FI101552B - Hybridi-DNA-molekyyli, joka koodaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia s ekä menetelmä proteiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

101552

Hybridi-DNA-molekyyli, joka koodaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia sekä menetelmä proteiinin valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään fibronektiiniä sitovan proteiiniin val-5 mistamiseksi sekä hybridi-DNA-molekyyleihin, esim. plasmideihin tai faageihin, jotka käsittävät nukleotidisekvenssin, joka koodaa sanottua proteiinia. Lisäksi hakemuksessa kuvataan mikro-organismeja, jotka käsittävät sanottuja molekyylejä, ja niiden käyttöä sanottuja proteiineja valmistettaessa.

Esillä olevan keksinnön kohteena on saada aikaan minimaalinen fibronektiiniä sito-10 va proteiini.

Lisäksi kohteena on saada aikaan sanottu proteiini geenitekniikalla käyttämällä esim. plasmidia, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodaa sanottua proteiinia.

Muut kohteet ilmenevät seuraavasta selityksestä.

WO-A1-85/05553 selostaa bakteerisolupintaproteiineja, joilla on fibronektiiniä, 15 fibrinogeeniä, kollageeniä ja/tai laminiinia sitova kyky. Täten on osoitettu, että eri bakteereilla on kyky sitoutua fibronektiiniin, fibrinogeeniin, kollageeniin ja/tai la-miniiniin. Lisäksi on osoitettu, että fibronektiiniä sitovan proteiinin molekyylipaino •. i on 165 kD ja/tai 87 kD, joten on oletettavissa, että pienempi proteiini on suuremman : :: osa.

| ·. | 20 Fibronektiini on suuri glykoproteiini (Mr suunnilleen 450 kD), jossa on kaksi sa-! manlaista alayksikköä, joiden molekyylikoko voi vaihdella riippuen prekursori- * : mRNA:n (1) kompleksiliitoskaavasta. Fibronektiinin pääasiallinen funktio, jota • · · *·’·* fibronektiiniä on löydetty ruumiinnesteistä, verihyyteistä ja solunulkoisista matrik- seista, näyttää olevan kohdistunut proteiinin kykyyn välittää useimpien eukaryootti- : *·· 25 solujen substraattiadheesiota (2, 3, 4, 5).

• · · • « · • · · ..· Seitsemänkymmentäluvun loppupuolella Kuusela havaitsi, että fibronektiini ei vain : toimi yhdessä eukaryoottisolujen kanssa, vaan sitoutuu Staphylococcus aureuksen soluihin (6). Tästä havainnosta lähtien on lukuisten patogeenisten mikro-organis-mien osoitettu sitoutuvan fibronektiiniin suurella spesifi syy stasolla ja suurella affi-30 niteetillä (7). Fibronektiini näyttää toimivan solunulkoisessa matriksissa myös erilaisten mikro-organismien kasvualustana. Fibronektiiniin sitoutuminen on monille 2 101552 mikro-organismeille ratkaiseva vaihe isännän kudoksen asuttamisessa ja tulehduksen kehittämisessä.

Useita erilaisia solupintakomponentteja on havaittu fibronektiinireseptoreiksi Gram-positiivisissa bakteereissa lipotekiohapot (8, 9) ja proteiini (10) mukaanlukien. 5 Aikaisemmissa tutkimuksissa fibronektiiniä sitova proteiini, jonka Mr on 197-210 kD, on eristetty S.aureus-lajista Newman (11, 12) ja se on identifioitu kokeellisesti fibronektiinireseptoriksi. Tämän fibronektiiniä sitovan proteiinin, joka on peräisin S. aureuksesta, lisäluonnehtimiseksi kloonattiin tätä proteiinia varten oleva geeni E. colissa. Tässä proteiinissa oleva fibronektiiniä sitova alue on myös paikallistettu ja 10 tämän domeenin sisältävän fuusioproteiinin ja proteiini A:n IgG:tä sitovien alueiden käyttäytymistä selostetaan jäljempänä.

Nyt on yllättäen havaittu mahdolliseksi ottaa talteen hybridi-DNA-molekyyli, joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka koodaa proteiinia tai polypeptidiä, jolla on fibronektiiniä sitovia ominaisuuksia. Todisteena tästä on seuraavanlainen nukleotidi-15 sekvenssi läsnä geenissä, joka koodaa sanottua proteiinia:

GGC CAA AAT AGC GGT AAC CAG TCA TTC GAG GAA GAC ACA GAA GAA

GAC AAA CCT AAA TAT GAA CAA GGT GGC AAT ATC GTA GAT ATC GAT

TTT GAT AGT GTA CCT CAA ATT CAT GGT CAA AAT AAA GGT AAT CAG

TCA TTC GAG GAA GAT ACA GAA AAA GAC AAA CCT AAG TAT GAA CAT

20 GGC GGT AAC ATC ATT GAT ATC GAC TTC GAC AGT GTG CCA CAT ATT

CAC GGA TTC AAT AAG CAC ACT GAA ATT ATT GAA GAA GAT ACA AAT

i AAA GAT AAA CCA AGT TAT CAA TTC GGT GGA CAC AAT AGT GTT GAC

• · *

TTT GAA GAA GAT ACA CTT CCA AAA GTA AGC GGC CAA AAT GAA GGT

• ·

CAA CAA AGC ATT GAA GAA GAT ACA ACA CCT CCA ATC GTG CCA CCA

25 ACG CCA CCG ACA CCA GAA GTA CCA AGT GAG CCG GAA ACA CCA ACG

• · ·

CCA CCA ACA CCA GAA GTA CCA AGT GAG CCG GAA ACA CCA ACA CCA

.. CCG ACA CCA GAA GTG CCG AGT GAG CCA GAA ACT CCA ACA CCG CCA

• «

ACA CCA GAG GTA CCA GCT

• · « • · « :·. Keksintö käsittää lisäksi plasmidin tai faagin, joka käsittää nukleotidisekvenssin, jo- • · · j · · ·. 30 ka koodaa sanottua fibronektiiniä sitovaa proteiinia.

Keksintö käsittää lisäksi mikro-organismin, joka käsittää vähintään yhden edellä . · · *. esitetyn mukaisen hybridi-DNA-molekyylin.

Keksintö käsittää lisäksi menetelmän fibronektiiniä sitovan proteiinin valmistamiseksi, jossa menetelmässä vähintään yksi edellä esitetty hybridi-DNA-molekyyli 3 101552 viedään mikro-organismiin, viljellään sanottua mikro-organismia viljelyväliaineessa, ja eristetään täten muodostunut proteiini liukenemattomaan kantoaineeseen sitoutuneesta fibronektiinistä tehdyn afiiniteettikromatografian avulla, jota seuraa ionin-vaihtokromatografia.

5 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Sopivat kantajaproteiinit voidaan liittää aminohapposekvenssiin samoin, kuten pro-teiini-A:n IgG:tä sitovat alueet.

Kuvio IA esittää affiniteettikromatografiaa fibronektiini-Sepharosella Lysaattiin (86) ml, joka saatiin E. coli -kloonin pFROOl kylmällä osmoottisella 10 shokilla, sekoitettiin 29 ml 2 M ammoniumasetaattia. Näyte levitettiin sitten kolonniin (1,9 x 5,7 cm), joka oli tasapainotettu 0,5 M ammoniumasetaatilla 50 ml/h virtausnopeudella. Näytteen levittämisen jälkeen kolonni pestiin viidellä kolonnitila-vuudella 0,5 M ammoniumasetaattia 20 ml/h virtausnopeudella. Samaan aikaan UV-monitorin herkkyys kasvoi viiden kertoimella. 200 ja 220 ml:n välille eluoituva 15 materiaali kerättiin, neutraloitiin ammoniumhydroksidilla ja dialysoitiin 10 mM ammoniumasetaattia vasten, pH 7,6.

