KR20180053467A - 사람 유래 dpp-4 유전자를 이용한 당뇨 질환 모델용 형질전환돼지 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 유래 DPP-4 (human dipeptidyl peptidase-4, hDPP-4)유전자를 발현하는 형질전환 돼지에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 당뇨 질환 모델용 형질전환 돼지를 생산하기 위한 벡터, 형질전환 돼지 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의한 형질전환 돼지는 제2형 당뇨병 치료제 개발과 약물 유효성 평가 등에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

사람 유래 DPP-4 유전자를 이용한 당뇨 질환 모델용 형질전환돼지 및 이의 용도{Transgenic cloned porcine Models for diabetes disease using human DPP-4 and the use thereof}

본 발명은 사람 유래 DPP-4 (human dipeptidyl peptidase-4, hDPP-4) 유전자를 이용한 당뇨 질환 모델용 형질전환돼지 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 제2형 당뇨병 치료제로 사용되는 약물들의 목표 단백질인 hDPP-4 유전자를 돼지에서 과발현 시켜 DPP-4를 타겟으로 하는 제 2형 당뇨병 치료제 개발과 약물 유효성 평가 등에 필요한 형질전환돼지 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

당뇨병은 전 세계적으로 심각한 건강의 위험 요소로 부각되고 있다. 세계보건기구(WHO)에 의하면 당뇨병으로 사망하는 사람들이 연간 110만 명이 넘는 숫자가 보고되고 있고, 또한 계속 증가하는 추세가 이어지고 있다. 미국의 통계에 의하면 당뇨병 환자가 2002년에 약 1천2백만 명에 이르고 있고, 2020년에는 약 1천7백만 명으로 늘어날 것으로 예상하고 있다. 우리나라에서는 2003년 당뇨병 환자가 400만 명이 넘는 숫자가 보고되고 있고, 이것은 이미 우리나라 인구의 8.3%에 해당하는 것으로 2020년에는 620만 명으로 늘어날 것으로 전망되고 있다.

최근 매우 특징적으로 나타나는 추이는 주로 고령층에서 발생하던 제2형 당뇨병이 소아 비만과 관련되어 비만에 의한 제2형 당뇨병이 아동을 비롯한 청소년층에서도 빈번하게 발생한다는 것이다. 이렇게 청소년층에서 비만과 당뇨가 증가한다는 사실을 생각했을 때 최근 증가되고 있는 대사증후군(metabolic syndrome)의 증가와도 밀접한 관련이 있다고 생각할 수 있다. 대사증후군은 인슐린 저항성, 고지혈증 및 고혈압 등의 증상의 총칭으로 당뇨병에 의한 주요한 사망 원인으로 대두되고 있는 심혈관 질환의 위험인자로 인식되고 있다.

지금까지 다양한 GM동물의 생산기술들은 기본적으로 유전자 재조합기술과 수정란조작기술을 필요로 한다. 특히 목표하는 유전자의 발현 형태에 따라 다양한 유전자 재조합 기술이 활용되고 있다. 예를 들어 목표하는 유전자의 발현이 증가된 ‘외래유전자 과발현(Overexpression) 동물’과 외래유전자의 발현을 인위적으로 조절할 수 있는 ‘외래유전자 발현조절(Conditional expression) 동물’을 위한 유전자 재조합 기술들이 개발되었다.

질환모델동물은 질환의 원인이 되는 유전자의 기능 규명은 물론 발병과정을 이해함으로써 치료제의 개발을 용이하게 한다. 또한, 이러한 동물들은 새로운 치료제의 효과와 독성 및 부작용 검증을 하는 데도 활용된다. 그동안 GM동물은 생산기술이 발달되면서 아직 약물이나 치료방법이 개발되지 않은 불치병을 연구하기 위하여 개발되어 왔다. 또한, 기존의 GM설치류를 주로 질환모델로 생산하였으나 해부학, 생리학적 차이 등 많은 제한이 동반되는 단점을 보완하기 위하여 최근에는 GM돼지를 질환모델로 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

특히 당뇨 질환을 연구하기 위하여 개발된 GM동물들은 질환을 연구하는 수준을 낮추어 유전자나 단백질 수준에서 발병원인을 규명할 수 있다. 또한, 신약 투여 등으로 치료한 다음, 실시간으로 치료과정의 추적이 가능하여 부작용을 최소화시킬 수가 있다. 따라서 GM질환모델 동물은 앞으로 의약산업의 발전에 크게 기여할 것으로 예상하고 있다.

