HU219679B - Eljárások kollagénkötő fehérje vagy polipeptid előállítására, kimutatására és alkalmazására - Google Patents
Eljárások kollagénkötő fehérje vagy polipeptid előállítására, kimutatására és alkalmazására Download PDFInfo
- Publication number
- HU219679B HU219679B HU9202074A HU207492A HU219679B HU 219679 B HU219679 B HU 219679B HU 9202074 A HU9202074 A HU 9202074A HU 207492 A HU207492 A HU 207492A HU 219679 B HU219679 B HU 219679B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- rtth
- pas
- collagen
- sas
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 102100027287 Serpin H1 Human genes 0.000 title claims description 22
- 108050008290 Serpin H1 Proteins 0.000 title claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 65
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 43
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 20
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 18
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 17
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 15
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 230000003367 anti-collagen effect Effects 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- 102100022108 Aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase Human genes 0.000 claims 2
- 101000644386 Brevibacillus parabrevis Phenylalanine racemase [ATP-hydrolyzing] Proteins 0.000 claims 2
- 101000906861 Chondromyces crocatus ATP-dependent tyrosine adenylase Proteins 0.000 claims 2
- 101000901030 Homo sapiens Aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase Proteins 0.000 claims 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims 2
- 235000008001 rakum palm Nutrition 0.000 claims 2
- 101710102786 ATP-dependent leucine adenylase Proteins 0.000 claims 1
- 102100022117 Abnormal spindle-like microcephaly-associated protein Human genes 0.000 claims 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- BIGRHVNFFJTHEB-UBHSHLNASA-N Asn-Trp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BIGRHVNFFJTHEB-UBHSHLNASA-N 0.000 claims 1
- 101000798402 Bacillus licheniformis Ornithine racemase Proteins 0.000 claims 1
- 101100311938 Dictyostelium discoideum phesA gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100423325 Dictyostelium discoideum phesB gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100501444 Escherichia phage P1 17 gene Proteins 0.000 claims 1
- XHWLNISLUFEWNS-CIUDSAMLSA-N Glu-Gln-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O XHWLNISLUFEWNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- 101150075567 Glyat gene Proteins 0.000 claims 1
- 101000900939 Homo sapiens Abnormal spindle-like microcephaly-associated protein Proteins 0.000 claims 1
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 claims 1
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 claims 1
- ZPCCSZFPOXBNDL-ZSTSFXQOSA-N [(4r,5s,6s,7r,9r,10r,11e,13e,16r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-5-[(2s,4r,5s,6s)-4,5-dihydroxy-4,6-dimethyloxan-2-yl]oxy-4-(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-10-[(2r,5s,6r)-5-(dimethylamino)-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-methoxy-9,16-dimethyl-2-oxo-7-(2-oxoe Chemical compound O([C@H]1/C=C/C=C/C[C@@H](C)OC(=O)C[C@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](CC=O)C[C@H]1C)O[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@](C)(O)C2)[C@@H](C)O1)N(C)C)O)OC)OC(C)=O)[C@H]1CC[C@H](N(C)C)[C@@H](C)O1 ZPCCSZFPOXBNDL-ZSTSFXQOSA-N 0.000 claims 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims 1
- 101150080777 pheS gene Proteins 0.000 claims 1
- DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N phosphonotyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 claims 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 claims 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 47
- 102000021124 collagen binding proteins Human genes 0.000 abstract description 41
- 108091011142 collagen binding proteins Proteins 0.000 abstract description 41
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 10
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 abstract 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 101710196256 Collagen adhesin Proteins 0.000 description 26
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 102000009268 Collagen Receptors Human genes 0.000 description 7
- 108010048623 Collagen Receptors Proteins 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108010042918 Integrin alpha5beta1 Proteins 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 101000632261 Homo sapiens Semaphorin-3A Proteins 0.000 description 4
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102100027974 Semaphorin-3A Human genes 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000689231 Aeromonas salmonicida S-layer protein Proteins 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 208000004575 Infectious Arthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 101000748795 Thermus thermophilus (strain ATCC 27634 / DSM 579 / HB8) Cytochrome c oxidase polypeptide I+III Proteins 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 201000001223 septic arthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008940 Alkaline Phosphatase assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101150069831 CBP gene Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- -1 FnBP A Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102100032965 Myomesin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000029586 bacterial cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- 238000011540 hip replacement Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/705—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a protein-A fusion
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
A találmány kollagénkötő tulajdonságokkal bíró fehérje vagy polipeptidelőállítására irányul, új rekombináns hibrid DNS-molekulákalkalmazásával. A leírás bemutatja a fehérje kifejezését a hibrid DNS-molekulákat tartalmazó mikroorganizmustörzsekkel. Az így kialakítottkollagénkötő fehérjék vagy polipeptidek gyógyszerként alkalmazhatókStaphylococcus-fertőzések megakadályozására, és diagnosztikumkéntalkalmazhatók Sta- phylococcus-fertőzések kimutatására. ŕ
Description
A leírás terjedelme 26 oldal (ezen belül 10 lap ábra)
HU 219 679 Β
A találmány tárgya: eljárás kollagénkötő fehérjék (CBP) vagy polipeptidek előállítására. Az említett fehérjét kódoló nukleotidszekvenciát hibrid DNS-molekulák, például plazmidok vagy fágok tartalmazzák. Az ilyen molekulákat tartalmazó mikroorganizmusok alkalmazha- 5 tók az említett fehéije előállítására. A fehérje szintetikusan is előállítható. A Staphylococcus aureus kollagénkötő fehérje (CBP) [amelyet Switalski és munkatársai (1989) kollagénreceptomak is neveznek] diagnosztikai célra és vakcina készítésére is felhasználható. 10
A találmány tárgya közelebbről az említett fehérje génmanipulációs technikával történő előállítása olyan plazmid alkalmazásával, amely az említett fehérjét kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz.
A találmány további tárgya az említett fehérje előál- 15 Irtása kémiai szintézissel.
A találmány további tárgyai nyilvánvalóak lesznek a későbbi leírásból.
Az alábbiakban ismertetjük a technika állását.
A WO-A1-85/05553 számú PCT szabadalmi közre- 20 bocsátási irat leír olyan bakteriális sejtfelületi fehérjéket, amelyek fibronektin-, fibrinogén-, kollagén- és/vagy lamininkötő képességgel rendelkeznek. Ezáltal kimutatták,
GCA
CGAGATATTT CATCAACGAA TGTTACAGAT TTAACTGTAT CACCGTCTAA GATAGAAGAT GGTGGTAAAA CGACAGTAAA AATGACGTTC GACGATAAAA ATGGAAAAAT ACAAAATGGT GACATGATTA AAGTGGCATG GCCGACAAGC GGTACAGTAA AGATAGAGGG TTATAGTAAA ACAGTACCAT TAACTGTTAA AGGTGAACAG GTGGGTCAAG CAGTTATTAC ACCAGACGGT GCAACAATTA CATTCAATGA TAAAGTAGAA AAATTAAGTG ATGTTTCGGG ATTTGCAGAA TTTGAAGTAC AAGGAAGAAA TTTAACGCAA ACAAATACTT TAGATGACAA AGTAGCTACG ATAACATCTG GGAATAAATC AACGAATGTT ATCGGTTGGA TAAAAGTGAA GCGGGAACCA GTAGTGTTTC TAATTAATAA AAGCGGGAAG ATATGCTACC AAGAAGATAC GACACATGTA CGATGGTTTT TAAATATTAA CAATGAAAAA AGTTATGTAT CGAAAGATAT TACTATAAAG GATCAGATTC AAGGTGGACA GCAGTTAGAT TTAAGCACAT TAAACATTAA TGTGACAGGT ACACATAGCA ATTATTATAG TGGACAAAGT GCAATTACTG ATTTTGAAAA AGCCTTTCCA GGTTCTAAAA TAACTGTTGA TAATACGAAG AACACAATTG
ATGTAACAAT TCCACAAGGC TATGGGTCAT ATAATAGTTT TTCAATTAAC TACAAAACCA AAATTACGAA TGAACAGCAA AAAGAGTTTG TTAATAATTC ACAAGCTTGG TATCAAGAGC ATGGTAAGGA AGAAGTGAAC GGGAAATCAT TTAATCATAC TGTGCACAAT ATTAATGCTA ATGCCGGTAT TGAAGGTACT GTAAAAGGTG AATTAAAAGT TTTAAAACAG GATAAAGATA CCAAGGCTCC TATAGCTAAT GTAAAATTTA AACTTTCTAA AAAAGATGGA TCAGTTGTAA AGGACAATCA AAAAGAAATT GAGATTATAA CAGATGCAAA CGGTATTGCT AATATTAAAG CGTTGCCTAG TGGAGACTAT ATTTTAAAAG AAATAGAGGC GCCACGACCG TATACATTTG ATAAGGATAA AGAATATCCG TTTACTATGA AAGATACAGA TAATCAGGGA TATTTTACGA CTATTGAAAA TGCAAAAGCG hogy különböző baktériumok kepesek kötődni nbronektinhez, fibrinogénhez, kollagénhez és/vagy lamininhez.
A kollagén S. aureushoz való kötéséről számos tanulmány számol be [Carret és munkatársai (1985); Holderbaum és munkatársai (1985); Speziale és munkatársai (1986); Switalski és munkatársai (1989)].
Switalski és munkatársai (1989) beszámolnak egy S. aureus felületi fehérje izolálásáról és jellemzéséről, amelyet ők kollagénreceptorként azonosítottak. Lizosztatint (a fehérjének a sejtfalból való kilépéséhez), majd ioncserélő kromatográfiát, ammónium-szulfátos kicsapást és gélszűrést alkalmazva a tisztításhoz lehetséges olyan fehérjét elkülöníteni, amelynek látszólagos molekulatömege (Mr) 135 kD. Azt is kimutatták, hogy a 135 kD-os fehérje ellen kialakuló antitestek gátolják a kollagén kötődését az S. aureus Cowan 1 sejtekhez.
Az alábbiakban leírjuk a találmányt.
Meglepő módon arra jöttünk rá, hogy elő lehet állítani egy olyan hibrid DNS-molekulát, amely kollagénkötő tulajdonságokkal bíró fehérjét vagy polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz. Amint a későbbiekben nyilvánvalóvá válik, az említett fehérjét kódoló génben az alábbi nukleotidszekvencia van jelen:
HU 219 679 Β
ATAGAAAAAA CAAAAGATGT TTCTGCTCAA AAGGTTTGGG AAGGCACTCA AAAAGTGAAA CCAACGATTT ATTTCAAGTT GTACAAACAA GATGACAATC AAAATACAAC ACCAGTAGAC AAAGCAGAGA TTAAAAAATT AGAAGATGGA ACGACAAAAG TGACATGGTC TAATCTTCCG GAAAATGACA AAAATGGCAA GGCTATTAAA TATTTAGTTA AAGAAGTAAA TGCTCAAGGT GAAGATACAA CACCAGAAGG ATATACTAAA AAAGAAAATG GTTTAGTGGT TACTAATACT GAAAAACCAA TCGAAACAAC ATCAATTAGT GGTGAAAAAG TATGGGACGA CAAAGACAAT CAAGATGGTA AGAGACCAGA AAAAGTCAGT GTGAATTTAT TGGCTAACGG GGAGAAAGTA AAAACGTTAG ACGTGACATC TGAAACAAAC TGGAAGTACG AATTTAAAGA CTTACCGAAG TATGATGAAG GAAAGAAAAT AGAATATACA GTGACCGAAG ATCACGTAAA AGACTACACA ACAGACATCA ACGGTACGAC AATAACGAAC AAGTATACAC CAGGAGAGAC ATCGGCAACA GTAACAAAAA ATTGGGATGA CAATAATAAC CAAGACGGAA AACGACCAAC TGAAATCAAA GTTGAGTTAT ATCAAGACGG AAAAGCAACA GGAAAAACGG CAACATTAAA TGAATCTAAT AACTGGACCC ATACGTGGAC AGGATTAGAT GAAAAAGCAA AAGGACAACA AGTAAAATAC ACAGTCGAGG AATTAACAAA GGTCAAAGGT TATACAACAC ATGTGGATAA CAATGATATG GGTAACTTGA TTGTGACGAA TAAATATACG CCAGAAACAA CATCAATTAG TGGTGAAAAA
GTATGGGACG ACAAAGACAA TCAAGATGGT AAGAGACCAG AAAAAGTCAG TGTGAATTTA TTGGCTGATG GAGAGAAAGT AAAAACGTTA GACGTGACAT CTGAAACAAA CTGGAAGTAC GAATTTAAAG ACTTACCGAA GTATGATGAA GGAAAGAAAA TAGAATATAC AGTGACCGAA GATCACGTAA AAGACTACAC AACAGACATC AACGGTACGA CAATAACGAA CAAGTATACA CCAGGAGAGA CATCGGCAAC AGTAACAAAA AATTGGGATG ACAATAATAA CCAAGACGGA AAACGACCAA CTGAAATCAA AGTTGAGTTA TATCAAGACG GAAAAGCAAC AGGAAAAACG GCAACATTAA ATGAATCTAA TAACTGGACC CATACGTGGA CAGGATTAGA TGAAAAAGCA AAAGGACAAC AAGTAAAATA CACAGTCGAG
