CN103396472B

CN103396472B - 一种具有溶栓活性的全蝎提取物

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Publication number: CN103396472B
Application number: CN201310252368.2A
Authority: CN
Inventors: 郭立玮; 付廷明; 田晓然; 刘峰; 张伟
Original assignee: SHAANXI BUCHANG PHARMACEUTICAL CO Ltd; Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: SHAANXI BUCHANG PHARMACEUTICAL CO Ltd; Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2033-06-24
Also published as: CN103396472A

Abstract

本发明提供一种具有溶栓活性的全蝎提取物，涉及中药分离领域。所述具有溶栓活性的全蝎提取物，为分子量在1000-1500Da的小分子肽的混合物，采用如下方法制备：（1）将全蝎药材用溶剂浸泡，粉碎后，离心取上清液；将所述上清液超滤，取截留液采用硫酸铵沉淀法得到粗蛋白；（2）将步骤（1）得到的粗蛋白采用酶水解得到酶解液；（3）将步骤（2）所述酶解液透过液依次经过阴离子交换层析、凝胶过滤层析和反相高效液相层析，取具有酰胺水解活性的洗脱液即得具有溶栓活性的全蝎提取物。本发明具有溶栓活性的全蝎提取物，具有较强的纤溶活性和抗凝血活性，去除了全蝎中大量的杂蛋白，活性成分的回收率高，纯化倍数高。

Description

一种具有溶栓活性的全蝎提取物

技术领域

本发明涉及中药分离领域，具体涉及具有溶栓活性的全蝎提取物。

背景技术

血栓性疾病严重影响着人类的健康和生命，是人类最主要的疾病之一。我国传统中医医书上记载着许多关于治疗血栓类疾病的药物。现代研究表明，从中药中提取的蛋白质治疗血栓性疾病，不容易出现免疫原性和过敏反应，减少副作用，如蚓激酶等。全蝎是钳蝎科动物东亚钳蝎Buthus martensii Karsch的干燥体，性辛，味平，有毒，具有归肝经，具有息风镇痉，攻毒散结，通络止痛的功效；主治“小儿惊风、抽搐痉挛、皮肤病、心脑血管病、炎症、乙肝、肿瘤”等病。若以全蝎粉末入药，存在着剂量大，易造成微生物污染等弊病。虽然，已经有人从全蝎中提取了活性成分，但是由于方法粗糙，提取物中存在着大量的杂质，易造成副作用、影响吸收及效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有溶栓活性的全蝎提取物，具有较强的纤溶活性和抗凝血活性，其提取方法去除了全蝎中大量的杂蛋白，活性成分的回收率高，纯化倍数高。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

具有溶栓活性的全蝎提取物，为分子量在1000-1500Da的小分子肽的混合物，采用如下方法制备：

（1）将全蝎用溶剂浸泡，粉碎，离心取上清液；将所述上清液超滤，取截留液采用硫酸铵沉淀法得到全蝎粗蛋白；

（2）将步骤（1）得到的全蝎粗蛋白采用酶水解得到酶解液；

（3）将步骤（2）所述酶解液依次经过阴离子交换层析、凝胶过滤层析和反相高效液相层析，取具有酰胺水解活性的洗脱液即得具有溶栓活性的全蝎提取物。

步骤（1）中所述超滤得到的截留液去除核酸后才用硫酸铵沉淀法得到全蝎粗蛋白。

所述截留液去除核酸的方法为：在截留液中加入聚乙烯亚胺，静置，离心取上清。

硫酸铵沉淀法具体为：在所述去除核酸的截留液中加入硫酸铵至饱和度为65%-75%，在0-4℃放置8-16h后，离心，取沉淀即得所述全蝎粗蛋白。

步骤（1）中所述超滤过程中超滤膜的截留分子量为5000-6000Da。

步骤（2）的具体方法为：将所述全蝎粗蛋白悬于人工胃液中，在36.5-37.5℃条件下水解4-6h后，离心取上清即得酶解液；所述人工胃液为：含有浓度为4000-8000U/ml的胃蛋白酶水溶液，pH为1.5-2.5。

