟缓。在攻毒后第16天，如图4C所示rGZ02a感染的新生鼠均存活，超过60％的rGZ02p感染和70％的GZ02感染的新生鼠出现死亡。并且如图4D所示，感染rGZ02a的新生鼠没有或仅有轻度的神经系统疾病，但是大多数感染rGZ02p或GZ02的新生鼠显示出严重的神经系统异常症状，这表明rGZ02a不会对新生儿神经系统造成严重损害。新生鼠大脑中的病毒基因组拷贝数检测结果如图4E所示，rGZ02a感染的新生鼠大脑中的病毒基因组拷贝显着低于rGZ02p或GZ02感染的新生鼠。因此，rGZ02a在新生鼠中致病性显著减弱，表现出了明显的减毒特征。

实施例3

为进一步研究减毒株rGZ02a在C57BL/6小鼠中的免疫原性和对新生鼠的保护效果，以图5A中孕妇免疫加新生儿攻毒模型的示意图进行实验。分别以1.0×10⁴(低),1.0×10⁵(中),1×10⁶(高)PFU rGZ02a(n＝5)或PBS在第0天与第21天对6周龄的雌性C57BL/6小鼠进行皮下注射(SC)初免与加强免疫,在最终免疫后21天，将免疫的雌性小鼠与未免疫的雄性小鼠交配。出生后第1天，用1.2×10⁴PFU野毒GZ02对每组免疫母鼠的新生鼠进行IP攻毒。不攻毒的新生鼠作为健康对照组。加强免疫后2周，通过ELISA检测免疫小鼠血清中E与NS1特异性抗体，评估小鼠血清抗体滴度，检测方法具体如下：

1.包被：1μg/ml的纯化E蛋白或NS1蛋白包被于96孔的PVDF板中；

2.封闭：PBS洗3遍，每孔加入200ul封闭液(5％脱脂奶粉)，每孔加入200ul，室温封闭2h，PBST洗3次，垂直甩干，然后在无菌纸上用力拍干；

3.孵一抗：每孔加入100ul各稀释30倍小鼠血清(5％脱脂奶粉稀释)，然后依次进行3倍稀释；同样稀释梯度的NS1蛋白免疫血清作阳性对照，PBS做阴性对照，37℃孵育2h后，PBST洗3次；

4.孵育辣根过氧化物酶标记的二抗：二抗以1:5000比例用5％脱脂奶粉稀释，每孔100μL，37℃，孵育1.5h后，每次加200ul PBST洗涤，室温摇床5min(最大速度)，用力拍干，PBST洗涤5次；

5.加底物显色液：每孔加入蓝色的100ul TMB溶液(辣根过氧化物酶底物)，放置于室温进行显色反应，避光孵育10min；

6.终止反应：每孔加入1M稀硫酸(100ul)进行终止反应(蓝色变为黄色)，室温避光孵育；

7.测OD值：在酶标仪上检测450nm的OD值。

上述ELISA实验结果经统计学处理，得到统计图5B，显示rGZ02a免疫可诱导较高的E特异性IgG抗体，且具有剂量依赖性；NS1特异性IgG抗体也呈剂量依赖性，表明rGZ02a可诱导对E和NS1的抗体反应。

同时，为了确定抗体应答是否对ZIKV感染具有抑制作用，通过抑制病毒实验将GZ02与小鼠免疫血清孵育，感染Vero细胞，免疫血清存在于培养基中直至检查。具体实验步骤为：

1.铺板：以2.0×10⁴个Vero细胞铺于96孔板中，常规培养24h；

2.血清与病毒共孵育：免疫小鼠血清10倍稀释，然后依次3倍稀释,与MOI＝0.1的寨卡病毒液混匀，在37℃，5％CO2培养箱中孵育1h；

3.将200ul病毒与血清混合液加入细胞板中，72h后，甩掉上清，用PBS洗1遍，用4％多聚甲醛室温固定30min，PBS洗3遍，用0.3％triton-X100破膜液室温破膜20min；

3.封闭：PBS洗3遍，每孔加入200ul封闭液，室温封闭2h，每孔加入200ul PBST洗3次，垂直甩干，然后在无菌纸上用力拍干(封闭液配制：PBS含有5％BSA，0.3％triton-100或者PBS含有5％FBS，0.3％triton-100)。

4.孵一抗：每孔加入100ul 8D10(5％脱脂奶粉稀释成3ug/ml)，PBS做阴性对照，37℃孵育2h后，PBST洗3次；

5.孵育辣根过氧化物酶标记的二抗：二抗以1:5000比例5％脱脂奶粉稀释，每孔100μL，37℃，孵育1.5h后，每次加200ul PBST洗涤，室温摇床5min(最大速度)，用力拍干，PBST洗涤5次；

6.加底物显色液：每孔加入蓝色的100ul TMB溶液(辣根过氧化物酶底物)，放置于室温进行显色反应，避光孵育10min；

7.终止反应：每孔加入1M浓硫酸(100ul)进行终止反应(蓝色变为黄色)，室温避光孵育；

8.测OD值：在酶标仪上检测450nm的OD值。

上述抑制病毒实验结果的相关OD值数据经统计学处理，得到统计图5C，通过基于ELISA的病毒抑制试验评估小鼠血清中的抑制性抗体，表明低剂量rGZ02a免疫诱导了较低的抑制性抗体反应，但中剂量或高剂量免疫诱导了较强的抑制性抗体反应。因此，减毒株rGZ02a诱导的抗体可在细胞水平抑制ZIKV感染。