당뇨병은 다양한 발병 기전에 의하여 발병되므로 그 치료법 또한 다양할 수밖에 없으며, 더구나 기존의 고식적인 치료법만으로 만족할 만한 효과를 보지 못하는 경우도 많기에 새로운 치료법이 요구된다. 당뇨병 치료제 연구는 당뇨병 환자의 90% 이상을 차지하는 제2형 당뇨병 치료제를 중심으로 기술개발이 활발히 이루어지고 있다. 인슐린요법은 그 효과가 확실하지만 매일 주사를 맞아야 하는 번거로움 때문에 약물요법이 인슐린 요법보다 선호되는 경향이 있으나, 설폰 요소제는 경우에 따라서 그 효능에 한계가 있고 또 비구아니드 제제는 유산증 같은 중대한 부작용을 초래할 수 있기에 그 적응증이 더욱 제한적이다. 따라서 기존 약제들을 보완하거나 능가할 수 있는 약제의 개발이 요구되고 있다. 이러한 요구에 부응하여 인슐린분비 촉진물질(pirogliride, linogliride, 2,4-디아미니노-5-시안-브로모리피딘, incretin, repaglinide, nateglinide), 인슐린 작용 증강제(troglitazone), 인슐린 저항성 개선제, 표적조직에서 인슐린 유사 효과를 나타내는 약물(pirogliride, linogliride, dichloroacetate, insulin lispro, insulin aspart), 포도당 신합성 억제제(지방분해억제제, 카르니틴 전이효소 억제제, 베타산화억제제), 인슐린 길항호르몬 억제제(somatostatin, 글루카곤 유도체), 탄수화물 흡수를 지연시키는 약제(식이성 섬유, 알파글루코시테이즈 억제제), amylin 유사체(pramlintide)에 대한 많은 연구가 수행되고 있다. 이들 중 일부는 현재 시판되고 있으나, 상당수가 아직도 인체에 사용하기에는 미흡한 실험단계에 있거나 독성 검사단계에 있다.

인크레틴(Incretin) 효과는 당분을 경구로 투여했을 때 동량의 당분을 정맥 주사했을 때보다 더 강력한 인슐린 분비 자극이 일어나는 것을 말하며, 이러한 개념은 이미 1960년대에 선구적인 연구자들에 의해 제시되었다. 뒤이은 연구는 인크레틴 효과가 혈당 의존적인 방식으로 일어나며, 건강한 사람에 비해 당뇨병 환자에서 이러한 효과가 감소되어 있음을 보여주었다. 인크레틴 호르몬인 GIP (glucose-dependent insulinotropic peptide), GLP-1 (glucagon like peptide-1) 및 이에 대한 생리적 분해효소인 DPP-4 (dipeptidyl peptidase-4)의 발견은 당뇨병의 새로운 치료 약제인 GLP-1 agonist와 DPP-4 억제제의 개발을 가능케 하였다. GLP-1 agonist가 먼저 시장에 등장했음에도 불구하고 상대적으로 비싼 가격과 투여 경로(피하 주사)의 단점으로 인해 처방과 사용에 제한적이었던 반면, DPP-4 억제제의 경우 GLP-1 agonist의 여러 장점을 공유하면서도 상대적으로 싼 가격과 경구 투여라는 장점 덕분에 임상 의사들이 손쉽게 선택하는 약제가 되었다. 최근 발표된 당뇨병 치료의 주요 가이드라인에서 DPP-4 억제제를 2차 약제, 혹은 특정한 환자 군에서는 1차 약제로까지 권고하고 있으며, DPP-4 억제제는 총 6종으로 sitagliptin, vildagliptin, saxagliptin, linagliptin, alogliptin 및 gemigliptin가 개발되었다. 그러나 이러한 연구 개발은 이러한 신약들의 효능 및 안전성 그리고 사람과 유사한 대상의 충분한 실험적 증거를 제시하지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 당뇨 질환 모델의 개발은 이러한 신약들의 검증과 관련된 형질전환 생산물들의 판별에 무엇 보다 중요한 증거 제시에 연구가 되리라 생각된다.

