JP2971067B2 - フイブロネクチン結合タンパク質とその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明はフイブロネクチン結合タンパク質と該タン
パク質をコード化したヌクレオチド系を含むプラスミド
やファージ等のハイブリッド−DNA−分子の製法に関
し、特に前記分子と前記タンパク質を製造するために用
いられると共に前記タンパク質で合成物質を含む微生物
を製造する方法に関するものである。

（従来の技術） 特許公報WO−A1−85/05553にはフイブロネクチン、フ
イブリノーゲン、コラーゲンおよび／またはラミニンと
結合性を有するバクテリヤ細胞表面タンパクについての
記載がある。それには、種々のバクテリアがフイブロネ
クチン、フイブリノーゲン、コラーゲンおよび／または
ラミニンと結合する能力を有することが示されている。
更に、フイブロネクチン結合タンパク質は165及び／ま
たは87KDの分子量のものであることが示されている。こ
れにより、小分子のタンパク質は大分子のものの一部で
あるといえる。

フイブロネクチンは２個の類似した亜単位からなる高
分子糖タンパク質である。このようなフイブロネクチン
は前駆物質mRNA（１）の複合結合型により細胞サイズに
変化することができる。フイブロネクチンの主たる機能
は体液、血液や細胞外のコロイド層（malrices）内に発
見される、これは大部分の真核細胞（2,3,4,5）の付養
基質を媒介するタンパク質の性能であるようにみえる。

1970年代にキューラセはフイブロネクチンは真核細胞
と相互作用を有するばかりでなくブドウ状球菌のアウレ
ウス細胞にもまた結合することを発見した（６）。この
ような視点からして、多くの病原微生物はフイブロネク
チンとの結合性に高度の特性と類縁性が発見される
（７）。細胞外マトリックス内のフイブロネクチンは基
体として作用するばかりでなく、また、種々の異なった
微生物の結合剤として作用するようにも見える。フイブ
ロネクチンの結合性は或る微生物にとって受容組織を移
植するためや病原菌系の感染を促進する極めて重要な段
階の役割を果すことができる。

数種の異なった細胞表面、組織はリポテチオリ酸（8.
9）やタンパク質（10）に含有するグラム陽性バクテリ
アにフイブロネクチン受容体として関係を有する。予備
的な研究において、197−210KDでMrのフイブロネクチン
結合タンパク質はエス・アウレウスがニューマン（11.1
2）に起債した特殊な変種から分離されたものでありフ
イブロネクチン受容体と同一視されるものである。エス
・アウレウスのものからのフイブロネクチン結合タンパ
ク質の特性は大腸菌などの細菌内に前記タンパク質の遺
伝因子がクローンを発生させる。そして、このタンパク
質に含有するフイブロネクチンの結合する領域は局所的
なものに限定され、この局所部分に含まれる溶解タンパ
ク質の性質とタンパク質のIgG−結合部位は後記の詳細
な記載で述べられている。

（本発明の目的） 本発明の目的は極微細なフイブロネクチン結合タンパ
ク質を得ることである。

本発明の他の目的は例えばタンパク質をコード化した
ナクレオチド（nucIeotide）系を含むプラスミドを使用
することによって遺伝学的な工学技術手段によって前記
タンパク質を得ることである。

本発明の更に他の目的は化学合成手段によって前記タ
ンパク質を製造する可能性を得ることである。

（課題を解決するための手段） 驚くべきことに、タンパク質をコーティングしたナク
レオチド或いはフイブロネクチン結合タンパク質を有す
るポリペプチドを含むハイブリッド−DNA−分子を製造
する方法を発見した。以下の説明から明らかな如く、ナ
クレオチド系は前記タンパク質をコード化した遺伝因子
（gene）に存在している。

更に本発明はフイブロネクチン結合タンパク質をコー
ド化したヌクレオチド系を有した遺伝子副体（Plasmi
d）かファージ（phage）を含む。

そして本発明はフイブロネクチン結合タンパク質の製
造を包含し、それにより、少くとも１個のハイブリッド
−DNA−分子を微生物内に誘導し、生長倍地内に微生物
を培養して、そして、クロマトグラフィで変換したイオ
ンをたどりながら不溶性キャリヤと結合させたフイブロ
ネクチンに親和力を有するクロマトグラフィ手段により
形成されたタンパク質を分離する。

更に本発明の特徴はフイブロネクチン結合タンパク質
の化学合成物質を含む、これにより、アミノ酸系はＣ−
ターミナルヒステイデインから出発したタンパク質をコ
ード化したナクレオチド系をベースとして合成されたも
のである。これは特有のアミノ酸と段階的に反応する、
これにより、フイブロネクチン結合ペプチドの部分に形
成するため、Ｎ−ターミナルエンドにおいてグリシンと
反応する。

