DK176146B1 - Fibronectinbindende protein og fremgangsmåde til fremstilling heraf - Google Patents

Description

DK 176146 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af et polypeptid med fibronectinbindende egenskaber ved fremstillingen af farmaceutiske præparater.

5 Den foreliggende opfindelse har til hensigt at tilvejebringe et minimalt fibronectinbindende protein.

Herudover tilvejebringer opfindelsen metoder til genetiske manipuleringsmetoder under anvendelse af for eksempel et plasmid 10 omfattende en nucleotidsekvens, der koder for proteinet.

Opfindelsen beskrives nærmere i den efterfølgende beskrivelse.

WO-A1-85/05553 (EP-A-0 163 623) omhandler bakteriecelleover-15 fladeproteiner, der udviser fibronectin-, fibrinogen-, collagen- og/eller lamininbindende evne. Her vises det, at forskellige bakterier har en evne til at binde til fibronectin, fibrinogen, collagen og/eller laminin. Endvidere vises det, at fibronectinbindende protein har en molekylvægt på 165 kD 20 og/eller 87 kD, hvorved det er muligt, at det mindre protein er en del af det større.

Fibronectin er et stort glycoprotein {Mr ca. 450 kD) med to lignende underenheder, der kan variere i molekylstørrelse af-25 . hængigt af et komplekst splejsningsmønster af et forstadium mRNA (1). Hovedfunktionen ved fibronectin, der findes i le- « gemsvæsker, blodkoageler og extracellulært materiale, synes at være relateret til proteinets evne til at formidle substrat-adhærence eller -vedhæftning af de fleste eukaryotiske celler 30 (2, 3, 4, 5).

I den sidste del af halvfjerdserne fandt Kuusela, at fibronectin ikke alene virker sammen med eukaryotiske celler, men også binder til celler af Staphylococcus aureus (6). Efter denne 2 DK 176146 B1 observation har en hel række pathogene mikroorganismer vist sig at binde til fibronectin med en høj specificitetsgrad og høj affinitet (7). Fibronectin i den extracellulære matrix synes at tjene som et substrat også for vedhæftning af forskel-5 lige mikroorganismer. Bindingen af fibronectin kan for visse mikroorganismer udvise et afgørende trin ved koloniseringen af værtsvæv og udvikling af infektion.

Adskillige forskellige celleoverfladekomponenter har været an-10 tydet som fibronectinreceptorer på Gram-positive bakterier, herunder lipotechionsyre (8, 9) og protein (10). I forudgående undersøgelser har man isoleret et fibronectinbindende protein med en Mr på 197 - 210 kD fra S. aureus stamme Newman (11,12) og foreløbigt identificeret som en fibronectinreceptor. For 15 yderligere at karakterisere dette fibronectinbindende protein fra S. aureus er genet for dette protein blevet klonet i E. coli. Det fibronectinbindende område inde i dette protein er også blevet lokaliseret, og egenskaberne ved et fusionsprotein indeholdende dette område og IgG-bindende områder af protein A 20 vil blive omtalt nedenfor.

Froman et al. (1986), FEMS Symposia, 31, p. 263-268, beskriver karakteriseringen af et fibronectinbindende protein af Staph, aureus, hvorved aminosyresammensætningen med hensyn til de in-25 dividuelle aminosyrer er givet. Der er ingen beskrivelse af en peptidbinding til fibronectin.

Froman et al. (1987), J. Biol. Chem. 262(14), p. 6564-6571, beskriver isoleringen og karakteriseringen af en fibronectin-30 bindingsrecep'tor fra Staph, aureus, hvilken receptor omfatter et 210 kDa protein, hvorved der ikke er givet nogen beskrivelse vedrørende et 38 aminosyre-polypeptid med fibronectinbin-dingsegenskaber eller anvendelsen af et sådant peptid i et farmaceutisk præparat.

3 DK 176146 B1

Espersen & Clemmensen (1982) Infection & Imm. 37(2), p. 526-531, beskriver et fibronectinbindendde protein med en molekylvægt på 197 kDa. Der findes ingen beskrivelse af et 38 amino-5 syre-polypeptid, der har fibronectinbindende egenskaber.

Det har nu overraskende vist sig muligt at opnå et polypeptid med fibronectinbindingsegenskaber og anvendelse deraf ved fremstillingen af farmaceutiske præparater, hvorved polypepti-10 det består af mindst en af følgende aminosyresekvenser:

Gly Gin Asn Ser Gly Asn Gin Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp

Lys Pro Lys Tyr Glu Gin Gly Gly Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp

Ser Val Pro Gin Ile His and/or

Gly Gin Asn Lys Gly Asn Gin Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp I 5

Lys Pro Lys Tyr Glu His Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro His Ile His and/or

Gly Phe Asn Lys His Thr Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp

Lys Pro Ser Tyr Gin Phe Gly Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu Glu 2ø Asp Thr Leu Pro Lys Val

Polypeptidet er baseret på følgende nucleotidsekvens til stede i et gen kodende for dette polypeptid.

Som det fremgår nedenfor forefindes følgende nucleotidsekvens 25 i det gen, der koder for proteinet.

GGC CAA AAT AGC GGT AAC CAG TCA TTC GAG GAA GAC ACA GAA GAA

GAC AAA CCT AAA TAT GAA CAA GGT GGC AAT ATC GTA GAT ATC GAT

TTT GAT.AGT GTA CCT CAA ATT CAT GGT CAA AAT AAA GGT AAT CAG TCA TTC GAG GAA GAT ACA GAA AAA GAC AAA CCT AAG TAT GAA CAT

gø GGC GGT AAC ATC ATT GAT ATC GAC TTC GAC AGT GTG CCA CAT ATT

CAC GGA TTC AAT AAG CAC ACT GAA ATT ATT GAA GAA GAT ACA AAT

AAA GAT AAA CCA AGT TAT CAA TTC GGT GGA CAC AAT AGT GTT GAC

TTT GAA GAA GAT ACA CTT CCA AAA GTA AGC GGC CAA AAT GAA GGT

CAA CAA AGC ATT GAA GAA GAT ACA ACA CCT CCA ATC GTG CCA CCA

ACG CCA CCG ACA CCA GAA GTA CCA AGT GAG CCG GAA ACA CCA ACG

CCA CCA ACA CCA GAA GTA CCA AGT GAG CCG GAA ACA CCA ACA CCA

CCG ACA CCA GAA GTG CCG AGT GAG CCA GAA ACT CCA ACA CCG CCA

ACA CCA GAG GTA CCA GCT

4 DK 176146 B1

Passende bæreproteiner kan også kobles til aminosyresekvensen, som f.eks. IgG-bindende regioner af protein A.

5 Opfindelsen beskrives nærmere nedenfor.

EKSEMPEL 1

tein_|FNBEM

En genbank i plasmid pBR322 af kromosomalt DNA fra Staphy-10 lococcus aureus stamme 8325-4 tidligere beskrevet af {13) undersøgtes for kloner, der udtrykker FNBP. E. coli kloner lyseredes, og lysaterne undersøgtes for deres evne til at hæmme bindingen af ibronectin til celler af S. aureus Cowan I som beskrevet i fremgangsmådedelen.

