ES2952521T3 - Anticuerpos monoclonales contra BAMBI y uso para el tratamiento de enfermedades inflamatorias - Google Patents
Anticuerpos monoclonales contra BAMBI y uso para el tratamiento de enfermedades inflamatorias Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales específicos frente a un péptido de la proteína BAMBI, así como a sus usos y métodos que los comprenden. Preferiblemente los anticuerpos se utilizan para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpos monoclonales contra BAMBI y uso para el tratamiento de enfermedades inflamatorias
La presente invención se refiere a anticuerpos contra la proteína BAMBI (BMP and Activin Membrane Bound Inhibitory, inhibidor unido a la membrana de activina y BMP) y al uso de los mismos para el tratamiento y la prevención de enfermedades inflamatorias. Por tanto, la presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina.
Estado de la técnica
Bajo la denominación de enfermedad “autoinmunitaria o inflamatoria crónica” se engloban actualmente más de 100 entidades nosológicas que globalmente afectan a aproximadamente el 10 % de la población mundial (Shoenfeld Y et al. 2008 J Autoimmun 31:325). Las enfermedades autoinmunitarias son el resultado de la acción de múltiples agentes ambientales sobre un fondo genético y/o epigenético específico. La acumulación de todos estos factores en un individuo altera la regulación de la respuesta inmunitaria, provocando respuestas inmunitarias aberrantes contra agentes externos o la reacción del sistema contra sí mismo. La consecuencia es el desarrollo de enfermedades autoinflamatorias y/o autoinmunitarias.
Entre las enfermedades autoinmunitarias se incluyen artritis reumatoide (AR), psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, espondiloartritis o lupus eritematoso sistémico, que comparten una serie de mecanismos etiopatogénicos, así como su respuesta a tratamientos inmunomoduladores o inmunosupresores similares o iguales. La AR es la enfermedad reumática autoinmunitaria más común.
En las enfermedades de base autoinmunitaria están especialmente implicados los linfocitos T CD4+, un término que se refiere a múltiples subpoblaciones efectoras (linfocitos TH1, TH2, TH17, TFH) o reguladoras (Treg, Tr1), definidas básicamente por los patrones de citocinas que secretan (Zhu J et al. 2010 Annu Rev Immunol 28:445; Zygmunt B et al. 2011 Adv Immunol 109:159). Alteraciones en el control de los mecanismos que regulan la diferenciación y activación de las diferentes subpoblaciones funcionales de linfocitos T CD4+ se han implicado en el desarrollo de patologías de base inmunitaria. En este sentido, algunas enfermedades autoinmunitarias graves se han asociado con el aumento incontrolado en la diferenciación y/o funcionalidad de los linfocitos TH17 (Rohn TA et al. 2006 Eur J Immunol 36:2857; Kebir H et al. 2007 Nat Med 13:1173; esclerosis múltiple o artritis reumatoide, entre otras) o TFH (Tangye SG et al. 2013 Nat Rev Immunol 13:412; lupus eritematoso sistémico). Por otro lado, la reducción en el número y/o la actividad supresora de las células Treg es crítica en el síndrome IPEX, observado en pacientes con mutaciones en el gen foxp3 (Bennett CL et al. 2001 Nat Genet 27:20) o en ratones deficientes en escurfina (Khattri R et al. 2003 Nat. Immunol 4:337). El documento US2007065446 proporciona antisueros policlonales generados contra un fragmento N-terminal de BAMBI (humana).
Para el tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias se han usado fármacos inmunosupresores con un bajo grado de especificidad y, por tanto, presentan múltiples efectos secundarios adversos. Más recientemente se han usado anticuerpos monoclonales específicos de citocinas o receptores solubles de dichos factores (globalmente conocidos como fármacos biológicos). Estos compuestos presentan como ventaja su alto grado de especificidad y los resultados obtenidos con ellos han sido muy positivos. Sin embargo, el uso de los fármacos biológicos no está exento de efectos secundarios graves y, además, es habitual la aparición de resistencia a los mismos, lo que obliga a la suspensión de los tratamientos. Por tanto, es esencial desarrollar terapias altamente específicas que usen anticuerpos monoclonales contra nuevas dianas biológicas.
Descripción de la invención
La presente invención muestra el uso de anticuerpos monoclonales contra BAMBI para el tratamiento y la prevención de enfermedades autoinmunitarias, ejemplificadas éstas con modelos reconocidos de artritis, psoriasis y colitis.
Debe interpretarse que las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción son referencias a los compuestos, a las composiciones farmacéuticas y a los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico). En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
El término “anticuerpo”, tal como se usa en la presente invención, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y a porciones (o fragmentos) inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas. Es decir, se refiere a moléculas que se unen específicamente a (inmunorreaccionan con) un antígeno, tal como, por ejemplo, un péptido o una proteína (un inmunógeno o epítopo). El término “anticuerpo” comprende anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales, y en la presente invención el anticuerpo es monoclonal, y se refiere a un anticuerpo intacto o a fragmentos inmunológicamente activos del mismo, e incluye anticuerpos humanos, humanizados y no humanos,
recombinantes, quiméricos y sintéticos. En el contexto de esta invención, el término anticuerpo se refiere a la inmunoglobulina que el animal o una célula híbrida ha sintetizado de forma específica contra la secuencia descrita en el primer aspecto de la presente invención.
Los ejemplos de porciones o fragmentos de inmunoglobulinas inmunológicamente activas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2, que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima, tal como pepsina.
Los “anticuerpos monoclonales” son poblaciones homogéneas de anticuerpos idénticos, producidos por un hibridoma, es decir, una célula híbrida que es el producto de la fusión de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y única célula madre y un tumor de células plasmáticas, que están dirigidos contra un sitio o determinante antigénico específico. El método de obtención de los anticuerpos monoclonales de la invención puede llevarse a cabo según métodos convencionales conocidos en el estado de la técnica. Opcionalmente, dichos anticuerpos pueden purificarse por medios convencionales, tales como cromatografía de afinidad, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel o diálisis.
Tal como conoce un experto en la técnica, hay cinco isotipos o clases principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG) (que a su vez presenta los siguientes subtipos en ratones: IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3), inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina E (IgE). Los anticuerpos monoclonales incluidos en la presente invención son el clon B101-37 (IgG1) y el clon B143-14 (IgM). El anticuerpo reconoce específicamente la secuencia SEQ ID NO: 1: péptido BAMBI(109-133) murino: LHDVLSPSKSEASGQGNRYQHDSSR o SEQ ID NO: 2: péptido BAMBI(109-133) humano: LHDVLSPPRGEASGQGNRYQHDGSR.
Una realización más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al anticuerpo en el que dicho anticuerpo se expresa a partir de la línea celular (hibridoma) depositada en una autoridad internacional.