GAATTAACAA AGGTCAAAGG TTATACAACA CATGTGGATA ACAATGATAT GGGCAACTTG ATTGTGACGA ATAAATATAC GCCAGAAACA ACATCAATTA GCGGTGAAAA AGTATGGGAC GACAAAGACA ATCAAGATGG TAAGAGACCA GAAAAAGTCA GTGTAAATTT ATTGGCTAAC GGAGAGAAAG TAAAAACGTT AGACGTGACA TCTGAAACAA ACTGGAAGTA CGAATTTAAA GACTTACCGA AGTATGATGA AGGAAAGAAA ATAGAATATA CAGTGACCGA AGATCACGTA AAAGACTACA CAACAGACAT CAACGGTACG ACAATAACGA ACAAGTATAC ACCAGGAGAG ACATCGGCAA CAGTAACAAA AAATTGGGAT GACAATAATA ACCAAGACGG AAAACGACCA ACTGAAATCA AAGTTGAGTT ATATCAAGAT GGAAAAGCAA CAGGAAAAAC GGCAATATTA AATGAATCTA ATAACTGGAC ACATACGTGG ACAGGATTAG ATGAAAAAGC AAAAGGACAA CAAGTAAAAT ACACAGTCGA TGAATTAACA AAAGTTAATG GCTATACAAC GCATGTGGAT AACAATGATA TGGGTAACTT GATTGTGACA AATAAATATA CGCCGAAAAA ACCGAATAAA CCAATCTATC CTGAAAAACC AAAAGACAAA ACACCACCAA CTAAACCTGA TCATTCTAAT AAAGTTAAAC CAACTCCCCC AGATAAGCCA TCAAAAGTGG ATAAGGATGA TCAACCTAAA GATAATAAAA CCAAACCTGA
HU 219 679 Β
AAATCCTCTA AAAGAATTAC CAAAAACTGG TATGAAGATT ATAACTTCAT GGATTACATG GGTATTTATA GGTATATTGG GACTGTATTT AATTTTAAGA AAAAGATTTA ACTCA, ahol ez a nukleotidszekvencia az alábbi fehéijét kódol- által a 2. ábrában bemutatott nukleotidok a szignálrend ja a fenti leolvasáshoz az 1. nukleotidnál kiindulva (ez- szer részei):
Alá
ArgAspIleSerSerThrAsnValThrAspLeuThrValSerProSerLysIleGluAsp
GlyGlyLysThrThrValLysMetThrPheAspAspLysAsnGlyLysIleGlnAsnGly
AspMetlleLysValAlaTrpProThrSerGlyThrValLysIleGluGlyTyrSerLys
ThrValProLeuThrValLysGlyGluGlnValGlyGlnAlaValIleThrProAspGly
AlaThrlleThrPheAsnAspLysValGluLysLeuSerAspValSerGlyPheAlaGlu
PheGluValGlnGlyArgAsnLeuThrGlnThrAsnThrLeuAspAspLysValAlaThr
IleThrSerGlyAsnLysSerThrAsnValIleGlyTrpIleLysValLysArgGluPro
ValValPheLeuIleAsnLysSerGlyLysIleCysTyrGlnGluAspThrThrHisVal
ArgTrpPheLeuAsnlleAsnAsnGluLysSerTyrValSerLysAspIleThrlleLys
AspGlnlleGlnGlyGlyGlnGlnLeuAspLeuSerThrLeuAsnlleAsnValThrGly
ThrHisSerAsnTyrTyrSerGlyGlnSerAlalleThrAspPheGluLysAlaPhePro
GlySerLysIleThrValAspAsnThrLysAsnThrlleAspValThrlleProGlnGly
TyrGlySerTyrAsnSerPheSerlleAsnTyrLysThrLysIleThrAsnGluGlnGln
LysGluPheValAsnAsnSerGlnAlaTrpTyrGlnGlúHisGlyLysGluGluValAsn
GlyLysSerPheAsnHisThrValHisAsnlleAsnAlaAsnAlaGlylleGluGlyThr
ValLysGlyGluLeuLysValLeuLysGlnAspLysAspThrLysAlaProIleAlaAsn
ValLysPheLysLeuSerLysLysAspGlySerValValLysAspAsnGlnLysGluIle
GluIlelleThrAspAlaAanGlylleAlaAsnlleLysAlaLeuProSerGlyAspTyr
IleLeuLysGluIleGluAlaProArgProTyrThrPheAspLysAspI.ysGluTyrPro
PheThrMetLysAapThrAspAsnGlnGlyTyrPheThrThrlleGluAsnAlaLyaAla
IleGluLysThrLyaAspValSerAlaGlnLysValTrpGluGlyThrGlnLysValLys
ProThrlleTyrPheLysLeuTyrLysGlnAspAspAsnGlnAsnThrThrProValAsp
LysAlaGluIleLysLysLeuGluAspGlyThrThrLysValThrTrpSerAsnLeuPro
GluAsnAspLysAsnGlyLysAlalleLysTyrLeuValLysGluValAsnAlaGlnGly
GluAspThrThrProGluGlyTyrThrLysLysGluAsnGlyLeuValValThrAsnThr
GluLysProIleGluThrThrSerlleSerGlyGluLysValTrpAspAspLysAspAsn
GlnAspGlyLysArgProGluLysValSerValAsnLeuLeuAlaAsnGlyGluLysVal
LysThrLeuAspValThrSerGluThrAsnTrpLysTyrGluPheLysAspLeuProLys
TyrAspGluGlyLysLysIleGluTyrThrValThrGluAspHisValLysAapTyrThr
ThrAspIleAsnGlyThrThrlleThxAanLysTyrThrProGlyGluThrSerAlaThr
ValThxLysAsnTxpAspAspAsnAsnAsnGlnAspGlyLysArgPxoThxGluIleLys
HU 219 679 Β
ValGluLeuTyrGlnAspGlyLysAlaThrGlyLysThrAlaThrLeuAsnGluSerAsn
AsnTrpThrHisThrTrpThrGlyLeuAspGluLysAlaLysGlyGlnGlnValLysTyr
ThrValGluGluLeuThrLysValLysGlyTyrThrThrHisValAspAsnAsnAspMet
GlyAsnLeuIleValThrAsnLysTyrThrProGluThrThrSerlleSerGlyGluLys
ValTrpAspAspLysAspAsnGlnAspGlyLysArgProGluLysValSerValAsnLeu
LeuAlaAspGlyGluLysValLysThrLeuAspValThrSerGluThrAsnTrpLysTyr
GluPheLysAspLeuProLysTyrAspGluGlyLysLysIleGluTyrThrValThrGlu
AspHisValLysAspTyrThrThrAspIleAsnGlyThrThrXleThrAsnLysTyrThr
ProGlyGluThrSerAlaThrValThrLysAsnTrpAspAspAsnAsnAsnGlnAspGly
LysArgProThrGluIleLysValGluLeuTyrGlnAspGlyLysAlaThrGlyLysThr
AlaThrLeuAsnGluSerAsnAsnTrpThrHisThrTrpThrGlyLeuAspGluLysAla
LysGlyGlnGlnValLysTyrThrValGluGluLeuThrLysValLysGlyTyrThrThr
HisValAspAsnAsnAspMetGlyAsnLeuIleValThrAsnLysTyrThxProGluThr
ThrSerlleSerGlyGluLysValTxpAspAspLysAspAsnGlnAspGlyLysAxgPro
GluLysValSerValAsnLeuLeuAlaAsnGlyGluLysValLysThrLeuAspValThr
SerGluThrAsnTrpLysTyrGluPheLysAspLeuProLysTyrAspGluGlyLysLys
IleGluTyrThrValThrGluAspHisValLysAspTyrThrThrAspIleAsnGlyThr
ThxIleThxAsnLysTyrThrProGlyGluThrSerAlaThrValThxLysAsnTrpAsp
AspAsnAsnAsnGlnAspGlyLysArgProThxGluIleLysValGluLeuTyrGlnAsp
GlyLysAlaThrGlyLysThrAlalleLeuAsnGluSerAsnAsnTrpThrHisThrTrp
ThrGlyLeuAspGluLysAlaLysGlyGlnGlnValLysTyrThrValAspGluLeuThr
Ly s Va lAsnGlyTyrThrThxHi s Va lAs pAsnAsnAspMe tG lyAs nLeu 11 eValThr
AsnLysTyrThrProLysLysProAsnLysProIleTyrProGluLysProLysAspLys
ThrProProThrLysProAspHisSerAsnLysValLysProThrPxoProAspLysPro
SerLysValAspLysAspAspGlnProLysAspAsnLysThrLysProGluAsnProLeu
LysGluLeuProLysThrGlyMetLysIlelleThrSerTrpIleThrTrpValPhelle
GlylleLeuGlyLeuTyrLeulleLeuArgLysArgPheAsnSer t
| A fenti egybetűs aminosavszekvenciában az alábbi | M | Met, | Metionin | |||
| rövidítéseket alkalmazzuk: | F | Phe, | Fenil-alanin | |||
| A | Alá, | Alanin; | P | Pro, | Prolin | |
| R | Arg, | Arginin; | S | Ser, | Szerin | |
| N | Asn, | Aszparagin; | 50 | T | Thr, | Treonin |
| D | Asp, | Aszparaginsav; | W | Trp, | Triptofán | |
| C | Cys, | Cisztein; | Y | Tyr, | Tirozin | |
| C | Cys, | Cisztin; | V | Val, | Valin | |
| G | Gly, | Glicin; | A találmány szerinti eljárásban olyan mikroorganiz- | |||
| E | Glu, | Glutaminsav | 55 | musok alkalmazhatók, amelyek legalább egy fentiek sze- | ||
| Q | Gin, | Glutamin | rinti hibrid DNS-molekulát tartalmaznak. A pSAC104 | |||
| H | His, | Hiszti din | plazmid E. coli TG1 törzsben deponálva van a DSM-nél | |||
| I | Ile, | Izoleucin | (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen), ahol a | |||
| L | Leu, | Leucin | DSM 6199 deponálási számot kapta. A találmány szerin- | |||
| K | Lys, | Lysin | 60 | ti klónozott gén | - a natív, S. aureus sejtekből kibocsátott |
HU 219 679 Β és tisztított CBP-vel összehasonlítva - javított CBP-tulajdonságokkal bíró CBP-t kódol. A gén egy S. aureus törzsből származik és egy klónozott génbe van beiktatva.
A találmány segítségével azonosítható a CBP-t kódoló gén (amelyet cbp-génnek nevezünk) nukleotidszekvenciája. A levezetett aminosavszekvencia olyan molekulára jellemző, amely számos elkülönült, a Staphylococcus eredetű sejtfelületi fehérjékre emlékeztető jellemvonással bír.
A találmány szerinti eljárás keretében a rekombináns CBP előállítására és tisztítására a molekula megtartja a kollagénkötő tulajdonságait, így ez a rekombináns CBP hasonlít a natív, ki nem szabadult S. aureus CBP-re.
A találmány foglalkozik továbbá a cbp-gén alkalmazásával diagnosztikai célokra. Olyan génvizsgáló mintákat alkalmazunk, amelyek fajlagosan felismerik a cbpgén jelenlétét klinikai S. aureus-izolátumokban. Példaként megemlítjük, hogy a fertőző ízületi gyulladásban szenvedő betegekből izolált S. aureus törzsek felületén levő CBP jelenléte igazolható a cbp-gén jelenlétével mindegyik vizsgált törzsben.
Az aminosavszekvenciához megfelelő hordozófehérjék kapcsolhatók, például az A-fehérje IgG-kötő területei.
A találmányt a következőkben részletesebben is leírjuk a példák segítségével, de az oltalmi kör nem korlátozódik a példákra.
Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.
1. ábra: (A) a p 16-ban és a cC0LR6A-ban levő beiktatás egyszerűsített restrikciós térképe, amely bemutatja a homológia területét; az MCS jelölés a többszörös klónozási hely rövidítése. (B) A különböző területeket kódoló cbp-gén sematikus ábrázolása. S jelenti a javasolt szignálszekvenciát, ezt követik az A terület és az ismétlődő B területek; W a sejtfalat átívelő terület; és M a membrán-„horgonyozó” terület.
2. ábra. A p 16-ban és cC0LR6A-ban levő beiktatásból való összeállított szekvencia nukleotidszekvenciája és aminosavszekvenciája. A különböző területeket nyíllal jelöljük, és jelöljük azokat a szekvenciákat, amelyek felismerik a riboszomális kötőhelyeket (RBS). A p 16-ban levő beiktatás 5’-végét és 3’-végét, valamint a cC0LR6A-ban levő beiktatás 5’-végét jelezzük.
3. ábra. S. aureus klinikai izolátumainak Westemfolt-elemzése antikollagénadhezin-antitestekkel vizsgálva. A törzsek lizosztatinlizátumát gélelektroforézissel elkülönítjük, és elektrofoltképzést végzünk Immobilon-P membránon. Jelölések: a vonal: Cowan; b vonal: #7; c vonal: #12; d vonal: #13; e vonal: #14; f vonal: #15; g vonal: #16; h vonal: Phillips; és i vonal: #9.
4. ábra. A S. aureus kollagénadhezin pozitív és negatív törzseinek időfüggő rögződése kollagénhez (A panel) és porchoz (D panel). Ennek a rögződésnek a gátlása antiadhezinantitestekkel (B és D panelek kollagénnel, illetve porccal). Két kollagénadhezin-pozitív törzs - S. aureus Phillips (Δ) és #14 (O) - és egy adhezinnegatív törzs - 9 (·) 125I-vel jelzett sejtjeit inkubáljuk kollagénnel bevont üregekben vagy porcdarabkákkal meghatározott időtartamon át. A Phillips kollagénadhezin pozitív S. aureus törzs porchoz rögződésének elektronmikroszkópos képe (C panel) és ennek a rögződésnek a gátlása antiadhezinantitestekkel (F panel).
5. ábra. 125I-vei jelzett kollagén kötődése vagy adhézió porchoz kollagénadhezinnel (O) vagy az S. aureus fibronektinreceptor rekombináns formájával (·, ZZFR) burkolt polisztirolgyöngyökkel. A panel: a ,25I-kollagén kötődése a fehérjével burkolt gyöngyökhöz az idő függvényében. B panel: a 125I-kollagén kötődésének gátlása antitestekkel. A 125I-jelzett gyöngyök rögződése porchoz az idő függvényében (C panel), és a 125I-vel jelzett gyöngyök porchoz rögződésének gátlása antitestekkel (D panel). Ebben a kísérletben 1 pg adhezinfehérjét kötünk 108 polisztirolgyöngyhöz. Kontroligyöngyöket burkolunk be fibronektinreceptorral azonos moláris koncentrációban. A gyöngyökön levő el nem reagált helyeket szarvasmarha-szérumalbuminnal telítjük. A kollagénadhezinnel (E panel) vagy fibronektinreceptor-fehérjével (F panel) burkolt porchoz rögzített gyöngyök elektronmikroszkópos képe.
6. ábra. Az S. aureus kollagénadhezinen belül a kollagénkötő tartomány lokalizálásához alkalmazott kifejezőkonstrukciók.
1. példa
A cbp-gén klónozása és azonosítása E. coliban
Abból a célból, hogy izoláljuk az S. aureus CBP-t kódoló gént, két kereskedelmi forgalomban beszerezhető (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) S. aureus törzsét (FDA 574 és FDA 485 törzsek) megvizsgálunk, vajon ezek kötnek-e meg radioaktívan jelzett kollagént. Ezt a vizsgálatot Switalski és munkatársai szerint (1989) végezzük. Az 574 törzsről úgy találjuk, hogy kötődik kollagénhez, ezért ugyanennek a törzsnek egy génkönyvtárát (amelyet a fent nevezett cégtől szerzünk be # XL 15016 katalógusszámon) átvizsgáljuk CBP-aktivitásra. A szállító cég munkamenetét alkalmazva [ezen a munkameneten kívül általában alkalmazzuk a molekuláris genetika megfelelő munkameneteit, amelyek megtalálhatók az alábbi szakkönyvekben. „Current Protocols in Molecular Biology” 1. és 2. kötet (szerkesztők: Ausubel F. M., Brent R„ Kingston R. E., Moore D. D., Seidman I. G., Smith J. A., Struhl U., kiadó: Greene, Wiley Interscience); és „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (szerkesztők: Maniatis T„ Fritsch E. F. és Sambrook J., kiadó: Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1982] a rekombináns lambda gt 11 fágokat E. coli Y1090 törzsön szélesztjük. 10 000-100 000 telepképző egységét (pfu) tartalmazó 90 mm-es lemezeket alkalmazunk. A tarfoltokat az egyes lemezekről átvisszük replikamódszerrel nitrocellulóz (NC)-szűrőkre (Schleicher és Schuell). Abból a célból, hogy kimutassuk a CBP-aktivitást kifejező tarfoltokat, két különböző eljárást alkalmazunk. Az első eljárásban a szűrőket előinkubáljuk 1 órán át 37 °C hőmérsékleten (vagy egy éjszakán át szobahőmérsékleten) olyan oldatban, amely 150 mmol/1 NaCl-ot, 10 mmol/1 triszt (pH 7,5), 1,36% zsírtalanított tejport tartalmaz. Az inkubálás után a szűrőket átvisszük a fentihez hasonló oldatba, amely azonban ki van egészítve
HU 219 679 Β 125I-vel jelzett szarvasmarha II. típusú kollagénnel, és a szűrőket egy éjszakán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A következő napon a szűrőket 3x 10 percig mossuk 37 °C hőmérsékleten olyan oldatban, amely 150 mmol/1 NaCl-ot, 0,05% Tween-20-at tartalmaz, szobahőmérsékleten megszárítjuk, és autoradiográfiának vetjük alá több napon át, hogy kimutassuk a kollagénkötő aktivitást kifejező kiónokat.