固有のキャリアタンパク質はタンパク質ＡのIgG結合
部分のようにアミノ酸系に結合することができる。

本発明は下記の実験例に示されているが、本発明はこ
の実験例に限定されるものではない。

（実験例１） フイブロネクチン結合タンパク質遺伝子貯蔵所の選択審
査 （FNBP） 予め（13）で述べたスタフイロコッカスアウレウスス
トレイン8325−４からクロマソマルDNAの遺伝子副体PBR
322のある遺伝子貯蔵所はFNBPと表示したクローンを分
別審査した。イー．コリークローンは溶解されており、
その溶解物は分類法法で述べたようにエス・アウレウス
カウン１の細胞に対して125−エーフィブロネクチンの
結合を抑制する性能について試験された。簡単に検査す
るために溶解されたものとテストされたものが25のロッ
トに貯蔵されていた。この貯蔵物以外は検査されてい
た。活性を最高に抑制されているものは、再検査されて
いた。これは第５の５個の貯蔵物である。最後に１つの
貯蔵物を独立したクローンは１つの寄託クローンの分離
の結果を検査された。寄託クローンのプラスミドは細胞
PFR001であった。

イー・コリーストレイン259内のプラスミドPFR001は
ドイッチェサムラング ホン マイクロオーガニズメン
（PSM）に寄託されていた。そして、これに寄託NO4124
が振り当てられていた。

イー・コリーPFR001からスタフイロコッカルFNBPの分
離、寄託されたFNBPのイーコリークローンは静置状態で
の生長相が37℃におけるLB−ネディアム内で生長した。
バクテリア細胞は浸透性ショック（14）によって遠心分
離の後溶解した。エス・アウレウス細胞に125I−フイリ
ブロネクチンを結合することについてのショック溶解物
の抑制効果を除外することは加水分解による活性による
ものである。溶解物は加熱混合物に加えられた、エス・
アウレウスに結合された125I−フイブロネクチンの量は
１、２、３〜４時間加熱したのち決定された。この加熱
時間の間、観察される抑制を示す溶解物残留室数（例え
ば50％）によって引起こされる抑制の程度は125I−置換
識別配位子またはこれに相当する受容体の進行する分解
によるものではない。

抑制された活性が溶解物中のFNBP類似構造物の存在に
よる場合はワイブロネクチンに対する特別の親和力を表
示すべきである。前記溶解物は後述の「物質とその製
法」（第１図Ａ）に記載されるようなフイブロネクチン
セファローズによるアフィニティークロマトグラフィー
によって分析される。精製は略30倍であった。更に分留
法はFPLCシステムに適合したモノＱカラムを用いてイオ
ン交換クロマトグラフィで精製した物質により達成され
た。この分留段階においては、二つの主たるピークが得
られた（第１図Ｂのポリアクリルアミド ゲル エレク
トロファーリシズによる分析は第２図に示す如く分子量
が165と87KDのタンパク質を含む二つのピークを示し
た。二つの成分はエス・アウレウスに対する125I−フイ
ブロネクチンの結合を抑制した。165KDタンパク質を含
む留分はオリジナルショック溶解物から430倍に精製し
たことを示す220ユニット/q・ｇの特別な活性抑制力を
有するものである。そして、それはデータには示されて
いないが、モルベースで87KDのタンパク質よりも30倍の
活性があった。

二つのタンパク質のアミノ酸分析の結果は非常に類似
したアミノ酸組成を有すると共に表１のエス・アウレウ
スから分離した自然のFNBPとして決定し得る権密な共通
性を有していた。エス・アウレウス ストレイン ニュ
ーマンから分離した自然のFNBPに対してイー．コリーPF
R001から分離した165KDのタンパク質の免疫学的な関係
が分析された。この156KDタンパク質はエス・アウレウ
ス ストレイン ニューマンに対して抗体の増大する希
釈により125I−ラベルドと免疫沈澱物とであった。300
倍に希釈した抗血清は125I−ラベルドタンパク質の50％
が沈澱した。自然のFNBPのようなアンラベルド165及び
よりKDタンパク質は（データーには示していないが）ラ
ベルド165KDのタンパク質の面積沈澱物で阻害した。こ
の観察結果によりエス・アウレウス ストレイン ニュ
ーマンから分離した165及び87KDタンパク質はフイブロ
ネクチン バインデングタンパク質（FNBP）に密接な関
係のあることを示している。