본 발명의 배경기술로 대한민국 공개특허 제10-2012-0050485호에는 당뇨병 치료를 위한 형질전환 돼지에 대해 기재되어 있다.

본 발명의 목적은 사람 유래 DPP-4 (human dipeptidyl peptidase-4, hDPP-4) 유전자를 발현하는 형질전환 돼지를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 돼지를 이용하여 당뇨 질환 치료 약제의 작용기작을 밝히기 위한 당뇨 질환 모델용 형질전환 돼지를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 프라이머를 포함하는 유전자 도입용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열을 가지며, (닭) CAG 프로모터를 포함하고, C-말단에 HA-tag를 삽입시킨 hDPP-4 유전자 도입용 발현벡터 정제산물 서열번호 5를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 사람 유래 DPP-4 (human dipeptidyl peptidase-4, hDPP-4) 유전자를 포함하는 형질전환 동물의 수정란을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 기재된 형질전환 돼지의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 사람 유래 DPP-4(human dipeptidyl peptidase-4, hDPP-4) 유전자를 발현하는 형질전환 돼지가 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 당뇨 질환 모델일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 프로모터 및 서열번호 1의 염기서열이 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트가 도입될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 프로모터는 CAG 프로모터를 포함하는 형질전환 돼지가 제공될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 사람 유래 DPP-4 유전자는 돼지의 간 조직, 장 조직 또는 귀 조직에서 발현될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 사람 유래 DPP-4 유전자는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트에 의해 증폭될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 사람 유래 DPP-4 유전자는 세포막에서 발현될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 형질전환 돼지는 돼지 수정란 전핵에 미세주입에 의해 상기 유전자 컨스트럭트가 도입되어 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 사람 유래 DPP-4 유전자를 포함하는 형질전환 돼지의 수정란이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 사람 유래 DPP-4 (human dipeptidyl peptidase-4, hDPP-4) 유전자를 포함하는 형질전환 동물의 수정란이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, a) 프로모터 및 서열번호 1의 염기서열이 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 구축하는 단계; b) 돼지 수정란에 상기 유전자 컨스트럭트를 미세 주입하는 단계; 및 c) 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 돼지를 수득하는 단계를 포함하는 형질전환 돼지의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 b) 단계의 유전자 컨스트럭트는 pCAGEN 발현벡터이고, 상기 발현벡터는 HincII와 HindIII 제한효소를 사용하여 절단한 후, 직선형 발현벡터만을 선택적으로 회수하고, 0.1 이상 내지 1% 이하의 아가로스 겔에 전기영동 한 후 DNA 절편을 회수 및 정제하여, 유전자 미세 주입을 하는 것을 특징으로 하는 형질전환 돼지의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 b) 단계의 상기 주입된 유전자 컨스트럭트의 농도는 5 내지 20 ng/㎕인 형질전환 돼지의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, a) 상기 형질전환 돼지에 당뇨 질환의 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계; b) 후보물질 투여 후, 상기 형질전환 돼지의 세포 또는 조직에서 인슐린 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 인슐린 발현수준을 증가 또는 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 당뇨 질환의 예방 및 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 돼지는 hDPP-4가 과발현되어 나타나는 생리적 표현형 분석에 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 돼지는 hDPP-4를 타깃으로 하는 제 2형 당뇨병 치료제 개발과 약물 유효성 평가 등에 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 돼지는 hDPP-4 억제제(inhibitor)로서 개발될 신약 뿐 아니라 이미 개발된 약물들의 약리유효성 검증을 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 HA-tag를 삽입시킨 프라이머 및 벡터를 이용하여, 빠르게 단백질의 발현을 분석할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 당뇨모델 형질전환 돼지를 생산하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 클로닝한 hDPP-4 유전자 서열(서열번호 1)을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 hDPP-4 단백질 서열(서열번호 2)을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 HA-tag의 hDPP-4의 3차 구조를 나타내며, 노란색으로 표시된 선은 HA-tag을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 hDPP-4 발현벡터의 구축 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 hDPP-4 발현벡터가 세포 내에서 발현이 확인된 것을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 DPP-4 유전자 주입 후 수정란(line 2 내지 5)에서 DPP-4 유전자가 발현되고 있음을 PCR로 확인한 pCAGEN-hDPP-4-HA발현벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 8는 본 발명의 일 실시예에 따른 DPP-4 유전자 주입 후 수정란(line 2 내지 5)에서 DPP-4 유전자가 발현되고 있음을 PCR로 확인한 것을 나타낸다. 반면 대조구(line 6 및 7)에서는 DPP-4 유전자가 발현되지 않음이 나타났다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 동물 생산을 위하여 수정란 내에 미세 주입법을 통해 생산한 산자에서 유전자 발현 여부 분석 실시한 것으로, PCR 방법에 의한 형질전환 개체의 검정결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 임신 40일째 및 임신 114일째 초음파 진단사진을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 DPP-4의 발현위치를 확인하기 위한 것으로, 형질전환 돼지 귀세포 채취하고, 상기 귀 세포로부터 분리한 체세포를 계대 배양하여 배양된 세포를 막부분과 세포질 부분을 분리하고 면역학적 방법으로 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 형질전환 자돈 게놈 분석 및 외래 유전자 삽입위치를 확인한 것으로, 형질전환 자돈 유래 체세포에서 게놈 DNA를 분리하고 NGS를 통해 외래유전자가 들어가 있는 영역을 분석한 결과, 돼지 Hemoglobin subunit beta 유전자 영역에 hDPP-4 유전자가 삽입됨을 확인한 것을 나타낸 것이다.

