FI101542B - Kemiallinen syntetointimenetelmä fibronektiiniä sitovan proteiinin tai polypeptidin valmistamiseksi - Google Patents

Description

, 101542

Kemiallinen syntetointimenetelmä fibronektiiniä sitovan proteiinin tai polypeptidin valmistamiseksi 5 Tämä hakemus on jakamalla erotettu kantahakemuksesta FI-882562.

Esillä oleva keksintö kohdistuu fibronektiiniä sitovaan proteiiniin sekä hybridi-DNA-molekyyleihin, esim. plasmideihin tai faageihin, jotka käsittävät nukleotidi-sekvenssin, joka koodaa sanottua proteiinia. Lisäksi keksintö kohdistuu mikro-10 organismeihin, jotka käsittävät sanottuja molekyylejä, ja niiden käyttöön sanottuja proteiineja valmistettaessa sekä sanotun proteiinin synteettiseen valmistamiseen.

Esillä olevan keksinnön kohteena on saada aikaan minimaalinen fibronektiiniä sitova proteiini.

15

Lisäksi kohteena on saada aikaan sanottu proteiini geenitekniikalla käyttämällä esim. plasmidia, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodaa sanottua proteiinia.

20 Lisäksi kohteena on . saada aikaan mahdollisuus valmistaa sanottua proteiinia kemiallisella synteesillä.

Muut kohteet ilmenevät seuraavasta selityksestä.

25 WO-A1-85/05553 selostaa bakteerisolupintaproteiineja, joilla on fibronektiiniä, fibrinogeeniä, kollageeniä ja/tai laminiinia sitova kyky. Täten on osoitettu, että eri bakteereilla on kyky sitoutua fibronektiiniin, fibrinogeeniin, kollageeniin ja/tai la-miniiniin. Lisäksi on osoitettu, että fibronektiiniä sitovan proteiinin molekyylipaino on 165 kD ja/tai 87 kD, joten on oletettavissa, että pienempi proteiini on suurem-30 man osa.

Fibronektiini on suuri glykoproteiini (Mr suunnilleen 450 kD), jossa on kaksi samanlaista alayksikköä, joiden molekyylikoko voi vaihdella riippuen prekursori-mRNA:n (1) kompleksiliitoskaavasta. Fibronektiinin pääasiallinen funktio, jota 35 fibronektiiniä on löydetty ruumiinnesteistä, verihyyteistä ja solunulkoisista matrik-seista, näyttää olevan kohdistunut proteiinin kykyyn välittää useimpien eukaryootti-solujen substraattiadheesiota (2, 3, 4, 5).

2 101542

Seitsemänkymmentäluvun loppupuolella Kuusela havaitsi, että fibronektiini ei vain toimi yhdessä eukaryoottisolujen kanssa, vaan sitoutuu Staphylococcus aureuksen soluihin (6). Tästä havainnosta lähtien on lukuisten patogeenisten mikro-organismien osoitettu sitoutuvan fibronektiiniin suurella spesifisyystasolla ja suurella affi-5 niteetillä (7). Fibronektiini näyttää toimivan solunulkoisessa matriksissa myös erilaisten mikro-organismien kasvualustana. Fibronektiiniin sitoutuminen on monille mikro-organismeille ratkaiseva vaihe isännän kudoksen asuttamisessa ja tulehduksen kehittämisessä.

10 Useita erilaisia solupintakomponentteja on havaittu fibronektiinireseptoreiksi Gram-positiivisissa bakteereissa lipotekiohapot (8, 9) ja proteiini (10) mukaanlukien. Aikaisemmissa tutkimuksissa fibronektiiniä sitova proteiini, jonka Mr on 197-210 kD, on eristetty S.aureus-lajista Newman (11, 12) ja se on identifioitu kokeellisesti fibronektiinireseptoriksi. Tämän fibronektiiniä sitovan proteiinin, joka 15 on peräisin S. aureuksesta, lisäluonnehtimiseksi kloonattiin tätä proteiinia varten oleva geeni E. colissa. Tässä proteiinissa oleva fibronektiiniä sitova alue on myös paikallistettu ja tämän domeenin sisältävän fuusioproteiinin ja proteiini A:n lgG:tä sitovien alueiden käyttäytymistä selostetaan jäljempänä.

20 Nyt on yllättäen havaittu mahdolliseksi ottaa talteen hybridi-DNA-molekyyli, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodaa proteiinia tai polypeptidiä, jolla on fibronektiiniä sitovia ominaisuuksia. Todisteena tästä on seuraavanlainen nukleotidi-sekvenssi läsnä geenissä, joka koodaa sanottua proteiinia: 9

: 25 GGC CAA AAT AGC GGT AAC CAG TCA TTC GAG GAA GAC ACA GAA GAA

GAC AAA CCT AAA TAT GAA CAA GGT GGC AAT ATC GTA GAT ATC GAT

TTT GAT AGT GTA CCT CAA ATT CAT GGT CAA AAT AAA GGT AAT CAG

TCA TTC GAG GAA GAT ACA GAA AAA GAC AAA CCT AAG TAT GAA CAT

GGC GGT AAC ATC ATT GAT ATC GAC TTC GAC AGT GTG CCA CAT ATT

30 CAC GGA TTC AAT AAG CAC ACT GAA ATT ATT GAA GAA GAT ACA AAT

AAA GAT AAA CCA AGT TAT CAA TTC GGT GGA CAC AAT AGT GTT GAC

TTT GAA GAA GAT ACA CTT CCA AAA GTA AGC GGC CAA AAT GAA GGT

CAA CAA AGC ATT GAA GAA GAT ACA ACA CCT CCA ATC GTG CCA CCA

ACG CCA CCG ACA CCA GAA GTA CCA AGT GAG CCG GAA ACA CCA ACG

35 CCA CCA ACA CCA GAA GTA CCA AGT GAG CCG GAA ACA CCA ACA CCA

CCG ACA CCA GAA GTG CCG AGT GAG CCA GAA ACT CCA ACA CCG CCA

ACA CCA GAG GTA CCA GCT

3 101542

Keksintö käsittää lisäksi plasmidin tai faagin, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodaa sanottua fibronektiiniä sitovaa proteiinia.

Keksintö käsittää lisäksi mikro-organismin, joka käsittää vähintään yhden edellä 5 esitetyn mukaisen hybridi-DNA-molekyylin.

Keksintö käsittää lisäksi menetelmän fibronektiiniä sitovan proteiinin valmistamiseksi, jossa menetelmässä vähintään yksi edellä esitetty hybridi-DNA-molekyyli viedään mikro-organismiin, viljellään sanottua mikro-organismia viljelyväliainees-10 sa, ja eristetään täten muodostunut proteiini liukenemattomaan kantoaineeseen sitoutuneesta fibronektiinistä tehdyn affiniteettikromatografian avulla, jota seuraa ioninvaihtokromatografia.

Lisäksi keksintö käsittää fibronektiiniä sitovan proteiinin kemiallisen synteesin, 15 jossa luodaan aminohapposekvenssi, joka perustuu sanottuun nukleotidisekvens-siin, joka koodittaa sanottua proteiinia, lähtien C-terminaalisesta histidiinistä, joka reagoitetaan vaiheittain sopivan aminohapon kanssa, jolloin se lopulta reagoitetaan N-terminaalisessa päässä olevan glysiinin kanssa fibronektiiniä sitovan peptidialu-een muodostamiseksi.

20

Sopivat kantajaproteiinit voidaan liittää aminohapposekvenssiin samoin, kuten pro-teiini-A:n IgG:tä sitovat alueet.

Kuvio IA esittää affiniteettikromatografiaa fibronektiini-Sepharosella.