并且，为了确定抗体应答能否减少ZIKV形成噬斑作用，通过病毒蚀斑减少实验，将GZ02与小鼠免疫血清孵育，感染Vero细胞，然后铺琼脂糖胶。具体实验步骤为：

1.铺细胞板：将30万vero细胞铺于12孔板中24h

2.血清稀释：将血清稀释10倍，再3倍依次稀释，与等体积的病毒液(100PFU/孔)混匀，放置37度，5％CO2培养箱孵育1h；

3.孵育：将混合液加入细胞板中，放置培养箱静置2h；

4.铺胶，放置培养箱72h；

5.固定：扣胶，4％多聚甲醛固定液固定30min，PBS洗3遍

6.破膜：0.05％triton-100破膜20min，PBS洗3遍；

7.孵育一抗：室温孵育8D10单抗(3ug/ml)过夜，PBS洗3遍；

8.孵育二抗：室温孵育山羊抗人的HRP二抗(1:1000)4-5h，PBS洗3遍；

9.显示：用AEC液显色，蒸馏水终止。

上述病毒蚀斑减少实验结果的噬斑值经统计学处理，得到结果图5D，表明低剂量、中剂量或高剂量rGZ02a免疫均可诱导了较高水平抗体反应，可显著减少病毒形成噬斑数量。因此，减毒株rGZ02a诱导的抗体可在细胞水平减少ZIKV活病毒数。

为了确定免疫rGZ02a的母体能否保护新生小鼠，在加强免疫后三周将免疫的雌鼠与未免疫的雄鼠交配。1.2×104PFU野生型毒株GZ02通过IP方式攻毒1日龄新生鼠。未免疫小鼠生产的新生鼠作阴性对照，以图5A所示的孕妇免疫加新生儿攻毒模型构建示意图所示进行实验，其中PBS组小鼠数量n＝17；健康对照组小鼠数量n＝17；rGZ02a组小鼠数量n＝20。攻毒后，通过连续记录各组小鼠体重，经统计形成的结果图6A可知，免疫rGZ02a的母鼠所生的新生鼠没有出现生长迟缓，而未免疫的小鼠所生的新生鼠却出现严重生长迟缓。并通过连续统计各组小鼠的生长情况，形成的生存曲线图6B可知，rGZ02a免疫小鼠所生的所有新生鼠均存活，但未免疫小鼠所生的新生鼠中有近75％出现死亡，这表明rGZ02a诱导的母体抗体可以转移给新生鼠并提供保护。

值得注意的是，通过对小鼠进行跟踪观察评估发现，高剂量免疫的母鼠所生的新生鼠(n＝20)均未出现任何神经系统症状，可提供完全保护作用。相反，如图6C和6D所示，在未免疫小鼠所生的所有新生儿均表现出严重的ZIKV疾病，而中、高剂量免疫的母鼠所生的新生鼠脑组织中未检测到病毒基因组。而在未免疫小鼠出生的新生鼠脑部可检测到高病毒载量(>3×109拷贝/克脑组织)。因此，减毒疫苗rGZ02a免疫孕妇可防止新生鼠脑部感染ZIKV，能够对免疫小鼠和孕鼠起到较好的保护作用。

其中，关于神经系统症状评分标准：对于每个后肢和前肢，神经学评分指定为：0，无体征；1，无力或步态改变；2，轻瘫；3，完全瘫痪。对于尾巴，神经学评分指定为：0，没有体征；1，半麻痹；2，全面瘫痪。新生小鼠的分数计算为每个肢体和尾巴的分数之和。因此，完全瘫痪的动物评分为14分。死亡率等于15分。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

序列表

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 一种重组寨卡病毒减毒株及其制备方法和应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1512

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcaggtgca ttggcgtctc caacagggac tttgtggagg gcatgtctgg cggcacctgg 60

gtggatgtgg tgctggagca tggcggctgt gtgacagtga tggcccagga caagcccaca 120

gtggatattg agctggtgac aactacagtc tctaacatgg ctgaagtgag gtcttattgc 180

tatgaggcct ccatctctga catggcctct gactccagat gccccaccca gggcgaggcc 240

tacctggaca agcagtctga tacacaatat gtctgcaaga ggaccctggt ggacaggggc 300

tggggcaatg gctgtggcct gtttggcaag ggctccctgg tgacctgtgc caagtttgcc 360

tgctccaaaa agatgacagg caagtccatc cagcctgaga acctggagta caggatcatg 420

ctgtctgtgc atggctccca gcactctggc atgattgtga atgacacagg ccatgagacc 480

gatgagaaca gggccaaggt ggagatcacc cccaactccc ctcgggctga ggccaccctg 540

ggcggctttg gctccctggg cctggactgt gagcccagga caggcctgga cttctctgac 600

ctgtactacc tgaccatgaa caacaagcac tggctggtgc acaaggagtg gttccatgac 660

atccccctgc catggcatgc tggcgctgac acaggcaccc cccactggaa caacaaggag 720

gccctggtgg agttcaagga tgcccatgcc aagaggcaga cagtggtggt gctgggctct 780

caagagggcg ctgtgcacac agccctggct ggcgccctgg aggctgagat ggatggcgcc 840

aagggcaggc tgtcctctgg ccatctgaag tgcaggctga agatggacaa gctgaggctg 900

aagggcgtct cctactccct gtgcaccgct gccttcacct tcaccaaaat ccctgctgag 960

accctgcatg gcacagtgac agtggaggtg cagtatgctg gcacagatgg cccatgcaaa 1020

gtgcctgccc agatggctgt ggacatgcag accctgaccc ctgtgggcag gctgatcaca 1080

gccaaccctg tgatcaccga gtccacagag aactccaaga tgatgctgga gctggacccc 1140

ccatttggcg actcctacat tgtgattggc gtgggcgaga agaagatcac ccatcactgg 1200

caccgctctg gctccaccat tggcaaggcc tttgaggcta cagtgagggg cgccaagagg 1260

atggctgtgc tgggcgacac agcctgggac tttggctctg tgggcggcgc cctgaactcc 1320

ctgggcaagg gcatccatca gatctttggc gctgccttca agtccctgtt tggcggcatg 1380

tcctggttct cccaaatcct gattggcacc ctgctgatgt ggctgggcct gaacaccaag 1440

aatggctcca tctccctgat gtgcctggcc ctgggcggcg tgctgatctt cctgtccaca 1500

gctgtctctg cc 1512

<210> 2

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgggctgct ctgtggactt ctccaagaag gagacccgct gtggcacagg cgtctttgtc 60