15 For at forenkle afsøgningen blev klonerne slået sammen i prøver på 25, lyseret og undersøgt. Ud af 22 sammen-slåede mængder, der undersøgtes, afprøvedes atter den med den højeste hæmmende virkning i fem sammenslåede prøver på 5. Til slut undersøgtes de enkelte kloner i en posi-20 tiv sammenslået mængde, hvilket resulterede i isolering af en enkelt positiv klon. Plasmidet i den positive klon blev betegnet pFROOl.

Μ

Dette pFROOl plasmid i en E. coli stamme 259 er deponeret i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) og har 25 fået deponeringsnummeret 4124.

y

Isolering af Staphylococ-FNBP fra E. coli pFROOl E. coli klonen, positiv for FNBP, dyrkedes i LB-substrat ved 37°C til den stationære vækstfase. Bakteriecellerne centrifugeredes og lyseredes ved hjælp af en osmotisk 5 DK 176146 B1 chockmetode (14). For at udelukke at hæmmende virkning af chocklysatet på bindingen af 125I-fibronectin til S. aureus celler skyldes proteolytisk aktivitet, sattes ly-satet til inkubationsblandingen, og mængden af ^2^I-fi-5 bronectin bundet til S. aureus bestemtes efter 1, 2, 3 og 4 timers inkubation. Under denne inkubationsperiode forblev hæmningsniveauet af lysatet konstant (fx 50%), hvilket antydede, at den observerede hæmning ikke skyldtes en fremadskridende nedbrydning af *-2^I-mærket ligand 10 eller tilsvarende receptor.

Dersom den hæmmende virkning skyldes tilstedeværelsen af FNBP-lignende strukturer i lysatet, skulle disse udtrykke en specifik affinitet for fibronectin. Lysatet analyseredes derfor ved hjælp af affinitetskromatografi på 15 en søjle af fibronectin-Sepharose således som beskrevet under materialer og metoder (fig. lA). Rensningen var cirka 30 gange. Yderligere fraktionering opnåedes ved at underkaste det affinitetsrensede materiale for ionbytter kromatografi under anvendelse af en mono Q-søjle 20 anbragt på et FPLC-system. I dette fraktioneringstrin fås to hovedtoppe (fig. IB). Analyse ved hjælp af poly-acrylamidgelfelektroforese indicerede, at de to toppe indeholdt proteiner af molekylvægte henholdsvis 185 og 87 kD (fig. 2). Begge komponenter hæmmede bindingen af 25 ^2^I-fibronectin til S. aureus. Fraktionen indeholdende 165 kD proteinet havde en specifik hæmmende virkning på 220 enheder/qg, hvilket repræsenterede en 430-gange oprensning fra det oprindelige chocklysat, og den var 30 gange mere aktiv end 87 kD proteinet beregnet på molba-30 sis (data ikke vist).

Aminosyreanalyse af de to proteiner viste, at de havde meget ens aminosyresammensætning, der også nært lignende den, der er bestemt for nativt FNBP isoleret fra S. aureus stamme Newman (tabel 1). Det immunologiske slægt-35 skab mellem 165 kD protein isoleret fra E. coli pFROOl 6 DK 176146 B1 og nativt FNBP isoleret fra S. aureus stamme Newman un- 125 dersøgtes. 165 kD proteinet I-mærkedes og immunopre- cipiteredes med stigende fortyndinger af et antistof over for S. aureus stamme Newman. En 300-fold fortynding af 125 5 antiserummet udfældede 50% af det I-mærkede protein. Umærkede 165 og 87 kD proteiner såvel som det native FNBP greb ind i immunoprecipitationen af det mærkede 165 kD protein (data ikke vist). Disse observationer antyder, at 165 og 87 kD proteinerne isoleret fra S. aureus 10 stamme Newman er nært beslægtet med det fibronectinbin-dende protein (FNBP).

Identifikation af regionen af den region af FNBP-qenet, der koder for bindingsaktiviteten •Størrelsen af indskuddet i plasmid pFROOl er cirka 6,5 15 kbp- Restriktionskortet af indskuddet er vist i fig.

3(A). For at bestemme transkriptionsretningen og lokalisere den region, der koder for den bindende funktion, genklonedes Pstl-fragmentet på cirka 3,7 kpb i Pstl-ste-det af pBR322. Dette bevirkede tab af ampicillin-resi-20 stens-phenotypen tildelt af dette plasmid. Der opnåedes otte sådanne kloner, af hvilke fem var positive og tre negative med hensyn til fibronectinbindende aktivitet.

En af disse undersøgtes for orientering af Pstl-fragmentet. Plasmidet af den positive klon pFFR004 havde 25 EcoRI-stedet nærmest til Amp-promotoren, og den negative klon havde den modsatte orientering. Disse resultater indicerer, at transkriptionsorienteringen er fra EcoRI til PstI på 3,7 kbp EcoRI - PstI fragmentet, og at mindst en del af fnbp-genet, der koder for bindingsfunktionen 30 er beliggende på dette fragment. For at verificere dette fjernedes Amp-promotoren i pFR0Q4 ved hjælp af EcoRI nedbrydning efterfulgt af religering af plasmidet. Det frembragte plasmid pFR008 udtrykte ikke fibronectinbindende virkning. I pFROOl er den endogene promotor såle-35 des sandsynlitvis beliggende et eller andet sted på den 7 DK 176146 B1 venstre side af EcoRI-stedet (som vist ved pilen i fig.

3A). Ved hjælp af en plasmid-konstruktion (ikke beskrevet) indførtes EcoRI (i indskuddet)-Sall (i pBR322) fragmentet fra pFROOl ind i pFR008. Den fibronectinbindende 5 virkning blev atter genoprettet, på grund af genoprettelse af den endogene promotor fra fnbp-genet.

Idet man kender transkriptionsretningen af fnbp-genet (fra venstre til højre som angivet i fig. 3(A)), fremstilledes fusioner til genet for staphylococprotein A.

10 En udtrykkelses-sekretionsvektor betegnet pRlT3 baseret på protein A-genet med restriktionsenzymmultilinker blev opbygget (15). Multilinkeren er anbragt umiddelbart nedenfor den sidste IgG-bindende region, hvorved man fjerner den C-endestillede cellevægsbindende region af pro-15 tein A. 3,7 kbp EcoRl-PstI fragmentet fra pFROOl indførtes i denne vektor, idet man forventede, at det kodede et protein A-FNBP fusionsprotein, forudsat at læserammen var korrekt. Dette var tilsyneladende tilfældet, da klonen indeholdende dette plasmid betegnet pFR013 er 20 positiv i undersøgelse for både protein A og FNBP.

