JPH02154689A - フイブロネクチン結合タンパク質とその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明はフイブロナクチン結合タンパク質と該タン パク質をコード化したヌクレオチド系を含むプラスミド
やファー ジ等のハイブリッド−デイ−エヌエイ−分子の製法に関
し、 特に前記分子と前記タンパク質を製造するために用いら
れ ると共に前記タンパク質で合成物質を含む微生物を製造
する方法に関 するものである。

（従来技術） 特庁公報ＷＯ−Ａ１−８５／０５５５３にはフィブロネ
クチン、 フイブリノーゲン、コラーゲン、および／またはラミニ
ンと結合性を 有するバクテリヤ細胞表面タンパクについての記載があ
る。

それには、種々のバクテリアがフィブロネクチン、フイ
ブリノーゲン、 コラーゲン、および／またはラミニンと結合する能力を
有する ことが示されている。更に、フィブロネクチン結合タン
パク 質は１６５及び／または８７ＫＤの分子量のものである
こと が示されている。これにより、小分子のタンパク質は大
分子のも のの一部であるといえる。

フィブロネクチンは２個の類似した亜単位からなる高分
子 糖タンパク質である。このようなフィブロネクチンは前
駆物 質ｍＲＮＡ（１）の複合結合型により細胞サイズに変化
する ことができる。フィブロネクチンの主たる機能は体液、
血液 や細胞外のコロイド層（ｍａｌｒｉｃｅｓ）内に発見さ
れる、これは 大部分の真核細胞（１、３、４、５）の付養気質を媒介
する タンパク質の性能であるようにみえる。

１９７０年代に、キユーセラはフィブロネクチンは真核
細 胞と相互作用を有するばかりでなくブドウ状球菌のアウ
レ ウス細胞にもまた結合することを発見した（６）。この
ような 視点からして、多くの病原微生物はフィブロネクチンと
の結 合性に高度の特性と類縁性が発見される（７）。

細 胞外マトリックス内のフィブロネクチンは基体として作
用するば かりでなく、また、種々の異なった微生物の結合剤とし
て作 用するようにも見える。フィブロネクチンの結合性は或
る微生 物にとって受容組織を移植ためや病原菌系の感染を促進 する極めて重要な段階の役割を果たすことができる。

数種の異なった細胞表面組織はリポテチオリ酸（８、９
）やタンパク質（１０）に含有するグラム陽性バクテリ
アに フィブロネクチン受容体として関係を有する。予備的な
研究に おいて、１９７−２１０ＫＤでＭｒのフィブロネクチン
結合タンパク 質はエス・アウレウスがニューマン（１１、１２）に記
載した特殊な変種 から分類されたものであり、フィブロネクチン受容体と
同一視 されるものである。エス・アウレウスのものからのフィ
ブロネクチン結合 タンパク質の特性は大腸菌などの細菌内に前記タンパク 質の遺伝因子がクローンを発生させる。そして、このタ
ンパク 質に含有するフィブロネクチンの結合する領域は局所的
な ものに限定さて、この局所部分に含まれる溶解タンパク 質の性質はタンパク質のＩｇＧ−結合部位は後記の詳細 な記載で述べられている。

（本発の目的） 本発明の目的は極微細なフィブロネクチン結合タンパク
質を得ることである。

本発明の他の目的は例えばタンパク質をコード化したナ
クレオチド（ｎｕｃＩｅｏｔｉｄｅ）系を含む遺伝子 副体を使用することによって遺伝学的な工学技術目的 によって前記タンパク質を得ることである。

本発明の更に他の目的は化学合成手段によって前記タン
パク質を製造する可能性を得ることである。

（課題を解決するための手段） 驚くべきことに、タンパク質をコーデイングしたナクレ
オチド 或いはフィブロネクチン結合タンパク質を有するポリペ
プチド を含むハイブリッド−ＤＮＡ分子を製造する方法を発見
した。

以下の説明から明らかな如く、ナクレオチド系は前記タ
ン パク質をコード化した遺伝因子（ｇｅｎｅ）に存在して
いる。

ＧＧＣ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＡＧＣ　ＧＧＴ　ＡＡＣ　Ｃ
ＡＧ　ＴＣＡ　ＴＴＣ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＣ　ＡＣ
Ａ　ＧＡＡ　ＧＡＡ ＧＡＣ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　Ｃ
ＡＡ　ＧＧＴ　ＧＧＣ　ＡＡＴ　ＡＴＣ　ＧＴＡ　ＧＡ
Ｔ　ＡＴＣ　ＧＡＴ ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＡＧＴ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＣＡＡ　Ａ
ＴＴ　ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＧＧ
Ｔ　ＡＡＴ　ＣＡＧ ＴＣＡ　ＴＴＣ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＡＣＡ　Ｇ
ＡＡ　ＡＡＡ　ＧＡＣ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＡＡＧ　ＴＡ
Ｔ　ＧＡＡ　ＣＡＴ ＧＧＣ　ＧＧＴ　ＡＡＣ　ＡＴＣ　ＡＴＴ　ＧＡＴ　Ａ
ＴＣ　ＧＡＣ　ＴＴＣ　ＧＡＣ　ＡＧＴ　ＧＴＧ　ＣＣ
Ａ　ＣＡＴ　ＡＴＴ ＣＡＣ　ＧＧＡ　ＴＴＣ　ＡＡＴ　ＡＡＧ　ＣＡＣ　Ａ
ＣＴ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡ
Ｔ　ＡＣＡ　ＡＡＴ ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＡＧＴ　ＴＡＴ　Ｃ
ＡＡ　ＴＴＣ　ＧＧＴ　ＧＧＡ　ＣＡＣ　ＡＡＴ　ＡＧ
Ｔ　ＡＴＴ　ＧＡＣ ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＡＣＡ　ＣＴＴ　Ｃ
ＣＡ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＡＧＣ　ＧＧＣ　ＣＡＡ　ＡＡ
Ｔ　ＧＡＡ　ＧＧＴ ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＧＣ　ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　Ｇ
ＡＴ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＡＴＣ　ＧＴ
Ｇ　ＣＣＡ　ＣＣＡ ＡＣＧ　ＣＣＡ　ＣＣＧ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　Ｇ
ＴＡ　ＣＣＡ　ＡＧＴ　ＧＡＧ　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣ
Ａ　ＣＣＡ　ＡＣＧ ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＧＴＡ　Ｃ
ＣＡ　ＡＧＴ　ＧＡＧ　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＣＣ
Ａ　ＡＣＡ　ＣＣＡ ＣＣＧ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＧＴＧ　ＣＣＧ　Ａ
ＧＴ　ＧＡＧ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＡＣ
Ａ　ＣＣＧ　ＣＣＡ ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＣＣＡ　ＧＡＴ 更に本発明はフィブロネクチン結合タンパク質をコード
化した ヌクレオチド系を有した遺伝子副体（ｐｌａｓｍｉｄ）
かファージ（ｐｈａｇｅ） を含む。