En una realización específica, el anticuerpo puede comprender un marcador detectable. Una realización incluso más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al anticuerpo en el que dicho anticuerpo está conjugado con un fluorocromo, una enzima, una partícula de oro, una nanopartícula, un péptido u otra proteína de interés, por ejemplo, un ligando proteico o peptídico de un receptor.
En la presente invención, el término “marcador detectable” o “elemento de marcaje” se refiere a una etiqueta molecular que permite la detección, localización y/o identificación de la molécula a la que está unido, por medio de métodos y equipos de detección adecuados, ya sea por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Los ejemplos de marcadores detectables para el marcaje de compuestos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos, sustratos enzimáticos, cofactores, ligandos, agentes quimioluminiscentes, fluoróforos, enzimas (por ejemplo, peroxidasa), receptores y combinaciones de los mismos. En una realización específica, el anticuerpo está marcado con biotina, avidina, estreptavidina, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante (HRP). Un experto en la técnica conoce métodos para marcar y guiar la selección de elementos de marcaje adecuados con diferentes propósitos.
El anticuerpo monoclonal puede alterarse bioquímicamente, por manipulación genética o puede ser sintético, también puede carecer de porciones.
En una realización más preferida del primer aspecto de la invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3 y/o una cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4. En otra realización más preferida del primer aspecto de la invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y/o una cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6. En una realización preferida, el anticuerpo es el anticuerpo denominado en la presente invención clon B101-37 (IgG1, k anti-BAMBI) y/o clon B143-14 (IgM, k anti-BAMBI).
En una realización específica, la presente invención también se refiere a un constructo génico que es capaz de generar el anticuerpo del primer aspecto de la presente invención.
El término “identidad”, tal como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a la proporción de aminoácidos idénticos entre dos péptidos o proteínas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias se conocen en el estado de la técnica, e incluyen, pero sin limitarse a, los programas BLASTP o BLASTN, ClustalW y FASTA. Puede considerarse que péptidos o proteínas con porcentajes de identidad de al menos el 80 % mantendrán las mismas propiedades que la secuencia SEQ ID NO: 1.
Por “reconocimiento específico” o “unión específica” se entiende la unión (reacción, interacción o unión específica) entre el anticuerpo de la invención y la secuencia descrita en el primer aspecto de la invención.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un antisuero que comprende el anticuerpo del primer aspecto de la invención.
El término “antisuero” se refiere a un suero obtenido tras la inmunización de un animal con un inmunógeno. El antisuero comprende anticuerpos específicos de dicho inmunógeno generados tras la respuesta inmunitaria producida en el animal. En el contexto de la presente invención, el inmunógeno es el péptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y el antisuero comprende anticuerpos monoclonales específicos generados contra dicha secuencia. Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a una célula que expresa el anticuerpo del primer aspecto de la invención (hibridoma).
Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere al uso del anticuerpo del primer aspecto de la invención o del antisuero del segundo aspecto de la invención para la inhibición del inhibidor unido a la membrana de activina y BMP (BAMBI).
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere al uso del anticuerpo del primer aspecto de la invención o del antisuero del segundo aspecto de la invención para la fabricación de un medicamento. Alternativamente, la presente invención también se refiere al anticuerpo del primer aspecto de la invención o al antisuero del segundo aspecto de la invención para su uso como medicamento.
Un sexto aspecto de la presente invención se refiere al uso del anticuerpo del primer aspecto de la invención o del antisuero del segundo aspecto de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedades autoinmunitarias. Alternativamente, la presente invención también se refiere al anticuerpo del primer aspecto de la invención o al antisuero del segundo aspecto de la invención para su uso como medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedades autoinmunitarias.
En la presente invención, por el término “enfermedad autoinmunitaria” se entiende una enfermedad en la que las células del sistema inmunitario desencadenan una respuesta inflamatoria crónica en uno o varios tejidos del individuo, provocando el deterioro o incluso la destrucción de los mismos. En la presente invención, los términos “enfermedad autoinmunitaria” y “enfermedad inflamatoria crónica” se usan indistintamente.
La enfermedad autoinmunitaria es preferiblemente artritis autoinmunitaria, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, espondiloartritis o lupus eritematoso sistémico. En una realización incluso más preferida, la artritis autoinmunitaria es artritis de reciente comienzo o artritis reumatoide.
Por este motivo, en una realización más preferida del sexto aspecto de la invención, las enfermedades autoinmunitarias se eligen de la lista que consiste en: artritis autoinmunitaria, espondiloartritis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico y enfermedad inflamatoria intestinal. Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
En la presente invención, el término “artritis autoinmunitaria” incluye ambos de los términos “artritis reumatoide” y “artritis indiferenciada”, independientemente de si es artritis de reciente comienzo o artritis bien establecida.
En la presente invención, “artritis de reciente comienzo” (ARC) (o artritis temprana) es una enfermedad que consiste en la inflamación de al menos una articulación, en menos de un año de evolución, que cumple los criterios preestablecidos por el Colegio Americano de Reumatología (American College of Rheumatology o ACR) y EULAR de “artritis reumatoide o AR” (Aletaha, Neogi et al. Ann Rheum Dis 2010;69:1580-1588) o, que sin cumplir dichos criterios, no cumple los criterios de otras enfermedades autoinmunitarias, degenerativas o metabólicas que puedan explicar los síntomas. Este último caso se denomina “artritis indiferenciada” (AI) que, en muchos casos, si no se trata, acaba desembocando en AR. En esta invención, los términos ARC, AR o AI se refieren a una enfermedad autoinmunitaria sistémica crónica y progresiva que provoca inflamación crónica, principalmente en las articulaciones, y que dada su naturaleza progresiva, produce la destrucción de las mismas, dando como resultado la deformación y pérdida de capacidad funcional. Además, esta enfermedad puede provocar alteraciones extraarticulares en diferentes órganos.
En la presente invención, por el término “espondiloartritis” se entiende cualquier enfermedad autoinmunitaria, axial y/o periférica, que cumple los criterios de clasificación de la Sociedad Internacional de Evaluación de Espodiloartritis (Assessment of SpondyloArthritis International Society o ASAS) (Rudwaleit et al. Ann Rheum Dis 2011;70:25-31). En la presente invención, por “lupus eritematoso sistémico” se entiende cualquier enfermedad autoinmunitaria sistémica definida por los criterios del Colegio Americano de Reumatología (Tan et al. Arthritis Rheum1982;25:1271-1277).