Kuvio 1 B esittää ioninvaihtokromatografiaa

Esimerkissä IA kuvattu affiniteettikromatografiasta dialysoitu materiaalinäyte (10 , ml) levitettiin 1 ml Mono Q (Pharmacia, Ruotsi) -anionikolonniin, joka oli tasapai- 20 notettu 10 mM ammoniumasetaatilla, pH 7,6. Virtausnopeus oli 2 ml/min ja kolonni elutoitiin vuorauksen lisäyksellä 25 mM per mooli ammoniumasetaattipitoisuudessa. Kaksi huippua (I ja II) yhdistettiin, kuten kuviossa on osoitettu.

v Kuvio 2 esittää E. coli pFROOl:n osmoottinen shokki -lysaatin erilaisista puhdistus- : V: vaiheista peräisin olevien materiaalien polyakryyliamidigeelielektroforeesia 25 Materiaali levitettiin (kaista 1) affiniteettikolonniin (fibronektiini-Sepharose) adsor-boimaton (kaista 2) ja adsorboitu (kaista 3) materiaali. Affiniteetilla puhdistetun j*:*. materiaalin ioninvaihtokromatografia Mono Q FPLC -kolonni (Pharmacia, Ruotsi): yhdistelmä I (kaista 4) ja yhdistelmä II (kaista 5,) kuten kuviossa IB on merkitty.

• · • · ·

Kuvio 3 esittää pFR001:een liitetyn liitoksen restriktiokarttaa, subklooneja ja delee-30 tioita ’; |’ (A) 6,5 ke:n liitoksen restriktiokartta. (B) erilaisia sub-klooneja, jotka on konstruoitu ’··’ geenin alueen määrittämiseksi, joka alue koodaa fibronektiiniä sitovaa toimintaa.

(C) deleetioita, jotka on tehty joko EcoRI-Pstl-fragmentin 3 - tai 5-päästä käsittele- 4 101552 mällä eksonukleaasilla Bal31 (katso selostusta yksityiskohtia varten). Erilaisten geenituotteiden fibronektiiniä sitova toiminta on osoitettu.

Kuvio 4 esittää ZZ-FR-proteiinin polyakryyliamidigeelielektroforeesia Proteiini A (Sigma Chemial Co, St. Louis; kaista A) ja ZZ-FR-fuusioproteiini 5 (kaista B) redusoitiin ja alistettiin elektroforeesiin SDSissä 5-15-%:isella polyak-ryyliamidigeelillä. Geeli väijättiin lisäksi Coomassie bluella. Kaistoissa C & D frak-tionoitiin ZZ-FR-fuusioproteiini ja proteiini A vastaavasti SDS-elektroforeesilla 5-9-%:isella polyakryyliamidigeelillä, sähkötäplitettiin selluloosanitraattipaperille ja testattiin 1251-merkityllä 29 kD:n fibronektiinifragmentilla, kuten on selostettu 10 (Fröman et ai., 1987). Nuolet osoittavat tunnetun molekyylipainon standardiprote-iinien migraatioetäisyyttä.

Kuvio 5 esittää ZZ-FR-proteiinin affiniteettikromatografiaa ZZ-FR-fuusioproteiinia (0,6 mg; ruutu A) ja proteiinia A (Sigma Chemical Co; 0,5 mg, ruutu B) levitettiin 7 ml Sepharose 4B CL -kolonniin, joka oli substituoitu 29 15 kD fibronektiinifragmentilla. Kolonni pestiin 0,5 M NaCl PBS:ssä ja eluoitiin lisäksi 6 M GuHCl PBS:ssä. 2 ml:n fraktiot kerättiin ja proteiini testattiin käyttämällä BioRad-järjestelmää.

Kuvio 6 esittää ZZ-FR-fuusioproteiinivalmisteen, joka on fraktionoitu affiniteetti-kromatografialla, polyakryyliamidigeeli-elektroforeesia .*·: 20 Materiaali, joka ei ollut sitoutunut (kaista A) ja joka oli sitoutunut sekä elutoitu (kaista B) vastaavasti, ja joka oli peräisin 29 kD affiniteettikolonnista, analysoitiin SDS-geelielektroforeesilla 5-15-%:isilla polyakryyliamidigeeleillä. Geelit värjättiin lisäksi Coomassie bluella. Nuolet osoittavat tunnetun molekyylipainon standardipro- • · . . teiinien migraatioetäisyyttä.

• · • · S * * «A» ·*·' 25 Kuvio 7 esittää 125I-fibronektiinin sitoutumisen bakteerisoluihin

Lajin Newman (ruutu A) tai lajin 8325-4 stafylokokki-soluja (5x107) inkuboitiin • · f *·· 5x104 cpm:llä 1251-merkittyä intaktia fibronektiiniä (o-o) tai 29 kD N-terminaalista V : fibronektiinifragmenttiä (Δ-Δ) PSB:ssä, jota oli täydennetty 0,1 %:lla BSA:ta ja 0,1 :·. %:lla Tween^ 80 0,5 ml:n kokonaispitoisuudessa 1 tunti ZZ-FR-fuusioproteiinin tai • ♦ · j... 30 proteiinin A (·-·) lisääntyvien määrien läsnäollessa. Katso käytetyn sitoutumistestin T lisäyksityiskohtia Fröman et ai. (1987). 1 ^-merkityn radioaktiivisuuden määrät, ; jotka liittyivät bakteerisoluihin määriteltiin ja fibronektiinin sitoutumisen laajuus laskettiin. Sata prosenttia sitoutumista edustaa l^I-ligandin sitoutumista bakteereihin inhiboivan proteiinin puuttuessa ja 0 % sitoutumista vastaa radioak-35 tiivisuutta, joka on mitattu inkubaatioseoksista, joissa ei ole bakteereita.

5 101552

Kuvio 8A esittää nukleotidisekvenssiä, joka koodaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia Nukleotidisekvenssi, joka koodaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia vastaavine amino-happoineen esitetään. Erilaiset 38 aminohappotoisteet on merkitty samoin kuin seuraavien lähes neljän täydellisen 14 aminohappotoisteen. Restriktiopaikat Ball-5 HincII-PvuII on merkitty kuvioon samoin kuin aminohapposekvenssit, jotka vastaavat erilaisia nukleotidisekvenssejä.

Kuvio 9 esittää kemiallisesti syntetoidun polypeptidin fibronektiiniä sitovaa kykyä Testattiin esimerkin 2 mukaisesti syntetoidun 38 aminohappotähdepolypeptidin fibronektiiniä sitova kyky yhdessä sanotun polypeptidin fragmenttien fibronektiiniä si-10 tovan kyvyn kanssa. (*-*) tarkoittaa polypeptidiä, joka vastaa aminohapposekvenssin 38(2)-toistoa; (Q □) tarkoittaa polypeptidiä, joka vastaa aminohapposekvenssin aminohappoja 1-19; (o-o) tarkoittaa polypeptidiä, joka vastaa aminohappo-sekvenssin aminohappoja 20-38; (Δ-Δ) tarkoittaa polypeptidiä, joka vastaa aminohapposekvenssin aminohappoja no 9-30; ja (---) polypeptidiseosta, joka käsittää 15 aminohappojen 1-19, aminohappojen 20-38 ja aminohappojen 9-30 polypeptidit. Sitoutumiskyky on merkitty prosenteissa lisätyn polypeptidin pg:tä kohti.

Keksintöä selostetaan seuraavassa viitaten annettuihin esimerkkeihin, jotka eivät kuitenkaan rajoita sitä.

Esimerkki 1 . 20 Geenipankin seulonta fibronektiiniä sitovaa proteiinia varten (FNBP) • · · : Staphylococcus aureus -lajista (8325-4) peräisin olevan kromosomaalisen DNA:n • · V*: plasmidissa pBR322 oleva geenipankki, joka on kuvattu aikaisemmin (13):ssa, • · :.v seulottiin FNBP:tä ilmentäviä klooneja varten. E. coli -kloonit lysoitiin ja lysaattien jY: kyky inhiboida 125ι.β|3Γ0ηε^ϋηΐη sitoutumista S. aureus -soluihin Cowan I testat- 25 tiin, kuten menetelmäkappaleessa kuvattiin. Seulonnan yksinkertaistamiseksi kloonit f-,, jaettiin 25 erään, lysoitiin ja testattiin. Kun 22 erää oli testattu, se, jolla oli suurin inhiboiva toiminta testattiin uudelleen 5:n 5:nä eränä. Lopuksi testattiin positiivisen erän yksittäiset kloonit, ja sitä seurasi yhden yksittäisen positiivisen kloonin • · ' " eristäminen. Positiivisessa kloonissa oleva plasmidi nimitettiin pFROOl :ksi.

i ’': 30 Tämä plasmidi pFROOl on tallennettu E. coli -lajissa 259 Deutsche Sammlung von ’; *. ’ Mikroorganismen (DSM):iin ja on sieltä saatavissa tallennenumerolla 4124.