본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “형질전환 돼지”란 외부에서 도입된 유전자를 재조합하여, 이를 돼지의 염색체 상에 인공적으로 삽입시킴으로써 그 형질의 일부가 변화된 돼지를 의미한다. 본 발명의 상기 형질전환 돼지는 도입한 유전자인 DPP-4가 형질전환된 돼지의 여러 조직에서 발현 될 수 있으며, 상기 조직은 꼬리, 귀, 간, 심장, 위, 소장, 대장, 심장 등에 제한이 없으나, 귀, 간, 소장, 및 대장 조직에 적합하다.

본 발명에서 사용되는 용어 “프라이머”는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 사상체질 특이적 복부비만을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “벡터”란 상기 벡터가 도입된 세포에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 벡터 내에 도입된 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 바람직하게 본 발명은 사람 유래 DDP-4 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있으며, 상기 제조된 재조합 벡터를 이용하여 이를 수정란에 도입함으로써, 형질전환된 수정란을 제조할 수 있으며, 이를 이용하여 형질전환돼지를 생산할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “프로모터”는 당업계에서 통상적으로 사용되는 발현벡터를 제조하기 위한 프로모터 서열을 제한 없이 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 프로모터의 예로는 CMV 프로모터, 또는 CAG 프로모터 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 프로모터 서열이 제한되는 것은 아니다. 이러한 프로모터는 필요에 따라 조직 특이적으로 발현시키기 위하여 특정 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “미세 주입”은 극미량의 고분자 물질을 주입하는 것으로, 유리모세관을 늘려 이것을 미세피펫이나, 미세주사기에 접속시키거나 현미경하에서 마이클로매티풀레이터(micro-manipulator)를 사용하여 주입할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 사람 유래 DPP-4(human dipeptidyl peptidase-4, hDPP-4) 유전자를 발현하는 형질전환 돼지가 제공될 수 있다. 사람유래 DPP-4 (Dipeptidyl peptidase-4, DPP-4 억제제)는 아데노신 디아미네이즈(adenosine deaminase) 복합체 단백질 또는 CD26(분화형 클러스터 26)으로 알려져 있으며, 사람에서는 DPP-4 유전자에 의해 코딩되는 단백질로, DPP-4의 주요 역할은 Glucogan like peptide-1(GLP-1)과 유사하게, 장에서 인크레틴(incretin)을 분해하는 효소로써 작용하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 당뇨 질환 모델인 형질전환 돼지가 제공될 수 있다.