Plasmid pFR013 blev behandlet med exonuclease Bal31 for at identificere en region, der er mindre end 3,7 kbp indskuddet, der koder for den fibronectinbindende virkning. Plasmidet spaltedes med EcoRI eller Pstl (ved henholds-25 vis 5' og 3' enden af den kodede region), behandledes til forskellige tider med Bal31 og revideredes. Under ligationer tilsattes 20 fold overskud af en EcoRI linker for at indføre EcoRI steder på nye positioner. Fig. 3(C) viser deletionerne opnået fra enten 3' eller 5' enden og 30 den tilsvarende fibronectinbindende virkning. Et område af genet på ca. 700 bp, der koder for bindingsaktivitet, er beliggende mellem slutpunkterne for deletionerne nr.

56 (deletion fra 5' enden) og nr. 22 (deletion fra 3' enden). Fra deletionsplasmid nr. 56 subklonedes 900 bp re-35 gionen fra det nyt indførte EcoRI sted til PvuII stedet.

8 DK 176146 B1

Dette fragment klonedes ind i pUC18 spaltet med EcoRI og Smal. Det fremkomne plasmid, der koder et fusionsprotein med både Ø-galactosidase og fibronectinbindende virkning, betegnes pFR015. Dette fragment kan reklones 5 fra pFR015 ved EcoRI og BamHI spaltninger på grund af multilinkeren i pUC18.

Restriktionsfragmenter subklonedes også som vist i fig.

3 (B). Når det drejer sig om EcoRI-PstI og EcoRI-Clal fragmenterne, anvendtes protein A udtrykkelsesvektoren 10 pRIT3. Fragmenterne BalI-ΡνυΊΙ og Ball-HincII subklonedes og udtryktes i pUC18. I alle tilfældene, bortset fra EcoRI-Clal fragmentet, opnåedes fusionsproteiner med fibronectinbindende virkning. Det negative resultat i tilfældet med Clal-Clal subklonen kan skyldes, at ind-15 skuddet forekommer i den gale læseramme.

Produktion og karakterisering af et fusionsprotein, ZZ-FR

Udbyttet af 165 kD proteinet (fig. 2) fra et osmotisk chocklysat af E. coli HB101 celler indeholdende plasmid pFROOl var omtrent 40 pg pr. liter dyrkningssubstrat.

20 Selv om der· var tab på grund af nedbrydning af den højmolekylære forbindelse under oprensningen, indicerer alle resultater, at fnbp-genet med en endogen promotor svagt er udtrykt i E. coli. For at forbedre udtrykkel-sesniveauet anvendtes et for nyligt udviklet udtrykkel-25 sessystem, der muliggør, at heterologe proteiner kan udskilles i vækstsubstratet af E. coli (16). Den anvendte plasmidvektor, pEZZ318, indeholder to syntetiske, let modificerede IgG-bindingsområder af genet for staphylo-coc-protein A med promotoren og signalsekvensen af det 30 samme gen liggende forud. Et Ball-PvuII fragment på omtrent 600 bp af fnbp-genet (fig. 3(B)) klonet i pUC18 reklonedes i pEEZZ318 spaltet med EcoRI og Hindlll.

Efter ligation og transformation isoleredes pEZZ-FR.

Dette plasmid koder et fusionsprotein bestående af det 35 IgG-bindende produkt ZZ og en fibronec-tion-bindende region FR af FNBP.

9 DK 176146 B1

Til fremstilling af ZZ-FR proteinet dyrkedes E. coli stamme HB101 indeholdende plasmid pEZZ-FR natten over i Trypticase soja bouillon. Bakterierne fjernedes ved centrifugering, og vækstsubstratet ledtes gennem en IgG-5 Sepharose hurtigstrømssøjle. Efter vask af søjlen med TST-puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4 150 rnM NaCl, 0,05%

Tween 20) elueredes ZZ-FR proteinet med 0,5 M eddikesyre titreret til pH 2,8 under anvendelse af ammoniumacetat. Der elueredes omtrent 50 mg protein fra søjlen 10 pr. liter anvendt vækstsubstrat.

Efter lyofilisering analyseredes det eluerede materiale ved hjælp af SDS-PAGE, der afslørede et hovedproteinbånd ved omtrent 63 kD (fig. 4). Herudover forekom bånd svarende til mindre fragmenter, sandsynligvis på grund af 15 proteolytisk nedbrydning af fusionsproteinet. Det intakte protein A, der blev kørt på samme gel, forekom som et diffust bånd omkring 56 kD. Proteinerne i gelen overførtes elektroforetisk til et nitrocellulosepapir og pro- 125 beundersøgtes med et I-mærket 29 kD fibronectionfrag-20 ment. Fig. 4, bane C og D, viser, at fusionsproteinet, men ikke det intakte protein A, binder det radiomærkede fibronectinfragment.

Yderligere bevis for den fibronectionbindende evne af ZZ-FR fusionsproteinet opnåedes ved affinitetskromatografi 25 på en Sepharose-søjle substitueret med 29 kD fibronectin-fragmentet. Fusionsproteinet blev bundet til søjlen og elueret fra affinitetsmatrixen med 6m GuHCl (fig. 5a).

Den fibronectinbindende aktivitet af ZZ-FR fusionsproteinet var tilsyneladende beliggende i et F.R-regionen, da 30 intakt protein A ikke binder til affinitetsmatrixen (fig.

5B). Den del af ZZ-FR fusionsproteinpræparatet, der ikke binder til affinitetsmatrixen, bestod af proteiner med M , der var lavere end det intakte fusionsprotein (fig.

6, bånd A), medens det materiale, der binder til søjlen,

35 bestod af et næsten rent præparat af intakt 63 kD ZZ-FR

10 DK 176146 B1 fusionsprotein (fig. 6, bane B).

For at bestemme, hvor meget af den fibronectinbindende evne ved staphylococ-celler, der kan tilskrives det klonede FNBP, kvantificeredes den hæmmende virkning af fu- 5 sionsproteinet ZZ-FR. Som angivet i fig. 7 hæmmede fu- 125 sionsproteinet totalt bindingen af I-mærket 29 kD fragment såvel som intakt fibronectin til celler af både S. aureus stamme Newman og 8325-4, protein A, der anvendtes som en kontrol, hæmmede ikke bindingen (fig. 7).

10 Efter artiklen af Kuusela (6), hvor det blev beskrevet, at S. aureus binder til fibronectin, har man anvendt store anstrengelser på at identificere den/de bakterielle komponent/komponenter, der var ansvarlige for bindingen. Begrundelsen for disse undersøgelser har været, at 15 binding af pathogene bakterier til fibronectin kan repræsentere en mekanisme for vævsvedhæftning af afgørende betydning ved tidlige stadier af infektion. Proteiner renset ved affinitetskromatografi på immobiliseret fibronectin har været involveret i bindingen af staphyloc-celler 20 til fibronectin. Imidlertid varierer de rapporterede molekylvægte af de fibronectinbindende proteiner fra 18 kD (10) helt op til 197 og 210 kD (11, 17). Hovedgrunden for denne uensartethed i molekylstørrelse kan være prote-olytisk nedbrydning af proteinerne under isoleringsmeto-25 derne.