• · 6 101552

Stafylokokkiperäisen FNBP:n eristäminen E. colista E. coli -kloonia, joka on FNBP-positiivinen, viljeltiin LB-väliaineessa 37°C:ssa muuttumattomaan kasvufaasiin. Bakteerisolut sentrifugoitiin ja ly soitiin osmoottisella shokkimenetelmällä (14). Sen poissulkemiseksi että shokkilysaatin inhiboiva 5 toiminta l^i.fjbronektiinin sitoutumiseen S. aureus -soluihin johtuisi proteolyytti-sestä vaikutuksesta, lysaatti lisättiin inkubointiseokseen, ja S. aureukseen sitoutuneen l^Sj.fibronektimm määrä määritettiin 1, 2, 3, ja 4 tunnin inkuboinnin jälkeen. Tämän inkubointijakson avulla lysaatin aiheuttama inhibitiotaso jäi vakaaksi (esim. 50 %) osoittaen, että inhibitio ei johtunut ligandin tai vastaavan re- 10 septorin kehittyvästä degradaatiosta.

Jos inhiboiva toiminta johtuu lysaatissa läsnäolevien FNBP-kaltaisten rakenteiden läsnäolosta, niiden pitäisi osoittaa spesifistä affiniteettia fibronektiiniin. Lysaatti analysoitiin sen tähden affiniteettikromatografialla fibronektiini-Sepharose-pylvääl-lä, kuten Materiaaleissa ja menetelmissä (kuvio IA) on kuvattu. Puhdistus oli noin 15 30-kertainen. Lisäfraktionoiminen saatiin alistamalla affiniteettipuhdistettu materiaali ioninvaihtokromatografiaan käyttämällä mono Q- pylvästä sovitettuna FPLC-järjestelmään. Tässä fraktionointivaiheessa saatiin kaksi suurempaa huippua (kuvio IB). Analyysit polyakryyliamidigeelielektroforeesilla osoittivat, että nämä kaksi huippua sisälsivät proteiineja, joiden molekyylipainot olivat vastaavasti 165 ja 87 • t ; 20 kD (kuvio 2). Molemmat komponentit inhiboivat 125i_fibronektiinin sitoumista S.

aureukseen. Fraktiolla, joka sisälsi 165 kd:n proteiinin, oli 220 yksikköä/qg:n spe-sifinen inhibointitoiminta, joka osoittaa 430-kertaisen puhdistumisen alkuperäisestä ; shokkilysaatista ja se oli 30 kertaa aktiivisempaa, kuin 87 kD:n proteiini moolipe- 1 · ' i rustalla (tietoa ei esitetty).

• · 1 · · • · · • · j·.·. 25 Näiden kahden proteiinin aminohappoanalyysi osoitti, että niillä oli hyvin samanlainen aminohappokoostumus, joka myös muistutti tarkalleen sitä, mikä on määritetty ..g luonnolliselle FNBP:lle, joka on eristetty S. aureus -lajista Newman (taulukko 1). E.

*... colista pFROOl eristetyn 165 kD:n proteiinin immunologinen suhde luonnolliseen S.

• · · aureus -lajista Newman eristettyyn FNBP:hen analysoitiin. 165 kD:n proteiini {**.. 30 125i_merkittjin ja immunopresipitoitiin S. aureus -lajin Newman vasta-aineen t"‘: kasvavilla laimennoksilla. Vastaseerumin 300-kertainen laimennus presipitoi 50 % ... proteiinista. Merkitsemättömät 165 ja 87 kD proteiinit sekä luon- nollinen FNBP ehkäisivät merkityn 165 kD:n proteiinin immunopresipitaatiota (tie- • · *···' toa ei esitetty). Nämä havainnot osoittavat, että S. aureus -lajista Newman eristetyt 35 165 ja 87 kD:n proteiinit ovat läheistä sukua fibronektiiniä sitovalle proteiinille (FNBP).

7 101552 fnbp-geenin sitovaa toimintaa koodaavan alueen identifiointi

Liitoksen koko plasmidissa pFROOl on noin 6,5 kep. Liitoksen restriktiokartta on osoitettu kuviossa 3(A). Transkriptiosuunnan määrittämiseksi ja sitovaa toimintaa koodaavan alueen paikallistamiseksi noin 3,7 kep Pstl-fragmentti uudelleenkloonat-5 tiin pBR322:n Pstl-paikkaan. Tämä aiheuttaa tämän plasmidin ampisilliiniresistans-si-fenotyypin katoamisen. Kahdeksan tällaista kloonia otettiin talteen, joista klooneista oli viisi fibronektiiniä sitovalle toiminnalle positiivisia ja negatiivisia kolme. Jokaisesta testattiin Pstl-fragmentin orientaatio. Positiivisen kloonin pFR004 plas-midilla oli EcoRI-paikka lähimpänä Amp-promoottoria ja negatiivisen kloonin Eco-10 RI-paikalla oli päinvastainen orientaatio. Nämä tiedot osoittivat, että transkriptio-orientaatio on EcoRLsta PstLeen 3,7 kep EcoRI-Pst-ffagmentissa ja että vähintään osa fnbp-geenistä, joka koodaa sitovaa toimintaa, sijaitsee tässä fragmentissa. Tämän varmentamiseksi pFR004:ssä oleva Amp-promoottori poistettiin EcoRI-hajo-tuksella, mitä seurasi plasmidin uudelleenligatointi. Tuloksena saatu plasmidi 15 pFR008 ei osoita fibronektiiniä sitovaa toimintaa. Endogeeninen promoottori sijaitsee täten otaksuttavasti pFROOl:ssä jossain EcoRl-paikan vasemmalla puolella, kuten kuviossa 3(A) on osoitettu nuolella. Plasmidikonstruktiolla (ei kuvattu yksityiskohtaisesti) vietiin sitten pFROOl:stä peräisin oleva EcoRI (liitoksessa) -Sali (pBR322:ssa) -fragmentti pFR008:aan. Fibronektiiniä sitova toiminta palautui fnbp-20 geenistä peräisin olevan endogeenisen promoottorin palauttamisen ansiosta.

’ ’: Kun tiedettiin fnbp-geenin transkriptiosuunta (vasemmalta oikealle, kuten kuviossa - 3(A) on esitetty) fuusioita geenin stafylokokkiproteiini A:ta varten suoritettiin.

‘ : Konstruoitiin ilmentymis/sekreetiovektori, joka on nimetty pRIT3:ksi, joka perustuu :.‘*i proteiini A -geeniin, ja jossa on restriktioentsyymimultiliittäjä (15). Multiliittäjä • · 25 sijaitsee välittömästi myötävirtaan viimeisestä IgG:tä sitovasta alueesta, ja eliminoi ιΥ: siten proteiini A:n C-terminaalisen soluseinää sitovan alueen. pFROOl:stä peräisin oleva 3,7 kep:n EcRI-Pstl-fragmentti liitettiin tähän vektoriin odottaen sen kooditta-;*·van proteiini A - FNBP -fuusioproteiinia, josta saatu lukemisrakenne oli korrekti.

Tämä oli itsestään selvä tapaus, koska plasmidi, jota kutsutaan pFR013, on testeissä 30 sekä proteiini A- että FNBP-positiivinen.

• · • · · , ‘"; Plasmidia pFRO 13 käsiteltiin eksonukleaasilla Bal31 tarkoituksella identifioida alue, joka on 3,7 kep liitosta pienempi, ja koodaa fibronektiiniä sitovaa toimintaa.

