BR112020008665A2 - método para inativar vírus da zika e para determinar a integridade de inativação - Google Patents

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Abstract

A presente divulgação refere-se a métodos para inativar um vírus da Zika que podem ser usados em vacinas e composições imunogênicas. A presente divulgação também se refere a um método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de arbovírus.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO
PARA INATIVAR VÍRUS DA ZIKA E PARA DETERMINAR A INTEGRIDADE DE INATIVAÇÃO". DECLARAÇÃO RELACIONADA À PESQUISA PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL
[001] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob Contrato Nº HHSO100201600015C com o Departamento de Saúde e Serviços Humanos, Gabinete do Secretário Adjunto de Preparação e Resposta, Autoridade de Desenvolvimento e Pesquisa Avançada Biomédica. Esta invenção foi criada no desempenho de um Acordo de Pesquisa e Desenvolvimento Cooperativo com os Centros de Controle e Prevenção de Doenças, uma Agência do Departamento de Saúde e Serviços Humanos. O governo dos Estados Unidos tem determinados direitos na invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente divulgação refere-se aos métodos para inativar um vírus da Zika que podem ser usados em vacinas e composições imunogênicas. A presente divulgação também se refere a um método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de arbovírus.
FUNDAMENTOS
[003] O vírus da Zika, um flavivírus classificado com outros vírus carregados por mosquito (por exemplo, vírus da febre amarela, dengue, Nilo Ocidental e encefalite japonesa) dentro da família Flaviviridae se espalhou rapidamente em uma grande epidemia hemisférica desde que o vírus foi introduzido no Brasil em 2013. O vírus atingiu as Américas do Norte e Central, o que inclui territórios dos Estados Unidos, consequentemente, ameaçam agora os EUA continentais. De fato, a cepa do vírus da Zika PRVABC59 foi isolada do soro de uma pessoa que viajou para Porto Rico em 2015. O genoma dessa cepa foi sequenciado pelo menos três vezes (consultar Lanciotti et al. Emerg. Infect. Dis. maio de 2016;22(5):933-5 e Número de Acesso GenBank KU501215.1; Número de Acesso GenBank KX087101.3; e Yun et al. Genome Announc. 18 de agosto de 2016;4(4) e Número de Acesso GenBank ANK57897.1).
[004] Inicialmente isolado em 1947 em Uganda, o vírus foi primeiro ligado à doença humana em 1952, e tem sido reconhecido como uma causa de doença febril autolimitada leve na África e Sudeste da Ásia (Weaver et al. (2016) Antiviral Res. 130:69-80; Faria et al. (2016) Science. 352(6283):345-349). No entanto, em 2007, um surto ocorreu na ilha do Pacífico Norte de Yap, e depois se disseminou de ilha para ilha através do Pacífico, resultando em um extenso surto em 2013 e 2014 na Polinésia Francesa, espalhando-se depois para a Nova Caledônia, Ilhas Cook e, finalmente, na Ilha de Páscoa. Um vírus de linhagem asiática foi subsequentemente transferido para o Hemisfério Ocidental por rotas que permanecem indeterminadas (Faria et al. (2016) Science. 352(6283):345-349). O vírus pode ser transmitido zoonoticamente pelo Aedes aegypti, A. albopictus, e possivelmente pelo A. hensilli e A. polinieseinsis (Weaver et al. (2016) Antiviral Res. 130:69- 80). Além disso, pensa-se que outros vetores de transmissão do vírus podem existir, e que o vírus pode ser transmitido por transfusão de sangue, via transplacentária e/ou através da transmissão sexual.
[005] No final de 2015, um aumento significativo de anomalias fetais (por exemplo, microcefalia) e síndrome de Guillain-Barre (GBS) em áreas de infecção generalizada de vírus da Zika levantou alarme de que o vírus da Zika poderia ser muito mais virulento do que se pensava inicialmente, o que levou a Organização Mundial de Saúde (OMS) a declarar uma emergência de Saúde Pública de Importância Internacional (ESPII) (Heymann et al. (2016) Lancet 387(10020): 719- 21). Enquanto vírus da Zika representa uma ameaça substancial à saúde pública, nenhuma vacina ou tratamento aprovado pelo FDA existente atualmente, e as únicas medidas preventivas para controlar o vírus da Zika envolvem a gestão das populações de mosquitos.
[006] Em recentes esforços para caracterizar um vírus da Zika recombinante para o desenvolvimento de uma potencial vacina, um vírus da Zika adaptado à célula não humana foi identificado que porta uma mutação na proteína de envelope viral na posição 330 (Weger- Lucarelli et al. 2017. Journal of Virology). Os autores deste estudo constataram que clones de cDNA infeccioso de comprimento inteiro da cepa de vírus da Zika PRVABC59 foram geneticamente instáveis quando amplificados durante a clonagem, e optaram por dividir o genoma viral para tratar a instabilidade observada, desenvolvendo e aplicando-se um sistema de dois plasmídeos. No entanto, um sistema de dois plasmídeos para o desenvolvimento de uma vacina contra Zika é menos desejável.
BREVE SUMÁRIO
[007] Assim, há uma necessidade em desenvolver vacinas e composições imunogênicas para tratar e/ou prevenir infecção de vírus da Zika que utilizam um vírus da Zika geneticamente estável. Uma opção para o desenvolvimento de uma vacina é inativar um vírus inteiro e usar esse vírus inteiro inativado para a vacinação de indivíduos. No entanto, durante o desenvolvimento de uma vacina viral inativada, uma garantia de segurança importante é ter certeza de que não nenhum vírus infeccioso permanece no produto de fármaco ou substância de fármaco. O desenvolvimento de um processo de inativação eficaz e análise de alta sensibilidade para medir e determinar se vírions infecciosos permanecem é um aspecto de segurança importante para o desenvolvimento de um vírus inativado purificado derivado de qualquer vírus de tipo selvagem, mas certamente com um vírus patogênico/encefálico que poderia causar anomalias fetais.
[008] A presente divulgação tem como base, pelo menos em parte, a descoberta surpreendente de que o vírus da Zika pode eficientemente ser inativado com uma baixa concentração de formaldeído que é aplicado no vírus durante um período de tempo relativamente curto em temperatura ambiente. Além disso, um ensaio foi desenvolvido que permite determinar, com uma alta sensibilidade se vírions infecciosos ainda estão presentes após inativação.
[009] Consequentemente, determinados aspectos da presente divulgação se referem a um método para inativar uma preparação de vírus da Zika que compreende: (a) isolar a preparação de vírus da Zika de uma ou mais células cultivadas in vitro, sendo que as células são usadas para produzir a preparação de vírus; e (b) tratar a preparação de vírus da Zika com 0,005% a 0,02% em p/v de formaldeído.
[010] Em algumas modalidades, as células são células não humanas. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com 0,01% de formaldeído. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada durante oito a doze dias, tal como durante dez dias. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada a uma temperatura de 15°C a 30°C, tal como uma temperatura de 22°C.
[011] O método pode compreender adicionalmente uma etapa (c) de determinar a integridade de inativação. Em algumas modalidades, a etapa (c) compreende: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma preparação de vírus da Zika tratada com 0,005% a 0,02% em p/v de formaldeído e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o sobrenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de vírus da Zika contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[012] Em algumas modalidades, as células de inseto são selecionadas a partir de células CCL-125, células Aag-2, células RML- 12, células C6/36, células C7-10, células AP-61, células A.t. GRIP-1, células A.t. GRIP-2, células A.t. GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos.55, células Sua1B, células 4a-3B, células Mos.42, células MSQ43, células LSB-AA695BB, células NIID-CTR e células TRA-171, tais como células C6/36.
[013] Em algumas modalidades, o primeiro período de tempo é de 3 a 7 dias.
[014] Em algumas modalidades, as células de mamífero são selecionadas a partir de células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito no documento Nº WO97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO), tais como células VERO.
[015] Em algumas modalidades, o segundo período de tempo é de 3 a 14 dias.
[016] O método pode compreender adicionalmente uma etapa (d) de neutralizar a preparação de vírus da Zika tratada com formaldeído com metabissulfito de sódio, tal como neutralizar a preparação de vírus da Zika tratada com formaldeído pelo menos cinco, pelo menos sete, pelo menos nove, pelo menos 11, ou pelo menos 14 dias após tratamento com formaldeído.
[017] O método pode compreender adicionalmente uma etapa (e)
de preparar uma composição farmacêutica que compreende o vírus da Zika inativado.
[018] Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika tratada é misturada com um adjuvante. O adjuvante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em sais de alumínio, agonistas de receptor do tipo toll (TLR), lipídeo de monofosforila A (MLA), lipídeo sintético A, miméticos ou análogos de lipídeo A, derivados de MLA, citocinas, saponinas, derivados de dipeptídeo de muramila (MDP), oligos de CpG, lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, polifosfazenos, emulsões, virossomas, cocleatos, micropartículas de poli(lactídeo-co-glicolídeos) (PLG), partículas de poloxâmero, micropartículas, lipossomas, Adjuvante Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA).
[019] Em algumas modalidades, o adjuvante é um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, sulfato de alumínio e potássio, e Alhydrogel 85.
[020] Em algumas modalidades, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de um ou mais antígenos na preparação de vírus tratada são adsorvidos no adjuvante.
[021] Em algumas modalidades, o vírus da Zika compreende uma mutação na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, tal como uma mutação Trp98Gly na SEQ ID Nº: 1.
[022] Em algumas modalidades, o vírus da Zika não compreende uma mutação na proteína de envelope (E). Em algumas modalidades, a sequência que codifica a proteína de envelope é igual à sequência correspondente na SEQ ID Nº: 2.
[023] Alguns aspectos da presente divulgação se referem a uma composição farmacêutica que compreende um vírus da Zika inativado obtenível através de qualquer um dos métodos divulgados no presente documento.
[024] Alguns aspectos da presente divulgação se referem a uma composição farmacêutica que compreende um vírus da Zika inativado e tem um teor de formalina residual menor que 0,5 µg/ml. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é obtenível através de qualquer um dos métodos divulgados no presente documento.
[025] Alguns aspectos da presente divulgação se referem a um método para determinar o teor de formalina residual em uma composição farmacêutica que compreende um vírus inativado que compreende as etapas de: (a) fornecer uma composição farmacêutica que compreende um vírus que foi tratado com formaldeído; (b) misturar a composição farmacêutica de (a) com ácido fosfórico e 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH), desse modo, se fornece uma mistura; (c) incubar a mistura de (b) sob condições adequadas; e (d) analisar a mistura para a presença de formalina residual.
[026] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém um adjuvante. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém hidróxido de alumínio como adjuvante. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém 0,1 mg/ml a 1,0 mg/ml de hidróxido de alumínio como adjuvante. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém 0,4 mg/ml de hidróxido de alumínio como adjuvante.
[027] Em algumas modalidades, um volume de 1 ml da composição farmacêutica de (a) é misturado com 20 µl de 15 a 25% (v/v) de ácido fosfórico e 50 µl de 0,9 a 1,1 mg/ml de DNPH. Em algumas modalidades, um volume de 1 ml da composição farmacêutica de (a) é misturado com 20 µl de 20% (v/v) de ácido fosfórico e 50 µl de 1,0 mg/ml de DNPH.
[028] Em algumas modalidades, a mistura da composição farmacêutica de (a) com ácido fosfórico e 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH) é incubada em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, a mistura da composição farmacêutica de (a) com ácido fosfórico e 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH) é incubada durante 10 a 30 minutos. Em algumas modalidades, a mistura da composição farmacêutica de (a) com ácido fosfórico e 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH) é incubada em temperatura ambiente durante 20 minutos.
[029] Em algumas modalidades, a mistura da composição farmacêutica de (a) com ácido fosfórico e 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH) é analisada através de HPLC. Em algumas modalidades, a HPLC é HPLC de fase invertida. Em algumas modalidades, uma mistura de água e acetonitrila (1:1, v/v) é usada como uma fase móvel em HPLC. Em algumas modalidades, o comprimento de onda de detecção é de 360 nm.
[030] Em algumas modalidades, o vírus é um vírus da Zika inativado. Em algumas modalidades, o vírus da Zika inativado foi tratado com 0,01% (p/v) de formaldeído durante 10 dias a 22°C. Em algumas modalidades, o vírus da Zika compreende uma mutação na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, tal como uma mutação Trp98Gly na SEQ ID Nº: 1.
[031] Alguns aspectos da presente divulgação se referem a um método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de arbovírus que compreende as etapas de: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma preparação de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante de célula de inseto;
(ii) inocular células de mamífero cultivadas com o sobrenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de arbovírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[032] Em algumas modalidades, o arbovírus é um flavivírus ou um alfavírus. Em algumas modalidades, o arbovírus é um vírus da Zika, um vírus do Oeste do Nilo, um vírus da Febre Amarela, um vírus da Encefalite Japonesa, um vírus da encefalite transmitida por carrapatos, um vírus da dengue, um vírus da Encefalite de St. Louis, um vírus da Chikungunya, um vírus O'nyong'nyong ou um Mayarovirus.
[033] Em algumas modalidades, a preparação de arbovírus foi submetida a uma etapa de inativação com detergente, formalina, peróxido de hidrogênio, beta-propiolactona (BPL), etilamina binária (BEI), etilenoimina de acetila, azul de metileno ou psoraleno.
[034] Em algumas modalidades, as células de inseto são selecionadas a partir de células CCL-125, células Aag-2, células RML- 12, células C6/36, células C7-10, células AP-61, células A.t. GRIP-1, células A.t. GRIP-2, células A.t. GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos.55, células Sua1B, células 4a-3B, células Mos.42, células MSQ43, células LSB-AA695BB, células NIID-CTR e células TRA-171, tais como células C6/36.
[035] Em algumas modalidades, o primeiro período de tempo é de 3 a 7 dias.
[036] Em algumas modalidades, as células de mamífero são selecionadas a partir de células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito no documento nº WO97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO), tais como células VERO.
[037] Em algumas modalidades, o segundo período de tempo é de 3 a 14 dias.
[038] Em algumas modalidades, o método tem capacidade para detectar menos que 1,0 TCID50 do arbovírus.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[039] A Figura 1 mostra imagens de microscopia de campo claro de cepa PRVABC59 infectada com simulado de monocamadas de célula Vero (superior) ou infectada com ZIKAV (inferior).
[040] A Figura 2 mostra cinética de crescimento de ZIKAV PRVABC59 P1 em monocamadas de célula Vero, conforme determinado por TCID50.
[041] A Figura 3 mostra teste de ensaio de potência (TCID50) de clones de PRVABC59 P5 de vírus da Zika a a f.
[042] A Figura 4 mostra imagens de microscopia de campo claro que representam o efeito citopático (CPE) de crescimento de clones de PRVABC59 P6 de vírus da Zika a a f em monocamadas de célula Vero.
[043] A Figura 5 mostra teste de ensaio de potência (TCID50) de clones de PRVABC59 P6 de vírus da Zika a a f.
[044] A Figura 6 mostra um alinhamento de sequência de aminoácidos que compara a sequência de glicoproteína de envelope de vírus da Zika próxima ao resíduo 330 das cepas PRVABC59 P6e (SEQ ID Nº: 8) e PRVABC59 (SEQ ID Nº: 9) de vírus da Zika com diversos outros flavivírus (WNV (SEQ ID Nº: 10); JEV (SEQ ID Nº: 11); SLEV (SEQ ID Nº: 12); YFV (SEQ ID Nº: 13); DENV 1 16007 (SEQ ID Nº: 14); DENV 2 16681 (SEQ ID Nº: 15); DENV 3 16562 (SEQ IDNO: 16); e DENV 4 1036 (SEQ ID Nº: 17)).
[045] A Figura 7 mostra um alinhamento de sequência de aminoácidos que compara a sequência de proteínas NS1 de vírus da
Zika próxima ao resíduo 98 das cepas PRVABC59 P6e (SEQ ID Nº: 18) e PRVABC59 (SEQ ID Nº: 19) de vírus da Zika com diversos outros flavivírus (WNV (SEQ ID Nº: 20); JEV (SEQ ID Nº: 21); SLEV (SEQ ID Nº: 22); YFV (SEQ ID Nº: 23); DENV 1 16007 (SEQ ID Nº: 24); DENV 2 16681 (SEQ ID Nº: 25); DENV 3 16562 (SEQ IDNO: 26); e DENV 4 1036 (SEQ ID Nº: 27)).
[046] A Figura 8 mostra o fenótipo de placa de clones de vírus ZIKAV PRVABC59 P6 a a f em comparação com vírus ZIKAV PRVABC59 P1.
[047] A Figura 9 mostra o tamanho de placa médio de clones de vírus ZIKAV PRVABC59 P6 em comparação com vírus ZIKAV PRVABC59 P1.
[048] A Figura 10 mostra a cinética de crescimento de clones de ZIKAV PRVABC59 P6 a a f em células Vero sob condições de crescimento isentas de soro.
[049] A Figura 11 mostra um esquema das etapas usadas para preparar produto de fármaco formulado de PRVABC59 P6b e P6e para os experimentos de imunização.
[050] A Figura 12A mostra a programação de dosagem de camundongos CD-1 com formulações de vacina derivadas dos clones de ZIKAV PRVABC59 P6b e P6e. PBS foi usada como placebo.
[051] A Figura 12B mostra as titulações de anticorpo de neutralização de ZIKAV séricas de camundongos CD-1 imunizados conforme descrito na Figura 12A com o uso de formulações de vacina derivadas de clones de ZIKAV PRVABC59 P6b e P6e. Titulações de anticorpo de neutralização de ZIKAV foram determinadas através de ensaio de neutralização de Partícula de Vírus Repórter (RVP). Linhas sólidas representam a média geométrica de um grupo. O limite de detecção (1,93 log10) é representado por uma linha tracejada.
[052] A Figura 13A mostra a programação de dosagem de camundongos AG129 com formulações de vacina derivadas dos clones de ZIKAV PRVABC59 P6b e P6e. PBS foi usada como um placebo.
[053] A Figura 13B mostra as titulações de anticorpo de neutralização de ZIKAV séricas de camundongos AG129 imunizados conforme descrito na Figura 13A com o uso de formulações de vacina derivadas de clones de ZIKAV PRVABC59 P6b e P6e. Linhas sólidas representam a média geométrica de um grupo. O limite de detecção (1,30 log10) é representado por uma linha tracejada. Animais sem titulação detectável (< 1,30) receberam uma titulação de 0,5.
[054] A Figura 14 mostra o peso médio de grupos de teste de AG129 após desafio, representado como um percentual de peso de partida. Barras de erro representam desvio padrão.
[055] A Figura 15 mostra a viremia sérica de camundongos AG129 individuais dois dias após desafio, relatada em PFU/ml. Linhas sólidas representam a média de um grupo. O limite de detecção (2,0 log10) é representado por uma linha tracejada.
[056] A Figura 16 mostra a análise de sobrevivência de grupos de teste de AG129 após desafio.
[057] A Figura 17 mostra as titulações de anticorpo de neutralização (Nab) de ZIKAV de circulação de soro pré-desafio depois da transferência passiva de soros agrupados a partir de camundongos AG129 vacinados e desafiados.
[058] A Figura 18 mostra o peso corporal médio de camundongos de transferência passiva e controle desafiados com vírus da Zika.
[059] A Figura 19 mostra a viremia sérica de camundongos AG129 individuais três dias após desafio, relatada em PFU/ml.
[060] A Figura 20 mostra a análise de sobrevivência de camundongos de transferência passiva e controle desafiados com vírus da Zika.
[061] A Figura 21 mostra a correlação entre viremia e titulações de anticorpo de neutralização de ZIKAV observada em camundongos de transferência passiva.
[062] A Figura 22 mostra a análise de sobrevivência de camundongos AG129 após infecção com estoques de vírus da Zika preMVS de P6a e P6e com o uso de uma curva de sobrevivência Kaplan Meier.
[063] A Figura 23 mostra o peso corporal médio conforme expresso em percentual de peso de partida no momento da invenção após infecção com estoques de vírus da Zika preMVS de P6a e P6e. A linha tracejada representa 100% de peso de partida para referência.
[064] A Figura 24 mostra a viremia sérica de camundongos AG129 individuais três dias após infecção com estoques de vírus da Zika preMVS de P6a e P6e, relatada em PFU/ml. A linha tracejada representa o limite de detecção do ensaio.
[065] A Figura 25 mostra a cinética compilada de dados de inativação. Dados comparam a potência infecciosa (TCID50) com cópia de RNA, e integridade de inativação (COI) para amostras a partir dos quatro lotes de toxicologia. Esses dados indicam que a sensibilidade do ensaio COI é maior que TCID50.
[066] A Figura 26 mostra uma comparação de sensibilidade de C6/36 e Vero no ensaio, conforme demonstrado com uma titulação de vírus de entrada de 0,31 TCID50.
[067] A Figura 27 mostra uma análise de regressão logística de CPE em relação a log TCID50 com o uso de sítio de células C6/36 que inclui intervalos de 99% de confiança ao redor de um valor-alvo de 0,01 TCID50/cavidade (-2 log TCID50/cavidade); o modelo prevê que 0,85% das cavidades será positiva.
[068] A Figura 28 mostra cromatogramas de PBS (a) e soluções de PBS que contêm 0,049 µg/ml (b), 0,098 µg/ml (c), 0,196 µg/ml (d), 0,491 µg/ml (e), 0,982 µg/ml (f) e 1,964 µg/ml (g) de formaldeído.
DESCRIÇÃO DETALHADA TÉCNICAS GERAIS
[069] As técnicas e procedimentos descritos ou citados no presente documento são, de modo geral, bem entendidos e normalmente empregados com o uso de metodologia convencional por aqueles versados na arte, tal como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, e Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley e Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); e The Antibodies (M. Zanetti e J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
VÍRUS DA ZIKA
[070] Determinados aspectos da presente divulgação se referem a um vírus da Zika inteiro inativado purificado que pode ser útil em vacinas e/ou composições imunogênicas.
[071] Vírus da Zika (ZIKV) é um flavivírus transmitido por mosquito primeiramente isolado a partir de um macaco-rhesus sentinela na Floresta de Zika em Uganda em 1947. Desde então, isolamentos foram feitos a partir de seres humanos tanto na África quanto na Ásia, e mais recentemente, nas Américas. ZIKV é encontrado em duas (possivelmente três) linhagens: uma linhagem africana (possivelmente separada em linhagens africanas ocidentais e orientais) e uma linhagem asiática. Consequentemente, exemplos de vírus da Zika adequados da presente divulgação incluem, sem limitação, vírus das linhagens africana e/ou asiática. Em algumas modalidades, o vírus da Zika é um vírus de linhagem africana. Em algumas modalidades, o vírus da Zika é um vírus de linhagem asiática. Adicionalmente, diversas cepas dentro das linhagens africana e asiática do vírus da Zika foram anteriormente identificadas. Qualquer uma ou mais cepas adequadas de vírus da Zika conhecidas na técnica podem ser usadas na presente divulgação que incluem, por exemplo, cepas Mr 766, ArD 41519, IbH 30656, P6-740, EC Yap, FSS13025, ArD 7117, ArD 9957, ArD 30101, ArD 30156, ArD 30332, HD 78788, ArD 127707, ArD 127710, ArD 127984, ArD 127988, ArD 127994, ArD 128000, ArD 132912, 132915, ArD 141170, ArD 142623, ArD 149917, ArD 149810, ArD 149938, ArD 157995, ArD 158084, ArD 165522, ArD 165531, ArA 1465, ArA 27101, ArA 27290, ArA 27106, ArA 27096, ArA 27407, ArA 27433, ArA 506/96, ArA 975-99, Ara 982-99, ArA 986-99, ArA 2718, ArB 1362, Nigeria68, Malaysia66, Kedougou84, Suriname, MR1429, PRVABC59, ECMN2007, DakAr41524, H/PF/2013, R103451, 103344, 8375, JMB-185, ZIKV/H, sapiens/Brazil/Natal/2015, SPH2015, ZIKV/Hu/Chiba/S36/2016 e/ou
Cuba2017. Em algumas modalidades, a cepa PRVABC59 é usada na presente divulgação.