所述阴离子交换层析中的介质DEAE-Sepharose FF。

所述凝胶过滤层析过程为：先采用Sephadex G-75凝胶过滤层析，然后采用Sephadex G-25凝胶过滤层析。

所述反相高效液相层析中使用的色谱柱为C18柱。

有益效果：

本发明具有溶栓活性的全蝎提取物，具有较强的纤溶活性和抗凝血活性，其提取方法去除了全蝎中大量的杂蛋白，得到的小肽分子量为1000-1500Da，活性成分的回收率高，纯化倍数高。

附图说明

图1 阴离子交换层析图谱。

图2 第一次Sephadex G-75凝胶层析图谱。

图3第二次Sephadex G-75凝胶层析图谱。

图4Sephadex G-25凝胶层析图谱。

图5 RP-HPLC层析图谱。

图6pH对全蝎提取物纤溶活性的影响。

图7温度对全蝎提取物纤溶活性的影响。

图8 纤维蛋白平板测定纤溶活性。

图9凝血酶对纤维蛋白原的降解产物的HPLC分析图谱。

图10全蝎提取物对纤维蛋白原降解产物的HPLC分析图谱。

图11全蝎提取物对纤维蛋白原的降解产物的SDS-PAGE凝胶电泳图谱，M泳道为蛋白Marker；1泳道为纤维蛋白原的三亚基，从上向下依次为Aα，Bβ，γ链；2-8泳道依次为纤维蛋白原分别降解5min，15min，30min，1h，2h，3h，4h的泳道。

具体实施方式

下述实施例中试剂的来源：聚乙烯亚胺（Alddin Chemistry Co.Ltd）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）；Tris碱、苯甲酞-DL-精氨酸-p-硝基酞替苯胺（BApNA）、苯甲磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）（国药集团化学试剂有限公司）；DEAE Sepharose FF(GE Healthcare)；Sephadex G-75, Sephadex G-25(Pharmacia)。

缓冲液A为20mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液，pH7.4。缓冲液B为含2.0 mol·L^-1 NaCl的缓冲液A。缓冲液C为含0.05 mol/L NaCl的缓冲液A。

酰胺水解活力测定方法：将BApNA用 20mM的Tris-HCI（PH7.5）溶解配成100μmol/L的底物缓冲液。取190μL底物缓冲液加入96孔板中，加入10μL待测液（以相同体积的生理盐水作为对照），在25°C孵育10min，测定其在405nm处测定吸光度值，以吸光度值每分钟增加0.001（DA/min=0.001）为1个酰胺水解活力单位。

活性多肽含量的测定方法：采用BCA蛋白浓度测定试剂盒。

实施例1全蝎提取物的制备

1.全蝎粗蛋白

全蝎药材若干，加水浸泡30min，湿法超微粉碎提取10min，提取液8000r/min离心10min后取上清液，过PES6000分子量超滤膜（截留分子量6000Da），用水洗涤截留液至其透过液中无小分子核酸类成分（HPLC法检测）。截留液加入核酸沉淀剂聚乙烯亚胺（PEI）（0.2mg/ml），放置1h后，12000r/min离心取上清，加入硫酸铵至其饱和度为70%，0-4℃放置过夜（12h），溶液8000r/min离心10min，取沉淀，得到全蝎粗蛋白。

2.酶解液

制备人工胃液：浓度为6000U/ml的胃蛋白酶水溶液，用1 mol/L盐酸调节pH至2.0。

将全蝎粗蛋白悬于20ml人工胃液中，放入37℃水浴摇床中振荡反应5h后，8000r/min离心10min，取上清液，置85℃水浴30min灭活胃蛋白酶即得到酶解液。

将酶解液冷冻干燥成冻干粉。将冻干粉溶于3ml、20mmol/L的Tris-HCl（pH7.4）中，0.45μm滤器过滤，留样1mL，测定总蛋白含量及酰胺水解活力。结果为：酶解液中总蛋白为962.18mg，其酰胺水解活力为181.85U，比活力0.189U/mg。