そして本発明はフィブロネクチン結合タンパク質の製法 包含し、それにより、少くとも１個のハイブリッド−Ｄ
ＡＮ−分子を 微生物内に誘導し、生長培地内に微生物を培養し、 そして、クロマトグラフイで変換したイオンをたどりな
がら不溶 性キャリアと結合させたフィブロネクチンに親和力を有
する クロマトグラフイ手段により形成されたタンパク質を分
離 する。

更に本発明の特徴はフィブロネクチン結合タンパク質の 化学合成物質を含む、これにより、アミノ酸系はＣ− ターミナルヒステイデインから出発したタンパク質をコ
ード 化したヌクレオチド系をベースとして合成されたもので
ある。

これは特有のアミノ酸と段階的に反応する、これにより
、 フィブロネクチン結合ペプチドの部分は形成するため、
Ｎ−ターミ ナルエンドにおいてグリシンと反応する。

固有のキャリアタンパク質はタンパク質ＡのＩｇＧ結 合部分のようにアミノ酸系に結合することができる。

本発明は下記の実験例に示されているが、本発明は この実験例に限定されるものではない。

（実験例１） フィブロネクチン結合タンパク質遺伝子貯蔵所の選択審
査 （ＦＮＢＰ） 予め（１３）で述べたスタフイロコッカスアルレウスス
トレイン ８３２５−４からクロマソマルＤＮＡの遺伝子副体ＰＢ
Ｒ ３２２のある遺伝子貯蔵所はＦＮＢＰと表示したクロー
ン を分別審査した。イ−・コリークロンは溶解されており
、 そのよう怪物は分類方法で述べたようにエス・アウレウ
ス カウン■の細胞に対して１２５エーフィブロネクチンの
結合 を抑制する性能について試験された。簡単に検査するた
めに溶解されたものとテストされたものが２５のロット
に 貯蔵されていた。この貯蔵物以外は検査されていた。活
性 を最高に抑制されているものは再検査されていた。これ
は 第５の５個の貯蔵物である。最後に１つの貯蔵物の独立 したクローンは１つの寄託クローンの分離の結果を検査
さ れた。寄託クローンの遺伝子副体は細胞ｐＦＲ００１で あった。

イ−・コリ−ストレイン２５９内の遺伝子副体とｐＦＲ
００１ はドッチェサムラン　ホン　マイクロオーガニズメン（
ＰＳＭ） に寄託されていた。そして、これに寄託ＮＯ４１２４が
振り当 てられていた。

イ−・コリーｐＦＲ００１からスタフイロカッカルＦＮ
ＢＰの分離、 寄託されたＦＮＢＰのイ−コリークロンは静置状態 での生長期が３７℃におけるＬＢ−メディアム内で生長
した。

バクテリア細胞は浸透性ショック（１４）によって遠心
分離 の後溶解した。エス・アウレウス細胞に１２５エーフィ
ブロネクチン を結合することについてのショック溶解物の抑制効果を 除外することは加水分解による活性によるものであ る。溶解物は加熱混合物に加えられた、エス・アウレウ
スに結合された１２５エーフィブロネクチンの 量は１、２、３〜４時間加熱したのち決定された。こ の加熱時間の間、観察される抑制を示す溶解物残留 室数（例えば５０％）によって引起こされる抑制の程 度は１２５■−置換識別配位子またはこれに相当する受
容体の進行する分解によるものではない。

抑制された活性が溶解物中のＦＮＢＰ類似構造物の存在
による場合はフィブロネクチンに対す る特別の親和力を表示すべきである。前記溶解物は第１
図Ａの資料または方法に記載されるようなフィブロネク
チンセフアローズの表にクロマトグラフイ の親和力によって分析される。精製は略３０倍であった
。更に分留法はＦＰＬＣ−組織に適合した 単一の表Ｑを用いてイオン交換クロマトグラフイの親和
力 で精製した物質により達成された。この分留段階におい
ては、二つの主たるピークが得られた（第 １図Ｂのポリアクリルアミド　ゲル　エレクトロファー
リ シズによる分析は第２図に示す如く分子量が１６５と ８７ＫＤのタンパク質を含み二つのピークを示した。

二つの成分はエス・アウレウスに対する１２５■−クイ
ブロネクチ ンの結合を抑制した。１６５ＫＤのタンパク質を含む 留分はオリジナルショック溶解物から４３０倍に精製し
たことを表す２２０ユニット／ｑ・ｇの特別な活 性抑制力を有するものである。そして、それはデータに 示されていないが、モルベースで８７ＫＤのタンパク 質よりも３０倍の活性が有った。

二つのタンパク質のアミノ酸分析の結果は非常に類似し
たアミノ酸組成を有すると共に表１のエス・ アウレウスから分離した自然のＦＮＢＰとして決定し得 る厳密な共通性を有していた。エス・アウレウス　スト
レ イン　ニューマンから分離した自然のＦＮＢＰに対して イ−・コリーｐＦＲ００１から分離した１６５ＫＤのタ
ンパク 質の面積学的な関係が分析された。この１６５ＫＤ タンパク質はエス・アウレウス　ストレイン　ニューマ
ン に対して抗体の増大する希釈により１２５■−ラベルド と免疫沈殿物とであった。３００倍に希釈した抗血清は
１２５■−ラベルドタンパク質の５０％が沈 澱した。自然のＦＮＢＰのようにアンラベルド１６５及
びよりＫＤ タンパク質は（データーは示していないが、）ラベルド
１６５Ｋ Ｄのタンパク質の免疫沈殿物で阻害した。この観察結果
により、エス・アウレウス　ストレイン　ニューマンか
ら分離した１６５ 及び８７ＫＤタンパク質はフィブロネクチン　バインデ
ング　 タンパク質（ＦＮＢＰ）に密接な関係のあることを示 している。