結合活性力をコード化したFNBP遺伝子部位の確認 プラスミドPFR001内に挿入した寸法は略6.5kbpであ
る。挿入のリイストリクションマップは第２図の3A部に
示している。転写方向と結合性能のコード化した部分を
収集することを決定するために、略3.7kbpのpst I片はp
BR322のPst Iサイトにクロンを再発生させる。このこと
はプラスミドと比較されたアムピシクン レジスタンス
へノタイプの損失をもたらす。８個のこのようなクロー
ンが得られた。そのうちの５個は陽性であり、３個はフ
イブロネクチン結合活性に対して陰性である。それぞれ
の各１個はpst I片のオリエンテイションのために検査
された。陽性クローンPFR004のプラスミドはアンプープ
ロモータに最も密接したECOR Iサイトを有していた。そ
して陰性クローンのそれは逆のオリエンティションを有
している。Ｉのデータは転写オリエンティションで3.7k
bp ECOR I−Pst I片に関してECOR IからPst Iであり、
そして、少くとも結合機能をコード化するfnbp−遺伝子
の部分をこの片に収集数とを示している。これを証明す
るために、PFR004内のアンプープロモータはプラスミド
のレリゲイションによって導かれECOR I熟成によって除
去された。その結果としてのプラスミドPFR008はフイブ
ロネクチン結合活性を表示しない。PFR001において、内
因性のプロモータは第２図の3A部の矢印で示されたよう
にECOR Iサイトの左手の或る部位に位置している。ここ
にはPFR001からの詳細に述べていないがプラスミド構成
により、ECOR I（挿入されている）−SaL I（PFR322
内）片はPFR008に誘導される。フイブロネクチン結合活
性はfnbo−遺伝子から内因性プロモータの復活により回
復される。第２図の3A部に画かれたように（左から右側
へ）fnbp−遺伝子の転写方向でわかるように、融合はス
タフィロゴカルタンパク質からなる遺伝子が形成され
た。リストリクションされたエンジムマルチリンカでタ
ンパク質Ａ遺伝子をベースとしたPRIT3と称するシセリ
ションベクトルの表示は（15）で構成されている。マル
チリンカは最終のIgG−結合部位の直下に配置されてい
る、斯様にしてタンパク質Ａの領域を結合するＣ−ター
ミナル細胞壁を除去する。PFR001からの3.7kbpのECOR I
−Pst I片はプロテインＡ−FN13Pの溶解タンパク質をコ
ード化し表示されたクレームが正しく取付けられている
ことを期待してこのベクトルに挿入された。このことは
プラスミド即ちPFR013を包含するクローンがタンパク質
ＡとFNBPとの両者を検査して陽性であることが明らかで
ある。

プラスミドPFR013はフイブネクチン結合活性をコード
化して3.7kbp挿入よりも小さい部位を確認するためにイ
クスヌクレアーゼBaL31で処理された。プラスミドはECO
R I或いはPst1（それぞれ、コード化した領域の５′と
３′の点）で分裂され、BaL31で何回も処理され、そし
て再結合された。結合の間、20倍以上のECOR Iリンカが
新しい位置でECOR Iサイドに誘導するために加えられ
た。第２図のＣ部は３′或いは５′端部またはこれに相
当するフイブロネクチン結合活性の何れかから得られた
ものを削除したことを示している。結合活性をコード化
した略700bpの遺伝子の領域はデレーションNO56（５の
端部から削除）とNO22（８の端部からの削除）との間に
位置している。欠失したプラスミドNO56から新しく誘導
されたECOR IサイトからPvu11サイトまでの900bp領域は
サブのローンされた。この片はECOR IとSma Iとで分裂
したpuc18にクローンされた。これに伴って引き起され
たプラスミドは、Ｂ−ガラクトシターゼとフイブロネク
チン結合活性の両者で融合タンパク質にコード化したも
のであるが、これはPFR015と称されている。前記片はpu
c18のマルチリンカによりECOR IとBamH IによるPFR015
から再度クローンされることができる。

限定された片はまた第２図のＢ部で示す如くサブクロ
ーンされた。ECOR I−Pst I及びECOR I−CLa I片の場合
はタンパク質Ａ表示ベクトルPRIT31が用いられた。片Ba
C I−pvu11とBaL I−HincI Iはサブクローンされpuc18n
中で圧搾された。ECOR I−CLa I片を除いたあらゆる場
合において、フイブロネクチン結合活性を有する融合タ
ンパク質が得られた。CLa I−CLa Iサブクローンの場合
においては陰性結果が誤った表示クレームに現れる挿入
に係ってくる。

溶解タンパク質ZZ−FRの製品とその特徴プラスミドPF
R001で処理されたE.CoLiHB101細胞の浸透ショック溶解
液から生ずる165KDタンパク質（参考写真Ａ）の収量は
培養基略40mg/であった。精製するあいた高分子量の
化合物の解体による損失があるけれどもエドジニアスプ
ロモータを有するfnbp−遺伝子はE.CoLiの中では極く弱
く圧搾されるということを示した。圧搾のレベルを改善
するために我々は最近開発された圧搾システムを用い
た。そのシステムは異種構造のタンパク質をE.CoLi（1
6）の生長培養基に隠した。用いられた遺伝子副体ベク
トル即ちPE22318は２つの合成物質で同じ遺伝子のプロ
モータとシグナル系によって優先するスタフイロコッカ
ルタンパク質Ａの遺伝子の僅かに修正されたIgG−結合
領域を包含する。puc18のクローンされたfnbp−遺伝子
（第２図のＢ部）の約600bpのBaL l−PVV II片はECOR I
とHind IIで解体したPEZZ318内にリクローンされた。結
合と生物変移ののちPEZZ−FRは分離した。このプラスミ
ドはIgG結合製品ZZ及びFNBPのフイブロネクチン結合領
域FRから構成されている溶解タンパク質をコード化す
る。