상기‘당뇨 질환’은 당뇨병을 포함하는 질환으로써 당뇨병으로 인한 만성합병증이 포함된다. 이에 한정하는 것은 아니나, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경증, 협심증 및 심근 경색증을 포함하는 허혈성 심장병, 뇌졸중 및 위궤양 또는 괴사, 면역기능의 이상, 지방 및/또는 단백질 대사의 불균형 등이 포함될 수 있다.

상기 형질전환 돼지를 이용하여 당뇨 질환 치료 약제의 작용기작을 밝히기 위한 당뇨 질환 모델용 형질전환 돼지가 제공된다. 상술한 바와 같이 DPP-4는 인크레틴을 분해하는 효소로, 상기 DPP-4 유전자를 억제하면 상대적으로 인크레틴의 농도가 증가되고, 그 결과 췌장에서 인슐린 분비의 증가 및 글루카곤 분비의 감소에 의해 혈당을 감소시키고, 이는 음식물의 소화 흡수 속도도 낮춰 혈당 상승이 천천히 이뤄지게 만든다. 반면, DPP-4 유전자가 과발현 되면, 상대적으로 인크레틴의 농도는 낮아지고, 그 결과 인슐린 분비의 감소 및 글루카곤의 분비가 증가가 초래되어 고혈당 증세가 나타난다. 따라서, 본 발명에 의해 당뇨 질환과 유사한 형태를 보이는, 당뇨 모델용 형질전환 돼지가 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 프로모터 및 서열번호 1의 염기서열이 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트가 도입된 형질전환 돼지가 제공될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 프로모터는 전신발현을 위한 CAG 프로모터, CMV 프로모터, EF1α 프로모터 및 SRα 프로모터 등이 포함될 수 있으며 알부민 프로모터를 대표로 한 조직특이적 프로모터 등도 포함할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 프로모터는 CAG 프로모터를 포함하는 형질전환 돼지가 제공될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 사람 유래 DPP-4 유전자는 돼지의 간 조직, 장 조직 또는 귀 조직에서 발현되는 형질전환 돼지가 제공될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 사람 유래 DPP-4 (human dipeptidyl peptidase-4, hDPP-4) 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 형질 전환 돼지가 제공된다(도 2 참조).

본 발명의 다른 측면에 의하면, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트를 포함하는 hDPP-4 유전자 도입용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 사람 유래 DPP-4 유전자는 세포질 및 세포막에 발현될 수 있으며 특히 세포외막에 발현되는 것이 특징인 형질전환 돼지가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 서열번호 5의 염기서열을 가지며, CAG 프로모터를 포함하고, C-말단에 HA-tag를 삽입시킨 hDPP-4 유전자 도입용 발현벡터가 제공된다(도 5 참조). 도 5의 전기영동 사진에는 도 5에 기재된 정방향 및 역방향 hDPP-4 발현벡터가 제대로 삽입되어 있음이 나타나 있다. 또한, COS7에서도 정방향 및 역방향의 발현 벡터가 제대로 발현되고 있음을 알 수 있다(도 6 참조). 본 발명은 hDPP-4의 조직 특이적 발현벡터를 구축하고자 일예로, 간 특이적 알부민(albumin) 프로모터를 가지고 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 각 발현이 요구되는 조직의 프로모터가 포함될 수 있다. 상기 발현벡터로 세포 내 발현 시에 내생적으로 생성되는 DPP-4(endogenous pig DPP-4)와 구별을 위해 hDPP-4의 3‘말단에 HA-tag를 삽입시켰으며, 이는 도 4의 구조(노란색)를 통해 확인 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조직은 간 또는 이자 조직인 hDPP-4 유전자 도입용 발현벡터가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 사람 유래 DPP-4 (human dipeptidyl peptidase-4, hDPP-4) 유전자를 포함하는 형질전환 동물의 수정란이 제공된다.

이에 한정되는 것은 아니나, 상기 수정란은 상기 형질전환 돼지 제조용 수정란이다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, a) 프로모터 및 서열번호 1의 염기서열이 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 구축하는 단계; b) 돼지 수정란에 상기 유전자 컨스트럭트를 미세 주입하는 단계; 및 c) 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 돼지를 수득하는 단계를 포함하는 형질전환 돼지의 제조방법이 제공될 수 있다.