結合活性力をコード化したＦＮＢＰ−遺伝子部位の 確認 遺伝子副体ｐＦＲ００１内に挿入した方法は略６．５Ｋ
ｂｐである。挿入のリイストリクションマップは 第３図の３Ａに示している。転写方向と結合性能の コード化した部分に集収することを決定するために、略 ３．７ＫｂｐのＰｓｔ■片はｐＢＲ３２２のＰｓｔ■サ
イトに クロンを再発生させる。このことは遺伝子副体と比較さ
れ たアレピレン　レジスタンスへノタイプの損失をもたら
す。８個 のこのようなクローンが得られた。そのうちの５個は陽
性 であり、３個はフィブロネクチン結合活性に対して陰性 である。それぞれの各１個はＰｓｔ■片のオリエンテイ
ション のために検師された。陽性クローンｐＦＲ００４の遺伝
子 副体はアンプープロモータに最も密接したＥＣＯＲＩサ
イトを 有していた。そして陰性クローンのそれは逆のオリエン
テイシ ョンを有している。■のデータは転写オリエンテイショ
ン ■３．７ＫｂｐＥＣＯＲＩ−Ｐｓｔ■片に関してＥＣＯ
ＲＩ からＰｓｔ■であり、そして、かくとも結合機能をコー
ド 化するｆｎｂｐ−遺伝子の部分をこの辺に集収物と を示してしる。これを説明するために、ｐＦＲ００４内 のアンプープロモータは遺伝子副体のレリゲイションに
よ って導かれＥＣＯＲＩ熟成によって除去された。

その 結果としての遺伝子副体ｐＦＲ００８はフィブロネクチ
ン結 合活性を表示しない。ｐＦＲ００１において、内因性 プロモータは図内３の矢印で示されていたようにＥＣＯ
ＲＩサ イトの左手の或る部位に位置している。ここにはｐＦＲ
００１からの 詳細に述べていないが遺伝子副体構成により、ＥＣＲＩ （挿入されている）−ＳａＬ■（ｐＢＲ３２２内）片は
ｐＦＲ００８に 誘導される。フィブロネクチン結合活性はｆｎｂｏ− 遺伝子の転写方向でわかるように、融合はスタフイロゴ カルタンパク質からなる遺伝子が形成された。リルトリ クションされたエンジム・マルチリンカでタンパク質Ａ
遺伝 子をベースとしたＰＲＩＴ３と賞するシセリションベク
トル の表示は（１５）で構成されている。，アルチリンカは
最終 のＩｇＧ−ヘツ合部位の直下に配置されている、斯様に してタンパク質Ａの領域を結合するＣ−ターミナル細 胞壁を除去する。ｐＦＲ００１からの３．７ＫｂｐのＥ ＣＯＲＩ−Ｐｓｔ■片はプロテインＡ−ＦＮＢＰの溶解
タンパ ク質をコード化し表示されたクレームが正しく取付られ
ている ことを期待してこのベクトルに挿入された。このこと は遺伝子副体ｐＦＲ０１３を包合するクロンがタン パク質ＡとＦＮＢＰとの両者を検査して陽性であること が明らかである。

遺伝子副体ｐＦＲ０１３はフィブロネクチン結合活性 をコード化して３．７Ｋｂｐ挿入よりも小さい部位を確
認 するためにイクスヌクレアーゼＢａＬ３１で処理された
、遺 伝子副体はＥＣＯＲＩ或いはＰｓｔ１（それぞれ、 コード化下領域の５′と３′の点）で分裂され、Ｂａ Ｌ３１で何回も処理され、そして再結合された。結合の
間、２０倍以上のＥＣＯＲＩｒｉｎｎｋａが 新しい位置でえＣＯＲＩサイトに誘導するために加え られた。第３図Ｃは３′或いは５′端部またはこれ に相当するフィブロネクチン結合化成の何れかから 得られたものを削除したことを示している。結合活性 をコード化した略７００ｂｐの遺伝子の領域はデレー ションＮｏ５６（５の端部から削除）とＮｏ２２（８の
端 部からの削除）との間に位置している。欠失した遺 伝子副体Ｎｏ５６から新しく誘導されたＥＣＯＲ■サイ トからＰｖｕ１１サイトまでの９００ｂｐ領域はサブ クローンされた。この片はＥＣＯＲ■とＳｍａ■とで 分裂したｐｕｃ１８にクローンされた。これに伴って 引き起された遺伝子副体は、β−ガラクトシターゼと フィブロネクチン結合活性の両者で融合タンパク質にコ
ード化したものであるが、これはＰＦＲ０１５と称 されている。前記片はｐｕｃ１８のマルチリンカにより ＥＣＯＲ■とＢａｍＨＩによるＰＦＲ０１５から再度 クローン化されることができる。

限定された片はまた第３図（Ｂ）で示す如くサブクロー
ンされた。ＥＣＯＲ■−Ｐｓｔ■及びＥＣＯ Ｒ■−ＣＬａＩ片の場合はタンパク質Ａ表示ベクト ルＰＲＩＴ３１が用いられた。片ＢａＣＩ−ｐｖｕ１１ とＢａＬＩ−ＨｉｎｃＩ■はサブクローンされｐｕｃ１
８ 中で圧搾された。ＥＣＯＲ■−ＣＬａＩ片を除いたあら
ゆる場合において、フィブロネクチン結合活 性を有する融合タンパク質が得られた。ＣＬａＩ−ＣＬ
ａＩサブクローンの場合においては陰性結果が誤った表
示クレームに現われる挿入に係ってくる。

溶解タンパク質ＺＺ−ＦＲの製品とその特徴遺伝子副体
ＰＦＲ００１で処理されたＥ．ＣｏＬｉ ＨＢ１０１細胞の浸透ショック溶解流から生ずる１６５
ＫＤタンパク質（第２図）の収量は培養基略４０ｍｇ／
ｌであった。精製するあいた高分子量の 化合物の解体による損失があるけれどもエドジニアスプ
ロモータを有するｆｎｂｐ−遺伝子はＥ．ＣｏＬｉ の中では極く弱く圧搾されるということを示した。

圧搾のレベルを改善するために我々は最近開発され た圧搾システムを用いた。そのシステムは異種構造 のタンパク質をＥ．ＣｏＬｉ（１６）の生長培養基に隠 した。用いられた遺伝子副体ベクトル即ちＰＥＺＺ３１
８ は２つの合成物質で同じ遺伝子のプロモータとシグナ ナル系によって優先するスタフィロコッカルタンパク質
Ａ の遺伝子の僅かに修正されたＩｇＧ−結合領域を包含す
る。ｐｕｃ１８のクローンされたｆｎｂｐ −遺伝子（第３図Ｂ）の焼く６００ｂｐのＢａＬＩ−Ｐ
ＶＶ ＩＩ片はＥＣＯＲ■とＨｉｎｄＩＩで解体したＰＥＺＺ
３１８内にリクローンされた。結合と生物変移ののちＰ
Ｅ ＺＺ−ＦＲは分離した。この遺伝子副体はＩｇＧ結合製
品ＺＺ及びＦＮＢＰのフィブロネクチン 結合領域Ｒから構成されている溶解タンパク質をコード
化する。

