CN103992374B - 具有降血糖和降血脂双功能的二肽di及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二肽DI，该二肽DI的氨基酸序列为：Asp-Ile。本发明还同时公开了该二肽DI在制备降血糖和降血脂双功能药物中的应用。具体而言，该二肽DI能同时作为α－葡萄糖苷酶抑制肽和HMG-CoA还原酶抑制肽。

Description

具有降血糖和降血脂双功能的二肽DI及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一个能与α-葡萄糖苷酶结合，抑制其活性，也能抑制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的活性。该二肽结构序列为Asp-Ile(DI)。

背景技术

血糖的主要来源之一是小肠对碳水化合物的消化吸收，淀粉等碳水化合物经α-葡萄糖苷酶分解成单糖，通过小肠吸收进入血液循环。因此α-葡萄糖苷酶在碳水化合物代谢生成葡萄糖中具有重要作用。α－葡萄糖苷酶抑制剂能通过抑制人体小肠上皮绒毛膜刷状缘上α－葡萄糖苷酶的活性，延缓葡萄糖的生成，在降低餐后血糖中具有重要作用，目前α－葡萄糖苷酶抑制剂已广泛应用于糖尿病治疗中。

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)是体内催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成二羟甲基戊酸(MVA)的关键酶，这一步是体内合成胆固醇的限速步骤，也是目前最主要的高血脂症临床药物的靶点。HMGR抑制剂是降血脂功效成分和药物筛选主要手段之一。

降血糖的药物常见的有：

①α-葡萄糖苷酶抑制剂：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等。

②胰岛素促进剂：瑞格列奈、那格列奈、格列美脲、格列喹酮等。

③胰岛素增敏剂：二甲双胍、噻唑烷二酮类等。

④胰岛素及其类似物：胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素等。

降血脂的药物有：

1、苯氧芳酸类：此类药物有非诺贝特、吉非罗齐、苯扎贝特等。苯氧芳酸类药物降血脂作用强，起效快，降甘油三酯的作用比降胆固醇的作用强。

2、三羟甲基戊二酰-辅酶A还原酶抑制剂：此类药物有洛伐他丁、辛伐他丁、普伐他丁等。此类药物以降胆固醇为主，降脂作用强，起效快。

3、烟酸类：此类药物中氧甲吡嗪较常用，降低血清甘油三脂的作用比降低胆固醇强。

4、多不饱和脂肪酸类：包括各种植物种子油。如橡胶种子油，月见草子，水飞蓟种子的油和海鱼的制剂。这类药物有降血脂和降低血粘度的作用，但作用比较温和。

5、泛硫乙胺：为辅酶A的衍生物，有降低血清胆固醇、甘油三脂和升高高密度脂蛋白-胆固醇的作用。

6、藻酸双酯钠(PPS)：是以海藻撮物为原料的类肝素海洋药物。有搞血长低血粘度、扩张血管和降低血脂，升高HDI水平的作用。主要用于缺血性心脑血管疾病的防治。

7、其他降血脂药物：如银杏类(天保宁)实验证明能使血清甘油三脂(TG)显著降低。

现有药物报道，除中药外，同时具有降血糖和降血脂作用的药物很少见。因为这两种药所作用的靶标不同。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种同时具有降血糖和降血脂双功能的二肽序列DI及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种二肽DI，该二肽DI的氨基酸序列为：Asp-Ile。

本发明还同时提供了上述二肽DI在制备降血糖和降血脂双功能药物中的应用。

作为本发明的二肽DI的应用的改进：制备同时作为α－葡萄糖苷酶抑制肽和HMG-CoA还原酶抑制肽的药物。

本发明的二肽DI可通过委托吉尔生化(上海)有限公司合成获得。

本发明所报道的二肽序列是针对α－葡萄糖苷酶和HMG-CoA还原酶两个靶标均具有抑制活性，从而表现出同时具有降血糖和降血脂双功能的特性。

本发明中所涉及的各项检测方法具体如下：

1、α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测方法：

分别取50μL一定浓度的多肽溶液(0.1mol/L，pH＝6.9磷酸缓冲液配置)，100μL10mg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液(用0.1mol/L，pH＝6.9磷酸缓冲液配制)，加入酶标板中，混匀后，25℃下放置10min。然后加入50μL5mmol/L的PNPG(对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷)溶液(用0.1mol/L，pH＝6.9磷酸缓冲液配制)，37℃下培养30min后，加入50μL0.67mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，测定405nm下吸光度。该体系称为样品。

同时设置以下3个体系：对照、样品空白、和对照空白。

对照：以50μL0.1mol/L，pH＝6.9磷酸缓冲液替代50μL的多肽溶液。

样品空白：以100μL的0.1mol/L，pH＝6.9磷酸缓冲液代替100μL10mg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液；