tacaatgatg tggaggcttg gagggatagg tataagtacc atcctgactc tcctcggagg 120

ctggctgctg ctgtgaagca ggcctgggag gatggcatct gtggcatctc ctctgtctct 180

cggatggaga acatcatgtg gcgctctgtg gagggcgagc tgaatgccat cctggaggag 240

aatggcgtgc agctgacagt ggttgtgggc tctgtgaaga accccatgtg gaggggcccc 300

cagaggctgc ctgtgcctgt gaatgagctg ccccatggct ggaaggcctg gggcaagtcc 360

tactttgtga gggctgccaa gaccaacaac tcctttgtgg tggatggcga caccctgaag 420

gagtgccccc tgaagcacag ggcctggaac tccttcctgg tggaggacca tggctttggc 480

gtcttccaca cctctgtctg gctgaaagtg agggaggact actccctgga gtgtgaccct 540

gctgtgattg gcacagctgt gaagggcaag gaggctgtgc actctgacct gggctactgg 600

atcgagtctg agaagaatga cacctggagg ctgaagaggg cccatctgat tgagatgaag 660

acctgcgagt ggcccaagtc ccacaccctg tggacagatg gcattgagga gtctgacctg 720

atcatcccca agtccctggc tggccccctg tcccatcaca acaccaggga gggctacagg 780

acccagatga agggcccatg gcactctgag gagctggaga tccgctttga ggagtgtcct 840

ggcacaaagg tgcatgtgga ggagacctgt ggcaccaggg gcccatccct gaggtccacc 900

acagcctctg gacgcgtgat tgaggagtgg tgctgcaggg agtgcaccat gcctcccctg 960

tcctttcggg ctaaggatgg ctgttggtat ggcatggaga tcaggcccag gaaggagcct 1020

gagtccaacc tggtgaggtc catggtgaca gctggctcc 1059

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgaagcacg gagatctaga agggctgtga ccctgccatc 40

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggtccatgt gatcagtgga gccagctgtc accatggac 39

<210> 5

<211> 1240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agttgttgat ctgtgtgaat cagactgcga cagttcgagt ttgaagcgaa agctagcaac 60

agtatcaaca ggttttattt tggatttgga aacgagagtt tctggtcatg aaaaacccaa 120

aaaagaaatc cggaggattc cggattgtca atatgctaaa acgcggagta gcccgtgtga 180

gcccctttgg gggcttgaag aggctgccag ccggacttct gctgggtcat gggcccatca 240

ggatggtctt ggcgattcta gcctttttga gattcacggc aatcaagcca tcactgggtc 300

tcatcaatag atggggttca gtggggaaaa aagaggctat ggaaataata aagaagttca 360

agaaagatct ggctgccatg ctgagaataa tcaatgctag gaaggagaag aagagacgag 420

gcgcagatac tagtgtcgga attgttggcc tcctgctgac cacagctatg gcagcggagg 480

tcactagacg tgggagtgca tactatatgt acttggacag aaacgatgct ggggaggcca 540

tatcttttcc aaccacattg gggatgaata agtgttatat acagatcatg gatcttggac 600

acatgtgtga tgccaccatg agctatgaat gccctatgct ggatgagggg gtggaaccag 660

atgacgtcga ttgttggtgc aacacgacgt caacttgggt tgtgtacgga acctgccatc 720

acaaaaaagg tgaagcacgg agatctagaa ctgatcacat ggaccacttc tcccttggag 780

tgcttgtgat cctgctcatg gtgcaggaag ggctgaagaa gagaatgacc acaaagatca 840

tcataagcac atcaatggca gtgctggtag ctatgatcct gggaggattt tcaatgagtg 900

acctggctaa gcttgcaatt ttgatgggtg ccaccttcgc ggaaatgaac actggaggag 960

atgtagctca tctggcgctg atagcggcat tcaaagtcag accagcgttg ctggtatctt 1020

tcatcttcag agctaattgg acaccccgtg aaagcatgct gctggccttg gcctcgtgtc 1080

ttttgcaaac tgcgatctcc gccttggaag gcgacctgat ggttctcatc aatggttttg 1140

ctttggcctg gttggcagta cgagcgatgg ttgttccacg cactgataac atcaccctag 1200

caatcctggc tgctctgaca ccactggctc gagggatccg 1240

<210> 6

<211> 791

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actggctcga gggatccggt accaactggg agaactacct ggtcaatcca tggaaaggga 60

gaatggatga ccactgaaga catgcttgtg gtgtggaaca gagtgtggat tgaggagaac 120

gaccacatgg aagacaagac cccagttacg aaatggacag acattcccta tttgggaaaa 180

agggaagact tgtggtgtgg atctctcata gggcacagac cgcgcaccac ctgggctgag 240

aacattaaaa acacagtcaa catggtgcgc aggatcatag gtgatgaaga aaagtacatg 300

gattacctat ccacccaagt tcgctacttg ggtgaagaag ggtctacacc tggagtgctg 360

taagcaccaa tcttaatgtt gtcaggcctg ctagtcagcc acagcttggg gaaagctgtg 420

cagcctgtga cccccccagg agaagctggg aaaccaagcc tatagtcagg ccgagaacgc 480

catggcacgg aagaagccat gctgcctgtg agcccctcag aggacactga gtcaaaaaac 540

cccacgcgct tggaggcgca ggatgggaaa agaaggtggc gaccttcccc acccttcaat 600

ctggggcctg aactggagat cagctgtgga tctccagaag agggactagt ggttagagga 660

gaccccccgg aaaacgcaaa acagcatatt gacgctggga aagaccagag actccatgag 720

tttccaccac gctggccgcc aggcacagat cgccgaatag cggcggccgg tgtggggaaa 780

tccatgggtc t 791

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggggaaatc catgggtctt ggccggcatg gtccc 35

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcacacagat caacaacttg catggtgctg gagctcg 37

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

actgatcaca tggaccactt ctcc 24

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tctagatctc cgtgcttcac ctt 23

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttacagcact ccaggtgtag accct 25