ＺＺ−ＦＲタンパク質を生産するため遺伝子副体Ｐ ＥＺＺ−ＦＲを媒介するＥ．コリ−ストレインＨＢ１０
１はトリプティ ケイス　ソイ　ブロースの中で１夜経過した。バクテリ
アは 遠心分離によって除去され、生長培養基はＩｇＧ−セフ
ァロー ゼファーストフローコラムを通過した。ＴＳＴ−バッフ
ァ（ ５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬｐＨ７．４　１５０ｍＭ　Ｎ
ａＣＬ、０．０５Ｚｏ　Ｔｗ ｅｅｎＲ２０）でコラムを洗浄したのち、ＺＺ−ＦＲタ
ンパク質はアンモ ニウムアセテートを用いてＰＨ２．８に滴出された０．
５Ｍ酢 酸で溶出した。略５０ｍｇのタンパク質は生長培養基の
ｌ当たりのコラムから溶出された。

親液したのち溶出物質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された
。そのことは第４図に示す如く略６ＫＤにおける主たる
タンパク質バンドを表示している。

付加するに、より小片となったバンドは溶解タンパク質
の加水分解により現われる。同じゲルに代用した完全な
タンパク質Ａは５６ＫＤの回りを分散型バンドとして現
われる。ゲル中のタンパク質は硝酸ペーパーへ電気泳動
的に運ばれ１２５■−ラベルド２９ＫＤフィブロネクチ
ン片で精 査される。第４図のＣｔｏＤの列は溶解タンパク質であ
るか完全タンパク質Ａではない置換して識別するフィブ
ロネクチン片として東郷することを 表示している。

ＺＺ−ＦＲ溶出タンパク質のフィブロネクチン結合 性能のための証拠は２９ＫＤフィブロネクチン片で置 換されたセファローゼコラムについて類縁性クロマト グラフィによって得られた。溶解タンパク質はコラムに
結合し、そして６ＭＧＯＨＣＬ（第５図Ａ） で類縁性マトリックスから溶出された。ＺＺ−ＦＲ溶解
タンパク質のフィブロネクチン結合特性は明らかにＦＲ
−レジホン中に位置しており、というのは、完全タンパ
ク質Ａは類縁性マトリックス（第５図Ｂ）に結合しなか
った。類縁性マトリックスに結合しなかったＺＺ−ＦＲ
溶解タンパク 質の製造した部分は完全な溶解タンパク質（第６図Ａ列
）よりも低いＭγでタンパク質を構成してあり、そのた
めにコラムに結合している物質は完全な６３ＫＤＺＺ−
ＦＲ溶解タンパク質（第６図Ｂ列）の殆ど純粋な製品か
ら構成されている。

クローンされたＦＮＢＰと見做すことができるところの
ステファロコッカスのフィブロペクチン結合性 能が大きさを決めるために量を調整された。第７図に示
す如く、溶解タンパク質は全体的にはエス・アウレウス
ニューマンと８３２５−４タンパク質Ａの両 者の細胞に対して完全なフィブロネクチンと同様に １２５Ｉ−ラベルド２９ＫＤ片の結合を抑制した、これ は制御材として用いたが（第７図に示す如く）結合 性を抑制するものではない。

エス・アウレウムがフィブロネクチンに対して結合する
というクッセラ （６）による報告の後、結合に対して反応するバクテリ
ア の構成要素を確認する試みが集中的になされた。これら
の研究に対する合理性は病原となるバクテリアのフィブ
ロネクチンに対する結合は感染 の早期段階で極めて重要な組織密着の 機構を現わすことができる。類縁性クロマトグラフィに
よるインモピウイズドフィブロネクチンに関する 精製したタンパク質はフィブロネクチンに対するスタフ
ィ ロコッカル細胞の結合において包合される。しかし、 フィブロネクチン結合タンパク質の分子量の報告は １８ＫＤ（１０）から常に１９７と２１０ＫＤ（１１、
１７）に 変化する。分子サイズの異種成分の主な理由は分離過程
中タンパク質を分解することができる。

本発明の説明において、エス・アウレウスストレイン８
７２５−４からのフィブロネクチン結合タンパ ク質に対してコード化した遺伝子のイ−・コリー内のク
ローニングが記載されている。Ｆｎｂｐ遺伝子 が内因的なプロモーターからイ−・コリー内で圧搾され
るとき タンパク質はオマモティックショックによってペソ プラズムから分離することができる。このことはプロモ
ーターのみでなくシグナルペプチドがイ−・コリー 内では機能的であることを示している。

クローンされたｆｎｂｐ−遺伝子によるコード化された タンパク質であっても１６５とよりＫＤ（第２図）の分
子量 を有する。その数字はエス・アウレウスストレーンニュ
ーマン （Ｍγ＝２１０ＫＤ）（１２）から分離されたＦＮＢＰ
より小さい。

それ等のアミノ酸構成は陰性タンパク質（表１）のそれ
に極く類似している。更に尚自然のＦＮＢＰ に対して発生する抗体は１６５と８７ＫＤタンパク質 に交互反応する。これ等のデーターはエス・アウレウス ストレーン８３２５−４からのクローンされた遺伝子に
よって コード化されたタンパク質の構造はエス・アウレウス ニューマンからの自然のＦＮＢＰのそれに類似してい るということを示している。８７ＫＤタンパク質は 転写或いは翻訳レベル或いは１６５ＫＤタンパク質の 選択的タンパク質の分裂において死の前に起る原因 となる。現在においては。１６５ＫＤのタンパク質が エス・アウレウス細胞に対し、フィブロネクチン結合の
抑 制間で８７ＫＤタンパク質よりも３０倍も多い活性 がなぜ出るかを説明することができない。

ＢａＬ３１−分裂とリストリクション片のサブクロー ニングを用いて精密に削除することによりフィブロネ クチン結合活性をコード化するｆｎｂｐ遺伝子の領 域は略３５０ｂｐ（第３図Ｂ）の領域に位置した。

