CN103205411B - 一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用 - Google Patents
一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103205411B CN103205411B CN201310142498.0A CN201310142498A CN103205411B CN 103205411 B CN103205411 B CN 103205411B CN 201310142498 A CN201310142498 A CN 201310142498A CN 103205411 B CN103205411 B CN 103205411B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sipunculus nudus
- product
- eluted product
- plasmin
- centrifugal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用。本发明提供了一种方格星虫纤溶酶的制备方法，包括如下步骤：1）将方格星虫的内脏与磷酸缓冲液混匀后匀浆，离心收集上清液A；2）向所述上清液A加入硫酸铵进行盐析，收集沉淀，即得到小分子方格星虫纤溶酶。本发明的实验证明，本发明提供的方法为从方格星虫中提取纤溶酶，且该纤溶酶的分子量为24917Da、等电点为3.211；与目前现有的纤溶酶相比，分子量小，更易于合成相关药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用。
背景技术
血栓性疾病(thrombotic disease，TD)危害心、脑、肺的血管系统，造成急性心肌梗塞、脑梗塞、脑血栓形成、肺动脉栓塞、肢体静脉血栓等疾病。目前临床上用于血栓预防和治疗的药物主要分为3类：抗血小板药物、抗凝药物和溶栓药物。现有溶栓药物还存在缺乏特异性、出血副作用强、药剂量难以控制、半衰期短、易出现再栓塞等问题。
方格星虫（Sipunculus nudus）是一种海洋底栖无脊椎动物，隶属于星虫动物门（Sipuncula），方格星虫纲（Sipunculida），星虫科，方格星虫属动物。生活在沿海滩涂一带沙泥底质的海域，涨潮时钻出，退潮时潜伏在沙泥洞中，俗称沙虫、光裸星虫、沙肠子。已报导的大约有300种隶属为全球分布种类，在我国沿海均有分布。星虫有较高药用功效和食疗价值。它性寒，味甘、咸，有滋阴降火、清肺补虚之功效。星虫体内富含多种活性物质，具有抗击疲劳、延缓衰老、增强免疫力、滋阴降火以及清肺化痰等功效。
国内外对方格星虫的研究主要集中在形态解剖学特征、繁殖生物学及生理生化等方面。关于星虫纤溶酶相关专利有李肖肖、雷丹青等从方格星虫中提取的纤溶酶（专利号：CN101892210A）其分子量在27-35kDa之间。牛荣丽、唐景财廖共山等从革囊星虫内脏中提取出具有激酶和直接溶解纤维蛋白活性的纤溶酶（专利号：CN102002488A）其分子量在28-32kDa之间。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种方格星虫纤溶酶。
本发明提供的方格星虫纤溶酶，为具有如下1）或2）特征的纤溶酶：1）其分子量为20KDa-25KDa；2）等电点为3.0-3.5。
上述方格星虫纤溶酶，为具有如下1）或2）特征的纤溶酶：1）其分子量为24917Da；2）等电点为3.211。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述方格星虫纤溶酶的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1）将离体的方格星虫内脏依次进行匀浆、盐析，收集盐析产物；
2）将所述盐析产物依次经离子交换柱层析和凝胶柱层析，得到方格星虫纤溶酶。
上述方法中，所述离子交换柱层析为阴离子交换柱层析；
所述阴离子交换柱层析为将所述盐析产物流经阴离子交换柱，用含0.1-1M NaCl的浓度为0.02M、pH值为7.8的Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，检测阴离子交换柱洗脱产物活性，收集具有活性的阴离子交换柱层析洗脱产物；所述线性洗脱的时间为20h，所述线性洗脱的流速为0.5mL/min；所述阴离子交换柱具体为DEAE-SepharoseFF，
所述凝胶柱层析为将所述阴离子交换柱洗脱产物流经葡聚糖凝胶柱，用浓度为0.02M、pH值为7.5的PBS缓冲液洗脱，检测葡聚糖凝胶柱洗脱产物活性，收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物；所述洗脱的时间为6h，所述洗脱的流速为1mL/min；所述葡聚糖凝胶柱具体为Sephadex G-50，
所述检测洗脱产物活性采用的方法具体为纤维素蛋白平板检测，若形成透明圈，则有活性。
上述收集具有活性的阴离子交换柱层析洗脱产物为每10min收集一管洗脱产物，收集第45-50管洗脱产物；