I foreliggende tilfælde omtales kloningen i E. coli af et gen, der koder for et fibronectinbindende protein for S. aureus stamme 8325-4. Når fnbp-genet udtrykkes i E. coli fra den endogene promotor, kan proteinet isoleres 30 fra periplasmet ved osmotisk tryk. Dette indicerer, at ikke alene promotoren, men også signalpeptidet er funktionelt i E. coli.

Skønt proteinerne kodes af det klonede fnbp-gen, har mo- 11 DK 176146 B1 lekylvægte på 165 og 87 kD (fig. 2) , der er mindre end FNBP isoleret fra S. aureus stamme Newman (M = 210 kD) (12), ligner deres aminosyresammensætning nært sammensætningen af det native protein (tabel 1). Yderligere 5 krydsreagerer antistoffer frembragt over for det native FNBP med 165 og 87 kD proteinerne. Disse resultater tyder stærkt på, at strukturen af proteinerne kodet af det klonede gen fra S. aureus stamme 8325-4 ligner det fra nativt FNBP fra S. aureus stamme Newman. 87 kD protei-10 net kan være resultatet af preterminering på det trans-skriptionelle eller translationelle niveau eller alternativt proteolytisk spaltning af 165 kD proteinet. For øjeblikket kan det ikke forklares, hvorfor 165 kD proteinet er så meget som 30 gange mere aktivt end 87 kD 15 proteinet til at hæmme fibronectinbinding til S. aureus celler.

Ved deletionskortlægning under anvendelse af Bal31-spalt-ning og subkloning af restriktionsfragmenterne er området for fnbp-genet, der koder fibronectin-bindingsvirk-20 ningen, blevet lokaliseret til en region på omtrent 350 bp (fig. 3(B)). Et fragment af genet på omtrent 600 bp dækkende disse 350 bp ligeredes direkte til en tandem gentagen sekvens (ZZ) af et syntetisk IgG-bindende domæne af protein A-genet, der torud havde protein A pro-25 motoren og signalsekvens i ekspressionsvektor pEZZ318 . (16). Det fremstillede fusionsprotein (ZZ-FR), der hav de en molekylvægt på omtrent 63 kD, bestemtes ved hjælp af SDS-PAGE (fig. 4), indeholder 126 aminosyrer af ZZ-domænet efterfulgt af omtrent 200 aminosyrer kodet af 30 det 600 bp indskud fra fnbp-genet. Den C-endestillede ende af proteinet består af aminosyrer, der er resultatet af en uden for rammeaflæsning - indtil LacZ'-genet af vektoren, indtil der nås en translationsstopkodon. Fusionsproteinet (ZZ-FR), der er udtrykt på et højt niveau 35 og udskilt i vækstsubstratet af E. coli, isoleres let ved affinitetskromatografi, idet man anvender igG-bin- 12 DK 176146 B1 dingsevnen af ZZ-domænet.

ZZ-FR proteinet blev bundet til det 29 kD NH2~endestil-lede domæne af fibronectin og hæmmede fuldstændigt bindingen af intakt fibronectin til S. aureus (fig. 5 og 6) .

5 Disse resultater tyder på, at under inkubationsbetingelser udtrykkes andre proteiner, der genkender domæner uden for 29 kD N-endestillingen af fibronectin, ikke af staphylococ-celler. Yderligere er den fibronectinbinden-de evne af FNBP blevet lokaliseret til et forholdsvis 10 lille stykke af proteinet. For nylig foretagen analyse af det native 210 kD FNBP isoleret fra S. aureus stamme Newman viste, at dette protein er multivalent, og at et molekyle af FNBP er i stand til at binde 6-9 fibronec-tinmolekyler (12). Det klonede FNBP-gen stammer fra 15 stamme S. aureus 8325-4. Hvis der ikke er nogen forskelle mellem stammerne af S. aureus, ville man forvente, at FR-regionen indeholdt adskillige gentagne sekvenser. Dette spørgsmål blev også besvaret ved sekvensanalyse af det klonede fnbp-gen. Sekvensen af FR-regionen 20 havde FMNP-egenskaber som angivet i fig. 8.

Der er grund til at antage, at FR-bindingsaktiviteten er relateret til hver af de tre 38 aminosyrer gentagelser, da Ball-PvuXI-fragmentet koder for en bindingsaktivitet (jf. fig. 3); ligesom Ball-HincII-fragmentet 25 koder for en bindingsaktivitet; og da HincII-PvuII- fragmentet ikke koder for bindingsaktivitet. Yderligere er den enkelte 38 aminosyrer gentagelse funktionel og i stand til at binde fibronection, da et syntetiseret 38-aminosyrer langt peptid (38(2)-gentagelse) har bin-30 dingsevne, hvilket fremgår af fig. 9. Hver af de tre 38 aminosyrer gentagelser er særdeles homologe.

EKSEMPEL 2 13 DK 176146 B1

Kemisk syntese af et polypeptid baseret på nucleotid-sekvensen, der koder for det fibronectin-bindende domæne på 38 aminosyrer (38(2)-gentaget) udførtes ved at 5 . opbygge aminosyresekvensen svarende til nucleotidsekven-sen, idet man gik ud fra det C-endestillede histidin og trinvis omsatte med den passende aminosyre og til sidst omsatte med glycin ved N-ende stillingsenden i en fast-fase-syntese således som beskrevet af K.B. Merrifield, 10 J. Am. Chem. Soc. 8j5, p. 304 (1964). Herved syntetise redes polypeptidet svarende til den anden 38 aminosy-re-gentagelse, såvel som tre yderligere polypeptider, der var dele af denne 38-gentagelse, dvs-: 1) det poly peptid, der dækker aminosyrer 1-19, 2) det polypeptid, 15 der dækker aminosyrer 9-30, og 3) det polypeptid, der dækker aminosyrer 20-38, blev alle syntetiseret på samme måde.

Den fibronectinbindende evne af den fuldstændige 38-gen-tagelse, såvel som af 1-19 aminosyrepolypeptidet, 9-30 20 aminosyrepolypeptidet, 20-38 aminosyrepolypeptidet såvel som en blanding af disse tre mindre polypeptider undersøgtes, og resultaterne er angivet i fig. 9. Fragmenterne af den fuldstændige 38-gentagelse blev syntetiseret for at checke, om fibronectin-binding er afhæng-25 ig af den fuldstændige 38-gentagelse, hvilket man ville antage, eller om fibronectinbindingsegenskaberne yderligere kunne indkredses til et noget mindre område på 38-aminosyresekvensen. Som det fremgår af fig. 9, er fi-bronectinbindingsegenskaben kun til stede i det fuld-30 stændige 38-aminosyrer-peptid.

14 DK 176146 B1

Bakteriestammer og plasmider

En genbank i pBR322 af kromosomal DNA fra Staphylococcus aureus stamme 8325-4, tidligere beskrevet (13) eftersøgtes for kloner, der udtrykker fibronectinbindende evne.