３５０ｂｐをカバーする略６００の遺伝子片は圧搾ブク トルＰＥＺＺ３１８（１６）によってタンパク質Ａプロ
モーターと シグナル系によって優先したタンパク質Ａ遺伝子の 合成ＩｇＧ結合領域の縦列に繰返された系（ＺＺに直接
結合した。その結果ともたらされた溶解タンパク質（Ｚ
Ｚ−ＦＲ）は、ＳＰＤ−ＰＡＧＥ（第４図） で決定された略６３ＫＤの分子量を持っているが、ｆｎ
ｂｐ遺伝子から６００ｂｐ挿入によりコード化 された略２００アミノ酸を包含する。タンパク質のＣ− ターミナル端はアミノ酸を構成しており、それは翻訳段
階コードが到達するまでベクトルのラックＺ遺伝子をク
レームの外側を読み通す結果となる。高いレベルで圧搾
され且つＥ．コリーの生長 培養基に隠れているところの溶解タンパク質（ＺＺ−Ｆ
Ｒ） はＺＺ−領域のＩｇＧ−結合性能の使用する類縁性クロ
マトグラフィによって容易に分離される。

ＺＺ−ＦＲタンパク質はフィブロネクチンの２９ＫＤ ＮＨ２−ターミナル領域に結合されて、そして、エス・
アウ レウス（第５、６図）に対して完全なフィブロネクチン
の結合 を抑制する。これらのデーターは他のタンパク質を 用いた培養条件のもとでは、またフィブロネクチンの２
９ ＫＤＮ−ターミナスの外国の認識された領域では、 スタフィロコッカル細胞によって圧搾されない。

更に、 ＦＮＢＰのフィブロネクチン結合活性はタンパク質の かなり小さいセグメントに喰い止める。エス・アウレウ
ス ストレーンニューマンから分離された自然の２１０ＫＤ ＦＮＢＰについての最近の分析はこのタンパク質が多価
染色体群でＦＮＢＰの１分子は６−９フィブ ロネクチン分子（１２）を結合することができるという
こ とを現わしている。クローンされたｆｎｂｐ−遺伝 子はストレースエス・アウレウス８３２５−４から抽出
される。

若しエス・アウレウスのストレーンの間に何等の差異 もなかったならば数種の繰返系を含むためにＦＲ−領域
を除外することになるであろう。この疑問はまたクロー
ンされたｆｎｂｐ遺伝子の系の分 析によって回答される。ＦＮＢＰ−プロパティーを 持ったＦＲ−領域の系は第８図に示されている。

ＦＲ結合活性は結合活性（第３図）をコード化した ＢａＬ１−ＰｖｕＩＩ片のように再現する３個の３８ア
ミノ酸の各々 に関係することは信ずるに充分な理由がある。このこと
は 結合活性をコード化したＢａＬ１−ＨｉｎｅＩＩ片や、
同様に 結合活性をコード化しないＨｉｎｃＩＩ−ＰｖｕＩＩ片
からも 理解できる。更に１個の単純な３８アミノ酸の複製は フィブロネクチンを結合するのに機能的である。

従って、合成 した３８−アミノ酸の長いペプチド（３８（２）−複製
）は結 合活性を有する（第９図に示す）。３８アミノ酸の複製 物の各々は同族である。

実験例２ ３８アミノ酸｛３８（２）複製｝のフィブロネクチン結
合 領域をコード化したリン酸基系をベースとしたポリペプ
チド の化学的合成物はＣ−ターミナルヒステイデンから出発
し、 固有のアミノ酸と反 応させる段階から、Ｋ．Ｂ．メルフィールド，Ｊ，Ａｎ
ｕ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ ８６，ＰＰ．３０４（１９６８４）による方法でコード
化した固体相 からな合成物で最終的にＮ−ターミナルでグリシンと反
応 させヌクレオチドに相当するアミノ酸系で組立てられた
。

これにより、第２のアミノ酸複製に相当するポリペプチ
ド法 合成物である。同様に第３のポリペプチドは３８−リピ
ート である、ｖｉｚ：１）、アミノ酸１−１９、をカバーす
るポリペプチド２）、 アミノ酸９−３０をカバーするポリペプチド３）、アミ
ノ酸２０−３８ をカバーするポリペプチド、等はすべて同様な方法によ
り コード化した合成物である。

コンプリート３８−リピートのフィブロネクチン、１−
１９アミノ酸 ポリペプチド、９−３０酸ポリペプチド、２０−３８ア
ミノ酸 ポリペプチドの３種の小さいポリペプチドが検査され、
そして その結果は第９図に示される。コンプリート３８リピー
トの 片はフィブロネクチン結合物が予期するようにコンプリ
ート３８ リピートと依るか、或いはフィブロネクチン結合特性が
３８ア ミノ酸系の或る小さな領域に限定されるとしても検 査のために合成される。第９図から明らかな如く、フィ ブロネクチン結合特性はコンプリート３８アミノ酸ペプ
チド に存在すみである。

物質とその製法 菌株と遺伝子副体。スタフィロコッカスアウレウム 菌株８３２５−４からのクロモソマルＤＮＡＰＢＲ３２
２（遺伝子 貯蔵所）はフィブロネクチン結合活量を圧搾したクロー
ン を濾過する。イ−・コリー株菌ＨＢ１０２，（１８）と
ＪＭ１０５（１９ はサブクローンや圧搾実験に用いる。遺伝子副体生物 はｐＢＲ３２２（２０）とｐＵＣ１８（２１）とタンパ
ク質Ａベクター ｐＲ１Ｔ３（１５）とｐＥ２２３１８（１６）であった
。エス・アウレウ ス株菌コーワン１、ニューマンと８３２５−４はＦＮＢ
Ｐの の分析評価に用いられる。

微生物生長媒質。イ−・コリーの培養においては下記の
如き媒質が用いられる。媒質の１リトレに関する分子 の量である Ｔｒｙｐｔｏｎ　Ｓｏｙ　Ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ　Ｌ
ｔｄ， Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｈａｎｔｓ，ＧＢ）　３０ｇ Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｏｘｏｉｄ）　１０ｇ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ　４０ｇ ＮＨ４ＣＬ　２．５ｇ Ｎａ２ＳＯ４．２Ｈ２Ｏ　７．５ｇ ＫＨ２ＰＯ４　３．０ｇ Ｎａ２ＳＯ４．１０Ｈ２Ｏ　２．５ｇ ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ　０．２ｇ ＣａＣＬ２．２Ｈ２Ｏ　０．５ｍｇ ＦｅＣＬ３．６Ｈ２Ｏ　１６．７ｍｇ ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ　０．１８ｍｇ ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ　０．１６ｍｇ ＭｎＳＯ４．４Ｈ２Ｏ　０．１５ｍｇ ＣｏＣＬ２　０．１０ｍｇ ＮａＥＤＴＡ　２０．１ｍｇ フィブロネクチン結合タンパク質（ＦＮＢＰ）の分析評
価の エス・アウレウス細胞に結合するフィブロネクチンの定
量 的測定は前述の（１０）に記載されている。若し他の方
法での 記述がないならば、エス・アウレウスコーワン■の１０
９細胞 は合計容積０．３ｍｌ中に牛血清１ｍｇ／ｍｌを含むｐ
ＢＳ 中にフィブロネクチン２９ＫＤＮＨ２−ターミナル片や
１２５■− ラベルドフィブロネクチンで加熱される。２２℃で２時 間加熱後、放射物線を細胞に当てながらガンマ計数管で
計測する， （１３）項記載のリソジチ を含むＴｈｉｓ−Ｈｅｌバッファ、ｐＨ８，１で製造さ
れたイ−、 コリ−クローン溶解物はフィブロネクチンの１２■■−
ラベル ド２９ＫＤＮＨ２−最終片と結合させるためスタフィロ
コッカス細 胞との反応性能についてその性能を測定することにより フィブロネクチン結合活量を分析した。５０％の結合力 を抑制し得るＦＮＢＰの量は１ユニットの活量として 考えられる， オスモティックショック処理はイ−・コリ−（１４）の ペリプラスミッタスペースからタンパク質を解放するた めに用いられる， ＦＮＢＰの精製。