상기 돼지 수정난의 채취는 호르몬을 처리하고 자연교미를 통해 종부를 진행시킨 후, 외과적 방법으로 1 세포기 수정란을 채취하였다. 회수된 수정란은 전핵을 관찰하기 위해 15,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 당뇨 질환 형질전환동물 생산용 유전자(DPP-4)를 주입하였다(도 1 참조). 본 발명은 기존 질환 모델 동물은 마우스를 대상으로 연구되고 있으나, 마우스 중심의 검증은 사람에 적용하기에는 한계를 극복하여 사람과 보다 유사한 돼지를 이용함으로써 이를 극복하고자 하였다.

DPP-4 유전자를 주입한 4개의 배반포(line 2-5) 중에서 3개에서 DPP-4 유전자가 발현되고 있을 확인 할 수 있었다(3/4 BL : 75%). 그러나, 대조군으로 이용된 단위발생 배반포 2개(line 6, 7)에서는 DPP-4 유전자의 발현이 확인되지 않았다(도 8 참조).

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 b) 단계의 유전자 컨스트럭트는 pCAGEN 발현벡터이고, 상기 발현벡터는 HincII와 HindIII 제한효소를 사용하여 절단한 후, 직선형 발현벡터만을 선택적으로 회수하고, 0.1 이상 내지 1% 이하의 아가로스 겔에 전기영동 한 후 DNA 절편을 회수 및 정제하여, 유전자 미세 주입을 하였다.

상기 b) 단계의 발현벡터는 pCAGEN 발현벡터이고, 상기 발현벡터는 HincII와 HindIII 제한효소를 사용하여 절단한 후, 직선형 발현벡터만을 선택적으로 회수하고, 0.1 이상 내지 1% 이하의 아가로스 겔에 전기영동 한 후 DNA 절편을 회수 및 정제하여, 유전자 미세 주입을 하는 것을 특징으로 하는 형질전환 돼지의 제조방법이 제공된다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 아가로스 겔은 0.5%의 농도일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 b) 단계의 상기 주입된 유전자 컨스트럭트의 농도는 5 내지 20 ng/㎕인 일 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 도입된 유전자의 농도는 10 ng/㎕이 적합하다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, a) 제1항의 형질전환 돼지에 당뇨 질환의 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계; b) 후보물질 투여 후, 상기 형질전환 돼지의 세포 또는 조직에서 인슐린 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 인슐린 발현수준을 증가 또는 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 당뇨 질환의 예방 및 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 a)의 후보 물질로는 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장 등이 있고, 이러한 화합물들은 신규 화합물이어도 되고, 널리 알려진 화합물이어도 된다.

상기 후보 물질은 염을 형성하고 있어도 된다. 상기 후보 물질의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산 등)이나 염기(예, 유기산 등) 등의 염이 있고 이 중에서 생리학적으로 허용되는 산첨가염이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 이와 같은 염으로는 예를 들면, 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 취화수소산 또는 황산 등)의 염 또는 유기산(예를 들면, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산 또는 벤젠술폰산 등)의 염 등이 이용될 수 있다.

상기 후보 물질을 투여하는 방법으로는 경구투여, 정맥주사, 스와빙(swabbing), 피하투여, 피내투여 또는 복강투여 등이 이용될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 실험 동물의 증상 또는 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다. 또한, 후보 물질의 투여량은 투여 방법, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 b) 및 c)의 상기 형질전환 돼지의 세포 또는 조직에서 인슐린 발현수준을 측정 및 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 인슐린 발현수준을 증가 또는 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계는 인슐린의 발현 수준 뿐 아니라, 당뇨병 또는 당대사 이상 증상과 상관관계가 있는 해부학적 또는 병리학적 지표인 복부 지방 감소, 체중 감소, 간조직의 증가 및 간의 지방세포 증가를 추가로 측정할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예

1. Human DPP4 유전자 클로닝

NCBI GeneBank에 등록된 사람 유래 DPP4(human DPP4, hDPP4) 유전자 서열을 기초로 유전자를 클로닝하기 위하여 Human HEK293(Kidney유래) 세포에서 mRNA를 분리하였다. hDPP-4 mRNA를 주형으로 cDNA를 합성하고 PCR 방법으로 유전자를 증폭시켜 pCR2.1-TA vector에 클로닝하여 유전자를 확보하였다. 유전자 염기서열 분석결과 GeneBank에 등록된 human DPP4(Accession number : NM_001935)와 서열이 동일한 것을 확인하였다(도 2 및 도 3).