En la presente invención, el término “enfermedad inflamatoria intestinal” o “EII” se refiere a la inflamación crónica del intestino en un individuo, en la que dicha inflamación es debida al sistema inmunitario del propio individuo. Las dos formas más habituales son la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. Por tanto, en una realización preferida, la
enfermedad autoinmunitaria es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
En la presente invención, por “psoriasis” se entiende cualquier enfermedad cutánea que está caracterizada por un mal funcionamiento del sistema inmunitario, lo que provoca un exceso de producción de células cutáneas. Esta enfermedad provoca la formación de abultamientos rojizos cubiertos de descamaciones. Además, el exceso de producción de células también provoca la infiltración de glóbulos blancos en la piel. Generalmente, las lesiones se localizan en zonas con un mayor rozamiento, tales como, aunque sin limitarse a, los codos, las rodillas y la zona inguinal.
Un séptimo aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal del primer aspecto de la invención o el antisuero del segundo aspecto de la invención.
En esta memoria descriptiva, el término “composición farmacéutica” se refiere a cualquier sustancia usada para diagnóstico, prevención, alivio, tratamiento o curación de una enfermedad en un ser humano o en animales. La composición farmacéutica de la invención puede usarse sola o en combinación con otras composiciones farmacéuticas. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende además un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
El término “excipiente” se refiere a una sustancia que ayuda a la absorción de la composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo de la invención, estabiliza dicha composición farmacéutica o ayuda en la fabricación de la misma en el sentido de darle consistencia, forma, aroma o cualquier otra característica funcional específica. Por tanto, los excipientes pueden tener la función de mantener los ingredientes unidos entre sí, tales como, por ejemplo, almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección tal como, por ejemplo, aislarlo del aire y/o la humedad, la función de relleno de un comprimido, una cápsula o cualquier otra forma de formulación, tales como, por ejemplo, fosfato de calcio dibásico, la función de disgregación para facilitar la disolución de los componentes y su absorción, sin excluir otros tipos de excipientes no mencionados en este párrafo. Un “portador farmacéuticamente aceptable” (o “farmacológicamente aceptable”) se refiere a cualquier sustancia, o combinación de sustancias, conocida en el sector farmacéutico, usada en la fabricación de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero no se limita a, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El portador puede ser una sustancia inerte o tener una acción similar a cualquiera de los compuestos de la presente invención, tener la función de facilitar la incorporación del fármaco así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de dosificación es líquida, el portador es el diluyente. El término “farmacológicamente aceptable” se refiere al hecho de que el compuesto al que hace se referencia está permitido y evaluado de modo que no provoque daño a los organismos a los que se administra.
La composición farmacéutica de esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración, y como tal, dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada para la vía de administración elegida.
Un octavo aspecto de la presente invención se refiere al uso in vitro del anticuerpo del primer aspecto de la invención o del antisuero del segundo aspecto de la invención para el cribado de fármacos, preferiblemente fármacos para el tratamiento o la prevención de enfermedades autoinmunitarias. Preferiblemente, las enfermedades autoinmunitarias se eligen de la lista que consiste en artritis autoinmunitaria, espondiloartritis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico y enfermedad inflamatoria intestinal. Más preferiblemente, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
El término “in vitro” se refiere al hecho de que el método de la invención se realiza fuera del cuerpo del sujeto. Es decir, se realiza en una muestra biológica de un sujeto.
En la presente invención, el término “muestra biológica” se refiere a cualquier muestra que permita el cribado de fármacos, e incluye, pero no se limita a, fluidos biológicos o tejidos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica que sirva para dicho fin. Por ejemplo, la muestra biológica puede ser, pero no se limita a, una muestra de fluido, tal como sangre, plasma, suero o tejido. La muestra biológica de la presente invención puede ser nueva, congelada, fijada o fijada e incrustada en parafina.
En la presente invención los términos “sujeto” e “individuo” se usan indistintamente. Tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” o “individuo” se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no se limita a, animales de granja y domésticos, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano, hombre o mujer, de cualquier edad o raza.
Un noveno aspecto, no cubierto por la presente invención, se refiere a un método de obtención de un anticuerpo monoclonal que reconoce una secuencia de aminoácidos que comprende un péptido con al menos un 80 % de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1, que comprende:
a. obtener suero previamente extraído de un animal no humano inmunizado con una proteína recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un péptido con al menos un 80 % de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1,
b. obtener un hibridoma a partir de la etapa a) que genere anticuerpos monoclonales específicos contra una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia con al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO: 1.
En una realización más preferida del noveno aspecto, el método comprende además una etapa (c) de aislar el anticuerpo monoclonal a partir del hibridoma generado en la etapa (b).
En otra realización más preferida del noveno aspecto, en la etapa (a), la secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
En una realización incluso más preferida del noveno aspecto, el animal no humano es un mamífero que se elige de la lista que consiste en cerdos, chimpancés, ratones, ratas, conejos y cobayas.
Un décimo aspecto de la presente invención se refiere a un kit y/o dispositivo, denominados a continuación en el presente documento “kit de la invención” o “dispositivo de la invención”, que comprenden el anticuerpo, el antisuero, la célula, tal como se describe en la invención, y/o cualquier combinación de los mismos.
El kit y/o dispositivo de la invención puede comprender además, pero no se limita a, sondas, tampones, enzimas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado, el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para poner en marcha y optimizar el mismo. El kit puede contener además otras proteínas, incluyendo anticuerpos o antígenos, que sirven como controles positivos y negativos. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para detectar la proteína BAMBI, preferiblemente mediante un ensayo inmunohistoquímico, más preferiblemente mediante ELISA, inmunotransferencia de tipo Western o inmunofluorescencia.
Opcionalmente, el anticuerpo de la invención en el kit está marcado o inmovilizado.
El término “marcado”, tal como se usa en la presente descripción, se refiere al hecho de que el anticuerpo está conjugado con un marcador. En el estado de la técnica se conocen un gran número de marcadores que pueden conjugarse con un anticuerpo. Ejemplos de marcadores que pueden usarse para marcar un anticuerpo son, sin limitación, radioisótopos (por ejemplo, 32P, 35S o 3H), marcadores fluorescentes o luminiscentes [por ejemplo, fluoresceína, isotiocianato (FITC), rodamina, rojo Texas, ficoeritrina (PE), aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2',4,7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 5-carboxifluoresceína (5-FAM), o N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA)]; anticuerpos, fragmentos F(ab)2, marcadores de afinidad [por ejemplo, biotina, avidina, agarosa, proteína morfogenética ósea (BMP), haptenos], enzimas o sustratos enzimáticos [por ejemplo, fosfatasa alcalina (AP) y peroxidasa de rábano picante (HRP)].
El término “inmovilizado”, tal como se usa en la presente descripción, se refiere al hecho de que el anticuerpo de la invención puede unirse a un soporte sin perder su actividad. Preferiblemente, el soporte puede ser la superficie de una matriz (por ejemplo, una matriz de nailon), una placa de microtitulación (por ejemplo, con 96 pocillos) o un soporte de plástico similar, o perlas (esferas, por ejemplo, esferas de agarosa o microesferas superparamagnéticas pequeñas fabricadas de matrices biodegradables).