25 Lysaattiin (86) ml, joka saatiin E. coli -kloonin pFROOl kylmällä osmoottisella shokilla, sekoitettiin 29 ml 2 M ammoniumasetaattia. Näyte levitettiin sitten kolonniin (1,9 x 5,7 cm), joka oli tasapainotettu 0,5 M ammoniumasetaatilla 50 ml/h virtausnopeudella. Näytteen levittämisen jälkeen kolonni pestiin viidellä kolonnitila-vuudella 0,5 M ammoniumasetaattia 20 ml/h virtausnopeudella. Samaan aikaan 30 UV-monitorin herkkyys kasvoi viiden kertoimella. 200 ja 220 ml:n välille eluoituva : materiaali kerättiin, neutraloitiin ammoniumhydroksidilla ja dialysoitiin 10 mM

ammoniumasetaattia vasten, pH 7,6.

Kuvio 1 B esittää ioninvaihtokromatografiaa.

35 Esimerkissä IA kuvattu affiniteettikromatografiasta dialysoitu materiaalinäyte (10 ml) levitettiin 1 ml Mono Q (Pharmacia, Ruotsi) -anionikolonniin, joka oli tasapainotettu 10 mM ammoniumasetaatilla, pH 7,6. Virtausnopeus oli 2 ml/min ja kolon- 4 101542 ni elutoitiin vuorauksen lisäyksellä 25 mM per mooli ammoniumasetaattipitoisuu-dessa. Kaksi huippua (I ja II) yhdistettiin, kuten kuviossa on osoitettu.

Kuvio 2 esittää E. coli pFR001:n osmoottinen shokki -lysaatin erilaisista puhdistus-5 vaiheista peräisin olevien materiaalien polyakryyliamidigeelielektroforeesia. Materiaali levitettiin (kaista 1) affiniteettikolonniin (fibronektiini-Sepharose) adsor-boimaton (kaista 2) ja adsorboitu (kaista 3) materiaali. Affiniteetilla puhdistetun materiaalin ioninvaihtokromatografia Mono Q FPLC -kolonni (Pharmacia, Ruotsi): yhdistelmä I (kaista 4) ja yhdistelmä II (kaista 5,) kuten kuviossa IB on merkitty.

10

Kuvio 3 esittää pFR001:een liitetyn liitoksen restriktiokarttaa, subklooneja ja de-leetioita.

(A) 6,5 ke:n liitoksen restriktiokartta. (B) erilaisia subklooneja, jotka on konstruoitu geenin alueen määrittämiseksi, joka alue koodaa fibronektiiniä sitovaa toimin-15 taa. (C) deleetioita, jotka on tehty joko EcoRI-Pstl-fragmentin 3'- tai 5'-päästä käsittelemällä eksonukleaasilla Bal31 (katso selostusta yksityiskohtia varten). Erilaisten geenituotteiden fibronektiiniä sitova toiminta on osoitettu.

Kuvio 4 esittää ZZ-FR-proteiinin polyakryyliamidigeelielektroforeesia.

20 Proteiini A (Sigma Chemial Co, St. Louis; kaista A) ja ZZ-FR-fuusioproteiini (kaista B) redusoitiin ja alistettiin elektroforeesiin SDS:ssä 5-15-%:isella polyak-ryyliamidigeelillä. Geeli värjättiin lisäksi Coomassie bluella. Kaistoissa C & D fraktionoitiin ZZ-FR-fuusioproteiini ja proteiini A vastaavasti SDS-elektroforeesil-la 5-9-%:isella polyakryyliamidigeelillä, sähkötäplitettiin selluloosanitraattipaperil-25 le ja testattiin 1251-merkityllä 29 kD:n fibronektiinifragmentilla, kuten on selostettu (Fröman et ai., 1987). Nuolet osoittavat tunnetun molekyylipainon standardiproteii-nien migraatioetäisyyttä.

Kuvio 5 esittää ZZ-FR-proteiinin affmiteettikromatografiaa.

30 ZZ-FR-fuusioproteiinia (0,6 mg; ruutu A) ja proteiinia A (Sigma Chemical Co; 0,5 mg, ruutu B) levitettiin 7 ml Sepharose 4B CL -kolonniin, joka oli substituoitu 29 kD fibronektiinifragmentilla. Kolonni pestiin 0,5 M NaCl PBS:ssä ja eluoitiin lisäksi 6 M GuHCl PBSrssä. 2 ml:n fraktiot kerättiin ja proteiini testattiin käyttämällä BioRad-järjestelmää.

Kuvio 6 esittää ZZ-FR-fuusioproteiinivalmisteen, joka on ffaktionoitu affiniteetti-kromatografialla, polyakryyliamidigeelielektroforeesia.

35 5 101542

Materiaali, joka ei ollut sitoutunut (kaista A) ja joka oli sitoutunut sekä elutoitu (kaista B) vastaavasti, ja joka oli peräisin 29 kD affiniteettikolonnista, analysoitiin SDS-geelielektroforeesilla 5-15-%:isilla polyakryyliamidigeeleillä. Geelit värjättiin lisäksi Coomassie bluella. Nuolet osoittavat tunnetun molekyylipainon standardi-5 proteiinien migraatioetäisyyttä.

Kuvio 7 esittää sitoutumisen bakteerisoluihin.

Lajin Newman (ruutu A) tai lajin 8325-4 stafylokokki-soluja (5x107) inkuboitiin 5x104 cpm:llä 1251-merkittyä intaktia fibronektiiniä (o-o) tai 29 kD N-terminaalis-10 ta fibronektiinifragmenttiä (Δ-Δ) PSBissä, jota oli täydennetty 0,1 %:lla BSA:ta ja 0,1 %:lla Tween^ 80 0,5 ml:n kokonaispitoisuudessa 1 tunti ZZ-FR-fuusioproteii-nin tai proteiinin A (·-·) lisääntyvien määrien läsnäollessa. Katso käytetyn sitoutumistestin lisäyksityiskohtia Fröman et ai. (1987). 125i_merkjtyn radioaktiivisuuden määrät, jotka liittyivät bakteerisoluihin määriteltiin ja fibronektiinin sitoutumisen 15 laajuus laskettiin. Sata prosenttia sitoutumista edustaa 125i_iigandin sitoutumista bakteereihin inhiboivan proteiinin puuttuessa ja 0 % sitoutumista vastaa radioaktiivisuutta, joka on mitattu inkubaatioseoksista, joissa ei ole bakteereita.

Kuvio 8A esittää nukleotidisekvenssiä, joka koodaa fibronektiiniä sitovaa proteii-20 nia.

Nukleotidisekvenssi, joka koodaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia vastaavine ami-nohappoineen, esitetään. Erilaiset 38 aminohappotoisteet on merkitty samoin kuin seuraavien lähes neljän täydellisen 14 aminohappotoisteen. Restriktiopaikat Ball-HincII-PvuII on merkitty kuvioon samoin kuin aminohapposekvenssit, jotka vastaa-: 25 vat erilaisia nukleotidisekvenssejä.

Kuvio 9 esittää kemiallisesti syntetoidun polypeptidin fibronektiiniä sitovaa kykyä. Testattiin esimerkin 2 mukaisesti syntetoidun 38 aminohappotähdepolypeptidin fibronektiiniä sitova kyky yhdessä sanotun polypeptidin fragmenttien fibronektiiniä 30 sitovan kyvyn kanssa. (*-*) tarkoittaa polypeptidiä, joka vastaa aminohapposek- • _ _ venssin 38(2)-toistoa; (0-0) tarkoittaa polypeptidiä, joka vastaa aminohapposekvenssin aminohappoja 1-19; (o-o) tarkoittaa polypeptidiä, joka vastaa aminohapposekvenssin aminohappoja 20-38; (Δ-Δ) tarkoittaa polypeptidiä, joka vastaa aminohapposekvenssin aminohappoja no 9-30; ja (---) polypeptidiseosta, joka käsittää 35 aminohappojen 1-19, aminohappojen 20-38 ja aminohappojen 9-30 polypeptidit. Sitoutumiskyky on merkitty prosenteissa lisätyn polypeptidin pg:tä kohti.

6 101542

Keksintöä selostetaan seuraavassa viitaten annettuihin esimerkkeihin, jotka eivät kuitenkaan rajoita sitä.