ＮＦＢＰの精製はイオン交換クロマトグラフィによって
処 理されたフィブロネクチン−セファローズの親和クロマ
トグラフィを ベースとする， ヒトのフィブロネクチンは既に記載された方法（２２）
による 旧式な血から製造される。それからヒィブロネクチンは
２０ｍＭ トリイス−ＨＣＬ，８，３ＰＨに対して透析される，そ
してＤＥＡＥ− コラムに濃縮される。セファローズＳＬ−４Ｂに対する
フィブ ロネクチンの粗引は既に知られている（２３）のような
ブロモ シアン活性処理によってなされた。

イ−・コリ−溶解物は親和コラム上に吸引される、これ は続いて発生するところの、バセリンが安定なもの（４
コラム量） となるまで０．５Ｍアンモニウムアセテートで洗浄され
る。それ からＦＮＢＰは０．４Ｍのアセティック酸で溶出された
，をして 他はアンモニア或はリオフィライズドで中和される。

更にＰＨ７．６に調製したアンモニアで１０ｍＭのアン
モニウム アセテートを透析したのち、更に、分別段階ではモノＱ コラムを用いたファーマシカＦＤＬＣ装置上で、イオン
変換 クロマトグラフィによってなされる。

ヌクレオチド系の分析 ヌクレオチド系はユイザムＡ．Ｍ．等（２７）によって
記 載された方法で決定される。

アミノ酸の分析。アミノ酸組成物はダラムＤ−５００分
析器を用いて決定される。このサンプルは１１０℃２４
時 間フェノル２ｍｇ／ｍｌを含んだ６ＭＨＣＬ内で加水分
解される。

１つのサンプルはシステインとメシオニンで測定するた
めにパフォ ーミック酸で酸化される。ノルロイシンはインターナル
スタンダ ードとして添加される。タンパク質は標準的にはボビン
セラ ムアルプミンを用いて（２４）に基づいて法定される。

電気泳動。他の方法を示し得ないなら、ＳＤＳ−ポリア
ク リルアシドヂルの電気泳動は５〜１５％の傾度を有する
ゲル で実行される。このゲルはコッマッシブリリアントブル
ー やデーステインド及び撮影するかして着色される。

標準免疫検定法による処理。１６５ＫＤのＳＤＳポリア
クリルアミド・ゲル・電気泳動法で定量的に測定 された分子量からなる精製ＦＮＢＰは（２５）で知られ
るよ うにクロラミンＴｏ方法による１２５■−オデインで分
類表示 される。その後、イオディネイトン物質はフィブロネク
チン−セファ ローズコラムにリクロマトグラフィされる１２５■−Ｆ
ＮＢＰ（３４００ｃｐｍイン１０μｌ）を含む加熱 混合物はラビットアンチセラム（ニス・アウレウムスト
レイン ニューマン）の種々のディリューションと混合される、
これは、 ０．２ｍｌの加熱バッファ（ＰＢＳ，０．１％トリトン
メ−１００と ０．０２％のソテイウム酸）中でされる。

上記サンプルは抗原抗体反応を許容するため２０℃で ２時間に亘り加熱する。ＰＢＳ中に６０％のサスペンシ
ョン ０．１ｍｌ（ｗ／ｖ）のタンパク質Ａ−セファローズが
加えられ、そ して、その混合物は相当の時間が熱された。この加熱は そのサンプルに１．７ｍｌの加熱バッファを加えること
により 停止した。２０００ｒｐｍ３分間遠心分離したのち表面
浮 遊物を吸収して排出した。ペセットは加熱バッファ中で ２回洗浄し、そして、タンパク質Ａ−セファローゼに関
係あるラ ジオアクティビティはガンマ測定器で測定された、 制限ニンドヌクレアーゼと他のエンジム。

リストリクションエジム、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとＢＡＬ ３１はＢＲＬから獲得する、そしてリコメンディション
に従って用い られる。複雑化したＰＮＡ工学の他の方法は本質的に （２６）の項で知られている。

表１ イ−・コリ−ｐＦＲ００１から分離したフィブロネクチ
ン結合タンパク 質（８７と１６５ＫＤ）のアミノ酸組成物とエス・アウ
レウス 溶液、たまには、薬学的に許容し得る分散媒介物を加え
て分散させる。種々異なった補助剤は組織内の開放を支
えるために用いることができる、そして 身体の免疫制御組織に長期間に亘ってタンパク質やペプ
チドを露出せしめる。

免疫を得るための適切な投与量はｋｇ／体重ＦＮＢＰ或
いはポリペプチド０．５〜５μｇであり、免疫剤を注 入する。永続性のある免疫を得るため、少くとも１〜３ 週間の間隔を隔てて１回以上連続的に、好ましくは ３回遂行すべきである。

本発明に係るＦＮＢＰ．或いはポリペプチドを用いると き、タンパク質は局所部位を治療するため２５〜２５０
μｇ／ｍｌ の濃度で均等塩溶液に分散させる。それにより、傷は 傷表面が完全に湿った状態を得るための量で治療される
。このようにして、通常の傷はほんの２〜３ｍｌ の溶液しか用いられなくてよい。傷にタンパク溶液を用
いて手当したあとは傷は均等塩溶液或いは他の適当傷治
療溶液で適切に洗 浄される。

更に、本発明は最小のフィブロネクチン結合サイトポリ
ペプチドのようなフィブロネクチン結合タンパク質 がスタフイロコッカルストレインによって引き起された
バクテ リアの感染を診断するために用いられる。これにより、 本発明に係るフィブロネクチン結合タンパク質は固形 担体に固定する。これは小さい乳液或いはセフアロー ゼＲビードである。それで，抗体に含まれるリンパ 液は通過の許容されてＦＮＢＰと反応し、固定される。