Otro aspecto de la invención se refiere al uso in vitro del kit de la invención para detectar el péptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso in vitro del kit y/o dispositivo de la invención para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunitarias. En una realización más específica de este aspecto, las enfermedades autoinmunitarias se eligen de la lista que consiste en artritis autoinmunitaria, espondiloartritis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico y enfermedad inflamatoria intestinal, más específicamente, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
Otro objeto está constituido por un método para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunitarias que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención, del antisuero de la invención o de la composición de la invención a un sujeto que lo necesita.
Para los propósitos de la presente invención, el término “tratamiento” se refiere a una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o la alteración de la patología de un trastorno. Por tanto, “tratamiento” se refiere tanto a tratamiento terapéutico así como también a medidas profilácticas o preventivas. Un “sujeto que necesita tratamiento” incluye cualquier caso en el que dicho sujeto ya padece el trastorno, así como cualquier caso en el que debe prevenirse el trastorno. En el tratamiento de una enfermedad de tipo inmunológica, un agente terapéutico
puede alterar directamente la magnitud de la respuesta de un componente de respuesta inmunitaria, o hacer que la enfermedad sea más susceptible al tratamiento mediante otros agentes terapéuticos, tales como antibióticos, antifúngicos, agentes antiinflamatorios, agentes quimioterápicos, etc. La administración puede tener lugar “en combinación con” uno o más agentes terapéuticos, e incluye administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
Para los propósitos de la presente invención, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de anticuerpo, antisuero o composición de la invención requerida para lograr una mejora apreciable en el estado, por ejemplo, una patología, de la enfermedad o afección que es el objeto del tratamiento.
En una realización preferida del método de tratamiento y/o prevención, el mismo se caracteriza porque las enfermedades autoinmunitarias se eligen de la lista que consiste en artritis autoinmunitaria, espondiloartritis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico y enfermedad inflamatoria intestinal, y más específicamente, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, no se pretende que la palabra “comprende” y sus variantes excluyan otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Para los expertos en la técnica, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán tanto de la descripción como del uso práctico de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Caracterización de los AcM anti-BAMBI(109-133) murino B101-37 y B143-14. A) Especificidad de los AcM anti-BAMBI B101-37 y B143-14 evaluada mediante inmunotransferencia de tipo Western en lisados de membranas celulares de corazón de ratones B6 normales y B6.BAMBI-KO. B) Reconocimiento de BAMBI humana por el AcM B101-37 evaluado mediante inmunotransferencia de tipo Western en lisados de membranas celulares de corazón humano. C) Secuencia de CDR de las cadenas pesadas y ligeras de los AcM B101-37 y B143-14. Se indica la recombinación VDJ y VJ de las cadenas pesadas y ligeras, respectivamente, de ambos AcM.
Figura 2: Inducción de la expresión de BAMBI en linfocitos T CD4+ murinos y humanos tras su activación. A) Análisis comparativo mediante citometría de flujo de la expresión de BAMBI en linfocitos T CD4+ de ratones B6 normales y B6.BAMBI-KO antes y 48 horas tras su activación in vitro con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en presencia o ausencia de TGFp o IL-2 (paneles superiores). En los paneles inferiores se compara la tinción con B101-37 de los linfocitos T CD4+ activados de ratones B6.BAMBI-KO con la del control de isotipo IgG1 en linfocitos T CD4+ activados en ratones normales. B) Inducción de BAMBI en linfocitos T humanos estimulados in vitro durante 48 horas con AcM anti-CD3 y anti-CD28. La expresión de BAMBI se analizó mediante inmunotransferencia de tipo Western en lisados de membrana plasmática. Como control de carga se comparó la expresión de N-Ras en los mismos lisados.
Figura 3: Efecto de la inhibición de BAMBI sobre la diferenciación in vitro de los linfocitos T CD4+ murinos y humanos a células Treg y TH17. A) Se estimularon células T CD4+CD25-CD62L+CD44- indiferenciadas de ratones B6 normales y BAMBI-KO durante 5 días con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en condiciones polarizantes de Treg (paneles superiores) o TH17 (paneles inferiores) en presencia del AcM B143-14 (IgM anti-BAMBI) o una IgM policlonal de ratón (Sigma). B) Se activaron in vitro linfocitos T CD4+ indiferenciados humanos, purificados mediante separación magnética, durante 10 días con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 conjugados con perlas en condiciones de diferenciación a TH0 y Treg y en presencia de AcM B143-14 (IgM anti-BAMBI) o una IgM policlonal de ratón. Se muestran los porcentajes de células CD4+FoxP3+ analizados mediante citometría de flujo en condiciones de diferenciación a TH0 (barras blancas) y condiciones de diferenciación a Treg (barras negras). C) Se activaron linfocitos T CD4+ humanos, purificados mediante separación magnética, durante 10 días con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 conjugados con perlas en condiciones de diferenciación a TH0 o TH17. Se muestra el efecto de la inhibición de BAMBI con el AcM B143-14 sobre la diferenciación a células TH17, ya sean productoras de IFNg o no, analizado mediante citometría de flujo. Las diferencias estadísticas se representan como: **p<0,01.
Figura 4: El AcM B101-37 inhibe el desarrollo de artritis en el modelo de CIA. A y B) Para la inducción de CIA, los ratones B10RIII normales fueron inmunizados con colágeno de tipo II bovino emulsionado en CFA. Los diferentes grupos experimentales recibieron tratamientos con 2 mg/ratón/semana, 0,3 mg/ratón/semana de B101-37 o con 2 mg/ratón/semana de una IgG1 murina irrelevante (IgG1-C) durante las primeras 4 semanas tras la inmunización. Se muestra el grado de gravedad clínica de cada ratón (A) y de distintas lesiones radiológicas (media ± DE) asociadas con la destrucción articular en la octava semana tras la inmunización (B). Como controles de los experimentos anteriormente mencionados, se comparó el desarrollo de CIA entre ratones B10RIII normales y BAMBI-KO. Se muestra la evolución de la gravedad clínica de la artritis en estos animales, expresada como media ± DE (C) y de distintas lesiones radiológicas (media ± DE) asociadas con la destrucción articular en la octava semana tras la inmunización (D). Las diferencias estadísticas se representan como: *p<0,05, **p<0,01.