ZZ−FRタンパク質を精算するためプラスミドPEZZ−FR
を媒介するE.コリーストレインHB101はトリプィティケ
イス ソイ ブロースの中で１夜経過した。バクテリア
は遠心分離によって除去され、生長培養基はIgG−セフ
ァローゼファーストフローコラムを通過した。TST−バ
ッファ（5mM Tris−HCL PH7.4 150mM NaCL,0.05 Twee
n^R20）でコラムを洗浄したのち、ZZ−FRタンパク質はア
ンモニウムアセテートを用いてPH2.8に滴された。0.5M
酢酸で溶出した。略50mgのタンパク質は生長培養基の
当たりのコラムから溶出された。

親液したのち溶出物質はSDS−PAGEで分析された。そ
のことは参考写真Ｂに示す如く略63KDにおける主たるタ
ンパク質バンドを表示している。付加するに、より小片
となったバンドは溶解タンパク質の加水分解により現わ
れる。同じゲルに作用した完全なタンパク質Ａは56KDの
回りを分散型バンドとして現われる。ゲル中のタンパク
質は硝酸ペーパーへ電気泳動的に運ばれ125Iラベルト29
KDフイブロネクチン片で精査される。参考写真ＢのＣと
Ｄの列は、溶解タンパク質であるか完全タンパク質Ａで
はない置換して識別するフイブロネクチン片として結合
することを表示している。

ZZ−FR溶出タンパク質のフイブロネクチン結合性能の
ための証拠は29KDフイブロネクチン片で置換されたセフ
ァローゼコラムについて類縁性クロマトグラフィーによ
って得られた。溶解タンパク質はコラムに結合し、そし
て6MGOHCL（第３図のＡ部）で類縁性マトリックスから
溶出された。ZZ−FR溶解タンパク質のフイブロネクチン
結合特性は明らかにFR−レジホン中に位置しており、と
いうのは、完全タンパク質Ａは類縁性マトリックス（第
３図のＢ部）に結合しなかった。類縁性マトリックスに
結合しなかったZZ−FR溶解タンパク質の製造した部分は
完全溶解タンパク質（参考写真ＣのＡ列）よりも低いMr
でタンパク質を構成してあり、そのためにコラムに結合
している物質は完全な63KDZZ−FR溶解タンパク質（参考
写真ＣのＢ列）の殆ど純粋な製品から構成されている。

クローンされたFNBPと見做すことができるところのヌ
テファロコッカスのフイブロペクチン結合性能が大きさ
を決めるために量を調整された。第４図に示す如く、溶
解タンパク質は全体的にはエス・アウレウスニューマン
と8325−４タンパク質Ａの両者の細胞に対して完全なフ
イブロネクチンと同様に125I−ラベルド29KD片の結合を
抑制した。これは制御材として用いたが（第４図）結合
性を抑制するものではない。

エス・アウレウスがフイブロネクチンに対して結合す
るというクッセラ（６）による報告の後、結合に対して
反応するバクテリアの構成要素を確認する試みが集中的
になされた。これらの研究に対する合理性は病原となる
バクテリアのフイブロネクチンに対する結合は感染の早
期段階で極めて重要な組織密着の機構を現わすことがで
きる。類縁性クロマトグラフィによるインモピライズド
フイブロネリチンに関する精製したタンパク質はフイブ
ロネクチンに対するスタフィロコッカル細胞の結合にお
いて包含される。しかし、フイブロネクチン結合結合タ
ンパク質の分子量の報告は18KD（10）から常に197と210
KD（11.17）に変化する。分子サイズの異種成分の主な
理由は分離過程中タンパク質を分解することができる。

本発明の説明において、エス・アウレウス ストレイ
ン8325−４からのフイブロネクチン結合タンパク質に対
してコード化した遺伝子のイー・コリー内のクローニン
グが記載されている。FNBP遺伝子が内因的なプロモータ
ーから１−1211−内で圧搾されるときタンパク質はオス
モティックショックによってペソプラズムから分離する
ことができる。このことはプロモーターのみでなくシグ
ナルペプチドガイーコリー内では機能的であることを示
している。

クローンされたfnbp−遺伝子によるコード化されたタ
ンパク質であっても165とよりKD（参考写真Ａ）第２図
の分子量を有する。その数字はエス・アウレウス スト
レーン ニューマン（Mj＝210KD）（12）から分離され
たFNBPより小さい。それ等のアミノ酸構成は陰性タンパ
ク質（表１）のそれに極く類似している。更に尚自然の
FNBPに対して発生する抗体は165と87KDタンパク質に交
互反応する。これ等のデーターはエス・アウレウス ス
トレーン8325−４からクローンされた遺伝子によってコ
ード化されたタンパク質の構造はエス・アウレウスニュ
ーマンからの自然のFNBPのそれに類似しているというこ
とを示している。87KDタンパク質は転写或いは翻訳レベ
ル或いは165KDタンパク質の選択的タンパク質の分裂に
おいて死の前に起る原因となる。現在においては、165K
Dタンパク質がエス・アウレウス細胞に対し、フイブロ
ネクチン結合の抑制間で87KDタンパク質よりも30倍も多
い活性がなぜあるかを説明することができない。