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

actgatcaca tggaccactt ctcc 24

<210> 13

<211> 6828

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

actgatcaca tggaccactt ctcccttgga gtgcttgtga tcctgctcat ggtgcaggaa 60

gggctgaaga agagaatgac cacaaagatc atcataagca catcaatggc agtgctggta 120

gctatgatcc tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcta agcttgcaat tttgatgggt 180

gccaccttcg cggaaatgaa cactggagga gatgtagctc atctggcgct gatagcggca 240

ttcaaagtca gaccagcgtt gctggtatct ttcatcttca gagctaattg gacaccccgt 300

gaaagcatgc tgctggcctt ggcctcgtgt cttttgcaaa ctgcgatctc cgccttggaa 360

ggcgacctga tggttctcat caatggtttt gctttggcct ggttggcagt acgagcgatg 420

gttgttccac gcactgataa catcacccta gcaatcctgg ctgctctgac accactggct 480

cgaggcacac tgcttgtggc gtggagagca ggccttgcta cttgcggggg gtttatgctc 540

ctctctctga agggaaaagg cagtgtgaag aagaacttac catttgtcat ggccctggga 600

ctaaccgctg tgaggctggt ggaccccatc aacgtggtgg gactgctgtt gctcacaagg 660

agtgggaagc ggagctggcc ccctagcgaa gtactcacag ctgttggcct gatatgcgca 720

ttggctggag ggttcgccaa ggcagatata gagatggctg ggcccatggc cgcggtcggt 780

ctgctaattg tcagttacgt ggtctcagga aagagtgtgg acatgtacat tgaaagagca 840

ggtgacatca catgggaaaa agatgcggaa gtcactggaa acagtccccg gctcgatgtg 900

gcgctagatg agagtggtga tttctccctg gtggaggatg acggtccccc catgagagag 960

atcatactca aggtggtcct gatgaccatc tgtggcatga acccaatagc catacccttt 1020

gcagctggag cgtggtacgt atacgtgaag actggaaaaa ggagtggtgc tctatgggat 1080

gtgcctgctc ccaaggaagt aaaaaagggg gagaccacag atggagtgta cagagtaatg 1140

actcgtagac tgctaggttc aacacaagtt ggagtgggag ttatgcaaga gggggtcttt 1200

cacactatgt ggcacgtcac aaaaggatcc gcgctgagaa gcggtgaagg gagacttgat 1260

ccatactggg gagatgtcaa gcaggatctg gtgtcatact gtggtccatg gaagctagat 1320

gccgcctggg acgggcacag cgaggtgcag ctcttggccg tgccccccgg agagagagcg 1380

aggaacatcc agactctgcc cggaatattt aagacaaagg atggggacat tggagcggtt 1440

gcgctggatt acccagcagg aacttcagga tctccaatcc tagacaagtg tgggagagtg 1500

ataggacttt atggcaatgg ggtcgtgatc aaaaatggga gttatgttag tgccatcacc 1560

caagggagga gggaggaaga gactcctgtt gagtgcttcg agccttcgat gctgaagaag 1620

aagcagctaa ctgtcttaga cttgcatcct ggagctggga aaaccaggag agttcttcct 1680

gaaatagtcc gtgaagccat aaaaacaaga ctccgtactg tgatcttagc tccaaccagg 1740

gttgtcgctg ctgaaatgga ggaggccctt agagggcttc cagtgcgtta tatgacaaca 1800

gcagtcaatg tcacccactc tggaacagaa atcgtcaact taatgtgcca tgccaccttc 1860

acttcacgtc tactacagcc aattagagtc cccaactata atctgtatat tatggatgag 1920

gcccacttta cagatccctc aagtatagca gcaagaggat acatttcaac aagggttgag 1980

atgggcgagg cggctgccat cttcatgacc gccacgccac caggaacccg tgacgcattt 2040

ccggactcca actcaccaat tatggacacc gaagtggaag tcccagagag agcctggagc 2100

tcaggctttg attgggtgac ggatcattct ggaaaaacag tttggtttgt tccaagcgtg 2160

aggaacggca atgagatcgc agcttgtctg acaaaggctg gaaaacgggt catacagctc 2220

agcagaaaga cttttgagac agagttccag aaaacaaaac atcaagagtg ggactttgtc 2280

gtgacaactg acatttcaga gatgggcgcc aactttaaag ctgaccgtgt catagattcc 2340

aggagatgcc taaagccggt catacttgat ggcgagagag tcattctggc tggacccatg 2400

cctgtcacac atgccagcgc tgcccagagg agggggcgca taggcaggaa tcccaacaaa 2460

cctggagatg agtatctgta tggaggtggg tgcgcagaga ctgacgaaga ccatgcacat 2520

tggcttgaag caagaatgct ccttgacaat atttacctcc aagatggcct catagcctcg 2580

ctctatcgac ctgaggccga caaagtagca gccattgagg gagagttcaa gcttaggacg 2640

gagcaaagga agacctttgt ggaactcatg aaaagaggag atcttcctgt ttggctggcc 2700

tatcaggttg catctgccgg aataacctac acagatagaa gatggtgctt tgatggcacg 2760

accaacaaca ccataatgga agacagtgtg ccggcagagg tgtggaccag acacggagag 2820

aaaagagtgc tcaaaccgag gtggatggac gccagagttt gttcagatca tgcggccctg 2880

aagtcattca aggaattcgc cgctgggaaa agaggagcgg cttttggagt gatggaagcc 2940

ctgggaacac tgccaggaca catgacagag agattccagg aagccattga caacctcgct 3000

gtgctcatgc gggcagagac tggaagcagg ccttacaaag ccgcggcagc ccaattgccg 3060

gagaccctag agaccattat gcttttgggg ttgctgggaa cagtctcgct gggaatcttc 3120

ttcgtcttga tgaggaacaa gggcataggg aagatgggct ttggaatggt gactcttggg 3180

gccagcgcat ggctcatgtg gctctcggaa attgagccag ccagaattgc atgtgtcctc 3240

attgttgtgt tcctattgct ggtggtgctc atacctgagc cagaaaagca aagatctccc 3300

caggacaacc aaatggcaat catcattatg gtagcagtag gtcttctggg cttgattacc 3360

gccaatgaac tcggatggtt ggagagaaca aagagtgacc taagccatct aatgggaagg 3420

agagaggagg gggcaaccat aggattctca atggacattg acctgcggcc agcctcagct 3480

tgggccatct atgctgcctt gacaactttc attaccccag ccgtccaaca tgcagtgacc 3540

acctcataca acaactactc cttaatggcg atggccacgc aagctggagt gttgtttggt 3600

atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tcccgctgct aatgataggt 3660

tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct cgtggcgcac 3720

tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagctgcgc gtgctgccca gaagagaacg 3780

gcagctggca tcatgaagaa ccctgttgtg gatggaatag tggtgactga cattgacaca 3840

atgacaattg acccccaagt ggagaaaaag atgggacagg tgctactcat agcagtagcc 3900

gtctccagcg ccatactgtc gcggaccgcc tgggggtggg gggaggctgg ggccctgatc 3960

acagccgcaa cttccacttt gtgggaaggc tctccgaaca agtactggaa ctcctctaca 4020

gccacttcac tgtgtaacat ttttagggga agttacttgg ctggagcttc tctaatctac 4080

acagtaacaa gaaacgctgg cttggtcaag agacgtgggg gtggaacagg agagaccctg 4140

ggagagaaat ggaaggcccg cttgaaccag atgtcggccc tggagttcta ctcctacaaa 4200

aagtcaggca tcaccgaggt gtgcagagaa gaggcccgcc gcgccctcaa ggacggtgtg 4260

gcaacgggag gccatgctgt gtcccgagga agtgcaaagc tgagatggtt ggtggatcgg 4320

ggatacctgc agccctatgg aaaggtcatt gatcttggat gtggcagagg gggctggagt 4380

tactacgccg ccaccatccg caaagttcaa gaagtgaaag gatacacaaa aggaggccct 4440

ggtcatgaag aacccgtgtt ggtgcaaagc tatgggtgga acatagtccg tcttaagagt 4500

ggggtggacg tctttcatat ggcggctgag ccgtgtgaca cgttgctgtg tgacataggt 4560

gagtcatcat ctagtcctga agtggaagaa gcacggacgc tcagagtcct ctccatggtg 4620

ggggattggc ttgaaaaaag accaggagcc ttttgcataa aagtgttgtg cccatacacc 4680

agcactatga tggaaaccct ggagcgactg cagcgtaggt atgggggagg actggtcaga 4740

gtgccactct cccgcaactc tacacatgag atgtactggg tctctggagc gaaaagcaac 4800

accataaaaa gtgtgtccac cacgagccag ctcctcttgg ggcgcatgga cgggcctagg 4860

aggccagtga aatatgagga ggatgtgaat ctcggctctg gcacgcgggc tgtggcaagc 4920

tgcgctgaag ctcccaacat gaagatcatt ggtaaccgca ttgaaaggat ccgcagtgag 4980

cacgcggaaa cgtggttctt tgacgagaac cacccatata ggacatgggc ttaccatgga 5040

agctatgagg cccccacaca agggtcagcg tcctctctaa taaacggggt tgtcaggctc 5100

ctgtcaaaac cctgggatgt ggtgactgga gtcacaggaa tagccatgac cgacaccaca 5160

ccgtatggtc agcaaagagt tttcaaggaa aaagtggaca ctagggtgcc agacccccaa 5220

gaaggcactc gtcaggttat gagcatggtc tcttcctggt tgtggaaaga gctaggcaaa 5280

cacaaacggc cacgagtctg taccaaagaa gagttcatca acaaggttcg tagcaatgca 5340

gcattagggg caatatttga agaggaaaaa gagtggaaga ctgcagtgga agctgtgaac 5400

gatccaaggt tctgggctct agtggacaag gaaagagagc accacctgag aggagagtgc 5460

cagagttgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga aacaagggga atttggaaag 5520

gccaagggca gccgcgccat ctggtatatg tggctggggg ctagatttct agagttcgaa 5580

gcccttggat tcttgaacga ggatcactgg atggggagag agaactcagg aggtggtgtt 5640

gaagggctgg gattacaaag actcggatat gtcctagaag agatgagtcg tataccagga 5700

ggaaggatgt atgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagcag gtttgatctg 5760

gagaatgaag ctctaatcac caaccaaatg gagaaagggc acagggcctt ggcattggcc 5820

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<212> DNA

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<210> 18

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tctctgacct gtactacctg accatgaaca acaagcactg gctggtgcac aaggagtggt 1620