Egy alternatív átvizsgálást eljárásban a natív kollagénreceptort felismerő poliklonális nyúl-IgG-ből való tisztított fragmentumokat alkalmazunk a CBP-aktivitást kifejező kiónok kimutatására. Az ilyen típusú Fab-fragmentum-készítményt korábban Switalski és munkatársai (1989) alkalmazták a kollagénreceptor azonosítására és jellemzésére. Ebben az alternatív eljárásban a replikamódszerrel szélesztett NC-szűrőket 45 percen át 37 °C hőmérsékleten előinkubáljuk olyan oldatban, amely 150 mmol/1 NaCl-ot, 10 mmol/1 íriszt (pH 7,5), és 3% (tömeg/térfogat) szarvasmarha-szérumalbumint (BSA) tartalmaz; az előinkubálás célja, hogy blokkoljuk a nem fajlagos kötéseket. A blokkolás után a szűrőket olyan oldatba (PBS-T) visszük át, amely 0,05% végső koncentrációban Tween-20-szal kiegészített, foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat; ez tartalmaz még 1:400 hígításban nyúl-antikollagénreceptorFab-fragmentumokat is. 2 órán át szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a szűrőket 3x10 percen át mossuk PBS-T-ben, ezután hozzáadunk szekunder kecskeantinyúl-IgG alkalikus foszfatázkonjugátumot (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok;katalógusszám: #170-618) 1:3000arányban hígítva PBS-T-ben, hogy kimutassuk a kötött primer Fab-fragmentumokat. 1 órán át szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a szűrőke t mossuk 3x10 percen át PBS-T-ben. A kötött, jelzett szekunder antitesteket színreakcióval mutatjuk ki a gyártó útmutatásai szerint (Bio-Rad: „Útmutatás a BCIP/NBT színkifejlesztő oldat előállításához az immunfolt alkalikusfoszfatáz-vizsgálati kísérletben való felhasználáshoz”).
A fentebb leírt eljárás alkalmazásával számos CBPaktivitást kifejező rekombináns lambda fágot azonosíthatunk és izolálhatunk.
Ezek közül a lambda fágok közül kettőt választunk ki további tanulmányozásra. Ezeket lambda coll 1-nek, illetve lambda cCOLR6A-nak nevezzük.
A lambda coll 1 alklónozása: Tisztított lambda coll 1 DNS-t hasítunk EcoRI-gyel, és a tapadós végeket betöltjük Klenow-fragmentumok és a dNTP-k alkalmazásával. Az S. aureus kromoszómákból eredő, tompa végű DNS-fragmentumokat Smal-gyel hasított pUC 18-ba (Pharmacia-LKB Biotechnology, Uppsala, Svédország) ligáljuk. Transzformálás után fagyasztott, kompetens E. coli TG1 sejtekben a rekombináns kiónokat átvizsgáljuk CBP kifejezésére. Úgy találjuk, hogy az összes klón, amely CBP-t fejez ki, egy olyan rekombináns plazmidban található, amelynek egy mintegy 4 kb-s beiktatása van. Az egyik ilyen kiónt, amelyet p 16-nak nevezünk, választjuk ki további tanulmányokhoz; az ebben a kiónban található beiktatásnak a vázlatos térképét az 1A. ábrán mutatjuk be.
Hasonló módon, mint a lambda coll 1-nél, két másik lambda-klónt alakítunk ki a genomikus könyvtár átvizsgálásával. Tiszta pozitív kiónok nagyléptékű tenyészeteit állítjuk elő és a DNS-t izoláljuk. A kiónok EcoRIgyel végzett emésztése két különböző méretű beiktatást eredményez. Az 1A klón egy 3,2 kb-s beiktatással bír, míg a 3B klón egy 4,5 kb-s beiktatással bír. A kettő közül a nagyobbat alkalmazzuk a további jellemzéshez. A 3B XGTl 1 kiónból tisztított beiktatott DNS-t (1,5 kb) ligáljuk az EcoRI-gyel emésztett pUC 18-hoz, és ezt transzformáljuk E. coli TB-1 sejtekbe, így alakítva ki a cCOLR6A alklónt. Ezt M13mpl8/JM101-be alklónozzuk szekvenciaelemzés céljából.
A CsCl2-on tisztított plazmid-DNS-t a cCOLR6A alklónból azután feltérképezzük egy sor különböző restrikciós endonukleázzal. A Pstl-gyel végzett emésztés két fragmentumot alakít ki, 2,9 kb és 1,7 kb mérettel. Mindkét fragmentum szekvenciaelemzését elvégezzük. A 2,9 kb-s EcoRI-PstI fragmentum részben átfedi a XCOLLl alklónt. A cCOLR6A alklón tartalmazza mindhárom ismétlődést, a sejtfaltartományt, valamint a transzmembrántartományt. Az ezen kiónban levő beiktatás vázlatos térképét az 1 A. ábrában mutatjuk be.
Az összehasonlító restrikciós enzimes emésztések a hibridizációs kísérletekkel együtt azt mutatják, hogy a p 16 és a cCOLR6A részlegesen átfedik egymást (1A. ábra).
2. példa
DNS- és aminosavszekvencia-adatok
Azért, hogy meghatározzuk a cbp-gén nukleotidszekvenciáját, a „Sequenase kit” (United States Biochemical Corporation, Amerikai Egyesült Államok) szekvenciaelemző készletben található munkamenetet követjük, hogy elemezzük a p 16-ban és cCOLR6A-ban levő beiktatásokat. A beiktatásokból való nukleotidszekvenciák összehasonlításával igazoljuk, hogy a két beiktatás részben homológ (1A. és 2. ábra). Ezeket a szekvenciákat egymással összeillesztve és megkeresve a nyitott leolvasókereteket arra a következtetésre jutunk, hogy egy 3555 méretű nyitott leolvasókeretet alkalmazunk, amely 1185 aminosav méretű következtetett aminosavszekvenciának felel meg. (2. ábra).
A következtetett aminosavszekvencián belül számos ismétlődő és homológ terület található. Ezeket vázlatosan az 1B. ábrán mutatjuk be. Az N-terminális végből indulva egy olyan szerkezetet tárunk fel, amely egy szignálszekvenciára emlékeztet. Ez egyezésben van azzal, amely várható, mivel a CBP az S. aureusban egy sejtfelületi fehérje. Ezen területet követően egy „A”nak nevezett területet találunk, amelyet pedig 187 aminosavas ismétlődő kiterjedések követnek, amelyeket B 1-nek, B 2-nek és B 3-nak nevezünk. Közvetlenül ezen területeket követve található egy W-nek nevezett terület, amely egy sok prolingyököt tartalmazó ismétlődő hidrofil szerkezetből áll. Ez a terület egy olyan hasonló területre emlékeztet, amely a Staphylococcus eredetű A-fehérjében (Guss és munkatársai, 1984) és FnBP Aban (Signás és munkatársai, 1989), valamint a Staphylococcus eredetű G-fehérjében (Guss és munkatársai,
HU 219 679 Β
1986) és M-fehéqében (Hollingshead és munkatársai, 1986) található. Erről a területről úgy véljük, hogy közvetíti a fehérje kötődését a sejtfalhoz. A C-terminálishoz legközelebbi aminosavszekvencia hidrofil gyökök hosszú kiterjedéséből áll, amelyet néhány töltött aminosav követ. Ez az M-nek nevezett terület szerkezetileg hasonló az A-fehérje, FnBP A, G-fehérje és M-fehérje C-terminális végeihez.
A következtetett CBP következtetett molekulatömege mintegy 133 kD (beleértve az S vélt szignálszekvenciát), amely nagyon közel áll ahhoz a 135 kD-os molekulatömeghez, amelyet a natív kibocsátott receptorról írtak le (Switalski és munkatársai, 1989).
Abból a célból, hogy megalkossunk egy olyan plazmidot, amely a teljes cbp-gént kódolja, S. aureus FDA 574 kromoszomális DNS-t tisztítunk, és kétszeresen hasítjuk HindlII-mal és Pstl-gyel. A Southern transzfer kísérletek útmutatásai szerint, amelyhez 32Pvel jelzett oligonukleotidvizsgáló mintát (próbát) alkalmaznak (5’-ATTAAAGCGTTGCCTAGTGG-3’), ismeretes, hogy a hasítás ezekkel az enzimekkel egy mintegy 3,2 kb-s fragmentumot alakít ki, amely a cbp-gén 3’-végének felel meg. Az ezen enzimekkel végzett hasítás után a kromoszomális DNS-t elektroforézissel elkülönítjük agarózgélen. Egy gélszeletet, amely durván megfelel a helyes méretnek, kihasítunk és a DNS-fragmentumokat eluáljuk és tisztítjuk. A tisztított fragmentumokat előzőleg HindlII-mal és Pstl-gyel kétszeresen hasított pUC 18-ba ligáljuk. Ligálás után transzformálás következik E. coli TGl-be; az így kialakult rekombináns kiónokat átvizsgáljuk a helyes fragmentum kinyerése érdekében, ehhez telephibridizálást alkalmazva azonos vizsgálómintával. A további tanulmányokhoz kiválasztunk egy pozitív kiónt, amely hibridizál a radioaktív vizsgálómintával. Ezt az E. coli pSAC 100-nak nevezett kiónt HindlII-mal elhasítjuk, és egy mintegy 1,8 kb méretű tisztított HindlII fragmentumot, amely a p 16-ból származik (és amely a cbp-gén 5’-végét kódolja, lásd az 1 A. ábrát) ligálunk a pSAC 100-ba. A transzformálás után E. coli TGl-be rekombináns kiónokat azonosítunk és izolálunk, amelyek rendelkeznek egy mintegy 1,8 kb méretű fragmentummal. A további tanulmányokhoz kiválasztunk egy kiónt, amelyet E. coli pSAC 104-nek nevezünk. Az ebben a kiónban található beiktatás képviseli a teljes cbp-gént. Ez a klón akkor is pozitív, amikor CBP kifejezésére vizsgáljuk (lásd a 3. példát). Ezt a kiónt elhelyeztük a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) törzsgyűjteményben, ahol ez a DSM 6199 deponálási számot kapta.
3. példa
A CBP kifejezése E. coliban
A 125I-kollagén-kötési vizsgálatot alkalmazva, amelyet Switalski és munkatársai írtak le (1989), a teljes cbp-gént vagy részeit tartalmazó E. coli-klónokat vizsgálunk át, azt vizsgálva, vajon az ezen kiónokból (amelyek CBP-aktivitásúak) való lizátumok gátolják-e a 125I-kollagén kötődését az S. aureus Cowan I sejtekhez. A megfelelő E. coli-klónt 50 mikrogramm/ml végső koncentrációban ampicillinnel kiegészített Luria tápközegben növesztjük egy éjszakán át. A baktériumokat lecentrifúgáljuk és a felülúszót elöntjük (ezt azért tesszük, mivel a CBP-aktivitás legnagyobb része a sejten belül található). A bakteriális üledéket újraszuszpendáljuk az eredeti térfogat 1/10-ének megfelelő oldatban, amely 50 mmol/1 triszt (pH 8), 50 mmol/1 EDTA-t és 1 mg/ml lizozimot tartalmaz, majd inkubálunk 37 °C hőmérsékleten, amíg bekövetkezik a teljes lízis. A lizált baktériumokat centrifugáljuk, hogy a sejttörmeléket eltávolítsuk, és a felülúszót megőrizzük. Megmérjük ennek a felülúszónak (tipikus térfogatként 100-200 mikrolitert alkalmazva) azon képességét, hogy gátolja a 125I-kollagén kötődését Cowan I sejtekhez. Kontrollként azonos módon kezelt E. coli TG1 pUC 18 sejteket alkalmazunk. A CBP-aktivitás jelenlétét úgy határozhatjuk meg, mint szignifikáns (bizonyos esetekben akár 66%-ig is teqedő) csökkenést a radioaktív kollagén kötődésében a Cowan 1 sejtekhez, amikor a mérést gamma-számlálóban végezzük. Három ilyen módon mért klón (E. coli TG1 p 16; E. coli TG1 pSAC 104; és E. coli TG1 pCA 1) nagy gátlóaktivitást mutat az E. coli TG1 pUC 18 kontrollal összehasonlítva, amely nem mutat jelentős gátlóaktivitást. Ez az eredmény ellentétben van azzal az észleléssel, amelyről Switalski és munkatársai számolnak be (1989); ők azt találták, hogy a tisztított vagy részben tisztított natív kollagénreceptor nem gátolja a kollagén kötődését S. aureus Cowan 1 sejtekhez. Ebből azt a következtetést lehet levonni, hogy a kifejezett rekombináns CBP többet őriz meg eredeti tulajdonságaiból, mint a staphylococcusokból kibocsátott fehérje.
Bár a CBP-aktivitás kimutatható a rekombináns E. coli lizátumban, a CBP-t nem lehet affinitással tisztítani immobilizált kollagénen vagy zselatinon. Ugyanakkor a „Western transzfer” kísérletekben a fentebb említett rekombináns klónokból szárazó lizátumokkal, az 1. példában leírt Fab-lfagmentumokat alkalmazva, lehetséges olyan csíkokat kimutatni, amelyek nagy molekulatömegű fragmentumoknak felelnek meg. Ezek olyan méretűek, amelyek a következtetett aminosavszekvenciából kalkulált várt méreteknek megfelelnek.
4. példa
Olyan CBP fúziós fehérje kifejezése, amely tisztítás után megőrzi kollagénkötő tulajdonságait
Mivel a rekombináns úton előállított CBP affinitásos tisztítása - immobilizált kollagént alkalmazva - sikertelen, más megközelítést alkalmazunk. Ez a megközelítés az, hogy a cbp-gént vagy a génnek egy részét fuzionáljuk egy másik génhez, amely egy úgynevezett „affinitásfarkat” kódol (Methods in Enzimology, 185. rész). A vizsgálandó affinitásfarok az A-fehérjéből származó rész, amely az IgG-kötő tartományokat kódolja. Ennélfogva egy olyan vektort alkalmazunk, amely kódolja az A-fehérjéből való fentebb említett tartományokat. Ezt a vektort pNSEQ 1-nek nevezzük; ez az IgGkötő tartományokon (E, D, A, B és C) kívül két multiklónozóhelyet (MCS) is tartalmaz, amelyek szegélyezik az IgG-kötő tartományokat. Ez lehetővé teszi, hogy olyan restrikciós enzimet válasszunk, amelynek van felismerőhelye mindkét MCS-ben; ez hasítás után
HU 219 679 Β olyan DNS-fragmentum kibocsátását eredményezi (feltéve, hogy a nevezett restrikciós hely nincs jelen az IgG-kötó tartományokban), amely az IgG-kötó tartományokat kódolja; ezt azután tisztíthatjuk és beiktathatjuk más vektorokba. Mivel a cbp-gén nukleotidszekvenciáját már meghatározták, megismerhető, hogy a p 16 kódolja a cbp-gén N-terminális részét; ennek megfelelően úgy döntünk, hogy el kell végezni egy C-terminális fúziót. Ezt a következő úton valósítjuk meg: a p 16-ot elhasítjuk EcoRI-gyel (lásd az 1A. ábrát), és egy, a pNSEQl-ből származó, az A-fehérje IgG-kötő részét kódoló tisztított EcoRI DNS-fragmentumot ligálunk a plazmidba. Transzformálás után olyan rekombináns kiónokat izolálunk és tisztítunk, amelyek a beiktatott A-fehérje-fragmentumot helyes orientációban tartalmazzák. Ezen kiónok egyikét, amelyet E. coli pCA 1nek nevezünk, választjuk ki a további tanulmányokhoz. Úgy találjuk, hogy ezen klón lizátuma - azonkívül, hogy gátolja a kollagénkötődést a 3. példa szerint mérve - A-fehérje-IgG-kötő aktivitást is mutat. A következő lépés az, hogy megpróbáljuk a feltételezett fúziós fehétje affinitásos tisztítását IgG-Sepharose FF-en (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Svédország). Az azonos gyártó cég A-fehéije-kézikönyvét alkalmazva lehetséges a fúziós fehérje affinitásos tisztítása a sejtlizátumból. A tisztított fehérje elemzéséhez SDS-PAGE-t (nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis) alkalmazva kimutatható, hogy számos, különböző molekulatömegeknek megfelelő csík jelenik meg, amikor a gélt Coomassie Brilliant kék festékkel megfestjük. A nagyobb csík azonban a teljes hosszúságú fúziós fehérje molekulatömegének felel meg, amint ezt a következtetett aminosavszekvenciából kiszámítjuk. Amikor CBP-aktivitásra méljük, ez a tisztított fehérjekészítmény képes gátolni a radioaktív kollagén kötését az S. aureus Cowan 1 sejtekhez éppen olyan hatékonysággal, mint a megfelelő sejtlizátum. Ez javulást jelent azokhoz az eredményekhez képest, amelyet Switalski és munkatársai mutattak be (1989). A következtetés az, hogy a jelen találmány gyakorlati alkalmazásával lehetséges olyan S. aureus CBP-t mind előállítani, mind tisztítani, amely jobban megőrzi biológiai tulajdonságait, mint a korábban leírt eljárások esetében.