' Plasmidi pilkottiin EcoRLlla tai PstLllä (koodaavan alueen 5'-ja 3'-päässä vastaa- vasti), käsiteltiin useita kertoja Bal31:llä ja ligatoitiin uudelleen. Ligatoinnin aikana 35 lisättiin 20-kertainen ylimäärä EcoRI-liittäjää EcoRI-paikkojen viemiseksi uusiin asemiin. Kuvio 3(C) esittää deleetioita, jotka saatiin joko 3'- tai 5-päähän ja vastaa- g 101552 vaa fibronektiiniä sitovaa toimintaa. Noin 700 ep geenialue, joka koodaa sitovaa toimintaa sijaitsee deleetionumeron 56 (deleetio 5'-päästä) ja -numeron 22 (deleetio 3-päästä) päätepisteiden välissä. Deleetioplasmidista numero 56 subkloonattiin 900 ep alue, joka on peräisin äskettäin PvuII-paikkaan viedystä EcoRI-paikasta. Tämä 5 fragmentti kloonattiin pUC18:ssa EcoRI:llä ja Smal:llä pilkottuna. Tulokseksi saatu plasmidi, joka koodittaa fuusioproteiinia, jossa on sekä β-galaktosidaasia ja fibronektiiniä sitovaa toimintaa, nimitettiin pFR015:ksi. Fragmentti voidaan uudelleen-kloonata pFR015:stä EcoRI- ja BamHI-pilkonnalla, koska pUC18:ssa on multiliit-täjä.

10 Restriktiofragmentit subkloonattiin myös kuten kuviossa 3(B) on osoitettu. EcoRI-Pstl-ja EcoRI-Clal-fragmenttien tapauksessa käytettiin proteiini A:n ilmentymisvek-toria pRIT3. Fragmentit Ball-PvuII ja Ball-HincII subkloonattiin ja ilmennettiin pUC18:ssa. Kaikissa tapauksissa, paitsi EcoRI-Clal-fragmentin, saatiin talteen fuu-sioproteiineja, joilla on fibronektiiniä sitova toiminta. Negatiivinen tulos Clal-Clal-15 subkloonin tapauksessa voi johtua liitoksesta, joka on väärässä lukemisjärjestyk-sessä.

Fuusioproteiinin ZZ-FR valmistaminen ja luonnehdinta 165 kD:n proteiinin saanto (kuvio 2), joka on peräisin E. coli HB 101 -solujen lysaa- tista, jossa on plasmidia pFROOl, oli noin 40 pg per litra viljelyväliaineessa. Vaikka ·. ; 20 esiintyi katoja, jotka johtuivat korkean molekyylipainon yhdisteen degradaatiosta ; · : puhdistuksen aikana, kaikki tosiasiat osoittivat, että fnbp-geeni, jossa on endogee- ;· ·* | ninen promoottori, ilmentyy heikosti E. colissa. Ilmentymistason parantamiseksi käytettiin äskettäin kehitettyä ilmentämisjärjestelmää, joka sallii heterologisten pro- jY: teiinien sekreetion E. colin kasvuväliaineeseen (16). Käytetty plasmidivektori ,γ. 25 pEZZ318 sisältää geenin kaksi synteettistä, hieman modifioitua IgG:tä sitovaa domeenia stafylokokkiproteiinia A varten, joita edeltää saman geenin promoottori ja .. signaalisekvenssi. fhbp-geenin noin 600 ep Ball-PvuII-ffagmentti (kuvio 3(B)), joka 2 · on kloonattu pUC18:ssa, kloonattiin uudelleen pEZZ318:ssa, joka on pilkottu EcoRTllä ja HindllFlla. Ligatoinnin ja transformaation jälkeen eristettiin pEZZ-FR. { *.. 30 Tämä plasmidi koodittaa fuusioproteiinia, joka koostuu IgG:tä sitovasta tuotteesta «"': ZZ ja FNBP:n fibronektiiniä sitovasta alueesta.

Ύ : ZZ-FR-proteiinin valmistamiseksi E. coli -lajia HB 101, jossa on plasmidia pEZZ- FR, viljeltiin yön yli Trypticase Soy Brothissa. Bakteerit poistettiin sentrifugoimalla ja viljelyväliaine vietiin IgG-Sepharose Fast Flow -pylvään läpi. Pylvään TST-35 puskurilla (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween R 20) pese- 9 101552 misen jälkeen proteiini eluoitiin 0,5 M etikkahapolla titrattuna pH:hon 2,8 käyttämällä ammoniumasetaattia. Noin 50 mg proteiinia eluoitiin pylväästä per litra käytettyä viljelyväliainetta.

Lyofilisoinnin jälkeen eluoitu materiaali analysoitiin SDS-PAGE:lla, joka ilmaisi 5 suuremman proteiininauhan olevan noin 63 kD (kuvio 4). Lisäksi esiintyi nauhoja, jotka vastasivat pienempiä fragmentteja, mikä johtuu ilmeisesti fuusioproteiinin proteolyyttisestä degradaatiosta. Intakti proteiini A, joka oli samalla geelillä, esiintyi 56 kD:n hajanaisena nauhana. Geelissä olevat proteiinit siirrostettiin elektroforeet-tisesti selluloosanitraattipaperiin ja tutkittiin 1251-merkityllä 29 kD:n fibronektiini-10 fragmentilla. Kuviossa 4 kaistat C ja D osoittavat, että fuusioproteiini, mutta ei intakti proteiini A, sitoo radioaktiivisesti merkittyä fibronektiinifragmenttia.

Lisätodiste ZZ-FR-fuusioproteiinin fibronektiiniä sitovasta kyvystä saatiin affini-teettikromatografian avulla Sepharose-pylväällä, joka oli substituoitu 29 kD:n fibro-nektiinifragmentilla. Fuusioproteiini sidottiin pylvääseen ja eluoitiin affiniteetti-15 matriksista 6 M GuHCkllä (kuvio 5A). ZZ-FR-fuusioproteiinin fibronektiiniä sitova toiminta sijaitsi ilmeisesti FR-alueella, koska intakti proteiini A ei sitoutunut affi-niteettimatriksiin (kuvio 5B). ZZ-FR-fuusioproteiinivalmisteen osa, joka ei sitoutunut affiniteettimatriksiin, koostui proteiineista, joissa Mr on alempi kuin intaktien fuusioproteiinien (kuvio 6, kaista A), kun taas materiaali, joka sitoutui pylvääseen, . . 20 koostui lähes puhtaasta intaktin 63 kD ZZ-FR-fuusioproteiinin valmisteesta (kuvio ,: 6, kaista B).

I · * 4 · · : Sen määrittämiseksi, kuinka paljon stafylokokkisolujen fibronektiiniä sitovasta ky- vystä voidaan pitää kloonatun FNBP:n ominaisuutena, niitattiin ZZ-FR-fuusiopro-,\\ teiinin inhibointitoiminta. Kuten kuviossa 7 on esitetty, inhiboi fuusioproteiini totaa- ·.·. 25 lisesti 1251-merkityn 29 kD fragmentin sitoutumisen sekä intaktin fibronektiinin sitoutumisen sekä S. aureus-lajien Newman että 8325-4 soluihin, proteiini A, jota käytettiin kontrollina, ei inhiboinut sitoutumista (kuvio 7).

i • jT: Kuuselan raportoitua (6), että S. aureus sitoutuu fibronektiiniin, on kohdistettu ;·* paljon työtä yrityksiin identifioida bakteerikomponentti (-komponentit), jotka ovat • »· 30 vastuussa sitoutumisesta. Näiden tutkimusten perusteena on ollut, että patogeenisten ; bakteerien sitoutuminen fibronektiiniin voi edustaa kudoskiinnittymismekanismia, '.·* : jolla on ratkaiseva merkitys infektion varhaisissa vaiheissa. Proteiinit, jotka on . puhdistettu affiniteettikromatografialla immobilisoidun fibronektiinin päällä, ovat osallistuneet stafylokokkisolujen sitoutumiseen fibronektiiniin. Kuitenkin fibronek-35 tiiniä sitovien proteiinien selostetut molekyylipainot vaihtelevat 18 kD:sta kauttaal- 10 101552 taan 197 ja 210 kD:iin (11, 17). Pääsyynä molekyylikoon hetorogeeniuteen voi olla proteiinien proteolyyttinen degradaatio eristysmenetelmien aikana.