[072] Em algumas modalidades, um exemplo de uma sequência de genoma de vírus da Zika é apresentado abaixo como a SEQ ID Nº: 2: 1 gttgttgatc tgtgtgaatc agactgcgac agttcgagtt tgaagcgaaa gctagcaaca 61 gtatcaacag gttttatttt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa 121 aaagaaatcc ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtgag 181 cccctttggg ggcttgaaga ggctgccagc cggacttctg ctgggtcatg ggcccatcag 241 gatggtcttg gcgattctag cctttttgag attcacggca atcaagccat cactgggtct 301 catcaataga tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaacaataa agaagttcaa 361 gaaagatctg gctgccatgc tgagaataat caatgctagg aaggagaaga agagacgagg 421 cgcagatact agtgtcggaa ttgttggcct cctgctgacc acagctatgg cagcggaggt 481 cactagacgt gggagtgcat actatatgta cttggacaga aacgatgctg gggaggccat 541 atcttttcca accacattgg ggatgaataa gtgttatata cagatcatgg atcttggaca 601 catgtgtgat gccaccatga gctatgaatg ccctatgctg gatgaggggg tggaaccaga 661 tgacgtcgat tgttggtgca acacgacgtc aacttgggtt gtgtacggaa cctgccatca 721 caaaaaaggt gaagcacgga gatctagaag agctgtgacg ctcccctccc attccaccag 781 gaagctgcaa acgcggtcgc aaacctggtt ggaatcaaga gaatacacaa agcacttgat 841 tagagtcgaa aattggatat tcaggaaccc tggcttcgcg ttagcagcag ctgccatcgc 901 ttggcttttg ggaagctcaa cgagccaaaa agtcatatac ttggtcatga tactgctgat 961 tgccccggca tacagcatca ggtgcatagg agtcagcaat agggactttg tggaaggtat 1021 gtcaggtggg acttgggttg atgttgtctt ggaacatgga ggttgtgtca ccgtaatggc 1081 acaggacaaa ccgactgtcg acatagagct ggttacaaca acagtcagca acatggcgga 1141 ggtaagatcc tactgctatg aggcatcaat atcagacatg gcttctgaca gccgctgccc 1201 aacacaaggt gaagcctacc ttgacaagca atcagacact caatatgtct gcaaaagaac 1261 gttagtggac agaggctggg gaaatggatg tggacttttt ggcaaaggga gcctggtgac 1321 atgcgctaag tttgcatgct ccaagaaaat gaccgggaag agcatccagc cagagaatct 1381 ggagtaccgg ataatgctgt cagttcatgg ctcccagcac agtgggatga tcgttaatga 1441 cacaggacat gaaactgatg agaatagagc gaaagttgag ataacgccca attcaccgag 1501 agccgaagcc accctggggg gttttggaag cctaggactt gattgtgaac cgaggacagg 1561 ccttgacttt tcagatttgt attacttgac tatgaataac aagcactggt tggttcacaa 1621 ggagtggttc cacgacattc cattaccttg gcacgctggg gcagacaccg gaactccaca 1681 ctggaacaac aaagaagcac tggtagagtt caaggacgca catgccaaaa ggcaaactgt 1741 cgtggttcta gggagtcaag aaggagcagt tcacacggcc cttgctggag ctctggaggc 1801 tgagatggat ggtgcaaagg gaaggctgtc ctctggccac ttgaaatgtc gcctgaaaat
1861 ggataaactt agattgaagg gcgtgtcata ctccttgtgt actgcagcgt tcacattcac 1921 caagatcccg gctgaaacac tgcacgggac agtcacagtg gaggtacagt acgcagggac 1981 agatggacct tgcaaggttc cagctcagat ggcggtggac atgcaaactc tgaccccagt 2041 tgggaggttg ataaccgcta accccgtaat cactgaaagc actgagaact ctaagatgat 2101 gctggaactt gatccaccat ttggggactc ttacattgtc ataggagtcg gggagaagaa 2161 gatcacccac cactggcaca ggagtggcag caccattgga aaagcatttg aagccactgt 2221 gagaggtgcc aagagaatgg cagtcttggg agacacagcc tgggactttg gatcagttgg 2281 aggcgctctc aactcattgg gcaagggcat ccatcaaatt tttggagcag ctttcaaatc 2341 attgtttgga ggaatgtcct ggttctcaca aattctcatt ggaacgttgc tgatgtggtt 2401 gggtctgaac acaaagaatg gatctatttc ccttatgtgc ttggccttag ggggagtgtt 2461 gatcttctta tccacagccg tctctgctga tgtggggtgc tcggtggact tctcaaagaa 2521 ggagacgaga tgcggtacag gggtgttcgt ctataacgac gttgaagcct ggagggacag 2581 gtacaagtac catcctgact ccccccgtag attggcagca gcagtcaagc aagcctggga 2641 agatggtatc tgcgggatct cctctgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggagatcagt 2701 agaaggggag ctcaacgcaa tcctggaaga gaatggagtt caactgacgg tcgttgtggg 2761 atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtcc acagagattg cccgtgcctg tgaacgagct 2821 gccccacggc tggaaggctt gggggaaatc gtatttcgtc agagcagcaa agacaaataa 2881 cagctttgtc gtggatggtg acacactgaa ggaatgccca ctcaaacata gagcatggaa 2941 cagctttctt gtggaggatc atgggttcgg ggtatttcac actagtgtct ggctcaaggt 3001 tagagaagat tattcattag agtgtgatcc agccgttatt ggaacagctg ttaagggaaa 3061 ggaggctgta cacagtgatc taggctactg gattgagagt gagaagaatg acacatggag 3121 gctgaagagg gcccatctga tcgagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt cccacacatt 3181 gtggacagat ggaatagaag agagtgatct gatcataccc aagtctttag ctgggccact 3241 cagccatcac aataccagag agggctacag gacccaaatg aaagggccat ggcacagtga 3301 agagcttgaa attcggtttg aggaatgccc aggcactaag gtccacgtgg aggaaacatg 3361 tggaacaaga ggaccatctc tgagatcaac cactgcaagc ggaagggtga tcgaggaatg 3421 gtgctgcagg gagtgcacaa tgcccccact gtcgttccgg gctaaagatg gctgttggta 3481 tggaatggag ataaggccca ggaaagaacc agaaagcaac ttagtaaggt caatggtgac 3541 tgcaggatca actgatcaca tggaccactt ctcccttgga gtgcttgtga tcctgctcat 3601 ggtgcaggaa gggctgaaga agagaatgac cacaaagatc atcataagca catcaatggc 3661 agtgctggta gctatgatcc tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcta agcttgcaat 3721 tttgatgggt gccaccttcg cggaaatgaa cactggagga gatgtagctc atctggcgct 3781 gatagcggca ttcaaagtca gaccagcgtt gctggtatct ttcatcttca gagctaattg 3841 gacaccccgt gaaagcatgc tgctggcctt ggcctcgtgt cttttgcaaa ctgcgatctc 3901 cgccttggaa ggcgacctga tggttctcat caatggtttt gctttggcct ggttggcaat 3961 acgagcgatg gttgttccac gcactgataa catcaccttg gcaatcctgg ctgctctgac
4021 accactggcc cggggcacac tgcttgtggc gtggagagca ggccttgcta cttgcggggg 4081 gtttatgctc ctctctctga agggaaaagg cagtgtgaag aagaacttac catttgtcat 4141 ggccctggga ctaaccgctg tgaggctggt cgaccccatc aacgtggtgg gactgctgtt 4201 gctcacaagg agtgggaagc ggagctggcc ccctagcgaa gtactcacag ctgttggcct 4261 gatatgcgca ttggctggag ggttcgccaa ggcagatata gagatggctg ggcccatggc 4321 cgcggtcggt ctgctaattg tcagttacgt ggtctcagga aagagtgtgg acatgtacat 4381 tgaaagagca ggtgacatca catgggaaaa agatgcggaa gtcactggaa acagtccccg 4441 gctcgatgtg gcgctagatg agagtggtga tttctccctg gtggaggatg acggtccccc 4501 catgagagag atcatactca aggtggtcct gatgaccatc tgtggcatga acccaatagc 4561 catacccttt gcagctggag cgtggtacgt atacgtgaag actggaaaaa ggagtggtgc 4621 tctatgggat gtgcctgctc ccaaggaagt aaaaaagggg gagaccacag atggagtgta 4681 cagagtaatg actcgtagac tgctaggttc aacacaagtt ggagtgggag ttatgcaaga 4741 gggggtcttt cacactatgt ggcacgtcac aaaaggatcc gcgctgagaa gcggtgaagg 4801 gagacttgat ccatactggg gagatgtcaa gcaggatctg gtgtcatact gtggtccatg 4861 gaagctagat gccgcctggg atgggcacag cgaggtgcag ctcttggccg tgccccccgg 4921 agagagagcg aggaacatcc agactctgcc cggaatattt aagacaaagg atggggacat 4981 tggagcggtt gcgctggatt acccagcagg aacttcagga tctccaatcc tagacaagtg 5041 tgggagagtg ataggacttt atggcaatgg ggtcgtgatc aaaaacggga gttatgttag 5101 tgccatcacc caagggagga gggaggaaga gactcctgtt gagtgcttcg agccctcgat 5161 gctgaagaag aagcagctaa ctgtcttaga cttgcatcct ggagctggga aaaccaggag 5221 agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaacaaga ctccgtactg tgatcttagc 5281 tccaaccagg gttgtcgctg ctgaaatgga ggaggccctt agagggcttc cagtgcgtta 5341 tatgacaaca gcagtcaatg tcacccactc tggaacagaa atcgtcgact taatgtgcca 5401 tgccaccttc acttcacgtc tactacagcc aatcagagtc cccaactata atctgtatat 5461 tatggatgag gcccacttca cagatccctc aagtatagca gcaagaggat acatttcaac 5521 aagggttgag atgggcgagg cggctgccat cttcatgacc gccacgccac caggaacccg 5581 tgacgcattt ccggactcca actcaccaat tatggacacc gaagtggaag tcccagagag 5641 agcctggagc tcaggctttg attgggtgac ggatcattct ggaaaaacag tttggtttgt 5701 tccaagcgtg aggaacggca atgagatcgc agcttgtctg acaaaggctg gaaaacgggt 5761 catacagctc agcagaaaga cttttgagac agagttccag aaaacaaaac atcaagagtg 5821 ggactttgtc gtgacaactg acatttcaga gatgggcgcc aactttaaag ctgaccgtgt 5881 catagattcc aggagatgcc taaagccggt catacttgat ggcgagagag tcattctggc 5941 tggacccatg cctgtcacac atgccagcgc tgcccagagg agggggcgca taggcaggaa 6001 tcccaacaaa cctggagatg agtatctgta tggaggtggg tgcgcagaga ctgacgaaga 6061 ccatgcacac tggcttgaag caagaatgct ccttgacaat atttacctcc aagatggcct 6121 catagcctcg ctctatcgac ctgaggccga caaagtagca gccattgagg gagagttcaa
6181 gcttaggacg gagcaaagga agacctttgt ggaactcatg aaaagaggag atcttcctgt 6241 ttggctggcc tatcaggttg catctgccgg aataacctac acagatagaa gatggtgctt 6301 tgatggcacg accaacaaca ccataatgga agacagtgtg ccggcagagg tgtggaccag 6361 acacggagag aaaagagtgc tcaaaccgag gtggatggac gccagagttt gttcagatca 6421 tgcggccctg aagtcattca aggagtttgc cgctgggaaa agaggagcgg cttttggagt 6481 gatggaagcc ctgggaacac tgccaggaca catgacagag agattccagg aagccattga 6541 caacctcgct gtgctcatgc gggcagagac tggaagcagg ccttacaaag ccgcggcggc 6601 ccaattgccg gagaccctag agaccataat gcttttgggg ttgctgggaa cagtctcgct 6661 gggaatcttc ttcgtcttga tgaggaacaa gggcataggg aagatgggct ttggaatggt 6721 gactcttggg gccagcgcat ggctcatgtg gctctcggaa attgagccag ccagaattgc 6781 atgtgtcctc attgttgtgt tcctattgct ggtggtgctc atacctgagc cagaaaagca 6841 aagatctccc caggacaacc aaatggcaat catcatcatg gtagcagtag gtcttctggg 6901 cttgattacc gccaatgaac tcggatggtt ggagagaaca aagagtgacc taagccatct 6961 aatgggaagg agagaggagg gggcaaccat aggattctca atggacattg acctgcggcc 7021 agcctcagct tgggccatct atgctgcctt gacaactttc attaccccag ccgtccaaca 7081 tgcagtgacc acctcataca acaactactc cttaatggcg atggccacgc aagctggagt 7141 gttgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tcccgctgct 7201 aatgataggt tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct 7261 cgtggcgcac tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagctgcgc gtgctgccca 7321 gaagagaacg gcagctggca tcatgaagaa ccctgttgtg gatggaatag tggtgactga 7381 cattgacaca atgacaattg acccccaagt ggagaaaaag atgggacagg tgctactcat 7441 agcagtagcc gtctccagcg ccatactgtc gcggaccgcc tgggggtggg gggaggctgg 7501 ggctctgatc acagccgcaa cttccacttt gtgggaaggc tctccgaaca agtactggaa 7561 ctcctctaca gccacttcac tgtgtaacat ttttagggga agttacttgg ctggagcttc 7621 tctaatctac acagtaacaa gaaacgctgg cttggtcaag agacgtgggg gtggaacagg 7681 agagaccctg ggagagaaat ggaaggcccg cttgaaccag atgtcggccc tggagttcta 7741 ctcctacaaa aagtcaggca tcaccgaggt gtgcagagaa gaggcccgcc gcgccctcaa 7801 ggacggtgtg gcaacgggag gccatgctgt gtcccgagga agtgcaaagc tgagatggtt 7861 ggtggagcgg ggatacctgc agccctatgg aaaggtcatt gatcttggat gtggcagagg 7921 gggctggagt tactacgtcg ccaccatccg caaagttcaa gaagtgaaag gatacacaaa 7981 aggaggccct ggtcatgaag aacccgtgtt ggtgcaaagc tatgggtgga acatagtccg 8041 tcttaagagt ggggtggacg tctttcatat ggcggctgag ccgtgtgaca cgttgctgtg 8101 tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagaa gcacggacgc tcagagtcct 8161 ctccatggtg ggggattggc ttgaaaaaag accaggagcc ttttgtataa aagtgttgtg 8221 cccatacacc agcactatga tggaaaccct ggagcgactg cagcgtaggt atgggggagg 8281 actggtcaga gtgccactct cccgcaactc tacacatgag atgtactggg tctctggagc
8341 gaaaagcaac accataaaaa gtgtgtccac cacgagccag ctcctcttgg ggcgcatgga 8401 cgggcctagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaat ctcggctctg gcacgcgggc 8461 tgtggtaagc tgcgctgaag ctcccaacat gaagatcatt ggtaaccgca ttgaaaggat 8521 ccgcagtgag cacgcggaaa cgtggttctt tgacgagaac cacccatata ggacatgggc 8581 ttaccatgga agctatgagg cccccacaca agggtcagcg tcctctctaa taaacggggt 8641 tgtcaggctc ctgtcaaaac cctgggatgt ggtgactgga gtcacaggaa tagccatgac 8701 cgacaccaca ccgtatggtc agcaaagagt tttcaaggaa aaagtggaca ctagggtgcc 8761 agacccccaa gaaggcactc gtcaggttat gagcatggtc tcttcctggt tgtggaaaga 8821 gctaggcaaa cacaaacggc cacgagtctg caccaaagaa gagttcatca acaaggttcg 8881 tagcaatgca gcattagggg caatatttga agaggaaaaa gagtggaaga ctgcagtgga 8941 agctgtgaac gatccaaggt tctgggctct agtggacaag gaaagagagc accacctgag 9001 aggagagtgc cagagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga aacaagggga 9061 atttggaaag gccaagggca gccgcgccat ctggtatatg tggctagggg ctagatttct 9121 agagttcgaa gcccttggat tcttgaacga ggatcactgg atggggagag agaactcagg 9181 aggtggtgtt gaagggctgg gattacaaag actcggatat gtcctagaag agatgagtcg 9241 tataccagga ggaaggatgt atgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagcag 9301 gtttgatctg gagaatgaag ctctaatcac caaccaaatg gagaaagggc acagggcctt 9361 ggcattggcc ataatcaagt acacatacca aaacaaagtg gtaaaggtcc ttagaccagc 9421 tgaaaaaggg aaaacagtta tggacattat ttcgagacaa gaccaaaggg ggagcggaca 9481 agttgtcact tacgctctta acacatttac caacctagtg gtgcaactca ttcggaatat 9541 ggaggctgag gaagttctag agatgcaaga cttgtggctg ctgcggaggt cagagaaagt 9601 gaccaactgg ttgcagagca acggatggga taggctcaaa cgaatggcag tcagtggaga 9661 tgattgcgtt gtgaagccaa ttgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga 9721 tatgggaaaa gttaggaagg acacacaaga gtggaaaccc tcaactggat gggacaactg 9781 ggaagaagtt ccgttttgct cccaccactt caacaagctc catctcaagg acgggaggtc 9841 cattgtggtt ccctgccgcc accaagatga actgattggc cgggcccgcg tctctccagg 9901 ggcgggatgg agcatccggg agactgcttg cctagcaaaa tcatatgcgc aaatgtggca 9961 gctcctttat ttccacagaa gggacctccg actgatggcc aatgccattt gttcatctgt 10021 gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac tacctggtca atccatggaa agggagaatg 10081 gatgaccact gaagacatgc ttgtggtgtg gaacagagtg tggattgagg agaacgacca 10141 catggaagac aagaccccag ttacgaaatg gacagacatt ccctatttgg gaaaaaggga 10201 agacttgtgg tgtggatctc tcatagggca cagaccgcgc accacctggg ctgagaacat 10261 taaaaacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10321 cctatccacc caagttcgct acttgggtga agaagggtct acacctggag tgctgtaagc 10381 accaatctta atgttgtcag gcctgctagt cagccacagc ttggggaaag ctgtgcagcc 10441 tgtgaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagcctatag tcaggccgag aacgccatgg
10501 cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac 10561 gcgcttggag gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg 10621 gcctgaactg gagatcagct gtggatctcc agaagaggga ctagtggtta gagga
[073] Em algumas modalidades, o vírus da Zika pode compreender a sequência de genoma de número de acesso GenBank KU501215.1. Em algumas modalidades, o vírus da Zika é da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, a sequência de genoma de número de acesso GenBank KU501215.1 compreende a sequência da SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, o vírus da Zika pode compreender uma sequência genômica que tem pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID Nº: 2.
[074] Em algumas modalidades, o vírus da Zika pode compreender pelo menos um polipeptídeo codificado pela sequência da SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, o vírus da Zika pode compreender pelo menos um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência da SEQ ID Nº: 2.
[075] Consequentemente, em algumas modalidades, vírus da Zika inativados da presente divulgação podem ser usados em qualquer uma das vacinas e/ou composições imunogênicas divulgadas no presente documento. Por exemplo, vírus da Zika inativados da presente divulgação podem ser usados para fornecer um ou mais antígenos úteis para tratar ou prevenir infecção de vírus da Zika em um indivíduo que necessita dos mesmos e/ou para induzir uma resposta imunológica, tal como uma resposta imunológica de proteção, contra vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma.
[076] O vírus da Zika usado na presente divulgação pode ser obtido a partir de uma ou mais células na cultura celular (por exemplo, por meio de purificação de placa). Quaisquer células adequadas conhecidas na técnica para produzir vírus da Zika podem ser usadas que incluem, por exemplo, células de inseto (por exemplo, células de mosquito, tais como células CCL-125, células Aag-2, células RML-12, células C6/36, células C7-10, células AP-61, A.t. GRIP-1 células, A.t. GRIP-2 células, A.t. GRIP-3 células, células UM-AVE1, células Mos.55, células Sua1B, células 4a-3B, células Mos.42, células MSQ43, células LSB-AA695BB, células NIID-CTR, células TRA-171 e células adicionais, ou linhas celulares de espécies de mosquito, tais como Aedes aegypti, Aedes albopictus, Aedes pseudoscutellaris, Aedes triseriatus, Aedes vexans, Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Anopheles albimus, Culex quinquefasciatus, Culex theileri, Culex tritaeniorhynchus, Culex bitaeniorhynchus, e/ou Toxorhynchites amboinensis), e células de mamífero (por exemplo, células VERO (de rins de macaco), células LLC-MK2 (de rins de macaco), células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219 conforme descrito no documento nº WO97/37001), células BHK21-F, células HKCC ou células de ovário de hamster chinês (células CHO). Em algumas modalidades, o vírus da Zika (por exemplo, um isolado clonal de vírus da Zika) é produzido a partir de uma célula não humana. Em algumas modalidades, o vírus da Zika (por exemplo,
um isolado clonal de vírus da Zika) é produzido a partir de uma célula de inseto. Em algumas modalidades, o vírus da Zika (por exemplo, um isolado clonal de vírus da Zika) é produzido a partir de uma célula de mosquito. Em algumas modalidades, o vírus da Zika (por exemplo, um isolado clonal de vírus da Zika) é produzido a partir de uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, o vírus da Zika (por exemplo, um isolado clonal de vírus da Zika) é produzido a partir de uma célula VERO.
[077] Os vírus da Zika têm um sentido positivo, um genoma de RNA de fita única que codifica polipeptídeos tanto estruturais quanto não estruturais. O genoma também contém sequências não codificantes em ambas as regiões terminais 5' e 3' que têm papel importante na replicação de vírus. Polipeptídeos estruturais codificados por esses vírus incluem, sem limitação, cápside (C), membrana de precursor (prM) e envelope (E). Polipeptídeos não estruturais (NS) codificados por esses vírus incluem, sem limitação, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5.
[078] Em determinadas modalidades, o vírus da Zika inclui uma mutação em proteína não estrutural 1 (NS1) de vírus da Zika. Em algumas modalidades, o vírus da Zika contém uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1.
[079] Em algumas modalidades, a mutação está dentro do polipeptídeo de NS1. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de NS1 de tipo selvagem a partir de uma cepa de vírus da Zika exemplificativa é apresentada como:
DVGCSVDFSKKETRCGTGVFVYNDVEAWRDRYKYHPDSPRRLAAA VKQAWEDGICGISSVSRMENIMWRSVEGELNAILEENGVQLTVVVGS VKNPMWRGPQRLPVPVNELPHGWKAWGKSYFVRAAKTNNSFVVD GDTLKECPLKHRAWNSFLVEDHGFGVFHTSVWLKVREDYSLECDPA VIGTAVKGKEAVHSDLGYWIESEKNDTWRLKRAHLIEMKTCEWPKSH TLWTDGIEESDLIIPKSLAGPLSHHNTREGYRTQMKGPWHSEELEIRF
EECPGTKVHVEETCGTRGPSLRSTTASGRVIEEWCCRECTMPPLSF RAKDGCWYGMEIRPRKEPESNLVRSMVT (SEQ ID Nº: 1).
[080] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de NS1 tem pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de NS1 pode ser da sequência de aminoácidos codificada pela sequência de número de acesso GenBank KU501215.1 (SEQ ID Nº: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de NS1 pode ser as posições de aminoácido 795 a 1145 da sequência de aminoácidos codificada pela sequência de número de acesso GenBank KU501215.1. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de NS1 pode ser da cepa de vírus da Zika PRVABC59.
[081] A expressão "Identidade de sequência", "% de identidade de sequência", "% de identidade", "% idêntica" ou "alinhamento de sequência" significa uma comparação de uma primeira sequência de aminoácidos com uma segunda sequência de aminoácidos, ou uma comparação de uma primeira sequência de ácidos nucleicos com uma segunda sequência de ácidos nucleicos e é calculada como um percentual com base na comparação. O resultado desse cálculo pode ser descrito como "percentual idêntico" ou "percentual de ID."
[082] De modo geral, um alinhamento de sequência pode ser usado para calcular a identidade de sequência através de uma das duas abordagens diferentes. Na primeira abordagem, tanto inadequações em uma única posição quanto intervalos em uma única posição são contados como posições não idênticas no cálculo de identidade de sequência final. Na segunda abordagem, inadequações em uma única posição são contadas como posições não idênticas no cálculo de identidade de sequência final; no entanto, intervalos em uma única posição não são contados (ignorados) como posições não idênticas no cálculo de identidade de sequência final. Em outras palavras, na segunda abordagem intervalos são ignorados no cálculo de identidade de sequência final. A diferença entre essas duas abordagens, isto é, contagem de intervalos como posições não idêntico em relação aos intervalos ignorados, em uma única posição, pode resultar em variabilidade no valor de identidade de sequência entre duas sequências.
[083] Em algumas modalidades, uma identidade de sequência é determinada por um programa, que produz um alinhamento e calcula identidade contando-se tanto inadequações em uma única posição quanto intervalos em uma única posição como posições não idênticas em cálculo de identidade de sequência final. Por exemplo, o programa Needle (EMBOS), que implantou o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), e que calcula a identidade de sequência por definições padrão produzindo-se primeiro um alinhamento entre uma primeira sequência e uma segunda sequência, então, contando-se o número de posições idênticas sobre o comprimento do alinhamento, então, dividindo-se o número de resíduos idênticos pelo comprimento de um alinhamento, então, multiplicando-se esse número por 100 para gerar o % de identidade de sequência [% de identidade de sequência = (nº de resíduos idênticos/comprimento de alinhamento) x 100)].