tccatgacat ccccctgcca tggcatgctg gcgctgacac aggcaccccc cactggaaca 1680

acaaggaggc cctggtggag ttcaaggatg cccatgccaa gaggcagaca gtggtggtgc 1740

tgggctctca agagggcgct gtgcacacag ccctggctgg cgccctggag gctgagatgg 1800

atggcgccaa gggcaggctg tcctctggcc atctgaagtg caggctgaag atggacaagc 1860

tgaggctgaa gggcgtctcc tactccctgt gcaccgctgc cttcaccttc accaaaatcc 1920

ctgctgagac cctgcatggc acagtgacag tggaggtgca gtatgctggc acagatggcc 1980

catgcaaagt gcctgcccag atggctgtgg acatgcagac cctgacccct gtgggcaggc 2040

tgatcacagc caaccctgtg atcaccgagt ccacagagaa ctccaagatg atgctggagc 2100

tggacccccc atttggcgac tcctacattg tgattggcgt gggcgagaag aagatcaccc 2160

atcactggca ccgctctggc tccaccattg gcaaggcctt tgaggctaca gtgaggggcg 2220

ccaagaggat ggctgtgctg ggcgacacag cctgggactt tggctctgtg ggcggcgccc 2280

tgaactccct gggcaagggc atccatcaga tctttggcgc tgccttcaag tccctgtttg 2340

gcggcatgtc ctggttctcc caaatcctga ttggcaccct gctgatgtgg ctgggcctga 2400

acaccaagaa tggctccatc tccctgatgt gcctggccct gggcggcgtg ctgatcttcc 2460

tgtccacagc tgtctctgcc gatgtgggct gctctgtgga cttctccaag aaggagaccc 2520

gctgtggcac aggcgtcttt gtctacaatg atgtggaggc ttggagggat aggtataagt 2580

accatcctga ctctcctcgg aggctggctg ctgctgtgaa gcaggcctgg gaggatggca 2640

tctgtggcat ctcctctgtc tctcggatgg agaacatcat gtggcgctct gtggagggcg 2700

agctgaatgc catcctggag gagaatggcg tgcagctgac agtggttgtg ggctctgtga 2760

agaaccccat gtggaggggc ccccagaggc tgcctgtgcc tgtgaatgag ctgccccatg 2820

gctggaaggc ctggggcaag tcctactttg tgagggctgc caagaccaac aactcctttg 2880

tggtggatgg cgaccccctg aaggagtgcc ccctgaagca cagggcctgg aactccttcc 2940

tggtggagga ccatggcttt ggcgtcttcc acacctctgt ctggctgaaa gtgagggagg 3000

actactccct ggagtgtgac cctgctgtga ttggcacagc tgtgaagggc aaggaggctg 3060

tgcactctga cctgggctac tggatcgagt ctgagaagaa tgacacctgg aggctgaaga 3120

gggcccatct gattgagatg aagacctgcg agtggcccaa gtcccacacc ctgtggacag 3180

atggcattga ggagtctgac ctgatcatcc ccaagtccct ggctggcccc ctgtcccatc 3240

acaacaccag ggagggctac aggacccaga tgaagggccc atggcactct gaggagctgg 3300

agatccgctt tgaggagtgt cctggcacaa aggtgcatgt ggaggagacc tgtggcacca 3360

ggggcccatc cctgaggtcc accacagcct ctggacgcgt gattgaggag tggtgctgca 3420

gggagtgcac catgcctccc ctgtcctttc gggctaagga tggctgttgg tatggcatgg 3480

agatcaggcc caggaaggag cctgagtcca acctggtgag gtccatggtg acagctggct 3540

ccactgatca catggaccac ttctcccttg gagtgcttgt gatcctgctc atggtgcagg 3600

aagggctgaa gaagagaatg accacaaaga tcatcataag cacatcaatg gcagtgctgg 3660

tagctatgat cctgggagga ttttcaatga gtgacctggc taagcttgca attttgatgg 3720

gtgccacctt cgcggaaatg aacactggag gagatgtagc tcatctggcg ctgatagcgg 3780

cattcaaagt cagaccagcg ttgctggtat ctttcatctt cagagctaat tggacacccc 3840

gtgaaagcat gctgctggcc ttggcctcgt gtcttttgca aactgcgatc tccgccttgg 3900

aaggcgacct gatggttctc atcaatggtt ttgctttggc ctggttggca gtacgagcga 3960

tggttgttcc acgcactgat aacatcaccc tagcaatcct ggctgctctg acaccactgg 4020

ctcgaggcac actgcttgtg gcgtggagag caggccttgc tacttgcggg gggtttatgc 4080

tcctctctct gaagggaaaa ggcagtgtga agaagaactt accatttgtc atggccctgg 4140

gactaaccgc tgtgaggctg gtggacccca tcaacgtggt gggactgctg ttgctcacaa 4200

ggagtgggaa gcggagctgg ccccctagcg aagtactcac agctgttggc ctgatatgcg 4260

cattggctgg agggttcgcc aaggcagata tagagatggc tgggcccatg gccgcggtcg 4320

gtctgctaat tgtcagttac gtggtctcag gaaagagtgt ggacatgtac attgaaagag 4380

caggtgacat cacatgggaa aaagatgcgg aagtcactgg aaacagtccc cggctcgatg 4440

tggcgctaga tgagagtggt gatttctccc tggtggagga tgacggtccc cccatgagag 4500

agatcatact caaggtggtc ctgatgacca tctgtggcat gaacccaata gccataccct 4560

ttgcagctgg agcgtggtac gtatacgtga agactggaaa aaggagtggt gctctatggg 4620

atgtgcctgc tcccaaggaa gtaaaaaagg gggagaccac agatggagtg tacagagtaa 4680

tgactcgtag actgctaggt tcaacacaag ttggagtggg agttatgcaa gagggggtct 4740

ttcacactat gtggcacgtc acaaaaggat ccgcgctgag aagcggtgaa gggagacttg 4800

atccatactg gggagatgtc aagcaggatc tggtgtcata ctgtggtcca tggaagctag 4860

atgccgcctg ggacgggcac agcgaggtgc agctcttggc cgtgcccccc ggagagagag 4920

cgaggaacat ccagactctg cccggaatat ttaagacaaa ggatggggac attggagcgg 4980

ttgcgctgga ttacccagca ggaacttcag gatctccaat cctagacaag tgtgggagag 5040

tgataggact ttatggcaat ggggtcgtga tcaaaaatgg gagttatgtt agtgccatca 5100

cccaagggag gagggaggaa gagactcctg ttgagtgctt cgagccttcg atgctgaaga 5160

agaagcagct aactgtctta gacttgcatc ctggagctgg gaaaaccagg agagttcttc 5220