Figura 5: Efecto del tratamiento con B101-37 sobre el desarrollo de artritis psoriásica inducida por inyección de
manano. A) Ratones B10RIII normales o BAMBI-KO tratados o no desde el inicio del experimento con el AcM B101-37 (2 mg/ratón/semana) recibieron una inyección i.p. de 10 mg de manano obtenido de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Se representa la evolución de la gravedad de la artritis y del porcentaje de aumento en el grosor de las orejas (media ± DE) en los diferentes grupos experimentales. B) Fotografías que muestran el aspecto macroscópico del pabellón auricular de los grupos experimentales descritos en (A). Las diferencias estadísticas se representan como: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Figura 6: Efecto terapéutico del tratamiento con B101-37 sobre el desarrollo de artritis psoriásica crónica. Ratones B10RIII normales recibieron una inyección semanal de 10 mg de manano (flechas blancas) y se trataron con el AcM B101-37 (2 mg/ratón/semana) desde el momento de la primera inyección de manano (B101-37 preventivo) o desde la aparición de los primeros signos de la enfermedad (B101-37 terapéutico) hasta el final del experimento (flechas negras). Como controles, se usaron ratones tratados con 2 mg/ratón/semana) de una IgG1 murina irrelevante (IgG1-C). Se muestra la evolución de la gravedad clínica de la artritis (panel superior) y del grosor de las orejas (panel inferior) como marcador de la gravedad de la psoriasis cutánea. Las diferencias estadísticas se representan como: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Figura 7: Efecto del tratamiento con B101-37 sobre el desarrollo de psoriasis inducida por imiquimod. Se aplicaron 12,5 mg de imiquimod (Aldara®) durante 6 días en las orejas derechas de los ratones B10RIII, deficientes o no en BAMBI. Los diferentes grupos experimentales se trataron desde el momento de la primera aplicación de imiquimod con una única dosis de 2 mg de B101-37 o de la IgG1 murina irrelevante (IgG1-C). A) Evolución de la gravedad clínica de las lesiones cutáneas, evaluando el aspecto y la gravedad del eritema, la descamación de la piel y el grosor de la oreja tratada en comparación con la oreja contralateral no tratada. B) Gravedad histológica de las lesiones cutáneas. Las fotografías superiores muestran ejemplos representativos (x10) de cortes histológicos de las orejas teñidos con hematoxilina y eosina. Los paneles inferiores muestran los valores del grosor de la epidermis (panel izquierdo) y de la dermis (panel derecho) en los diferentes animales de cada grupo experimental. Las diferencias estadísticas se representan como: *p<0,05, ***p<0,001.
Figura 8: Efecto terapéutico del tratamiento con B101-37 sobre el desarrollo de colitis inducida por DSS. Ratones B6 normales o BAMBI-KO tratados o no desde el inicio del experimento con el AcM B101-37 (2 mg/ratón/semana) recibieron DSS disuelto al 3 % en el agua del biberón durante 5 días. La gravedad de la colitis se evaluó mediante cuantificación del DAI (A) o analizando el acortamiento del colon (B). C) Mortalidad en los diferentes grupos experimentales. Las diferencias estadísticas se representan como: *p<0,05, **p<0,01.
Ejemplos
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que revelan la eficacia del producto de la invención.
MATERIAL Y MÉTODOS
Obtención y caracterización de los anticuerpos monoclonales anti-BAMBI murinos:
Se inmunizaron ratones B6.BAMBI-KO con el péptido BAMBI(109-133) murino conjugado con hemocianina de lapa californiana (KLH) y emulsionado en adyuvante completo de Freund (CFA). Los ratones se inmunizaron en dos ocasiones más (con un mes de diferencia entre cada inmunización) con el mismo péptido emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA). El péptido BAMBI(109-133) murino se localiza en la región extracelular de BAMBI y difiere de su homólogo humano en 4 aminoácidos (posiciones 8, 9, 10 y 23 de SEQ ID NO: 1). La presencia de anticuerpos circulantes anti-BAMBI(109-133) murinos en los ratones inmunizados se evaluó 15 días tras cada inmunización mediante ELISA. Los ratones con títulos más altos de estos anticuerpos se usaron para la obtención de los anticuerpos monoclonales (AcM) anti-BAMBI murinos. Para ello, suspensiones celulares de bazo se fusionaron con la línea celular de mieloma no secretor SP2/O-Ag14 tal como se ha descrito previamente (Yokoyama WM. et al. Curr Protoc Immunol. 2013, unidad 2.5). Los hibridomas productores de AcM anti-BAMBI humano se seleccionaron mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA). En la presente invención se han caracterizado dos de los AcM obtenidos; el clon B101-37 (IgG1, k anti-BAMBI) y el clon B143-14 (IgM, k anti-BAMBI). La especificidad de los AcM se evaluó posteriormente mediante inmunotransferencia de tipo Western en lisados de membranas celulares de corazón procedentes de ratones B6 normales y B6.BAMBI-KO y de muestras de miocardio humano obtenidas de biopsias quirúrgicas.
El ácido ribonucleico (ARN) de los AcM B101-37 y B143-14 se aisló mediante el kit comercial RNeasy Mini Kit (Qiagen). Para definir las secuencias codificantes para las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en la cadena pesada y ligera de ambos AcM, se realizaron RT-PCR a partir de los ARN purificados, tal como se ha descrito previamente (Wang Z. et al. J Immunol Methods. 2000, 233:167). Para definir la CDR de la cadena pesada de B101-37 se usaron los siguientes amplicones: amplicón 5' degenerado de la región FR1 de la cadena pesada: 5'-CTT CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC-3' (SEQ ID NO: 7); amplicón 3' de la región constante de IgG1: 5'-GGA AGA TCT ATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC-3' (SEQ ID NO: 8). Para definir la CDR de la cadena pesada de B143-14 se usaron el amplicón degenerado anteriormente mencionado de la región FR1 de la
cadena pesada y el amplicón 3' de la región constante de IgM: 5'-GGA AGA TCT GAC ATT TGG GAA GGA CTG ACT CTC-3' (s Eq ID NO: 9). Para definir la CDR de la cadena pesada de B101-37 y B143-14 se usaron los siguientes amplicones: amplicón degenerado de la región FR1 de la cadena ligera k: 5'-GG GAG CTC GAT ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA-3' (SEQ ID NO: 10); amplicón 3' de la región constante de la cadena ligera k : 5'-GGT GCA TGC GGA TAC AGT tGg TGC AGC ATC-3' (SEQ ID NO: 11). Posteriormente se secuenciaron los productos de PCR (STABVida, Caparica, Portugal) y se analizaron las secuencias mediante el programa IgBLAST.
Estudio de la expresión de BAMBI en linfocitos T CD4 murinos y humanos.
Se estudió mediante citometría de flujo la expresión of BAMBI en linfocitos T CD4+ de ratones B6 normales tras su estimulación usando AcM B101-37 biotinilado. Los linfocitos T CD4+ aislados del bazo de ratones B6 normales se estimularon in vitro durante 48 horas con anticuerpos anti-CD3 (1 |ig/pocillo) y anti-CD28 (0,5 |ig/pocillo) unidos a la placa en presencia o ausencia de 2 ng/ml of TGFp murino recombinante y/o 1 ng/ml of IL-2 murina recombinante (PeproTech, Londres). Como controles negativos se usaron células de bazo de ratones B6.BAMBI-KO estimuladas de la misma manera y coloreadas con B101-37 biotinilado y de ratones B6 normales coloreadas con un control de isotipo biotinilado. Las células coloreadas se analizaron en un citómetro FACSCanto II equipado con el software FACSDiva (BD Biosciences).