BaL31−分裂とリストリクション片のサブクローニン
グを用いて精密に削除することによりワイブロネクチン
結合活性をコード化するfnbp−遺伝子の領域は略350bp
（第２図のＢ部）の領域に位置した。350bpをカバーす
る略600の遺伝子片は圧搾ブクトルPEZZ318（16）によっ
てタンパク質Ａプロモーターとシグナル系によって優先
したタンパク質Ａ遺伝子の合成IgG結合領域の縦列に繰
返された系（ZZ）に直接結合した。その結果ともたらさ
れた溶解タンパク質（ZZ−FR）は、SPD−PAGE（参考写
真Ｂ）で決定された。略63KDの分子量を持っているが、
fnbp遺伝子から600bp挿入によりコード化された略アミ
ノ酸により誘導されたZZ領域の126アミノ酸を包含す
る。タンパク質のＣ−ターミナル端はアミノ算を構成し
ており、それは翻訳段階コードが到達するまでのベクト
ルのラックＺ遺伝子をクレームの外側を読み通す結果と
なる。高いレベルで圧搾され且つE,コリーの生長培養基
に隠れているところの溶解タンパク質（ZZ−FR）はZZ−
領域のIgG−結合性能の使用を有する類縁性クロマトグ
ラフィによって容易に分離される。

ZZ−FRタンパク質はフイブロネクチンの29KDNH₂−タ
ーミナル領域に結合されて、そして、エス・アウレウス
（第３図、参考写真Ｃ）に対して完全なフイブロネクチ
ンの結合を抑制する。これらのデーターは他のタンパク
質を用いた溶媒条件のもとでは、またフイブロネクチン
の29KDN−ターミナスの外国の認識された領域ではスタ
フイロコッカル細胞によって圧搾されない。更に、FNBP
のフイブロネクチン結合活性はタンパク質のかなり小さ
いセグメントに喰い止める。エス・アウレウス ストレ
ーン ニューマンから分離された自然の210KDFNBPにつ
いての最近の分析はこのタンパク質が多価染色体群でFN
BPの１分子６−９はフイブロネクチン分子（12）を結合
することができるということを現わしている。クローン
されたfnbp−遺伝子はストレース エス・アウレウス83
25−４から抽出される。然しエス・アウレウスのストレ
ーンの間に何等の差異もなかったならば数種の繰返系を
含むためにFR−領域を除外することになるであろう。こ
の疑問はまたクローンされたfnbp遺伝子の系の分析によ
って回答される。FNBP−プロパティーを持ったFR−領域
の系は第５図Ｂに示されている。

FR結合活性は結合活性（第２図）をコード化したBaL1
−PVU II片のように再現する３個の38アミノ酸の各々に
関係することは信ずるに充分な理由がある。このことは
結合性をコード化したBaL1−Hine II片や同様に結合活
性をコード化しないHinc II−PVU II片からも理解でき
る。更に１個の単純な38アミノ酸の複製はフイブロネク
チンを結合するのに機能的である。従って、合成した38
−アミノ酸の長いペプチド｛38（２）−複製｝は結合活
性を有する（第６図に示す）。38アミノ酸の複製物の各
々は同族である。

実験例２ 38アミノ酸｛38（２）複製｝のフイブロネクチン結合
領域をコード化したリン酸基系をベースとしたポリペプ
チドの化学的合成物はＣ−ターミナルヒステイデンから
出発し、固有のアミノ酸と反応させる段階から、K.B.メ
ルフィールド,J,Λnu,Chem.Soc86,PP.304（19684）によ
る方法でコード化した固体相からなる合成物で最終的に
Ｎ−ターミナルでグリシンと反応させクレオチドに相当
するアミノ酸系で組立てられた。これにより、第２のア
ミノ酸複製に相当するポリペプチド法合成物である。同
様に第３のポリペプチドは38−リピートである、viz:
1）、アミノ酸１−19、をカバーするポリペプチド、
２）、アミノ酸９−30をカバーするポリペプチド３）、
アミノ酸2038をカバーするポリペプチド、等はすべて同
様な方法によりコード化した合成物である。

コンプリート38−リピートのフイブロネクチン、１−
19アミノ酸ポリペプチド、９−30アミノ酸ポリペプチ
ド、20−38アミノ酸ポリペプチドの３種の小さいポリペ
プチドが検査され、そしてその結果は第９図に示され
る。コンプリート38リピートの片はフイブロネクチン結
合物が予期するようにコンプリート38リピートと依る
か、或いはフイブロネクチン結合特性が38アミノ酸系の
或る小さな領域に限定されるとしても検査のために合成
される。第６図から明らかな如く、フイブロネクチン結
合特性はコンプリート38アミノ酸ペプチドに存在すみで
ある。

物質とその製法 菌株とプラスミド。スタフイロコッカスアウレウム菌
株8325−４からのクロモソマルDNA PBR322遺伝子貯蔵
所）はフイブロネクチン結合活量を圧搾したクローンを
濾過する。イー・コリー株菌HB102,（18）とJM105（1
9）はサブクローンや圧搾実験に用いる。プラスミド生
物はPBR322（20）とPUC18（21）とタンパク質Ａベクタ
ーPR1T3（15）とPE22318（16）であった。エス・アウレ
ウス株菌コーワン１、ニューマンと8325−４はFNBPの分
析評価に用いられる。