Esimerkki 1 5 Geenipankin seulonta fibronektiiniä sitovaa proteiinia varten (FNBP)

Staphylococcus aureus -lajista (8325-4) peräisin olevan kromosomaalisen DNA:n plasmidissa pBR322 oleva geenipankki, joka on kuvattu aikaisemmin (13):ssa, seulottiin FNBPrtä ilmentäviä klooneja varten. E. coli -kloonit lysoitiin ja lysaattien kyky inhiboida 125i-fibronektiinin sitoutumista S. aureus -soluihin Cowan I testat-10 Uin, kuten menetelmäkappaleessa kuvattiin. Seulonnan yksinkertaistamiseksi kloonit jaettiin 25 erään, lysoitiin ja testattiin. Kun 22 erää oli testattu, se, jolla oli suurin inhiboiva toiminta testattiin uudelleen 5:n 5:nä eränä. Lopuksi testattiin positiivisen erän yksittäiset kloonit, ja sitä seurasi yhden yksittäisen positiivisen kloonin eristäminen. Positiivisessa kloonissa oleva plasmidi nimitettiin pFROOLksi. 15 Tämä plasmidi pFROOl on tallennettu E. coli -lajissa 259 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM):iin ja on sieltä saatavissa tallennenumerolla 4124.

Stafvlokokkiperäisen FNBP:n eristäminen E. colista 20 E. coli -kloonia, joka on FNBP-positiivinen, viljeltiin LB-väliaineessa 37°C:ssa muuttumattomaan kasvufaasiin. Bakteerisolut sentrifugoitiin ja lysoitiin osmoottisella shokkimenetelmällä (14). Sen poissulkemiseksi että shokkilysaatin inhiboiva toiminta 125i.fj|)ronejctijnjn sitoutumiseen S. aureus -soluihin johtuisi proteolyytti-sestä vaikutuksesta, lysaatti lisättiin inkubointiseokseen, ja S. aureukseen sitoutu-25 neen 125määrä määritettiin 1, 2, 3, ja 4 tunnin inkuboinnin jälkeen.

Tämän inkubointijakson avulla lysaatin aiheuttama inhibitiotaso jäi vakaaksi (esim. 50 %) osoittaen, että inhibitio ei johtunut 125i_mer]Qtyn Ugandin tai vastaavan reseptorin kehittyvästä degradaatiosta.

30 Jos inhiboiva toiminta johtuu lysaatissa läsnäolevien FNBP-kaltaisten rakenteiden läsnäolosta, niiden pitäisi osoittaa spesifistä affiniteettia fibronektiiniin. Lysaatti analysoitiin sen tähden affiniteettikromatografialla fibronektiini-Sepharose-pylvääl-lä, kuten Materiaaleissa ja menetelmissä (kuvio IA) on kuvattu. Puhdistus oli noin 30-kertainen. Lisäfraktionoiminen saatiin alistamalla affiniteettipuhdistettu materi-35 aali ioninvaihtokromatografiaan käyttämällä mono Q- pylvästä sovitettuna FPLC-järjestelmään. Tässä fraktionointivaiheessa saatiin kaksi suurempaa huippua (kuvio IB). Analyysit polyakryyliamidigeelielektroforeesilla osoittivat, että nämä kaksi huippua sisälsivät proteiineja, joiden molekyylipainot olivat vastaavasti 165 ja 87 7 101542 kD (kuvio 2). Molemmat komponentit inhiboivat l^I-fibronektiinin sitoumista S. aureukseen. Fraktiolla, joka sisälsi 165 kd:n proteiinin, oli 220 yksikköä/qg:n spe-sifmen inhibointitoiminta, joka osoittaa 430-kertaisen puhdistumisen alkuperäisestä shokkilysaatista ja se oli 30 kertaa aktiivisempaa, kuin 87 kD:n proteiini moolipe-5 rustalla (tietoa ei esitetty).

Näiden kahden proteiinin aminohappoanalyysi osoitti, että niillä oli hyvin samanlainen aminohappokoostumus, joka myös muistutti tarkalleen sitä, mikä on määritetty luonnolliselle FNBP.lle, joka on eristetty S. aureus -lajista Newman (taulukko 10 1). E. colista pFROOl eristetyn 165 kD:n proteiinin immunologinen suhde luonnol liseen S. aureus -lajista Newman eristettyyn FNBP:hen analysoitiin. 165 kD:n proteiini l^I-merkittiin ja immunopresipitoitiin S. aureus -lajin Newman vasta-aineen kasvavilla laimennoksilla. Vastaseerumin 300-kertainen laimennus presipitoi 50 % 125I-merkitystä proteiinista. Merkitsemättömät 165 ja 87 kD proteiinit sekä luon-15 nollinen FNBP ehkäisivät merkityn 165 kD:n proteiinin immunopresipitaatiota (tietoa ei esitetty). Nämä havainnot osoittavat, että S. aureus -lajista Newman eristetyt 165 ja 87 kD:n proteiinit ovat läheistä sukua fibronektiiniä sitovalle proteiinille (FNBP).

20 fnbp-geenin sitovaa toimintaa koodaavan alueen identifiointi

Liitoksen koko plasmidissa pFROOl on noin 6,5 kep. Liitoksen restriktiokartta on osoitettu kuviossa 3(A). Transkriptiosuunnan määrittämiseksi ja sitovaa toimintaa koodaavan alueen paikallistamiseksi noin 3,7 kep Pstl-ffagmentti uudelleenkloonat-tiin pBR322:n Pstl-paikkaan. Tämä aiheuttaa tämän plasmidin ampisilliiniresistans-\ 25 si-fenotyypin katoamisen. Kahdeksan tällaista kloonia otettiin talteen, joista kloo neista oli viisi fibronektiiniä sitovalle toiminnalle positiivisia ja negatiivisia kolme. Jokaisesta testattiin Pstl-fragmentin orientaatio. Positiivisen kloonin pFR004 plas-midilla oli EcoRl-paikka lähimpänä Amp-promoottoria ja negatiivisen kloonin Eco-Rl-paikalla oli päinvastainen orientaatio. Nämä tiedot osoittivat, että transkriptio-30 orientaatio on EcoRLsta PstLeen 3,7 kep EcoRI-Pst-fragmentissa ja että vähintään osa fhbp-geenistä, joka koodaa sitovaa toimintaa, sijaitsee tässä fragmentissa. Tämän varmentamiseksi pFR004:ssä oleva Amp-promoottori poistettiin EcoRI-hajo-tuksella, mitä seurasi plasmidin uudelleenligatointi. Tuloksena saatu plasmidi pFR008 ei osoita fibronektiiniä sitovaa toimintaa. Endogeeninen promoottori sijait-35 see täten otaksuttavasti pFROOl:ssä jossain EcoRI-paikan vasemmalla puolella, kuten kuviossa 3(A) on osoitettu nuolella. Plasmidikonstruktiolla (ei kuvattu yksityiskohtaisesti) vietiin sitten pFROOl:stä peräisin oleva EcoRI (liitoksessa) -Sali 8 101542 (pBR322:ssa) -fragmentti pFR008:aan. Fibronektiiniä sitova toiminta palautui fribp-geenistä peräisin olevan endogeenisen promoottorin palauttamisen ansiosta.

Kun tiedettiin fhbp-geenin transkriptiosuunta (vasemmalta oikealle, kuten kuviossa 5 3(A) on esitetty) fuusioita geenin stafylokokkiproteiini A:ta varten suoritettiin.

Konstruoitiin ilmentymis/sekreetiovektori, joka on nimetty pRIT3:ksi, joka perustuu proteiini A -geeniin, ja jossa on restriktioentsyymimultiliittäjä (15). Multiliittäjä sijaitsee välittömästi myötävirtaan viimeisestä IgG:tä sitovasta alueesta, ja eliminoi siten proteiini A:n C-terminaalisen soluseinää sitovan alueen. pFR001:stä peräisin 10 oleva 3,7 kep:n EcRI-Pstl-fragmentti liitettiin tähän vektoriin odottaen sen koodatavan proteiini A - FNBP -fuusioproteiinia, josta saatu lukemisrakenne oli korrekti. Tämä oli itsestään selvä tapaus, koska plasmidi, jota kutsutaan pFR013, on testeissä sekä proteiini A- että FNBP-positiivinen.