Esillä olevassa selostuksessa esitetään geenin, joka koodaa S. aureus -lajista 8325-4 peräisin olevaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia, kloonaaminen E. colissa. Kun fnbp-5 geeni ilmennetään E. colissa endogeenisestä promoottorista, voidaan proteiini eristää periplasmasta osmoottisella shokilla. Tämä osoittaa, että promoottori ohella myös signaalipeptidi, on funktionaalinen E. colissa.

Vaikka proteiineilla, jotka on koodattu kloonatulla fnbp-geenillä, on 165 ja 87 kD:n molekyylipaino (kuvio 2), joka on pienempi kuin FNBP:n molekyylipaino, joka 10 FNBP on eristetty S. aureus -lajista Newman (Mr = 210 kD) (12), niiden aminohappokoostumukset muistuttavat läheisesti luonnollisen proteiinin koostumuksia (taulukko 1). Lisäksi vasta-aineet, jotka on herätetty luontaista FNBP:tä vastaan, ristireagoivat 165 ja 87 kD:n proteiinien kanssa. Nämä tiedot osoittavat vahvasti, että proteiinien rakenne, jotka proteiinit on koodattu S. aureus -lajista 8325-4 peräi-15 sin olevalla kloonatulla geenillä, muistuttaa S. aureus -lajista Newman peräisin olevaa luonnollisen FNBP:n rakennetta. 87 kD:n proteiini voi olla tulosta preterminaa-tiosta 165 kD:n proteiinin transkriptionaalisella tai translaationaalisella tasolla tai vaihtoehtoisesti proteolyyttisestä pilkkoutumisesta. Tällä hetkellä ei voida selittää, miksi 165 kD:n proteiini on yli kolmekymmentä kertaa aktiivisempi kuin 87 kD:n - ; 20 proteiini fibronektiinin sitoutumisen S. aureus -soluihin inhiboinnissa.

' · : Deleetiokartoituksella käyttäen Bal31-pilkontaa ja subkloonaamalla restriktiofrag- ’ p: : mentit fnbp-geenin alue, joka koodittaa fibronektiiniä sitovaa toimintaa, on paikal- listettu noin 300 ep:n alueelle (kuvio 3(B)). Noin 600 ep geenin fragmentti, joka kattaa nämä 350 ep, ligatoitiin suoraan proteiini A -geenin synteettisen IgG:tä si- * · 25 tovan domeenin peräkkäin toistettuun sekvenssiin (zz), jota edeltää proteiini A -promoottori ja signaalisekvenssi ilmentämisvektorissa pEZZ318 (16). Tulokseksi saatu fuusioproteiini (ZZ-FR), jonka molekyylipaino on noin 63 kD määritettynä SDS-PAGElla (kuvio 4), sisältää ZZ-domeenin 126 aminohappoa, joita seuraa noin « « · 200 aminohappoa, jotka on kooditettu 600 ep liitoksella, joka on peräisin fiibp-gee-j\. 30 nistä. Proteiinin C-terminaalinen pää koostuu aminohapoista, jotka ovat tulosta kaa- f": vion ulkopuolelta lukemisesta vektorin lacZ-geenin kautta, kun translaation pysäy- , \. tyskodoni on saavutettu. Fuusioproteiini (ZZ-FR), joka on ilmentynyt korkealla ta- solia ja sekretoitunut E. colin viljelyväliaineeseen, on helposti eristettävissä affini- k * ' · · · * teettikromatografialla käyttäen ZZ-domeenin IgG:tä sitovaa kykyä.

u 101552 ZZ-FR-proteiini sitoutui fibronektiinin 29 kD:n NH2-terminaaliseen domeeniin ja inhiboi täydellisesti intaktin fibronektiinin sitoumisen S. aureukseen (kuviot 5 ja 6). Nämä tiedot osoittavat, että inkubaatio-olosuhteissa käytetyt muut proteiinit, jotka tunnistavat domeenit, jotka ovat fibronektiinin 29 kD:n N-terminaalin ulkopuolella, 5 eivät ole ilmennettävissä stafylokokkisoluilla. Lisäksi FNBP:n fibronektiiniä sitova toiminta on paikallistettu proteiinin melko pieneen segmenttiin. Luontaisen 210 kD:n FNBP:n, joka oli eristetty S. aureus -lajista Newman, äskettäinen analyysi osoitti, että tämä proteiini on multivalentti ja yksi FNBP:n molekyyli kykenee sitomaan 6-9 fibronektiinimolekyyliä (12). Kloonattu fhbp-geeni on johdettu S. 10 aureus -lajista 8325-4. Jos S. aureus -lajien välillä ei olisi eroja, yksi voisi FR-aluet-ta lukuunottamatta sisältää useita toistavia sekvenssejä. Tähän kysymykseen on vastattu kloonatun fnbp-geenin sekvenssianalyysillä. FR-alueen sekvenssi, jolla on FNBP-ominaisuuksia, on annettu kuviossa 8.

On syytä uskoa, että FR-sitova toiminta liittyy kuhunkin 38 aminohappotoistoon, 15 koska Ball-PvuII-fragmentti koodittaa sitovaa toimintaa (ks. kuvio 3); koska Ball-HincII-fragmentti koodittaa sitovaa toimintaa; ja koska HincII-PvuII-fragmentti ei koodita sitovaa toimintaa. Lisäksi yksi ainoa 38 aminohapon toisto on funktionaalinen fibronektiinin sitomisessa, sillä syntetoidulla 38 aminohappoa pitkällä peptidillä (38(2)-toisto) on sitova kyky, kuten on esitetty kuviossa 9. Kukin kolmesta 38 20 aminohapon toistosta oli hyvin homologinen.

i ' .* Esimerkki 2 • 1 « : ; j Polypeptidin kemiallinen synteesi, joka perustuu nukleotidisekvenssiin, joka koodaa : \i 38 aminohapon (38(2)-toisto) fibronektiiniä sitovaa aluetta, suoritettiin rakentamalla * Y; aminohapposekvenssi, joka vastaa sanottua nukleotidisekvenssiä alkaen C-terminaa- • % jV. 25 lisesta histidiinistä, ja reagoittamalla vaiheittain sopivalla aminohapolla sekä lopuksi reagoittamalla glysiinin kanssa N-terminaalisessa päässä, kiintofaasisynteesillä K.B ..t Merrifieldin, J. Am. Chem. Soc. 86, s. 304, (1964) mukaisella menetelmällä. Täten syntetoitiin polypeptidi, joka vastaa toista aminohappotoistetta, samaten 3 muuta *\ ’ polypeptidiä, jotka ovat osia tästä 38-toistosta, nimittäin 1) polypeptidi, joka kattaa ! *.. 30 aminohapot 1-19, 2) polypeptidi, joka kattaa aminohapot 9-30 ja 3) polypeptidi, !' ‘ : joka kattaa aminohapot 20-38, syntetoituivat kaikki saman menetelmän mukaisesti.

i I I t ’ : ' Täydellisen 38-toiston, samoin kuin 1-19 aminohappopolypeptidin, 9-30 amino- •« · happopolypeptidin, 20-38 aminohappopolypeptidin sekä näiden kolmen pienemmän polypeptidin seoksen fibronektiiniä sitova kyky testattiin ja tulokset on annettu ku-35 viossa 9. Täydellisen 38-toiston fragmentit syntetoitiin tarkoituksella tarkistaa, onko 12 101552 fibronektiinisitovuus riippuvainen täydellisestä 38-toistosta, kuten on ennalta odotettu, vai rajoittuvatko fibronektiiniä sitovat ominaisuudet 38 aminohapposekvenssin jollekin pienemmälle alueelle. Kuten kuviosta 9 ilmenee, on fibronektiiniä sitova ominaisuus läsnä vain täydellisessä 38 aminohapon sekvenssissä.