微生物生長培地・イー・コリーの培養においては下記
の如き培地が用いられる。媒質の１リトレルに関する分
子の量である。

Typton Soy Broth（Oxode Ltd,Basingstoke,Hants,G
B） 30 g Yeast Extract（Oxoid） 10 g Ｄ−glucose 40 g NH₄cl 2.5 g Na₂HPO₄.2H₂O 7.5 g KH₂PO₄ 3.0 g Na₂SO₄10H₂O 2.5 g Mgso₄.7H₂O 0.2 g CaCl₂.2H₂O 0.5mg FeCl₃.6H₂O 16.7mg ZnSO₄.7H₂O 0.18mg CuSO₄.5H₂O 0.16mg MnSO₄.4H₂O 0.15mg CoCl₂. 0.10mg NaEDTA 20.1 mg フイブロネクチン結合タンパク質（FNBP）の分析評価
のエス・アウレウス細胞に結合するフイブロネクチンの
定量的測定は前述の（10）に記載されている。若し他の
方法での記述がないならば、エス・アウレウスコーワン
Ｉの109細胞は合計容積0.3ml巾に牛血清1mg/mlを含むPB
S中にフイブロネクチン29KDNH₂−ターミナル片や125I−
ラベルドフイブロネクチンで加熱される。22℃で２時間
加熱後、放射線を細胞に当てながらガンマ計数管で計測
する。

（13）項記載のリソジチを含むThis−HeLバッファ、P
H8,1で製造されたイー・コリークローン溶解物はフイブ
ロネクチンの125I−ラベルド29KDNH₂−最終片と結合さ
せるためスタフイロコッカス細胞との反応性能について
その性能を測定することによりフイブロネクチン結合活
量を分析した。50％結合力を抑制し得るFNBPの量は１ユ
ニットの活量として考えられる。

オスモティック ショック処理はイー・コリー（14）
のペリプラスミックスペースからタンパク質を解放する
ために用いられる。

FNBPの精製。

FNBPの精製はイオン交換クロマトグラフィによって後
処理されたフイブロネクチン−セファローズによるアフ
ィニティークロマトグラフィをベースとする。

ヒトのフイブロネクチンは既に記載された方法（22）
による旧式な値から製造される。それからヒドブロネク
チンは20mMトリイス−HCL,8,3PHに対して透析される、
そしてDEAE−コラムに濃縮される。セファローズSL−4B
に対するフイブロネクチンの結合は既に知られている
（23）のようなブロモシアン活性処理によってなされ
た。

イー・コリー溶解物はアフィニティーコラム上に吸引
された後ベースラインが安定なもの（４コラム量）とな
るまで0.5Mアンモニウムアセテートで洗浄される。それ
からFNBPは0.4Mのアセティック酸で溶出され、アンモニ
アで中和されるか凍結乾燥される。更にアンモニアでpH
7.6に調製した10mMのアンモニウムアセテートを透析し
たのち、更に、分別段階はモノＱコラムを用いたファー
マシカFDLC装置上でイオン交換クロマトグラフィによっ
てなされる。

ヌクレオチド系の分析 ヌクレオチド系はユイザムA.M等（27）によって記載
された方法で決定される。

アミノ酸の分析。アミノ酸組成物はダラムＤ−500分
析器を用いて決定される。このサンプルは110℃24時間
フエノル2mg/mlを含んだ6M HCL内で加水分解される。１
つのサンプルはシステインとメシオニンで測定するため
にパフォーミック酸で酸化される。ノルロイシンはイン
ターナルスタンダードとして添加される。タンパク質は
標準的にはボビンセラムアルプミンを用いて（24）に基
づいて決定される。

電気詠動。他の方法を示し得ないなら、SDS−ポリア
クリルアシドヂルの電気詠動は５〜15％の傾度を有する
ゲルで実行される。このゲルはコッマッシブリリアント
ブルーやデーステンインド及び撮影するかして着色され
る。

標識免疫検定法による処理。165KDのSDS−ポリアクリ
ルアミド・ゲル・電気詠動法で定量的に測定された分子
量からなる精製FNBPは（25）で知られるようにクロラミ
ンTo方法による125I−オデインで分類表示される。その
後、イオデイネイトン物質はフイブロネクチン−セファ
ローズ コラムにリクロマトグラフィされる。

125I−FNBP（3 400cpmイン10μ）を含む加熱混合物
はラビットアンチセラム（ニス・アウレウム ストレイ
ン ニューマン）の種々のデイリューションと混合され
る、これは、0.2mlの加熱バッファ（PBS,0.1％トリトン
メー100と0.02％のソテイウム酸）中でされる。

上記サンプルは抗原抗体反応を許容するため20℃で２
時間に亘り加熱する。PBS中に60％のサスペンション0.1
ml（wp）のタンパク質Ａ−セファローズが加えられ、そ
して、その混合物は相当の時間が熱された。この加熱は
サンプルに1.7mlの加熱バッフアを加えることにより停
止した。2000rpm3分間遠心分離したのち表面浮遊物を吸
収して排出した。ペセットは加熱バッファ中で２回洗浄
し、そしてタンパク質Ａ−セファローゼに関係あるラジ
オアクティビィはガンマ測定器で測定された。