[084] Uma identidade de sequência pode ser calculada a partir de um alinhamento de pares que mostra ambas sequências sobre o comprimento inteiro, assim, se mostra a primeira sequência e a segunda sequência em seu comprimento inteiro ("Identidade de Sequência Global"). Por exemplo, programa Needle (EMBOSS) produz tais alinhamentos; % de identidade de sequência = (Nº de resíduos idênticos/comprimento de alinhamento) x 100)].
[085] Uma identidade de sequência pode ser calculada a partir de um alinhamento de pares que mostra apenas uma região local da primeira sequência ou da segunda sequência ("Identidade Local"). Por exemplo, o programa Blast (NCBI) produz tais alinhamentos; % de identidade de sequência = (nº de resíduos idênticos/comprimento de alinhamento) x 100)].
[086] O alinhamento de sequência é preferencialmente gerado com o uso do algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (1979) 48, páginas 443-453). Preferencialmente, o programa "NEEDLE" (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)) é usado com o parâmetro padrão de programas (intervalo aberto = 10,0, intervalo estendido = 0,5 e matriz = EBLOSUM62 para proteínas e matriz = EDNAFULL para nucleotídeos). Então, uma identidade de sequência pode ser calculada a partir do alinhamento que mostra ambas sequências sobre o comprimento inteiro, assim, se mostra a primeira sequência e a segunda sequência em seu comprimento inteiro ("Identidade de Sequência Global"). Por exemplo: % de identidade de sequência = (Nº de resíduos idênticos/comprimento de alinhamento) x 100)].
[087] Em algumas modalidades, a mutação ocorre em uma ou mais posições de aminoácido dentro do polipeptídeo de NS1. Em algumas modalidades, a mutação ocorre na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1 quando alinhada com a SEQ ID Nº: 1 com o uso de um algoritmo de alinhamento de pares. Em algumas modalidades, a mutação na posição 98 é uma substituição de triptofano por glicina.
[088] Em algumas modalidades, o vírus da Zika compreende uma mutação na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1. Uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1 pode ser determinada alinhando-se a sequência de aminoácidos de uma proteína NS-1 com a SEQ ID Nº: 1 com o uso de um algoritmo de alinhamento de pares. Resíduos de aminoácido em vírus diferentes do vírus da Zika, que correspondem ao resíduo de triptofano na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 são mostrados na Figura 7 do presente pedido, onde esses resíduos estão em caixas. Em algumas modalidades, a mutação na posição 98 é uma substituição de triptofano por glicina. Em algumas modalidades, a mutação na posição 98 é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1.
[089] Em algumas modalidades, o vírus da Zika contém uma mutação dentro da proteína NS1, e pelo menos uma mutação dentro de uma ou mais das proteínas virais C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. Em algumas modalidades, o vírus da Zika contém uma ou mais mutações dentro da proteína NS1, e não contém pelo menos uma mutação dentro de uma ou mais das proteínas virais C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. Em algumas modalidades, o vírus da Zika contém uma mutação dentro da proteína NS1 e não contém pelo menos uma mutação dentro da proteína de envelope E. Em algumas modalidades, o vírus inativado inteiro contém pelo menos uma mutação na proteína não estrutural 1 (NS1) de vírus da Zika, e não inclui uma mutação na proteína de envelope E (Env) de vírus da Zika. Em algumas modalidades, o vírus da Zika contém uma mutação na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1 e não contém nenhuma mutação dentro da proteína de envelope E. Em algumas modalidades, o vírus da Zika inativado inteiro contém uma mutação na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1 e não inclui uma mutação na proteína de envelope E (Env) de vírus da Zika. Em algumas modalidades, o vírus inativado inteiro contém pelo menos uma mutação na proteína não estrutural 1 (NS1) de vírus da Zika e a sequência que codifica a proteína de envelope é igual à sequência correspondente na SEQ ID NO 2. Em algumas modalidades, o vírus da Zika contém uma mutação na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1 e a sequência que codifica a proteína de envelope é igual à sequência correspondente na SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, o vírus da Zika inativado inteiro contém uma mutação na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1 e a sequência que codifica a proteína de envelope é igual à sequência correspondente na SEQ ID Nº: 2.
[090] Em algumas modalidades, o vírus da Zika contém pelo menos uma mutação que aprimora a estabilidade genética em comparação com um vírus da Zika que carece da pelo menos uma mutação. Em algumas modalidades, o vírus da Zika contém pelo menos uma mutação que aprimora a replicação viral em comparação com um vírus da Zika que carece da pelo menos uma mutação. Em algumas modalidades, o vírus da Zika contém pelo menos uma mutação que reduz ou, de outra forma, inibe a ocorrência de mutações indesejáveis, tal como dentro da proteína de envelope E (Env) do vírus da Zika.
[091] Nas modalidades acima da presente divulgação, um algoritmo de alinhamento de pares exemplificativo é o algoritmo de alinhamento global Needleman-Wunsch, que usa parâmetros padrão (por exemplo, com penalidade de abertura de intervalo = 10,0, e com penalidade de extensão de intervalo = 0,5, com o uso da matriz de pontuação EBLOSUM62). Esse algoritmo é convenientemente implantado na ferramenta needle no pacote EMBOSS.
[092] Em algumas modalidades, o vírus da Zika inativado pode ser usado em vacinas e composições imunogênicas. Por exemplo, o vírus da Zika inativado pode ser útil para tratar ou prevenir infecção de vírus da Zika em um indivíduo que necessita dos mesmos e/ou para induzir uma resposta imunológica, tal como uma resposta imunológica de proteção, contra vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma.
PRODUÇÃO DE VACINAS E COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS
[093] Outros aspectos da presente divulgação se referem às vacinas e composições imunogênicas de vírus da Zika que contêm um vírus inteiro inativado purificado, tal como um vírus da Zika com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus da Zika inteiro inativado purificado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus da Zika inteiro inativado purificado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59 que compreende a sequência genômica de acordo com a SEQ ID Nº: 2. Em uma modalidade, as vacinas e composições imunogênicas contêm um isolado de vírus da Zika clonal purificado de placa. Tais vacinas e composições imunogênicas podem ser úteis, por exemplo, para tratar ou prevenir infecção de vírus da Zika em um indivíduo que necessita dos mesmos e/ou para induzir uma resposta imunológica, tal como uma resposta imunológica de proteção, contra vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma.
[094] A produção de vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação inclui cultivo de vírus da Zika. Cultivo em cultura celular é um método para preparar vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação. Células para cultivo viral podem ser cultivadas em suspensão ou em condições aderentes.
[095] Linhas celulares adequadas para crescimento do pelo menos um vírus da presente divulgação são preferencialmente de origem mamífera e incluem, porém, sem limitação: células de inseto (por exemplo, células de mosquito, conforme descrito no presente documento, células VERO (de rins de macaco), células de cavalo, vaca (por exemplo, células MDBK), ovelha, cachorro (por exemplo, células MDCK dos rins de cachorro, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) ou MDCK 33016, número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito no documento nº WO97/37001), gato e roedor (por exemplo, células de hamster, tais como células BHK21-F, células HKCC ou células de ovário de hamster chinês (células CHO)), e podem ser obtidas a partir de uma ampla variedade de estágios de desenvolvimento que incluem, por exemplo, adulto, neonatal, fetal e embrião. Em determinadas modalidades, as células são imortalizadas (por exemplo, células PERC.6, conforme descrito nos documentos nº WO 01/38362 e WO 02/40665, e conforme depositado sob o número de depósito ECACC 96022940). Em modalidades preferenciais, células de mamífero são utilizadas e podem ser selecionadas a partir de e/ou derivadas a partir de um ou mais dentre os seguintes tipos de célula não limitantes: células de fibroblasto (por exemplo, dérmica, pulmonar), células endoteliais (por exemplo, aórtica, coronária, pulmonar, vascular, microvascular dérmica, umbilical), hepatócitos, queratinócitos, células imunológicas (por exemplo, célula T, célula B, macrófago, NK, dendríticas), células de mamífero (por exemplo, epiteliais), células de músculo liso (por exemplo, vascular, aórtica, coronária, arterial, uterina, bronquial, cervical, retiniana, pericitos), melanócitos, células neurais (por exemplo, astrócitos), células da próstata (por exemplo, epiteliais, de músculo liso), células renais (por exemplo, epiteliais, mesangiais, tubulares proximais), células esqueléticas (por exemplo, condrócito, osteoclasto, osteoblasto), células musculares (por exemplo, mioblasto, esqueléticas, lisas, bronquiais), células hepáticas, retinoblastos e células estromais. Os documentos nº WO 97/37000 e WO 97/37001 descrevem a produção de células e linhas celulares animais que têm capacidade para cultivo em suspensão e em meios isentos de soro e são úteis na produção e replicação de vírus.
[096] As condições de cultura para os tipos de célula acima são conhecidas e descritas em diversas publicações. Alternativamente, meio de cultura, complementos e condições podem ser adquiridos comercialmente, tais como, por exemplo, os descritos no catálogo e na literatura adicional de Cambrex Bioprodutos (East Rutherford, N.J.).
[097] Em determinadas modalidades, as células usadas nos métodos descritos no presente documento são cultivadas em meios isentos de soro e/ou proteína. Um meio é denominado um meio isento de soro no contexto da presente divulgação, caso não contenha nenhum aditivo de soro de origem humana ou animal. Entende-se que, isento de proteína, significa culturas nas quais a multiplicação das células ocorre com a exclusão de proteínas, fatores de crescimento, outros aditivos de proteína e proteínas não séricas, porém, podem incluir opcionalmente proteínas, tais como tripsina ou outras proteases que podem ser necessárias para o cultivo viral. As células que crescem em tais culturas naturalmente contêm, elas mesmas, proteínas.
[098] Meios isentos de soro conhecidos incluem meio Iscove, meio
Ultra-CHO (BioWhittaker) ou EX-CELL (JRH Bioscience). Meios que contêm soro comuns incluem Meio Basal de Eagle (BME) ou Meio Essencial Mínimo (MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959)) ou Meio de Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM ou EDM), que são normalmente usados com até 10% de soro de vitelo fetal ou aditivos similares. Opcionalmente, Meio Essencial Mínimo (MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959)) ou Meio de Eagle Mínimo da Dulbecco (DMEM ou EDM) podem ser usados sem qualquer complemento que contém soro. Meios isentos de proteína como PF-CHO (JHR Bioscience), meios quimicamente definidos como ProCHO 4CDM (BioWhittaker) ou SMIF 7 (Gibco/BRL Life Technologies) e peptídeos mitogênicos como Primactone, Pepticase ou HyPep.TM. (todos da Quest International) ou hidrolisado de lactalbumina (Gibco e outros fabricantes) também são adequadamente conhecidos na técnica anterior. Os aditivos de meios com base em hidrolisados vegetais têm a vantagem especial de que a contaminação com vírus, micoplasma ou agentes infecciosos desconhecidos pode ser descartada.
[099] Condições de cultura celular (temperatura, densidade celular, valor de pH, etc.) são variáveis sobre uma faixa muito ampla devido à adequação da linha celular empregada, de acordo com a presente divulgação, e podem ser adaptadas às exigências de cepas virais particulares.
[100] O método para propagar o vírus em células cultivadas inclui, de modo geral, as etapas de inocular as células cultivadas com a cepa a ser cultivada, cultivar as células infectadas durante um período de tempo desejado para propagação do vírus, tal como, por exemplo, conforme determinado pela titulação de vírus ou expressão de antígeno (por exemplo, entre 24 e 168 horas após inoculação) e coletar o vírus propagado. Em algumas modalidades, o vírus é coletado por meio de purificação de placa. As células cultivadas são inoculadas com um vírus
(medido por PFU ou TCID50) em razão celular de 1:500 a 1:1, preferencialmente 1:100 a 1:5. O vírus é adicionado a uma suspensão das células ou é aplicado a uma monocamada das células, e o vírus é absorvido nas células durante pelo menos 10 minutos, pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 40 minutos, pelo menos 50 minutos, pelo menos 60 minutos, porém, normalmente menos que 300 minutos a 25°C a 40°C, preferencialmente 28°C a 38°C.
A cultura celular infectada (por exemplo, monocamadas) pode ser removida coletando-se o sobrenadante (isento de células), descongelando-se ou através de ação enzimática para aumentar o teor viral dos sobrenadantes de cultura coletada.
Os fluidos coletados são, então, inativados ou armazenados congelados.
Células cultivadas podem ser infectadas em uma multiplicidade de infecção ("MOI") de cerca de 0,0001 a 10, preferencialmente de 0,002 a 5, mais preferencialmente 0,001 a 2. Ainda mais preferencialmente, as células são infectadas em uma MOI de cerca de 0,01. Durante a infecção a razão de meio de cultura para a área do vaso de cultura celular pode ser inferior àquela durante a cultura das células.
Manter essa razão baixa maximiza a probabilidade de que o vírus infectará as células.
O sobrenadante das células infectadas pode ser coletado a partir de 30 a 60 horas após infecção, ou 3 a 10 dias após infecção.
Em determinadas modalidades preferenciais, o sobrenadante das células infectadas é coletado de 3 a 7 dias após infecção.
Mais preferencialmente, o sobrenadante das células infectadas é coletado de 3 a 5 dias após infecção.
Em algumas modalidades, proteases (por exemplo, tripsina) podem ser adicionadas durante a cultura celular para permitir liberação viral, e as proteases podem ser adicionadas em qualquer estágio adequado durante a cultura.
Alternativamente, em determinadas modalidades, o sobrenadante de culturas celulares infectadas pode ser coletado e o vírus pode ser isolado ou de outra forma purificado a partir do sobrenadante.
[101] O inóculo viral e a cultura viral são preferencialmente isentos de (isto é, teriam sido testados e recebido um resultado negativo para contaminação pelo) vírus herpes simplex, vírus sincicial respiratório, vírus parainfluenza 3, coronavírus SARS, adenovírus, rinovírus, reovírus, poliomavírus, birnavírus, circovírus e/ou parvovírus (WO 2006/027698).
[102] Quando o vírus foi cultivado em uma linha celular, então, é prática padrão minimizar a quantidade de DNA de linha celular residual na vacina final, de modo a minimizar qualquer atividade oncogênica do DNA de célula hospedeira. DNA contaminado pode ser removido durante a preparação de vacina com o uso de procedimentos de purificação padrão, por exemplo, cromatografia, etc. Remoção de DNA de célula hospedeira residual pode ser aprimorada por tratamento de nuclease, por exemplo, com o uso de uma DNase. Um método conveniente para reduzir a contaminação de DNA de célula hospedeira divulgado nas referências (Lundblad (2001) Biotechnology and Applied Biochemistry 34:195-197, Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM). Maio de 2001) envolve um tratamento em duas etapas, primeiro com o uso de uma DNase (por exemplo, Benzonase), que pode ser usada durante cultivo viral e, então, um detergente catiônico (por exemplo, CTAB), que pode ser usado durante interrupção de vírion. Remoção através de tratamento com β- propiolactona também pode ser usada. Em uma modalidade, o DNA contaminado é removido através de tratamento com benzonase do sobrenadante de cultura.
PRODUÇÃO DE ANTÍGENOS
[103] O vírus da Zika pode ser produzido e/ou purificado ou de outra forma isolado através de qualquer método adequado conhecido na técnica. Em uma modalidade, o antígeno da presente divulgação é um vírus da Zika inteiro inativado purificado.
[104] Em algumas modalidades, o vírus inativado pode ser produzido, conforme descrito na seção acima intitulada "Produção de Vacinas e Composições Imunogênicas".
[105] Em determinadas modalidades, o vírus da Zika da presente divulgação pode ser produzido cultivando-se uma célula não humana. Linhas celulares adequadas para a produção de vírus da Zika da presente divulgação podem incluir células de inseto (por exemplo, quaisquer células de mosquito, conforme descrito no presente documento). Linhas celulares adequadas para a produção de vírus da Zika da presente divulgação também podem ser células de origem mamífera e incluem, porém, sem limitação: células de inseto (por exemplo, células de mosquito, conforme descrito no presente documento, células VERO (de rins de macaco), células de cavalo, vaca (por exemplo, células MDBK), ovelha, cachorro (por exemplo, células MDCK dos rins de cachorro, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) ou MDCK 33016, número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito no documento nº WO97/37001), gato e roedor (por exemplo, células de hamster, tais como células BHK21-F, células HKCC ou células de ovário de hamster chinês (células CHO)), e podem ser obtidas a partir de uma ampla variedade de estágios de desenvolvimento que incluem, por exemplo, adulto, neonatal, fetal e embrião. Em determinadas modalidades, as células são imortalizadas (por exemplo, células PERC.6, conforme descrito nos documentos nº WO 01/38362 e WO 02/40665, e conforme depositado sob o número de depósito ECACC 96022940). Em modalidades preferenciais, células de mamífero são utilizadas e podem ser selecionadas a partir de e/ou derivadas a partir de um ou mais dentre os seguintes tipos de célula não limitantes: células de fibroblasto (por exemplo, dérmica, pulmonar), células endoteliais (por exemplo, aórtica, coronária, pulmonar, vascular, microvascular dérmica, umbilical), hepatócitos, queratinócitos, células imunológicas (por exemplo, célula T, célula B, macrófago, NK, dendríticas), células de mamífero (por exemplo, epiteliais), células de músculo liso (por exemplo, vascular, aórtica, coronária, arterial, uterina, bronquial, cervical, retiniana, pericitos), melanócitos, células neurais (por exemplo, astrócitos), células da próstata (por exemplo, epiteliais, de músculo liso), células renais (por exemplo, epiteliais, mesangiais, tubulares proximais), células esqueléticas (por exemplo, condrócito, osteoclasto, osteoblasto), células musculares (por exemplo, mioblasto, esqueléticas, lisas, bronquiais), células hepáticas, retinoblastos e células estromais. Os documentos nº WO 97/37000 e WO 97/37001 descrevem a produção de células e linhas celulares animais que têm capacidade para cultivo em suspensão e em meios isentos de soro e são úteis na produção de antígenos virais. Em determinadas modalidades, a célula não humana é cultivada em meios isentos de soro.
INATIVAÇÃO DE VÍRUS
[0106] Determinadas modalidades da presente divulgação se referem às vacinas e/ou composições imunogênicas de vírus da Zika que contêm um vírus da Zika inativado purificado. O termo "vírus da Zika inativado", conforme usado no presente documento, é destinado a compreender um vírus da Zika que foi tratado com um método de inativação, tal como tratamento com uma quantidade eficaz de formalina. Em particular, o vírus da Zika inativado é obtenível/obtido a partir de um método em que o vírus da Zika é tratado com formaldeído em uma quantidade de cerca de 0,01% em p/v por 10 dias a uma temperatura de 20°C a 24°C. O vírus da Zika inativado não tem mais capacidade para infectar células hospedeiras que podem ser infectadas com um vírus da Zika que não foi inativado. Em uma modalidade, o vírus da Zika inativado não tem mais capacidade para infectar células VERO e para exercer um efeito citopático nas células VERO.
[0107] O termo "vírus da Zika purificado" significa que o vírus da Zika foi submetido a um processo de purificação conforme descrito abaixo. O vírus da Zika purificado tem um teor de proteínas de célula hospedeira, tais como proteínas de célula Vero e DNA de célula hospedeira, tais como DNA de célula Vero, inferior a um vírus da Zika não purificado. A pureza do vírus da Zika purificado pode ser determinada por cromatografia de exclusão de tamanho. O pico principal do vírus da Zika purificado na cromatografia de exclusão de tamanho pode ser maior que 85% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão de tamanho, ou mais que 90% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão de tamanho, ou mais que 95% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão de tamanho. Tais resultados são considerados vírus da Zika "purificado".
[0108] O termo "vírus da Zika inteiro inativado purificado" se refere, assim, a um vírus da Zika obtenível/obtido a partir de um método em que o vírus da Zika purificado é tratado com formaldeído em uma quantidade de 0,01% em p/v por 10 dias a uma temperatura de 20°C a 24°C e fornece um pico principal de pelo menos 85% da área total sob a curva na cromatografia de exclusão de tamanho. Em determinadas modalidades, o vírus da Zika inteiro inativado purificado é um isolado clonal obtido/obtenível por purificação de placa.
[0109] Métodos para inativar ou eliminar vírus para destruir sua habilidade em infectar células de mamífero, porém, não destroem a estrutura secundária, terciária ou quaternária e epítopos imunogênicos do vírus são conhecidos na técnica. Tais métodos incluem ambos os meios químico e físico. Meios adequados para inativar um vírus incluem, sem limitação, tratamento com uma quantidade eficaz de um ou mais agentes selecionados a partir de detergentes, formalina (também denominada no presente documento "formaldeído"), peróxido de hidrogênio, beta-propiolactona (BPL), etilamina binária (BEI), etilenoimina de acetila, calor, radiação eletromagnética, radiação de raio x, radiação gama, radiação ultravioleta (radiação UV), radiação UV-A, radiação UV-B, radiação UV-C, azul de metileno, psoraleno, carboxifulereno (C60), peróxido de hidrogênio e qualquer combinação de qualquer um dos mesmos. Conforme já mencionado acima, para os fins do presente pedido os termos "formalina" e "formaldeído" são usados intercambiavelmente.
[0110] Em determinadas modalidades da presente divulgação, o pelo menos um vírus é quimicamente inativado. Agentes para inativação química e métodos para inativação química são bem conhecidos na técnica e descritos no presente documento. Em algumas modalidades, o pelo menos um vírus é quimicamente inativado com um ou mais dentre BPL, peróxido de hidrogênio, formalina ou BEI. Em determinadas modalidades, em que o pelo menos um vírus é quimicamente inativado com BPL, o vírus pode conter uma ou mais modificações. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações podem incluir um ácido nucleico modificado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico modificado é um ácido nucleico alquilado. Em outras modalidades, a uma ou mais modificações podem incluir um polipeptídeo modificado. Em algumas modalidades, o polipeptídeo modificado contém um resíduo de aminoácido modificado que inclui uma ou mais dentre uma cisteína, metionina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, tirosina, lisina, serina e treonina modificada.
[0111] Em determinadas modalidades, em que o pelo menos um vírus é quimicamente inativado com formalina, o vírus inativado pode conter uma ou mais modificações. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações podem incluir um polipeptídeo modificado. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações podem incluir um polipeptídeo reticulado. Em algumas modalidades em que o pelo menos um vírus é quimicamente inativado com formalina, a vacina ou composição imunogênica inclui adicionalmente formalina. Em determinadas modalidades, em que o pelo menos um vírus é quimicamente inativado com BEI, o vírus pode conter uma ou mais modificações. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações podem incluir um ácido nucleico modificado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico modificado é um ácido nucleico alquilado.
[0112] Em algumas modalidades em que o pelo menos um vírus é quimicamente inativado com formalina, qualquer formalina não reagida residual pode ser neutralizada com metabissulfito de sódio, pode ser dialisada e/ou pode ser trocada por tampão para remover a formalina não reagida residual. Em algumas modalidades, o metabissulfito de sódio é adicionado em excesso. Em algumas modalidades, as soluções podem ser misturadas com o uso de um misturador, tal como um misturador estático alinhado, e subsequentemente filtradas ou adicionalmente purificadas (por exemplo, com o uso de um sistema de filtrações de fluxo cruzado).
[0113] Determinadas modalidades da presente divulgação se referem a um método para inativar uma preparação de vírus da Zika. Em algumas modalidades, o método envolve (a) isolar a preparação de vírus da Zika de uma ou mais células cultivadas in vitro que são usadas para produzir a preparação de vírus e (b) tratar a preparação de vírus com a partir de cerca de 0,005% a cerca de 0,02% em v/v de formaldeído.
[0114] Em algumas modalidades, as células são células não humanas. Células de mamífero não humano adequadas incluem, porém, sem limitação, células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito no documento Nº WO97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO). Em algumas modalidades, as células de mamífero são células Vero.
[0115] Em determinadas modalidades do método, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina a uma temperatura que está na faixa de cerca de 2°C a cerca de 42°C. Por exemplo, a preparação de vírus da Zika pode ser tratada com formalina a uma temperatura que está na faixa de cerca de 2°C a cerca de 42°C, cerca de 2°C a cerca de 8°C, cerca de 15°C a cerca de 37°C, cerca de 17°C a cerca de 27°C, cerca de 20°C a cerca de 25°C, ou a uma temperatura de cerca de 2°C, cerca de 4°C, cerca de 8°C, cerca de 10°C, cerca de 15°C, cerca de 17°C, cerca de 18°C, cerca de 19°C, cerca de 20°C, cerca de 21°C, cerca de 22°C, cerca de 23°C, cerca de 24°C, cerca de 25°C, cerca de 26°C, cerca de 27°C, cerca de 28°C, cerca de 29°C, cerca de 30°C, cerca de 37°C, ou cerca de 42°C. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina a uma temperatura de 15°C a 30°C. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina a uma temperatura de 18°C a 25°C. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina a uma temperatura de 22°C.