3.具有溶栓活性的全蝎提取物

（1）DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析

DEAE-Sepharose FF柱（2.5×20cm），用缓冲液A平衡洗脱。取酶解液2ml，上样，然后用缓冲液A、B进行线性洗脱。具体洗脱条件为：流速1ml·min^-1，洗脱时间140min；洗脱梯度：0～140min，缓冲液B 0～100% 线性升高，缓冲液A 100～0% 线性降低。每2ml洗脱液收集一管。测定各管洗脱液的酰胺水解活力。洗脱液OD₂₈₀吸收值及酰胺水解活力曲线如图1所示。将具有酰胺水解活力各管洗脱液（对应图1中第24-30管洗脱液）合并，得到洗脱液F-Ⅰ。洗脱液F-Ⅰ的酰胺水解活力为144.32U，比活力为2.74U/mg，回收率为79.4%，纯化倍数为14倍。

（2）脱盐

将截留分子量为1.0KD的透析袋剪成10cm段，用2%Na₂CO₃溶液煮沸10min，用蒸馏水彻底清洗。再用1mmol/L EDTA（pH8.0）溶液煮沸10min，蒸馏水洗净备用。将阴离子交换层析得到的具有酰胺水解活力的洗脱液用透析袋透析8h，透析溶液为缓冲液A，不断更换缓冲液，直至透析液与0.1 mol/L AgNO₃溶液作用无白色沉淀为止。将脱盐后的洗脱液制成冻干粉。

（3）第一次Sephadex G-75凝胶层析

Sephadex G-75柱（1.5×50cm）经缓冲液C平衡两个柱体积后。取步骤（2）所得冻干粉，用1ml缓冲液A溶解后，上样，用缓冲液C以流速为0.8ml·min^-1进行洗脱。洗脱5个柱体积，按照每2ml一管，收集洗脱液。测定每管洗脱液的酰胺水解活性，将有活性的洗脱液（对应图2中第24-31管洗脱液）汇集并编号为F-Ⅱ，如图2所示。将洗脱液F-Ⅱ冻干，其酰胺水解活力为122.48U，比活力为21.76 U/mg，回收率为67.35%，纯化倍数为115倍。

（4）第二次Sephadex G-75凝胶层析

由上述色谱结果分析，经过一次Sephadex G-75凝胶层析柱分离，具有酰胺水解活力的活性峰附近仍然有一部分峰存在，增加一倍的填料量，即1.5×100cm柱，进行第二次Sephadex G-75凝胶层析。将步骤（3）所得冻干粉溶解后上样，洗脱，具体方法同步骤（3）。从图3可以看出，样品实现了更细致的分离，收集具有酰胺水解活力的洗脱液（第19-30管洗脱液），合并得到洗脱液F-Ⅲ，制备成冻干粉，其酰胺水解活力为114.71U，比活力为83.13 U/mg，回收率为63.08%，纯化倍数为440倍。

（5）Sephadex G-25凝胶层析

Sephadex G-25柱（2.5×50cm）经缓冲液C平衡两个柱体积后，取步骤（4）所得冻干粉用1ml缓冲液A溶解，上样，用流速为1.0 ml·min^-1的缓冲液C洗脱，洗脱120ml ，按照每2ml一管收集洗脱液。测定每管的酰胺水解活性。将有酰胺水解活性的洗脱液（第24-32管洗脱液）汇集为F-Ⅳ，如图4所示。将洗脱液F-Ⅳ制成冻干粉，其酰胺水解活性为108.42U，比活力为162.88 U/mg，回收率为59.62%，纯化倍数为862倍。

（6）反相高效液相色谱层析（RP-HPLC层析）

流动相A:体积百分浓度为0.055%的三氟乙酸水溶液。

流动相B: 含有0.05%（体积百分浓度）三氟乙酸的乙腈溶液。

将步骤（3）所得冻干粉，溶解于含有0.05%乙腈的水溶液中，取10μL上样于洗脱平衡的Kromasil-C₁₈柱，用流动相A和B进行洗脱。洗脱程序为： 0-10min，5%B；10-20min，5%-15%B；20-30min，15%-55%B；30-35min，55%-5%B，洗脱流速为0.8 ml·min^-1。色谱图如图5所示。收集具有酰胺水解活性的洗脱液F-Ⅴ。多次上样，相同条件下制备具有酰胺水解活性的组分，即全蝎提取物。最终获得了酰胺水解活力为87.16U的全蝎提取物，比活力为346.97 U/mg，回收率为47.93%，纯化倍数为1836倍。分离纯化过程中的具体参数见表1。