对照空白：分别以相应体积量的0.1mol/L，pH＝6.9磷酸缓冲液代替多肽溶液和α-葡萄糖苷酶溶液，抑制率按下式计算。

2、降血脂肽活性的体外检测方法：

色谱条件

C1₈色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)。流动相为:V(K₂HPO₄-KH₂PO₄)：V(甲醇)＝85：15，pH7.2，等度洗脱，流速1mL/min；检测波长337nm；进样量20μL；柱温25℃。

反应体系实验步骤

反应中各种组分的加入量及顺序如表1，反应温度37℃水浴，反应完成后加入200μL0.5mol/LNaOH溶液终止反应，按上述的色谱条件测量样品中还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的浓度。反应时间根据酶对照组时间梯度来确定。

表1反应体系组成成分

备注说明：反应缓冲液为0.1mol/L的磷酸钾缓冲液，HMGR溶液的浓度为6.56μg/mL，HMG-CoA溶液浓度为5.23mmol/mL，NADPH溶液浓度为1mg/mL。抑制剂溶液：即本发明的二肽。

实验结果的计算

加入抑制剂后，HMG-CoA还原酶的活性受到抑制，底物反应的量减少。因此,可以利用HPLC测定反应前后NADPH量的变化来评价抑制剂对HMG-CoA还原酶的抑制率。计算公式为：

R＝(S_抑制剂-S_对照)/(S_空白-S_对照)×100

式中，R为抑制率(％)；S_空白、S_对照和S_抑制剂分别为空白组、酶对照组和抑制剂组中NADPH的峰面积(mAU.min)。

本发明的优点和积极效果：

(1)该二肽分子可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

(2)本发明的α-葡萄糖苷酶抑制肽(或简称为二肽DI)同时具有HMG-CoA还原酶抑制活性。

依据本发明所述的氨基酸序列，可委托吉尔生化(上海)有限公司合成，从而获得本发明所述的α-葡萄糖苷酶抑制肽(或简称为二肽DI)。

本发明的α-葡萄糖苷酶抑制肽和HMG-CoA还原酶抑制肽(或简称为二肽DI)的用法和用量如下：

本发明的二肽为口服型，用量为口服，每次500mg，每日2～3次。

具体实施方式

实施例1、

1)、二肽DI在1.0mg/mL的浓度下的α-葡萄糖苷酶抑制活性：

检测方法：将通过化学合成法获得的此二肽DI，配制成1.0mg/mL进行抑制活性检测(检测方法同上)。

结果：二肽DI在1.0mg/mL时的α-葡萄糖苷酶抑制活性为35.2％。

2)、二肽DI在1.0mg/mL的浓度下的HMG-CoA还原酶抑制活性：

检测方法：将通过化学合成法获得的此二肽DI，配制成1.0mg/mL进行抑制活性检测(检测方法同上)。

结果：二肽DI在1.0mg/mL时的HMG-CoA还原酶抑制活性为26.3％。

实施例2、

1)、二肽DI在2.0mg/mL的浓度下的α-葡萄糖苷酶抑制活性：

检测方法：将通过化学合成法获得的此二肽DI，配制成2.0mg/mL进行抑制活性检测(检测方法同上)。

结果：二肽DI在2.0mg/mL时的α-葡萄糖苷酶抑制活性为68.5％。

2)、二肽DI在2.0mg/mL的浓度下的HMG-CoA还原酶抑制活性：

检测方法：将通过化学合成法获得的此二肽DI，配制成2.0mg/mL进行抑制活性检测(检测方法同上)。

结果：二肽DI在2.0mg/mL时的HMG-CoA还原酶抑制活性为42.3％。

通过实施例1和实施例2中的抑制浓度和活性数据，说明此二肽DI的活性与浓度存在量效关系，此二肽结构同时具有α-葡萄糖苷酶抑制活性和HMG-CoA还原酶抑制未见报道，属于新的兼具α-葡萄糖苷酶抑制活性和HMG-CoA还原酶抑制活性的双功能肽。

对比例1、二肽TA(检测方法同上)

二肽TA在1.0mg/mL时的α-葡萄糖苷酶抑制活性为15.2％，HMG-CoA还原酶抑制活性为13.5％。

在2.0mg/mL时的α-葡萄糖苷酶抑制活性为31.5％，HMG-CoA还原酶抑制活性为25.6％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，比如不同蛋白质来源降解分离所得的DI结构及其衍生化结构。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110>浙江省农业科学院

<120>具有降血糖和降血脂双功能的二肽DI及其用途

<160>1

<210>1

<211>2

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>二肽DI

<400>1

AspIle

Claims (2)

1.二肽DI在制备降血糖和降血脂双功能药物中的应用，该二肽DI的氨基酸序列为：Asp-Ile。

2.根据权利要求1所述的二肽DI的应用，其特征是：制备同时作为α－葡萄糖苷酶抑制肽和HMG-CoA还原酶抑制肽的药物。