ctgaaatagt ccgtgaagcc ataaaaacaa gactccgtac tgtgatctta gctccaacca 5280

gggttgtcgc tgctgaaatg gaggaggccc ttagagggct tccagtgcgt tatatgacaa 5340

cagcagtcaa tgtcacccac tctggaacag aaatcgtcga cttaatgtgc catgccacct 5400

tcacttcacg tctactacag ccaattagag tccccaacta taatctgtat attatggatg 5460

aggcccactt tacagatccc tcaagtatag cagcaagagg atacatttca acaagggttg 5520

agatgggcga ggcggctgcc atcttcatga ccgccacgcc accaggaacc cgtgacgcat 5580

ttccggactc caactcacca attatggaca ccgaagtgga agtcccagag agagcctgga 5640

gctcaggctt tgattgggtg acggatcatt ttggaaaaac agtttggttt gttccaagcg 5700

tgaggaacgg caatgagatc gcagcttgtc tgacaaaggc tggaaaacgg gtcatacagc 5760

tcagcagaaa gacttttgag acagagttcc agaaaacaaa acatcaagag tgggactttg 5820

tcgtgacaac tgacatttca gagatgggcg ccaactttaa agctgaccgt gtcatagatt 5880

ccaggagatg cctaaagccg gtcatacttg atggcgagag agtcattctg gctggaccca 5940

tgcctgtcac acatgccagc gctgcccaga ggagggggcg cataggcagg aatcccaaca 6000

aacctggaga tgagtatctg tatggaggtg ggtgcgcaga gactgacgaa gaccatgcac 6060

attggcttga agcaagaatg ctccttgaca atatttacct ccaagatggc ctcatagcct 6120

cgctctatcg acctgaggcc gacaaagtag cagccattga gggagagttc aagcttagga 6180

cggagcaaag gaagaccttt gtggaactca tgaaaagagg agatcttcct gtttggctgg 6240

cctatcaggt tgcatctgcc ggaataacct acacagatag aagatggtgc tttgatggca 6300

cgaccaacaa caccataatg gaagacagtg tgccggcaga ggtgtggacc agacacggag 6360

agaaaagagt gctcaaaccg aggtggatgg acgccagagt ttgttcagat catgcggccc 6420

tgaagtcatt caaggaattc gccgctggga aaagaggagc ggcttttgga gtgatggaag 6480

ccctgggaac actgccagga cacatgacag agagattcca ggaagccatt gacaacctcg 6540

ctgtgctcat gcgggcagag actggaagca ggccttacaa agccgcggca gcccaattgc 6600

cggagaccct agagaccatt atgcttttgg ggttgctggg aacagtctcg ctgggaatct 6660

tcttcgtctt gatgaggaac aagggcatag ggaagatggg ctttggaatg gtgactcttg 6720

gggccagcgc atggctcatg tggctctcgg aaattgagcc agccagaatt gcatgtgtcc 6780

tcattgttgt gttcctattg ctggtggtgc tcatacctga gccagaaaag caaagatctc 6840

cccaggacaa ccaaatggca atcatcatta tggtagcagt aggtcttctg ggcttgatta 6900

ccgccaatga actcggatgg ttggagagaa caaagagtga cctaagccat ctaatgggaa 6960

ggagagagga gggggcaacc ataggattct caatggacat tgacctgcgg ccagcctcag 7020

cttgggccat ctatgctgcc ttgacaactt tcattacccc agccgtccaa catgcagtga 7080

ccacctcata caacaactac tccttaatgg cgatggccac gcaagctgga gtgttgtttg 7140

gtatgggcaa agggatgcca ttctacgcat gggactttgg agtcccgctg ctaatgatag 7200

gttgctactc acaattaaca cccctgaccc taatagtggc catcattttg ctcgtggcgc 7260

actacatgta cttgatccca gggctgcagg cagcagctgc gcgtgctgcc cagaagagaa 7320

cggcagctgg catcatgaag aaccctgttg tggatggaat agtggtgact gacattgaca 7380

caatgacaat tgacccccaa gtggagaaaa agatgggaca ggtgctactc atagcagtag 7440

ccgtctccag cgccatactg tcgcggaccg cctgggggtg gggggaggct ggggccctga 7500

tcacagccgc aacttccact ttgtgggaag gctctccgaa caagtactgg aactcctcta 7560

cagccacttc actgtgtaac atttttaggg gaagttactt ggctggagct tctctaatct 7620

acacagtaac aagaaacgct ggcttggtca agagacgtgg gggtggaaca ggagagaccc 7680

tgggagagaa atggaaggcc cgcttgaacc agatgtcggc cctggagttc tactcctaca 7740

aaaagtcagg catcaccgag gtgtgcagag aagaggcccg ccgcgccctc aaggacggtg 7800

tggcaacggg aggccatgct gtgtcccgag gaagtgcaaa gctgagatgg ttggtggatc 7860

ggggatacct gcagccctat ggaaaggtca ttgatcttgg atgtggcaga gggggctgga 7920

gttactacgc cgccaccatc cgcaaagttc aagaagtgaa aggatacaca aaaggaggcc 7980

ctggtcatga agaacccgtg ttggtgcaaa gctatgggtg gaacatagtc cgtcttaaga 8040

gtggggtgga cgtctttcat atggcggctg agccgtgtga cacgttgctg tgtgacatag 8100

gtgagtcatc atctagtcct gaagtggaag aagcacggac gctcagagtc ctctccatgg 8160

tgggggattg gcttgaaaaa agaccaggag ccttttgcat aaaagtgttg tgcccataca 8220

ccagcactat gatggaaacc ctggagcgac tgcagcgtag gtatggggga ggactggtca 8280

gagtgccact ctcccgcaac tctacacatg agatgtactg ggtctctgga gcgaaaagca 8340

acaccataaa aagtgtgtcc accacgagcc agctcctctt ggggcgcatg gacgggccta 8400

ggaggccagt gaaatatgag gaggatgtga atctcggctc tggcacgcgg gctgtggcaa 8460

gctgcgctga agctcccaac atgaagatca ttggtaaccg cattgaaagg atccgcagtg 8520

agcacgcgga aacgtggttc tttgacgaga accacccata taggacatgg gcttaccatg 8580

gaagctatga ggcccccaca caagggtcag cgtcctctct aataaacggg gttgtcaggc 8640

tcctgtcaaa accctgggat gtggtgactg gagtcacagg aatagccatg accgacacca 8700

caccgtatgg tcagcaaaga gttttcaagg aaaaagtgga cactagggtg ccagaccccc 8760

aagaaggcac tcgtcaggtt atgagcatgg tctcttcctg gttgtggaaa gagctaggca 8820