5 Materiaalit ja menetelmät

Bakteerilajit ja plasmidit

Staphylococcus aureus -lajista 8325-4 peräisin olevan kromosomaalisen DNA:n pBR322:ssa oleva geenipankki, joka on kuvattu aikaisemmin (13):ssa seulottiin kloonien saamiseksi, jotka ilmentävät fibronektiiniä sitovaa toimintaa. Subkloonaus-10 ja ilmentymiskokeissa käytettiin E. coli -lajeja HB 102, (18) ja JM 105 (19). Käytetyt plasmidivektorit olivat pBR322 (20), pUC18 (21) ja proteiini A -vektorit pRIT3 (15) ja pEZZ318 (16). Fibronektiiniä sitovan proteiinin (FNBP) testeissä käytettiin S. aureus -lajeja Cowan I, Newman ja 8325-4.

Mikro-organismien viljelyväliaine 15 E. coli -bakteerien viljelyssä käytettiin seuraavaa väliainetta. Annetut määrät koskevat litraa väliainetta.

Trypton S oy Broth (Oxoid Ltd, .’· : Basingstoke, Hants, GB) 30 g : hiivauute (Oxoid) 10 g : 20 D-glukoosi 40 g j nh4ci 2,5 g Λ'/ Na2HP04.2H20 7,5 g Y:‘ KH2P04 3,0 g * *' Na2S04.10H2O 2,5 g 25 MgS04.7H20 0,2 g : “ CaCl2.2H20 0,5 g v : FeCl3-6H20 16,7 mg

ZnS04.7H20 0,18 mg .···. CuS04.5H20 0,16 mg '·" 30 MnS04.4H20 0,15 mg * CoCl2 0,10 mg

NaEDTA 20,1 mg 13 101552

Fibronektiiniä sitovan proteiinin (FNBP) analysointi

Fibronektiinin sitoutumisen määrittäminen S. aureus -soluihin on kuvattu aikaisemmin (10). Jos muuta ei ole mainittu, 10^ S. aureus Cowan I -solua inkuboitiin 125i-merkityllä fibronektiinillä tai fibronektiinin 29 kD NH2-terminaalisella frag-5 mentilla PBS:ssä, joka sisältää 1 mg/ml naudan seerumialbumiinia kokonaismääränä 0,3 ml. 2 tunnin 22°C:ssa inkuboinnin jälkeen soluihin sitoutunut radioaktiivisuus mitattiin gammalaskijalla.

E. coli -kloonien lysaatit, jotka valmistettiin Tris-HCl-puskurissa, pH 8,1, joka sisältää lysotsyymi-EDTA:a, kuten aikaisemmin on kuvattu (13):ssa, analysoitiin ΑΕΙ 0 ronektiiniä sitovan toiminnan toteamiseksi mittaamalla niiden kyky kilpailla stafy-lokokkisolujen kanssa sitoutumisesta fibronektiinin 1 ^.merkittyihin 29 kD NH2-terminaalisiin fragmentteihin. FNBP:n määrä, joka kykenee inhiboimaan sitomista 50 %:iin, on ilmaistu yhtenä toiminnan yksikkönä.

Osmoottista shokkimenetelmää käytettiin proteiinien vapauttamiseen E. colin solu-15 Ilmatilasta (14).

FNBP: n puhdistaminen

Puhdistaminen perustui affiniteettikromatografiaan fibronektiini-Sepharosen päällä, jota seurasi ioninvaihtokromatografia.

: f; Humaani-fibronektiini valmistettiin vanhentuneesta verestä tunnetulla menetelmällä : 20 (22). Fibronektiini dialysoitiin vasten 20 mM Tris-HCl, pH 8,3, ja konsentroitiin : DEAE-pylväässä. Fibronektiinin kytkentä Sepharose SL-4B:hen tehtiin tunnetulla • · · bromisyaaniaktivointimenetelmällä (23).

• · » • · • · v.; E. coli -lysaatit pumpattiin affiniteettipylvääseen, jota pestiin 0,5 M ammoniumase- taatilla, kunnes perusviiva oli vakaa (noin neljä pylvään tilavuutta). Sitten FNBP :*v 25 eluoitiin 0,4 M etikkahapolla ja joko neutralisoitiin ammoniakilla tai lyofilisoitiin.

Sen jälkeen kun se oli dialysoitu vasten 10 mM ammoniumasetaattia, jonka pH on säädetty 7,6:een, jossa oli ammoniakkia, suoritettiin lisäfraktionointi ioninvaihto-'.. ” kromatografialla Pharmacia FPLC -varusteilla käyttämällä mono Q-pylvästä.

.···. Nukleotidisekvenssianalyysi 30 Nukleotidisekvenssi määritettiin Maxam, A.M. et al.:n kuvaamien menetelmien mukaisesti.

14 101552

Aminohappoanalyysi

Aminohappokoostumus määritettiin käyttämällä Durrum D-500 -analysaattoria. Näytteitä hydrolysoitiin 6 M HCl:ssa, joka sisältää 2 mg/ml fenolia, 24 tuntia 110°C:ssa. Yksi näytteistä myös hapetettiin permuurahaishapolla kysteiinin ja 5 metioniinin määrittämiseksi. Norluesiinia lisättiin sisäisenä standardina. Proteiini määritettiin (24):n mukaisesti käyttämällä naudan seerumialbumiinia standardina.

Elektroforeesi

Jos muuta ei ole mainittu, suoritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi 5-15-%:isissa gradienttigeeleissä. Geelit värjättiin Coomassie brilliant bluella, väri 10 poistettiin ja valokuvattiin.

Sädetysimmuunitestimenetelmä

Puhdistettu FNBP, jonka arvioitu molekyylipaino on 165 kD SDS-polyakryyli-amidigeelielektroforeesissa, merkittiin 1 ^^I-odiinilla tunnetulla kloramiini-T-mene-telmällä (25). Jodauksen jälkeen materiaali kromatografoitiin uudelleen fibro-15 nektiini-Sepharose-pylväässä.

Inkubointiseokseen, joka sisälsi 125μρΝΒΡ (3400 cpm 10 l:ssa), sekoitettiin erilaisia kaniantiseerumin (joka sisältää vasta-aineita, jotka on suunnattu S. aureus -lajia Newman vastaan) laimennoksia inkubointipuskurissa (PBS, 0,1% Triton : p: X-100 ja 0,02 % natriumatsidi) tilavuudessa 0,2 ml.

• · • · · Ί ; 20 Näytteitä inkuboitiin 2 tuntia 20°C:ssa antigeeni-vasta-ainereaktion mahdollistami- ’· seksi. 0,1 ml proteiini A - Sepharosen 10-%:ista suspensiota (paino/til.) PBS:ssä li- • · · ’·’·* sättiin ja seosta inkuboitiin toinen tunti. Inkubointi pysäytettiin lisäämällä toiset 1,7 ml inkubointipuskuria näytteisiin. Sentrifugoinnin 2000 rpm 3 min jälkeen super-natantit imettiin pois. Pelletit pestiin kahdesti inkubointipuskurissa ja radioaktiivi- • · • ·.. 25 suus, joka liittyy proteiini A - Sepharoseen mitattiin gammalaskijalla.

• · · • · · • · ·

Restriktioendonukleaasit ja muut entsyymit • · • · * « .*··. Restriktioentsyymit, T4-DNA-ligaasi ja Bal31 hankittiin BRListä ja käytettiin hei- .; t dän suositustensa mukaisesti. Muut menetelmät mukaanä lukien DNA-tekniikat oli- *·* ’ vat oleellisesti tunnettuja (26).

• · ,5 101552

Taulukko 1 E. colista pFROOl eristettyjen fibronektiiniä sitovien proteiinien (87 ja 165 kD) aminohappokoostumusten ja luonnollisen S. aureus -lajista Newman eristetyn luontaisen FNBP:n (210 kD) vertailu.

5 Koostumus (mooli-%)

Aminohappo 210 kDa) 165 kD 87 kD

asparagiinihappo/asparagiini 15,4 14,6 13,4 treoniini 9,7 10,7 10,3 10 seriini 7,4 6,5 8,0 glutamiinihappo/glutamiini 17,9 17,1 15,1 proliini 6,3 6,2 5,8 glysiini 8,9 7,9 8,4 alaniini 5,3 4,6 4,7 15 puoli-kystiini 0,1 0,2 n.d.

väliini 7,2 7,8 8,6 metioniini 0,6 0,6 n.d.

isoleusiini 4,3 4,7 3,8 leusiini 4,1 4,0 4,6 . . 20 tyrosiini 2,1 2,3 4,1 ’· / fenyylialaniini 2,4 2,0 3,6 -·' histidiini 1,0 3,2 3,0 i.: : lysiini 5,3 6,3 6,6 V·· tryptofaani n.d. n.d. n.d.