制御ニンドヌクレアーゼと他のエンジム。

リストリクションエジム、T4 DNAリガーゼとBAL31はB
RLから獲得する、そしてリコメンデイションに従って用
いられる。複雑化したPNF工学の他の方法は本質的に（2
6）の項で知られている。

本発明に係るフイブロネクチン結合タンパク質は兎疫
のために用いられる。これにより好ましくは、応答して
大きい抗原を発生させるために溶解タンパク質と組合せ
て哺乳動物内で免疫学的な反応を引起こすように投薬と
して注入される。斯様にして、このフイブロネクチン結
合タンパク質はスタフイロコッカス感染で引起された乳
腺炎に対して動物のワクチンに用いることができる。本
発明のフイブロネクチン結合タンパク質は下記表に示す
ようにはつかねずみにスタフイロコッカルに感染に対し
て抗体を形成することが示されている。

免疫性が終始有することは上記表から明らかなように
プラスミドPFR001を含むイー・コリーによって示される
ようなFNBPを用いることにより得られる。

更にフイブロネクチン結合タンパク質は懸濁液状のフ
イブロネクチン結合タンパク質を用いて傷を処理するこ
とにより皮膚の開いた傷に感染を妨げるように用いるこ
とができる。このように、フイプロネクチン結合タンパ
ク質はタンパク受容体を妨げ、或いは免疫（ワクチン）
を妨げるような傷口の手当のために用いることができ
る。後者の場合は保菌者はフイブロネクチン結合タンパ
ク質のようなものを含むバクテリアストレインの侵入に
対してこれを防ぐような特別な抗体を生産することがで
きる。これにより、抗体はダメージを受けた組織に対し
てバクテリアストレインの癒着を妨げることができる。

崩壊した組織を移植する実験例 ａ）皮膚の傷や結合組織の移植において、前記傷は機械
的外傷、化学的損傷及び／またはやけどによって引き起
こされた。

ｂ）口腔、乳腺、尿道、膣口のような粘膜の傷の移植。

ｃ）結合組織タンパク質の移植はミニマル組織の傷（マ
イクロレシオン）は露出される。前記組織は皮膚組織、
内皮（乳腺炎、心臓弁膜症、ヒップエクスチェンデ外
科）を関係している。

人を含む哺乳動物に免疫（ワクチン摂取）の目的でFN
BPや38アミノ酸ポリペプチドを用いるときはタンパク質
やポリペプチドは無菌状で均等塩溶液、たまには、薬学
的に許容し得る分散媒介物を加えて分散させる。種々異
なった補助剤は組織内の開放を支えるために用いること
ができる、そして身体の免疫制御組織に長期間に亘って
タンパク質やペプチドを露出せしめる。

免疫を得るための適切な投与量はkg/体重FNBP或いは
ポリペプチド0.5〜５μｇであり、免疫剤を注入する。
永続性のある免疫を得るため、少くとも１〜３週間の間
隔を隔てて１回以上連続的に、好ましくは３回遂行すべ
きである。

本発明に係るFNBP或いはポリペプチドを用いるとき、
タンパク質は局所部位を治療するため25〜250mg/mlの濃
度で均等塩溶液に分散させる。それにより、傷は傷表面
が完全に湿った状態を得るための量で治療される。この
ようにして、通常の傷はほんの２〜3mlの溶液しか用い
られなくてよい。傷にタンパク溶液を用いて手当したあ
とは傷は均等塩溶液或いは他の適当治療溶液で適切に洗
浄される。

更に、本発明は最小のフイブロネクチン結合サイト
ポリペプチドのようなフイブロネクチン結合タンパク質
がスタフイロコッカルストレインによって引き起こされ
たバクテリアの感染を診断するために用いられる。これ
により、本発明に係るフイブロネクチン結合タンパク質
は固形担体に固定する。これは小さい乳液或いはセファ
ローゼＲビードである。それで、抗体に含まれるリンパ
液は通過が許容されてFNBPと反応し、固定される。それ
から、傷口の癒着は公知の方法で測定される。

更にFNBP或いはポリペプチドはELISAテスト（Emzyme
Linked Immuno Sorbent Ass ay;E Engvall,Med.Biol,5
5,193,1977）で用いられる。ポリスチレン マイクロテ
イトレプレートのウエルはFNBPで塗布され、それから、
４℃で１夜培養する。前記プレートは0.5％。ツイーン2
0を含むPBSを用いて完全に洗浄される。そして乾燥させ
る。順次希釈されたパテイエントセラムはPBS−トイー
ンに形成され、前記ウエルに添加される、そして30℃で
1.5時間培養される。洗浄したのち、酵素と接合した抗
人−IgGや酵素と接合した抗中はウエルに添加したの
ち、30℃で1.5時間培養される。それから、前記IgGが結
合したとき洗浄する。それから、酵素の基質がアルカリ
性リン酸酵素の場合はＰ−ニトロリン酸塩が添加され、
過酸化水素酵素の場合はオートハニレン ジアニン基質
（OPP）が用いられる。このように、ウエルを含むプレ
ートが0.055％のOPDと0.005％のH₂O₂,とを用いて洗浄
し、そして30℃で10分間培養した。酵素の反応はウエル
に対し硫酸の4N溶液を添加することにより停止する。色
彩的に改良するにはスペクトル光度計を用いて測定す
る。

