CN101948528B

CN101948528B - 一种来自斑蝥的纤溶活性蛋白及其制备方法和应用

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Publication number: CN101948528B
Application number: CN201010292971XA
Authority: CN
Inventors: 谭竹钧; 汪威; 韩雅莉; 吴艳玲
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2010-09-26
Filing date: 2010-09-26
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2030-09-26
Also published as: CN101948528A

Abstract

本发明公开了一种来自斑蝥的纤溶活性蛋白及其制备方法和应用，本发明从斑蝥中提取一种具有纤溶活性的单一组分蛋白，其分子量为95.5KD，易于纯化和批量制备，并且纤溶活性较强，比活高，无毒性；分子量小、抗原反应低，是较为理想的纤溶酶制剂原料，是理想的溶栓药物；本发明还公开了这种纤溶活性蛋白的制备方法，以及这种纤溶活性蛋白在制备治疗血液栓塞疾病的药物中的应用。

Description

一种来自斑蝥的纤溶活性蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其是斑蝥中纤溶活性蛋白的提取。本发明从斑蝥中提取一种具有纤溶活性的单一组分蛋白，并且涉及这种纤溶活性蛋白的制备方法，以及这种纤溶活性蛋白在制备治疗血液栓塞疾病的药物中的应用。

背景技术

斑蝥是芫菁科昆虫，我国在《神农本草经》《本草纲目》等著作中记载了它的应用。《神农本草经》记载斑蝥有大毒，归肝、胃、肾、大肠和小肠经，具有攻毒蚀疮，逐淤散结的功效。

目前，由于各种原因引起的血液栓塞疾病，如脑血栓、心肌梗塞、冠心病、肢体血管栓塞等的发病率呈上升趋势；仅我国每年用于防治和康复等方面的费用高达数千亿元人民币，此类疾病严重危害了患者的生存质量，增加了患者家庭及社会的负担。因而，针对此类疾病的临床用药的研究开发也进展迅速；临床上较为常用的治疗方法是突击性溶栓疗法，常见的药物有：尿激酶，降纤酶等。此类药物必须在患者发病后六小时内用药，药物通过激活纤溶酶原使之成为纤溶酶，后者裂解血栓中的纤维蛋白，使血栓溶解，血管再通，从而特效抢救急性心肌梗塞、脑梗塞等血栓性疾病的患者，显著降低病死率，提高患者病后的生活质量，避免因缺血造成的不可逆性的半暗带死亡，从而不给患者留下后遗症。这就要求溶栓物具有高效的溶解血栓的作用，同时无毒副作用。

目前，国内上市或在研的溶栓药物很多，从原料来源上，可分为四类：

基因重组产品：如重组链激酶、重组水蛭素、t-PA等。

生物工程产品：如葡激酶、纳豆激酶等。

生化药品：如尿激酶、降纤酶、蛇毒纤溶酶、蚓激酶等。

从药理学特点上，可分为三代：

第一代制剂如链激酶(SK)、尿激酶(UK)等，主要特点是引起全身纤溶活性提高而增加出血的危险，但费用较低，应用广泛。

第二代制剂如重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)、对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)和重组链激酶(r-SK)等，其主要特点是选择性溶栓，对全身纤溶活性影响较少，但其半衰期短，价格昂贵。如rt-PA能特异地溶解血栓而出现系统性纤溶状态，但它进入血浆后易与纤溶酶原激活剂抑制物(PAI)形成复合物而迅速失活，半衰期仅8min，故治疗剂量大，费用昂贵，且其颅内出血发生率比其他溶栓药高，限制了它的应用。

第三代溶栓药是指正在开发或研制的溶栓药。随着分子生物学技术和结构生物学的发展，t-PA的各个特定结构域与其各种生物学活性之间的关系得以阐明，结构域中的指形区(F)和Kringle2(K2)结构域与t-PA与纤溶蛋白的亲合力有关。EGF是含肝细胞膜识别t-PA的受体结构，与t-PA代谢有关；Lys296-His-Arg-Arg299带正电荷序列是t-PA与PAI相结合的位点。

因此，正在研发的第三代溶栓药绝大多数为t-PA变异体，如TNK-t-PA、Reteplase、Monteplase、Canoteplase等。它们都是根据t-PA构效关系，利用分子生物学技术对t-PA进行一系列结构改造，而得到的突变体。这些突变体许多性能都优于野生的t-PA，如半衰期延长了，有一定的抗PAI抑制作用，如改造而得的Reteplase其半衰期从8min延长到18min，已取得相当不错的进步，但与离理想的溶栓药还有较大的距离。因此，人们又把研究的热点转向其他来源的纤溶酶原激活剂上来，如纳豆激酶(NK)、吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(bat-PA)和蛇毒纤溶酶原激活剂等。

但至今仍未见到有关于斑蝥纤溶活性蛋白的相关报道，本发明涉及的纤溶蛋白是斑蝥体内一种单一组分蛋白，分子量在95.5kD，是一种新的纤溶蛋白，易于纯化和批量制备，并且纤溶活性较强，比活高，无毒性；分子量小、抗原反应低，是较为理想的纤溶酶制剂原料，是理想的溶栓药物。