25 arginiini 1,9 1,2 ’: ----------------------------------------------------------------------------------- • # a) Fröman et al.:sta (1987), (12).0 j·. n.d = ei määritetty.

* • · · • · · *·’ ‘ Esillä olevaa fibronektiiniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää immunointiin, jolloin 30 proteiini, edullisesti yhdistelmänä fuusioproteiinin kanssa suuren antigeenivasteen i"1; luomiseksi, injektoidaan annoksina, jotka aiheuttavat immuunireaktion isäntänisäk- käässä. Täten fibronektiiniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää märehtijöiden rokot-'; ‘ ‘ tamiseen stafylokokki-infektioiden aiheuttamaa utaretulehdusta vastaan. Tämän kek- '···' sinnön fibronektiiniä sitova proteiini on osoittautunut muodostavan vasta-aineita 35 stafylokokkiperäistä nisätulehdusta vastaan hiirimallissa, kuten taulukossa on jäljempänä osoitettu.

,, 101552 16

Taulukko

Kokeellinen hiiren nisätulehdus aiheutettiin S. aureus -lajilla SA 113(83A) annoksena 1,0x103 cfu. Immunointi arvioitiin käyttämällä 15 g proteiinia per hiiri fibro-nektiiniä sitovaa proteiinia, joka on ilmennetty E. colissa, joka sisältää plasmidia 5 pFROOl, kuten tässä on identifioitu.

Hiiri- Rokot. Vamman yhteis- Tutkit- Vamman mikroskoop- ryhmä maito- tutkintatyyppi tujen pinen tyyppi (%) rau- (%) maito- hasten rauhas- 10 määrä ten määrä +++ ++ + 0 A B Cl C2 C3

Roko tetut 15 (FNBP) 30 3 8 83 10 11 9 0 0 91 0

Kontrolli 38 50 16 32 3 8 38 0 25 38 0 . . 20 Nisätulehdus: +++ = voimakas; ++ = keskiasteinen; + = lieväasteinen; 0 = ei paljain ’ · / silmin näkyviä muutoksia; A = yhdenmukaisesti ei-reaktiivinen, totaali nekroosi; B = pitkälle kehittyneitä re- : gressiivisiä muutoksia + lievä tulehdusreaktio; Cl = levinnyt tulehdusreaktio + pai- • · kallinen nekroosi; C2 = levinnyt tulehdusreaktio; C3 = paikallinen tulehdusreaktio; • · · 1 25 0 = ei reaktiota.

> : : • ·

Kuten edellä oleva taulukko osoittaa, yhdenmukainen immunointi saadaan aikaan • *.. käyttämällä FNBP:tä, joka on ilmennetty E. colilla, joka sisältää plasmidia FR001.

• · · • · · • · ·

Lisäksi fibronektiiniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää estämään avoimen ihohaa-: *·· van infektio käsittelemällä haavaa käyttämällä fibronektiiniä sitovaa proteiinia sus- 30 pensiossa. Täten fibronektiiniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää haavojen hoitoon, esim. proteiinireseptorien suojastukseen tai immunointiin (rokotus). Jälkimmäisessä . · · ·. tapauksessa isännän ruumis tuottaa spesifisiä vasta-aineita, jotka voivat suojella sitä bakteerilajien invaasiolta, jotka käsittävät tällaista fibronektiiniä sitovaa proteiinia.

Täten vasta-aineet estävät bakteerilajien kiinnittymisen vahingoittuneeseen kudok seen.

,7 101552

Esimerkkejä kudosvammojen kolonisoinnista ovat: a) ihohaavojen ja sidekudosten kolonisointi, jotka haavat johtuvat mekaanisista 5 vammoista, kemiallisista vammoista ja/tai kuumuudesta johtuvista vammoista; b) limakalvojen haavojen kolonisoinnista, kuten suuontelon, tai maitorauhasten, virtsaputken tai emättimen limakalvojen haavat; c) sidekudosproteiinien kolonisoinnista, jotka sidekudokset ovat altistuneet minimaalisille vammoille (vähäpätöinen vamma) yhteydessä epiteeliin ja endoteeliin 10 (nisätulehdus, sydänläpän infektio, lonkanvaihtokirurgia).

Jos esillä olevaa FNBP:tä tai 38 aminohappopolypeptidiä käytetään nisäkkäiden, ihminen mukaan luettuna, immunointitarkoitukseen (rokotus), proteiini tai poly-peptidi dispergoidaan steriiliin isotoniseen suolaliuokseen samalla kun optionaali-sesti lisätään farmaseuttisesti hyväksyttävää dispergointiainetta. Lisäksi voidaan 15 käyttää erityyppisiä apuaineita kudokseen vapautumisen pitkittämiseksi ja siten proteiinin tai polypeptidin altistamiseksi pitemmäksi aikaa kehon immuunipuolus-tusjärjestelmälle.

·.'· Sopiva annostus immunoinnin aikaansaamiseksi on 0,5-5 pg FNBP:tä tai polypep- : tidiä per ruuminpainokilo ja immunointi-injektio. Kestävän immunoinnin aikaan- i 20 saamiseksi rokotus pitää suorittaa useamman kuin yhden peräkkäisen kerran 1-3 .·. : viikon aikana, edullisesti 3 kertaa.

• · • · • '·* Jos esillä olevaa FNBP:tä tai polypeptidiä käytetään ulkoisesti paikallisesti, proteiini

Lv dispergoidaan isotoniseen suolaliuokseen 25-250 μg/l pitoisuuteen. Haavoja käsi tellään sitten vain sellaisella määrällä, joka kostuttaa täydellisesti haavan pinnan.

• '·· 25 Keskimäärin käytetään haavoihin vain muutama millilitra liuosta tällä tavoin. Kä- sittelyn käyttämällä proteiiniliuosta jälkeen haavat pestään soveltuvasti isotonisella ./ suola- tai muulla sopivalla haavanhoitoliuoksella.

• · · 1...: Lisäksi keksinnön mukaista fibronektiiniä sitovaa polypeptidiä samaten kuin mini- . ·: ·. maalista fibronektiiniä sitovaa paikkapolypeptidiä voidaan käyttää stafylokokkilajien 30 aiheuttamien bakteeri-infektioiden diagnosointiin, jolloin esillä olevan keksinnön mukainen fibronektiiniä sitova proteiini immobilisoidaan kiinteällä kantoaineella, kuten pienet lateksi- tai Sepharose®-palloset, minkä jälkeen seerumien, jotka sisäl 18 101552 tävät vasta-aineita, annetaan läpäistä ja reagoida FNBP:n kanssa, jolloin FNBP immobilisoituu. Agglutinaatio mitataan sitten tunnetuilla menetelmillä.

Lisäksi FNBP:tä tai polypeptidiä voidaan käyttää ELISA-testissä (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay; E. Engvall, Med. Biol. 55, 193, (1977)). Polystyreenimik-5 rotiitterilevyn kolot peitettiin FNBP:llä ja inkuboitiin yön yli 4°C:ssa. Levyt pestiin sitten perusteellisesti käyttämällä PBS:ää, joka sisältää 0,05 % TWEEN 20, ja kuivattiin. Potilaan seerumin sarjalaimennos tehtiin PBS-Tweenissä, lisättiin koloihin ja inkuboitiin 30°C:ssa 1,5 tuntia. Huuhtelun jälkeen antihumaani-IgG:tä, joka oli konjugoitu entsyymiin, tai antinaudan-IgG:tä, joka oli konjugoitu entsyymiin, 10 vastaavasti, piparjuuriperoksidaasia tai alkalista fosfataasia lisättiin koloihin ja inkuboitiin 30°C:ssa 1,5 tuntia, kunnes IgG oli sitoutunut siihen ja huuhtelemisen jälkeen lisättiin entsyymialusta, alkalisen fosfataasin tapauksessa p-nitrofosfaattia tai peroksidaasin ollessa kyseessä lisättiin ortofenyleenidiamiinisubstraattia (OPD) vastaavasti. Levyt, jotka käsittivät koloja, huuhdeltiin sitten käyttämällä sitraatti-15 puskuria, joka sisältää 0,055 % OPD ja 0,005 % H2O2, ja inkuboitiin 30°C:ssa 10 min. Entsyymireaktio pysäytettiin lisäämällä Η2θ2:η 4 N liuosta kuhunkin koloon. Värinkehitys mitattiin käyttämällä spektrofotometria.