それから、傷口の癒着は公知の方怯で測定される。

更にＦＮＢＰ或いはポリペプチドはＥＬＩＳＡテスト（
Ｅｍｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓ ａｙ；Ｅ　Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．５５、
１９３、１９７７） で用いられる。ポリスチレンマイクロライトレプレート のウエルはＦＮＢＰで塗布され，それから４℃で１夜 培養する。前記プレートは０．５％。ツイ−ン２０を含
む ＰＢＳを用いて完全に洗浄される。そして乾燥される。

順次希釈されたパテイエントセラムはＰＢＳ−トイ−ン
に形 成され、前記ウエルに添加される。そして３０°で１．
５ 時間培養される。洗浄したのち、酵素と接合した抗 人−ＩｇＧや酵素と接合した抗中はウエルに添加した のち、３０°で１．５時間培養される。それから、前記
ＩｇＧが 結合したとき洗浄する、それから、酵素の基質がアルカ リ性リン酸酵素の場合はｐ−ニトロリン酸塩が添加され
、過酸化水素系酵素の場合はオートハニレンジアニン基
質（ＯＰＤ）が用いられる。このように． ウエルを含むプレートが０．０５５％のＯＰＤ、と０．
００５％の Ｈ２Ｏ２、とを用いて洗浄し、そして３０°で１０分間
培養した。

酵素の反応はウエルに対し流酸の４Ｎ溶液を添加するこ
とにより停止する。色彩的に改良するには スペクトル光度計を用いて測定する。

フルオロスセンス測定に用いる酵素基質の型によつては
ウエルのように用いることができる。

スタフイロコツシ感染を診断する他の方法はＦＮ酵素が
３８アミノ酸ポリペプチド系か直ベースとする方法 で判明するＤＮＡ遺伝子を用いることによるものである
。

これにより、自然または合成ＤＮＡ系は固体の担体に アタッチする、上記のようなポリスチレンプレートは乳
腺 突を診断する場合のミルクをその表面に加える．。

ＤＮＡ遺伝子はラベルドインジマテイカリのときもある
が、 その他に、ライオアクテイブアウソトープがＤＮＡ系を 含む固体表面プレートに加えられることにより証明され
る。これにより、ＤＮＡ遺伝子は外部より視 認し得る葉に付着することにより証明する。酵素やラジ
オアクテイブアイソトープは既に公知の方法 によって決定することができる。

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ボラトリ　マニアル， ゴールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー，ニュ
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ーレン， エム，（１９８５），エンボ　ゼイ，４，１０７５−１
０８０， １６、ニルソン，ピー，，モックス．テイ−．，ジャン
ソン，ビー，， アブラハムセン，エル，，エルムブラッド，ニイ，，ホ
ルムグレン， イ−，，ヘンリクソン，エル，，ジョネス，テイ−，エ
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セル，エヌ．ジー；とヘペル，エル，エイ．（１９６５
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イ−，（１９８６） セル，４４，５１７−５１８． １０、リデン，シー．，ルビン；ケイ．，スペジール，
ピー．，フック， エム．，リンドバーグ，エム．とワドストローム，テイ
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スペジァル．， ピー，，ルビン，ケイ，，リデン，シー，，クローマン
，ジー，， ハリス，エイ，，リンドバーグ，エム，，ホック，エム
，，（１９８５）， イン　ジャクソン，ジー，ゼイ，（ｅｄ），パーソゼエ
ンス　オブ　イン フエクシヨン，スプリンガー　パーラグ，ベルリン，ハ
イデルベルグ， ニューヨーク，東京，ピーピー，１９３−２０７． ４、ウッヅ，エイ，，カーチマン，ゼイ，アール，，ヨ
ハンソン， エス，，とホック，エム． ５、ヤマダ，ケイ，エム．（１９８３），アニュー，レ
ブ，バイオケミカル， ５２，７６１−７９９，