15 Plasmidia pFR013 käsiteltiin eksonukleaasilla Bal31 tarkoituksella identifioida alue, joka on 3,7 kep liitosta pienempi, ja koodaa fibronektiiniä sitovaa toimintaa. Plasmidi pilkottiin EcoRI:lla tai Pstl:llä (koodaavan alueen 5'- ja 3'-päässä vastaavasti), käsiteltiin useita kertoja Bal3 l:Ilä ja ligatoitiin uudelleen. Ligatoinnin aikana lisättiin 20-kertainen ylimäärä EcoRI-liittäjää EcoRI-paikkojen viemiseksi uusiin 20 asemiin. Kuvio 3(C) esittää deleetioita, jotka saatiin joko 3'- tai 5-päähän ja vastaavaa fibronektiiniä sitovaa toimintaa. Noin 700 ep geenialue, joka koodaa sitovaa toimintaa sijaitsee deleetionumeron 56 (deleetio 5'-päästä) ja -numeron 22 (deleetio 3-päästä) päätepisteiden välissä. Deleetioplasmidista numero 56 subkloonattiin 900 ep alue, joka on peräisin äskettäin PvuII-paikkaan viedystä EcoRI-paikasta. Tämä 25 fragmentti kloonattiin pUC18:ssa EcoRI.llä ja Smal.llä pilkottuna. Tulokseksi saatu plasmidi, joka koodittaa fuusioproteiinia, jossa on sekä β-galaktosidaasia ja fibronektiiniä sitovaa toimintaa, nimitettiin pFR015:ksi. Fragmentti voidaan uudelleen-kloonata pFR015:stä EcoRI-ja BamHI-pilkonnalla, koska pUC18:ssa on multiliittäjä.

30

Restriktiofragmentit subkloonattiin myös kuten kuviossa 3(B) on osoitettu. EcoRI-Pstl- ja EcoRI-Clal-fragmenttien tapauksessa käytettiin proteiini A:n ilmentymis-vektoria pRIT3. Fragmentit Ball-PvuII ja Ball-HincII subkloonattiin ja ilmennettiin pUC18:ssa. Kaikissa tapauksissa, paitsi EcoRI-Clal-fragmentin, saatiin talteen fuu-35 sioproteiineja, joilla on fibronektiiniä sitova toiminta. Negatiivinen tulos Clal-Clal-subkloonin tapauksessa voi johtua liitoksesta, joka on väärässä lukemisjärjestyk-sessä.

9 101542

Fuusioproteiinin ZZ-FR valmistaminen ia luonnehdinta 165 kD:n proteiinin saanto (kuvio 2), joka on peräisin E. coli HB 101 -solujen ly-saatista, jossa on plasmidia pFROOl, oli noin 40 per litra viljelyväliaineessa. Vaikka esiintyi katoja, jotka johtuivat korkean molekyylipainon yhdisteen degra-5 daatiosta puhdistuksen aikana, kaikki tosiasiat osoittivat, että fnbp-geeni, jossa on endogeeninen promoottori, ilmentyy heikosti E. colissa. Ilmentymistason parantamiseksi käytettiin äskettäin kehitettyä ilmentämisjärjestelmää, joka sallii heterolo-gisten proteiinien sekreetion E. colin kasvuväliaineeseen (16). Käytetty plasmidi-vektori pEZZ318 sisältää geenin kaksi synteettistä, hieman modifioitua IgG:tä sito-10 vaa domeenia stafylokokkiproteiinia A varten, joita edeltää saman geenin promoottori ja signaalisekvenssi. fiibp-geenin noin 600 ep Ball-PvuII-fragmentti (kuvio 3(B)), joka on kloonattu pUC18:ssa, kloonattiin uudelleen pEZZ318:ssa, joka on pilkottu EcoRI:llä ja HindllLlla. Ligatoinnin ja transformaation jälkeen eristettiin pEZZ-FR. Tämä plasmidi koodittaa fuusioproteiinia, joka koostuu IgG:tä sitovasta 15 tuotteesta ZZ ja FNBP:n fibronektiiniä sitovasta alueesta.

ZZ-FR-proteiinin valmistamiseksi E. coli -lajia HB 101, jossa on plasmidia pEZZ-FR, viljeltiin yön yli Trypticase Soy Brothissa. Bakteerit poistettiin sentrifugoi-malla ja viljelyväliaine vietiin IgG-Sepharose Fast Flow -pylvään läpi. Pylvään 20 TST-puskurilla (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween R 20) pesemisen jälkeen proteiini eluoitiin 0,5 M etikkahapolla titrattuna pH:hon 2,8 käyttämällä ammoniumasetaattia. Noin 50 mg proteiinia eluoitiin pylväästä per litra käytettyä viljelyväliainetta.

• 25 Lyofilisoinnin jälkeen eluoitu materiaali analysoitiin SDS-PAGE.lla, joka ilmaisi suuremman proteiininauhan olevan noin 63 kD (kuvio 4). Lisäksi esiintyi nauhoja, jotka vastasivat pienempiä fragmentteja, mikä johtuu ilmeisesti fuusioproteiinin proteolyyttisestä degradaatiosta. Intakti proteiini A, joka oli samalla geelillä, esiintyi 56 kD:n hajanaisena nauhana. Geelissä olevat proteiinit siirrostettiin elektrofo-30 reettisesti selluloosanitraattipaperiin ja tutkittiin 1251-merkityllä 29 kD:n fibronek-tiinifragmentilla. Kuviossa 4 kaistat C ja D osoittavat, että fuusioproteiini, mutta ei intakti proteiini A, sitoo radioaktiivisesti merkittyä fibronektiinifragmenttia.

Lisätodiste ZZ-FR-fuusioproteiinin fibronektiiniä sitovasta kyvystä saatiin affini-35 teettikromatografian avulla Sepharose-pylväällä, joka oli substituoitu 29 kD:n fibronektiinifragmentilla. Fuusioproteiini sidottiin pylvääseen ja eluoitiin affini-teettimatriksista 6 M GuHCLllä (kuvio 5A). ZZ-FR-fuusioproteiinin fibronektiiniä sitova toiminta sijaitsi ilmeisesti FR-alueella, koska intakti proteiini A ei sitoutunut 10 101542 affiniteettimatriksiin (kuvio 5B). ZZ-FR-fuusioproteiinivalmisteen osa, joka ei sitoutunut affiniteettimatriksiin, koostui proteiineista, joissa Mr on alempi kuin intak-tien fuusioproteiinien (kuvio 6, kaista A), kun taas materiaali, joka sitoutui pylvääseen, koostui lähes puhtaasta intaktin 63 kD ZZ-FR-iuusioproteiinin valmisteesta 5 (kuvio 6, kaista B).

Sen määrittämiseksi, kuinka paljon stafylokokkisolujen fibronektiiniä sitovasta kyvystä voidaan pitää kloonatun FNBP:n ominaisuutena, mitattiin ZZ-FR-fuusiopro-teiinin inhibointitoiminta. Kuten kuviossa 7 on esitetty, inhiboi fuusioproteiini 10 totaalisesti 1251-merkityn 29 kD fragmentin sitoutumisen sekä intaktin fibronektii-nin sitoutumisen sekä S. aureus-lajien Newman että 8325-4 soluihin, proteiini A, jota käytettiin kontrollina, ei inhiboinut sitoutumista (kuvio 7).