表1 活性多肽分离纯化表

实施例2 全蝎提取物的性质

1. 全蝎提取物的成分鉴定

采用液相质谱联用(LC-MS/MS)对全蝎提取物进行检测，以确定其组分的分子量分布和范围。

全蝎提取物的分离在U3000液相色谱仪（美国戴安）上进行，waters symmetry C18反相柱（1.0mm*150mm），洗脱液为(0-45min,5%-55%乙腈;45-60min,80%乙腈), 检测波长为214nm。色谱分离后直接进入LTQ-静电场轨道肼钠离子源（赛默飞世尔，USA），配备waters Nanospray UPLC系统。MS/MS质谱检测操作在正离子模式，分析条件设定为从0-150min 60%缓冲液B的线性梯度，流速调节至200nl/min。

利用LTQ DataAnalysis 软件对质谱数据进行必要的处理，包括积分、背景去除、MS信号标记等。肽指纹图谱测定（PMF）法利用测得肽段的MS数据与蛋白质库中蛋白质肽片段理论分子量试匹配，通过Mascot搜寻软件(http://www.matrixscience.com)，进行蛋白库搜寻鉴定匹配率最高者即为鉴定蛋白质，搜索范围为节肢动物门(Arthropoda)、蛛形纲(Arachricla)、蝎目(Scorpionida)。

结果显示，全蝎提取物含有16种多肽成分。氨基酸组成为8-11个，分子量范围分布在1029-1434之间。16种多肽的具体序列及分子量如表2所示。

表2 16种多肽的序列及分子量

序列	相对分子质量（Da）
		CVYNYSRECM	1380.526
DLMTSSSCMQ	1158.436
		DSFMLPLEEG	1136.506
GTPDMAFSWM	1141.457
		GVCDSHCRGM	1177.443
INMRSEGMSM	1154.488
		IUFMVMPUUI	1356.342
MHTIAMAYCG	1153.472
		MKMYHSYH	1095.463
MMKPNPNCDD	1220.462
		MLNALNSLSE	1090.533
MTGCMQHNLY	1253.499
		PDWVGWASI	1029.492
VCDSHCRGMG	1177.443
		SYFDYNSSML	1225.496
YKHLDHEPFSY	1434.657

2. 全蝎提取物的基本性质

纤溶活性采用纤维蛋白平板法测定，具体方法见本实施例标题3中（2）。

（1）pH值对全蝎提取物活性的影响

将全蝎提取物，调节至不同的pH，以纤维蛋白平板法测定纤溶活性，对pH作图，发现其在pH2~7范围内活性最高，随着pH增大，逐渐失去了纤溶活性，见图6。

（2）温度对全蝎提取物活性的影响

取100μL全蝎提取物，在不同的温度保温30min，以纤维蛋白平板法测定纤溶活性，对温度作图，发现在20°C到100°C均有较高的纤溶活性，可见全蝎提取物对温度的变化并不敏感，尤其耐高温，见图7。

（3）抑制剂对全蝎提取物活性的影响

不同浓度的苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液和乙二胺四乙酸（EDTA）与等体积全蝎提取物混合，37°C保温15min，测定纤溶活力，以不加任何离子的一组作为对照组，酶活力设为100%。结果见表3。由表中可知，PMSF对多肽的活性有明显的抑制作用，EDTA对其活性影响较小。

表3抑制剂对多肽纤溶活性的影响

（4）金属离子对全蝎提取物活性的影响

分别取K⁺，Na⁺，Ca²⁺，Zn²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺ 各5mmol/L金属离子盐溶液与等体积全蝎提取物混合，37°C保温1h，测定纤溶活力，以不加任何离子的一组作为对照组，多肽活力设为100%。以上实验均重复3次。由表4看出，Ca²⁺对多肽的纤溶活性有一定的增强作用， Zn²⁺对其活性有一定抑制作用，其他金属离子对其作用不明显。