[0116] Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina durante pelo menos cerca de 1 dia. Por exemplo, a preparação de vírus da Zika pode ser tratada com formalina durante pelo menos cerca de 1 dia, pelo menos cerca de 2 dias, pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 4 dias, pelo menos cerca de 5 dias, pelo menos cerca de 6 dias, pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 8 dias, pelo menos cerca de 9 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 11 dias, pelo menos cerca de 12 dias,
pelo menos cerca de 13 dias, pelo menos cerca de 14 dias, pelo menos cerca de 15 dias, pelo menos cerca de 16 dias, pelo menos cerca de 17 dias, pelo menos cerca de 18 dias, pelo menos cerca de 19 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 21 dias, pelo menos cerca de 22 dias, pelo menos cerca de 23 dias, pelo menos cerca de 24 dias, pelo menos cerca de 25 dias, pelo menos cerca de 26 dias, pelo menos cerca de 27 dias, pelo menos cerca de 28 dias, pelo menos cerca de 29 dias, pelo menos cerca de 30 dias, ou mais. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina durante pelo menos cerca de 9 dias. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina durante pelo menos cerca de 11 dias. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina durante pelo menos cerca de 14 dias. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina durante pelo menos cerca de 20 dias. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina durante pelo menos cerca de 30 dias. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina durante oito a doze dias. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina durante nove a onze dias. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com formalina durante dez dias.
[0117] No meio do período de tratamento de inativação, a mistura da preparação de vírus e da formalina pode ser filtrada para remover agregados. Após filtração, a mistura da preparação de vírus e da formalina é transferida para um novo vaso e adicionalmente tratada com formalina até o fim do período de tratamento de inativação. Em algumas modalidades, a mistura da preparação de vírus e da formalina é filtrada após quatro a seis dias de tratamento com formalina, se o período de tratamento com formalina total for de oito a doze dias. Em algumas modalidades, a mistura da preparação de vírus e da formalina é filtrada após cinco a seis dias de tratamento com formalina, se o período de tratamento com formalina total for de nove a onze dias. Em algumas modalidades, a mistura da preparação de vírus e da formalina é filtrada após cinco dias de tratamento com formalina, se o período de tratamento com formalina for de dez dias. Um filtro adequado para essa etapa é um filtro de 0,2 µm.
[0118] Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com 0,005 a 0,02% (p/v) de formalina durante oito a doze dias a uma temperatura de 15°C a 30°C. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com 0,008 a 0,015% (p/v) de formalina durante nove a onze dias a uma temperatura de 18°C a 25°C. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com 0,01 % (p/v) de formalina durante dez dias a uma temperatura de 22°C.
[0119] Uma preparação de vírus da Zika inteira inativada é considerada obtenível/obtida a partir de um método em que o vírus da Zika é tratado com formaldeído em uma quantidade que está na faixa de cerca de 0,02% em p/v durante 14 dias a uma temperatura de 22°C. Em algumas modalidades, uma preparação de vírus da Zika inteira inativada é considerada obtenível/obtida a partir de um método em que o vírus da Zika é tratado com formaldeído em uma quantidade de cerca de 0,01% em p/v durante 10 dias a uma temperatura de 22°C.
[0120] Em algumas modalidades, o método envolve adicionalmente neutralizar formalina não reagida com uma quantidade eficaz de metabissulfito de sódio. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz de metabissulfito de sódio está na faixa de cerca de 0,01 mM a cerca de 100 mM. Por exemplo, o metabissulfito de sódio pode ser adicionado em uma concentração eficaz de cerca de 0,01 mM a cerca de 100 mM, de cerca de 0,1 mM a cerca de 50 mM, de cerca de 0,5 mM a cerca de 20 mM, ou de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, ou em uma concentração de cerca de 0,01 mM, cerca de 0,05 mM, cerca de 0,1 mM, cerca de 0,25 mM, cerca de 0,5 mM, cerca de 0,75 mM, cerca de 1 mM, cerca de 2 mM, cerca de 3 mM, cerca de 4 mM, cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM, cerca de 20 mM, cerca de 30 mM cerca de 40 mM, cerca de 50 mM, cerca de 75 mM ou cerca de 100 mM. Em algumas modalidades, a formalina é neutralizada com cerca de 2 mM de metabissulfito de sódio.
[0121] Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com peróxido de hidrogênio. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com peróxido de hidrogênio em concentrações que estão na faixa de 0,1 a 3%, ou 0,1 a 1% em qualquer temperatura de 20°C a 30°C durante 5 a 120 minutos. Em algumas modalidades, a preparação de vírus da Zika é tratada com peróxido de hidrogênio em uma concentração final de 0,01% durante 60 minutos ou menos.
[0122] Em algumas modalidades, o método envolve (a) isolar a preparação de vírus da Zika de uma ou mais células cultivadas in vitro que são usadas para produzir a preparação de vírus; (b) purificar a preparação de vírus através de uma ou mais etapas de purificação; (c) tratar a preparação de vírus com uma quantidade eficaz de formalina; (d) neutralizar a preparação de vírus com uma quantidade eficaz de metabissulfito de sódio; e (e) preparar uma composição farmacêutica que compreende o vírus da Zika inativado. Qualquer método para purificar uma preparação de vírus conhecida na técnica pode ser empregado para isolar o vírus da Zika, que inclui, sem limitação, usar filtração de fluxo cruzado (CFF), cromatografia multimodal, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca catiônica e/ou cromatografia de troca aniônica. Em algumas modalidades, a preparação de vírus é isolada através de filtração de fluxo cruzado (CFF). Em algumas modalidades, a preparação de vírus é purificada até um alto grau em uma quantidade que é de cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95% cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais.
[0123] Em algumas modalidades, o vírus da Zika pode ser selecionado a partir do grupo de cepas que consiste nas cepas Mr 766, ArD 41519, IbH 30656, P6-740, EC Yap, FSS13025, ArD 7117, ArD 9957, ArD 30101, ArD 30156, ArD 30332, HD 78788, ArD 127707, ArD 127710, ArD 127984, ArD 127988, ArD 127994, ArD 128000, ArD 132912, 132915, ArD 141170, ArD 142623, ArD 149917, ArD 149810, ArD 149938, ArD 157995, ArD 158084, ArD 165522, ArD 165531, ArA 1465, ArA 27101, ArA 27290, ArA 27106, ArA 27096, ArA 27407, ArA 27433, ArA 506/96, ArA 975-99, Ara 982-99, ArA 986-99, ArA 2718, ArB 1362, Nigeria68, Malaysia66, Kedougou84, Suriname, MR1429, PRVABC59, ECMN2007, DakAr41524, H/PF/2013, R103451, 103344, 8375, JMB-185, ZIKV/H, sapiens/Brazil/Natal/2015, SPH2015, ZIKV/Hu/Chiba/S36/2016, Thailand SVO127/14, Philippine COC C0740, Brazil Fortaleza 2015 e Cuba2017.
[0124] Em determinadas modalidades, o vírus da Zika inclui uma mutação em proteína não estrutural 1 (NS1) de vírus da Zika. Em algumas modalidades, o vírus da Zika contém uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus da Zika inteiro inativado purificado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus da Zika inteiro inativado purificado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59 que compreende a sequência genômica de acordo com a SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus da Zika inteiro inativado purificado que se difere da cepa PRVABC59 em uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1.
[0125] As vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação que contêm um ou mais antígenos de pelo menos um vírus da Zika inativado podem ser úteis para tratar ou prevenir infecção de vírus da Zika em um indivíduo que necessita das mesmas e/ou para induzir uma resposta imunológica, tal como uma resposta imunológica de proteção, contra vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma.
DETERMINAÇÃO DE INTEGRIDADE DE INATIVAÇÃO
[0126] Outros aspectos da presente divulgação se referem aos métodos para determinar a integridade de inativação de uma preparação de arbovírus com o uso da infecção sequencial de dois tipos de célula diferentes. Esse método tem um limite surpreendentemente baixo de detecção (LOD) em comparação com um ensaio que usa apenas um tipo de célula e também em comparação com outros métodos, tal como o método TCID50. Ademais, esse método evita o uso de animais para determinar a infectividade do vírus inativado.
[0127] O método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de arbovírus compreende as seguintes etapas: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma preparação de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o sobrenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e
(iii) determinar se a preparação de vírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0128] Arbovírus são vírus que são transmitidos para seres humanos através de artrópodes. Os mesmos incluem vírus dos gêneros flavivírus, togavírus e buniavírus. A preparação de arbovírus examinada pelo método divulgado no presente documento contém um arbovírus que tem capacidade para infectar células de mamífero, em particular células Vero, e para provocar um efeito citopático nessas células. Em algumas modalidades, o arbovírus é selecionado a partir de um vírus da Zika, um vírus do Oeste do Nilo, um vírus da Febre Amarela, um vírus da Encefalite Japonesa, um vírus da dengue, um vírus da Encefalite de St. Louis, vírus da encefalite transmitida por carrapato, um vírus da Chikungunya, um vírus O'nyong'nyong ou um Mayarovirus. Em algumas modalidades, o arbovírus é um vírus da Zika.
[0129] Em algumas modalidades, o vírus da Zika pode ser selecionado a partir do grupo de cepas que consiste nas cepas Mr 766, ArD 41519, IbH 30656, P6-740, EC Yap, FSS13025, ArD 7117, ArD 9957, ArD 30101, ArD 30156, ArD 30332, HD 78788, ArD 127707, ArD 127710, ArD 127984, ArD 127988, ArD 127994, ArD 128000, ArD 132912, 132915, ArD 141170, ArD 142623, ArD 149917, ArD 149810, ArD 149938, ArD 157995, ArD 158084, ArD 165522, ArD 165531, ArA 1465, ArA 27101, ArA 27290, ArA 27106, ArA 27096, ArA 27407, ArA 27433, ArA 506/96, ArA 975-99, Ara 982-99, ArA 986-99, ArA 2718, ArB 1362, Nigeria68, Malaysia66, Kedougou84, Suriname, MR1429, PRVABC59, ECMN2007, DakAr41524, H/PF/2013, R103451, 103344, 8375, JMB-185, ZIKV/H, sapiens/Brazil/Natal/2015, SPH2015, ZIKV/Hu/Chiba/S36/2016, Thailand SVO127/14, Philippine COC C0740, Brazil Fortaleza 2015 e Cuba2017.
[0130] Em determinadas modalidades, o vírus da Zika inclui uma mutação em proteína não estrutural 1 (NS1) de vírus da Zika. Em algumas modalidades, o vírus da Zika contém uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus da Zika inteiro inativado purificado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus da Zika inteiro inativado purificado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59 que compreende a sequência genômica de acordo com a SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus da Zika inteiro inativado purificado que se difere da cepa PRVABC59 em uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1.
[0131] As células de inseto cultivadas são inoculadas com a preparação de arbovírus adicionando-se a preparação de arbovírus na cultura celular de inseto que contém células de inseto e meio de cultivo. As células de inseto inoculadas são, então, incubadas durante um primeiro período de tempo com a preparação de arbovírus sob condições adequadas. Em algumas modalidades, o primeiro período de tempo é de três a sete dias. Em algumas modalidades, o primeiro período de tempo é de cinco a sete dias. Em algumas modalidades, o primeiro período de tempo é de seis dias. Portanto, em algumas modalidades, as células de inseto inoculadas são incubadas com a preparação de arbovírus durante três a sete dias. Em algumas modalidades, as células de inseto inoculadas são incubadas com a preparação de arbovírus durante cinco a sete dias. Em algumas modalidades, as células de inseto inoculadas são incubadas com a preparação de arbovírus durante seis dias. Durante a incubação, qualquer vírus vivo será secretado no sobrenadante de célula de inseto.
[0132] As células de inseto usadas podem ser quaisquer células de inseto que podem ser infectadas pelo arbovírus a ser investigado e cuja viabilidade não é alterada por infecção viral. As células de inseto são selecionadas de modo que o vírus não tenha um efeito citopático nas células. Células de inseto adequadas incluem, porém, sem limitação, células CCL-125, células Aag-2, células RML-12, células C6/36, células C7-10, células AP-61, células A.t. GRIP-1, células A.t. GRIP-2, células A.t. GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos.55, células Sua1B, células 4a-3B, células Mos.42, células MSQ43, células LSB-AA695BB, células NIID-CTR e células TRA-171. Em algumas modalidades, as células de inseto são células C6/36.
[0133] O sobrenadante de célula de inseto produzido incubando-se as células de inseto com a preparação de arbovírus é, então, usado para inocular células de mamífero cultivadas. Para inoculação, o sobrenadante de célula de inseto é transferido para as células de mamífero e incubado com as células de mamífero durante 60 a 120 minutos ou durante 80 a 100 minutos ou durante 90 minutos. Após o meio de cultura celular de inoculação ser adicionado e as células de mamífero serem incubadas com o sobrenadante de célula de inseto durante um segundo período de tempo sob condições adequadas. Em algumas modalidades, o segundo período de tempo é de três a 14 dias. Em algumas modalidades, o segundo período de tempo é de cinco a doze dias. Em algumas modalidades, o segundo período de tempo é de seis a dez dias. Em algumas modalidades, o segundo período de tempo é de sete a nove dias. Em algumas modalidades, o segundo período de tempo é de oito dias. Portanto, em algumas modalidades, as células de mamífero inoculadas são incubadas com o sobrenadante de célula de inseto durante três a 14 dias. Em algumas modalidades, as células de mamífero inoculadas são incubadas com o sobrenadante de célula de inseto durante cinco a doze dias. Em algumas modalidades, as células de mamífero inoculadas são incubadas com o sobrenadante de célula de inseto durante sete a nove dias. Em algumas modalidades, as células de mamífero inoculadas são incubadas com o sobrenadante de célula de inseto durante oito dias. Durante a incubação, qualquer vírus vivo exercerá um efeito citopático nas células de mamífero. Durante a incubação, qualquer vírus de replicação residual exercerá um efeito citopático nas células de mamífero, tais como células Vero.
[0134] As células de mamífero usadas podem ser quaisquer células de mamífero que podem ser infectadas pelo arbovírus a ser investigado e em que o vírus exerce um efeito citopático. Células de mamífero adequadas incluem, porém, sem limitação, células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito no documento Nº WO97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO). Em algumas modalidades, as células de mamífero são células Vero.
[0135] Em algumas modalidades, o método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de arbovírus compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante de célula C6/36; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o sobrenadante de célula C6/36 produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e
(iii) determinar se a preparação de vírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0136] Em algumas modalidades, o método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de arbovírus compreende as seguintes etapas: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma preparação de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de vírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0137] Em algumas modalidades, o método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de arbovírus compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante de célula C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de célula C6/36 produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de vírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0138] Em algumas modalidades, o método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de vírus da Zika compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante de célula C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de célula C6/36 produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de vírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0139] Em algumas modalidades, o método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de vírus da Zika compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto durante três a sete dias, desse modo, se produz um sobrenadante de célula C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de célula C6/36 produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de vírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0140] Em algumas modalidades, o método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de vírus da Zika compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante de célula C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de célula C6/36 produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante três a 14 dias; e (iii) determinar se a preparação de vírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0141] Em algumas modalidades, o método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de vírus da Zika compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto durante três a sete dias, desse modo, se produz um sobrenadante de célula C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de célula C6/36 produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante três a 14 dias; e (iii) determinar se a preparação de vírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0142] Em algumas modalidades, o método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de vírus da Zika compreende as seguintes etapas: (i) inocular células C6/36 com uma preparação de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto durante seis dias, desse modo, se produz um sobrenadante de célula C6/36; (ii) inocular células Vero com o sobrenadante de célula C6/36 produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante oito dias; e
(iii) determinar se a preparação de vírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0143] No fim do segundo período de tempo é determinada a possibilidade de a preparação de vírus ter um efeito citopático nas células de mamífero. Um efeito citopático é qualquer alteração na estrutura celular provocada por invasão viral, infecção e germinação das células durante replicação viral. No método da presente divulgação, o efeito citopático é determinado por uma alteração na cor dos meios de rosa para laranja ou amarelo, se as células são cultivadas em um meio que contém vermelho fenol, ou por um exame microscópico das células de mamífero. Se o exame microscópico das células de mamífero mostra que as células redondas começam a se distanciar do vaso de cultura de tecido (placa, cavidade ou frasco) ou se liberam da placa/frasco de cultura de tecido, considera-se que um efeito citopático está presente. Outros indícios de um efeito citopático incluem a fusão de células adjacentes para formar sincícios e o surgimento de corpos de inclusão nucleares ou citoplasmáticos.
[0144] Conforme abordado acima, o método divulgado no presente documento tem um limite de detecção muito baixo. Com esse método, um teor de vírus menor que 1,0 TCID50 pode ser detectado. Em algumas modalidades, um teor de vírus menor que 0,8 TCID50 pode ser detectado. Em algumas modalidades, um teor de vírus menor que 0,5 TCID50 pode ser detectado. Em algumas modalidades, um teor de vírus menor que 0,2 TCID50 pode ser detectado. Em algumas modalidades, um teor de vírus menor que 0,1 TCID50 pode ser detectado.
[0145] O método acima para determinar a integridade de inativação pode ser usado em qualquer método para inativar um arbovírus. Em uma modalidade, o método para inativar uma preparação de arbovírus compreende:
(a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, sendo que as células são usadas para produzir a preparação de arbovírus; (b ratar a preparação de arbovírus com 0,005% a 0,02% em p/v de formaldeído. (c) determinar a integridade de inativação ao: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma preparação de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o sobrenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de arbovírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0146] Em algumas modalidades, o método para inativar uma preparação de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, sendo que as células são usadas para produzir a preparação de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,1 a 3% de peróxido de hidrogênio a uma temperatura de 20°C a 30°C durante 5 a 120 minutos; (c) determinar a integridade de inativação ao: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma preparação de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o sobrenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de arbovírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0147] Em algumas modalidades, o método para inativar uma preparação de arbovírus compreende: (a) isolar a preparação de arbovírus de uma ou mais células cultivadas in vitro, sendo que as células são usadas para produzir a preparação de arbovírus; (b) tratar a preparação de arbovírus com 0,01% de peróxido de hidrogênio a uma temperatura de 20°C a 30°C durante 60 minutos; (c) determinar a integridade de inativação ao: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma preparação de vírus tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o sobrenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de arbovírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0148] O método acima para determinar a integridade de inativação pode ser usado em qualquer método para inativar um vírus da Zika. Em uma modalidade, o método para inativar uma preparação de vírus da Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus da Zika de uma ou mais células cultivadas in vitro, sendo que as células são usadas para produzir a preparação de vírus da Zika; (b) tratar a preparação de vírus da Zika com 0,005% a 0,02% em p/v de formaldeído; (c) determinar a integridade de inativação ao: (i) inocular células de inseto cultivadas com a preparação de vírus da Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o sobrenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de vírus da Zika contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0149] Em algumas modalidades, o método para inativar uma preparação de vírus da Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus da Zika de uma ou mais células cultivadas in vitro, sendo que as células são usadas para produzir a preparação de vírus da Zika; (b) tratar a preparação de vírus da Zika com 0,1 a 3% de peróxido de hidrogênio a uma temperatura de 20°C a 30°C durante 5 a 120 minutos; (c) determinar a integridade de inativação ao: (i) inocular células de inseto cultivadas com a preparação de vírus da Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o sobrenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e
(iii) determinar se a preparação de vírus da Zika contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0150] Em algumas modalidades, o método para inativar uma preparação de vírus da Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus da Zika de uma ou mais células cultivadas in vitro, sendo que as células são usadas para produzir a preparação de vírus da Zika; (b) tratar a preparação de vírus da Zika com 0,01% de peróxido de hidrogênio a uma temperatura de 20°C a 30°C durante 60 minutos; (c) determinar a integridade de inativação ao: (i) inocular células de inseto com a preparação de vírus da Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante; (ii) inocular células de mamífero com o sobrenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de vírus da Zika contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0151] Em algumas modalidades, o método para inativar uma preparação de vírus da Zika compreende: (a) isolar a preparação de vírus da Zika de uma ou mais células cultivadas in vitro, sendo que as células são usadas para produzir a preparação de vírus da Zika; (b) tratar a preparação de vírus da Zika com 0,05% de formalina a uma temperatura de 20°C a 30°C, tal como 22°C, durante sete dias;
(c) determinar a integridade de inativação ao: (i) inocular células de inseto cultivadas com a preparação de vírus da Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o sobrenadante produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de vírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
[0152] Em algumas modalidades, as células são células não humanas. Células de mamífero não humano adequadas incluem, porém, sem limitação, células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito no documento Nº WO97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO). Em algumas modalidades, as células de mamífero são células Vero.
ADJUVANTES
[0153] Outros aspectos da presente divulgação se referem às vacinas e/ou composições imunogênicas de vírus da Zika que contêm um ou mais antígenos de pelo menos um vírus da Zika descrito no presente documento em combinação com um ou mais adjuvantes. Em algumas modalidades, as vacinas e/ou composições imunogênicas contêm um vírus da Zika inteiro inativado purificado, tal como um vírus da Zika com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1 conforme descrito no presente documento, em combinação com um ou mais adjuvantes. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus da Zika inteiro inativado purificado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, em que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59 em combinação com um ou mais adjuvantes. Em algumas modalidades, a vacina ou composição imunogênica compreende um vírus da Zika inteiro inativado purificado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59 que compreende a sequência genômica de acordo com a SEQ ID Nº: 2 em combinação com um ou mais adjuvantes. Em uma modalidade, as vacinas e composições imunogênicas contêm um isolado de vírus da Zika clonal purificado de placa em combinação com um ou mais adjuvantes. Tais vacinas e/ou composições imunogênicas com adjuvante da presente divulgação podem ser úteis para tratar ou prevenir infecção de vírus da Zika em um indivíduo que necessita das mesmas e/ou induzir uma resposta imunológica, tal como a resposta imunológica de proteção, contra vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma.
[0154] Vários métodos para alcançar um efeito de adjuvante para vacinas são conhecidos e podem ser usados em combinação com as vacinas e/ou composições imunogênicas de vírus da Zika divulgadas no presente documento. Os princípios e métodos gerais são detalhados em "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, e também em "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, Nova Iorque, ISBN 0- 306-45283-9.
[0155] Adjuvantes exemplificativos podem incluir, porém, sem limitação, sais de alumínio, fosfato de cálcio, agonistas de receptor do tipo toll (TLR), lipídeo de monofosforila A (MLA), derivados de MLA, lipídeo sintético A, miméticos ou análogos de lipídeo A, citocinas, saponinas, derivados de dipeptídeo de muramila (MDP), oligos de CpG, lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, polifosfazenos, emulsões (emulsões de óleo), quitosana, vitamina D, tirosina de estearila ou octadecila, virossomas, cocleatos, micropartículas de poli(lactídeo-co-glicolídeos) (PLG), partículas de poloxâmero, micropartículas, lipossomas, Adjuvante Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA). Em algumas modalidades, o adjuvante é um sal de alumínio.
[0156] Em algumas modalidades, o adjuvante inclui pelo menos um dentre alumínio, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, sulfato de alumínio e potássio, e Alhydrogel 85. Em algumas modalidades, adjuvantes de sal de alumínio da presente divulgação aumentaram a adsorção dos antígenos das vacinas e/ou composições imunogênicas de vírus da Zika da presente divulgação. Consequentemente, em algumas modalidades, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou cerca de 100% do antígeno é adsorvido no adjuvante de sal de alumínio.
[0157] Determinadas modalidades da presente divulgação incluem um método para preparar uma vacina ou composição imunogênica de vírus da Zika com adjuvante, que envolve (a) misturar a vacina ou composição imunogênica com um adjuvante de sal de alumínio, com a vacina ou composição imunogênica que inclui um ou mais antígenos de pelo menos um vírus da Zika descrito no presente documento e (b)
incubar a mistura sob condições adequadas durante um período de tempo que está na faixa de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas (por exemplo, cerca de 16 horas a cerca de 24 horas), com pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou cerca de 100% do antígeno adsorvido no adjuvante de sal de alumínio. Em determinadas modalidades do método, o pelo menos um vírus da Zika é um vírus da Zika que compreende uma mutação de adaptação de célula não humana (por exemplo, uma mutação de adaptação de célula não humana na proteína NS1, tal como uma mutação Trp98Gly). Em algumas modalidades, o pelo menos um vírus da Zika é um vírus da Zika inteiro inativado purificado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, o vírus da Zika é um vírus da Zika inteiro inativado purificado que compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59 que compreende a sequência genômica de acordo com a SEQ ID Nº: 2.