5. példa
A CBP-gén alkalmazása dianosztikai egységként Megalkotunk két oligonukleotidot (JP-1,5’-AGTGGT-TAC-TAA-TAC-TG-3’; és JP-2,5’-CAG-GATAGA-TIG-GTT-TA-3’), amelyek komplementerek a CBP Bl, B2 és B3 ismétlődéseket szegélyező területeivel. 6 különböző Staphylococcus aureus törzsből, amelyekről ismeretes, hogy megkötik a 125I-kollagént (1. táblázat) genomikus DNS-t izolálunk úgy, ahogyan ezt korábban Lindberg leírta. Polimeráz-láncreakciót (PCR) végzünk „Cetus/Perkin-Elmer DNA Thermocycler” berendezésben. A reakciókeverék (100 μΐ) 1-1 mmol/1 prímért, 200-200 mmol/1 dNTP-t, 1 mmol/1 trisz-HCl-ot (pH 8,3), 5 mmol/1 KCl-ot, 15 mmol/1 MgCl2-ot, 0,001% zselatint, 3 g templát-DNS-t és 2,5 egység AmpliTaq DNS-polimerázt tartalmaz. A reakciókeveréket felülrétegezzük 100 μΐ ásványolajjal és 30 cikluson át sokszorozzuk (amplifikáljuk); egy ciklus a következőkből áll: 2 perc denaturálás 94 °C hőmérsékleten, 2 perces összeforrasztási periódus 55 °C hőmérsékleten, és 3 perc kiterjesztési periódus 72 °C hőmérsékleten. Sokszorozás után 15 μΐ PCR-terméket elemzünk 1%-os agarózgélen (SeaKem GTG, FMC Inc., Rockland, Maine).
A különböző S. aureus-izolátumokból való genomikus DNS PCR-elemzése két határozottan eltérő méretű terméket mutat. Az FDA 574, Cowan és #13 egy 1677 bp-s géntermékkel bírnak, míg a Phillips, #7 és #14391 1118 bp-s géntermékkel bírnak. Az S. aureus Newman, amelyről ismert, hogy nem kollagénkötő, nem rendelkezik kimutatható PCR-termékkel. Itt közvetlen korreláció van az ismétlődés mérete és a különböző vizsgált S. aureus törzsekből való tisztított natív kollagénreceptor becsült molekulatömege között. További szekvenciaelemzés alapján úgy tűnik, hagy egy 1677 bp méretű PCR-termék 3 ismétlődő egységnek felel meg, amelyek mindegyike 560 bp hosszúságú. Egy 1118 bp hosszúságú PCR-termék ennek megfelelően 2 egységnek felel meg, melyek mindegyike 560 bp hosszúságú. Ezek az eredmények nagymértékű korrelációban vannak a tisztított natív kollagénreceptorok 135 kD-os, illetve 115 kD-os becsült molekulatömegével.
További PCR-elemzést végzünk az alábbi primereket alkalmazva: JP-3(5’-ATA-TGA-ATT-CGA-GTATAA-GGA-GGG-GTT-3’) és JP-4(5’-ATT-CTGCAG-AGA-ACT-AAG-AAT-AGC-CTT-3’). Ezek a primerek szegélyezik az ép cbp-gént az 5’-, illetve 3’végeknél. Hasonló PCR-paramétereket alkalmazva az ép gént sikeresen izolálhatjuk S. aureus genomikus DNS-ből. Ismét két erősen eltérő méretű génterméket észlelünk. Érdekes módon azok az S. aureus-izolátumok, amelyeknek 3 ismétlődésük van, olyan cbp-génnel bírnak, amelyek 3,5 kb-nek felelnek meg. Azoknak az S. aureus törzseknek, amelyek csak két ismétlődéssel bírnak, 3,0 kb-s cbp-génjük van. Ez a munka közvetlen bizonyítékot nyújt arra, hogy a különböző S. aureus-izolátumokból való cbp-gének mérete közvetlenül arányos az ismétlődő egységek számával.
Az ép cbp-gén kifejezése. A 3,5 kb-s PCR-terméket, amely magában foglalja az ép gént (JP-3, JP-4 primerek), pKK223-3 prokarióta-kifejezővektorba (Pharmacia-LKB) klónozzuk. Ez a vektor tartalmaz egy IPTG-vel indukálható tac promotort, amely elősegíti a klónozott gén kifejezését. Indukció esetén az SDS-PAGE gél Coomassie-festése feltár egy 135 kDos fehérjét. Ez illeszkedik a natív kollagénreceptor várt molekulatömegéhez (4). Ezt a fehérjét igazoljuk Westem-folt-elemzéssel és biológiai működési vizsgálattal.
A különböző klinikai izolátumokból való kollagénadhezin immunológiai rokonsága
Korábbi eredmények azt jelzik, hogy a kollagénadhezin pozitív (CA+) S. aureus Cowan törzs teljes sejtjei vagy ennek tisztított kollagénadhezinje ellen kialakuló antitestek hatékonyan gátolják a 125I-vel jelzett kollagén kötődését a homológ törzshöz (Switalski és munkatársai, 1989). Ezek az antitestek hatékonyan gátolják
HU 219 679 Β a 125I-kollagén kötődését az összes, kollagént kötő törzsből, amely a kollagénkötő hely immunológiai keresztreaktivitását jelzi. Abból a célból, hogy megvizsgáljuk az ezen antitestek által felismert sejtfelületi fehérjéket, különböző S. aureus-izolátumokból készített lizosztatinlizátumok Westem-folt-elemzését végezték el (3. ábra). A lizosztatinos emésztés egy sor fehérjét bocsát ki az S. aureus sejtfelületéről; mintegy 30 csík látható a lizátumban a gél Coomassie Brilliant kékkel végzett festésével (Switalski és munkatársai, 1989). Az antiadhezinantitestek egy 135 kD molekulatömegű komponenst ismernek fel a Cowan törzs lizátumában (3. ábra, a vonal), amely egyezésben van korábbi megfigyeléseinkkel (Switalski és munkatársai, 1989). A más kollagénadhezin-pozitív törzsek (CA+) lizátumaiban kimutatott fő immunreaktív fehérjék eltérő molekulatömegűek és vagy 110 kD, vagy 135 kD molekulatömeget mutatnak (3. ábra, b-h vonalak). Korreláció nem figyelhető meg a törzs immunreaktív fehérjéje látszólagos mérete és a törzs kollagént vagy annak eredetét (csont, ízületi folyadék) kötő kapacitása között. A kilenc vizsgált, kollagént nem kötő S. aureus törzs egyike sem fejezett ki immunreaktív fehérjét (3. ábra, i vonal).
Staphylococcusok kollagénadhezin közvetített rögződése kollagén jellegű szubsztrátumokhoz
A kapcsolat a kollagénadhezin kifejeződésének képessége és a fertőzés megfigyelt lokalizálódása között kollagénben gazdag szövetekben arra késztetett minket, hogy elemezzük a sejtfelületi adhezin szerepét a baktérium kötődésében a kollagént tartalmazó szubsztrátumokhoz. Elsőként a baktériumok kötődését tanulmányozzuk II. típusú kollagénnel burkolt felületekhez. Az eredmények azt jelzik, hogy egy kollagénnel burkolt felület kitűnő rögzítőszubsztrátum olyan törzsek számára, amelyek valamely felületen lokalizálódó kollagénadhezint fejeznek ki. A rögződés időfüggő és telíthető, az egyensúlyt az inkubálás 3. órája után érve el (4A. ábra). A rögződött baktériumok számát nem befolyásolja az adhezin mérete, mivel a #14 és a Phillips törzs baktériumai, amelyek 135 kD-os, illetve 110 kD-os adhezint fejeznek ki, azonos számban rögződnek a kollagénnel burkolt szubsztrátumon. Amikor a baktériumokat előinkubáljuk antiadhezinantitestekkel, amelyek az S. aureus Cowan törzs adhezinje ellen irányulnak, a rögződés gátlódik koncentrációfüggő módon (4B. ábra). Ez igazolja a korábbi megfigyeléseket a kollagénadhezinen belüli kollagénkötő hely immunológiai keresztreaktivitásával kapcsolatban. Az adhezinnegatív törzsek (CA-) rögződésére nem hat az előinkubálás az antiadhezinantitestekkel.
Az S. aureus rögződése porchoz
Ezután tanulmányozzuk a baktériumok rögződését porchoz olyan modellben, amely utánozza a kiindulási eseményeket a fertőző ízületi gyulladás kifejlődésében. Ebben a modellben porc egyforma darabjait inkubáljuk 125I-vel felületen jelzett S. aureussal. Szarvasmarhaorrporcot, amely szövettanilag azonos a csontporccal, alkalmazunk ebben a tanulmányban. A porcszövettel kapott adatok nagyon erősen emlékeztetnek a kollagénnel burkolt felületeknél kapott eredményekre. Csak a CA+ törzsek rögződnek a porchoz (4D. ábra) kinetikailag analóg módon, mint ahogyan a CA+ törzsek a kollagénnel burkolt szubsztrátumokhoz rögződnek. Ez a rögződés teljes mértékben gátolható antiadhezinantitestekkel végzett előinkubálással (4E. ábra). Ezek az adatok azt jelzik, hogy a szöveti kollagén felismerése, úgy tűnik, elegendő a baktériumok számára, hogy telepeket létesítsenek a porcon. Az elektronmikroszkópos felvételek igazolják az előzőleg bemutatott mennyiségi megfigyeléseket. Azok az S. aureus törzsek, amelyek kötődnek 125I-vel jelzett kollagénhez, és Westem-folt-képzés alapján egy immunreaktív fehérjével bírnak, nagy számmal rögződnek porcszövetekhez, és láthatólag előszeretettel rögződnek kollagénrostokhoz (4C. ábra). A rögződő baktériumok száma drasztikusan csökken antiadhezinantitestek jelenlétében (4F. ábra). Elektronmikroszkópos megfigyelések jelzik, hogy a baktériumok rögződése a csontszövethez valóban kapcsolatban van a baktériumoknak azon képességével, hogy biológiailag működőképes kollagénadhezint fejeznek ki.
Mesterséges baktériumok megalkotása „Mesterséges baktérium”-okat készítünk kollagénadhezin-fehérjével kovalensen burkolt polisztirolgyöngyökkel (1,2 pm átmérő - szemben a staphylococcusok 0,8-1,0 pm átmérőjével). Ezeket a gyöngyöket azután egy sor kísérletben megvizsgáljuk, amely kísérletek analógok az ép baktériumokkal elvégzett kísérletekkel. A kollagénadhezinnel (CA) burkolt gyöngyök hasonló módon kötődnek a 125I-vel jelzett kollagénhez (5A. ábra), mint az S. aureus CA+ törzseinek kollagénadhezinje (Speziale és munkatársai, 1986), míg azok a gyöngyök, amelyek egy másik Staphylococcus eredetű sejtfelületi komponens, a fibronektinreceptor rekombináns formájával vannak burkolva (Flack és munkatársai, 1987), nem kötődnek. Ez a kötődés megszüntethető anti-CA-antitestekkel, míg a preimmunantitestek hatékonyan nem gátolják a kötődést (5B. ábra). Amikor a „mesterséges baktérium”-okat azon képességükre vizsgáljuk, hogy rögződnek kollagénhez vagy porchoz (adatokat nem mutatunk be), úgy találjuk, hogy a CAgyöngyök időfüggő módon rögződnek a szubsztrátumhoz, azonos módon, mint az S. aureus CA+ törzsek baktériumai, míg azok a gyöngyök, amelyek a fibronektinreceptorral vannak burkolva, szignifikáns szinten nem rögződnek (5C. ábra). Az anti-CA-antitestek gátolják a CA-gyöngyök rögződését porchoz dózisfüggő módon, míg a preimmunantitesteknek nincs hatása (5D. ábra). A kvantitatív kötődési adatokat megerősítik az elektronmikroszkópos megfigyelések. A CA-val burkolt gyöngyök nagy számban rögződnek a porcszövethez, elsősorban a kollagénrostokhoz (5E. ábra), míg a fibronektinreceptorral burkolt gyöngyökhöz nem rögződnek (5F. ábra).
A kollagénkötö tartomány lokalizálása a kollagénadhezinen belül
Különböző kifejezőkonstrukciókat alkotunk meg E. coliban abból a célból, hogy pontosabban lokalizáljuk a kollagénkötő tartományt. Ezekben a kísérletekben két különböző típusú kifejezővektort alkalmazunk, a pKK223-3-at és pGEX-2T-t, amelyek közül a máso10
HU 219 679 Β dikban a kollagénadhezin glutation-S-transzferázhoz van fuzionálva. Jelenlegi ismereteink szerint az adhezin legkisebb területe, amelynek kimutatható kollagénkötő aktivitása van, a pGEX-1.1 konstrukción belül található. Ez a fúziós fehérje mintegy 68 kD méretű, amelyből 41 kD képviseli a kollagénadhezint. Amint a
6. ábrában bemutatjuk, a kollagénkötő aktivitás a cnagén A tartományán belül helyezkedik el.
A kollagénkötő fehérjét alkalmazhatjuk immunizáláshoz, amennyiben a fehérjét - előnyösen valamely fúziós fehérjével kombinálva, hogy a válaszhoz nagy antigént alakítsunk ki - immunológiai reakciót előidéző adagokban injektáljuk az emlős-gazdaszervezetbe. így a kollagénkötő fehéijét alkalmazhatjuk kérődzők vakcinálására Staphylococcus-fertőzések által előidézett tőgygyulladás (mastitis) ellen.
A kollagénkötő fehéijét alkalmazhatjuk továbbá a fertőzés gátlására nyílt bőrsebeknél, a bőr kezelésénél a kollagénkötő fehérjét szuszpenzióban alkalmazva. így a kollagénkötő fehéijét alkalmazhatjuk sebek kezelésében, például a fehéijereceptorok blokkolásához, vagy immunizáláshoz (vakcináláshoz). Az utóbbi esetben a gazdaszervezet fajlagos antitesteket termel, amelyek védhetnek az ilyen kollagénkötő fehérjét tartalmazó baktériumtörzsek behatolása ellen. Ezáltal az antitestek blokkolják a baktériumtörzsek tapadását a károsult szövethez. A fertőző ízületi gyulladás kezelése hasonlóképpen idetartozik.
A szöveti károsodáson történő telepképzésre példák lehetnek az alábbiak:
a) telepképzés a bőrön és kötőszöveten levő sebeken, amely sebeket valamely mechanikai sérülés, vegyi károsodás és/vagy hőkárosodás idézett elő;
b) telepképzés a nyálkahártyákon levő sebeken, például a szájüregben, az emlőmirigyekben, húgyutakban vagy a hüvelyben;
c) telepképzés kötőszöveti fehérjéken, amelyek minimális szöveti károsodásnak (mikrosérülés) voltak kitéve a felhámmal (epithelium) és belhámmal (endothelium) kapcsolatban (tőgygyulladás, szívbillentyű-fertőzés, csípőcsontcsere sebészeti beavatkozása).
Amikor a CBP-t vagy a polipeptidet immunizálás (vakcinálás) céljára alkalmazzuk emlősökben, ideértve az embereket is, a fehérjét vagy polipeptidet steril, izotóniás, fiziológiás konyhasóoldatban diszpergáljuk, miközben gyógyászatilag elfogadható diszpergálószert adunk hozzá. Alkalmazhatunk továbbá különböző típusú adjuvánsokat abból a célból, hogy fenntartsuk a kibocsátást a szövetben, és így a fehérjét vagy peptidet hosszabb ideig tegyük ki a test immunvédő rendszerének.