Kuuselan raportoitua (6), että S. aureus sitoutuu fibronektiiniin, on kohdistettu 15 paljon työtä yrityksiin identifioida bakteerikomponentti (-komponentit), jotka ovat vastuussa sitoutumisesta. Näiden tutkimusten perusteena on ollut, että patogeenisten bakteerien sitoutuminen fibronektiiniin voi edustaa kudoskiinnittymismekanis-mia, jolla on ratkaiseva merkitys infektion varhaisissa vaiheissa. Proteiinit, jotka on puhdistettu affiniteettikromatografialla immobilisoidun fibronektiinin päällä, ovat 20 osallistuneet stafylokokkisolujen sitoutumiseen fibronektiiniin. Kuitenkin fibronektiiniä sitovien proteiinien selostetut molekyylipainot vaihtelevat 18 kD.sta kauttaaltaan 197 ja 210 kD:iin (11, 17). Pääsyynä molekyylikoon hetorogeeniuteen voi olla proteiinien proteolyyttinen degradaatio eristysmenetelmien aikana.

25 Esillä olevassa selostuksessa esitetään geenin, joka koodaa S. aureus -lajista 8325-4 peräisin olevaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia, kloonaaminen E. colissa. Kun fnbp-geeni ilmennetään E. colissa endogeenisestä promoottorista, voidaan proteiini eristää periplasmasta osmoottisella shokilla. Tämä osoittaa, että promoottori ohella myös signaalipeptidi, on funktionaalinen E. colissa.

30

Vaikka proteiineilla, jotka on koodattu kloonatulla fnbp-geenillä, on 165 ja 87 kD:n molekyylipaino (kuvio 2), joka on pienempi kuin FNBP:n molekyylipaino, joka FNBP on eristetty S. aureus -lajista Newman (Mr = 210 kD) (12), niiden aminohappokoostumukset muistuttavat läheisesti luonnollisen proteiinin koostumuksia 35 (taulukko 1). Lisäksi vasta-aineet, jotka on herätetty luontaista FNBP.tä vastaan, ristireagoivat 165 ja 87 kD:n proteiinien kanssa. Nämä tiedot osoittavat vahvasti, että proteiinien rakenne, jotka proteiinit on koodattu S. aureus -lajista 8325-4 peräisin olevalla kloonatulla geenillä, muistuttaa S. aureus -lajista Newman peräisin ole- 11 101542 vaa luonnollisen FNBP:n rakennetta. 87 kD:n proteiini voi olla tulosta pretermi-naatiosta 165 kD:n proteiinin transkriptionaalisella tai translaationaalisella tasolla tai vaihtoehtoisesti proteolyyttisestä pilkkoutumisesta. Tällä hetkellä ei voida selittää, miksi 165 kD:n proteiini on yli kolmekymmentä kertaa aktiivisempi kuin 87 5 kD:n proteiini fibronektiinin sitoutumisen S. aureus -soluihin inhiboinnissa.

Deleetiokartoituksella käyttäen Bal31-pilkontaa ja subkloonaamalla restriktiofrag-mentit fnbp-geenin alue, joka koodittaa fibronektiiniä sitovaa toimintaa, on paikallistettu noin 300 ep:n alueelle (kuvio 3(B)). Noin 600 ep geenin fragmentti, joka 10 kattaa nämä 350 ep, ligatoitiin suoraan proteiini A -geenin synteettisen IgG:tä sitovan domeenin peräkkäin toistettuun sekvenssiin (zz), jota edeltää proteiini A -promoottori ja signaalisekvenssi ilmentämisvektorissa pEZZ318 (16). Tulokseksi saatu fuusioproteiini (ZZ-FR), jonka molekyylipaino on noin 63 kD määritettynä SDS-PAGElla (kuvio 4), sisältää ZZ-domeenin 126 aminohappoa, joita seuraa noin 15 200 aminohappoa, jotka on kooditettu 600 ep liitoksella, joka on peräisin fhbp-gee- nistä. Proteiinin C-terminaalinen pää koostuu aminohapoista, jotka ovat tulosta kaavion ulkopuolelta lukemisesta vektorin lacZ'-geenin kautta, kun translaation py-säytyskodoni on saavutettu. Fuusioproteiini (ZZ-FR), joka on ilmentynyt korkealla tasolla ja sekretoitunut E. colin viljelyväliaineeseen, on helposti eristettävissä 20 affiniteettikromatografialla käyttäen ZZ-domeenin lgG:tä sitovaa kykyä.

ZZ-FR-proteiini sitoutui fibronektiinin 29 kD:n NH2-terminaaliseen domeeniin ja inhiboi täydellisesti intaktin fibronektiinin sitoumisen S. aureukseen (kuviot 5 ja 6). Nämä tiedot osoittavat, että inkubaatio-olosuhteissa käytetyt muut proteiinit, jotka 25 tunnistavat domeenit, jotka ovat fibronektiinin 29 kD:n N-terminaalin ulkopuolella, eivät ole ilmennettävissä stafylokokkisoluilla. Lisäksi FNBP:n fibronektiiniä sitova toiminta on paikallistettu proteiinin melko pieneen segmenttiin. Luontaisen 210 kD:n FNBP:n, joka oli eristetty S. aureus -lajista Newman, äskettäinen analyysi osoitti, että tämä proteiini on multivalentti ja yksi FNBP:n molekyyli kykenee 30 sitomaan 6-9 fibronektiinimolekyyliä (12). Kloonattu fnbp-geeni on johdettu S.

» ’· aureus -lajista 8325-4. Jos S. aureus -lajien välillä ei olisi eroja, yksi voisi FR- aluetta lukuunottamatta sisältää useita toistavia sekvenssejä. Tähän kysymykseen on vastattu kloonatun fiibp-geenin sekvenssianalyysillä. FR-alueen sekvenssi, jolla on FNBP-ominaisuuksia, on annettu kuviossa 8.

On syytä uskoa, että FR-sitova toiminta liittyy kuhunkin 38 aminohappotoistoon, koska Ball-PvuII-fragmentti koodittaa sitovaa toimintaa (ks. kuvio 3); koska Ball-HincII-fragmentti koodittaa sitovaa toimintaa; ja koska HincII-PvuII-frag- 35 12 101542 mentti ei koodita sitovaa toimintaa. Lisäksi yksi ainoa 38 aminohapon toisto on funktionaalinen fibronektiinin sitomisessa, sillä syntetoidulla 38 aminohappoa pitkällä peptidillä (38(2)-toisto) on sitova kyky, kuten on esitetty kuviossa 9. Kukin kolmesta 38 aminohapon toistosta oli hyvin homologinen.

5

Esimerkki 2

Polypeptidin kemiallinen synteesi, joka perustuu nukleotidisekvenssiin, joka koo-daa 38 aminohapon (38(2)-toisto) fibronektiiniä sitovaa aluetta, suoritettiin rakentamalla aminohapposekvenssi, joka vastaa sanottua nukleotidisekvenssiä alkaen 10 C-terminaalisesta histidiinistä, ja reagoittamalla vaiheittain sopivalla aminohapolla sekä lopuksi reagoittamalla glysiinin kanssa N-terminaalisessa päässä, kiintofaasi-synteesillä K.B Merrifieldin, J. Am. Chem. Soc. 86, s. 304, (1964) mukaisella menetelmällä. Täten syntetoitiin polypeptidi, joka vastaa toista aminohappotoistetta, samaten 3 muuta polypeptidiä, jotka ovat osia tästä 38-toistosta, nimittäin 1) poly-15 peptidi, joka kattaa aminohapot 1-19, 2) polypeptidi, joka kattaa aminohapot 9-30 ja 3) polypeptidi, joka kattaa aminohapot 20-38, syntetoituivat kaikki saman menetelmän mukaisesti.

Täydellisen 38-toiston, samoin kuin 1-19 aminohappopolypeptidin, 9-30 amino-20 happopolypeptidin, 20-38 aminohappopolypeptidin sekä näiden kolmen pienemmän polypeptidin seoksen fibronektiiniä sitova kyky testattiin ja tulokset on annettu kuviossa 9. Täydellisen 38-toiston fragmentit syntetoitiin tarkoituksella tarkistaa, onko fibronektiinisitovuus riippuvainen täydellisestä 38-toistosta, kuten on ennalta odotettu, vai rajoittuvatko fibronektiiniä sitovat ominaisuudet 38 aminohappo-25 sekvenssin jollekin pienemmälle alueelle. Kuten kuviosta 9 ilmenee, on fibronektiiniä sitova ominaisuus läsnä vain täydellisessä 38 aminohapon sekvenssissä.