【図面の簡単な説明】

第１図はフィブロネクチン−セファローゼの親和なクロ
マトグラフィ， イ−．コリークローン，．ＦＲ００１のコールド　オモ
ステイック　シヨックに よって得られた溶解物（８６ｍｌ）は２９ｍｌ２ｍのア
ンモニウム アセテートと混合された。それから，実験例のサンプル
は５０ｍｌ／■の率（流動） ０、５ｍのアンモニウム　アセテートと釣合いをよって
　コラム（１、９×５、７ｃｍ）に適用された。これか
らコラム／該サンプルの適用後該コラムは２０ｍｍ／ｈ
ｐ の流動率の０．５ｍのアンモニウム　アセテートの４個
のコラムと共に流 作された。同時にＵＶ−モニターの感度は５０■数によ
って増 大されていった。２００〜２２０ｍｌの間の量で流出す
る物質 はプールされ、アンモニウムハイドロオキサイドで中和
し■■ １０ｍＭｏアンモニウムアセテートｐＨ７．６を分離し
た。 第１図Ｂイオン交換クロマトグラフイ 第１図Ａにします親和力クロマトグラフイで分離した 物質からなる１０ｍｌのサンプルは１０ｍＭアンモニウ
ムアセ テートｐＨ７．６と平衡をとった陰イオンコラム１ｍｌ
Ｑ（ファーマンア スウェーデン）に適用した。流動率は２ｍｌ／分で、該
コラム は２５ｍＭ／ｍｌのアンモニウムアセテートの濃度で増
大 することにより溶出した。（図上■と■）の２７のピー
ク は図に示されているようにプールされた。 第２図、イ−・コリーｐＦＲ００１のオスモティックシ
ョック 溶解物の異なった精製段階からのポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動。 溶解物は親和力コラム（フィブロネクチン−セフア ローゼ）に適用される（レーン１）、非吸着（レーン２
）、吸 着（レーン３）物質、Ｅ／ＱＦＰＬＣコラム（ファーマ
シア、スウ ェーデン）に親和力精製物質のイオン交換クロマトグラ
フイ： プール１（レーン４）と第１図Ｂに示すようなマークし
たプール■（レーン５）、 第３図レストリクションマップ、サブクローンとｐＦＲ ００１に挿入したデレーション。 （Ａ）６．５ＫＤを挿入したリストリクションマップ（
Ｂ） フィブロネクチン結合活性をコード化した遺伝子の領域
を ■定するために構成された種々のサブクローン。 （Ｃ）エク ソナクリーズＢａＬ３１で処理することによりえＣＯＲ
１− Ｐｓｔ■−片の３′か５′かから製造されたデレーショ
ン、 異なる遺伝子生産法のためのフィブロネクチン結合活性 は示されている。 第４図、ＺＺ−ＦＲタンパク質のポリアクリルアミド遺
伝子の電気泳動。 タンパク質Ａ（シグマケミカルＣｏ，Ｓｔ．ルイス；レ
ーンＡ）と ＺＺ−ＦＲタンパク質（レーンＢ′）は５〜１５％のポ
リアクリ ルアミドゲルのＳＤＳに電気泳動させるために還元 させる。該ゲルは直ちにコマッシーブルーに濾過された
、 レーンＣとＤ内におけるＺＺ−ＦＲ溶解タンパク質と タンパク質Ａは夫々５〜９％のポリアウリルアミドゲル のＳＤＳ−電気泳動によって分留し、ニトロセルローズ
紙で 吸収したのち、（フローマン等１９８７）の記載のよう
な１２５■−ラベル ド２９ＫＤフィブロネクチン片で検診する。矢印は公知
の 第５図、ＺＺ−ＦＲタンパク質の親和力クロマトグラフ
イ− ＺＺ−ＦＲ溶解タンパク質（０．６ｍｇ；パネルＡ）と
タンパク質 Ａ（シグマケミカルＣｏ；０．５ｍｇ；パネルＢ）は２
９ＫＤフイブロネ クチン片に置換したセフアローズ４ＢＣＬの７ｍｌのコ
ラム に適用した。該コラムはＰＢＳ内の０．５Ｍｏ塩化ナト
リウム で記載し、そして直ちにＰＢＳ中の６ＭのぐＨＣＬで溶
出 した。２ｍＬの分留物が集収され、バイオラッド系に用
いる タンパク質を評価分析した。 第６図、ＺＺ−ＦＲ溶解タンパク質のポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、親和性クロマトグラフイによ る分留 ２９ＫＤ親和力コラムからの物質が化合しないもの（レ
ーンＡ） と化合して溶出するもの（レーンＢ）の夫々の物質は５
〜１５％ のポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ−ゲル電気泳動によ
っ て分析される。該ゲルはコーマッシーブルーで着色され
、 矢印は公知の分子量の標準タンパク質の移動距離を 表示する。 第７図、結合性の抑制、バクテリア細胞の１２５エーフ
ィブロネクチン 菌株ニューマン（パネルＡ）か菌株８３２５−４（パネ
ルＢ） のスタイロコッカル細胞（５×１０７）は菌株ニューマ
ン（パネルＡ） か菌株８３２５−４（パネルＢ）かのスタイフイロコッ
カル細胞（５× １０７）はＺＺ−ＦＲ溶解タンパクかタンパク質Ａかの
量■ に増大するもので１時間０．５ｍｌの全汁量で０．１％
ＢＳＡ と０．１％トウイ−ンＲ１とで捕捉させるＰＢＳ中の５
×１０４シ ピエムの１２５エーフィブロネクチン片（△−△）で培
養 する。 第８図Ａ１Ａ２、フィブロネクチン結合タンパク質を コード化したナクレオチド系 用い居られるアミノ酸と協同作用にするフィブロネクチ
ン結合 タンパク質をコード化したナクレオチド系、異なった■
■アミノ酸 リピート、Ｂａｌ■−Ｈ：ｎｃ■−Ｐｖｕ■を■置した
リストリクション か図■に示されると同様に異なったナクレオチド系に付
随 するアミノ酸系を有するものである。 第９図。化学的に合成したポリペプチドのフイブロ ネクチン結合活性。 ポリペプチド片のフィブロネクチン結合活性を使用して 実験例２に行う化学的に合成した３８アミノ酸ポリペプ チドのフィブロネクチン結合性能、アミノ酸系の３８（
２）リピート に付随するポリペプチド（＊−＊）表示，アミノ酸原の
ア ミノ酸１−１９に付随したポリペプチドの（□−□）表
示，アミノ酸 ■のアミノ酸２０−３８に付随したポリペプチドの（○
−○） 表示，アミノ酸原のアミノ酸Ｎｏ９−３０に付随する ポリペプチドの（△−△）表示，とアミノ酸１−１９，
アミノ酸 ２０〜３８，アミノ酸９−９０のポリペプチドを含むポ
リペ プチド混合物，加えられたμｇ単位のポリペプチド に対して■かれた結合性能。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）フィブロネクチン結合性を有するタンパク質及び
   ポリペプチドをコード化したエス・アウレウスのナクレ
   オチド系からなるハイブリッド−ＤＮＡ−分子。
2. （２）フィブロネクチン結合性を有するタンパク質及び
   ポリペプチドをコード化したエス・アウレウスのナクレ
   オチド系からなる遺伝子副体或いはファージ。
3. （３）当該番号ＤＳＭ４１２５を有するイ−、コリ−ス
   トレイン２５９に含有する遺伝子副体ＰＥＲＣＣ１
4. （４）前記フィブロネクチン結合タンパク質を表示する
   イ−、コリ−ストレイン。
5. （５）ＤＮＡ分子を組換えることにより形質を転換した
   Ａ微生物。
6. （６）下記に表示するナクレオチド系の１個またはそれ
   以上のものからなることを特徴とする請求項（１）乃至
   （３）のハイブリット−ＤＮＡ−分子、 【遺伝子配列があります】
7. （７）、ナクレオチド系が１個またはそれ以上からなる
   請求項（６）の遺伝子副体及びファージ。
8. （８）少くとも遺伝子副体またはファージを含む請求項
   （７）の微生物。
9. （９）ａ）微生物を誘導した少くとも１個以上のハイブ
   リット−ＤＮＡ−分子とｂ）生長プロモーティングメデ
   ィアムで培養した微生物とｃ）イオン化クロマトグラフ
   ィと連続するインソルビライズド担体に化合するフィブ
   ロネクチンのコラムで親和性クロマトグラフィ手段で分
   離して形成されたタンパク質からなるフィブロネクチン
   結合タンパク及びポリペプチドの製法。
10. （１０）アミノ酸残基はタンパク質またはポリペプチド
    をコード化したナクレオチド系をベースとして構成し、
    Ｃ−ターミナルヒスティディンから出発し、該Ｃ−ター
    ミナルヒスティディンは適当なアミノ酸と段階的に反応
    させ、これにより最終的にＮ−ターミナルエンドでグリ
    シンと反応させるフィブロネクチン結合タンパク質また
    はポリペプチドの化学的合成法。
11. （１１）少くとも１個以上の下記の如きアミノ酸系物質
    から構成されるフィブロベクチンまたはポリペプチド。 【遺伝子配列があります】