Az immunizálás eléréséhez megfelelő adag 0,5-5 pg CBP vagy polipeptid 1 testtömeg-kg-ra, az immunizálást injektálással végezve. Abból a célból, hogy tartós immunizálást érjünk el, a vakcinálást egynél több egymást követő alkalommal el kell végezni 1-3 hetes intervallumokkal; az előnyös a három alkalommal végzett vakcinálás.
Amikor a találmány szerint előállított CBP-t vagy polipeptidet alkalmazzuk helyi alkalmazáskor, a fehérjét izotóniás, fiziológiás konyhasóoldatban diszpergáljuk 25-250 pg/ml koncentrációban. A sebeket azután csak olyan mennyiségű oldattal kezeljük, hogy a seb felületének teljes átnedvesedését érjük el. Ezen a módon az oldatnak csak néhány milliliterét alkalmazzuk egy átlagos sebhez. A fehérjeoldatot alkalmazó kezelés után a sebeket megfelelően lemossuk izotóniás, fiziológiás konyhasóoldattal vagy valamely más sebkezelő oldattal.
A találmány szerint előállított kollagénkötő fehérjét, valamint a minimális kollagénkötő helyű polipeptidet alkalmazhatjuk Staphylococcus törzsek által okozott bakteriális fertőzések diagnosztizálására, ahol egy jelen találmány szerinti kollagénkötő fehérjét immobilizálunk szilárd hordozón, például kis latexen vagy Sepharose gyöngyökön, majd antitesteket tartalmazó szérumokat engedünk át ezen és reagáltatunk az így immobilizált CBP-vel. Az agglutinációt azután ismert módon mérjük.
A CBP vagy a polipeptid alkalmazható továbbá ELISA-vizsgálatban [Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay; Engvall E.: Med. Bioi. 55, 193 (1977)]. Itt polisztirol mikrotitrálólemez üregeit CBP-vel burkolják, és inkubálják egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten. A lemezeket azután alaposan átmossák 0,05% Tween-20at tartalmazó PBS-sel (foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat), majd megszárítják. A beteg szérumának sorozathígításait, amelyeket PBS-Tweennel készítenek, hozzáadják az üregekhez és 30 °C hőmérsékleten inkubálják 1,5 órán át. Átöblítés után, valamely enzimmel konjugált antihumán IgG-t, illetve valamely enzimmel konjugált antiszarvasmarha-IgG-t (ahol ez az enzim torma-peroxidáz vagy alkalikus foszfatáz) adnak az üregekhez és 30 °C hőmérsékleten 1,5 órán át inkubálják; ez alatt az idő alatt az IgG az üregekhez kötődik; öblítés után az üregekhez hozzáadják az enzimszubsztrátumot: alkalikus foszfatáz esetében p-nitrofoszfát, peroxidáz esetében pedig ortofenilén-diamin (OPD)-szubsztrátumot alkalmaznak. Az üregeket tartalmazó lemezeket ezután átöblítik olyan citrátpuffert alkalmazva, amely 0,055% OPD-t és 0,005% H2O2-ot tartalmaz, és 10 percig inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten. Az enzimreakciót úgy állítják le, hogy az egyes üregekhez hozzáadnak 4 n H2SO4-oldatot. A szín kifejlődését spektrofotométerben mérik.
Az alkalmazott enzimtől és szubsztrátumtól függően fluoreszcenciás mérés is alkalmazható.
A Staphylococcus-fertőzések diagnosztizálására javasolt eljárás egy DNS-gén-vizsgáló mintamódszer alkalmazása, ahol a vizsgálóminta a CBP nukleotidszekvenciáján vagy polipeptidszekvenciáján alapul. Tőgygyulladás (mastitis) diagnosztizálása esetén egy tejmintát átengedünk olyan membránon, amely összegyűjti a jelen levő baktériumokat. A baktériumok autolízise alkalikus oldatban a kibocsátott egyszálú DNS-t a membránhoz köti. A DNS-gén-vizsgáló mintát, amely kívánt esetben jelezve van valamely enzimmel vagy radioaktív izotóppal, azután hozzáadjuk a DNS-szekvenciát tartalmazó membránhoz, miáltal a DNS-gén-vizsgáló minta hozzákötődik a szekvenciához, ahol van ilyen. Az en11
HU 219 679 Β zimet vagy a radioaktív izotópot azután könnyen meghatározhatjuk ismert eljárásokkal.
A fentiekben a „kollagénkötő fehéije” kifejezés magában foglalja azokat a polipeptidszekvenciákat is, amelyek a teljes fehéije minimális kollagénkötő helyét ké- 5 pezik.
IRODALMI HIVATKOZÁSOK Carret G., Emonard H., Fardel G., Druguet M., Herbage D., és Flandrois J. P.: Ann. Inst Pasteur (Paris) 136A; 241-245 (1985).
Guss B., Uhle’n M., Nilsson B., Lindberg M., Sjöquist
J. , és Sjödahl J.: J. Biochem., 138, 413-420 (1981).
Guss B., Ellásson M., Olsson A., Uhle’n M., Frej A.K. , Jömvall H., Flock J.-I. és Lindberg Μ.: EMBO J. 5,
1567-1575 (1986). 15
Holderbaum D., Spech R. A., és Ehrhart L. A.: Collagen Relat, Rés. 5, 261-271 (1985).
Holderbaum D., Hall G. S. és Ehrhart L. A.: Infect. Immun 54, 359-364 (1986).
Hollingshead S. K., Fischetti V. A. és Scott J. R.: J. 20 Bioi. Chem. 261, 1677-1686 (1986).
Signás S., Raucci G., Jönsson K., Lindgren P.-E., Anantharamaiah G. M„ Höök M. és Lindberg M.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 699-703 (1989).
Speziale P., Raucci G., Visal L., Switalski L. M., Timpl R. és Höök M.: J: Bact. 167, 77-81 (1986).
Switalski L. M., Speziale P. és Höök M.: J. Bioi. Chem. 264, 21 080-21 086 (1989).
Uhle’n M., Guss B., Nilsson B., Gatenbeck S., Philipsson L. és Lindberg M.: J. Bioi. Chem. 259, 10 1695-1702(1984).
Vercellotti G. M„ McCarthy J. B., Lindholm P., Peterson P. K., Jacob H. S. és Furcht L. T.: Am. J. Pathol. 120, 13-21 (1985).
Claims (4)
1. Eljárás valamely kollagénkötő fehéije vagy polipeptid előállítására, amely legalább egy alábbi aminosavszekvenciát tartalmaz:
Alá
Ar gAs plleSerSerThrAs nVaITh rAspLeuThrValSerProSerLysI1eGluAs p G1 yGlyLysThrTh rVa1Ly sMe tTh r PheAs pAspLy sAs nGlyLy sI1eGlnAsnGly As pMe t I leLysValAlaTr pPr oTh r Se rGlyTh rValLysIleGluGlyTyrSerLys ThrVa 1Pr oLeuTh rValLysGlyGluGlnVa1G1yGlnAlaVa1I1eTh r Pr oAs pGly AlaTh r11eThr PheAsnAs pLy sVa1G1uLy sLeuSe rAs pVa1 Se rGlyPheAlaGlu PheGl uVa 1G1nGlyAr gAs nLeuTh rGlnTh rAsnTh rLeuAs pAs pLy sVa1AlaTh r IleThrSerGlyAsnLysSe rTh rAs nVa1IleGlyTrpIleLysValLy sArgGluPr o Va 1 Va 1 PheLeuI1eAsnLy s Se rGlyLy sI1eCysTyrGlnGluAs pTh rTh rHi sVa1 ArgTrpPheLeuAsnI1eAsnAsnGluLysSe rTyrVa1 Se rLysAspI1eThr11eLys As pGl η 11eGlnGlyGlyGlnGlnLeuAs pLeuSe rTh rLeuAsη I1eAsnVaIThrGly ThrHi sSerAsnTyrTyrSe rGlyGlnSe rAla 11eThrAspPheGluLysAlaPhePr o GlySerLysIleThrValAs pAsnTh rLy sAs nThr11eAs pVa1Th rI1ePr oGlnGly Ty rGl ySe rTy rAsnSe r PheSe rI1eAsnTy rLy sTh rLy sI1eTh rAsnGluGlnGln Ly sGl uPheVa lAsnAsnSe rGl nAl aTr pTy rGl nGl uHi sGl yLy sGl uGl uVa lAsn GlyLysSerPheAsnHi sThrValHi sAsnlleAsnAlaAsnAlaGlyI1eGluGlyThr ValLysGlyGluLeuLysValLeuLysGlnAs pLysAs pTh rLy sAlaPr ο I1eAlaAsn ValLysPheLysLeuSerLysLysAspGlySerValValLysAspAsnGlnLysGluI le G1 u I 1e11eThrAspAlaAs nGly11eAlaAsnIleLysAlaLeuProSerGlyAs pTyr 11eLeuLysGluI1eGluAlaPr oAr gPr oTy rTh r PheAs pLy sAspLysGluTyrPro PheThrMe tLysAspThrAspAsnGlnGlyTyrPheThrThr11eGluAsnAlaLysAla 11eGl uLysTh rLy sAs pValSerAlaGlnLysValTr pGluGlyThrGlnLysValLys Pr oThrIleTyrPheLysLeuTyrLy sGlnAs pAs pAsnGlnAs nTh rTh r Pr oValAsp Ly sAl aGluI1eLy sLy sLeuGluAs pGlyThrThrLy sVaIThrTrpSerAsnLeuPro G1 uAsnAspLysAsnGlyLy sAla I1eLy sTyrLeuVaILy sGluVa 1 AsnAl aGl nGl y G1 uAs pThrThr Pr oGluGlyTyrTh rLysLy sGluAsnGlyLeuVa 1 Va ITh rAs nTh r G1 uLy sPr ο I1eGluTh rTh rSerlleSerGlyGluLy sVa1Tr pAs pAs pLy sAspAsn G1 nAs pGlyLy sArgPr oGluLysVa1 Se rVa1AsnLeuLeuAlaAsnGlyGluLy sVa1 LysThrLeuAspVa1ThrSe rGluThrAsnTrpLysTyrGluPheLysAspLeuProLys TyrAs pGluGlyLy sLy sí 1eGluTy rTh rVaITh rGluAs pHi sVa 1Ly sAspTyrTh r ThrAspI1eAsnGlyThrThr11eThrAsnLysTyrThrPr oGlyGluThrSe rAlaThr ValThrLysAsnTr pAs pAs pAsnAs nAsnGlnAspGlyLy sAr gPr oTh rGluI1eLy s Va 1G1uLeuTyrGlnAspGlyLysAlaThrGlyLysThrAlaThrLeuAsnGl uSe rAsn AsnTrpThrHi sThrTr pTh rGlyLeuAs pGluLysAlaLysGlyGlnGl nVa 1Ly sTy r Th rVa1G1uGluLe uThrLy sVa1Ly sGlyTy rThrThrHisVa1 As pAsnAs nAs pMe t G1 yAsnLeuI1eVaIThrAs nLy sTy rThr Pr oGluThrTh rSerlleSerGlyGluLy s Va 1 Tr pAspAs pLy sAs pAsnGlnAs pGlyLysArgProGluLysValSerValAsnLeu LeuAl aAspGlyGluLysVaILysThrLeuAspVa1ThrSe rGluThrAsnTrpLysTyr
HU 219 679 Β
Gl uPheLy sAspLeuPr oLy sTy rAs pGluGlyLy sLy s11eGluTyrTh rVaITh rGlu AspHi sVa ILy sAspTy rTh rTh rAsp I 1 eAsnGl yThrThr 11 eThrAs nLy sTy rThr Pr oGl yGl uTh rSerAlaThrValThrLy sAsnT r pAs pAs pAsnAsnAs nGl nAspGl y Ly sArgPr oTh rGlu11eLy sVa1G1uLeuTy rGlnAs pGlyLy sAlaTh rGlyLysThr Al aThrLeuAsnGluSe rAsnAsnTr pThrHi sThrTr pThrGlyLeuAs pGluLysAla Ly sGl yGlnGlnVaILysTyrThrVa1G1uGluLeuThrLy sVa1Ly sGlyTy rTh rTh r Hi sValAspAsnAsnAs pMe tGlyAsnLeu11eVaITh rAs nLy sTyrTh r Pr oGluTh r ThrSerlleSerGlyGluLysValTr pAs pAspLy sAs pAs nGlnAs pGlyLy sAr gPr o Gl uLy sVa1 Se rVa1AsnLeuLeuAlaAs nGlyGluLy sVa1LysThrLeuAspVa1Th r Se rGluThrAsnTr pLy sTyrGluPheLysAs pLeuPr oLysTy rAspGluGlyLy sLy s I 1 eGl uTy rTh rVa 1 Th rGl uAspHi sVa 1 Ly sAs pTy rTh rTh rAsp I 1 eAsnGl yThr Thr11eThrAsnLy sTy rThr Pr oGlyGluTh rSerAlaThrValThrLy sAsnT r pAs p As pAsnAsnAsnGlnAspGlyLy sAr gPr oTh rGlu11eLysVa1G1uLeuTyrGlnAs p GlyLy sAlaTh rGlyLy sTh rAlalleLeuAsnGluSe rAsnAsnT r pTh rHi sThrTr p Th rGl yLeuAs pGl uLy sAl aLy sGl yGl nGl nVa 1 Ly sTy rTh rVa 1 As pGl uLeuThr Ly sVa lAsnGlyTyrTh rThrHi sValAspAsnAsnAs pMe tGlyAsnLeuI1eVaIThr AsnLysTyrThrProLysLysProAsnLysProI1eTyrProGluLysProLysAspLys Thr Pr oPr oTh rLy s Pr oAs pHi sSerAsnLysValLysProTh r Pr oPr oAs pLy s Pr o Se rLy sVa1As pLy sAs pAs pGlnPr oLy sAs pAsnLy sTh rLy sPr oGluAsnPr oLeu Ly sGluLeuPr oLy sTh rGl yMe tLysIlelleThrSerTrpIleThrTrpValPhelle GlylleLeuGlyLeuTyrLeuIleLeuAr gLy sAr gPheAs nSe r azzal jellemezve, hogy