上述收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物为每10min收集一管洗脱产物，收集第18-22管洗脱产物。
上述方法中，步骤2）中，在所述离子交换柱层析步骤前，还包括将所述盐析产物溶解后透析除盐的步骤；所述溶解采用的pH值为7.5、浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液。
在所述阴离子交换柱层析中，在所述检测阴离子交换柱洗脱产物活性的步骤前还包括：将线性梯度洗脱的产物透析除盐的步骤；
在所述凝胶柱层析中，在收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物的步骤后还包括：将所述具有活性的凝胶柱层析洗脱产物透析除盐、干燥，得到方格星虫纤溶酶的步骤。
上述方法中，所述透析采用截留分子量为10kDa的透析袋。上述干燥为冷冻干燥。
上述方法中，步骤1），所述匀浆为将所述方格星虫的内脏与pH为7.5、浓度为0.02mol/L的磷酸缓冲液混匀后匀浆，离心收集上清液A；
所述盐析包括如下步骤：
A、向所述上清液A加入硫酸铵至质量百分含量为30%，混匀、静置、离心收集上清液B；
B、向所述上清液B中加入硫酸铵至质量百分含量为70%，混匀、静置、离心，收集沉淀，得到盐析产物。
上述方法中，所述方格星虫的内脏与所述磷酸缓冲液的配比为250g：1L；
所述匀浆在0-4℃条件下进行；所述匀浆具体在0℃条件下进行；
所述静置均为4-10℃静置2-8h，所述静置均具体为4℃静置2h；
所述离心均为在4-10℃、离心力为4000-8000g下离心10-30min；所述离心均具体为在4℃、离心力为5000g下离心10min。
由上述的方法制备得到的方格星虫纤溶酶也是本发明保护的范围，所述方格星虫纤溶酶分子量具体为24917Da、等电点具体为3.211。
上述的方格星虫纤溶酶在降解纤维蛋白原中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，本发明提供的方法，可以从方格星虫中提取纤溶酶，且该纤溶酶的分子量为24917Da、等电点为3.211；与目前现有的纤溶酶相比，分子量小，具有直接降解或通过激活纤溶酶原降解纤维蛋白原（血栓）的激酶活性，由于其具有更小的分子量，更容易进行蛋白表达，也更易于制备预防和治疗由血栓引起的相关疾病的药物。
附图说明
图1为SDS-PAGE测方格星虫纤溶酶SNF分子量
图2为MALDI-TOF/MS测方格星虫纤溶酶SNF分子量
图3为等点聚焦测定方格星虫纤溶酶SNF的等电点
图4为标准和加热琼脂糖纤维蛋白平板
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、方格星虫纤溶酶的制备
1、匀浆
取2kg活方格星虫（购买自厦门水产市场），洗净解剖，取250g内脏，加入1L pH7.5的0.02mol/L磷酸缓冲液（PBS）（PBS配方：NaCl1.169g、KCl0.2g、Na2HPO43.63g、KH2PO40.24g和水混合，调节pH值为pH7.5），冰浴匀浆（0℃），然后5000g，4℃离心10min，收集上清液A。
2、盐析
在上述上清液A中加入硫酸铵至其质量百分含量为30%，混匀后4℃静置2h，5000g，4℃离心10min收集上清液B；再向上清液B中加入硫酸铵至终浓度为70%（质量百分含量），混匀后4℃静置2h，5000g，4℃离心10min收集沉淀为盐析产物。
3、纯化
1）阴离子交换柱层析
向上述沉淀加入pH7.5、0.02mol/L的PBS缓冲液溶解，用截留分子量为10kDa的透析袋透析除盐，得到透析后产物。
将上述透析后产物经阴离子交换柱DEAE-Sepharose FF（上海宝曼生物科技有限公司，玻璃层析柱）进行线性梯度洗脱，洗脱缓冲液为含0.1-1M NaCl的0.02M，pH7.8的Tris-HCl缓冲液；洗脱时NaCl的初始浓度为0.1M，在20h（洗脱总时间）达到1M，流速为0.5mL/min，每10min收集一管，分光光度仪在280nm检测多肽特征吸收峰，合并第45-50管单个峰样品，再经截留分子量为10kDa的透析袋透析除盐，采用纤维素蛋白平板检测峰活性（方法可见实施例2所示），形成透明圈为活性峰，收集活性峰对应的样品。
2）凝胶柱层析
将上述活性峰对应的样品经葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50（GE HealthcareBioscience，货号：17-0043-01，玻璃层析柱）进行分离，以0.02M，pH7.5的PBS缓冲液洗脱，流速为1mL/min，每10min收集一管，洗脱总时间为6h；分光光度仪在280nm检测多肽特征吸收峰，合并第18-22管单个峰样品单个峰样品，采用纤维素蛋白的平板（方法可见实施例2所示）检测峰活性（若形成透明圈，则为活性峰。），收集活性峰对应的样品，（凝胶柱层析溶液盐浓度低可直接测活性）再将活性峰对应的样品经截留分子量为10kDa透析除盐后冷冻干燥，-20℃保存备用，得到纤溶酶SNF。
实施例2、方格星虫纤溶酶的鉴定
1、纤溶酶的分子量、等电点鉴定
1）Native-Page电泳检测