Materiaalit ja menetelmät 30 Bakteerilaiit ia plasmidit. Staphylococcus aureus -lajista 8325-4 peräisin olevan kromosomaalisen DNA:n pBR322:ssa oleva geenipankki, joka on kuvattu aikaisemmin (13):ssa seulottiin kloonien saamiseksi, jotka ilmentävät fibronektiiniä sitovaa toimintaa. Subkloonaus- ja ilmentymiskokeissa käytettiin E. coli -lajeja HB102, (18) ja JM105 (19). Käytetyt plasmidivektorit olivat pBR322 (20), pUC18 35 (21) ja proteiini A -vektorit pRIT3 (15) ja pEZZ318 (16). Fibronektiiniä sitovan proteiinin (FNBP) testeissä käytettiin S. aureus -lajeja Cowan I, Newman ja 8325-4.

,3 101542

Mikro-organismien vilielyväliaine. E. coli -bakteerien viljelyssä käytettiin seuraa-vaa väliainetta. Annetut määrät koskevat litraa väliainetta.

Trypton Soy Broth (Oxoid Ltd, 5 Basingstoke, Hants, GB) 30 g hiivauute (Oxoid) 10 g D-glukoosi 40 g NH4C1 2,5 g

Na2HP04.2H20 7,5 g 10 KH2P04 3,0 g

Na2SO4.10H2O 2,5 g

MgS04.7H20 0,2 g

CaCl2.2H20 0,5 g

FeCl3.6H20 16,7 mg 15 Ζη804.7Η20 0,18 mg CUSO4.5H2O 0,16 mg

MnS04.4H20 0,15 mg C0CI2 0,10 mg

NaEDTA 20,1 mg 20

Fibronektiiniä sitovan proteiinin (FNBP) analysointi. Fibronektiinin sitoutumisen määrittäminen S. aureus -soluihin on kuvattu aikaisemmin (10). Jos muuta ei ole mainittu, 10^ S. aureus Cowan I -solua inkuboitiin 125i_merkjtyllä fibronektiinillä tai fibronektiinin 29 kD NH2-terminaalisella fragmentilla PBSissä, joka sisältää 25 1 mg/ml naudan seerumialbumiinia kokonaismääränä 0,3 ml. 2 tunnin 22°C:ssa in- kuboinnin jälkeen soluihin sitoutunut radioaktiivisuus mitattiin gammalaskijalla.

E. coli -kloonien lysaatit, jotka valmistettiin Tris-HCl-puskurissa, pH 8,1, joka sisältää lysotsyymi-EDTA:a, kuten aikaisemmin on kuvattu (13):ssa, analysoitiin fib-30 ronektiiniä sitovan toiminnan toteamiseksi mittaamalla niiden kyky kilpailla stafy-lokokkisolujen kanssa sitoutumisesta fibronektiinin 125j_merkjttyihin 29 kD NH2-terminaalisiin fragmentteihin. FNBP:n määrä, joka kykenee inhiboimaan sitomista 50 %:iin, on ilmaistu yhtenä toiminnan yksikkönä.

35 Osmoottista shokkimenetelmää käytettiin proteiinien vapauttamiseen E. colin solu-limatilasta (14).

Μ 101542 14 FNBP:n puhdistaminen. Puhdistaminen perustui affiniteettikromatografiaan fibro-nektiini-Sepharosen päällä, jota seurasi ioninvaihtokromatografia.

Humaani-fibronektiini valmistettiin vanhentuneesta verestä tunnetulla menetelmällä 5 (22). Fibronektiini dialysoitiin vasten 20 mM Tris-HCl, pH 8,3, ja konsentroitiin DEAE-pylväässä. Fibronektiinin kytkentä Sepharose SL-4B:hen tehtiin tunnetulla bromisyaaniaktivointimenetelmällä (23).

E. coli -lysaatit pumpattiin affiniteettipylvääseen, jota pestiin 0,5 M ammoniumase-10 taatilla, kunnes perusviiva oli vakaa (noin neljä pylvään tilavuutta). Sitten FNBP eluoitiin 0,4 M etikkahapolla ja joko neutralisoitiin ammoniakilla tai lyofilisoitiin. Sen jälkeen kun se oli dialysoitu vasten 10 mM ammoniumasetaattia, jonka pH on säädetty 7,6:een, jossa oli ammoniakkia, suoritettiin lisäfraktionointi ioninvaihto-kromatografialla Pharmacia FPLC -varusteilla käyttämällä mono Q-pylvästä.

15

Nukleotidisekvenssianalvysi. Nukleotidisekvenssi määritettiin Maxam, A M. et al.:n kuvaamien menetelmien mukaisesti.

Aminohappoanalyysi. Aminohappokoostumus määritettiin käyttämällä Durrum 20 D-500 -analysaattoria. Näytteitä hydrolysoitiin 6 M HClissa, joka sisältää 2 mg/ml fenolia, 24 tuntia 110°C:ssa. Yksi näytteistä myös hapetettiin permuurahaishapolla kysteiinin ja metioniinin määrittämiseksi. Norluesiinia lisättiin sisäisenä standardina. Proteiini määritettiin (24):n mukaisesti käyttämällä naudan seerumialbumiinia standardina.

; 25

Elektroforeesi. Jos muuta ei ole mainittu, suoritettiin SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesi 5-15-%:isissa gradienttigeeleissä. Geelit värjättiin Coomassie brilliant bluella, väri poistettiin ja valokuvattiin.

30 Sädetvsimmuunitestimenetelmä. Puhdistettu FNBP, jonka arvioitu molekyylipaino on 165 kD SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa, merkittiin 125].otjiiniua tunnetulla kloramiini-T-menetelmällä (25). Jodauksen jälkeen materiaali kromato-grafoitiin uudelleen fibronektiini-Sepharose-pylväässä.

35 Inkubointiseokseen, joka sisälsi 125i_pNBP (3400 cpm 10 l:ssa), sekoitettiin erilaisia kaniantiseerumin (joka sisältää vasta-aineita, jotka on suunnattu S. aureus -lajia Newman vastaan) laimennoksia inkubointipuskurissa (PBS, 0,1% Triton X-100 ja 0,02 % natriumatsidi) tilavuudessa 0,2 ml.

15 101542 Näytteitä inkuboitiin 2 tuntia 20°C:ssa antigeeni-vasta-ainereaktion mahdollistamiseksi. 0,1 ml proteiini A - Sepharosen 10-%:ista suspensiota (paino/til.) PBS:ssä lisättiin ja seosta inkuboitiin toinen tunti. Inkubointi pysäytettiin lisäämällä toiset 1,7 ml inkubointipuskuria näytteisiin. Sentrifugoinnin 2000 rpm 3 min jälkeen super-5 natantit imettiin pois. Pelletit pestiin kahdesti inkubointipuskurissa ja radioaktiivisuus, joka liittyy proteiini A - Sepharoseen mitattiin gammalaskijalla.

Restriktioendonukleaasit ia muut entsyymit. Restriktioentsyymit, T4-DNA-ligaasi ja Bal31 hankittiin BRListä ja käytettiin heidän suositustensa mukaisesti. Muut πιει 0 netelmät mukaan lukien DNA-tekniikat olivat oleellisesti tunnettuja (26).

Taulukko 1 E. colista pFROOl eristettyjen iibronektiiniä sitovien proteiinien (87 ja 165 kD) aminohappokoostumusten ja luonnollisen S. aureus -lajista Newman eristetyn 15 luontaisen FNBP:n (210 kD) vertailu.

Koostumus (mooli-^O

Aminohappo 210 kDa) 165 kD 87 kD

20 asparagiinihappo/asparagiini 15,4 14,6 13,4 treoniini 9,7 10,7 10,3 seriini 7,4 6,5 8,0 glutamiinihappo/glutamiini 17,9 17,1 15,1 proliini 6,3 6,2 5,8 25 glysiini 8,9 7,9 8,4 alaniini 5,3 4,6 4,7 puoli-kystiini 0,1 0,2 n.d.

väliini 7,2 7,8 8,6 metioniini 0,6 0,6 n.d.