a) legalább egy, a következő nukleotidszekvenciát:
GCA
CGAGATATTT CATCAACGAA TGTTACAGAT TTAACTGTAT CACCGTCTAA GATAGAAGAT GGTGGTAAAA CGACAGTAAA AATGACGTTC GACGATAAAA ATGGAAAAAT ACAAAATGGT GACATGATTA AAGTGGCATG GCCGACAAGC GGTACAGTAA AGATAGAGGG TTATAGTAAA ACAGTACCAT TAACTGTTAA AGGTGAACAG GTGGGTCAAG CAGTTATTAC ACCAGACGGT GCAACAATTA CATTCAATGA TAAAGTAGAA AAATTAAGTG ATGTTTCGGG ATTTGCAGAA TTTGAAGTAC AAGGAAGAAA TTTAACGCAA ACAAATACTT TAGATGACAA AGTAGCTACG ATAACATCTG GGAATAAATC AACGAATGTT ATCGGTTGGA TAAAAGTGAA GCGGGAACCA GTAGTGTTTC TAATTAATAA AAGCGGGAAG ATATGCTACC AAGAAGATAC GACACATGTA CGATGGTTTT TAAATATTAA CAATGAAAAA AGTTATGTAT CGAAAGATAT TACTATAAAG GATCAGATTC AAGGTGGACA GCAGTTAGAT TTAAGCACAT TAAACATTAA TGTGACAGGT ACACATAGCA ATTATTATAG TGGACAAAGT GCAATTACTG ATTTTGAAAA AGCCTTTCCA GGTTCTAAAA TAACTGTTGA TAATACGAAG AACACAATTG ATGTAACAAT TCCACAAGGC TATGGGTCAT ATAATAGTTT TTCAATTAAC TACAAAACCA AAATTACGAA TGAACAGCAA AAAGAGTTTG TTAATAATTC ACAAGCTTGG TATCAAGAGC ATGGTAAGGA AGAAGTGAAC GGGAAATCAT TTAATCATAC TGTGCACAAT ATTAATGCTA ATGCCGGTAT TGAAGGTACT GTAAAAGGTG AATTAAAAGT TTTAAAACAG GATAAAGATA CCAAGGCTCC TATAGCTAAT GTAAAATTTA AACTTTCTAA AAAAGATGGA TCAGTTGTAA AGGACAATCA AAAAGAAATT GAGATTATAA CAGATGCAAA CGGTATTGCT AATATTAAAG CGTTGCCTAG TGGAGACTAT ATTTTAAAAG AAATAGAGGC GCCACGACCG TATACATTTG ATAAGGATAA AGAATATCCG TTTACTATGA AAGATACAGA TAATCAGGGA TATTTTACGA CTATTGAAAA TGCAAAAGCG ATAGAAAAAA CAAAAGATGT TTCTGCTCAA AAGGTTTGGG AAGGCACTCA AAAAGTGAAA CCAACGATTT ATTTCAAGTT GTACAAACAA GATGACAATC AAAATACAAC ACCAGTAGAC AAAGCAGAGA TTAAAAAATT AGAAGATGGA ACGACAAAAG TGACATGGTC TAATCTTCCG GAAAATGACA AAAATGGCAA GGCTATTAAA TATTTAGTTA AAGAAGTAAA TGCTCAAGGT GAAGATACAA CACCAGAAGG ATATACTAAA AAAGAAAATG GTTTAGTGGT TACTAATACT GAAAAACCAA TCGAAACAAC ATCAATTAGT GGTGAAAAAG TATGGGACGA CAAAGACAAT CAAGATGGTA AGAGACCAGA AAAAGTCAGT GTGAATTTAT TGGCTAACGG GGAGAAAGTA AAAACGTTAG ACGTGACATC TGAAACAAAC TGGAAGTACG AATTTAAAGA CTTACCGAAG TATGATGAAG GAAAGAAAAT
HU 219 679 Β
AGAATATACA
ACGGTACGAC
GTAACAAAAA
TGAAATCAAA
CAACATTAAA
GAAAAAGCAA
GGTCAAAGGT
TTGTGACGAA
GTATGGGACG
TGTGAATTTA
CTGAAACAAA
GGAAAGAAAA
AACAGACATC
CATCGGCAAC
AAACGACCAA
AGGAAAAACG
CAGGATTAGA
GAATTAACAA
GGGCAACTTG
GCGGTGAAAA
GAAAAAGTCA
AGACGTGACA
AGTATGATGA
AAAGACTACA
ACCAGGAGAG
ACCAAGACGG
GGAAAAGCAA
ACATACGTGG
ACACAGTCGA
AACAATGATA
ACCGAATAAA
CTAAACCTGA
TCAAAAGTGG
AAATCCTCTA
GGATTACATG
AAAAGATTTA
GTGACCGAAG
AATAACGAAC
ATTGGGATGA
GTTGAGTTAT
TGAATCTAAT
AAGGACAACA
TATACAACAC
TAAATATACG
ACAAAGACAA
TTGGCTGATG
CTGGAAGTAC
TAGAATATAC
AACGGTACGA
AGTAACAAAA
CTGAAATCAA
GCAACATTAA
TGAAAAAGCA
AGGTCAAAGG
ATTGTGACGA
AGTATGGGAC
GTGTAAATTT
TCTGAAACAA
AGGAAAGAAA
CAACAGACAT
ACATCGGCAA
AAAACGACCA
CAGGAAAAAC
ACAGGATTAG
TGAATTAACA
TGGGTAACTT
CCAATCTATC
TCATTCTAAT
ATAAGGATGA
AAAGAATTAC
GGTATTTATA
ACTCA
ATCACGTAAA
AAGTATACAC
CAATAATAAC
ATCAAGACGG
AACTGGACCC
AGTAAAATAC
ATGTGGATAA
CCAGAAACAA
TCAAGATGGT
GAGAGAAAGT
GAATTTAAAG
AGTGACCGAA
CAATAACGAA
AATTGGGATG
AGTTGAGTTA
ATGAATCTAA
AAAGGACAAC
TTATACAACA
ATAAATATAC
GACAAAGACA
ATTGGCTAAC
ACTGGAAGTA
ATAGAATATA
CAACGGTACG
CAGTAACAAA
ACTGAAATCA
GGCAATATTA
ATGAAAAAGC
AAAGTTAATG
GATTGTGACA
CTGAAAAACC
AAAGTTAAAC
TCAACCTAAA
CAAAAACTGG
GGTATATTGG
AGACTACACA
CAGGAGAGAC
CAAGACGGAA
AAAAGCAACA
ATACGTGGAC
ACAGTCGAGG
CAATGATATG
CATCAATTAG
AAGAGACCAG
AAAAACGTTA
ACTTACCGAA
GATCACGTAA
CAAGTATACA
ACAATAATAA
TATCAAGACG
TAACTGGACC
AAGTAAAATA
CATGTGGATA
GCCAGAAACA
ATCAAGATGG
GGAGAGAAAG
CGAATTTAAA
CAGTGACCGA
ACAATAACGA
AAATTGGGAT
AAGTTGAGTT
AATGAATCTA
AAAAGGACAA
GCTATACAAC
AATAAATATA
AAAAGACAAA
CAACTCCCCC
GATAATAAAA
TATGAAGATT
GACTGTATTT
ACAGACATCA
ATCGGCAACA
AACGACCAAC
GGAAAAACGG
AGGATTAGAT
AATTAACAAA
GGTAACTTGA
TGGTGAAAAA
AAAAAGTCAG
GACGTGACAT
GTATGATGAA
AAGACTACAC
CCAGGAGAGA
CCAAGACGGA
GAAAAGCAAC
CATACGTGGA
CACAGTCGAG
ACAATGATAT
ACATCAATTA
TAAGAGACCA
TAAAAACGTT
GACTTACCGA
AGATCACGTA
ACAAGTATAC
GACAATAATA
ATATCAAGAT
ATAACTGGAC
CAAGTAAAAT
GCATGTGGAT
CGCCGAAAAA
ACACCACCAA
AGATAAGCCA
CCAAACCTGA
ATAACTTCAT
AATTTTAAGA tartalmazó DNS-molekulát bevezetünk valamely mikroorganizmusba;
b) a mikroorganizmust valamely növekedést előse- 40 gítő tápközegben tenyésztjük; és
c) az így képződött fehéijét ioncserélő kromatográfiával, ammónium-szulfátos kicsapással és gélszűréssel izoláljuk.
2. ÁBRA
AípA«r.Asr.AsnGlr.AspGlylysArg?ro7hrGluIleLyaValGluLeu7yrGlr-A«p (4. folyt)
4021.
40614141
4201
4261
4321
4361
4441
4501
4561
GGAAAAGCAACAGGAAAAACGGCAA7AT7AAA7GAA7C7AA7AAC?GGACACATACGTGG ——— +------------—————4——————---4--------4- -——---4
Glyly*Al*7hrClyly*ThrAlalleLeuAinGluS€xA$nAsnTrpThr?4jThrTrp
ACACCA77ACATCAAAáAGCAAAAGGACAACAAGTAAAA7ACACAG7CGATGAAT7AACA ——- — «—4----—---4--———4—— — 4——----4—— —4
ThrGlyl^uAspCluLysAlalycGlyGlnGlnValLyaTytTkrValAs pGluLauThr AAACTTAATCCCTATACAACGCATCTCGATAACAATGATA7GGGTAACT“GATTGTGACA
----- —4———4———4—---^------4
LytVal^nGI^TyrThrThrBltValAspAinAsnAspX» tGlyAt.-.LcuIltValThr AATAAATATACGCCGAAAAAACCCAA7AAACCAA7C7A7CC?CAAAAACCAAAAGACAAA
---4AsnLysTyrThrPre^.yslyx?reAsnl.ys?rol2tTyr?roGluLy5?rolysAapLys
ACACCACCAACTAAACXTCATCAT7CTAATAAAGT7AAACCAACTCCCCCAGATAAGCCA —— — — 4---------4---- —-4———4 ——4———*
ThrProProThrl.ys?roAspai »SarAtnLysValLys?roThr7ro?roAsplysPro
4080
4140
4200
4260
4320 ?CAAAAGTGGATAAGCATGA7CAACCTAAAGA7AA7AAAACCAAACC?GAAAATCC7CTA ———4———+ ———————4—————————4 4360
StrLyíValAj?LysA$?AjpGla?roLy$AipAjaLyi7hrLys?rDGluAsr.ProL«u f—+ M _
AAAGAA77ACCAAAAACTGG7A7GAAGATTA7AACTTCA7GGAT7ACA7GGGTA7TTA7A ———————4--————4—--4---------4-—4——————4 4440
LyrGluLeu?roLyí7hrGlyKetLysIleIl?ThrSerTrpIleThrTrpVal?heIl» . r-* töltött C-terminális
GGTATAT7GGGACTGTATTTAA7TTTA4GAAAAAGATT7AACTCA7AAAGCA77A7AAT7 —-4— —————4————————4 —— — — — — —— — 4 —— — — ———4 4500
GlyXIaLtuGlyLtuTyrLeuIlcLauArilytArsrhtAssSer&r.á
ATTTTTAIAGATAAGGCTATTCTIAGTTCTATGTATAATACATGATATTAATAGGTCACT -——-4——-4——4————4-·——-4—---- - 4 4560
7nAA7CTCTATGTAAGCAGACTAAGAGTGGCCnTTAAACAAATAAAA<AA ---------4------------------4--------+---------*— 4612
HU 219 679 Β
Int Cl.7: C 07 K 14/31 ab cd efg h i
200.0*
L /
116.3*
97.4* *135 *110
14.4*
2. ÁBRA ( 3.folyt.)
C7A7GGGAWACA-<AGACAJtfCAAGATGGTWGAGACCAGMAV.G?CAG“GTQ‘-ATTTA 3121 ---------*---------*..................♦----------------4 3180
ValrpAjpAipLyíA3pA3nGl.rJl3 pGlyL)jAr£?roGluL)'s V«.lS«rV*lAjnLrj
TTOGC?GA7GGAGACAAAGTAAAAACGTTAGACC7GACAC7GAAACAAAC7GGAAGTAC 3181 -------*---------------------------------------4---------+ 3240
UuAltAjpClyGluLyiValLysThrLeuAspVelThrSerGluThrAxnTrpLysTyt
GAATTTAAAGACTTACCGAAGTATGATGAAGGAAAGAAAATAGAATATACACTCACCCAA 3241 .........——.....*---------4---------♦...................♦ 3300
Glu9hely<AspL*u?roLys7ycAcpGluGlyLyslyslleGlu7yr7hsYal7hrGlu
GATCACGTAAAAGAC7ACACAACAGACATCAACGGTACGACAAT/.ACGA-t.CAAG7A7ACA 3301 —...................................*-------------------4' 3360
Af?HííVallysAspTyrThrTbrAspIl*A$nGlyThrThrIleThrAxaLysTyrIhr
CCA06ACAGACATCGSCAACAGTAACAAAAAATTGGGATGACAA7AA7AACCAAGACGGA 3361 ---»-----4---------4---------4---------4---------4--------.4 3420
FroGlyGlu7hr5etAlaThrVtl7hrLysAsnTrpAs?AspAsrJ-snAsnGlnAspGly
AAACGACCAACTGAáATCAAAGTTGAGTTATATCAAGACGGAAAAGCAACAGGAAAAACG 3421 ...................►.............................4---------4 3450 ty$Ars?ro7hrGluIleLyíValGluLeu7yrGlr.AspGlyLysAlaThrGlyLyx7hr
CCAACATTAAATCAATCTAATAACTGGACCCATACGTGGACAGGATTAGATGAAAAAGCA 3481 ---------*-------------------------------------------------- 3540
AlaThrLeuAsnGluSerAsnAsnTrpThrSisTfcrTrpThrGlyLauAspGluLyaAla
AAAGGACAACAAGTAAAATACACAGTCGAGGAATTAACAAAGGTCAAAGGTTATACAACA 3541 -—-———4-------—-“_“4—------4 3600
LysGlyGlnGlnValLys7yrThrValGluGltiVeuThrI.ysValLysGly7yrThrThr Γ“> B3
CATGaGGA‘AACA-ATGAIATGGGCAACTTGATTGTGACCAATAAATATACGCCAGA.UCA 3601 ———4———-4————————4—————4—-------4------>-—4 3580
EísValAspAir.AynAjpí'arGlyAsr.I.euIltVilThrAsr.LysTyrThrProGluTbr
ACA?CAATTAGCGGTGAAAAAGIA7GGGACGACAAAGACAA7CAAGA?GSTAAGAGACCA 3581 ---------4---------4---------------------------------------- 3720
7hrStrZlaStrGlyGluLycValTrpAa?Ax?Ly>At?A*nGlr.AspGlyl.ysArs?ro
CAAAAAGTCAG7GTAAATTTA7TGCCTAACGGAGAGAAAG7AAAAACGTTACACG“GACA 3721 ------------------------------------------------------------ 3760
GluLysYil5trYalAxnLcuUuAl&AsnGlyGluLysYalLysThrLeuA.spValThr
TC7GAAACAÁAC?GGAAGTACGAA77?AAAGAC77ACCGAAG7ATGATGAAGSAAAGAAA 3781 -4-—-4—-——--——4——-———-—-4-—-—————-4 3860
SerGlu7hrAxaTrplys“yrGlu?hel.yxAspLey5rol-ys7yrAspGluGlyl.yíl.ys
ATAGAATATACAG7GACCGUGA7CACG7AAAAGACTACACAACAGACATCAACGC7ACG 3841 ———--4---- __ 4—------ 4------4--——3900
IleCluTyrThrValTbrGluAspSisValLysArpTyrThrThrAspJleAsnGlyThr o p16-ban lévő beiktatás 31 vége—| acaa7aaccaaca.ag7atacaccaggacagaca7cgcc/4Acagtaacaaaaaat7ggga7 3901 ---------------------------------------4-------------------4 3P50
7hrll*7hrAsn!.yi7yr7hr?roGlyGluThrSerAle7hrValThrLy£AsnTrpAsp
GACAATA.A7AACCAACACGGAAAACGACCAAC7GA.A.A“CAAAG7TGAG“”A7A7CAAGA?
3961 ------4---------4-------------------4---------4---------4 ,4020
HU 219 679 Β
Int. Cl.7: C 07 K14/31
2. ÁBRA
2101 -----------------------------------------------------------♦ 2160 ( 2. folyt.)