发明内容

本发明旨在提供一种来自斑蝥的分子量为95.5kD的单一组分的纤溶活性蛋白。

本发明的另一个目的是提供一种上述纤溶活性蛋白的制备方法。

本发明的再一个目的是提供所述纤溶活性蛋白在制备治疗血液栓塞疾病的药物中的应用。

本发明的目的是这样实现的：

1)将干斑蝥剪碎，加入磷酸钠缓冲液，浸泡，磨碎，4℃浸提过夜；

2)离心去沉淀，分段盐析，取20％～80％部分沉淀，加少量磷酸钠缓冲液溶解，透析除盐，浓缩，得到粗提物；

3)将步骤2)得到的粗提物通过DEAE-32离子交换层析，用含有氯化钠的Tris-HCl缓冲液分段洗脱，收集活性蛋白峰，透析除盐，浓缩，冻干。

所述步骤1)以及步骤2)中的磷酸钠缓冲液其pH7.2，浓度为0.02mol/L。

所述步骤1)中干斑蝥重量与磷酸钠缓冲液体积之比为1∶10；浸泡时间为2h；磨碎方式为实验用组织破碎机或家用榨汁机磨碎。

所述步骤2)中磷酸钠缓冲液的加入量与步骤1)中磷酸钠缓冲液的加入量按体积之比为1～2∶100。

所述步骤2)分段盐析为在上清液中加固体硫酸铵达20％饱和度，8000转/分，4℃高速离心机中离心30min，收集上清液；再加入固体硫酸铵达80％饱和度，8000转/分，4℃高速离心机中离心30min，收集沉淀。

步骤2)以及步骤3)所述对纤溶组分浓缩是指聚乙二醇浓缩。

步骤3)所述离子交换层析是二乙氨基乙基-32纤维素离子交换柱，所述洗脱缓冲液是分别含有0.1、0.2、0.5mol/L氯化钠的0.02mol/LpH8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

步骤3)所述浓缩之前透析除盐是指用透析袋透析，冻干是指冷风吹干或冷冻干燥。

将粗提液过DEAE-32纤维素离子交换层析柱纯化，用含NaCl的Tris-HCl缓冲液分段洗脱，分部收集器收集，每管收集8.0mL，UV mini-1240型紫外可见分光光度计测OD280nm值。对各个蛋白质峰做纤溶检测实验，将纤溶活性峰组分收集并浓缩，得到纯品。

本发明的有益效果是：

本发明的斑蝥活性蛋白是斑蝥中的一种单一组分蛋白，分子量在95.5kD的一种新的纤溶活性蛋白，易于纯化和批量制备，并且纤溶活性强，比活高，无毒性；分子量小、抗原反应低，是较为理想的纤溶酶制剂原料，是理想的溶栓药物。

附图说明

图1：SDS-PAGE电泳测定纤溶活性蛋白分子量的图片。

具体实施方式

下面能过实施例详细说明本发明，但是这些实施例不在任何方面限制本发明的范围。实施例1：斑蝥纤溶活性蛋白的制备

材料：斑蝥(产地：中国)

制备：

1、粗提液的制备

称取10g斑蝥虫，剪碎，按1∶10(干重∶体积)的比例加入100mL预冷的0.02mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.4)浸泡2h后，研磨至糜状，4℃浸提过夜。将浸提液在8000转/分，4℃的高速离心机中离心15min，收集上清液，在上清液中加固体硫酸铵达20％饱和度，8000转/分，4℃的高速离心机中离心30min，收集上清液；再加入固体硫酸铵达80％饱和度，8000转/分，4℃的高速离心机中离心30min，收集沉淀用1～2mL的0.02mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.4)溶解后，用透析袋进行透析并用聚乙二醇浓缩，得到粗提液。

2、离子交换层析

预先用0.02mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-纤维素32离子交换层析柱，将粗提液用pH8.0Tris-HCl缓冲液平衡后吸入到层析柱中，用分别含0.1、0.2、0.5mol/L NaCl的0.02mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液各150ml进行分段洗脱，流速0.8mL/min，分部收集器收集，每管收集8.0mL，UV mini-1240型紫外可见分光光度计测OD280nm值，收集活性峰，透析浓缩，得到纯品。

3、电泳

将纯品做电泳，使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离胶浓度是12％。结果为一条蛋白带，证明其成分为一种单一蛋白，分子量为95.5KD(如附图所示)。此为本发明从斑蝥中提取的一种新的纤溶活性蛋白。

实施例2：本发明斑蝥纤溶活性蛋白生物活性的测定

纤溶活性的测定方法是本领域技术人员公知的。因纤溶平板法灵敏度高且既可定性又可定量，故本研究采用纤溶平板法，具体做法如下：

试剂：牛血纤维蛋白原溶液，浓度10mg/mL，牛血纤维蛋白原为Sigma公司产品；牛凝血酶，浓度100U/mL，牛凝血酶为Sigma公司产品；尿激酶，尿激酶为Sigma公司产品。