PURIFICAÇÃO DE VÍRUS
[0158] Aspectos adicionais da presente divulgação se referem aos métodos para purificar vírus da Zika. Em algumas modalidades, o método inclui inocular uma pluralidade de células com um inóculo que contém uma população de vírus da Zika, e obter a partir de uma ou mais dentre as células inoculadas um isolado clonal de vírus da Zika através de purificação de placa. Em algumas modalidades, as células são células não humanas (por exemplo, células de inseto, células de mamífero, etc.). Em algumas modalidades, as células são células de inseto (tal como qualquer uma dentre células/linhas celulares de mosquito descritas no presente documento). Em algumas modalidades, as células são células de mamífero (tal como qualquer uma dentre células/linhas celulares de mamífero descritas no presente documento). Em algumas modalidades, as células de mamífero são células de macaco.
[0159] Em algumas modalidades, a população de vírus da Zika é heterogênea (por exemplo, que compreende dois ou mais genótipos). Em algumas modalidades, a população de vírus da Zika compreende um isolado clínico de vírus da Zika (por exemplo, da cepa PRVABC59) e/ou um ou mais vírus da Zika que foram anteriormente passados em cultura celular. Em algumas modalidades, purificação de placa (por exemplo, conforme descrito no presente documento) permite a separação substancial e/ou completa de um isolado clonal (geneticamente homogêneo) de uma população viral heterogênea. Em algumas modalidades, as células de macaco são de uma linha celular VERO (por exemplo, células VERO 10-87). Em algumas modalidades, o inóculo compreende soro humano. Em algumas modalidades, o inóculo compreende um ou mais agentes acidentais (por exemplo, um ou mais vírus de contaminação). Em algumas modalidades, purificação de placa (por exemplo, conforme descrito no presente documento) permite a purificação substancial e/ou completa de um isolado clonal (geneticamente homogêneo) na direção oposta a um ou mais agentes acidentais.
[0160] Em algumas modalidades, os métodos descritos para isolar e/ou purificar um vírus da Zika clonal inclui uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, etc.) purificações de placa adicionais do isolado clonal de vírus da Zika.
Em algumas modalidades, os métodos descritos para isolar e/ou purificar um isolado clonal de vírus da Zika inclui passar o isolado clonal de vírus da Zika uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, etc.) vezes em cultura celular (por exemplo, em células de inseto, tal como uma linha celular de mosquito e/ou em células de mamífero, tal como uma linha celular VERO).
[0161] Aspectos adicionais da presente divulgação se referem aos métodos para purificar vírus da Zika para a preparação de uma vacina ou composição imunogênica. Em algumas modalidades, os métodos incluem uma ou mais (por exemplo, uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, ou seis) etapas de (em qualquer ordem, que inclui a seguinte ordem): realizar filtração de profundidade de uma amostra ou preparação que contém um vírus da Zika; troca de tampão e/ou diluir uma amostra que contém um vírus da Zika (por exemplo, através de filtração de fluxo cruzado (CFF)) para produzir um retentado; ligar uma amostra que compreende um vírus da Zika a uma membrana de troca iônica (por exemplo, uma membrana de troca aniônica, uma membrana de troca catiônica) para produzir uma fração ligada, sendo que a fração ligada compreende o vírus da Zika, e eluir a fração ligada a partir da membrana de troca iônica; tratar uma amostra que contém um vírus da Zika com uma quantidade eficaz de qualquer um dos inativadores químicos descritos no presente documento; neutralizar uma amostra que contém um vírus da Zika quimicamente inativado com metabissulfito de sódio; e/ou purificar uma amostra neutralizada que compreende um vírus da Zika quimicamente inativado (por exemplo, através de filtração de fluxo cruzado (CFF)). Em algumas modalidades, o método inclui as etapas de (a) passar uma amostra que contém um vírus da Zika através de um primeiro filtro de profundidade para produzir um primeiro eluato, sendo que o primeiro eluato contém o vírus da Zika; (b) troca de tampão e/ou diluir o primeiro eluato através de filtração de fluxo cruzado (CFF) para produzir um primeiro retentado, sendo que o primeiro retentado contém o vírus da Zika; (c) ligar o primeiro retentado a uma membrana de troca iônica para produzir uma primeira fração ligada, sendo que a primeira fração ligada contém o vírus da Zika, e eluir a primeira fração ligada a partir da membrana de troca iônica para produzir um segundo eluato, sendo que o segundo eluato contém o vírus da Zika; (d) passar o segundo eluato através de um segundo filtro de profundidade para produzir um segundo retentado, sendo que o segundo retentado contém o vírus da Zika; (e) tratar o segundo retentado com uma quantidade eficaz de um inativador químico; (f) neutralizar o segundo retentado tratado com metabissulfito de sódio; e (g) purificar o segundo retentado neutralizado através de filtração de fluxo cruzado (CFF). FORMULAÇÕES DE VACINAS E/OU COMPOSIÇÕES
IMUNOGÊNICAS
[0162] Aspectos adicionais da presente divulgação se referem às formulações de vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação que contêm um ou mais antígenos de um vírus da Zika descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o vírus da Zika é um vírus da Zika inteiro inativado purificado. Em algumas modalidades, o vírus da Zika inteiro inativado purificado compreende uma mutação na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, o vírus da Zika inteiro inativado purificado compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, o vírus da Zika inteiro inativado purificado compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, o vírus da Zika inteiro inativado purificado compreende uma mutação Trp98Gly na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59 que compreende a sequência genômica de acordo com a SEQ ID Nº: 2.
[0163] Tais vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação que contêm um ou mais antígenos de um vírus da Zika descrito no presente documento podem ser úteis para tratar ou prevenir infecção de vírus da Zika em um indivíduo que necessita das mesmas e/ou para induzir uma resposta imunológica, tal como uma resposta imunológica de proteção, contra vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma.
[0164] Tipicamente, vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação são preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para a solução em, ou suspensão em líquido antes da injeção também podem ser preparadas. Tais preparações também podem ser emulsificadas ou produzidas como um pó seco. O ingrediente imunogênico ativo é frequentemente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, sacarose, glicerol, etanol ou semelhantes, e combinações dos mesmos. Adicionalmente, caso desejado, a vacina ou composição imunogênica pode conter substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, ou adjuvantes que aprimoram a eficácia da vacina ou composição imunogênica.
[0165] Vacinas ou composições imunogênicas podem ser convencionalmente administradas por via parenteral, através de injeção, por exemplo, seja por via subcutânea, transcutânea,
intradérmica, subdérmica ou intramuscular. Formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações oral, peroral, intranasal, bucal, sublingual, intraperitoneal, intravaginal, anal e intracraniana. Para supositórios, ligantes e carreadores tradicionais podem incluir, por exemplo, polialcalenoglicóis ou triglicerídeos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas que contêm o ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10%, ou mesmo 1 a 2%. Em determinadas modalidades, uma cera de baixo ponto de fusão, tal como uma mistura de glicerídeos de ácido graxo ou manteiga de cacau é primeiro derretida e a vacina e/ou composição imunogênica de vírus da Zika descrita no presente documento é distribuída de maneira homogênea, por exemplo, agitando-se. A mistura homogênea derretida é, então, despejada em moldes convenientemente dimensionados e deixada para resfriar e solidificar.
[0166] As vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação podem ser administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e em tal quantidade, conforme será terapeuticamente eficaz e imunogênica. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, que inclui, por exemplo, a capacidade de o sistema imunológico do indivíduo montar uma resposta imunológica, e do grau de proteção desejado. Faixas de dosagem adequadas podem incluir, por exemplo, de cerca de 0,1 µg a cerca de 100 µg do vírus da Zika inteiro inativado purificado. A quantidade do vírus da Zika purificado inativado pode ser determinada por um ensaio Bradford (Bradford et al. (1976) Anal. Biochem. 72: 248- 254) com o uso de quantidades definidas de proteína de envelope de vírus da Zika recombinante para estabelecer a curva padrão.
[0167] Regimes adequados para administração inicial e disparos de intensificador também são variáveis, porão, tipificados por uma administração inicial seguida por inoculações subsequentes ou outras administrações.
[0168] A maneira de aplicação pode ser variada amplamente. Qualquer um dos métodos convencionais para administração de uma vacina ou composição imunogênica são aplicáveis. Esses incluem aplicação oral em uma base fisiologicamente aceitável sólida ou em uma dispersão fisiologicamente aceitável, por via parenteral, através de injeção ou semelhantes. A dosagem da vacina ou composição imunogênica dependerá da rota de administração e pode variar de acordo com a idade da pessoa a ser vacinada e da formulação do antígeno. A vacina ou composição imunogênica pode ter um volume de dosagem unitária maior que 0,5 ml, de 0,5 ml ou menor que 0,5 ml, conforme descrito no presente documento. Por exemplo, a mesma pode ser administrada a um volume de 0,25 ml.
[0169] Para controlar tonicidade, é preferencial incluir um sal fisiológico, tal como um sal sódico. O cloreto de sódio (NaCl) é preferencial, que pode estar presente entre 1 e 20 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, di- hidrogenofosfato de potássio, fosfato dissódico desidratado, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, etc.
[0170] Vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação podem incluir um ou mais tampões. Tampões típicos incluem: um tampão de fosfato; um tampão Tris; um tampão de borato; um tampão de succinato; um tampão de histidina (particularmente com um adjuvante de hidróxido de alumínio); ou um tampão de citrato. Tampões serão tipicamente incluídos na faixa de 5 a 20 mM
[0171] O pH de uma vacina ou composição imunogênica estará, de modo geral, entre 5,0 e 8,5 ou 5,0 e 8,1, e mais tipicamente entre 6,0 e 8,5 por exemplo, entre 6,0 e 8,0, entre 6,5 e 8,0, entre 6,5 e 7,5, entre 7,0 e 8,5, entre 7,0 e 8,0, ou entre 7,0 e 7,8. Um processo de fabricação da presente divulgação pode incluir, portanto, uma etapa de ajustar o pH da vacina grossa antes da embalagem.
[0172] A vacina ou composição imunogênica é preferencialmente estéril. A mesma é preferencialmente não pirogênica, por exemplo, que contém < 1 EU (unidade endotoxina, uma medição padrão) por dose, e preferencialmente < 0,1 EU por dose. A mesma é preferencialmente isenta de glúten.
[0173] Em determinadas modalidades, as vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação podem incluir um detergente em uma concentração eficaz. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de detergente pode incluir sem limitação, cerca de 0,00005% em v/v a cerca de 5% em v/v ou cerca de 0,0001% em v/v a cerca de 1% em v/v. Em determinadas modalidades, uma quantidade eficaz de detergente é de cerca de 0,001% em v/v, cerca de 0,002% em v/v, cerca de 0,003% em v/v, cerca de 0,004% em v/v, cerca de 0,005% em v/v, cerca de 0,006% em v/v, cerca de 0,007% em v/v, cerca de 0,008% em v/v, cerca de 0,009% em v/v, ou cerca de 0,01% em v/v. Sem desejar estar vinculado pela teoria, detergentes ajudam a manter as vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação em solução e ajudam a evitar que as vacinas e/ou composições imunogênicas se agreguem.
[0174] Detergentes adequados incluem, por exemplo, tensoativo de éster de sorbitana de polioxietileno (conhecido como ‘Tweens'), octoxinol (tal como octoxinol-9 (Triton X 100) ou t- octilfenoxipolietoxietanol), brometo de cetiltrimetilamônia (‘CTAB'), e desoxicolato de sódio. O detergente pode estar presente apenas em quantidades vestigiais. Outros componentes residuais em quantidades vestigiais poderiam ser antibióticos (por exemplo, neomicina, canamicina, polimixina B). Em algumas modalidades, o detergente contém polissorbato. Em algumas modalidades, a concentração eficaz de detergente inclui faixas de cerca de 0,00005% em v/v a cerca de 5% em v/v.
[0175] As vacinas e/ou composições imunogênicas são preferencialmente armazenadas entre 2°C e 8°C. De modo ideal, as mesmas devem ser mantidas longe da luz direta. O antígeno e emulsão estarão, tipicamente, em mistura de adição, embora possam estar inicialmente presentes na forma de um kit de componentes separados para mistura por adição extemporânea. Vacinas e/ou composições imunogênicas estarão, de modo geral, em forma aquosa quando administradas a um indivíduo.
MÉTODOS DA PRESENTE DIVULGAÇÃO
[0176] Aspectos adicionais da presente divulgação se referem aos métodos para uso de vacinas e/ou composições imunogênicas, descritas no presente documento, que contêm um vírus da Zika inteiro inativado purificado, tal como um vírus da Zika com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, conforme descrito no presente documento, para tratar ou prevenir vírus da Zika em um indivíduo que necessita das mesmas e/ou para induzir uma resposta imunológica ao vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma. Aspectos adicionais da presente divulgação se referem aos métodos para uso de vacinas e/ou composições imunogênicas, descritas no presente documento, que contêm um vírus da Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1 para tratar ou prevenir vírus da Zika em um indivíduo que necessita das mesmas e/ou para induzir uma resposta imunológica ao vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma. Aspectos adicionais da presente divulgação se referem aos métodos para uso de vacinas e/ou composições imunogênicas, descritas no presente documento, que contêm um vírus da Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº:1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, em que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59, para tratar ou prevenir vírus da Zika em um indivíduo que necessita das mesmas e/ou para induzir uma resposta imunológica ao vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma. Aspectos adicionais da presente divulgação se referem aos métodos para uso de vacinas e/ou composições imunogênicas, descritas no presente documento, que contêm um vírus da Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59 que compreende a sequência genômica de acordo com a SEQ ID Nº: 2 para tratar ou prevenir vírus da Zika em um indivíduo que necessita das mesmas e/ou para induzir uma resposta imunológica ao vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma.
[0177] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere aos métodos para tratar ou prevenir infecção de vírus da Zika em um indivíduo que necessita dos mesmos administrando-se ao indivíduo um vírus da Zika inteiro inativado purificado, tal como um vírus da Zika com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, conforme descrito no presente documento.
[0178] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere aos métodos para tratar ou prevenir infecção de vírus da Zika em um indivíduo que necessita dos mesmos administrando-se ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente divulgação que contém um vírus da Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere aos métodos para tratar ou prevenir infecção de vírus da Zika em um indivíduo que necessita dos mesmos administrando-se ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente divulgação que contém um vírus da Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere aos métodos para tratar ou prevenir infecção de vírus da Zika em um indivíduo que necessita dos mesmos administrando-se ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente divulgação que contém um vírus da Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59 que compreende a sequência genômica de acordo com a SEQ ID Nº: 2.
[0179] Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere aos métodos para induzir uma resposta imunológica ao vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma administrando-se ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente divulgação que contém um vírus da Zika inteiro inativado purificado, tal como um vírus da Zika com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1 conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere aos métodos para induzir uma resposta imunológica ao vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma administrando-se ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente divulgação que contém um vírus da Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59. Em algumas modalidades, a presente divulgação se refere aos métodos para induzir uma resposta imunológica ao vírus da Zika em um indivíduo que necessita da mesma administrando-se ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina e/ou composição imunogênica da presente divulgação que contém um vírus da Zika inteiro inativado purificado com uma mutação que é uma substituição de triptofano por glicina na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1, sendo que o vírus da Zika é derivado da cepa PRVABC59 que compreende a sequência genômica de acordo com a SEQ ID Nº: 2.
[0180] Em algumas modalidades, a etapa de administração induz uma resposta imunológica de proteção contra vírus da Zika no indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em algumas modalidades, o indivíduo está grávido ou pretende estar grávido.
[0181] Em algumas modalidades, a etapa de administração inclui uma ou mais administrações. Administração pode ser através de uma programação de dose única ou uma programação de múltiplas doses (início-intensificação). Em uma programação de múltiplas doses as várias doses podem ser dadas através de rotas iguais ou diferentes, por exemplo, um início parenteral e intensificação na mucosa, um início na mucosa e intensificação parenteral, etc. Tipicamente serão dadas pela mesma rota. Múltiplas doses serão tipicamente administradas com pelo menos 1 semana de diferença (por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 9 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 11 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanas, etc.). Dar duas doses separadas por 25 a 30 dias (por exemplo, 28 dias) é particularmente útil.
[0182] Os métodos da presente divulgação incluem administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade imunogênica das vacinas e/ou composições imunogênicas de vírus da Zika da presente divulgação. Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade imunogênica pode ser uma quantidade das vacinas e/ou composições imunogênicas da presente divulgação que induzirão uma resposta imunológica protetora no indivíduo não infectado, infectado ou não exposto ao qual é administrada. Tal resposta resultará, de modo geral, no desenvolvimento de uma resposta imunológica secretora, celular e/ou mediada por anticorpo à vacina no indivíduo. Normalmente, tal resposta inclui, porém, sem limitação, um ou mais dos seguintes efeitos; a produção de anticorpos a partir de qualquer uma das classes imunológicas, tais como imunoglobulinas A, D, E, G ou M; a proliferação de linfócitos B e T; a provisão de sinais de ativação, crescimento e diferenciação às células imunológicas; expansão de célula T auxiliar, célula T supressora e/ou célula T citotóxica.
[0183] Preferencialmente, a quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade imunogênica é suficiente para provocar tratamento ou prevenção de sintomas de doença. A quantidade exata necessária variará dependendo do indivíduo que é tratado; da idade e condição geral do indivíduo a ser tratado; da capacidade do sistema imunológico do indivíduo para sintetizar anticorpos; do grau de proteção desejado; da gravidade da afecção que é tratada; do antígeno de vírus da Zika particular selecionado e seu modo de administração, dentre outros fatores. Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade imunogênica apropriada pode ser prontamente determinada por uma pessoa com habilidade na técnica. Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade imunogênica estará dentro de uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de ensaios de rotina.
[0184] A presente divulgação será entendida mais completamente a título de referência nos seguintes Exemplos. No entanto, os mesmos não devem ser interpretados como limitantes de nenhum aspecto ou escopo da presente divulgação, de forma alguma.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE CEPA DE VÍRUS DA ZIKA CLONAL
[0185] Esse exemplo descreve a produção de cepas de vírus da Zika (ZIKAV) com um histórico de pesquisa conhecido.
MATERIAIS E MÉTODOS MANUTENÇÃO DE CÉLULA VERO
[0186] Um frasco de células WHO Vero 10-87 foi rapidamente descongelado em um banho de água e diretamente inoculado em 19 ml de DMEM preaquecido (meio essencial mínimo modificado da Dulbecco) que contém penicilina-estreptomicina, L-glutamina 40 mM e 10% de FBS em um frasco de T-75 cm2 a 36°C+/2°C, em 5% de CO2. Permitiu-se que células crescessem para confluência e foram subcultivadas com o uso de TryplE. Esse frasco foi expandido para dois frascos de T-185 cm2, crescidos para confluência e subcultivados para frascos de 31 xT-185 cm2 e crescidos até que as células alcançassem 100% de confluência. Células foram coletadas por tripsinização, centrifugadas a 800 x g por 10 minutos, e ressuspensas em DMEM que contém 10% de FBS e 10% de DMSO a uma concentração de 1,9x10 7 células/ml. Um frasco das células Vero foi rapidamente descongelado e ressuscitado, conforme descrito acima, em um frasco de T-75 cm2.
Esses foram subcultivados duas vezes para produzir um banco de células em frascos de 13 x T-185 cm2. Após tripsinização, as células foram centrifugadas a 800 x g e ressuspensas em meios de congelamento (DMEM que contém 10% de FBS e 10% de DMSO) em uma concentração de 4,68x105 células/ml. Esse banco de células foi aliquotado em criovasos.
[0187] As células Vero foram cultivadas e mantidas em DMEM que contém penicilina-estreptomicina, L-glutamina e 10% de FBS (cDMEM- 10%-FBS). TryplExpress foi usado para manter e tripsinizar células. Dois dias antes da adsorção viral, placas de 6 cavidades foram semeadas com 4 a 5 x 105 células/cavidade em 3 ml de cDMEM-10%- FBS ou 7 x 105 células em frascos de T-25 cm2 em 5 ml de cDMEM- 10%-FBS, ou 1 x 104 células/cavidade em placas de 96 cavidades em 0,1 ml de cDMEM-10%-FBS. Incubadoras foram monitoradas diariamente para manter as temperaturas indicadas. As linhas celulares Vero foram armazenadas em nitrogênio líquido.
ENSAIO DE PLACA
[0188] Titulações virais foram determinadas por titulação de placa em monocamadas recentemente confluentes de células Vero cultivadas em placas de 6 cavidades. Alíquotas congeladas foram descongeladas e séries de diluição de dez vezes das alíquotas foram realizadas em cDMEM-0%-FBS em placas de 96 cavidades. Os vírus diluídos foram mantidos em gelo antes da inoculação das monocamadas de célula Vero. No momento do ensaio, o meio de cultivo foi aspirado da placa de 6 cavidades, e 100 μl de cada diluição de vírus foram adicionados nas cavidades. O vírus foi adsorvido por 60 min a 36°C ± 2°C, em 5% de CO2, com frequente agitação (a cada 10 min) das placas para evitar secagem das folhas de célula. Depois da adsorção viral, 4 ml de uma primeira sobreposição de agarose (1X cDMEM-2%-FBS + 0,8% de agarose) mantidos em 40 a 41°C foram adicionados em cada cavidade.
Permitiu-se que a agarose solidificasse por 30 min em temperatura ambiente, e as placas foram, então, incubadas de ponta cabeça por 4 a 6 dias a 36°C+/2°C, em 5% de CO2. Dois ml de uma segunda sobreposição de agarose que contém 160 μg/ml de corante vital vermelho neutro foram adicionados no dia 4. Placas foram visualizadas nos dias 5 e 6. QUANTIFICAÇÃO DE VÍRUS ATRAVÉS DE ENSAIO TCID50
[0189] Titulações virais também foram determinadas por titulação de placa em monocamadas recentemente confluentes de células Vero cultivadas em placas de 96 cavidades. Alíquotas congeladas foram descongeladas e séries de diluição de dez vezes das alíquotas foram realizadas em diluente cDMEM-2%-FBS em placas de 96 cavidades. Os vírus diluídos foram mantidos em gelo antes da inoculação das monocamadas de célula Vero. No momento do ensaio, o meio de cultivo foi aspirado da placa de 96 cavidades, e 100 μl de cada diluição de vírus foram adicionados nas cavidades. As placas foram incubadas por 5 dias a 36°C+/2°C, em 5% de CO2. A titulação de 50% de dose infecciosa de cultura de tecido (TCID50) foi calculada com o uso da calculadora Reed/Muench.
ARTIGOS DE TESTE
[0190] A cepa de vírus da Zika PRVABC59 (um frasco de 0,5 ml em gelo seco) foi recebida a partir dos Centros para Controle e Prevenção de Doenças (CDC), em que a identificação de vírus da Zika foi confirmada através de RT-PCR. A cepa testou negativo para Alfavírus e contaminação de micoplasma por PCR. Essas informações são resumidas na Tabela 1.
TABELA 1: INFORMAÇÕES SOBRE A CEPA PRVABC59 Informações Informações Informações Cepa de sobre Análises PFU de preparação Isolamento paciente  Sequenciamento por torrente de íons: nº de Passagem: acesso de gene KU501215 Vero(2)C6/36(1 Soro )  PFU por ensaio de placa 6,7 log humano; PRVABC59 Nenhuma viagem para Prep: 29 de  Identidade por RT-PCR de pfu/ml (asiática) fornecida Porto Rico janeiro de 2016  (-) Para alfavírus por em 2015 Hospedeiro: PCR C6/36  (-) Para micoplasma por ATCC e ABM PCR
SEQUENCIAMENTO
[0191] Um kit QIAampViral RNA Mini Spin foi usado para extrair RNA das coletas de vírus estabilizadas de cada isolado, de acordo com protocolos do fabricante. RNA extraído de cada isolado foi usado para criar e amplificar 6 fragmentos de cDNA que englobam o genoma viral de Zika inteiro. Fragmentos de cDNA amplificados foram analisados por tamanho e pureza em um gel de 1% de Agarose/TBE e, subsequentemente, gel purificado com o uso de um kit Qiagen Quick Gel Extraction. Um sequenciador ABI 3130XL Genetic Analyzer foi usado para conduzir reações de sequenciamento automático. O software Lasergene SeqMan foi usado para analisar dados de sequenciamento.