フルオロスセンス測定に用いる酵素基質の型によって
はウエルのように用いることができる。

スタフイロコッシ感染を診断する他の方法はFNBP系か
38アミノ酸ポリペプチド系かをベースとする方法で判明
するDNA遺伝子を用いることによるものである。これに
より、自然または合成DNA系は固体の担体にアタッチす
る。上記のようなポリスチレンプレートは乳腺炎を診断
する場合のミルクをその表面に加える。DNA遺伝子はラ
ベルドインジマテイカリのときもあるが、その他に、ラ
ジオアクティブアクソトープがDNA系を含む固体表面プ
レートに加えられることにより証明される。これによ
り、DNA遺伝子は外部より視認し得る葉に付着すること
により証明する。酵素やラジオアクティブアイソトープ
は既に公知の方法によって決定することができる。

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イオケミカル.52、761−799.

【図面の簡単な説明】

第１図Ａはフイブロネクチン・セファローズの親和性ク
ロマトグラフィによってアンモニウムアセテートを分離
する反応状態を示すグラフ図である。 第１図Ｂは第１図Ａに示す親和性クロマトグラフィで分
離した物質からイオン交換クロマトグラフィによってア
ンモニウムアセテートの濃度の増大に対応して陰イオン
コラムの溶出する状態を示すグラフ図である。 第２図はpFR001に挿入するサブクローンを削除するリス
トリクション図であって、第２図のＡ部は6.5Kbを挿入
したリストリクション図、第２図のＢ部はフイブロネク
チン結合活性をコード化して遺伝子領域を決定するため
に構成した種々のサブクローンの処理工程を示すリスト
リクション図、第２図のＣ部は異なる遺伝子生産品のた
めのフイブロネクチン結合活量を示すリストリクション
図である。 第３図は親和性クロマトグラフィによってZZ−FRタンパ
ク質の濃度と溶質量を示すグラフ図である。 第４図はバクテリア細胞の125₁−フイブロネクチンの結
合性を抑制する状態を示すグラフ図である。 第５図Ａと第５図Ｂはフイブロネクチン結合タンパク質
をコード化したナクレオチド系及び異なったアミノ酸系
を略符号で図表化したものである。 第６図はアミノ酸系ポリペプチドの添加量とフイブロネ
クチン結合性能との関係を示すグラフ図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ラース クリスター シグナス スウェーデン ウプサラ エス‐753 23 ハムネスプラナデン ２ エイ (72)発明者 トーケル ミカエル ワードストローム スウェーデン ルンド エス‐223 67 レクトルスバーゲン ７ (72)発明者 グンナー フロマン スウェーデン ウプサラ エス‐752 40 リンドスバーグスガータン ５ビイ (56)参考文献 実表 昭61−502334（ＪＰ，Ｕ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のヌクレオチド配列１）〜３）の１また
   は２以上からなるフイブロネクチン結合性を有するタン
   パク質またはポリペプチドをコードするスタフイロコッ
   カス・アウレウスの遺伝子。
2. 【請求項２】特許請求の範囲第１項記載の遺伝子を含む
   寄託番号DSM 4124を有するイー．コリーストレイン259
   に含まれるプラスミドPFR001。
3. 【請求項３】特許請求の範囲第１項記載のスタフイロコ
   ッカス・アウレウスのヌクレオチド配列によってコード
   されるフイブロネクチン結合タンパク質を発現するイ
   ー．コリーストレイン。
4. 【請求項４】特許請求の範囲第１項記載の遺伝子により
   形質を転換した微生物。
5. 【請求項５】特許請求の範囲第２項記載のプラスミドを
   含む微生物。
6. 【請求項６】ａ）特許請求の範囲第１項記載の遺伝子を
   微生物に導入する工程と、ｂ）該微生物を生長促進培地
   で培養する工程と、ｃ）こうして形成されたタンパク質
   を、不溶化担体にフイブロネクチンが結合したカラム上
   でアフイニティークロマトグラフィーにかけ、次いでイ
   オン交換クロマトグラフィーにかけることにより分離す
   る工程、からなるフイブロネクチン結合タンパク質また
   はポリペプチドの製造方法。
7. 【請求項７】少くとも１個の下記アミノ酸配列からなる
   フイブロネクチン結合タンパク質またはポリペプチド。
8. 【請求項８】アミノ酸残基はタンパク質またはポリペプ
   チドをコードする特許請求の範囲第１項記載の遺伝子を
   ベースとして構成し、Ｃ末端ヒステイデインから出発
   し、適当なアミノ酸と段階的に反応させ、最終的にＮ末
   端でグリシンと反応させる特許請求の範囲第７項記載の
   フイブロネクチン結合タンパク質またはポリペプチドの
   化学的合成法。