5 E. coli stamme HP102 (18) og JM105 (19) anvendtes ved subklonings- og udtrykkelsesforsøg- De anvendte plas-midvektorer var pBR322 (20), p(JCl8 (21) og protein A-vektorerne pRIT3 (15) og pEZZ318 (16). S. aureus stamme Cowan I, Newman og 83525-4 anvendtes ved undersøgelsen 10 af fibronectinbindende protein (FNBP).

Vækstsubstrat for mikroorganismer

Ved dyrkning af E. coli-bakterier anvendtes følgende substrat. De angivne mængder er pr. liter substrat.

Trypton sojabouillon (Oxoid Ltd, 15 Basinstoke, Hants, (GB) 30 g Gærekstrakt (Oxoid) 10 g D-glucose 40 g NH4C1 2,5 g

Na2HP04.2H20 7,5 g 20 KH2P04 3,0 g

Na2SO4-10H2O 2,5 g

MgS04-7H20 0,2 mg

CaCl2.2H20 0,5 mg

FeCl3-2H20 16,7 mg 25 ZnS04-7H20 0,18 mg

CuS04-4H20 0,16 mg

MnS04.4H20 0,15 mg

CoCl2 0,10 mg

NaEDTA 20,1 mg 15 DK 176146 B1 !

Undersøgelse af fibronectinbindende protein (FNBP)

Kvantificering af fibronectinbinding til celler af S.

aureus er tidligere beskrevet (10). Med mindre andet er 9 angivet, inkuberes 10 celler af S. aureus Cowan I med 125 5 . I-mærket fibronectin eller det 29 kD Nt^-endestillede fragment af fibronectin i PBS indeholdende 1 mg/ml bovin-serumalbumin i et totalrumfang på 0,3 ml. Efter inkubation i 2 timer ved 22°C måltes den bundne radioaktivitet til cellerne i en gamma-tæller.

10 Lysater af E. coli kloner fremstillet i Tris-HCl-puffer, pH 8,1, indeholdende lysozym EDTA som tidligere beskrevet (13), analyseredes for fibronectinbindende aktivitet ved at måle deres evne til at konkurrere med staphylococ- 125 celler for binding af det I-mærkede 29 kD Nl-^-ende-15 stillede fragment af fibronectin. Den mængde FNBP, der er i stand til at hæmine binding med 50%, antages som værende en aktivitetsenhed.

En osmotisk chokmétode anvendtes til at frigøre proteiner fra det periplasmiske rum af E. coli (14).

20 Rensning af FNBP

Rensningen udførtes baseret på affinitetskromatografi på fibronectin-Sepharose efterfulgt af ionbytterkromatogra-fi.

Humant fibronectin fremstilledes ud fra gammelt blod ved 25 hjælp af den kendte metode (22) . Fibronectinen dialyseredes herefter over for 20 mM Tris-HCl, pH 8,3 og koncen- . treredes på en DEAE-søjle. Koblingen af fibronectin til Sepharose S1-4B blev foretaget ved hjælp af en bromcyan-aktiveringsmetode, således som den er beskrevet i (23).

30 e. coli lysatet pumpedes på affinitetssøjlen, der herefter vaskedes med 0,5 M ammoniumacetat, indtil basislinien 16 DK 176146 B1 var stabil (ca. fire søjlerumfang) . FNBP elueredes herefter med 0,4 M eddikesyre og neutraliseredes enten med ammoniak eller lyofiliseredes. Efter dialyse mod 10 mM ammoniumacetat med pH indstillet til 7,6 med ammoniak 5 udførtes et yderligere fraktioneringstrin ved ionbytningskromatografi på et Pharmacia FPLC udstyr under anvendelse af en mono Q-søjle.

Nucleotidsekvens-analyse

Nucleotidsekvensen bestemtes således som beskrevet af 10 Maxam, A.M. et al. (27).

Aminosyreanalyse

Aminosyresammensætningen bestemtes under anvendelse af en Durrum D-500 analysator. Prøver hydrolyseredes i 6 M HC1 indeholdende 2 mg/ml phenol i 24 timer ved 110°C. En 15 prøve oxideredes også med permyresyre for at bestemme cystein og methionin. Norleucin sattes til som ;en indre standard. Protein bestemtes som beskrevet i (24) under anvendelse af bovin serumalbumin som en standard.

Elektroforese 20 Dersom intet andet er angivet, udførtes SDS polyacryl-amid gelelektroforese i 5-15% gradient-geler. Gelerne blev farvet med Coomassie brilliantblåt, affarvet og fotograferet.

Radioimmuno-undersøgelsesmetode 25 Det rensede FNBP med en bestemt molekylvægt i SDS-poly- 125 acrylamid gelelektroforese på 165 kD mærkedes med I-iod ved hjælp af chloramin-T-metoden således som beskrevet (25). Efter iodering kromatograferedes materialet atter på en fibronectin-Sepharose-søjle.

125 30 Inkubationsblandingen indeholdende I-FNBP (3400 cmp i 10 μΐ) blandedes med forskellige fortyndinger af et 17 DK 176146 B1 kanin-antiserum (indeholdende antistoffer rettet mod S. aureus stammen Newman) i inkubationspuffer (PBS, 0,1% Triton-X-100 og 0,02% natriumazid) i et rumfang på 0,2 ml.

5 Prøver inkuberedes 2 timer ved 20°C for at muliggøre an-tigen-antistof-reaktion. 0,1 ml af 10% suspension (vægt/ rumfang) protein A-Sepharose i PBS tilsattes, og blandingen inkuberedes yderligere 1 time. Inkubationen blev afbrudt ved at tilsætte yderligere 1,7 ml inkubationspuf-10 fer til prøverne. Efter centrifugering ved 2.000 omdrejninger pr. minut i 3 minutter afsugedes den supernatante del. Pellerne blev vasket to gange i inkubationspuffer, og radioaktivitet i forbindelse med protein A-Sepharosen måltes i en gamma-tæller.

15 Restriktions-endonucleaser og andre enzymer

Restriktionsenzymer, T4 DNA-ligase og Bal31 blev indkøbt fra BRL og anvendt efter fabrikantens anbefalinger. Andre metoder i forbindelse med DNA-teknikker var i det væsentlige velkendte (26).

18 DK 176146 B1 TABEL 1

Sammenligning af aminosyresammensætninger af fibronectin-bindende proteiner (87 og 165 kD) isoleret fra E. coli pFROOl og det native FNBP isoleret fra S. aureus stamme 5 Newman (210 kD)

Sammensætning (mol%)

Aminosyre -:-

210 kDa 165 kD 87 kD

Asparaginsyre/asparagin 15,4 14,6 13,4

Threonin 9,7 10,7 10,3 10 Serin 7,4 6,5 8,0

Glutaminsyre/glutamin 17,9 17,1 15,1

Prolin 6,3 6,2 5,8

Glycin , 8,9 7,9 8,4

Alanin 5,3 4,6 4,7 15 Halv-cystin 0,1 0,2 n.d.