30 isoleusiini 4,3 4,7 3,8 leusiini 4,1 4,0 4,6 tyrosiini 2,1 2,3 4,1 fenyylialaniini 2,4 2,0 3,6 histidiini 1,0 3,2 3,0 35 lysiini 5,3 6,3 6,6 tryptofaani n.d. n.d. n.d.

arginiini 1,9 1,2 ie 101542 a) Fröman et al.ista (1987), (12).0 n.d = ei määritetty.

Esillä olevaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää immunointiin, jolloin 5 proteiini, edullisesti yhdistelmänä fuusioproteiinin kanssa suuren antigeenivasteen luomiseksi, injektoidaan annoksina, jotka aiheuttavat immuunireaktion isäntänisäk-käässä. Täten fibronektiiniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää märehtijöiden rokottamiseen stafylokokki-infektioiden aiheuttamaa utaretulehdusta vastaan. Tämän keksinnön fibronektiiniä sitova proteiini on osoittautunut muodostavan vasta-ainei-10 ta stafylokokkiperäistä nisätulehdusta vastaan hiirimallissa, kuten taulukossa on jäljempänä osoitettu.

Taulukko

Kokeellinen hiiren nisätulehdus aiheutettiin S. aureus -lajilla SA 113(83A) annok-15 sena 1,0x103 cfu. Immunointi arvioitiin käyttämällä 15 g proteiinia per hiiri fibronektiiniä sitovaa proteiinia, joka on ilmennetty E. colissa, joka sisältää plasmidia pFROOl, kuten tässä on identifioitu.

Hiiri- Rokot. Vamman yhteis- Tutkit- Vamman mikroskoop- 20 ryhmä maito- tutkintatyyppi tujen pinen tyyppi (%) rau- (%) maito- hasten rauhas- määrä ten määrä 25 +++ ++ + 0 A B Cl C2 C3

Roko tetut (FNBP) 30 3 8 83 10 11 9 0 0 91 0 30 .. Kontrolli 38 50 16 32 3 8 38 0 25 38 0 35 Nisätulehdus: +++ = voimakas; ++ = keskiasteinen; + = lieväasteinen; 0 = ei paljain silmin näkyviä muutoksia; A = yhdenmukaisesti ei-reaktiivinen, totaali nekroosi; B = pitkälle kehittyneitä regressiivisiä muutoksia + lievä tulehdusreaktio; Cl = levinnyt tulehdusreaktio + pai- 17 101542 kallinen nekroosi; C2 = levinnyt tulehdusreaktio; C3 = paikallinen tulehdusreaktio; 0 = ei reaktiota.

Kuten edellä oleva taulukko osoittaa, yhdenmukainen immunointi saadaan aikaan 5 käyttämällä FNBPitä, joka on ilmennetty E. colilla, joka sisältää plasmidia FROO1.

Lisäksi fibronektiiniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää estämään avoimen ihohaavan infektio käsittelemällä haavaa käyttämällä fibronektiiniä sitovaa proteiinia suspensiossa. Täten fibronektiiniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää haavojen hoitoon, 10 esim. proteiinireseptorien suojastukseen tai immunointiin (rokotus). Jälkimmäisessä tapauksessa isännän ruumis tuottaa spesifisiä vasta-aineita, jotka voivat suojella sitä bakteerilajien invaasiolta, jotka käsittävät tällaista fibronektiiniä sitovaa proteiinia. Täten vasta-aineet estävät bakteerilajien kiinnittymisen vahingoittuneeseen kudokseen.

15

Esimerkkejä kudosvammojen kolonisoinnista ovat: a) ihohaavojen ja sidekudosten kolonisointi, jotka haavat johtuvat mekaanisista vammoista, kemiallisista vammoista ja/tai kuumuudesta johtuvista vammoista; b) limakalvojen haavojen kolonisoinnista, kuten suuontelon, tai maitorauhasten, 20 virtsaputken tai emättimen limakalvojen haavat; c) sidekudosproteiinien kolonisoinnista, jotka sidekudokset ovat altistuneet minimaalisille vammoille (vähäpätöinen vamma) yhteydessä epiteeliin ja endoteeliin (nisätulehdus, sydänläpän infektio, lonkanvaihtokirurgia).

; 25 Jos esillä olevaa FNBPitä tai 38 aminohappopolypeptidiä käytetään nisäkkäiden, ihminen mukaan luettuna, immunointitarkoitukseen (rokotus), proteiini tai poly-peptidi dispergoidaan steriiliin isotoniseen suolaliuokseen samalla kun optionaali-sesti lisätään farmaseuttisesti hyväksyttävää dispergointiainetta. Lisäksi voidaan käyttää erityyppisiä apuaineita kudokseen vapautumisen pitkittämiseksi ja siten 30 proteiinin tai polypeptidin altistamiseksi pitemmäksi aikaa kehon immuunipuolus-tusjärjestelmälle.

Sopiva annostus immunoinnin aikaansaamiseksi on 0,5-5 pg FNBPitä tai polypep-tidiä per ruuminpainokilo ja immunointi-injektio. Kestävän immunoinnin aikaan-35 saamiseksi rokotus pitää suorittaa useamman kuin yhden peräkkäisen kerran 1-3 viikon aikana, edullisesti 3 kertaa.

18 101542

Jos esillä olevaa FNBP:tä tai polypeptidiä käytetään ulkoisesti paikallisesti, proteiini dispergoidaan isotoniseen suolaliuokseen 25-250 \xg/\ pitoisuuteen. Haavoja käsitellään sitten vain sellaisella määrällä, joka kostuttaa täydellisesti haavan pinnan. Keskimäärin käytetään haavoihin vain muutama millilitra liuosta tällä tavoin.

5 Käsittelyn käyttämällä proteiiniliuosta jälkeen haavat pestään soveltuvasti isotonisella suola- tai muulla sopivalla haavanhoitoliuoksella.

Lisäksi keksinnön mukaista fibronektiiniä sitovaa polypeptidiä samaten kuin minimaalista fibronektiiniä sitovaa paikkapolypeptidiä voidaan käyttää stafylokokkilaji-10 en aiheuttamien bakteeri-infektioiden diagnosointiin, jolloin esillä olevan keksinnön mukainen fibronektiiniä sitova proteiini immobilisoidaan kiinteällä kantoai-neella, kuten pienet lateksi- tai Sepharose®-palloset, minkä jälkeen seerumien, jotka sisältävät vasta-aineita, annetaan läpäistä ja reagoida FNBP:n kanssa, jolloin FNBP immobilisoituu. Agglutinaatio mitataan sitten tunnetuilla menetelmillä.

15

Lisäksi FNBP:tä tai polypeptidiä voidaan käyttää ELISA-testissä (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay; E. Engvall, Med. Biol. 55, 193, (1977)). Polystyreenimik-rotiitterilevyn kolot peitettiin FNBP:llä ja inkuboitiin yön yli 4°C:ssa. Levyt pestiin sitten perusteellisesti käyttämällä PBS:ää, joka sisältää 0,05 % TWEEN 20, ja 20 kuivattiin. Potilaan seerumin sarjalaimennos tehtiin PBS-Tweenissä, lisättiin koloihin ja inkuboitiin 30°C:ssa 1,5 tuntia. Huuhtelun jälkeen antihumaani-lgG:tä, joka oli konjugoitu entsyymiin, tai antinaudan-IgG:tä, joka oli konjugoitu entsyymiin, vastaavasti, piparjuuriperoksidaasia tai alkalista fosfataasia lisättiin koloihin ja in-kuboitiin 30°C:ssa 1,5 tuntia, kunnes lgG oli sitoutunut siihen ja huuhtelemisen : 25 jälkeen lisättiin entsyymialusta, alkalisen fosfataasin tapauksessa p-nitrofosfaattia tai peroksidaasin ollessa kyseessä lisättiin ortofenyleenidiamiinisubstraattia (OPD) vastaavasti. Levyt, jotka käsittivät koloja, huuhdeltiin sitten käyttämällä sitraatti-puskuria, joka sisältää 0,055 % OPD ja 0,005 % H2O2, ja inkuboitiin 30°C:ssa 10 min. Entsyymireaktio pysäytettiin lisäämällä Η2θ2:η 4 N liuosta kuhunkin koloon. 30 Värinkehitys mitattiin käyttämällä spektrofotometria.