aacacaaacg gccacgagtc tgtaccaaag aagagttcat caacaaggtt cgtagcaatg 8880

cagcattagg ggcaatattt gaagaggaaa aagagtggaa gactgcagtg gaagctgtga 8940

acgatccaag gttctgggct ctagtggaca aggaaagaga gcaccacctg agaggagagt 9000

gccagagttg tgtgtacaac atgatgggaa aaagagaaaa gaaacaaggg gaatttggaa 9060

aggccaaggg cagccgcgcc atctggtata tgtggctggg ggctagattt ctagagttcg 9120

aagcccttgg attcttgaac gaggatcact ggatggggag agagaactca ggaggtggtg 9180

ttgaagggct gggattacaa agactcggat atgtcctaga agagatgagt cgtataccag 9240

gaggaaggat gtatgcagat gacactgctg gctgggacac ccgcattagc aggtttgatc 9300

tggagaatga agctctaatc accaaccaaa tggagaaagg gcacagggcc ttggcattgg 9360

ccataatcaa gtacacatac caaaacaaag tggtaaaggt ccttagacca gctgaaaaag 9420

ggaaaacagt tatggacatt atttcgagac aagaccaaag ggggagcgga caagttgtca 9480

cttacgctct taacacattt accaacctag tggtgcaact cattcggaat atggaggctg 9540

aggaagttct agagatgcaa gacttgtggc tgctgcggag gtcagagaaa gtgaccaact 9600

ggttgcagag caacggatgg gataggctca aacgaatggc agtcagtgga gatgattgcg 9660

ttgtgaagcc aattgatgat aggtttgcac atgccctcag gttcttgaat gatatgggaa 9720

aagttaggaa ggacacacaa gagtggaaac cctcaactgg atgggacaac tgggaagaag 9780

ttccgttttg ctcccaccat ttcaacaagc tccatctcaa ggacgggagg tccattgtgg 9840

ttccctgccg ccaccaagat gaactgattg gccgggctcg cgtctctcca ggggcgggat 9900

ggagcatccg ggagactgct tgcctagcaa aatcatatgc gcaaatgtgg cagctccttt 9960

atttccacag aagggacctc cgactgatgg ccaatgccat ttgttcatct gtgccagttg 10020

actgggtacc aactgggaga actacctggt caatccatgg aaagggagaa tggatgacca 10080

ctgaagacat gcttgtggtg tggaacagag tgtggattga ggagaacgac cacatggaag 10140

acaagacccc agttacgaaa tggacagaca ttccctattt gggaaaaagg gaagacttgt 10200

ggtgtggatc tctcataggg cacagaccgc gcaccacctg ggctgagaac attaaaaaca 10260

cagtcaacat ggtgcgcagg atcataggtg atgaagaaaa gtacatggat tacctatcca 10320

cccaagttcg ctacttgggt gaagaagggt ctacacctgg agtgctgtaa gcaccaattt 10380

tagtgttgtc aggcctgcta gtcagccaca gtttggggaa agctgtgcag cctgtaaccc 10440

ccccaggaga agctgggaaa ccaagctcat agtcaggccg agaacgccat ggcacggaag 10500

aagccatgct gcctgtgagc ccctcagagg acactgagtc aaaaaacccc acgcgcttgg 10560

aagcgcagga tgggaaaaga aggtggcgac cttccccacc cttcaatctg gggcctgaac 10620

tggagactag ctgtgaatct ccagcagagg gactagtggt tagaggagac cccccggaaa 10680

acgcaaaaca gcatattgac gctgggaaag accagagact ccatgagttt ccaccacgct 10740

ggccgccagg cacagatcgc cgaacagcgg cggccggtgt gggg 10784

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tggaggctga ggaagttcta g 21

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cttcacaacg caatcatctc cactg 25

Claims

1.一种重组寨卡病毒减毒株，其特征在于，所述重组寨卡病毒减毒株至少存在以下一种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸。

2.根据权利要求1所述的重组寨卡病毒减毒株，其特征在于，所述重组寨卡病毒减毒株存在以下三种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸。

3.根据权利要求1所述的重组寨卡病毒减毒株，其特征在于，所述重组寨卡病毒减毒株的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，或如SEQ ID NO.18所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，但能编码相同蛋白质的核苷酸序列。

4.一种重组寨卡病毒cDNA，其特征在于，所述重组寨卡病毒减毒株的cDNA为野生型寨卡病毒cDNA且所编码蛋白中存在以下至少一种非同义突变：包膜蛋白中第304位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，非结构蛋白1中第103位的精氨酸突变为赖氨酸，非结构蛋白5中第637位色氨酸突变为精氨酸的核苷酸序列；

或所述重组寨卡病毒cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，或如SEQ ID NO.18所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，但能编码相同蛋白质的核苷酸序列。

5.一种重组寨卡病毒表达蛋白，其特征在于，其为权利要求1-3任一项所述重组寨卡病毒减毒株所表达的蛋白；或其为权利要求4所述重组寨卡病毒cDNA翻译的蛋白。

6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体上插入有如权利要求4所述的重组寨卡病毒cDNA，或所述重组表达载体上插入可用于表达权利要求5所述重组寨卡病毒表达蛋白的基因。

7.一种重组寨卡病毒减毒株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(3)将上述重组克隆pVAX-GZ02转染仓鼠肾细胞，拯救获得cDNA序列如SEQ ID NO.18所示的重组寨卡病毒减毒株。

8.根据权利要求7所述的重组寨卡病毒减毒株的制备方法，其特征在于，所述pVAX-GZ02-Intron为通过overlap PCR技术构建了从5'UTR到NS2A的5'区域的片段，以及NS5的3'区域和3'UTR，在NS2A和NS5之间插入了NS2A的3'区域到NS5的5'区域的片段，通过体外连接构建而得；

优选为，所述制备包括如下步骤：

(1)以序列如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示核苷酸片段为模板，以序列如SEQID NO.3-SEQ ID NO.4所示的引物对进行融合PCR获得插入内含子的optENS1片段；

(3)以pVAX-AB质粒作为模板，以序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示的引物对进行PCR线性化pVAX-AB，通过pVAX-AB与optENS1片段进行二片段重组形成pVAX-optENS1质粒；

9.权利要求1-3中任意一项所述的重组寨卡病毒减毒株，和/或权利要求4所述的重组寨卡病毒cDNA，和/或权利要求5所述的重组寨卡病毒表达蛋白，和/或权利要求6所述的重组表达载体在制备重组寨卡病毒疫苗中的应用。

10.一种重组寨卡病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗中含有活性成分和辅料，所述活性成分来源于权利要求1-3中任意一项所述的重组寨卡病毒减毒株，和/或权利要求4所述的重组寨卡病毒cDNA，和/或权利要求5所述的重组寨卡病毒表达蛋白，和/或权利要求6所述的重组表达载体。