Valin 7,2 7,8 8,6

Methionin 0,6 0,6 n.d.

Isoleucin 4,3 4,7 3,8

Leucin 4,1 4,0 4,6 20 Tyrosin 2,1 2,3 4,1

Phenylalanin 2,4 2,0 3,6

Histidin 1,0 3,2 3,0

Tryptophan n.d. n.d. n.d.

Arginin 1,9 1,2 25 a)fra Froman et al. (1987), (12). n.d. = ikke bestemt.

Det omhandlede fibronectinbindende protein kan anvendes til immunisering, hvorved proteinet, fortrinsvis i forbindelse med et fusionsprotein for at frembringe et stør-30 re antigen til at frembringe respons overfor, injiceres i sådanne doser, at der opnås immunologisk reaktion hos 19 DK 176146 B1 værtspattedyret- Det fibronectinbindende protein kan således anvendes til vaccination af drøvtyggere mod mastitis forårsaget af staphylococ-infektioner. Det fi-bronectinbindende protein ifølge opfindelsen har vist sig 5 at danne antistoffer over for en staphylococ-mastitis i et museforsøg således som angivet i tabellen nedenfor.

TABEL

Eksperimentel musexnastitis frembragt af S. aureus stamme SA 113(83A) i en dosis på 1,0 x 10^ cfu. Evaluering af 10 immunisering under anvendelse af 15 pg protein pr. mus af det fibronectinbindende protein udtrykt fra E- coli indeholdende plasmid pFROOl, således som det er beskrevet heri.

Antal gross-undersøgelse Antal mikroskopiske 15 brysttypelæsioner (%) brysttypelæsioner (%)

Gruppe mus kirtler - kirtler - inocul. +++ ++ + 0 undersøgt A B Cl C2 C3

Vaccineret (FNBP) 30 3 8 83 10 11 9 0 0 91 0 20 Kontrol 38 50 16 32 3 8 38 0 25 38 0

Mastitis: +++ = gross; ++ = middelgrad; + = lav grad; 0 = ingen makroskopisk forandring; A = vedvarende ikke-reaktiv, total necrosis; B = fremadskridende regressive forandringer + lille inflammations reaktion; Cl = disse-25 mineret inflammatorisk reaktion + lokal necrosis; C2 = dissemineret inflammatorisk reaktion; C3 = lokal inflammatorisk reaktion; 0 = ingen reaktion.

Som det fremgår af ovennævnte tabel, opnås en vedvarende immunisering under anvendelse af FNBP udtrykt af E. coli 30 indeholdende plasmid pFROOl.

20 DK 176146 B1

Yderligere kan det fibronectinbindende protein anvendes til at blokere en infektion i et åbent hudsår ved sårbehandling under anvendelse af det fibronectinbindende protein i en suspension. Det fibronectinbindende prote-5 in kan således anvendes til behandling af sår, dvs. til at blokere proteinreceptorer eller til immunisering (vaccination) . I sidstnævnte tilfælde frembringer værtsorganismens legeme specifikke antistoffer, der kan beskytte mod invasion af bakteriestammer omfattende et sådant 10 ' fibronectinbindende protein. Herved blokerer antistofferne for vedhæftningen af bakteriestammerne til beskadiget væv.

Eksempler på kolonisering af en vævsbeskadigelse er: a) kolonisering af sår i hud og bindevæv, hvilke sår er 15 forårsaget af mekanisk påvirkning, kemisk beskadigel se og/eller varmebeskadigeIse; b) kolonisering af sår på slimhinder, som f:< i mundhulen eller i brystkirtler, urinvejene eller vagina; c) kolonisering på bindevævsproteiner, der er blevet ud- 20 sat for minimal vævsbeskadigelse (mikrolæsion) i for bindelse med epitheliet og endotheliet (mastitis, hjerteklapinfektion^ hoftekirurgi).

Når man anvender det omhandlede FNBP eller polypeptidet på 38 aminosyrer til immunisering (vaccination) af pat-25 tedyr, herunder af mennesket, dispergeres proteinet eller polypeptidet i sterilt, isotonisk saltvandsopløsning, eventuelt under tilsætning af et farmaceutisk acceptabelt dispersionsmiddel. Forskellige typer adjuvan-ser kan yderligere anvendes for at understøtte frigørel-30 sen i vævet og således eksponere proteinet eller pep-tidet for et længere tidsrum for immunforsvarssystemet fra legemet.

21 DK 176146 B1

En passende dosis til opnåelse af immunisering er 0,5 til 5 pg FNBP eller polypeptid pr. kg legemsvægt og injektion af immuniseringsmateriale. For at opnå en længere varende immunisering bør vaccinationen udføres med mere 5 end én efterfølgende behandling med et mellemrum på 1 til 3 uger-, fortrinsvis tre gange.

Dersom man anvender det omhandlede FNBP eller polypeptid til topisk, lokal administrering, dispergeres proteinet i en isotonisk saltvandsopløsning til en koncen-10 tration på 25 til 250 pg pr. ml. Herefter behandles sårene med en sådan mængde, at der kun fås en fuldstændig opfugtning af såroverfladen. Til et gennemsnitssår skal der således kun anvendes et par milliliter af opløsningen på denne måde. Efter behandling under anven-15 delse af proteinopløsningen vaskes sårene passende med isotonisk saltvand eller anden passende sårbehandlingsopløsning .

Yderligere kan det fibronectinbindende protein såvel som det minimalt fibronectinbindende sted-polypeptid anven-20 des til at diagnosticere bakterielle infektioner forårsaget af Staphylococ-stammer, idet et fibronectinbindende protein ifølge opfindelsen immobilieres på et fast bærestof som fx små latex- eller Sepharose-kugler, hvorefter sera indeholdende antistoffer løber gennem eller rea-25 gerer med det således immobil iserede FNBP. Agglutinering måles herefter på kendt måde.

Yderligere kan FNBP eller polypeptidet anvendes i et ELISA-forsøg (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay; E Engvall, Med. Biol. 55^, 193 (1977)). Til dette formål 30 beklædes brønde i en polystyren-mikrotiterplade med FNBP og inkuberes natten over ved 4°C. Herefter vaskes pladerne grundigt under anvendelse af PBS indeholdende 0,05% TWEEN 20 og tørres. Rækkefortyndinger af patientserum foretages i PBS-Tween og sættes til brøndene og inkube- 22 DK 176146 B1 res ved 30°C i 1,5 timer. Efter at have renset et anti-humant-IgG konjugeret med et enzym eller et antibovin-IgG konjugeret med et enzym tilsattes peberrodsperoxi-dase eller en alkalisk phosphatase til brøndene og in-5 kuberedes ved 30°C i 1,5 timer, hvorpå, når IgG var blevet bundet hertil, og efter rensning, der tilsattes et enzymsubstrat, en p-nitrophosphat, når det drejede sig om alkalisk phosphatase, eller orthophenylendiaminsub-strat (OPD), når det drejede sig om anvendelsen af per-10 oxidase. Herefter vaskedes pladerne med brøndene under anvendelse af en citratpuffer indeholdende 0,055% OPD og 0,005% H909 og inkuberedes 10 minutter ved 30°C. Enzymreaktionen blev afbrudt ved at tilsætte en 4N opløsning af til hver brønd. Farveudviklingen blev 15 målt under anvendelse af et spektrofotometer.