RESULTADOS
[0192] Uma cepa de ZIKAV com um histórico de pesquisa conhecido que foi relevante para o surto de ZIKAV atual nas América foi buscada. Por essa razão, a cepa PRVABC59 de ZIKAV foi escolhida. Para gerar um vírus de cavidade caracterizada adaptado para crescimento em células Vero, a cepa PRVABC59 de ZIKAV foi primeiro amplificada em células Vero (P1).
[0193] Frascos de células Vero (T-175 cm2), 100% confluentes, foram infectados em uma MOI de 0,01 em 4 ml de cDMEM-0%-FBS. O vírus foi adsorvido na monocamada por 60 minutos a 36°C ± 2°C, em 5% de CO2, então, 20 ml de cDMEM-0%-FBS foram aplicados para amplificação viral a 36°C± 2°C, em 5% de CO2. A camada de célula foi monitorada diariamente para efeito citopático (CPE) depois da inoculação (Figura 1). O sobrenadante foi coletado após 96 horas coletando-se os meios e clarificando-se através de centrifugação (600 x g, 4°C, 10 min). A coleta foi estabilizada adicionando-se trealose até uma concentração final de 18% em p/v. O volume foi aliquotado em criovasos de 0,5 ml e armazenado a -80°C.
[0194] A coleta de P1 estabilizada foi analisada pela presença de vírus infeccioso em monocamadas de célula Vero por um ensaio TCID50. A cinética de crescimento foi monitorada obtendo-se alíquotas diariamente, começando na hora 0. A titulação de pico foi alcançada na hora 72 (Figura 2).
[0195] O material P1 foi purificado em placa titulando-se a coleta a partir do dia 3 nas monocamadas de 6 cavidades de células Vero. Placas foram visualizadas no dia 6, e 10 placas a serem isoladas foram identificadas desenhando-se um círculo ao redor de uma placa distinta e separada no fundo da placa de plástico. Placas foram escolhidas extraindo-se o tampão de agarose com o uso de uma pipeta de furo largo estéril enquanto se raspa o fundo a cavidade e se lava com cDMEM-10%-FBS. O tampão de agarose foi adicionado em 0,5 ml de cDMEM-10%-FBS, passado em vórtex, identificado como PRVABC59 P2a-j e colocado em uma incubadora de um dia para o outro a 36°C ± 2°C, em 5% de CO2.
[0196] Três placas (PRVABC59 P2a-c) foram carregadas para frente para purificação adicional. Cada isolado foi puramente colocado em placa em duplicatas em uma monocamada de 6 cavidades frescas de células Vero. Essa transição P2/P3 foi purificada em placa, e identificada PRVABC59 P3a-j.
[0197] Seis placas (PRVABC59 P3a-f) foram carregadas para frente para uma rodada final de purificação. Cada isolado foi puramente colocado em placa em duplicatas em uma monocamada de 6 cavidades frescas de células Vero. Essa transição P3/P4 foi purificada em placa, e identificada PRVABC59 P4a-j.
[0198] Seis placas (PRVABC59 P4a-f) da purificação de placa P4 foram passadas às cegas em monocamadas de células Vero em frascos de T-25 cm2. Cada retirada de placa foi diluída em 2 ml de cDMEM-0%- FBS – 1 ml foi adsorvido por 1 hora a 36°C± 2°C, em 5% de CO2; o outro 1 ml foi estabilizado com trealose (18% em v/v final) e armazenado em < -60°C. Depois da adsorção de vírus, cDMEM-0%-FBS foi adicionado em cada frasco e deixado para crescer a 36°C ± 2°C, em 5% de CO2 por 4 dias. Os sobrenadantes de vírus foram coletados, clarificados por centrifugação (600 x g, 4C, 10 min), estabilizados em 18% de trealose, e aliquotados e armazenados a < -60°C. Essa semente P5 foi testada por TCID50 para potência de vírus da Zika (Figura 3).
[0199] Monocamadas confluentes de frascos de T-175 cm2 de células Vero foram infectadas com cada um dos seis clones de PRVABC59 (P5a-f) em uma MOI de 0,01 em 4 ml de cDMEM-0%-FBS. Permitiu-se que o vírus adsorvesse por 60 minutos a 36°C +/ 2°C, em 5% de CO2, após isso 20 ml de cDMEM-0%-FBS foram adicionados em cada frasco e deixados para crescer a 36°C ± 2°C, em 5% de CO2. A integridade de monocamada de célula Vero e CPE foram monitorados diariamente. O vírus foi coletado nos dias 3 e 5 conforme indicado (Figura 4). As coletas de cepa P6 dos dias 3 e 5 foram agrupadas, estabilizadas com 18% de trealose, aliquotadas e armazenadas < -60°C.
[0200] Cada um dos seis clones de PRVABC59 (P6a-f) foram testados para potência de vírus da Zika in vitro (Figura 5). A potência foi determinada através de dois métodos diferentes, TCID50 e titulação de placa. A TCID50 foi calculada através de inspeção visual de CPE (microscópio) e medindo-se a diferença em absorvância (A560-A420) das cavidades que exibem CPE (de cor amarela) em comparação com vermelho (sem CPE). As placas foram gravadas em um leitor de placa, e aplicadas na mesma calculadora que as placas microscopicamente gravadas (absorvância). Os valores em TCID50 entre as duas técnicas de pontuação são bastante similares, embora os valores obtidos por titulação de placa sejam menores.
[0201] Um sumário da geração do vírus P6 e caracterização é mostrado na Tabela 2 abaixo. TABELA 2: SUMÁRIO DE PASSAGEM DE VÍRUS E
CARACTERIZAÇÃO PARA A GERAÇÃO DE CEPAS DE ZIKAV
CLONAIS Passagem Produção/purificação de semente Caracterização P1 Amplificação de vírus em Vero titulação de TCID50 Amplificar P1 através de titulação de placa; P2 purificação de placa purificação de placa de P1 Escolher e passar placas do ensaio de P3 purificação de placa placa P2; purificação de placa de P2 Escolher e passar placas do ensaio de P4 purificação de placa placa P3; purificação de placa de P3 P5 Amplificar placas P4 (a a f) em células Vero titulação de TCID50 Titulação de TCID50, fenótipo de placa, P6 Amplificar vírus P5 (a a f) em células Vero genótipo, sequenciamento de genoma completo, cinética de crescimento
[0202] Um clone de vírus da Zika isolado que pareceu muito com a sequência de glicoproteína de envelope do isolado original foi buscado, visto que a proteína de envelope de flavivírus é a porção imunogênica dominante do vírus. Clones de PRVABC59 P6a, P6c, P6d e P6f contiveram uma mutação G→T no nucleotídeo 990 na região de envelope (G990T), que resulta em uma mutação de aminoácido de Val→Leu no resíduo de envelope 330, enquanto o gene de envelope de clones de PRVABC59 P6b e P6e foi idêntico com relação à cepa de referência (Nº de referência GenBank KU501215.1) (Tabela 3 e Figura 6). TABELA 3: SEQUENCIAMENTO DE CLONES DE PRVABC59 P6 Sequenciamento de envelope (gene de referência de PRVABC59; nº de acesso KU501215) Cepa Nucleotídeo Aminoácido Mutação Comentários PRVABC59 P6a Env-990: G→T Env-330: Val330→Leu Val/Leu Mutação em 3 de 4 gravações.
Env-1404: T→G Tipo selvagem com relação à PRVABC59 P6b Tipo selvagem Tipo selvagem silencioso referência.
PRVABC59 P6c Env-990: G→T Env-330: Val330→Leu Val/Leu Mutação em 3 de 4 gravações.
PRVABC59 P6d Env-990: G→T Env-330: Val330→Leu Val/Leu Mutação em 2 de 2 gravações.
Tipo selvagem com relação à PRVABC59 P6e Tipo selvagem Tipo selvagem Tipo selvagem referência.
Env-990: Env-330: Mutação em 2 de 2 gravações. 190 PRVABC59 P6f Val/Leu bp não sequenciados (aa 421 – G→T Val330→Leu 484).
Sequenciamento de genoma completo (gene de referência de PRVABC59; nº de acesso KU501215) Cepa Nucleotídeo Aminoácido Mutação Comentários Env-1404 T→G Tipo selvagem Silencioso Mutação em 2 de 2 gravações PRVABC59 P6b NS1-292 T→G NS1-98 Trp98→Gly Trp/Gly Mutação em 2 de 2 gravações PRVABC59 P6e NS1-292 T→G NS1-98 Trp98→Gly Trp/Gly Mutação em 2 de 2 gravações
[0203] Os dois clones que carecem de mutações na sequência de envelope de Zika foram, então, submetidos ao sequenciamento de genoma completo.
Resultados de sequenciamento são resumidos na Tabela 3 acima.
A análise de sequência revelou uma substituição de T→G no nucleotídeo 292 na região NS1 para ambos os clones, que resulta em uma mutação Trp→Gly no resíduo NS1 98. Essa mutação também foi confirmada posteriormente através de sequenciamento profundo.
A mutação NS1 W98G está localizada no laço interligado do domínio lateral de ZIKAV NS1, que foi implicado na associação de membrana, interação com proteína de envelope e potencialmente formação de NS1 hexamérica.
Embora outros resíduos de triptofano (W115, W118), sejam altamente conservados através de flavivírus, W98 não é (Figura 7). Curiosamente, no entanto, 100% da conservação do resíduo W98 é observado através de 11 diferentes cepas de ZIKAV, que incluem aquelas das linhagens africanas e asiáticas.
As mutações identificadas em cada cepa são resumidas na Tabela 4. TABELA 4: SUMÁRIO DE MUTAÇÕES IDENTIFICADAS EM CLONES PRVABC59 P6 Mutações identificadas em envelope
Clone Nucleotídeo Aminoácido
P6a G990T V330L
P6b T1404G (silencioso)
P6c G990T V330L
P6d G990T V330L
P6e nenhum nenhum
P6f G990T V330L Mutações adicionais identificadas em genoma
Clone Nucleotídeo Aminoácido
P6b NS1-T292G NS1-W98G
P6e NS1-T292G NS1-W98G Sequência de referência: KU501215.1 (PRVABC59)
[0204] Análise fenotípica dos estoques de ZIKAV PRVABC59 P6 foi conduzida para caracterizar os clones de ZIKAV. Conforme ilustrado na Figura 8 e quantificado na Figura 9, cada isolado clonal consistiu em uma população relativamente homogênea de placas grandes em comparação com o vírus P1 que teve uma população misturada de placas grandes e pequenas. Esses dados sugerem o isolamento bem- sucedido de clones de ZIKAV únicos.
[0205] A seguir, análises de cinética de crescimento em células Vero dos clones ZIKAV PRVABC59 P6 foram analisadas. Células Vero foram infectadas com 0,01 TCID50/célula de cada um dos clones ZIKAV P6 em meio de cultivo isento de soro. Amostras de sobrenadante viral foram obtidas diariamente e avaliadas simultaneamente para titulação infecciosa pelo ensaio de TCID50. Para todos os clones P6, o pico de titulação ocorreu entre os dias 3 e 4 (~9,0 log10 TCID50/ml). Não houve nenhuma diferença significativa em cinética de crescimento dos vários clones P6 (Figura 10).
[0206] Em conjunto, os resultados indicaram que uma semente de vírus da Zika foi gerada com sucesso. Essa seleção de semente exigiu entendimento de histórico de crescimento, cinética, rendimento, genótipo e fenótipo do vírus. Importantemente, o isolamento clonal das cepas de vírus da Zika permitiu a purificação bem-sucedida do vírus distante dos agentes de contaminação (por exemplo, agentes acidentais que podem estar no isolado humano parental). Curiosamente, três purificações de placa sequenciais foram bem-sucedidas em rapidamente selecionar vírus adaptados à célula Vero (cepas P6a-f), em que essas cepas tiveram capacidade para replicar a cavidade em culturas de célula Vero isentas de soro, em que a cepa P6a, c, d e f portam uma mutação na proteína de envelope viral, enquanto as cepas p6b e p6e obtiveram uma mutação na proteína viral NS1 (sem modificação no envelope viral). Adicionalmente, as cepas adaptadas a
Vero permitiram crescimento eficiente e reproduzível e fabricação de passagens virais subsequentes propagadas a partir dessas cepas. Sem desejar estar vinculado pela teoria, a mutação Env-V330L observada em cepas P6a, c, d e f pode ser, potencialmente, um resultado de adaptação in vitro, como uma mutação em Env 330 também foi observada mediante passagem nas células Vero (Weger-Lucarelli et al.
2017. Journal of Virology). Devido à proteína de envelope ser o epítopo imunogênico dominante do vírus da Zika, cepas que contêm uma mutação Vero adaptativa em Env podem impactar negativamente a imunogenicidade de vacina. Sem desejar estar vinculado pela teoria, a mutação de adaptação na proteína NS1 parece não só aprimorar replicação viral, mas também pode reduzir ou, de outra forma, inibir a ocorrência de mutações indesejáveis, tal como na proteína de envelope E (Env) do vírus da Zika. Adicionalmente, NS1 pode ser conhecido por se ligar à proteína Envelope durante o ciclo de vida do vírus. Essa mutação (NS1 W98G) pode ser implicada na alteração da capacidade de NS1 em se associar e, possivelmente, copurificar, com o vírus durante processamento a jusante. NS1 também é conhecida por ser imunogênica, e poderia estar implicada na resposta imunológica à vacina. EXEMPLO 2: IMUNOGENICIDADE PRÉ-CLÍNICA E EFICÁCIA DE UMA VACINA DE VÍRUS DA ZIKA INATIVADO PURIFICADO (PIZV) DERIVADA DAS CEPAS P6B E P6E
[0207] O seguinte exemplo descreve a imunogenicidade pré-clínica e eficácia em camundongos CD1 e AG129 de uma vacina de vírus da Zika inativado (PIZV) derivada das cepas P6b e P6e. Conforme descrito no Exemplo 1, seis clones foram gerados a partir da cepa PRVABC59 epidemicamente relevante, e dois (P6b e P6e) foram escolhidos para estudos de eficácia e imunogenicidade pré-clínica adicionais.
MATERIAIS E MÉTODOS PURIFICAÇÃO, INATIVAÇÃO E FORMULAÇÃO DE UMA VACINA DE VÍRUS DA ZIKA
[0208] Diversas vacinas de ZIKAV inativado, adequadas para uso nos estudos de eficácia e imunogenicidade pré-clínicos, foram geradas e caracterizadas. O vírus foi amplificado a partir das cepas P6b e P6e infectando-se frascos de células Vero confluentes em uma MOI de 0,01. O vírus foi adsorvido por 1 hora a 36°C ± 2°C/5% de CO2. Depois da adsorção, 20 ml de cDMEM-0%-FBS foram adicionados em cada frasco, e incubados a 36°C ± 2°C/5% de CO2 durante cinco dias. Os sobrenadantes de célula foram coletados no dia 3 e 5 após infecção, e resíduos de célula foram clarificados por centrifugação.
[0209] Para cada isolado, sobrenadantes clarificados foram agrupados, estabilizados em DMEM que contém 18% de trealose e armazenados a < -60°C. Sobrenadantes de vírus clarificados agrupados foram descongelados em um banho de água a 37°C e tratados com benzonase de um dia para o outro a 4°C. Depois de tratamento com benzonase, cada amostra foi aplicada em um filtro de profundidade Sartorius PP3. Depois de filtração de profundidade, cada amostra foi aplicada em um dispositivo filtração de fluxo tangencial (TFF) Centricon Plus-70. Retentado trocou de tampão, foi diluído e aplicado em um Sartorius SartobindQ IEXNano. Cada amostra foi aplicada em um segundo Sartorius SartobindQ IEXNano e eluída com o uso de um processo de eluição de 3 etapas com 250 mM, 500 mM e 750 mM de NaCl. Depois de cromatografia e diluição em MonoQ, cada 250 mM de eluato foi aplicado em um dispositivo de filtração de fluxo cruzado (CFF) Centricon Plus-70 para troca de tampão, diluído em 35 ml com PBS e armazenado em 2 a 8°C.
[0210] Para inativação de formalina, 1% de formaldeído recentemente preparado foi adicionado gota-a-gota em cada amostra purificada com agitação suave para obter uma concentração de formaldeído final de 0,02%. Amostras foram incubadas a temperatura ambiente (~22°C) durante 14 dias com inversão diária. Formaldeído foi neutralizado com metabissulfito de sódio por 15' em temperatura ambiente antes de ser aplicado em um dispositivo de filtração de fluxo tangencial (TFF) Centricon Plus-70. A troca de tampão foi realizada quatro vezes através da adição de 50 ml de Tampão de Substância de Fármaco (10 mM de NaH2PO4, 50 mM de NaCl, 6% de sacarose, pH 7,4). Cada amostra foi, então, diluída em 15 ml com Tampão de Substância de Fármaco, esterilizada com o uso de um filtro de seringa de 0,2 m, aliquotada em frascos de vidro com rolha estéreis (0,5 ml por frasco) e congeladas a < -60°C.
[0211] A inativação de vírus foi confirmada por ensaio TCID50 e ensaio de infectividade duplo. Brevemente, a amostra de substância de fármaco foi aplicada em células C6/36 e deixada para amplificar por 6 dias. O sobrenadante das células C6/36 foi aplicado em células Vero e CPE foi monitorado por 8 dias. Para formulação de produto de fármaco, frascos de substância de fármaco de PIZV foram descongelados, agrupados de acordo com o tipo de amostra e diluídos em 1 μg/ml ou 10 μg/ml em PBS com ou sem Alhydrogel (Brenntag; 0,5 mg/ml final, 0,050 mg/dose) e incubados de um dia para o outro em 2 a 8°C com agitação suave. Os lotes de produto de fármaco resultantes foram, então, aliquotados em frascos de vidro com rolha estéreis e armazenados em 2 a 8°C até o uso. A Figura 11 fornece um resumo das etapas usadas para preparar o produto de fármaco.
IMUNIZAÇÃO E DESAFIO COM CAMUNDONGO
[0212] Para o estudo de imunogenicidade, camundongos Swiss- ICR (CD-1) machos e fêmeas de seis semanas de idade foram divididos em 6 grupos (n = 10/grupo). No Dia 0, camundongos nos grupos 1 a 5 foram inoculados com 0,1 ml de vacina pela rota intramuscular (i.m.)
(injeções de 2 x 0,05 ml). Camundongos no grupo 6 foram inoculados com PBS como um controle de placebo. Camundongos foram intensificados nos dias 28 e 56 com o uso da mesma dosagem e tipo de vacina que o dia 0. Amostras sanguíneas foram coletadas no dia -1 (pré- imune), dia 27 (início), dia 42 (intensificação 1) e dia 70 (intensificação 2).
[0213] Para o estudo de imunogenicidade e eficácia, camundongos AG129 machos e fêmeas de quatro semanas de idade foram divididos em 7 grupos (n = 5/grupo). No Dia 0, camundongos nos grupos 1 a 6 foram inoculados com 0,1 ml de vacina pela rota intramuscular (i.m.) (injeções de 2 x 0,05 ml). Camundongos no grupo 7 foram inoculados com PBS como um controle de placebo. Camundongos foram intensificados no dia 28 com o uso da mesma dosagem e tipo de vacina que no dia 0. Amostras sanguíneas foram coletadas a partir da veia caudal no dia -1 (pré-imune), dia 27 (início) e dia 55 (intensificação). No momento da eutanásia, camundongos sangraram por meio de punção cardíaca sob anestesia profunda com isofluorano (terminal). No dia 56, camundongos foram intraperitonealmente desafiados com 104 unidades formadoras de placa (PFU) de ZIKAV PRVABC59.
TRANSFERÊNCIA DE SORO
[0214] Soro foi coletado a partir de camundongos AG129 vacinados e desafiados com PIZV, e foi congelado após agrupamento (grupos 1, 2, 4 e 5 da Tabela 6). O grupo sérico foi descongelado, e os artigos de teste foram gerados por diluições de três vezes do grupo sérico em PBS. Um placebo foi gerado com o uso de diluições de 3 vezes de soro de camundongo AG129 normal em PBS.
[0215] Os artigos de teste foram administrados como injeções intraperitoneais de 0,1 ml em camundongos AG129 (um volume equivalente do artigo de placebo foi administrado aos camundongos de controle). Animais foram, então, desafiados intraperitonealmente com
104 unidades formadoras de placa de cepa de vírus da Zika PRVABC59 em 100 µl.
[0216] Volume sanguíneo admissível por peso foi coletado como sangue total através de hemorragia caudal de dez camundongos no dia -11 (pré-imunização). Sangue total foi coletado de cada camundongo no dia 1 (primeiro, Nab circulante) e dia 4 (viremia) através de hemorragia caudal. A hemorragia terminal após desafio letal foi realizada por punção cardíaca sob anestesia profunda para volume maior antes da eutanásia por deslocamento cervical. Amostras sanguíneas foram coletadas em tubos de gel de separação de soro microtainer SST e deixadas para coagular durante pelo menos 30 min antes da separação de soro por centrifugação (10.000 x g durante 2 min) e congeladas a - 80°C.
TESTE DE NEUTRALIZAÇÃO DE REDUÇÃO DE PLACA
[0217] Titulações de anticorpo de neutralização foram determinadas por um teste de neutralização de redução de placa (PRNT) conforme descrito anteriormente (consultar, por exemplo, Osorio et al. Lancet Infect Dis. setembro de 2014;14(9):830-8).
ENSAIO DE NEUTRALIZAÇÃO DE PARTÍCULA DE VÍRUS REPÓRTER (RVP)
[0218] Titulações de anticorpo de neutralização foram analisadas por titulação de amostras de soro com uma quantidade constante de RVPs de Zika em células Vero cultivadas em placas de 96 cavidades. RVPs contiveram as proteínas prME de Zika (cepa SPH2012) e um repórter de Renilla luciferase com base em Dengue. Brevemente, soros foram inativados por calor a 56°C durante 30 min, diluídos e, então, incubados a 37°C com RVPs. A mistura de soro/RVP foi, então, misturada com células Vero e incubada por 72 horas em 37°C ± 2°C/5% de CO2 antes da detecção com substrato de luciferase. Dados foram analisados com o uso de análise de 4 parâmetros não lineares JMP11,
normalizados para um controle de rastreio positivo e dose eficaz de 50% (EC50) foi relatada.
[0219] A menos que seja indicado o contrário, todos os métodos experimentais adicionais foram conduzidos conforme descrito no Exemplo 1 acima.
RESULTADOS
[0220] Para avaliar a imunogenicidade dos candidatos a PIZV em camundongos CD-1 machos e fêmeas de 6 semanas de idade, grupos de camundongos CD-1 (N = 10/grupo) foram imunizados através da rota i.m. com uma dose de 0,1 µg (+ alum), 1,0 µg (+ alum) de uma vacina derivada de cepas de vírus ZIKAV PRVABC69 P6b ou P6e. Para avaliar a necessidade por adjuvante, um grupo de animais foi vacinado com 0,1 µg de vacina derivada de P6e e que carece de adjuvante de alum. Vacinações ocorreram nos dias 0, 28 e 56, em que o grupo 6 recebe PBS como um controle de placebo (Figura 12A e Tabela 5). TABELA 5: FORMULAÇÕES DE PIZV E DESAFIOS EM CAMUNDONGOS CD-1 Grupo Cepa Dose (µg) Alum (µg) N 1 P6b 0,1 0,50 10 2 P6b 1,0 0,50 10 3 P6e 0,1 0,50 10 4 P6e 1,0 0,50 10 5 P6e 0,1 - 10 6 Placebo (PBS) - - 10
[0221] Depois da vacinação, amostras de soro coletadas após imunizações primária (dia 27), secundária (dia 40) e terciária (dia 70) foram testadas para anticorpos de neutralização específicos para ZIKAV por ensaio de neutralização de RVP (Figura 12B). Vinte e sete dias após receber a primeira dose, uma leve resposta de anticorpo de neutralização foi observada em camundongos vacinados com PIZV derivados de qualquer clone que contém alum, em comparação com o grupo de controle de placebo de PBS. Importantemente, essa resposta aumentou significativamente mediante uma segunda imunização (dia 40), porém, não foi adicionalmente aprimorada mediante imunização com uma terceira dose (dia 70). Nenhuma resposta de anticorpo de neutralização foi observada em camundongos vacinados com vacina sem adjuvante (Figura 12B).