La expresión de BAMBI en células T CD4+ humanas tras su estimulación in vitro se analizó mediante inmunotransferencia de tipo Western. Dichos linfocitos se purificaron a partir de 50 ml de capas leucoplaquetarias procedentes de donantes sanos del Banco de Sangre y Tejidos de Cantabria (Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, Santander). Las células mononucleares obtenidas tras el gradiente de Ficoll se sometieron a una selección positiva tras el marcaje con AcM específico de CD4 conjugado con micropartículas magnéticas (MACS) usando un separador magnético (AutoMACS, Miltenyi Biotec). Posteriormente se estimularon in vitro los linfocitos T CD4+ durante 48 horas con anticuerpos anti-CD3 (1 |ig/pocillo) y anti-CD28 (0,5 |ig/pocillo) unidos a la placa de cultivo. Los lisados de membranas celulares de los linfocitos activados se obtuvieron tal como se describió anteriormente.
Cultivos de diferenciación in vitro de linfocitos T CD4+ murinos y humanos a células Treg y TH17.
La capacidad inhibidora de los AcM anti-BAMBI dirigidos contra el péptido BAMBI(109-133) se exploró in vitro en cultivos de linfocitos T CD4+ murinos y humanos diferenciados a células Treg y TH17. En estos experimentos se usó el AcM B143-14. En los experimentos con linfocitos murinos, se purificaron células CD4+ indiferenciadas (CD4+CD25-CD62L+CD44-) de los bazos de ratones B6 normales mediante clasificación celular (FACSAria, BD Biosciences). Se estimularon 5x105 células CD4+ indiferenciadas durante 5 días con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos al plástico de la placa de cultivo, en condiciones polarizantes de Treg (2 ng/ml de TGFp murino) o TH17 (1 ng/ml de TGFp murino y 10 ng/ml de IL-6 murina) en presencia de 20 |ig/ml de B143-14 o 20 |ig/ml de IgM murina (Sigma, St Louis, Missouri) como control de isotipo. Los porcentajes de linfocitos T CD4+FoxP3+ (Treg) y CD4+IL-17+ (TH17) al final del cultivo se analizaron mediante citometría de flujo, tal como se ha descrito previamente (Iglesias M. et al. Arthritis Rheum 2013, 65:343).
Se activaron in vitro linfocitos T CD4+ humanos indiferenciados (en la diferenciación a Treg) o linfocitos T de memoria CD45RO+ (en la diferenciación a TH17), purificados mediante separación magnética, durante 10 días con anticuerpos (Ac) anti-CD3 y anti-CD28 conjugados con perlas en condiciones de diferenciación a Treg (5 ng/ml de TGFp) o TH17 (20 ng/ml de IL-1 p, 30 ng/ml de IL-6, 30 ng/ml de IL-23, 3 ng/ml de TGFp1, 1 |ig/ml de anticuerpo anti-IFNy y 2,5 |ig/ml de anticuerpo anti-IL-4) en presencia de 20 |ig/ml B143-14 o 20 |ig/ml of IgM murina. Los porcentajes de linfocitos T CD4+FoxP3+ (Treg) y CD4+IL-17+ (TH17) al final del cultivo se analizaron mediante citometría de flujo.
Modelo experimental de artritis tras inmunización con colágeno de tipo II bovino emulsionado en CFA (CIA).
Grupos de 10 ratones B10RIII (MHC H-2r) deficientes o no en BAMBI se inmunizaron antes de la 12a semana de edad por vía intradérmica en la base de la cola con 150 |ig de colágeno de tipo II bovino (MD Biosciences, Zúrich) emulsionado (vol. 1/1) en CFA que contenía una concentración de Mycobacterium tuberculosis de 4 mg/ml (MD Biosciences), tal como se ha descrito previamente (Iglesias M. et al. Arthritis Rheum 2013, 65:343). Para estudiar el efecto de la inhibición de BAMBI sobre el desarrollo de CIA, los ratones B10RIII normales se trataron por vía intraperitoneal (i.p.) durante las primeras 4 semanas tras la inmunización con 2 ó 0,3 mg/semana de B101-37 o con 2 mg/semana de IgG1 anti-TNP usada como control de isotipo (IgG1-C). La evolución de la artritis se monitorizó semanalmente desde la 3a semana (fecha de comienzo de la artritis) hasta la octava semana tras la inmunización. La gravedad de la artritis se evaluó en cada una de las cuatro extremidades mediante el método descrito por Wooley et al. (Wooley PH. et al. J Immunol 1985, 135:2443). Así mismo, en la octava semana de la inmunización se evaluaron las lesiones articulares en las patas delanteras y traseras mediante radiología, tal como se ha descrito previamente (Iglesias M. et al. Arthritis Rheum 2013, 65:343).
Modelo experimental de colitis inducida por sulfato sódico de dextrano (colitis inducida por DSS).
Para la inducción de colitis, se disolvió DSS (MPbio.com) en agua al 3 %. Esta disolución (con cambios diarios del agua) se suministró en el biberón a los ratones de los diferentes grupos experimentales durante un periodo de tiempo variable [hasta que los ratones del grupo control alcanzaron un índice de actividad de la enfermedad (DAI) de entre 1,5-2 (aproximadamente 4-5 días)]. Diariamente se midió el agua consumida por cada grupo experimental y se evaluó el DAI calculando la puntuación clínica de los siguientes parámetros: A) pérdida de peso: 0 = no hay pérdida de peso, 1 = pérdida de peso del 1-5 %, 2 = pérdida de peso del 5-10 %, 3 = pérdida de peso del 10-20 % y 4 = pérdida de peso de más del 20 %; B) consistencia de las heces (se otorga el mismo valor a todos los animales que estén en la misma jaula): 0 = heces de consistencia normal, 2 = heces blandas y 4 = diarrea; C) sangrado rectal (se otorga el mismo valor a todos los animales que estén en la misma jaula): 0 = no hay sangrado, 2 = sangrado leve y 4 = sangrado intenso. El valor de DAI final se calculó sumando los valores de los diferentes parámetros y dividiéndolo entre 3.
Artritis psoriásica inducida por manano.