Afhængig af typen af det anvendte enzymsubstrat kan man også anvende en fluorescensmåling.

En anden metode til at diagnosticere staphylococ-infek-tioner er ved at anvende DNA-genprobemetoden baseret på 20 FNBP-sekvensen eller den 38-aminosyre store polypeptid-sekvens. Til dette formål bindes de naturlige eller syntetiske DNA-sekvenser til et fast bæremateriale, som fx en polystyrenplade omtalt ovenfor, fx ved at tilsætte mælk, når det drejer sig om diagnosticering af masti-25 tis, til overfladen. DNA-genproben, eventuelt enzymatisk mærket eller mærket med en radioaktiv isotop, sættes herefter til den faste overflade af pladen indeholdende DNA-sekvensen, hvorved DNA-genproben fastgør sig til sekvensen, hvor den forekommer. Enzymet eller den radio-30 aktive isotop kan herefter let bestemmes ved velkendte metoder.

Med hensyn til fibronectinbindende protein omfatter dette udtryk også en vilkårlig af de 38 aminosyrer store polypeptidsekvenser, hvilke 38 aminosyrepolypeptid-sekven- 23 DK 176146 B1 ser danner det minimale fibronectinbindingssted af det komplette protein.

REFERENCER

8. Beachey, E.H. og Simpson, VJ.A. (1982). Infection 5 10, 107-110.

20. Bolivar, F., Rodriquez, R.L., Greene, P.J., Betlach, H.C., Heyneker, H:L., Boyer, H.W., Crosa, J.H. og Falkow, S. (1977). Gene, 2, 95-113.

18. Boyer, H.W. og Roulland-Dussoix, D. (1969). J. Mol.

10 Biol: 4JL, 459-472.

9. Courtney, H.S., Ofek, I., Simpson, W.A., Hasty, D.L. og Beachey, E.H. (1986). Infect. Immun. 5_3 , 454-459 .

11. Espersen, F. og Clemmensen, I. (1982). Infect. Immun.

15 37, 526-531.

17. Froman, G., Switalski, L.N., Guss, B., Lindberg, M., Hook, M. og Wadstrom, T. (1986) Lark, D.L. udg. Protein-Carbohydrate Interactions in Biological Systems. Academic Press, London, p. 263-268.

20 12. Froman, G., Switalski, L.N., Speziale, P. og Hook, M. (1987) i trykken. J. Biol. Chem.

25. Hunter, W.M. (1978) Radioimmunoassay. I: Wier, K.M. udg. Handbook of Experimental Immunology. London Blackwell, 14.1-1440.

25 1. Hynes, R.O. (1985) Annu. Rev. Cell Biol. 1, 67-90.

2. Hynes, R.O. (1986) Sci. Ann. 254, 42-51.

24 DK 176146 B1 6. Kuusela, P. (1978) Nature 276 , 718-720.

24. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. og Randall, R.J., Biol. Chem. 193, 265-275.

13. Lofdahi, S., Guss, B., Uhlén, M.m Philipson, L. og 5 Lindberg, M. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 697-701.

26. Maniatis, T., Fritsch, E.F. og Sambrok, J. (1982). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

10 23. March, S.C. Parikh, I. og Cuatrecasas, P. (1974).

Analyt. Biochem. ¢)0, 149-152.

27. Maxara, A.M. og Gilbert, W. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560.

28. Merrifield, K.B., J. Am. Chem. Soc., 86, p. 304' 15 (1964).

19. Messing, J. og Carlsson, J. (1984). J. Biotechnol.

1, 253-264.

22. Miekka, S.I., Ingham, K.C. og Menache, D. (1982).

Thromb Res. 21_, 1-14.

20 15. Nilsson, B., Abramsén, L. og Uhlén, M. (1985).

EMBO J. 4, 1075-1080.

16. Nilsson, B., Moks. T., Jansson, B., Abramsén, L., Elmblad, A., Holmgren, E., Henrichson, L. , Jones, T.A. og Uhlén, M. (1986) . Protein Engineering, i 25 trykken.

21. Norrander, J., Kempe, T. og Messing, J. (1983).

Gene, 26^, 101-106.

25 DK 176146 B1 14. Nossal, N.G. og Heppel, L.A. (1965). J. Biol. Chem. 241, 3055-3962.

3. Ruoslahti, E. og Pierschbacher, M.D. (1986). Cell, 4_4 , 517-518.

5 10. Rydén, C., Rubin, K., Speziale, P., Hook, M., Lind- berg, M. og Wadstrom, T. (1983), j. Biol. Chem.

258, 3396-3401.

7. Wadstrom, T., Switalski, L., Speziale, P. Rubin, K., Rydén, C., Froman, G., Faris, A., Lindberg, M.,

Hook, M. (1985). _I: Jackson, G.J. (udg.), Pathoge nesis of Infection. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, pp. 193-207.

4. Woods, A., Coucham, J.R., Johansson, S. og Hook, M. (1986), EMBO J. 5, 665-670.

15 5. Yamada, K.M. (1983), Annu. Rev. Bioc'nem. 5_2, 761- 799 .

m 26 DK 176146 B1

FORKLARING TIL TEGNINGER

Fig. 1A. Affinitetskromatografi på fibronectin-Sepharose

Et lysat (86 ml) opnået ved koldt osmotisk chock af E. coli-klonen pFROOl blandedes med 29 ml 2 M ammoniumace-5 tat. Prøven påførtes herefter en søjle (1,9 x 5,7 cm) bragt i ligevægt med 0,5 M ammoniumacetat med en gennemstrømningshastighed på 50 ml/time. Efter påførsel af prøven vaskedes søjlen med fire søjlerumfang 0,5 M ammoniumacetat med en gennemstrømningshastighed på 20 ml/ 10 time. På samme tid steg følsomheden af UV-monitoren med en faktor på 5. Det eluerede materiale mellem 20 og 220 ml blev slået sammen, neutraliseret med ammoniumhydroxid og dialyseret over for 10 mM ammoniumacetat, pH 7,6.

Fig. IB. Ionbytninqskromatografi 15 En prøve (10 ml) af det dialyserede materiale fra affinitetskromatografien beskrevet i fig. 1A påførtes en 1 ml mono Q (Pharmacia, Sverige) anionsøjle bragt i ligevægt med 10 mM ammoniumacetat, pH 7,6. Gennemstrømningshastigheden var 2 ml/min., og søjlen elueredes med en 20 lineær stigning i koncentrationen af ammoniumacetat på 25 mM pr. ml. De to toppe (I og II) blev slået sammen som vist på figuren.