操作：

制备纤维蛋白平板，将0.1g琼脂糖溶于12mL磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.6)中，煮沸，于50℃水浴冷却保温，加入0.5mL纤维蛋白原溶液(10mg/ml)和20μL凝血酶(100u/ml)溶液，混匀后迅速倒入50℃预热的培养皿(直径9cm)中，于室温静置30min，制得纤维蛋白标准板，然后在琼脂平板上打孔(直径2.0mm)，各取5μl的上述过柱收集的3个峰的蛋白样品溶液以及纯化后的纤溶蛋白溶液(10mg/ml)，分别加入孔中，以5μl磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.6)为阴性对照，以5μl尿激酶(UK，100u/ml)为标准品，将纤维板置于37℃保温18h，测量溶圈的两个垂直直径，并减去孔径。以尿激酶为标准品，做纤溶活性标准曲线。计算样品的纤溶活性时将样品的纤溶圈大小对照标准曲线换算成国际标准活力单位即可。经检测，每毫克斑蝥纤溶活性蛋白相当于14.7国际标准活力单位。

实施例3：含有本发明纤溶活性蛋白的体外溶栓实验和溶血实验

体外溶栓实验以小鼠血栓为模型来判定本发明纤溶活性蛋白的体外溶栓效果；而溶血实验是考察注射剂用药安全的一个重要指标，以小鼠血为模型来判定本发明纤溶活性蛋白作为治疗血栓的注射剂用药是否会引起溶血反应；以上实验方法是本领域技术人员所公知的，操作简便，具有说服力，具体做法如下：

试剂：小鼠血(实验用小白鼠眼眶取血)；尿激酶，尿激酶为Sigma公司产品。

操作：

体外溶栓实验：取小鼠血1ml，待凝固后用生理盐水洗涤60分钟，烘干称重得W，将血凝块置于试管中。配制1mg/ml的斑蝥纤溶蛋白溶液，按表1加不同体积1mg/ml目的蛋白液和生理盐水，阴性对照组加等体积生理盐水，阳性对照组加尿激酶(5u/ml)，放入37℃培养箱中培养8h后取出，用生理盐水洗60min，烘干称重得G，按下列公式计算：血凝块的溶解率R(％)＝[(W-G)/W]×100％，结果如表1。

表1斑蝥纤溶蛋白体外溶栓实验

溶血实验：小鼠眼眶取血，搅拌去除纤维蛋白，2500rpm离心5min，去除上清液，用生理盐水洗涤，2500rpm离心10min，吸去上清液，余下细胞根据体积用生理盐水配成2％的红细胞悬液。将斑蝥纤溶蛋白冻干粉配成1mg/ml目的蛋白溶液。根据表2加不同体积1mg/ml目的蛋白液和生理盐水。37℃温浴3h，观察到实验组各试管中红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，阴性对照管无溶血和凝聚发生；阳性对照管上清液为红色，并伴有凝聚现象发生，说明阳性对照管中有溶血发生，结果如表2。

表2斑蝥纤溶蛋白溶血实验

注：“+”为溶血，“-”为无溶血

溶栓实验结果表明，含有本发明纤溶活性蛋白溶液具有溶栓作用，所有实验组溶血率均高与阴性对照组，且溶血率随目的蛋白浓度增大而升高，高浓度组溶栓效果接近阳性对照组；溶血实验结果表明，含有本发明纤溶活性蛋白溶液无溶血反应，符合作为治疗血栓疾病的注射剂药物的要求。

Claims

1.一种来自斑蝥的纤溶活性蛋白的制备方法，其特征在于该方法有如下步骤：

3)将步骤2)得到的粗提物通过DEAE-32离子交换层析，用含有氯化钠的Tris-HCl缓冲液分段洗脱，收集活性蛋白峰，透析除盐，浓缩，冻干；

所述步骤1)以及步骤2)中的磷酸钠缓冲液其pH7.2，浓度为0.02mol/L；

所述步骤1)中干斑蝥重量与磷酸钠缓冲液体积之比为1∶10；浸泡时间为2h；磨碎方式为实验用组织破碎机或家用榨汁机磨碎；

所述步骤2)中磷酸钠缓冲液的加入量与步骤1)中磷酸钠缓冲液的加入量按体积之比为1～2∶100；

所述步骤2)分段盐析为在上清液中加固体硫酸铵达20％饱和度，8000转/分，4℃高速离心机中离心30min，收集上清液；再加入固体硫酸铵达80％饱和度，8000转/分，4℃高速离心机中离心30min，收集沉淀；

2.根据权利要求1所述的纤溶活性蛋白的制备方法，其特征在于：步骤2)以及步骤3)所述对纤溶组分浓缩是指聚乙二醇浓缩。

3.根据权利要求1所述的纤溶活性蛋白的制备方法，其特征在于：步骤3)所述浓缩之前透析除盐是指用透析袋透析，冻干是指冷风吹干或冷冻干燥。

4.一种权利要求1所述的纤溶活性蛋白在制备治疗血液栓塞疾病的药物中的应用。