Para la inducción de síntomas agudos de artritis psoriásica, los grupos de ratones B10RIII deficientes o no en BAMBI recibieron una inyección i.p. de 10 mg de manano obtenido de la levadura S. cerevisiae (Sigma-Aldrich) disuelto en 200 |il de PBS (Khmaladze I. et al. Proc Natl Acad Sci USA 2014, 111:E3669). Adicionalmente, se indujo una forma crónica del proceso en ratones B10RIII no transgénicos mediante inyecciones repetidas de la misma dosis de manano una vez a la semana. Para estudiar el efecto del tratamiento con B101-37 sobre la prevención de artritis psoriásica, los ratones que recibieron una única inyección de manano se trataron desde el momento de la administración de manano (inducción de la enfermedad) con 2 mg/semana de B101-37 o con 2 mg/semana de IgG1 anti-TNP usada como IgG1-C. Para evaluar el efecto terapéutico del tratamiento con B101-37, los ratones B10RIII no transgénicos con la forma crónica de la enfermedad se trataron con 2 mg/semana de B101-37 (dividido en 3 dosis iguales cada dos días) desde el momento de la primera inyección de manano (tratamiento preventivo) o desde el momento en que se observaron los primeros signos clínicos del proceso (3 días después de la primera inyección de manano; tratamiento terapéutico) hasta el final del experimento. De nuevo, como controles, se analizaron ratones B10RIII no transgénicos tratados con IgG1 anti-TNP desde el momento de la aparición de los primeros signos de la enfermedad. Las lesiones psoriásicas se evaluaron a nivel de los pabellones auriculares cuantificando el grosor de los mismos con ayuda de un calibre digital. La gravedad de la artritis se evaluó en cada una de las cuatro patas, en una escala de 0-10 (intervalo total de 0-40) de la siguiente manera: inflamación grave de carpo/tarso = 5 puntos sumándose 1 punto adicional por cada dedo inflamado. Si la inflamación es leve = 3 puntos por carpo/tarso 0,5 puntos por cada dedo inflamado.
Modelo experimental de psoriasis cutánea inducida por imiquimod.
Para la inducción de psoriasis cutánea, se aplicaron por vía tópica 12,5 mg de imiquimod (Aldara®) durante 6 días en las orejas derechas de ratones B10RIII, deficientes o no en BAMBI. Los diferentes grupos experimentales se trataron en el momento de la primera aplicación de imiquimod con una única dosis de 2 mg de B101-37 o de IgG1 murina irrelevante. Diariamente se evaluaron el eritema, la descamación y el aumento del grosor de la oreja. El eritema y la descamación se evaluaron usando una puntuación clínica de 0 a 4 de la siguiente manera: ausencia = 0, leve = 1, moderado = 2, grave = 3, muy grave = 4. El aumento del grosor de la oreja tratada se calculó con la ayuda de un calibre digital en comparación con el grosor de la oreja no tratada de la siguiente manera: sin aumento = 0, aumento del 0,1-10 % = 1, aumento del 10,1-20 % = 2, aumento del 20,1-30 % = 3, aumento del 30,1-40 % = 4, aumento del 40,1-50 % = 5. Los animales se sacrificaron 24 horas tras la última aplicación de imiquimod y se recogieron muestras cutáneas para el estudio histológico. El grosor de la epidermis y la dermis en las muestras histológicas de las orejas tratadas con imiquimod se cuantificó en cada animal usando el programa ImageJ, en relación con los grosores respectivos de las muestras histológicas de las orejas contralaterales que no se trataron. Ejemplo 1: Caracterización molecular de AcM anti-BAMBI.
La especificidad de los AcM anti-BAMBI B101-37 y B143-14 se determinó inicialmente mediante ELISA (durante el procedimiento de cribado de hibridomas) y posteriormente mediante inmunotransferencia de tipo Western. Ambos AcM reconocen una banda de aproximadamente 27-29 kDa y otra de aproximadamente 54 kDa, compatibles con monómeros y dímeros de BAMBI resistentes a dodecilsulfato de sodio (SDS) y condiciones reductoras, tal como se ha descrito previamente (Xavier S et al. 2010 PLoS One 5:e12995) en lisados de ratones B6 pero no en los de ratones B6.BAMBI-KO (figura 1A).
Aunque el péptido BAMBI(109-133) murino usado para el desarrollo de AcM anti-BAMBI difiere de su homólogo humano en 4 aminoácidos, estudios mediante inmunotransferencia de tipo Western en lisados de membrana plasmática de miocardio indican que B101-37 también reconoce a BAMBI humana (figura 1B).
Posteriormente, se caracterizaron las CDR de las cadenas pesadas y ligeras de ambos AcM anti-BAMBI mediante secuenciación de ácido desoxirribonucleico (ADN) (SEQ ID No : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO; 6). La comparación de las secuencias de ADN con la base de datos IgBLAST indica que las CDR de las cadenas pesada y ligera del AcM B101-37 son el resultado del reordenamiento de los segmentos V9-3/D1-3/J1 y V15-103/J5,
respectivamente, mientas que las CDR de las cadenas pesada y ligera del AcM B143-14 son el resultado del reordenamiento de los segmentos V1-55/D4-1/J2 y V5-43/J1, respectivamente.
Ejemplo 2: Expresión de BAMBI en linfocitos T CD4+.
Los linfocitos T CD4+ desempeñan un papel fundamental en el desarrollo de patologías inflamatorias y autoinmunitarias. Por este motivo, se estudió la regulación de la expresión de BAMBI en esta población de linfocitos en ratones mediante citometría de flujo y posteriormente en humanos mediante inmunotransferencia de tipo Western, usando en ambos casos el AcM B101-37. En linfocitos T CD4+ indiferenciados murinos no se detectó la expresión de BAMBI, pero se indujo 48 horas tras su estimulación in vitro con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (figura 2A). Esta expresión aumentó tras la adición de TGFp, pero no de IL-2, a las células T CD4+ activadas (figura 2A). Como controles de especificidad del AcM B101-37, no se detectó marcaje en citometría de flujo ni en los linfocitos T CD4+ activados de ratones BAMBI-KO coloreados con B101-37 ni en los de los ratones B6 normales coloreados con IgG1 de control de isotipo, respectivamente (figura 2A, paneles inferiores).
Al igual que en el ratón, la expresión de BAMBI fue muy baja en los linfocitos CD4+ indiferenciados humanos, induciéndose tras su estimulación con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (figura 2B).
Ejemplo 3: La inhibición de BAMBI con el AcM anti-BAMBI(109-133) murino B143-14 altera la diferenciación in vitro de los linfocitos T CD4+ de ratón y humanos a los subtipos Treg y TH17.