Käytetystä entsyymialustasta riippuen voidaan käyttää yhtä hyvin fluorointimit-tausta.

35 Toinen menetelmä stafylokki-infektioiden diagnoimiseksi on käyttää DNA-geeni-koetinmenetelmää, joka perustuu FNBP-sekvenssiin tai 38 aminohappopolypeptidi-sekvenssiin. Tällöin luonnollinen tai synteettinen DNA-sekvenssi kiinnitetään kiinteään kantajaan, kuten edellä mainittu polystyreenilevy, esim lisäämällä maitoa 19 101542 pinnalle nisätulehdusta diagnosoitaessa. DNA-geenikoetin, joka on merkitty optio-naalisesti entsymaattisesti tai radioaktiivisella isotoopilla, lisätään sitten kiinteään oikotasoon, joka käsittää DNA-sekvenssin, jolloin DNA-geenikoetin kiinnittyy sekvenssiin, jossa se on. Entsyymi tai radioaktiivinen isotooppi voidaan sitten helposti 5 määritellä tunnetuilla menetelmillä.

Edellä oleva termi "fibronektiiniä sitova proteiini" käsittää minkä tahansa 38 ami-nohappopolypeptidisekvenssin samoin kuin sen, jossa 38 aminohappopolypeptidi-sekvenssi muodostaa täydellisen proteiinin minimaalisen fibronektiiniä sitovan pai-10 kan.

101542

Viitteet 8. Beachey, E.H. and Simpson, W.A(1982>. Infection 10, 107-110.

5 20. Bolivar, F., Rodriquez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C.,

Heyneker, H: L., Boyer, H.W., Crosa, J.H. and Falkow, S. (1977) . Gene, 2, 95-113.

18. Boyer, H.W. and Rou 11 and-Dussoix, D. (1969). J. Mol.Biol: £1_, A59-472 .

10 9. Courtney, H.S., Ofek,I., Simpson, W.A., Hasty, D.L. and

Beachey, E.H. (1986). Infect. Immun. 53, 454-459.

11. Espersen, F. and Clemmensen, I. (1982). Infect. Immun.

37, 526-531.

17. Fröman, G., Switalski, L.M., Guss, B., Lindberg, M., Höök, 15 M. and Wadstrom, T. (1986) In Lark, D.L. ed. Protein-Car bohydrate Interactions in Biological Systems. Academic Press, London, pp. 263-268.

12. Fröman, G., Switalski, L.M., Speziale, P. and Hook, M. (1987) in press. J. Biol. Chem.

20 25. Hunter, W.M. (1978) Radioimmunoassay. In: Wier, K.M. ed.

Handbook of Experimental Immunology. London Blackwell. 14.1-14.40.

1. Hynes, R.O. (1985) Annu. Rev. Cell Biol. 1_, 67-90.

2. Hynes, R.O. (1986) Sci. Ann. 254, 42-51.

25 6. Kuusela, P. (1978) Nature 276, 718-720.

• 24. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. and Randall, R.J., Biol. Chem. 193, 265-275.

13. Löfdahl, S., Guss B., Uhlen, M., Philipson, L. and Lindberg, M. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8(), 697-701 .

30 26. Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrok, J. (1982). Mole cular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor . Laboratory, New York.

23. March, S.C., Parikh, I. and Cuatrecasas, P. (1974). Ana-lyt. Biochem. 60, 149-152.

35 27, Maxam, A.M. and Gilbert, W., (1 977) , . Proc . Natl. Acad.

Sci., USA, 74, 560.

28. Merrifield, K.B., J. Am. Chem. Soc., 86, PP-304, (1964) 19. Messing, j. and Carlsson, J. (1 984). J. Biotechnol. 1_, 253-264 .

21 101542 22. Miekka, S.I., Ingham, K.C. and Menache, D. (1982). Thromb Res. 27, 1-U.

15. Nilsson, B., Abrahamsen, l. and Uhlen, M. (1985). EMBO J. A, 1075-1080.

5 16. Nilsson, B., Moks, T., Jansson, B., Abrahamsen, L., Elm- blad, A., Holmgren, E., Henrichson, L., Jones, T.A. and Uhlen, M. (1986). Protein Engineering, In press.

21. Norrander, J., Kempe, T. and Messing, J. (1983). Gene, 26, 101-106.

10 14. Nossal, N.G. and Heppel, L.A. (1965). J. Biol. Chem. 241, 3055-3062.

3. Ruoslahti, E. and Pierschbacher, M.D. (1986). Cell, 4_4, 517-518.

10. Rydön, C., Rubin, K., Speziale, P., Höök, M., Lindberg, 15 M. and Wadstrom, T. (1983), J. Biol. Chem. 258, 3396-3401.

7. Wadstrom, T., Suitalski, L., Speziale, P., Rubin, K.,

Ryden, C., Fröman, G., Paris, A., Lindberg, M., Höök, M., (1985) , In Jackson, G.J. (ed), Pathogenesis of Infection. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, pp.

20 193-207.

4. Woods, A., Couchman, J.R., Johansson, S., and Höök, M.

(1986) , EMBO J. 5, 665-670.

5. Yamada, K.M. (1983), Annu. Rev. Biochem. 52_, 7 61 - 7 9 9 .

«

Claims (4)

1. 22 101542 Patenttivaatimus Kemiallinen syntetisointimenetelmä fibronektiiniä sitovan proteiinin tai polypepti-din valmistamiseksi, tunnettu siitä, että fibronektiiniä sitovalla proteiinilla tai 5 polypeptidillä on yksi tai useampi seuraavista aminohapposekvensseistä Gly Gin Asn Ser Gly Asn Gin Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gin Gly Gly Asn Ile Vai Asp Ile Asp Phe Asp Ser Vai Pro Gin Ile His 10 Gly Gin Asn Lys Gly Asn Gin Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro Lys Tyr Glu His Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Vai Pro His Ile His
2. 15 Gly Phe Asn Lys His Thr Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp Lys Pro Ser Tyr Gin Phe Gly Gly His Asn Ser Vai Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu Pro Lys Vai jolloin aminohappotähteet rakennetaan näiden aminohapposekvenssien mukaisesti 20 lähtien C-terminaalisesta histidiinistä tai valimista, joka reagoitetaan vaiheittain sopivan aminohapon kanssa, jolloin se reagoitetaan lopulta glysiinin kanssa N-ter-minaalisessa päässä fibronektiiniä sitovan proteiinin tai polypeptidin muodostamiseksi.
3. 25 Patentkrav Kemisk syntesmetod för produktion av ett fibronektinbindande protein eller poly-peptid, kännetecknat av att det fibronektinbindande proteinet eller polypeptiden har en eller flera av följande sekvenser: ’· 30 Gly Gin Asn Ser Gly Asn Gin Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gin Gly Gly Asn Ile Vai Asp Ile Asp Phe Asp Ser Vai Pro Gin Ile His Gly Gin Asn Lys Gly Asn Gin Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys
4. 35 Asp Lys Pro Lys Tyr Glu His Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Vai Pro His Ile His 101542 Gly Phe Asn Lys His Thr Glu lie lie Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp Lys Pro Ser Tyr Gin Phe Gly Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu Pro Lys Val 5 varvid en aminosyrarest bygges upp baserad pä nämnda aminosyrasekvens utgaende fran C-terminala histidinet, resp. valinet, som stegvis reageras med lämplig aminosyra, varvid den slutligen reageras med glycinet i N-terminala änden, till bildning av det fibronektinbindande proteinet eller polypeptiden.