将实施例1得到的纤溶酶样品和2×样品溶解液（1.0%溴酚蓝0.5ml，Tris-HCl（0.5mol/L，pH6.8）2.5mL，50%甘油2.5mL）混合，用10%（m/V）分离胶，5%（m/V）浓缩胶的Native-Page检测，结果实施例1得到的纤溶酶为单一电泳条带的纤溶酶。
2）纤溶酶的酶纯度
将实施例1得到的纤溶酶样品和2×样品溶解液（10%SDS4.0mL，1.0%溴酚蓝0.5ml，Tris-HCl（0.5mol/L，pH6.8）2.5mL，50%甘油2.5mL，β-巯基乙醇1.0mL）混合，于100℃加热3min，使蛋白质变性，用12%（m/V）分离胶，5%（m/V）浓缩胶的SDS-PAGE进行酶纯度检测，结果如图1所示，为分子量约为25kDa的单一电泳条带（箭头所示）。
3）纤溶酶的分子量
酶解：将实施例1得到的纤溶酶放入Eppendorf管中，每管加入200-400μL100mmol/L NH4HCO3/30%ACN脱色，冻干后加入5μL2.5-10ng/μL测序级Trypsin(Promega)溶液（酶与被分析蛋白质质量比一般为1∶20-1∶100），37℃反应过夜，20小时左右；吸出酶解液，转移至新EP管中，原管加入100μL60%ACN/0.1%TFA,超声15分钟，合并前次溶液，冻干；用Ziptip（millipore）进行脱盐，得到脱盐产物。
再将上述脱盐产物与5mg/mLHCCA基质1:1混合后，用4800串联飞行时间质谱仪〔4800Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer)(Applied Biosystems，USA)进行质谱分析，测定纤溶酶的分子量。激光源为355nm波长的Nd:YAG激光器，加速电压为2kV。
结果如图2所示，实施例1得到的纤溶酶的大小为24917Da。
4）纤溶酶的等电点
采用等点聚焦测定（BIO-RAD公司PROTEAN IEF Cell）实施例1得到的纤溶酶的等电点，结果如图3所示，可以看出，实施例1得到的纤溶酶等电点为3.211。
2、方格星虫纤溶酶的活性鉴定
采用纤维蛋白平板法测定纤溶酶的酶活，具体方法如下：
在直径9cm的平皿中加入生理盐水配制的1mL的凝血酶（美国Sigma，T-4648，1000U，10U/mL），然后加入6mL0.5%（质量百分含量）的纤维蛋白原溶液（由溶质和溶剂组成；溶质为牛纤维蛋白原购自美国Sigma产品编号F8630，溶剂为0.02M，pH7.5的PBS缓冲液），再加入2%（质量百分含量）琼脂糖水溶液6mL，快速晃匀，室温（25℃）静置60min，得到纤维蛋白平板。制成的平板分两组，一组不加热，一组加热。加热的平板为在85℃加热30min（灭活纤维蛋白原中的纤溶酶原）。
用打孔器分别在两组平板上打直径3mm孔，分别加入10uL方格星虫纤溶酶SNF溶液（由实施例1得到的纤溶酶SNF溶解在0.02M，pH7.5的PBS缓冲液中，且纤溶酶SNF的蛋白浓度经BCA蛋白含量测定试剂盒检测为301.8ug/mL）入孔，37℃保温18h，用游标卡尺测量纤溶圈横纵直径，以尿激酶标准品为对照。
以尿激酶标准品（美国Sigma产品编号U0633）浓度为横坐标，不同浓度尿激酶溶圈横纵直径积为纵坐标作图（标曲函数式：Y=2.5892X-3.9728，R2=0.9959）。
纤溶酶的酶活力单位为将纤溶酶的横纵纤溶圈直径乘积按尿激酶标准曲线查出酶活力单位。
结果如图4所示。
采用BCA蛋白含量测定试剂盒进行纤溶酶的蛋白含量为301.8ug/mL（每ml方格星虫纤溶酶SNF溶液中蛋白含量）；
纤溶酶比活力为上述测定的酶活力单位与蛋白含量的比，纤溶酶（SNF）的比活力为13674U/mg蛋白。
上述结果进一步证明，实施例1得到的为纤溶酶。
Claims (10)
1.一种制备方格星虫纤溶酶的方法，包括如下步骤：
1)将离体的方格星虫内脏依次进行匀浆、盐析，收集盐析产物；
2)将所述盐析产物依次经离子交换柱层析和凝胶柱层析，得到方格星虫纤溶酶；所述离子交换柱层析为阴离子交换柱层析；
所述阴离子交换柱层析为将所述盐析产物流经阴离子交换柱，用含0.1-1M NaCl的浓度为0.02M、pH值为7.8的Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，检测阴离子交换柱洗脱产物活性，收集具有活性的阴离子交换柱层析洗脱产物；所述线性梯度洗脱的时间为20h，所述线性梯度洗脱的流速为0.5mL/min；
所述收集具有活性的阴离子交换柱层析洗脱产物为每10min收集一管洗脱产物，收集第45-50管洗脱产物；
所述凝胶柱层析为将所述阴离子交换柱洗脱产物流经葡聚糖凝胶柱，用浓度为0.02M、pH值为7.5的PBS缓冲液洗脱，检测葡聚糖凝胶柱洗脱产物活性，收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物；所述洗脱的时间为6h，所述洗脱的流速为1mL/min；
所述收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物为每10min收集一管洗脱产物，收集第18-22管洗脱产物；
所述阴离子交换柱为DEAE-Sepharose FF；所述葡聚糖凝胶柱为Sephadex G-50。