[0222] Para avaliar a imunogenicidade e eficácia protetora dos candidatos a PIZV, grupos de camundongos AG129 de 4 semanas de idade (n = 5/grupo) foram imunizados através da rota i.m. com uma dose de 0,1 µg (+ alum), dose de 1,0 µg (+ alum) ou dose de 0,1 µg (- alum) de uma vacina derivada dos estoques de ZIKAV PRVABC59 P6b ou P6e nos dias 1 e 28 (Figura 13A e Tabela 6). TABELA 6: FORMULAÇÕES DE PIZV E DESAFIOS EM CAMUNDONGOS AG129 Grupo Sexo Cepa Dose (µg) Alum (µg) N 1 F P6b 0,1 0,50 5 2 F P6b 1,0 0,50 5 3 F P6b 0,1 - 5 4 M P6e 0,1 0,50 5 5 M P6e 1,0 0,50 5 6 M P6e 0,1 - 5 7 M Placebo (PBS) - - 5
[0223] Depois da vacinação, camundongos vacinados e de controle foram intraperitonealmente desafiados no dia 56 com 104 PFU de ZIKAV PRVABC59 (pouca passagem). Amostras de soro coletadas após imunizações primária (D27) e secundária (D55) foram testadas para resposta de anticorpo de neutralização específica para ZIKAV (Figura 13B e Tabela 7). Apenas os grupos que recebem a alta dose de vacina com adjuvante alum (grupos 2 e 5) elicitaram uma resposta de anticorpo de neutralização após uma única imunização, que aumentou drasticamente após intensificação. Em contraste, grupos que recebem a dose alta ou baixa de vacina com adjuvante alum produziram uma alta resposta de anticorpo de neutralização após uma segunda dose. Ao receber duas doses de vacina, não houve diferença estatística entre grupos de camundongos que recebem vacina com adjuvante alum, independentemente da dosagem ou da derivação do clone P6. TABELA 7: RESPOSTAS DE ANTICORPO DE NEUTRALIZAÇÃO
ESPECÍFICAS PARA ZIKAV Titulações de anticorpo de neutralização de soro D27 (início) D55 (intensificação) Grupo Formulação GMT % de sc GMT % de sc 1 P6b 0,1 µg + alum <20 40 1280 100 2 P6b 1,0 µg + alum 135 80 2229 100 3 P6b 0,1 µg - alum <20 0 <20 0 4 P6e 0,1 µg + alum <20 20 640 100 5 P6e 1,0 µg + alum 30 100 905 100 6 P6e 0,1 µg - alum <20 0 <20 20 7 PBS <20 0 <20 0
[0224] Todos os grupos também foram monitorados para mortalidade, morbidade e perda de peso durante 21 dias após desafio. Viremia depois do desafio foi detectada e quantificada pela titulação de placa. Camundongos vacinados com uma baixa ou alta dose de candidatos a PIZV formulados com alum (grupos 1, 2, 4 e 5) estavam completamente protegidos do desafio de ZIKAV letal, conforme avaliado pelo ensaio de teste de neutralização de redução de placa (PRNT), assim como um ensaio de neutralização secundário comparável (Tabela 8). Nenhuma perda de peso ou sinais clínicos de doença foram observados em camundongos vacinados, nenhum teve viremia infecciosa detectável três dias após desafio, e todos os camundongos vacinados com baixa ou alta dose de antígeno + adjuvante alum sobreviveram 21 dias após o desafio (Figuras 14 a 16). Em contraste, o desafio de todos os camundongos virgens resultou em alta viremia no dia 2 após desafio e morbidade/mortalidade entre dia 10 e 18 após desafio (mediana de sobrevivência = D13). Adicionalmente, o desafio de camundongos vacinados com uma vacina de baixa dose de adjuvante diferente de alum derivada da cepa P6b resultou em alta viremia no dia 2 após desafio e um dia de mediana de sobrevivência similar ao grupo de controle de placebo, enquanto os camundongos vacinados com uma baixa dose de adjuvante diferente de alum derivados de clone e permaneceram parcialmente protegidos com uma mediana de sobrevivência de 19 dias. Esses resultados indicam que a imunização é mais eficaz com alum, a imunização secundária pode ser uma necessidade e que baixa dose foi tão eficaz quanto alta dose. TABELA 8: TITULAÇÕES DE ANTICORPO DE NEUTRALIZAÇÃO DE
SORO Titulações de anticorpo de neutralização de soro Terminal (após desafio) Agrupamento PRNT50 Ensaio secundário Alum (1, 2, 4, 5) 10240 20480 Sem alum (3, 6) 2560 2560 PBS (7) 1280 1280
[0225] Adicionalmente, a presença de NS1 na substância de fármaco (DS) da vacina produzida a partir de vírus P7b e P7e inativado inteiro (uma passagem adicional das cepas P6b e P6e, respectivamente) foi testada. Um ELISA sanduíche foi realizado com o uso de placas pré-revestidas com um anticorpo monoclonal reativo com ambas linhagens asiáticas e africanas da NS1 de vírus da Zika, porém, sem reação cruzada com NS1 de Dengue. Diluições de 2, 4, 8, 16 e 32 vezes duplicadas de DS foram preparadas, e foram comparadas com uma curva padrão com o uso de NS1 purificada recombinante em duplicata em uma concentração de 0 a 8 ng/ml. Diluições duplicadas de tampão de DS sozinhas foram preparadas como controles negativos. NS1 ligada foi detectada com conjugado de HRP anti-NS1, e a absorvância (A450-A630) das cavidades com tampão de DS sozinho foi subtraída da absorvância medida nas cavidades que contêm as amostras de DS correspondentes. Resultados do ELISA sanduíche são mostrados na Tabela 9 abaixo. Curiosamente, se observou que NS1 se copurifica com as preparações de substância de fármaco de vacina, o que sugere que NS1 viral pode ser um componente imunogênico da vacina de vírus inativado inteiro. TABELA 9: ELISA DE NS1 Cepa na OD de log Inferior Superior Fator de Concentração Erro preparação de Amost previsto a 95% a 95% Diluição Prevista (ng/ml) padrão vacina ra ng/ml P7b 3,61 0,951 0,018 0,915 0,986 32 ~285 P7e 3,79 0,980 0,023 0,935 1,024 32 ~306
[0226] O limite de anticorpo de neutralização (Nab) necessário para conferir proteção do desafio de vírus da Zika de tipo selvagem após transferência passiva de anticorpos foi testado a seguir. (Tabelas 10A e B).
TABELA 10A: PROJETO DE ESTUDO DE TRANSFERÊNCIA PASSIVA EM CAMUNDONGOS AG129 Artigo de Diluição de Titulação de Nab Grupo Teste soro prevista antes de IP 1 100 µl 1/3 6827/3,83 2 100 µl 1/9 2276/3,36 3 100 µl 1/27 759/2,88 4 100 µl 1/81 253/2,40 5 100 µl 1/243 84/1,93 6 100 µl 1/729 28/1,45 7 100 µl 1/2187 9/0,97 8 100 µl PBS - TABELA 10B: TEMPORIZAÇÃO DE ESTUDO DE TRANSFERÊNCIA PASSIVA EM CAMUNDONGOS AG129 Descrição Dia de Estudo Transferência passiva Dia 0 Hemorragia Primária (AM) Dia 1 Desafio (PM) Dia 1 Hemorragia de Viremia Dia 4 Hemorragia Terminal Dia 29 para sobreviventes
[0227] Soro agrupado de camundongos AG129 vacinados e desafiados foi diluído em série de 3 vezes em PBS e injetado intraperitonealmente em 7 grupos (N = 5/grupo) de camundongos
AG129 de 5 a 6 semanas de idade. Soro de camundongo AG129 pré- imune foi usado como controle de placebo (grupo 8). Depois da transferência passiva (~16 a 19 horas depois), sangue total foi coletado e soro foi separado através de centrifugação de cada camundongo antes do desafio de vírus para determinação de titulação de anticorpo de neutralização de circulação (Figura 17). Logo antes do desafio de vírus, grupos de camundongos (grupos designados 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) tiveram titulações de anticorpo de neutralização de log10 médio de 2,69, 2,26, 1,72, 1,30, <1,30, <1,30, <1,30, <1,30, respectivamente.
[0228] Vinte e quatro horas depois da transferência passiva de nAbs de ZIKV, camundongos foram intraperitonealmente desafiados com 104 pfu de ZIKV PRVABC59. Depois do desafio, animais foram ponderados diariamente e monitorados 1 a 3 vezes ao dia durante 28 dias para sinais de doença. Uma pontuação clínica foi dada a cada animal com base nos sintomas (Tabela 11). Animais que eram moribundos e/ou demonstraram claros sinais neurológicos (pontuação clínica ≥2) sofreram, humanamente, eutanásia e contaram como não sobreviventes. TABELA 11: DESCRIÇÃO DE PONTUAÇÕES CLÍNICAS DADAS
DURANTE MONITORAMENTO PARA MORBIDADE E
MORTALIDADE Pontuação Descrição 0 Aparência e comportamento normais 1 Pelo levemente desmanchado e/ou perda geral de condição Aumentos no comportamento/aparência acima, alterações respiratórias, 2 tremores, comportamento antissocial Primeiros sinais de neuropatia – Postura altamente curvada, paralisia 3 parcial (imobilidade, caminhar instável, flacidez nas pernas, tremores graves) ou paralisia completa 4 Encontrado morto sem demonstrar sinais de pontuação 2 ou 3 primeiro
[0229] Sinais de doença começa a aparecer nove dias após desafio no grupo de controle (grupo 8) e grupos 5 a 7, com uma perda correspondente em peso (Figura 18). Sangue total foi coletado e soro foi separado através de centrifugação de cada animal três dias após desafio. Amostras de soro foram analisadas para a presença de ZIKV infeccioso com o uso de um ensaio de titulação de placa (Figura 19). A titulação infecciosa média (log10 pfu/ml) para camundongos em grupos 1 a 8 foi: 1,66, 2,74, 4,70, 4,92, 7,24, 7,54, 7,54 e 7,46, respectivamente. Importantemente, camundongos nos grupos 1 a 4 com níveis detectáveis de anticorpos de neutralização de ZIKV (≥1,30 log10) tiveram níveis inferiores estatisticamente significativos (titulações 102,5 a 106,0 vezes inferiores) de viremia (p = 0,0001, 0,0003, 0,0007 e 0,0374) em relação aos camundongos de controle. Esses resultados sugeriram que níveis detectáveis de anticorpos de neutralização de ZIKV (≥1,30 log10) reduziram viremia de uma maneira dependente de dose.
[0230] A mediana de sobrevivência em dias de camundongos nos grupos 1 a 8 foi: não determinada, dia 17, dia 17, dia 13, dia 11, dia 11, dia 11 e dia 10, respectivamente (Figura 20). Importantemente, as curvas de sobrevivência para grupos de camundongos com titulações de anticorpo de neutralização de ZIKV detectáveis (grupos 1 a 4) foram estatisticamente diferentes em comparação com o grupo de controle (grupo 8) (p = 0,0019, 0,0019, 0,0019, 0,0153, respectivamente). Esses resultados sugeriram que níveis detectáveis (≥1,30 log10) de anticorpos de neutralização de ZIKV atrasaram o início da doença de uma maneira dependente de dose.
[0231] Finalmente, a titulação de anticorpo de neutralização de ZIKV de cada animal foi colocada em gráfico contra sua titulação de viremia correspondente e uma análise de regressão linear foi realizada. Uma relação correlacionada de maneira altamente inversa entre titulações de anticorpo de neutralização de ZIKV e níveis de viremia no dia 3 após desafio foi observada (Figura 21). Um resumo dos resultados dos estudos de transferência passiva é mostrado na Tabela 12 abaixo. TABELA 12: SUMÁRIO DOS RESULTADOS DE TRANSFERÊNCIA
PASSIVA nAb de ZIKV de % de Mediana de Diluição Viremia (D3) Grupo circulação sobrevivência sobrevivência de soro log10 pfu/ml GMT (D28) dia 1 1/3 2,69 ± 0,17 1,66 ± 0,62 20 24 2 1/9 2,26 ± 0,13 2,73 ± 0,68 0 17 3 127 1,72 ± 0,16 4,69 ± 0,77 0 17 4 1/81 1,30 ± 0,16 4,94 ± 1,29 0 13 5 1/243 <1,30 7,25 ± 0,10 0 11 6 1/729 <1,30 7,54 ± 0,31 0 11 7 1/2187 <1,30 7,52 ± 0,39 0 11 8 PBS <1,30 7,47 ± 0,37 0 10
[0232] Embora nenhum grupo de camundongos que recebe anticorpos de neutralização de ZIKAV tenha se protegido completamente do desafio de ZIKAV letal nesse experimento, níveis de viremia reduzidos e início atrasado de doença de uma maneira dependente de dose dentre os grupos de camundongos com níveis detectáveis de titulações de anticorpo de neutralização de ZIKAV de circulação foram demonstrados.
[0233] Em conjunto, dados pré-clínicos de ambos os estudos de camundongo CD-1 e AG129 indicaram que um PIZV derivado de clones virais separados e caracterizados por cavidade que são imunogênicos e têm capacidade para fornecer proteção contra o desafio com ZIKAV de tipo selvagem. Importantemente, uma baixa e alta dose de vacina elicitou uma resposta de anticorpo de neutralização similar após duas doses, e forneceu níveis similares de proteção contra desafio de ZIKAV letal. Curiosamente, camundongos vacinados com um candidato a PIZV sem adjuvante também mostraram proteção parcial de desafio de ZIKAV. Vacina antissoro diminuiu significativamente viremia em camundongos AG129 passivamente imunizados, e prolongou a sobrevivência contra desafio de ZIKAV letal. Esses resultados também demonstram que os candidatos a PIZV caracterizados por cavidade foram altamente eficazes contra infecção de ZIKAV no modelo de camundongo AG129 altamente suscetível a ZIKAV.
[0234] Adicionalmente, constatou-se que a sequência de um PRVABC59 (de PRVABC59 P6e) na passagem 7 foi geneticamente idêntica àquela da passagem 6. Isso foi surpreendente dado que flavivírus são geralmente considerados geneticamente confiáveis. PRVABC59 P6e foi selecionada como a semente de vírus pré-mestre devido, em parte, à sua estabilidade genética sobre 7 passagens. Sem desejar estar vinculado pela teoria, acredita-se que essa estabilidade genética aprimorada pode ocorrer devido à única substituição de aminoácido (W98G) no domínio lateral de NS1, na medida em que foi a única mutação observada no genoma de PRVABC59 P6 adaptado à célula Vero. Adicionalmente, a estabilidade e homogeneidade genética é vantajosa pelo fato de que reduz variabilidade e aumenta produção reproduzível de cepas subsequentes que podem ser usadas para a formulação de vacina. EXEMPLO 3: AVALIAÇÃO PRÉ-CLÍNICA DO FENÓTIPO DAS CEPAS P6A E P6E
MATERIAIS E MÉTODOS
[0235] Camundongos AG129 (que carecem de receptores de interferon α/β e γ) são suscetíveis à infecção e doença de ZIKV, que incluem graves patologias no cérebro. Camundongos AG129 de 14 semanas de idade foram infectados intraperitonealmente com 104 e 103 pfu dos clones de ZIKV de passagem 6 a e e.
[0236] Camundongos foram ponderados e monitorados diariamente (até 28 dias) para sinais clínicos de doença (perda de peso, pelo desmanchado, postura curvada, letargia, fraqueza nas pernas, paralisia parcial/completa). Adicionalmente, a análise de viremia foi realizada através de titulação de placa de amostras de soro coletadas três dias após o desafio, conforme descrito no Exemplo 1.
RESULTADOS Infecção com preMVS P6e resultou em 100% de mortalidade (tempo de mediana de sobrevivência = 12,5 dias), enquanto a infecção com preMVS P6a resultou em apenas 33% de mortalidade (tempo de mediana de sobrevivência = não determinado) (Figura 22). De acordo com isso, camundongos infectados com preMVS P6e mostraram maior perda de peso em comparação com camundongos infectados com PRVABC59 P6a (3). Nenhuma diferença estatística foi encontrada nos níveis de viremia de grupo médio entre grupos de camundongos infectados com PRVABC59 P6a ou P6e (Figura 24). Esses dados sugerem que a cinética de crescimento sozinha pode não ser um determinante importante (visto que ambas cepas produziram viremia similar, e titulações de pico similar in vitro) e que uma característica da proteína de Envelope poderia ser importante para virulência (de uma cepa de tipo selvagem) e imunogenicidade (de um candidato inativado). EXEMPLO 4: INTEGRIDADE DE ENSAIO DE INATIVAÇÃO PARA
DETERMINAR EFICÁCIA DE INATIVAÇÃO
[0237] Um ensaio de dupla infectividade também denominado ensaio de integridade de inativação (COI) foi desenvolvido para determinar a eficácia de inativação de formalina (0,01% de formaldeído) e potencial atividade viral infecciosa residual de substância de fármaco volumosa (BDS) de vírus da Zika inativado purificado (PIZV).
[0238] Preparação de amostra: Quatro lotes (Lotes Tox 1 a 4) de Vacina de Zika Purificado Inativado (PIZV) de clone e, conforme descrito acima, foram fabricados por cultivo em células Vero. Sobrenadantes de 4 coletas diárias (que totalizam cerca de 4000 ml) foram purificados através de cromatografia seguida pela adição de formaldeído a uma concentração final de 0,01% em p/v. Permitiu-se que a inativação avançasse por 10 dias a 22°C. No Controle de Processo (IPC) amostras foram removidas diariamente da substância de fármaco volumosa (BDS) durante inativação para caracterização e análises. As amostras de IPC diárias foram neutralizadas com metabissulfito de sódio e dialisadas em DMEM (meio de cultivo viral). As amostras contêm o vírus da Zika purificado inativado. No dia final de inativação, o volume restante de amostras de BDS não foi neutralizado, porém, foi processado com TFF para remover formaldeído e tampão trocado em PBS.
[0239] Integridade de ensaio de inativação (COI): O ensaio de COI foi usado para análise da eficácia de inativação nas amostras de IPC diárias para entender a cinética de inativação, e a BDS final. Para sensibilidade máxima, duas linhas celulares, Vero e C6/36, foram inicialmente utilizadas nesse ensaio para detectar vírus potencialmente vivo nas amostras de IPC e DS. Quando o vírus da Zika infecta células Vero na presença de meio de cultivo que contém vermelho fenol, os subprodutos de morte celular provocam uma queda em pH. Consequentemente, as alterações de cor de meios de vermelho/rosa para amarelo, indicativas dessa comutação ácida no pH do meio. Esse fenômeno é causado pela apoptose e efeitos citopáticos (CPE), que se referem às alterações observadas na estrutura celular das células hospedeiras que são provocadas pela invasão, infecção viral e germinação das células durante replicação viral. Por fim, embora ambas as células vero e de mosquito C6/36 sejam de uma linha celular permissiva para infecção, a infecção de vírus da Zika mata apenas células Vero in vitro. Portanto, células Vero foram usados como a linha celular indicadora para o ensaio. Em contraste, células C6/36 que são derivadas de um vetor hospedeiro natural para vírus da Zika não exibem um CPE após infecção de Zika e não sofrem lise. Os meios não alteram cor e a viabilidade das células C6/36 não é alterada.
[0240] O ensaio é, assim, dividido em duas partes: A primeira parte do ensaio permite a amplificação paralela de partículas virais potencialmente vivas nas placas de 96 cavidades das duas linhas celulares suscetíveis por seis dias. A segunda etapa do ensaio envolve a transferência do sobrenadante das placas de 96 cavidades (que incluem partículas potencialmente amplificadas) em placas de 6 cavidades que contêm monocamadas de células Vero, e incubação por mais 8 dias para permitir que infecção viral e um efeito citopático se desenvolvam nas células Vero. Qualquer CPE observado foi confirmado com o uso de microscópio de luz.
[0241] Embora descrito em detalhes com relação ao uso de placas de 96 cavidades na primeira parte do ensaio, isto é, a cultura em células C6/36, e placas de seis cavidade na segunda parte do ensaio, isto é, a cultura de células Vero para observar um efeito citopático, o ensaio pode ser facilmente dimensionado de acordo com a seguinte tabela:
Parte 1 do ensaio: Aplicação de BDS (deve estar dentro da Parte 2 do ensaio: faixa de vol recomendada) transferência para Vero (deve acomodar volume agrupado para transferência) placa ou frasco Área de Faixa de volume ml de volume de nº de frascos nº de frascos volume ml de volume de superfície recomendada amostra por inóculo por necessários necessários agrupado amostra inóculo (cm2) (para cultivo) cm2 cavidade (ou para para para por cm2 transferido por frasco) dimensiona- dimensiona- transferên- por cavidade mento de mento de cia (ml) (ou frasco) 15X; diluição 15X; diluição de duas de 5 vezes vezes formato de 96 0,32 100 a 200 ul 0,3125 0,1 cavidades formato de 12 3,8 0,076 a 1,14 0,3125 1,188 6,48 16,21 11,88 cavidades ml formato de 6 9,5 1,9 a 2,9 ml 0,3125 2,969 4,32 10,81 17,81 0,0526 0,1 cavidades formato de 25 5 a 7,5 ml 0,3125 7,813 9,86 24,64 7,813 0,0526 1,32 frasco T25 formato de 75 15 a 22,5 ml 0,3125 23,438 3,29 8,21 23,438 0,0526 3,95 frasco T75 formato de 150 30 a 45 ml 0,3125 46,875 1,64 4,11 46,88 0,0526 7,89 frasco T150 formato de 175 35 a 52,5 0,3125 54,688 1,41 3,52 54,69 0,0526 9,21 frasco T175 formato de 235 47 a 70,5 0,3125 73,438 1,05 2,62 73,44 0,0526 12,36 frasco T235 formato de 300 30 a 40 ml? 0,3125 93,750 0,82 2,05 93,75 0,0526 15,78 frasco T300 CF1 6/36 150 a 200 0,3125 198,750 0,39 0,0526 33,45 CF2 1272 300 a 400 0,3125 397,500 0,19 0,0526 66,91 CF10 63360 1500 a 2000 0,3125 19800,000 0,00 0,0526 3332,74
[0242] É aparente que durante o dimensionamento o volume de amostra por cm2 de vaso permanece constante para a parte 1 e as mesmas condições de infecção viral são mantidas na parte 2.
[0243] Controle de ensaio de COI: Os controles de titulação e titulação de retorno para esse ensaio foram realizados com o uso de células indicadoras Vero e pontuados em um formato de 96 cavidades TCID50 em que cavidades pontuaram positivo com base na alteração de cor dos meios de rosa para amarelo, como um substituto para a morte celular, ou a presença de CPE.
[0244] Teste de controle de titulação de vírus: Duas repetições independentes do vírus de controle (PRVABC59) da titulação conhecida foram submetidas a uma série de diluição de 10 vezes em meios que contêm 2% de FBS, e 100 µl de cada diluição foram adicionados em quatro cavidades de uma placa de 96 cavidades que contém células Vero. Placas foram incubadas durante 5 dias, então, as cavidades que contêm CPE foram gravadas e a titulação de vírus foi calculada com o uso da calculadora Reed-Meunch.
[0245] Teste de controle de titulação de retorno de vírus: O vírus de controle de titulação conhecida foi diluído em série em 200 TCID50. Duas repetições independentes do vírus de controle 200 TCID50 foram submetidas a uma série de diluição de duas vezes em meios que contêm 2% de FBS, e 100 µl de cada diluição foram adicionados em quatro cavidades de uma placa de 96 cavidades que contém células Vero. Células foram incubadas durante 5 dias, então, as cavidades que contêm CPE foram gravadas e a titulação de vírus foi calculada com o uso da calculadora Reed-Meunch. PROTOCOLO DE COI DETALHADO:
1. Primeira parte do ensaio: Células Vero (1,4 E+05 células/ml) e de mosquito Aedes aegypti C6/36 (4 E+05 células/ml) foram semeadas em placas de 96 cavidades dois dias antes da adição das amostras. As células Vero foram cultivadas em DMEM + 10% de FBS final + 2% de L-glutamina + 1% de penicilina/estreptomicina a 37°C. Células C6/36 foram cultivadas em DMEM + 10% de FBS + 2% de L- glutamina + 1% de Penicilina/estreptomicina + 1% de aminoácidos não essenciais a 28°C.
2. Três repetições independentes do vírus de controle 200 TCID50 (preparado no teste de controle de titulação de retorno de vírus) ou das amostras de DS foram diluídas (diluições de 5 vezes e 10 vezes) nos meios que contêm 2% de FBS.
3. As células em placas de 96 cavidades foram inoculadas com as amostras. Antes da infecção das monocamadas de célula nas placas de 96 cavidades, a amostra foi passada em vórtex para romper qualquer possível agregação. 100 µl de cada diluição foram aplicados em cada uma das 5 cavidades em duas placas de 96 cavidades separadas que contêm células Vero e C6/36, respectivamente.