表4金属离子对多肽纤溶活性的影响

对照

K⁺

Na⁺

Ca²⁺

Zn²⁺

Cu²⁺

Fe³⁺

活性

100%±4.2

105.3%±1.3

104.1%±1.7

118.4%±2.1

86.4%±1.7

96.8%±2.3

98.3%±1.1

3全蝎提取物的纤溶活性

（1）凝血活性测定

取4×2ml Eppendorf管，每管加入1.0 ml 4 mg/ml纤维蛋白原液（溶剂为20mmol/L Tris-HCl pH 7.4缓冲液），试管置于37℃水浴中保温2min，然后加入实施例1所述全蝎粗蛋白的水溶液、酶解液、全蝎提取物及胰蛋白酶溶液（250U/ml）各0.1 ml，迅速摇匀，计时，至完全凝结（试管内液体不在流动），则定义为有凝血活性，不凝结则视为无凝血活性。

实验结果： 2min时，全蝎粗蛋白的水溶液并无凝血活性，酶解液、全蝎提取物均有凝血活性，这可能是由于酶解液、全蝎提取物迅速降解了纤维蛋白原的链端，形成侧链不交联的不稳定的纤维蛋白产物导致凝血。2h后，加入酶解液、全蝎提取物的管中，由原本凝固的状态慢慢溶解，由此推断，酶解液、全蝎提取物对生成的不稳定纤维蛋白也有一定的降解作用。胰蛋白酶管作为对照，现象与全蝎提取物管中一致。

（2）纤溶活性测定

采用纤维蛋白平板法测定全蝎提取物的纤溶活性。参考Astrup T,Mullertz S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,1952(40):346-351。

取4 mg/ml纤维蛋白原液（溶剂为20mmol/L Tris-HCl pH 7.4缓冲液）10ml，倒入灭菌过的培养皿(直径 90 mm)中，加入60μL 40 U/ml的凝血酶溶液，混匀，取放置室温的1%琼脂溶液5ml加入培养皿，打旋混匀静置，形成凝胶后，即成“标准平板”。将标准平板于 85℃温箱中加热 30min 后取出即成“加热平板”。

同时在标准平板和加热平板上点样，因为纤维蛋白原试剂中含有少量血浆纤溶酶原，若标准平板有纤溶活性而加热平板无纤溶，可初步确定样品有纤溶酶原激活剂作用。在平板上打直径 6mm的小孔，每孔加80μL全蝎提取物，置37℃保温18h，取出观察结果。胰蛋白酶（125.0U/ml）为阳性对照组，生理盐水为阴性对照。

由图8可以看出，无论在标准平板还是加热平板上，全蝎提取物均有活性。根据胰蛋白酶标准曲线（以胰蛋白酶浓度与溶圈直径对数所作的标准曲线），在标准平板上全蝎提取物的纤溶活性为158.2U/mg，在加热平板上为150.5 U/mg。由此推断，全蝎提取物并无明显纤溶酶原激活剂作用，之所以在平板上出现溶圈，很有可能与其能直接降解纤维蛋白有关。

（3）纤维蛋白原降解产物

取2×2ml Eppendorf管，每管加入1.0 ml 4 mg/ml纤维蛋白原液（溶剂为20mmol/L Tris-HCl pH 7.4缓冲液），试管置于37℃水浴中保温2min。一管中加入100μL的凝血酶（20U/ml）37 ℃水浴保温30min，12000r/min离心5min，取上清备用。另一管中加入100μL全蝎提取物，37 ℃水浴中保温30min，煮沸5min终止反应，离心取上清。将各上清液通过0.45μm微孔滤膜过滤后，注入高效液相系统进行分析。检测波长为214nm，流动相梯度条件为：5%-75%乙腈水溶液（含有0.05%三氟乙酸），流速为1ml/min。

图9是凝血酶对纤维蛋白原降解产物的高相液相图。从该图中可以看出，温浴30min后，纤维蛋白原可被凝血酶从N端切断Aα和Bβ链，释放出FPA（纤维蛋白肽A）和FPB（纤维蛋白肽B），侧链相交后生成纤维蛋白。图10是全蝎提取物对纤维蛋白原降解产物的高相液相图。根据图10中保留时间分析，并没有检测到FPA和FPB色谱峰，推测纤维蛋白原在与全蝎提取物共同温浴30min后，全蝎提取物可直接降解纤维蛋白原产生部分多肽片段但并没有释放出FPA或者FPB，由此推断该全蝎提取物可能具有类似纤溶酶的作用，可能是从纤维蛋白原C端裂解 Aα和Bβ链，并不产生FPA和FPB，但可以进一步的裂解纤维蛋白产物，发挥纤溶活性作用。