2. 전신발현용 발현벡터 구축

전신발현용 hDPP-4 발현벡터 구축과 세포내 발현 후, 빠르게 단백질의 발현분석을 위해 단백질의 C-말단에 HA-tag를 삽입시킨 프라이머(서열번호 3 및 4)를 합성하여 PCR 방법을 사용하여 유전자를 다시 증폭시켰으며 증폭된 hDPP-4유전자는 pCR2.1-TA vector에 클로닝하고 전체 염기서열 분석을 통해 돌연변이가 삽입되지 않았음을 확인하였다.

DNA 염기서열이 확인된 plasmid로부터 hDPP-4 유전자를 제한효소로 절단한 후, CAG promoter를 사용하는 pCAGEN 발현벡터에 삽입시키고 삽입위치를 확인하였다(도 5).

또한, 구축된 발현벡터가 유전자를 발현시키는지 확인하고자 COS7세포에 transfection시켰고(Lipofectamine 2000을 사용), hDPP-4의 발현분석을 위하여 Western blot로 확인하였다(도 6). pCAGEN 발현벡터(도 7)는 HincII와 HindIII 제한효소를 사용하여 절단한 후, 직선형 발현벡터만을 선택적으로 회수하기 위해서 0.5% 아가로스겔에 전기영동 후 DNA단편을 회수하여 정제한 후, 유전자 미세주입을 실시하였다.

3. 유전자 미세주입 및 수정란 이식

돼지 수정란의 채취는 발정동기와 호르몬을 처리하고 자연교미를 통해 종부를 진행시킨 후, 외과적 방법으로 1세포기 수정란을 채취하였다. 회수된 난자 전핵에 형질전환동물 생산용 hDPP-4 유전자를 주입하였고, 총 27두(공란돈)에서 배란된 733개의 난자 중에서 684개의 수정란을 채란하고, 1세포기 수정란을 선별하여 총 15두에 478개의 hDPP-4가 주입된 수정란을 이식하였다.

DPP-4 당뇨 질환 모델 돼지를 생산하기 위하여, 형질전환 동물 생산을 위하여 수정란 내에 미세주입법을 통해 생산한 산자에서 유전자 발현 여부 분석을 PCR을 이용하여 실시하였다. 채란 수 34개를 회수하여 29개의 란에 유전자를 주입하였다. 또한 이를 모두 난관 내 이식하였다.

수정란 이식 후 임신 40일, 및 114일 째 임신 진행 상황을 체크하기 위해 진단을 실시하였다. 도 11의 화살표는 각각 착상된 태아의 부분을 표시한 것이다(도 10 참조).

결과

PCR 방법에 의한 형질전환 개체의 검정

대리모 15두 가운데 3두가 임신하였으나 1두는 임신 중반에 사산되었으며 1두는 분만하여 4두를 생산하였으나 형질전환된 자돈은 생산되지 않았다. 최종적으로 1두에서 총 6두(암컷 2두, 수컷 3두, 1두 폐사)가 생산되었다. 생산된 자돈들은 형질전환 여부를 귀세포에서 genomic DNA를 분리하여 PCR을 통해서 확인하였으며 생존한 5마리 중, 1두가 형질전환체임을 확인하였다(16.7%, 도 9 참조).

형질전환돼지 귀세포 채취 및 귀세포 배양

형질전환돼지 귀세포로부터 체세포를 분리하여 계대배양을 실시하였고 배양된 세포의 특성을 분석하기 위해 DPP-4가 존재하는 막부분과 세포질부분을 분리하여 면역학적방법으로 발현을 확인한 결과 막부분에 존재하는 것을 확인하였다(도 11 참조).