Fig. 2. Polyacrylamidgelelektroforese af materialer fra forskellige rensninqstrin af et osmotisk chock-25 lysat af E. coli pFROOl

Materialet påført (bane 1) til affinitetssøjlen (fibronectin-Sepharose) , ikke-adsorberet (bane 2) og adsorbe-ret (bane 3) materiale. Ionbytningskromatografi af affinitetsrenset materiale på en mono Q FPLC-søjle (Phar-30 macia, Sverige): sammenslået materiale I (bane 4) og sammenslået materiale II (bane 5) således som angivet i fig. IB.

27 DK 176146 B1

Fig. 3. Restriktionskort, subkloner og deletioner af indskuddet i pFROOl (A) Restriktionskort af 6,5 kb indskuddet. (B) forskel-' lige subkloner konstrueret for at bestemme området af 5 genet, der koder for den fibronectinbindende aktivitet.

(C) deletioner foretaget enten fra 3'- eller 5'-enden af EcoRI-Pstl-fragmentet ved behandling med exonuclease Bal31 (se beskrivelsen for nærmere detaljer). Den fi-bronectinbindende aktivitet af de forskellige genproduk-10 ter er angivet.

Fig- 4. Polyacrylamid i gelelektroforese af ZZ-Fr-prote-inet

Protein A (Sigma Chemical Co-, St. Louis; bane A) og ZZ-FR-fusionsproteinet (bane B) blev reduceret og under-15 kastet elektroforese i SDS på en 5-15% polyacrylamidgel. Gelen farvedes herefter med Coomassie-blåt. I bane C og .

D var ZZ-FR-fusionsproteinet og protein A fraktioneret ved hjælp af SDS elektroforese på en 5-9% polyacrylamidgel, elektroaftryk på nitrocellulosepapir og probe-under-125 20 søgt med I-mærket 29 kD fibronectinfragment således som beskevet (Froman et al., 1987). Pile giver vandringslængden af standardproteiner med kendt molekylvægt.

Fig. 5. Affinitetskromatografi af ZZ-Fr-proteinet ZZ-FR-fusionsproteinet (0,6 mg; A) og protein A (Sigma 25 Chemical Co, 0,5 mg; panel B) blev påført en 7 ml søjle af Sepharose 4B CL substitueret med 29 kD fibronectinf ragment. Søjlen vaskedes med 0,5 M NaCl i PBS og elueredes herefter med 6 M GuHCl i PBS. Fraktioner på 2 ml blev opsamlet og undersøgt for protein under anven-30 delse af BioRad-systemet.

DK 176146 B1 28

Fig . 6. Polyacrylamidgelelektroforese af ZZ-FR fusionspro teinpræparatat: fraktioneret ved hjælp af af-finitetskromatoqrafi

Materiale ikke bundet (bane A) og bundet og elueret 5 (bane B) fra 29 kD affinitetssøjlen analyseredes ved hjælp af SDS-gelelektroforese på 5-15% polyacrylamid-geler. Gelen farvedes herefter med Coomassie blåt. Pile viser vandringslængde af standardproteiner med kendte molekylvægte.

12 5 10 Fig. 7. Hæmning af binding af_I-fibronectin til bak terieceller

Staphylococ-celler (5 x 107) af stamme Newman (afbilding A) eller stamme 8325-4 (afbilding B) inkuberedes med & 12 5 5 x 10' cpm I-mærket intakt fibronectin (o-o) eller 15 29 kD N-endestillet fibronectinfragment (Δ-Δ) i PBS til sat 0,1% BSA og 0,1% Tween** 80 i et toalrumfang på 0,5 ml i 1 time i nærværelse af stigende mængder af ZZ-FR fusionsprotein eller protein A (*-·)- For yderligere detaljer med hensyn til bindingsforsøget, se Froman et 125 20 al. (1987). Mængden af I-radioaktivitet i forbindelse med bakterieceller kvantificeredes,og graden af fi- bronectionbinding beregnedes. En 100% binding repræsen-125 terer I-ligand bundet til bakterier uden hæmmende protein og 0% binding svarer til radioaktiviteten registre-25 ret fra inkubationsblandinger uden bakterier.

Fig. 8A Sekvens af nucleotid, der koder for fibronectin-bindende protein

Nucleotidsekvensen, der koder for det fibronectinbindende protein·sammen med dets tilsvarende aminosyrer er angivet.

30 De forskellige 38-aminosyrer-gentagelser er mærket, ligesom de forekommer efter næsten 4 fuldstændige 14-amino-syrer-gentagelser. Restriktionspladserne Ball-HincII-PvuII er afmærket i figuren, ligesom aminosyresekvenser-ne svarende til de forskellige nucleotidsekvenser.

-------------------- 29 DK 176146 B1

Fig. 9. Fibronectinbindende evne af et kemisk syntetiseret polypeptid

Den fibroneqtinbindende evne af det kemisk syntetiserede 38-aminosyrer-lange polypeptid fra eksempel 2 sammen 5 med den fibronectinbindende evne af fragmenterne af po-lypeptidet er undersøgt. (*-·*) angiver polypeptidet svarende til 38(2) gentagelsen af aminosyresevkensen; • (Q-3) svarer til polypeptidet svarende til aminosyrer 1-19 af aminosyresekvensen; (o-o) svarer til polypep-10 tid svarende til aminosyrerne 20-38 af aminosyresekvensen ; (Δ-Δ) svarer til polypeptidet svarende til aminosy rerne nr. 9-30 af aminosyresekvensen; og (- - -)svarer til polypeptidblandingen omfattende polypeptiderne af aminosyrerne 1-19, aminosyrerne 20-38 og aminosyrerne 15 9-30. Bindingsevnen i procent er afsat mod vig tilsat polypeptid.

Claims (4)

1. Anvendelse af et polypeptid bestående af mindst en af ami-nosyresekvenserne 5 Gly Gin Asn Ser Gly Asn Gin Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gin Gly Gly Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gin Ile His og/eller 10 Gly Gin Asn Lys Gly Asn Gin Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Lys Asp Lys Pro Lys Tyr Glu His Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro His Ile His og/eller Gly Phe Asn Lys His Thr Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp . Lys Pro Ser Tyr Gin Phe Gly Gly His.Asn Ser Val Asp Phe Glu Glu Asp Thr Leu Pro Lys Val ved fremstillingen af farmaceutiske præparater, der forhindrer 20 adhærence af staph, aureus til fibronectinholdigt væv.

2. Anvendelse ifølge krav 1 ved fremstillingen af væskeformige farmaceutiske præparater, hvori polypeptidet eller polypep-tiderne er dispergeret i en isotonisk opløsning omfattende 25 25 til 250 pg pr. ml.

3. Anvendelse ifølge krav 1-2, hvori det farmaceutiske præparat fremstilles som et injicerbart præparat til immuniseringsformål . 30

4. Anvendelse ifølge krav 1-2, hvori det farmaceutiske præparat fremstilles som et sårbehandlingspræparat.