（4）纤维蛋白原降解过程

向Eppendorf管加入100μL、4 mg/ml的纤维蛋白原溶液（溶剂为20mmol/L Tris-HCI，pH7.4）和10μL全蝎提取物，混合后在37°C恒温水浴5min，15min，30min，1h，2h，3h，4h后，取样加入2xLoadingBuffer混匀，在沸水浴中变性5min，取出冷却后离心取上清进行SDS-PAGE电泳(SDS-PAGE浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%)。

由图11中看出，全蝎提取物对纤维蛋白原具有降解活性，且5min时三个亚基中Aα已经降解，Bβ开始降解，30min后Bβ也降解完全，两者降解为45.0KD和35.0KD左右的多肽链，γ链在2h时发生降解，3小时后，三条多肽链及其降解链均无法在图谱中显示。

从上述结果，可以推断全蝎提取物从纤维蛋白原C端裂解Aα或者Bβ链，并不产生FPA和FPB，但可进一步裂解纤维蛋白产物。在凝血活性测定中，全蝎提取物裂解纤维蛋白原产生纤维蛋白导致凝血，随后又降解纤维蛋白导致凝血溶解；其对纤维蛋白的降解作用主要表现在本实施例标题3中（2）实验，纤维蛋白原平板上出现了溶圈，同时在该实验中排除了全蝎提取物的纤溶酶原激活剂的可能性。

全蝎提取物对纤维蛋白原的降解活性的研究则清晰的显示，全蝎提取物对纤维蛋白原的降解过程。由此推断，全蝎提取物的纤溶机理主要为：对纤维蛋白原和纤维蛋白的双重降解作用。

发明人考察了大鼠口服全蝎提取物后，其血浆的TT/PT/APTT时间（TT为凝血酶时间， PT为凝血酶原时间， APTT为活化部分凝血酶时间）。结果证明全蝎提取物口服对大鼠凝血时间均有一定的延长作用。

Claims

1.具有溶栓活性的全蝎提取物，其特征在于：为分子量在1000-1500Da的小分子肽的混合物，采用如下方法制备

（1）将全蝎用溶剂浸泡，湿法超微粉碎提取，离心取上清液；将所述上清液超滤，取截留液采用硫酸铵沉淀法得到全蝎粗蛋白；

（2）将步骤（1）得到的全蝎粗蛋白采用酶水解得到酶解液；步骤（2）的具体方法为：将所述全蝎粗蛋白悬于人工胃液中，在36.5-37.5℃条件下水解4-6h后，离心取上清即得酶解液；所述人工胃液为：含有浓度为4000-8000U/ml的胃蛋白酶水溶液，pH为1.5-2.5；

（3）将步骤（2）所述酶解液依次经过阴离子交换层析、凝胶过滤层析和反相高效液相层析，取具有酰胺水解活性的洗脱液即得具有溶栓活性的全蝎提取物；所述阴离子交换层析中的介质DEAE-Sepharose FF；所述凝胶过滤层析过程为：先采用Sephadex G-75凝胶过滤层析，然后采用Sephadex G-25凝胶过滤层析；所述反相高效液相层析中使用的色谱柱为C18柱。

2.根据权利要求1所述具有溶栓活性的全蝎提取物，其特征在于：步骤（1）中所述超滤得到的截留液去除核酸后才用硫酸铵沉淀法得到全蝎粗蛋白。

3.根据权利要求2所述具有溶栓活性的全蝎提取物，其特征在于：所述截留液去除核酸的方法为：在截留液中加入聚乙烯亚胺，静置，离心取上清。

4.根据权利要求3所述具有溶栓活性的全蝎提取物，其特征在于：硫酸铵沉淀法具体为：在所述去除核酸的截留液中加入硫酸铵至饱和度为65%-75%，在0-4℃放置8-16h后，离心，取沉淀即得所述全蝎粗蛋白。

5.根据权利要求4所述具有溶栓活性的全蝎提取物，其特征在于：步骤（1）中所述超滤过程中超滤膜的截留分子量为5000-6000Da。