IleL*utysGluIltGluAla?roArj?ro7yr7hrrheAspLysAjpLyjGlu7yr?ro
777ACTA7CAAAGA7ACAGA7AA7CAGGGA?A7777ACGAC7AT?GAAAA7GCAAAAGCG 2161 ------------------------------------------------------------ 2220 ?HThrKetlysAjp7hvAspAsnGlnGly7yxPlie7hrThrIle51vA«nAlttyjAla
ATAGAAAAAACAAAAGATGTTTC7GCTCAAAAGG777GGGA4GGCACTCAAA.AAGTGAAA
2221 ---------4-*--------♦.....................—---------------- 2280
XleGluly»ThrLysAspValS«rAltGlslysValTrpCluCly7fcrC2nLyíVall.ya
CCAACGATTTATTTgAAGT7GTACAAACAAGA7GACAATCAAAA7ACAACACCAGTAGAC 2281·-------*---------4--------------------------------------4 2340
PreTfcrIleTyrPh*LyíLeuTyxLyxGlnAfpA»pAsnGlnAxaThxTkr?xeValA»p , „ , f— a cCÖLR6A-ban levő beiktatás 5
AAAGCAGAGAT7AAAAAATTAGAAGATGGAAC&ACAAAAG?GXCATGG7C7 AATGTTCCG vége
2341 --4---------4-----—-4—-------4——--4™-------4 2400
LysAltGluIleLyiLyiLeuGluA»pGly7ht“hrlyiVal7hrTrpStrAinLeuPio
GAAAA7GACAAAAATGGCAAGGC7A7?AAA7ATT7AGTTAAAGAAGTAAATGC7CAAGGT 2401 ---------4-------------------4------------------4---------- 2460
GlvAxnAxplysAsnGlyLysAlalleLysTyxleuYalLyrGluValAsnAlaClnGly
GAAGA7ACAACACCAGAAGGATATACTAAAAAAGAAAA7GC777AG7GG77ACTAA7ACT 2461 —------------------------4------'-------------------- 2520
GluAsp7Ar7hrProGlvGlyTycThrLysLysGluAsnGlylevValYalThxAca7kr
Bl
GAAAAACCAATCGAAÁCAACATCAATTAGTGSTGAAAAAGTATGGGACGACAAAGACAAT 2521 -----—4»————————4—————————4---------4——-—4 2580
GlulyiPrelleGluTkxThrStrllaSarGlyGlnlysValTrpAípAipLyaAspAsa
CAAGAfGG7AAGAGACCAGAAAAAGTCAGTGTGAA7TTATTGGC7AACGGGGACAAACTA 2581 -4-————————4——————4———————--4——4—————————4 2640
GlnAfpSlyLysArsFroGluLycValStrYalArnLauLtuAlaAsnGlyGluLysVal
AAAACGTTAGACGTGACA?C7GAAACAAAC7GCAAGTACGAAT7TAAAGACT?ACCGAAG 2641 —————4———————4—————————4-——------4----——-——4—————_.__4 2700
LyiThrLfcuAspValTht5trtluThrAsnTrptysTyrGlu?hety«AspLeuTroI.ys
TATGATGAAGGAAAGAAAA7AGAA7ATACAGTGACCGAAGATCAGÜTAAAAGACTACACA 2701 ------------------------------------------------------------ 2760
TyrAípGlvClylyílyjJltGluTyrThiValThrtluAspBiíValLyiAspTyxThr
ACAGACATCAACGCTACGACAATAACGAACAAGTATACACCAGGAGAGÁCATCGGCAACA 2761 -------------------------------------*-------------------- 2820
ThxAfpJlaAsnGlyThxnrlltThrAínlysTyrThxProGlyGluThrSaxAlaThr
GTAA0AAAAAATTGGGATGaCAA7AATAACCAAGACGGAAAACGACCAACTCAAATCAAA 2821 ........................................................ 2880
ValThrLy«AsnlrpAxpAipA»RA»r.Ax.nGlriAipGlylyíArsPxoThrtltillely$
GTTGAGTTATATCAAGACGGAAAAGCAACAGGAAAAACGGCAACATTAAATGAATCTAAT 2681 ----—-------------------------------------------*---------- 2940
ValGlul«uTyrGlRA»pGlylyíAla7hrGlylyí7krAlaTkrl<uAinGluSerAsn
AACTCCACCCATACGTGGACAGGATTAGATGAAAAAGCAAAAGGACAACAACTAAAATAC 2941 —--------------------------------------------------------- 5000
Arn7rpTkxKlJThrTrp7krGlyLeuAspGluLyíAlaly$GlyClnGlnValLyíTyr
ACAGTCGAGCAATTAACAAAGG7CAAAGGTTATACAACACATCTGGATAACAA7GATATG 3001 ---------------------------------------*-------------------- 3060
ThtVa2GluGluLeuThrLyíVallysGlyTyr7kr7hr!:ííValAs?AsnASAA$pXet f——? B2
GG7AAC7TGAT?GTGACCAA7AAA7ATACCCCACAAACAACATCAATTAG?GGTGAAAAA 3061 ------------------------------------------------------------ 3120
ClyAíR’-tuIltVBlThrAir.LyiTyr-.'-.rrreGlvThrThrSxrlltSarGlyCluLys
HU 219 679 Β
Int. Cl.7: C 07 K 14/31
2.ÁBRA (1- folyt.)
HU 219 679 Β
Int. Cl.7: C 07 K14/31
2.ÁBRA
GACCTG7T7TCACAAATCC7CT7CAAATGAAAAA6GCCATAGCA/iTTAACCATATAC7AT
TAT7ACCAAAACCACCGACAGCCGT777CA7GTCAACAATGCCAACCAGCACCA7GATTG 301 4—— -r->. ...... 4„_—4——--4----4
300
360
TAAATCCAATTACAGAGACAGCCCCAATTGGCATCűGTTGTGTAATACAAGCAATGATTG 361 ——~~-4———-4———4—..-..-4————4—.....4 430
T0GCGACGAATA77GCGAACATATACCA7GCTGTTGCA7CCACAGCTTCCCC7TTAATAG
GTGTAAGTGCCCAAATAAGCAGACCTACAACGATAGGGAGTATAAACTTACGATATTTAA 481 —--—4—-—4———-^---------4---4 540
CCGTCT7TTCCATGTTAAAJ.CG7CXT7CTT7G7ATC77TTA7ACATATTTCAA7TTAAGA
600
ATAAAGCTAAC7ACAAAACA7GTACAG7AATAATTAAATATAAAATTCAATTAACCAAAT
601 —————4—........ 4.———4.—————4—....... 4 660
CATTAATATAAT7ATrnTCGAGAACCGGTGAAGAACTGGIA7£G77GGTC7TTArrAAA 661 -4-.-4-—.. 4———— 4——.... 4 720
TTTAAAAGAT7r7GAAAATGAACTAA7ATACTAAGAAAT7AATTGATACAAG77AACTTC 721 -4——-——·4-———4———4 760
A7GCAC77GTA77C5TTA7AC7G7A7A7AT7TTGCATAATAAAATAATAATA7GAATm 781 -___-4—4-----------——.4
840
900
7GATAAAT7TCA77'GAA7AAGAACTAAAT7AG77TATAA777A77A77AGTATCCTC7GG 841 ....——4—— —-x—______4———4——————4
RBS j—- s
ATATGACATACACTATXa*GGAGGGGTTTTTATCAACAAAAATGTG7TCAAG7TXATGCTC
901 —4—......4------------------—-----4. 960
KetAsaLysAanValUuLyafheXciVa
T77A7AATGTTA77AAATA7CA7CACACCnTA7T7AATAAAAATGAACCAT7TGCACCA 961 ----------------4--------------------------------------PhtUtKexUyUuAínIlell«7hrProUufheAsaLysA$aGluAliPheAlaAl*
1020
CGAGA7ATT7GATCAACGAA7GT7ACAGA7TTAACTG7ATCACCG7CTAAGATAGAAGAT 1021 ------------------------------------------------4 1080
ArgAípIleSerSer7hrAsnValThrAjpL«yThtValS«r?roSerLyílleGluA$p
GCTGG7AAAACGACACTAAAAA7GACGTTCGACGA7AAAAA7GCAAAAa7ACAAAA7GGT 1061 ................—4...................*------------------♦
GlyClyLy$7hrTkrV»lLysKetThrPheA«?Aí?LysA$nClyl.ysll«Glr.AsnGly
1160
HU 219 679 Β
Int. Cl.7: C 07 K 14/31
GACA7CAT7AAAG7GGCA7G5CCCACAACCGG7ACAG7AAAGA7AGAGGGT7A7AG7AAA 11X1 --------*---------------------------------------------♦ 1203 · A«pK«tIlely»ValAlaTrpPr©ThrSerGly7hiVellyiIleGlueiy7yrSerLys
ACAG7ACCATTAACTCTTAAAGG7GAACAGGTGGG7CAAGCAG7TA77ACACCAGACCGT 1201 ---------*---------♦-----------------------------♦---------- 1260
ThfY*lPreLtuThrValLy$Glj-GluGlnVilGlyClRAltVtllle7hrProAspGly
CCAACJATTACA77CAA7CAT/JJG7ACAAAAA77AAG7CA7G7TTCGGGA7TTCCAC/A 1261 ---------♦-----+---------------------------+---------♦ 1320
AlaThrZlíThrPhaAanAapLyaValGluLyiUuSerAípValStrClyPhaAlaGln
Tr*GAACTACAAGCAAGAAATTTAACGCAAACAAATAC7T7AGA7GACAAAG7AGCTACG 1321 -------------------------------------------------*---------* 1360
FhtClvV*lcinG2yArgAxnI.euThrCln7hrA«n7hrí.«uAípAjpI.yiValAl4Tkr ataacatctggcaazaaatcaacgaatgtzacggttcataaaagtgaagcgggaaca,
1361 ----------------------------*------—....................- 1440
IleThrStrtlyAínLyjSirThJAíOVtlThrValHisLysSerGluAlaGlyThr acggttcataaaagtgaagcgggaacagatatgctaccagaagatacGAOAcatgta 1441 — —---------———-----------------------*--------♦ 1500
SerSerValPheTyrTyrLysThrGlyAspMetLeuProGluAspThrThrEisVal
CCATGG7T7TTAAATA1TAACAATGAAAAAAG77ATGIATCGAAAGATA7TACTA7AAAG 1501 1560
ArsTrpPkaLeuAcnllcA<nAcnCluLysSer7ysVUSe;Ly<Acpllt7hrZlalyx
GA7CACA77CAAGG7GGACAGCACT7AGA7T7AAGCACAT7AAACAT7AA7G7GACAGGT 1561------+-------»-------------------------------------♦ 1620
AspSlnZleGlnGlyGlyGlnGlnLeuArpltuStrThrL'tuAfnZleAtr.Ytl.ThrGly *
ACACATA6CAATTA7TA7AGTGGACAAACTGCAArZACTGA7T77CAAAAACCCTT7CCA 1621 1660 ThrKÍJSerAjn7yrTyrSerGlyGlnStrAlille7hrArp?heGluLysAla?he?ro
CGTTCTAAAATAACTC77GATAATACGAACAACACAATTGA7ffTAACAATTCCACAACCC 1661 1740
GlySerLysIlaTTirValAcpAsnThrLyxAsnThrZleAtpValThrXleProGlnGly
TA7GGG?CA7A7AATAGTTTTTCAATTAACTACAAAACCAAAATTACGAATGAACAGCAA 1741 1800
TyrGlySct7yrAsnScrrhtSeslleA(»TyrLysThrLysZl«7hrAf.-)GluGlnGln
Hindin
AAACAG777GnAATAA7TCACÁÁGCÍfGCTATCAAGAGCATGGTAAGGAACAAGTCAAC 1801 -----------------♦----------------------------♦---------- 1660
LyíGlv?heValA«nAM5»rGÍnAl*Tr?TyrClnGlu51sGlyl,ysGluCluValAsn
GGGAAA7CATTTAATCATAC7GTGCACAATATTAATGC7AATGCCGGTAT7GAAGG7ACT 1861 +—————————+—————————— 1920
GlyLysScrPheAsnai jTirValElsAinlleAir-AltAínAliGlylleGluGlyThr
C7AAAACC7GAA7TAAAAG7777AAAACAGGATAAAGA7ACCAACGC7CCTA7AGC7AA7 1921 ---------·-------------------------------------------------- 1960
ValLysGlyGluUuLyaYalLeuLycGlnAcpLyxAapThrLytAltProZlaAlaAsn
G7AAAA7T?AÁACTT7C7AAAAAAGA?GCA7CAG77G7AAAGGACAA7CAAAAAGAAA7?
1931 -------------------♦-------------------·---------♦---------. 2040
ValLys?heLytLeuScrl.ysLysAspGlySerVAlVally<AspAa»G2ntysGluZle , GACA77A7AACAGA7GCAAACGG7A77CC7AATA77AAACCC77GCC7AG7CGAGAC7A7 2041 -------------------...-------------------------------------+ 2100
GluZltlltThrAtpAlaAjnGlylleAliAsnllelysAlALeuProSerClyAípTyr
A77TTA-AAACAAA7ACACCCCCCACCACC:7A7ACA777Ca7AAG5AW.aCAA?A7CCG
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás kollagénkötő fehérje vagy polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a kollagénkötő fehéijét kódoló gént E. coliban kifejezzük és affinitáskromatográfiás tisztításnak vetjük alá.
3. ÁBRA
HU 219 679 Β
Int. Cl.7: C 07 K 14/31 inkubólási idő (óra ) hozzáadott Fab ( pg )
HU 219 679 B
Int. Cl.7: C 07 K 14/31 rögződött gyöngyök/mm2(χ 103 ),125l-kollagénnel kötött(cpmxlO3)
5.ÁBRA
HU 219 679 B
Int. Cl.7: C 07 K 14/31 <ΡΙ·’εεΚ .....................— Hl «μ···········»»···*·······»·· WS>DId
e.