En estudios previos se demostró que la ausencia de BAMBI en linfocitos T CD4+ de ratones BAMBI-KO potenciaba e inhibía su diferenciación in vitro a las poblaciones Treg y TH17, respectivamente (Postigo J et al. Tesis doctoral defendida el 19 de abril de 2013, Universidad de Cantabria). Para evaluar el efecto inhibidor de los AcM anti-BAMBI dirigidos contra el epítopo BAMBI(109-133) murino, se analizó la capacidad de B143-14 para alterar la diferenciación funcional de los linfocitos T CD4+ de ratones normales en el mismo sentido que lo observado en ratones BAMBI-KO. Para ello, se activaron in vitro linfocitos T CD4+ indiferenciados de ratones B6 normales y BAMBI-KO en condiciones polarizantes a células Treg o TH17, en presencia de AcM B143-14 o de una IgM murina usada como control de isotipo. Al igual que lo observado con los linfocitos de ratones BAMBI-KO, la inhibición de BAMBI tras la adición al cultivo de B143-14, pero no del control IgM, aumentó y redujo la diferenciación in vitro a Treg y TH17, respectivamente, de los linfocitos T CD4+ de ratones B6 normales (figura 3A).
Finalmente, se observó que, en presencia de AcM B143-14, pero no del control IgM, la diferenciación in vitro de linfocitos T CD4+ indiferenciados (a Treg) o linfocitos T de memoria (a Th17) humanos, activados en condiciones polarizantes a Treg (figura 3B) o TH17 (figura 3C) se altera en el mismo sentido que en el ratón: aumento de Treg y reducción de TH17.
Ejemplo 4: Efecto terapéutico del AcM B101-37 sobre el desarrollo de CIA, artritis psoriásica inducida por manano, psoriasis inducida por imiquimod y colitis inducida por DSS.
Los resultados anteriores indican que: 1) se dispone de AcM capaces de reconocer a BAMBI en ratones y humanos, 2) la expresión de BAMBI se induce en los linfocitos T CD4+ tras su activación tanto en ratones como en humanos; y 3) en ambas especies, la inhibición in vitro de BAMBI con un AcM anti-BAMBI(109-133) murino altera la diferenciación funcional de los linfocitos T CD4+ en el mismo sentido que lo descrito en ratones B6.BAMBI-KO (aumento de células Treg y reducción de TH17). Estos hallazgos plantean la posibilidad de que la inhibición in vivo de BAMBI tenga un efecto terapéutico sobre patologías inflamatorias/autoinmunitarias.
En la presente invención se ha caracterizado el potencial terapéutico de B101-37 en el desarrollo de CIA (el modelo experimental de artritis reumatoide más usado por la comunidad científica), artritis psoriásica inducida por manano, psoriasis inducida por imiquimod (el modelo experimental de psoriasis cutánea más usado por la comunidad científica) y colitis inducida por DSS.
Tanto desde el punto de vista clínico como radiológico, el tratamiento de los ratones B10RIII normales con 2 mg/semana de B101-37 durante las primeras 4 semanas tras la inmunización con colágeno de tipo II bovino inhibió el desarrollo de CIA en estos animales, a diferencia de lo observado en los ratones tratados con 0,3 mg/semana de B101-37 o con 2 mg/semana de IgG1-C (figuras 4A y 4B). La inhibición de CIA tras el tratamiento con la dosis alta de B101-37 fue similar a lo observado en los ratones B10RIII.BAMBI-KO inmunizados (figuras 4C y 4D).
Al igual que en el modelo de CIA, el tratamiento con 2 mg/semana de B101-37 desde el momento de la administración de manano a los ratones B10RIII normales redujo de forma muy significativa la gravedad de las lesiones articulares y cutáneas en este modelo experimental de artritis psoriásica aguda inducida tras una única inyección de manano, de forma similar a lo observado en los B10RIII.BAMBI-KO (figura 5).
Los resultados anteriores muestran un efecto preventivo del tratamiento con B101-37 sobre el desarrollo de lesiones cutáneas y articulares agudas tras la administración de una única inyección de manano. Posteriormente se analizó el potencial terapéutico de B101-37 en la variedad crónica de este modelo experimental. La figura 6 muestra que la
inyección de manano semanalmente a ratones B10RIII provoca la aparición de lesiones articulares y cutáneas que se mantienen a lo largo del tiempo. El tratamiento preventivo con 2 mg/semana de B101-37 (que comenzó en el momento de la inyección de manano y se mantuvo hasta el final del experimento) redujo significativamente la gravedad de dichas lesiones a lo largo del estudio (figura 6). Así mismo, se observó una reducción significativa, de forma similar a lo observado en el tratamiento preventivo, de las manifestaciones cutáneas y articulares tras el comienzo del tratamiento con B101-37 una vez que ya eran evidentes los primeros signos de la enfermedad (tres días tras la primera inyección de manano) (figura 6).
Se confirmó el potencial terapéutico de B101-37 en psoriasis en el modelo experimental de psoriasis cutánea más ampliamente usado por la comunidad científica, la psoriasis inducida por imiquimod. La aplicación tópica de imiquimod durante 6 días consecutivos a ratones B10RIII no transgénicos induce lesiones cutáneas con características histológicas de psoriasis (figura 7). A diferencia del modelo anterior, la administración de imiquimod no provoca el desarrollo de artritis. El tratamiento de ratones B10RIII no transgénicos con B101-37, desde el momento de la primera aplicación de imiquimod y con la misma dosis usada en los modelos anteriores, redujo significativamente la gravedad de la enfermedad desde el punto de vista clínico (figura 7A) e histológico (figura 7B), tal como se observa en ratones B10RIII.BAMBI-KO.
Finalmente, se analizó el efecto terapéutico de B101-37 en el modelo experimental de colitis inducida por DSS. Al igual que en los ratones B6.BAMBI-KO, los ratones B6 normales tratados con 2 mg/semana de B101-37 desde el momento de la administración de DSS desarrollaron una colitis significativamente menos grave que los controles no tratados (figura 8A). Sin embargo, el efecto protector del tratamiento con B101-37 en los ratones B6 no fue tan importante como el observado en los animales BAMBI-KO, especialmente en lo que respecta al grado de acortamiento del colon (figura 8A, panel derecho). Cabe destacar que, tanto en los animales B6 tratados con B101-37 como en los ratones BAMBI-KO, se previno completamente la mortalidad asociada con la colitis inducida por DSS (figura 8B).
Por tanto, la presente invención demuestra el uso de anticuerpos monoclonales contra BAMBI para el tratamiento y la prevención de enfermedades autoinmunitarias.
Claims (12)
1. Anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4.
3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.
4. Célula que expresa el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Uso in vitro del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la inhibición del inhibidor unido a la membrana de activina y BMP (BAMBI).
Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso como medicamento.
7. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades autoinmunitarias.
Anticuerpo para su uso según la reivindicación 7, en el que las enfermedades autoinmunitarias se seleccionan de la lista que consiste en: artritis autoinmunitaria, espondiloartritis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico y enfermedad inflamatoria intestinal, preferiblemente en el que la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
9. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
10. Uso in vitro del anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para el cribado de fármacos.
11. Kit y/o dispositivo que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
12. Uso in vitro del kit según la reivindicación 11, para la detección de la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
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