Käytetystä entsyymialustasta riippuen voidaan käyttää yhtä hyvin fluorointimittaus-ta.

·/ : 20 Toinen menetelmä staiylokki-infektioiden diagnoimiseksi on käyttää DNA-geeni- : koetinmenetelmää, joka perustuu FNBP-sekvenssiin tai 38 aminohappopolypeptidi- : sekvenssiin. Tällöin luonnollinen tai synteettinen DNA-sekvenssi kiinnitetään kiin- .·. : teään kantajaan, kuten edellä mainittu polystyreenilevy, esim lisäämällä maitoa pin- ,·.·! nalle nisätulehdusta diagnosoitaessa. DNA-geenikoetin, joka on merkitty optionaa- • · · 25 lisesti entsymaattisesti tai radioaktiivisella isotoopilla, lisätään sitten kiinteään oiko- f · · * * tasoon, joka käsittää DNA-sekvenssin, jolloin DNA-geenikoetin kiinnittyy sekvens- .. siin, jossa se on. Entsyymi tai radioaktiivinen isotooppi voidaan sitten helposti * · : “ määritellä tunnetuilla menetelmillä.

• · # • · · • · « ./ Edellä oleva termi "fibronektiiniä sitova proteiini" käsittää minkä tahansa 38 ami- 30 nohappopolypeptidisekvenssin samoin kuin sen, jossa 38 aminohappopolypeptidi-·;·’ sekvenssi muodostaa täydellisen proteiinin minimaalisen fibronektiiniä sitovan pai- kan.

,9 101552

Viitteet 8. Beachey, E.H. and Simpson, W. A( 1 982). Infection 10, 107-110.

5 20. Bolivar, F., Rodriquez, R.L., Greene, P.J., 8etlach, M.C.,

Heyneker, H:L., Boyer, H.W., Crosa, J.H. and Falkou, S. (1977). Gene, 2, 95-113.

18. Boyer, H.W. and Roulland-Dus soix , D. (1969). J. Mol.Biol: 4J_, 459-472.

10 9. Courtney, H.S., Of ek , I .., . S i m-pson, W. A . ,. H a s £ y ,, D . L . and

Beachey, E.H. (1 986). Infect. Immun. ^_3, 454-459.

11. Espersen, F. and Clemmensen, I. (1982). Infect. Immun.

37, 526-531.

17. Fröman, G., Switalski, L.M., Guss, B., Lindberg, M., Höök, 15 M . and Wadstrom, T. (1986) In Lark, D.L. ed. Protein-Car bohydrate Interactions in Biological Systems. Academic Press, London, pp. 263-268.

12. Fröman, G., Switalski, L. M. , Speziale, P. and Hook, M. (1987) in press. J. 3iol. Chem.

20 25. Hunter, W. M. (1978) Radioimmunoassay. In: Wier, K.M. ed.

Handbook of Experimental Immunology. London Blackwell. 14.1-14.40.

1. Hynes, R. 0. (1 985) Annu. Rev. Cell Biol. 1_, 67-90 .

. 2. Hynes, R.O. (1 986) Sci. Ann. 2_54, 42-51 .

:.-.25 6 . Kuusela, P. (1 978) Nature 276, 718-720.

'·' l 24. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. and Randall, • · · I R.J., Biol. -them. 193, 265"*275 .

II 13. Löfdahl, S., Guss B., Uhlen, M., Philipson, L. and lind- ,·*.· berg, M. (1 983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 697-701 .

30 26. Maniatis, 7., Fritsch, E.f. and Sambrok, J. (1982). Mole- * · ; ·· cular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor • · · *.*· Laboratory, New York.

s\ 23. March, S.C., Parikh, I. and Cuatrecasas, P. (1974). Ana- ···. lyt. Biochem. 6£, 1 49-1 52 .

35 27, Maxam, A.M. and Gilbert, W., ( 1 977),.Prcc. Natl. Acad.

*;]/ Sci., USA , 7_4 , 560 .

28. Merrifield, K.3., J. Am. Chem. Soc., 86, op.304, (1964) 19. Messing, J. and Carlsson, J. d?84). J. 3iotechnol. 253-264.

20 101552 22. Miekka, S.I., Ingham, K.C. and Menache, D. (1982). Thromb Res. 27, 1-14.

15. Nilsson, B., Abrahamsen, l. and Uhlen, M. (1985). EMBO J . 4, 1 075-1 080 .

5 16. Nilsson, B., Moks, T., Jansson, B., Abrahamsen, L., Elm- blad. A., Holmgren, E., Henrichson, L., Jones, T.A. and Uhlen, M. (1986). Protein Engineering, In press.

21. Norrander, J., Kemp^, T. and Messing, J; (1983). Gene, 2_6, 101-106.

10 14. Nossal, N.G. and Heppel, L.A. (1965). J. Biol. Chem. 241, 3055-3062.

3. Ruoslahti, E. and Pierschbacher, M.D. (1986). Cell, 44, 517-518.

10. Ryden, C., Rubin, K., Speziale, P., Höök, M., Lindberg, 15 M. and Wadstrom, T. (1983), J. Biol. Chem. 258, 3396-3401.

7. Wadstrom, T., Suita Iski, L., Spezi'ale, P., Rubin, K.,

Ryden, C., Fröman, G., Faris, A., Lindberg, M., Höök, M., (1985), In Jackson, G.J. (ed). Pathogenesis of Infection. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, pp. 20 193-207.

•. ·: 4. Woods, A., Couchman, J.R., Johansson, S., and Höök, M.

(1 986), EMBO J. 5, 665-670.

]/· l 5. Yamada, K. M. (1983), Annu. Rev. Biochem. 52, 761-799.

• a a · · « · «

• I

• · 1 · 2 1 · • · · • · » « I · · 4 · · • · « « • · • · · • · · • · · • · i * • · » I • · · i ": « · « a « · · • ·

Claims (4)

21 101552

1. Hybridi-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se käsittää yhden tai useamman seuraavistanukleotidisekvensseistä: GGC CAA AAT AGC GGT AAC CAG TCA TTC GAG GAA GAC ACA GAA GAA

5 GAC AAA CCT AAA TAT GAA CAA GGT GGC AAT ATC GTA GAT ATC GAT TTT GAT AGT GTA CCT CAA ATT CAT GGT CAA AAT AAA GGT AAT CAG TCA TTC GAG GAA GAT ACA GAA AAA GAC AAA CCT AAG TAT GAA CAT GGC GGT AAC ATC ATT GAT ATC GAC TTC GAC AGT GTG CCA CAT ATT CAC

10 GGA TTC AAT AAG CAC ACT GAA ATT ATT GAA GAA GAT ACA AAT AAA GAT AAA CCA AGT TAT CAA TTC GGT GGA CAC AAT AGT GTT GAC TTT GAA GAA GAT ACA CTT CCA AAA GTA

2. Menetelmä proteiinin valmistamiseksi, jolla on kyky sitoa fibronektiiniä, 15 tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 1 mukaisella hybridi-DNA-mo- lekyylillä transformoitua mikro-organismia, ja muodostunut proteiini eristetään.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sanottua transformoitua mikro-organismia viljellään kasvua edistävässä väliaineessa, ja täten muodostunut proteiini eristetään affiniteettikromatografian avulla kolonnissa, ; 20 jossa fibronektiini on sitoutunut liukenemattomaan kantoaineeseen, mitä seuraa : ioninvaihtokromatografia. · I

4. Plasmidi pFROOl sisällytettynä E. coli -kantaan 259, jonka talletusnumero * onDSM4124. i : : • · • « : : : • · 9 « • « * I a « • · · I f i • · · * % * * · • · · I · · I t * · * t I < 4 * 22 101552