3. Kémiai szintézises eljárás kollagénkötő fehéije vagy polipeptid előállítására, amely legalább egy alábbi aminosavszekvenciát tartalmaz:
Al a
Ar gAs plleSerSerTh rAsnVaIThrAs pLeuTh rValSerProSerLysI1eGluAsp GlyGlyLysThrThrVa1Ly sMe tThr PheAspAspLy sAsnGlyLys11eGlnAsnGly AspMe 111eLysVa1A1aTr pPr oThrSe rGlyThrVaILys11eGluGlyTyrSe rLys Th rVa 1Pr oLeuThrVa1Ly sGlyGluGlnVa1G1yGlnAlaVa1I1eTh r Pr oAs pGly Al aThr11eThrPheAsnAspLysVa1G1uLysLeuSe rAspVa1 Se rGlyPheAlaGlu PheGluVa1G1nGlyAr gAsnLeuTh rGlnTh rAsnTh rLeuAs pAs pLy sVa1AlaThr I1eTh r Se rGlyAsnLy sSe rThrAsnVa1I1eGlyTr p11eLy sVa1Ly sAr gGluPr o Va 1Va1PheLeuI1eAsnLy sSe rGlyLy s11eCy sTyrGlnGluAspThrThrHi sVa1 Ar gTrpPheLeuAsn11eAsnAsnGluLysSe rTyrVa1 Se rLy sAspI1eThrI1eLys AspGlη 11eGlnGlyGlyGlnGlnLeuAspLeuSe rThrLeuAsη 11eAsnVaIThrGIy Th rHi sSe rAsnTyrTyr Se rGlyGlnSe rAla I1eTh rAs pPheGluLy sAlaPhePr o GlySerLysIleThrValAs pAsnThrLy sAsnTh r11eAs pVaITh rI1ePr oGlnGly TyrGlySerTyrAsnSerPheSerI1eAsnTy rLy sTh rLy sI1eTh rAsnGluGlnGln LysGluPheVa 1 AsnAsnSe rGl nAl aTr pTy rGl nGl uHi sGl yLy sGl uGl uVa 1 Asn
HU 219 679 Β
Gl yLy sSe r PheAsnHi sThrValHisAsnI1eAs nAlaAsnAlaGlyI1eGluGlyTh r Va 1Ly sGlyGluLeuLy sVa1LeuLysGlnAspLy sAs pTh rLy sAlaPr ο 11eAlaAs n ValLysPheLysLeuSerLysLysAspGlySerValValLy sAspAs nGlnLysGIulle Gl u11eI1eThrAspAlaAsnGlyl1eAlaAsnIleLysAlaLeuProSerGlyAspTyr
I 1eLeuLysGlu11eGluAlaPr oArgPr oTyrThrPheAspLysAspLysGluTyrPr o PheTh rMe tLy sAs pTh rAs pAsnGlnGlyTyr PheTh rTh rí 1eGluAsnAlaLy sAla 11eGluLy sTh rLy sAspVa1 Se rAlaGlnLy sValTrpGluGlyThrGlnLy sVa ILy s ProThrI1eTyrPheLysLeuTyrLysGlnAspAspAsnGlnAsnThrThrProValAsp LysAlaGluI1eLysLy sLeuGluAspGlyThrThrLysVaITh rTr pSe rAsnLeuPr o Gl uAsnAs pLysAsnGlyLysAla I1eLy sTy rLeuVa1Ly sGluValAsnAlaGlnGly Gl uAspTh rTh r Pr oGluGlyTyrThrLysLysGluAsnGlyLeuVa1VaIThrAsnTh r Gl uLy s Pr ο I1eGluTh rTh rSerlleSerGlyGluLy sVa1T r pAspAs pLy sAs pAsn Gl nAs pGlyLy sAr gPr oGluLy sVa1 Se rVa1As nLeuLeuAlaAsnGlyGluLy sVa1 LysTh rLeuAs pVa1Th r Se rGluTh rAsnTr pLy sTyrGluPheLy sAs pLeuPr oLy s Ty rAs pGl uGl yLy sLy sí 1 eGl uTy rTh rVa ITh rGl uAs pHi sVa 1 Ly sAs pTy rThr ThrAspI 1 eAs nGl yTh rThr I 1 eThrAsnLy sTy rThrPr oGl yGl uThrSe rAl aThr Va IThrLysAsnTrpAspAspAsnAsnAsnGlnAspGlyLysArgPr oThrGlu11eLys Va 1G1 uLeuTy rGlnAspGlyLy sAlaTh rGlyLy sTh rAlaThrLeuAsnGluSe rAs n AsnTr pThrHi sTh rTr pTh rGl yLeuAs pGl uLy sAl aLy sGl yGl nGl nVa ILy sTy r ThrVa 1G1uGluLeuThrLysVaILysGlyTyrThrThrHi sValAspAsnAsnAspMe t Gl yAsnLeuI1eVa1Th rAsnLy sTyrTh r Pr oGluTh rTh rSerlleSerGlyGluLy s Va 1Tr pAs pAs pLy sAs pAsnGlnAs pGlyLysArgPr oGluLy sValSerValAsnLeu LeuAl aAspGlyGluLy sVa1Ly sTh rLeuAs pVaIThrSerGluThrAsnTrpLysTyr GluPheLysAs pLeuPr oLy sTy rAs pGluGlyLy sLy sí 1eGluTyrThrVaIThrGlu AspHi sValLysAspTyrThrThrAspI1eAsnGlyTh rTh ríleThrAsnLysTyrThr ProGlyGluThrSerAlaThrVaIThrLysAsnTrpAspAspAsnAsnAsnGlnAspGly LysArgProThrGluIleLysValGluLeuTyrGlnAs pGlyLysAlaThrGlyLysThr Al aTh rLeuAs nGl uSe r AsnAsnT r pTh rHi sTh rTr pTh rGl yLeuAs pGl uLy sAl a LysGl yGlnGlnVa1Ly sTyrThrVa1G1uGluLeuTh rLy sVa1Ly sGlyTyrThrTh r Hi sVa1As pAs nAs nAs pMe tGlyAs nLeu11eVa1Th rAs nLy sTy rThr Pr oGluTh r Th rSerlleSerGlyGluLy sVa1Tr pAs pAs pLy sAspAsnGlnAs pGlyLysArgPro Gl uLysVa1 Se rValAsnLeuLeuAlaAsnGlyGluLysVaILysThrLeuAspVaIThr Se rGluThrAsnTr pLy sTyrGluPheLy sAs pLeuPr oLy sTy rAs pGluGlyLy sLy s
II eGl uTyrThrVaIThrGIuAspHi sVaILysAspTyrThrThrAspI1eAsnGlyThr ThrlleThrAsnLysTyrThrProGlyGluThrSerAlaThrValThrLysAsnTr pAs p AspAsnAsnAsnGlnAspGlyLysArgPr oThrGlu11eLysVa1G1uLeuTyrGlnAsp GlyLysAlaThrGlyLysThrAlal1eLeuAsnGluSe rAsnAsnT r pThrHi sThrTr p ThrGl yLeuAs pGluLy sAlaLy sGlyGlnGlnVa1Ly sTy rThrValAs pGluLeuTh r Ly sVa lAsnGlyTyrTh rTh rHi sVa1AspAsnAsnAs pMe tGlyAsnLeu11eVaITh r AsnLysTyrThrProLysLysProAsnLysProI1eTyrProGluLysProLysAspLys Thr Pr oPr oTh rLysPr oAspHi sSerAsnLysValLy s Pr oThr Pr oPr oAs pLys Pr o Se rLysVa1AspLy sAs pAs pGlnPr oLy sAspAsnLy sTh rLys Pr oGluAsnPr oLeu Ly sGl uLeuPr oLy sTh rGlyMe tLysIlelleThrSerTrpIleThrTrpValPhelle GlylleLeuGlyLeuTyrLeülieLeuAr gLy sArgPheAsnSe r, azzal jellemezve, hogy az említett fehérjét vagy polipeptidet kódoló nukleotidszekvencián alapuló aminosavszekvenciát építünk fel a C-terminális szerintői kiindulva, amelyet lépésről lépésre reagáltatunk a megfelelő aminosavakkal és végül az N-terminális véget képező alaninnal.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás kollagénkötő fehéije előállítására, azzal jellemezve, hogy a fehérje kódolására az előbbiekben megadott nukleotidszekvenciát tartalmazó plazmidot vagy fágot alkal- 55 mázunk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pSAC104 jelű plazmidot alkalmazzuk, amely DSM 6199 számon van letétbe helyezve.
6. Eljárás kollagénkötő fehéijegén jelenlétének S. aureus klinikai izolátumaiban történő kimutatására alkalmas diagnosztikai eszköz előállítására, azzal jellemezve, hogy specifikus reagensként a kollagénkötő fe50 héijét kódoló DNS-szekvenciából ismert módon származtatott, az 5. igénypont szerinti plazmidban található szekvenciát alkalmazzuk.
7. Eljárás kollagénkötő fehéije jelenlétének kimutatására immunológiai módszerekkel, azzal jellemezve, hogy specifikus ligandumként az 5. igénypont szerinti plazmidban található kollagénkötő fehérjét kódoló DNS-szekvencia által kódolt fehérje elleni antikollagénkötőfehérje-antitesteket alkalmazunk.
HU 219 679 Β
8. Eljárás staphylococcusok tapadásának gátlására kollagénbevonatú mesterséges felületen, kollagén-, porc- és csontszöveten, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerinti plazmidban található kollagénkötő fehérjét kódoló DNS-szekvencia által kódolt fehérje el- 5 leni antikollagénkötőfehérje-antitesteket alkalmazunk.
9. Eljárás vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy immunogén anyagként az 5. igénypont szerinti plazmidban található kollagénkötő fehérjét kódoló DNS által kódolt fehérjét vagy ennek Staphylococcus elleni immunválasz kiváltására alkalmas részeit alkalmazzuk.
HU 219 679 Β
Int. Cl.7: C 07 K 14/31 <
eo
CŰ
ABRA
HU 219 679 Β
Int. Cl.7: C 07 K 14/31 a yektorwr-*. a p16-ban lévő κΓεεθ I beiktQtás 5'vége
GGA7CCCCAA7TCr777AAM.CTAGAAAT7CACCCATTr77CT7GATGATTCGTCrmG
--------♦---------*---------------------------------------- fcQ ctttccaaccaaatcattcaca/^ctgatttcataattccgaacatcattccaccaccac frl --------1---------*--------------*--------+ 120
C0G0GG7AT7A.CT7GCTG7AGCAGGCGCTAGAAT7AAA7CTACACCGAGGATAGAATAGG
121 ---------4--------------------♦———4-----------—...... ISO
CTAAACC7AA7G77T7TTTACCAAA7AAT77GAGGAAATCAAC7GCGA7A0GTCTACCAA 161 ——---4—4____——4———♦-——-....4, 240
+•4· i + l
Irt
Ί3« <
oc co <
o
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törőcsik Zsuzsanna főosztályvezető-helyettes Windor Bt., Budapest
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9003374A SE9003374D0 (sv) | 1990-10-22 | 1990-10-22 | A collagen binding protein as well as its preparation |
| PCT/SE1991/000707 WO1992007002A1 (en) | 1990-10-22 | 1991-10-22 | A collagen binding protein as well as its preparation |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9202074D0 HU9202074D0 (en) | 1992-10-28 |
| HUT64369A HUT64369A (en) | 1993-12-28 |
| HU219679B true HU219679B (hu) | 2001-06-28 |
Family
ID=20380713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9202074A HU219679B (hu) | 1990-10-22 | 1991-10-22 | Eljárások kollagénkötő fehérje vagy polipeptid előállítására, kimutatására és alkalmazására |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0506923B1 (hu) |
| JP (1) | JPH05505943A (hu) |
| AT (1) | ATE139541T1 (hu) |
| AU (1) | AU652587B2 (hu) |
| CA (1) | CA2071950C (hu) |
| DE (1) | DE69120390T2 (hu) |
| DK (1) | DK0506923T3 (hu) |
| ES (1) | ES2090357T3 (hu) |
| FI (1) | FI105333B (hu) |
| GR (1) | GR3020997T3 (hu) |
| HU (1) | HU219679B (hu) |
| IE (1) | IE76292B1 (hu) |
| NO (2) | NO922421L (hu) |
| SE (1) | SE9003374D0 (hu) |
| WO (1) | WO1992007002A1 (hu) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5648240A (en) * | 1994-05-24 | 1997-07-15 | Texas A&M University | MHC II analog from Staphylococcus aureus |
| US5700928A (en) * | 1995-10-16 | 1997-12-23 | Smithkline Beecham, P.L.C. | Polynucleotide encoding saliva binding protein |
| US6013482A (en) | 1996-10-15 | 2000-01-11 | Smithkline Beecham Plc | Cell surface protein compounds |
| EP0859845A1 (en) * | 1995-10-16 | 1998-08-26 | Smithkline Beecham Plc | Novel cell surface protein compounds |
| ATE309271T1 (de) * | 1996-05-16 | 2005-11-15 | Texas A & M Univ Sys | Zusammensetzungen von kollagenbindungsprotein und verfahren zur deren verwendungen |
| US5882871A (en) * | 1996-09-24 | 1999-03-16 | Smithkline Beecham Corporation | Saliva binding protein |
| US6692739B1 (en) | 1998-08-31 | 2004-02-17 | Inhibitex, Inc. | Staphylococcal immunotherapeutics via donor selection and donor stimulation |
| US6908994B1 (en) | 1999-05-10 | 2005-06-21 | The Texas A&M University System | Collagen-binding proteins from enterococcal bacteria |
| WO2004032957A1 (en) | 2002-10-11 | 2004-04-22 | Bengt Guss | Immunization of non-human mammals against streptococcus equi |
| AU2008336295B2 (en) | 2007-12-13 | 2013-07-11 | Intervacc Ab | Improved immunizing composition |
| CN112225820B (zh) * | 2020-10-21 | 2023-01-17 | 中美福源生物技术(北京)股份有限公司 | 肿瘤特异靶向性基质的重组人血清白蛋白-胶原结合域融合蛋白和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE454403B (sv) * | 1984-05-30 | 1988-05-02 | Alfa Laval Agri Int | Anvendning av ett cellyteprotein med fibronektin-, fibrinogen-, kollagen-, och/eller lamininbindande egenskaper vid framstellning av sarbehandlingsmedel |
-
1990
- 1990-10-22 SE SE9003374A patent/SE9003374D0/xx unknown
-
1991
- 1991-10-22 EP EP91918842A patent/EP0506923B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-22 AU AU87518/91A patent/AU652587B2/en not_active Expired
- 1991-10-22 WO PCT/SE1991/000707 patent/WO1992007002A1/en active IP Right Grant
- 1991-10-22 AT AT91918842T patent/ATE139541T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-22 IE IE369491A patent/IE76292B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-10-22 DE DE69120390T patent/DE69120390T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-22 JP JP91517169A patent/JPH05505943A/ja active Pending
- 1991-10-22 DK DK91918842.5T patent/DK0506923T3/da active
- 1991-10-22 ES ES91918842T patent/ES2090357T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-22 HU HU9202074A patent/HU219679B/hu unknown
- 1991-10-22 CA CA002071950A patent/CA2071950C/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-06-18 FI FI922865A patent/FI105333B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-06-19 NO NO92922421A patent/NO922421L/no unknown
-
1996
- 1996-09-12 GR GR960402347T patent/GR3020997T3/el unknown
-
1997
- 1997-01-10 NO NO970113A patent/NO970113D0/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO922421D0 (no) | 1992-06-19 |
| DE69120390T2 (de) | 1997-01-16 |
| AU8751891A (en) | 1992-05-20 |
| CA2071950C (en) | 2007-08-21 |
| EP0506923B1 (en) | 1996-06-19 |
| ES2090357T3 (es) | 1996-10-16 |
| IE913694A1 (en) | 1992-11-18 |
| JPH05505943A (ja) | 1993-09-02 |
| HU9202074D0 (en) | 1992-10-28 |
| AU652587B2 (en) | 1994-09-01 |
| DE69120390D1 (de) | 1996-07-25 |
| NO970113L (no) | 1997-01-10 |
| EP0506923A1 (en) | 1992-10-07 |
| ATE139541T1 (de) | 1996-07-15 |
| FI922865A0 (fi) | 1992-06-18 |
| NO970113D0 (no) | 1997-01-10 |
| IE76292B1 (en) | 1997-10-08 |
| SE9003374D0 (sv) | 1990-10-22 |
| WO1992007002A1 (en) | 1992-04-30 |
| NO922421L (no) | 1992-08-20 |
| GR3020997T3 (en) | 1996-12-31 |
| DK0506923T3 (da) | 1996-10-28 |
| CA2071950A1 (en) | 1992-04-23 |
| FI105333B (fi) | 2000-07-31 |
| HUT64369A (en) | 1993-12-28 |
| FI922865A (fi) | 1992-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100871330B1 (ko) | 응고효소 음성 포도상구균 유래의 폴리펩타이드 및폴리뉴클레오타이드 | |
| FI102768B (fi) | Hybridi-DNA-molekyyli ja menetelmä fibronektiiniä sitovan proteiinin v almistamiseksi | |
| JP4486748B2 (ja) | 黄色ブドウ球菌由来の細胞外マトリックス結合タンパク質 | |
| AU628339B2 (en) | Fibronectin binding protein | |
| US5851794A (en) | Collagen binding protein as well as its preparation | |
| WO1994006830A1 (en) | Fibrinogen binding protein | |
| JP4173549B2 (ja) | コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に由来する、新規フィブリノーゲン結合たん白質 | |
| HU219679B (hu) | Eljárások kollagénkötő fehérje vagy polipeptid előállítására, kimutatására és alkalmazására | |
| WO1997008553A1 (en) | Targeting of proteins to the cell wall of gram-positive bacteria | |
| US6277381B1 (en) | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of Ehrlichia infection | |
| EP1261631A1 (en) | A 52 kDa PROTEIN FROM COAGULASE NEGATIVE STAPHYLOCOCCI AND FRAGMENTS THEREOF | |
| EP1613642A2 (en) | Staphylococcus aureus efb protein and c3 binding region which inhibit complement activation | |
| EP0942982A1 (en) | Bacterial elastin binding protein, nucleic acid sequence encoding same and diagnostic and therapeutic methods of use thereof | |
| WO1994010330A9 (en) | Fibronectin binding protein as well as its preparation | |
| JPH10201484A (ja) | 新規ＦｔｓＬ | |
| US20040014178A1 (en) | Von willebrand factor-binding proteins from staphylococci | |
| CA2324981A1 (en) | Peptides | |
| Davis | Studies of the structure and function of a fibrinogen binding MSCRAMM from Staphylococcus epidermidis |