2.根据权利要求1所述的方法，包括如下步骤：所述检测洗脱产物活性采用的方法为纤维素蛋白平板检测。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤2)中，在所述离子交换柱层析步骤前，还包括将所述盐析产物透析除盐的步骤；
在所述阴离子交换柱层析中，在所述检测阴离子交换柱洗脱产物活性的步骤前还包括：将线性梯度洗脱的产物透析除盐的步骤；
在所述凝胶柱层析中，在收集具有活性的凝胶柱层析洗脱产物的步骤后还包括：将所述具有活性的凝胶柱层析洗脱产物透析除盐、干燥，得到方格星虫纤溶酶的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述透析采用截留分子量为10kDa的透析袋。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤1)，所述匀浆为将所述方格星虫的内脏与pH为7.5、浓度为0.02mol/L的磷酸缓冲液混匀后匀浆，离心收集上清液A；
所述盐析包括如下步骤：
A、向所述上清液A加入硫酸铵至质量百分含量为30％，混匀、静置、离心收集上清液B；
B、向所述上清液B中加入硫酸铵至质量百分含量为70％，混匀、静置、离心，收集沉淀，得到盐析产物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
所述方格星虫的内脏与所述磷酸缓冲液的配比为250g：1L；
所述匀浆在0-4℃条件下进行；
所述静置均为4-10℃静置2-8h；
所述离心均为在4-10℃、离心力为4000-8000g下离心10-30min。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
所述匀浆在0℃条件下进行；
所述静置均为4℃静置2h；
所述离心均为在4℃、离心力为5000g下离心10min。
8.由权利要求1-7任一所述的方法制备得到的方格星虫纤溶酶。
9.根据权利要求8所述的方格星虫纤溶酶，其特征在于：所述方格星虫纤溶酶分子量为24917Da、等电点为3.211。
10.权利要求8或9所述的方格星虫纤溶酶在降解纤维蛋白原中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310142498.0A CN103205411B (zh) | 2013-04-23 | 2013-04-23 | 一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310142498.0A CN103205411B (zh) | 2013-04-23 | 2013-04-23 | 一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103205411A CN103205411A (zh) | 2013-07-17 |
| CN103205411B true CN103205411B (zh) | 2014-11-05 |
Family
ID=48752817
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310142498.0A Expired - Fee Related CN103205411B (zh) | 2013-04-23 | 2013-04-23 | 一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103205411B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105861474B (zh) * | 2016-05-06 | 2020-10-30 | 南京中医药大学 | 具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶及其制备方法和应用 |
| CN106497950B (zh) * | 2016-11-08 | 2019-05-10 | 中国热带农业科学院海口实验站 | 一种方格星虫纤溶酶cDNA基因、重组纤溶酶及其应用 |
| CN110579614A (zh) * | 2019-10-30 | 2019-12-17 | 天津市宝坻区人民医院 | 消除纤维蛋白原干扰的化学发光法试剂盒配方 |
| CN116103270A (zh) * | 2023-02-14 | 2023-05-12 | 华侨大学 | 基于琼脂糖凝胶的星虫纤溶酶亲和纯化方法及其纤溶酶和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101892210A (zh) * | 2010-06-28 | 2010-11-24 | 广西医科大学 | 方格星虫纤溶酶及其制备方法 |
-
2013
- 2013-04-23 CN CN201310142498.0A patent/CN103205411B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101892210A (zh) * | 2010-06-28 | 2010-11-24 | 广西医科大学 | 方格星虫纤溶酶及其制备方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 低分子质量蚯蚓纤溶酶的获得及其活性研究;张汶婕 等;《药物生物技术》;20090630;第16卷(第6期);550-553 * |