형질전환 자돈 게놈 분석 및 외래유전자 삽입위치 확인

형질전환 자돈 유래 체세포에서 게놈 DNA를 분리하고 분리된 게놈 DNA를 차세대 염기서열분석을 통해 외래유전자가 들어가 있는 영역을 분석한 결과 돼지 헤모글로빈 서브유닛 β(Hemoglobin subunit beta) 유전자 영역에 hDPP-4 유전자가 삽입되어 있는 것을 확인하였다(도 12 참조).

이상으로 본 발명을 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Composition comprising SNP genetic marker of cow mitochondria DNA for discriminating cow breed and cow discrimination method using the same <130> NPF30092 <160> 3 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 16339 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 1 actaatggct aatcagccca tgctcacaca taactgtgct gtcatacatt tggtattttt 60 ttattttggg ggatgcttgg actcagctat ggccgtcaaa ggccctgacc cggagcatct 120 attgtagctg gacttaactg catcttgagc accagcataa tgataagcat ggacattaca 180 gtcaatggtc acaggacata aattatatta tatatccccc cttcataaaa atttccccct 240 taaatatcta ccaccacttt taacagactt ttccctagat acttatttaa atttttcacg 300 ctttcaatac tcaatttagc actccaaaca aagtcaatat ataaacgcag gccccccccc 360 cccgttgatg tagcttaacc caaagcaagg cactgaaaat gcctagatga gtctcccaac 420 tccataaaca cataggtttg gtcccagcct tcctgttaac tcttaataaa cttacacatg 480 caagcatcta caccccagtg agaatgccct ctaggttatt aaaactaaga ggagctggca 540 tcaagcacac accctgtagc tcacgacgcc ttgcttaacc acaccccacg ggaaacagca 600 gtgacaaaaa 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<400> 3 cttgatgcca gctcctctta gt 22

Claims (13)

1. 사람 유래 DPP-4(human dipeptidyl peptidase-4, hDPP-4) 유전자를 발현하는 형질전환 돼지.
   
2. 제1항에 있어서, 당뇨 질환 모델인 형질전환 돼지.
   
3. 제1항에 있어서, 프로모터 및 서열번호 1의 염기서열이 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트가 도입된 형질전환 돼지.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터를 포함하는 형질전환 돼지.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 사람 유래 DPP-4 유전자는 돼지의 간 조직, 장 조직 또는 귀 조직에서 발현되는 형질전환 돼지.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 사람 유래 DPP-4 유전자는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트에 의해 증폭되는 형질전환 돼지.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 사람 유래 DPP-4 유전자는 세포막에 발현되는 것이 특징인 형질전환 돼지.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 형질전환 돼지는 돼지 수정란 전핵에 미세주입에 의해 상기 유전자 컨스트럭트가 도입되어 제조된 형질전환 돼지.
   
9. 사람 유래 DPP-4 유전자를 포함하는 형질전환 돼지의 수정란.
   
10. a) 프로모터 및 서열번호 1의 염기서열이 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 구축하는 단계;
    b) 돼지 수정란에 상기 유전자 컨스트럭트를 미세 주입하는 단계; 및
    c) 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 돼지를 수득하는 단계를 포함하는 형질전환 돼지의 제조방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 b) 단계의 유전자 컨스트럭트는 pCAGEN 발현벡터이고,
    상기 발현벡터는 HincII와 HindIII 제한효소를 사용하여 절단한 후, 직선형 발현벡터만을 선택적으로 회수하고, 0.1 이상 내지 1%이하의 아가로스 겔에 전기영동 한 후 DNA 절편을 회수 및 정제하여, 유전자 미세 주입을 하는 것을 특징으로 하는 형질전환 돼지의 제조방법.
    
12. 제10항에 있어서,
    b) 단계의 상기 주입된 유전자 컨스트럭트의 농도는 5 내지 20 ng/㎕인 형질전환 돼지의 제조방법.
    
13. a) 제1항의 형질전환 돼지에 당뇨 질환의 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계;
    b) 후보물질 투여 후, 상기 형질전환 돼지의 세포 또는 조직에서 인슐린 발현수준을 측정하는 단계; 및
    c) 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 인슐린 발현수준을 증가 또는 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 당뇨 질환의 예방 및 치료제의 스크리닝 방법.

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