4. O meio sozinho foi incluído em outra cavidade para cada tipo de célula como um controle de CPE negativo.
5. Placas foram incubadas durante 6 dias na temperatura apropriadas para a linha celular.
6. Segunda parte do ensaio: Para permitir que o vírus vivo seja adicionalmente amplificado e visualizado pelo CPE em uma linha celular permissiva, o volume inteiro de cada sobrenadante de 96 cavidades de ambas as células Vero e C6/36 foi transferido para cavidades individuais de placas de 6 cavidades das células Vero. Inoculação avançou por 90 minutos com agitação em intervalos de 15 minutos.
7. Meio que contém 2% de FBS foi adicionado nas cavidades e placas foram incubadas durante mais 8 dias para detecção subsequente das amostras amplificadas como uma função de CPE. A inativação foi considerada incompleta caso alguma das repetições da DS tenha demonstrado CPE no fim do dia 8.
7. A presença de vírions vivos/replicados foi visualizada pela formação de placas ou CPE em monocamadas de célula suscetíveis após transferência para a placa de 6 cavidades, e incubação durante 8 dias para permitir replicação viral. A % de pontuação de CPE nas placas de 6 cavidades no fim do ensaio foi calculada como a seguir: - Cada placa de 6 cavidades de células Vero foi examinada para CPE através de visualização de alteração colorimétrica, seguido por confirmação de CPE por inspeção sob um microscópio de luz invertido. - Cada placa de 6 cavidades representou uma das repetições das diluições de DS preparadas nas diluições de 5 e 10 vezes descritas acima (5 cavidades, mais uma cavidade que contém meios sozinhos).
[0246] Portanto, a % de CPE para cada repetição refletiu o número de cavidades com CPE dentre o total de 5 cavidades por amostra (total de 120 cavidades são usadas por ensaio). % média de CPE e desvio padrão foram calculados com base em três repetições de cada diluição.
[0247] Resultados: As amostras diárias foram analisadas em cada um dos lotes tox nº 1 a 4 conforme mostrado nas seguintes tabelas.
TABELA A: CINÉTICA DE INATIVAÇÃO, LOTE TOX Nº 1
% média Amostra Transferência STDV de CPE
1:10 Dia 1 Vero-a-Vero 100 0
1:10 Dia 0 Vero-a-Vero 100 0
1:10 Dia 1 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 2 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 3 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 4 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 7 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 8 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 9 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 10 Vero-a-Vero 0 0
100TCID50/ml Vero-a-Vero 100 0
1:10 Dia 1 C6/36-a-Vero 100 0
1:10 Dia 0 C6/36-a-Vero 100 0
1:10 Dia 1 C6/36-a-Vero 6,7 12
1:10 Dia 2 C6/36-a-Vero 13,3 12
1:10 Dia 3 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 4 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 7 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 8 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 9 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 10 C6/36-a-Vero 0 0
100TCID50/ml C6/36-a-Vero 100 0
TABELA B: CINÉTICA DE INATIVAÇÃO, LOTE TOX Nº 2
Amostra Transferência % média de CPE STDV
1:10 Dia 1 Vero-a-Vero 100 0
1:10 Dia 0 Vero-a-Vero 100 0
1:10 Dia 1 Vero-a-Vero 100 0
1:10 Dia 2 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 3 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 4 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 7 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 8 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 9 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 10 Vero-a-Vero 0 0
100TCID50/ml Vero-a-Vero 100 0
1:10 Dia 1 C6/36-a-Vero 100 0
1:10 Dia 0 C6/36-a-Vero 100 0
1:10 Dia 1 C6/36-a-Vero 100 12
1:10 Dia 2 C6/36-a-Vero 13,3 12
1:10 Dia 3 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 4 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 7 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 8 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 9 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 10 C6/36-a-Vero 0 0
100TCID50/ml C6/36-a-Vero 100 0
TABELA C: CINÉTICA DE INATIVAÇÃO, LOTE TOX Nº 3
Amostra Transferência % média de CPE STDV
1:10 Dia 1 Vero-a-Vero 100 0
1:10 Dia 0 Vero-a-Vero 100 0
1:10 Dia 1 Vero-a-Vero 27 12
1:10 Dia 2 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 3 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 4 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 7 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 8 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 9 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 10 Vero-a-Vero 0 0
100TCID50/ml Vero-a-Vero 100 0
1:10 Dia 1 C6/36-a-Vero 100 0
1:10 Dia 0 C6/36-a-Vero 100 0
1:10 Dia 1 C6/36-a-Vero 87 12
1:10 Dia 2 C6/36-a-Vero 27 12
1:10 Dia 3 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 4 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 7 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 8 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 9 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 10 C6/36-a-Vero 0 0
100TCID50/ml C6/36-a-Vero 100 0
TABELA D: CINÉTICA DE INATIVAÇÃO, LOTE TOX Nº 4
Amostra Transferência % média de CPE STDV
1:10 Dia 1 Vero-a-Vero 100 0
1:10 Dia 0 Vero-a-Vero 93 12
1:10 Dia 1 Vero-a-Vero 0
1:10 Dia 2 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 3 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 4 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 7 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 8 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 9 Vero-a-Vero 0 0
1:10 Dia 10 Vero-a-Vero 0 0
100TCID50/ml Vero-a-Vero 100 0
1:10 Dia 1 C6/36-a-Vero 100 0
1:10 Dia 0 C6/36-a-Vero 100 0
1:10 Dia 1 C6/36-a-Vero 33 23
1:10 Dia 2 C6/36-a-Vero 7 12
1:10 Dia 3 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 4 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 7 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 8 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 9 C6/36-a-Vero 0 0
1:10 Dia 10 C6/36-a-Vero 0 0
100TCID50/ml C6/36-a-Vero 100 0
[0248] Cinética compilada de dados de inativação: Dados de COI para amostras dos quatro lotes de toxicologia foram comparados com a potência infecciosa (TCID50) determinada conforme descrito acima e com cópia de RNA. A cópia de RNA foi determinada purificando-se ácidos nucleicos da amostra e amplificando-se RNA de Zika com iniciadores de serótipo específico com o uso de um kit de RT- PCR. O resultado mostrado na Figura 25 mostra que a sensibilidade do ensaio de COI é significativamente maior que aquela de TCID50.
[0249] Características de desempenho do ensaio de COI - Precisão: As diluições-alvo (TCID50/cavidade) e suas respectivas proporções de CPE foram usadas para determinar precisão relativa. Para as células Vero, houve uma relação linear estatisticamente significativa entre as proporções observadas e esperadas de CPE positivo. A inclinação da linha com relação aos resultados observados e esperados é de 0,92 com um intervalo de 95% de confiança (CI) de 0,83 a 1,01 que sobrepõe 1 indicam 100% de precisão. Para as células C6/36, é uma relação linear estatisticamente significativa entre as proporções observadas e esperadas de CPE positivo. A inclinação da linha com relação aos resultados observados e esperados é de 0,88 com um intervalo de 95% de confiança (CI) de 0,80 a 0,95 indicam que uma leve inclinação (5 a 20%) foi vista com essa linha celular. Ambas as linhas celulares demonstram precisão satisfatória (relativa).
[0250] Características de desempenho do ensaio de COI – Limite de Detecção (LoD): A sensibilidade do ensaio foi avaliada para ambas as placas C6/36-a-Vero e Vero-a-Vero. Conforme descrito acima, os dados se ajustaram com o uso de regressão de mínimos quadrados da proporção de +ve CPE observada por total de cavidades em placa com diluições de titulação em placa que começam em 10,00 TCID50/cavidade até uma titulação inferior de 0,08 TCID50. Ademais, controles negativos (0,00 TCID50/cavidade) foram incluídos para cada diluição dentro das placas. Pontuação de CPE foi realizada para cada diluição através de ambas as placas C6/36-a-Vero e Vero-a-Vero. Uma relação clara entre a titulação de vírus de entrada de CPE e log foi vista. Isso exibe a relação logística (sigmoidal) entre a proporção de cavidades positivas de CPE com relação à concentração de log10 de TCID50/cavidade juntamente com um limite de confiança de 99% inferior e superior. Em uma concentração -2 log10 (= 0,01 TCID50/cavidade), um modelo com base em e que explica toda fonte de variação fixada e aleatória nos dados de qualificação previstos 0,85%, ou 0,01 quando arredondado até 0,01 TCID50/cavidade, com um limite de confiança de 99% inferior de 0,42%. Visto que o limite de confiança de 99% inferior não inclui zero, há uma chance muito pequena quantificável (< 1%) das cavidades de 0,85% de CPE surgirem de 0 TCID50/cavidade (isto é, devido ao ruído). Isso estabelece um limite de detecção para o ensaio de pelo menos 0,01 TCID50/cavidade (isto é, a menor quantidade de partículas de Zika vivas na amostra que podem ser detectadas). Isto é, quando arredondado para cima, 1 em 60 cavidades serão positivas para CPE ou dados esses parâmetros, a menor proporção teórica do CPE +ve que poderia ser detectada em 60 cavidades seria 1,67% ou 0,0167.
[0251] Os tipos de célula (C363 e Vero) foram comparados por sensibilidade relativa, em que C6/36 demonstra que uma diluição inferior de titulação de vírus poderia ser detectada em comparação com células Vero, conforme mostrado na Figura 26; no mesmo nível de entrada de vírus (0,31 TCID50), a proporção de cavidades de CPE positiva é superior para C6/36 com relação às células Vero.
[0252] O menor valor de entrada de vírus usado durante a qualificação desse ensaio foi 0,02 TCID50 (-1,61 log TCID50). Usar a curva ajustada para células C6/36 resulta na pontuação de CPE positiva em 0,035 ou 3,5% das cavidades (1 em 28 cavidades). Se a curva for extrapolada em relação ao menor nível prático de 0,167 ou 1,6%, então, isso se equipara a um nível de entrada de vírus de 0,015 TCID50 (-1,82 log TCID50). No entanto, o impacto de variância de ensaio transmitido deve ser considerado ao determinar os menores níveis de vírus infeccioso que podem ser detectados conforme refletido nos resultados de +ve CPE. Esse ruído surge da geração do estoque de trabalho de vírus de entrada. Comparação da TCID50-alvo e do cálculo de titulação de retorno mostra que a TCID50 do vírus de estoque de trabalho exibiu um desvio padrão (SD) de 85 TCID50/ml, derivado de uma média de 213 ao alvejar uma concentração de TCID50/ml de estoque de 200. A % de CV calcula para ~40% com uma inclinação de cerca de +7%. Esse ruído foi fatorizado no modelo de regressão logística para gerar intervalos de confiança ao redor dos valores alvejados para as diluições de vírus. Em um valor-alvo de 0,01 TCID50/cavidade, um modelo com base em e que explica toda fonte de variação fixada e aleatória nos dados de qualificação através dos dois locais prevê que 0,86% das cavidades serão positivas para CPE (1 em 60 cavidades). Visto que o limite de confiança de 99% inferior não inclui zero, há uma chance muito pequena quantificável (< 1%) das cavidades de 0,85% de CPE positivo surgirem de 0 TCID50/cavidade devido ao ruído (Figura 27). Isso estabelece um limite de detecção para o ensaio: 0,01 TCID50/cavidade é a menor quantidade de partículas de Zika vivas na amostra que podem ser detectadas.
[0253] Características de desempenho do ensaio de COI - Faixa: A faixa do ensaio foi de 0,01 TCID50/cavidade a 4,5 TCID50/cavidade e é definida como a faixa de vírus de entrada que resultou em uma pontuação de proporção de CPE +ve maior que 0%, porém, menor que 100%.
[0254] Conclusão: Análise dos quatro lotes Tox revelou que a inativação foi concluída após incubação em 0,01% de formaldeído durante 10 dias em temperatura ambiente. Inativação foi alcançada nos dias 3 a 4 em todos os lotes produzidos, conforme medido pelo ensaio de COI. O ensaio de COI é mais sensível que as medições de potência de TCID50 ou RNA; a sensibilidade aumentada também foi observada por LoD. EXEMPLO 5: DETERMINAÇÃO DE TEOR DE FORMALINA
RESIDUAL EM UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA
1. MATERIAIS E MÉTODOS
1.1 MATERIAIS
[0255] A solução padrão de formaldeído (em metanol) (982 µg/ml), DNPH, acetonitrila de qualidade para HPLC e ácido fosfórico foram adquiridos da Wako Pure Chemicals Co. (Tóquio, Japão). Água destilada usada para diluir ácido fosfórico foi obtida da Otsuka Ⓡ Pharmaceutical (Tokushima, Japão). 2% de Alhydrogel (que corresponde a 10 mg/ml de alumínio) usado como gel de hidróxido de alumínio foi obtido da Brenntag (Frederikssund, Dinamarca). PBS foi preparada em casa, e o produto de fármaco de vacina contra Zika que contém gel de hidróxido de alumínio foi fabricado conforme descrito abaixo. O vírus da Zika foi purificado com várias técnicas após coleta. Após inativação com formaldeído, o vírus foi concentrado, e o tampão foi trocado com PBS através de filtração. A substância de fármaco volumosa foi diluída com PBS e formulada com gel de hidróxido de alumínio (0,4 mg/ml de alumínio) para formar o produto de fármaco final.
1.2 CONDIÇÕES DE HPLC
[0256] Um sistema da Waters HPLC alliance equipado com um detector UV (Milford, EUA) e uma coluna de fase inversa (YMC-Pack ODS-A, 4,6 mm x 250 mm, 5 µm (Quioto, Japão)) foi usado. Uma mistura de água e acetonitrila (1:1, v/v) foi usada como a fase móvel, o comprimento de onda de detecção foi definido em 360 nm, e a taxa de fluxo foi de 1,0 ml/min. A temperatura de coluna e o volume de injeção estavam em 25°C e 50 µl, respectivamente.
1.3 PREPARAÇÃO DE AMOSTRA
[0257] O produto de fármaco de vacina (1,2 ml) foi centrifugado a 15000 rpm durante 10 min, e o sobrenadante (1 ml) foi transferido em um frasco de vidro de HPLC de 2 ml adquirido da Waters (Milford, EUA). Depois, 20 µl de 20% (v/v) de ácido fosfórico e 50 µl de 1,0 mg/ml de solução de DNPH em acetonitrila foram adicionados, e a mistura foi agitada e deixada em temperatura ambiente por 20 min antes da injeção.
1.4 VALIDAÇÃO DE MÉTODO
[0258] De acordo com as orientações de ICH Q2, o método foi validado em termos de especificidade, linearidade, precisão, repetibilidade, precisão intermediária, robustez e estabilidade da amostra. No estudo de precisão, o produto de fármaco de vacina contra Zika e solução de gel de hidróxido de alumínio foram espetados com uma quantidade específica de formaldeído, e a amostra foi bem misturada por vórtex antes de seguir o procedimento descrito na Seção
2.3.
2. RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.1 LINEARIDADE E ESPECIFICIDADE
[0259] Seis soluções padrão de formaldeído (0,049, 0,098, 0,196, 0,491, 0,982 e 1,964 µg/ml) foram preparadas por diluição com PBS. Depois, 20% (v/v) de ácido fosfórico e 1 mg/ml de solução de DNPH em acetonitrila foram adicionados em cada solução, e os cromatogramas correspondentes são mostrados na Figura 28. Claramente, a área de pico de 10,4 min mostrou linearidade com a equação de regressão: y = 1075730x + 11731 (em que y é a área do pico de 10,4 min e x é a concentração de formaldeído em µg/ml) (coeficiente de correlação: 0,9998), que indica que ocorreu devido a HCHO-DNPH (isto é, formaldeído derivatizado com DNPH). Além disso, o pico em 5,8 min foi atribuído à DNPH na medida em que foi detectada em todas as amostras adicionadas com DNPH. Portanto, a área de pico de HCHO- DNPH foi usada para avaliação de linearidade e precisão após subtrair a área de pico de histórico de PBS.
2.2 PRECISÃO E EXATIDÃO (REPETIBILIDADE)
[0260] O efeito de adjuvante de hidróxido de alumínio foi avaliado por estudos de recuperação, que foram conduzidos espetando-se três amostras de hidróxido de alumínio (0,1, 0,4 e 1,0 mg/ml de alumínio) em PBS com 0,05 µg/ml de formaldeído na ausência da substância de fármaco de vacina. As recuperações médias foram de 102% (n = 3), 100% (n = 3), e 100% (n = 3), respectivamente, com valores baixos de desvio padrão relativo (RSD) (Tabela 13). O RSD dos dados de precisão foi calculado para avaliar a repetibilidade, e foi de 1,0%, que indica que as quantidades de alumínio até 1,0 mg/ml não interferiram na recuperação de formaldeído. TABELA 13 PRECISÃO E REPETIBILIDADE AVALIADAS COM O
USO DE AMOSTRAS DE HIDRÓXIDO DE ALUMÍNIO ESPETADAS COM 0,05 µG/ML DE FORMALDEÍDO Concentração de hidróxido de alumínio Média (n = 3) [%] [mg/ml de alumínio] (RSD [%]) 0,1 102 (0,2) 0,4 100 (0,8) 1,0 100 (0,3) Repetibilidade [%] (n = 9) 1,0
[0261] A precisão do método foi avaliada por estudos de recuperação, que foram conduzidos espetando-se o produto de fármaco de vacina contra Zika que contém adjuvante de hidróxido de alumínio com três concentrações de formaldeído (0,05, 0,10 e 1,00 µg/ml), e os resultados de recuperação média são mostrados na Tabela 14. O RSD dos dados de precisão foi calculado para avaliar a repetibilidade, e foi de 3,7%, o que indica que os produtos de fármaco de vacina contra Zika formulados com hidróxido de alumínio não interferem na recuperação de formaldeído entre 0,05 e 1,00 µg/ml. TABELA 14 PRECISÃO E REPETIBILIDADE AVALIADAS COM O
USO DE PRODUTOS DE FÁRMACO DE VACINA CONTRA ZIKA QUE CONTÊM HIDRÓXIDO DE ALUMÍNIO ESPETADO COM
FORMALDEÍDO Concentração de formaldeído espetada Média (n = 3) [%] [µg/ml] (RSD [%]) 0,05 102 (5,6) 0,10 97 (0,3) 1,00 98 (0,7) Repetibilidade [%] (n = 9) 3,7
2.4 ROBUSTEZ
[0262] A robustez do método foi avaliada para determinar como a concentração de formaldeído em amostras seria afetada por variações em parâmetros experimentais durante a preparação de amostra. Considerando-se o impacto sobre a eficácia de derivatização, a concentração de DNPH e ácido fosfórico foi selecionada conforme os parâmetros monitorados nesse estudo. O efeito foi examinado variando- se as concentrações de DNPH e ácido fosfórico em ± 0,1 mg/ml e ± 5%, respectivamente. Formaldeído foi determinado em dois lotes de produto de fármaco de desenvolvimento sob cada condição, e os resultados, mostrados na Tabela 15, sugerem que as variações em concentrações de DNPH e ácido fosfórico não tiveram impacto significativo na determinação de formaldeído.
TABELA 15 ROBUSTEZ DO MÉTODO
Concentração de formaldeído Concentração de Concentração de Condição [µg/ml] DNPH [mg/ml] ácido fosfórico [%] Lote B Lote C
1* 1,0 20 0,51 0,45
2 1,1 20 0,53 0,48
3 0,9 20 0,49 0,47
4 1,0 15 0,52 0,49
5 1,0 25 0,52 0,48
(*) Condições definidas do método

Claims (36)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para inativar uma preparação de vírus da Zika, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) isolar a preparação de vírus da Zika de uma ou mais células cultivadas in vitro, sendo que as células são usadas para produzir a preparação de vírus da Zika; e (b) tratar a preparação de vírus da Zika com 0,005% a 0,02% em p/v de formaldeído.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células são células não humanas.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a preparação de vírus da Zika é tratada com 0,01% de formaldeído.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a preparação de vírus da Zika é tratada por oito a doze dias.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a preparação de vírus da Zika é tratada por dez dias.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a preparação de vírus da Zika é tratada a uma temperatura de 15°C a 30°C.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a preparação de vírus da Zika é tratada a uma temperatura de 22°C.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa (c) de determinar a integridade de inativação.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma preparação de vírus da Zika tratada de acordo com a etapa (b) e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o sobrenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de vírus da Zika contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as células de inseto são selecionadas a partir de células CCL-125, células Aag-2, células RML-12, células C6/36, células C7-10, células AP-61, células A.t. GRIP-1, células A.t. GRIP-2, células A.t. GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos.55, células Sua1B, células 4a- 3B, células Mos.42, células MSQ43, células LSB-AA695BB, células NIID-CTR e células TRA-171, tais como células C6/36.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro período de tempo é de 3 a 7 dias.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que as células de mamífero são selecionadas a partir de células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito no documento nº WO97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO), tais como células VERO.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o segundo período de tempo é de 3 a 14 dias.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa (d) de neutralizar a preparação de vírus da Zika tratada com formaldeído com metabissulfito de sódio.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a preparação de vírus da Zika tratada com formaldeído é neutralizada pelo menos cinco, pelo menos sete, pelo menos nove, pelo menos 11, ou pelo menos 14 dias após tratamento com formaldeído.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa (e) de preparar uma composição farmacêutica que compreende a preparação de vírus da Zika inativada.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a preparação de vírus da Zika é misturada com um adjuvante.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em sais de alumínio, agonistas de receptor do tipo toll (TLR), lipídeo de monofosforila A (MLA), lipídeo sintético A, miméticos ou análogos de lipídeo A, derivados de MLA, citocinas, saponinas, derivados de dipeptídeo de muramila (MDP), oligos de CpG, lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, polifosfazenos, emulsões, virossomas, cocleatos, micropartículas de poli(lactídeo-co-glicolídeos) (PLG), partículas de poloxâmero, micropartículas, lipossomas, Adjuvante Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA).
19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o adjuvante é um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, sulfato de alumínio e potássio, e Alhydrogel 85.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de um ou mais antígenos na preparação de vírus da Zika são adsorvidos no adjuvante.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o vírus da Zika compreende uma mutação na posição 98 da SEQ ID Nº: 1 ou em uma posição que corresponde à posição 98 da SEQ ID Nº: 1.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a mutação é uma mutação Trp98Gly na SEQ ID Nº: 1.
23. Método, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o vírus da Zika não compreende uma mutação na proteína de envelope (E).
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica a proteína de envelope é igual à sequência correspondente na SEQ ID Nº: 2.
25. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um vírus da Zika inativado obtenível através do método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.
26. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um vírus da Zika inativado e tem um teor de formalina residual menor que 0,5 µg/ml.
27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que é obtenível através do método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.
28. Método para determinar a integridade de inativação de uma preparação de arbovírus, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) inocular células de inseto cultivadas com uma preparação de arbovírus que foi submetida a uma etapa de inativação e incubar as células de inseto durante um primeiro período de tempo, desse modo, se produz um sobrenadante de célula de inseto; (ii) inocular células de mamífero cultivadas com o sobrenadante de célula de inseto produzido em (i) e incubar as células de mamífero durante um segundo período de tempo; e (iii) determinar se a preparação de arbovírus contém um vírus de replicação residual que produz um efeito citopático nas células de mamífero.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o arbovírus é um flavivírus ou um alfavírus.
30. Método, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que o arbovírus é um vírus da Zika, um vírus do Oeste do Nilo, um vírus da Febre Amarela, um vírus da Encefalite Japonesa, um vírus da encefalite transmitida por carrapatos, um vírus da dengue, um vírus da Encefalite de St. Louis, um vírus da Chikungunya, um vírus O'nyong'nyong ou um Mayarovirus.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado pelo fato de que a preparação de arbovírus foi submetida a um tratamento com detergente, formalina, peróxido de hidrogênio, beta-propiolactona (BPL), etilamina binária (BEI), etilenoimina de acetila, azul de metileno ou psoraleno.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizado pelo fato de que as células de inseto são selecionadas a partir de células CCL-125, células Aag-2, células RML- 12, células C6/36, células C7-10, células AP-61, células A.t. GRIP-1, células A.t. GRIP-2, células A.t. GRIP-3, células UM-AVE1, células Mos.55, células Sua1B, células 4a-3B, células Mos.42, células MSQ43, células LSB-AA695BB, células NIID-CTR e células TRA-171, tais como células C6/36.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, caracterizado pelo fato de que o primeiro período de tempo é de 3 a 7 dias.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 33, caracterizado pelo fato de que as células de mamífero são selecionadas a partir de células VERO, células LLC-MK2, células MDBK, células MDCK, células ATCC CCL34 MDCK (NBL2), células MDCK 33016 (número de depósito DSM ACC 2219, conforme descrito no documento nº WO97/37001), células BHK21-F, células HKCC e células de ovário de hamster chinês (células CHO), tais como células VERO.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34, caracterizado pelo fato de que o segundo período de tempo é de 3 a 14 dias.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 35, caracterizado pelo fato de que o método tem capacidade para detectar menos que 1,0 TCID50 do arbovírus.
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