| 光裸星虫提取物对血栓形成的影响;刘欣 等;《中国海洋药物》;20130415;第32卷(第2期);17-25 * |
| 刘欣 等.光裸星虫提取物对血栓形成的影响.《中国海洋药物》.2013,第32卷(第2期), * |
| 张汶婕 等.低分子质量蚯蚓纤溶酶的获得及其活性研究.《药物生物技术》.2009,第16卷(第6期), * |
| 方格星虫纤溶酶的分离纯化及其性质研究;李肖肖;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑 E057-73》;20110815(第8期);9-45 * |
| 李肖肖.方格星虫纤溶酶的分离纯化及其性质研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑 E057-73》.2011,(第8期), * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103205411A (zh) | 2013-07-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103205411B (zh) | 一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用 | |
| JP2651674B2 (ja) | 新規生理活性物質及びその製造方法 | |
| NO160114B (no) | Blanding for bruk ved ekstern paavisning og lokalisering av blodpropp. | |
| CN105111282A (zh) | 一种具有ace抑制活性的核桃肽及其制备方法 | |
| CN103509105A (zh) | 基于阴离子交换柱高效分离出高活性水蛭素的生产工艺 | |
| Ando et al. | Preparation of anti-lipolytic substance from Panax ginseng | |
| CN104530207A (zh) | 一种从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法 | |
| US4314994A (en) | Process for obtaining a plasminogen activator | |
| CN102924562A (zh) | 一种人凝血因子ⅷ的干热处理稳定剂及其用途 | |
| CN103630634B (zh) | 一种龟甲胶、鹿角胶及其制品的检测物及其检测方法 | |
| Yagi et al. | Bradykinin-degrading glycoprotein in Aloe arborescens var. natalensis | |
| CN103630619A (zh) | 一种龟甲胶及其制品的检测物及其质谱检测方法 | |
| CN1307198C (zh) | 眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素的分离纯化方法 | |
| CN105219825A (zh) | 一种蓝圆鯵抗氧化钙离子螯合肽的制备方法 | |
| CN105481976A (zh) | 一种制备人凝血因子viii的离子交换层析用洗涤缓冲液及其用途 | |
| Viscarello et al. | Purification of human leukocyte elastase and cathepsin G by chromatography on immobilized elastin | |
| CN103145800B (zh) | 蜈蚣酶解物抗血栓性多肽 | |
| CN104560924A (zh) | 一种鼠妇纤溶酶及其应用 | |
| CN105566482A (zh) | 一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺 | |
| CN103396472B (zh) | 一种具有溶栓活性的全蝎提取物 | |
| CN105688182A (zh) | 一种鹿瓜多肽注射制剂 | |
| CN103630623A (zh) | 一种龟甲胶及其制品的检测物及其检测方法 | |
| OTAWARA et al. | PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF CALCIUMBINDING PROTEIN CONTAINING γ-CARBOXYGLUTAMIC ACID FROM RAT BONE | |
| CN106011116A (zh) | 一种人凝血酶的制备方法 | |
| CN101948528B (zh) | 一种来自斑蝥的纤溶活性蛋白及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141105 Termination date: 20170423 |