CN107056881B - 一种地龙蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；2)加入无水乙醇，浸泡，离心，去除上清；3)加入高氯酸溶液，浸提，离心，抽取上清；4)加入活性炭，搅拌并静置，离心，抽取上清；5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5‑6，加入硫酸钠粉末，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；6)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris‑HCl缓冲液溶解，用DEAE‑Sephadex离子交换法纯化，收集洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。本发明制备方法简单、周期短，提取效果好、纯度高，得到的地龙蛋白可延长凝血酶时间，有效降低小鼠的BALF中EOS总数。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质提取领域。更具体地，涉及一种地龙蛋白的提取方法。
背景技术
地龙是重要的动物药材之一。地龙蛋白提取自地龙，含有胶原酶、纤溶酶、蚓激酶、核酸、微量元素等多种成分，其分子量在5000-10000，属于短链小分子物质。现代研究表明，地龙蛋白含有胶原酶、纤溶酶、核酸、微量元素等多种成分，对体内的凝血系统和纤溶系统具有广泛的影响，既可明显降低血小板黏附率，延长体内血栓形成和溶解体内血栓，又能增加脑血流量，减少脑血管阻力，还能提高红细胞变形能力，从而改善血液流变性和微循环障碍，其药用价值备受重视。但是由于地龙蛋白不稳定，易受酸、碱、离子强度、温度等的影响，因而传统的以水煎入药，影响了其药效的发挥。
因此，需要提供一种工艺简单、周期短、提取效果好、纯度高的地龙蛋白的提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种地龙蛋白的提取方法，该提取方法简单、周期短，地龙蛋白的提取效果好、纯度高。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：
1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；
2)加入3-4倍体积的无水乙醇，0-4℃浸泡16-24h，离心，去除上清；
3)加入浓度为0.05％-0.10％的高氯酸溶液，调节pH值到3.5-4.5，15-20℃浸提20-30min，离心，抽取上清；
4)加入活性炭，搅拌并静置，离心，抽取上清；
5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5-6，加入硫酸钠粉末，处理10-15min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；
6)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.4 20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。
进一步，所述活性炭的添加量为50-100mg/mL，静置5-10min。
进一步，所述加入硫酸钠粉末后使得硫酸钠的饱和度为40-55％。
进一步，步骤2)、3)、4)中所述的离心均为以8000-12000r/min的转速离心3-8min。
本发明中对不加入活性炭利用硫酸铵和硫酸钠沉淀和加入活性炭利用硫酸钠和硫酸铵沉淀制备得到的地龙蛋白的提取效果进行比较，结果表明，未加入活性炭时，硫酸铵进行沉淀的提取效果优于硫酸钠，但是加入活性炭后，硫酸钠进行沉淀的提取效果明显优于硫酸铵，说明当活性炭与硫酸钠结合使用能明显提高硫酸钠的沉淀效果，进而提高地龙蛋白的纯度和提取效果。
本发明的有益效果如下：
本发明制备方法简单、周期短、地龙蛋白质量高。本发明采用与现有技术不同的提取方法，在提取过程中减少了有机溶液的使用，降低了成本；利用低浓度的高氯酸进行提取，通过活性炭吸附小分子无机物和色素等物质，增强了硫酸钠的沉淀效果，明显提高了地龙蛋白的纯度、提取效率和活性。利用本发明制备方法得到的地龙蛋白可延长凝血酶时间，得率超过了25％，并能有效降低小鼠的BALF中EOS总数。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1一种地龙蛋白的提取方法
一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：
1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；
2)加入3倍体积的无水乙醇，0℃浸泡16h，以8000r/min的转速离心8min，去除上清；
3)加入浓度为0.05％的高氯酸溶液，调节pH值到3.5，15℃浸提20min，以8000r/min的转速离心8min，抽取上清；
4)每毫升上清液中加入50mg活性炭，搅拌并静置5min，以8000r/min的转速离心8min，抽取上清；
5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5，加入硫酸钠粉末使得硫酸钠的饱和度为40％，处理10min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；
6)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.4 20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。
实施例2一种地龙蛋白的提取方法
一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：
1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；
2)加入4倍体积的无水乙醇，4℃浸泡24h，以12000r/min的转速离心8min，去除上清；
3)加入浓度为0.1％的高氯酸溶液，调节pH值到4.5，20℃浸提30min，以12000r/min的转速离心8min，抽取上清；
4)每毫升上清液中加入100mg活性炭，搅拌并静置10min，以12000r/min的转速离心8min，抽取上清；
5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至6，加入硫酸钠粉末使得硫酸钠的饱和度为55％，处理15min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；
6)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.4 20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。
实施例3一种地龙蛋白的提取方法
一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：
1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；
2)加入3倍体积的无水乙醇，2℃浸泡20h，以10000r/min的转速离心5min，去除上清；
3)加入浓度为0.075％的高氯酸溶液，调节pH值到4.0，18℃浸提25min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；
4)每毫升上清液中加入75mg活性炭，搅拌并静置8min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；
5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5.5，加入硫酸钠粉末使得硫酸钠的饱和度为50％，处理12min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；
6)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.4 20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。
实施例4一种地龙蛋白的提取方法
一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：
1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；
2)加入3倍体积的无水乙醇，2℃浸泡20h，以10000r/min的转速离心5min，去除上清；
3)加入浓度为0.075％的高氯酸溶液，调节pH值到4.0，20℃浸提25min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；
4)每毫升上清液中加入60mg活性炭，搅拌并静置8min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；
5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5.5，加入硫酸钠粉末使得硫酸钠的饱和度为40％，处理12min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；
6)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.4 20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。
对比例1一种地龙蛋白的提取方法
一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：
1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；
2)加入3倍体积的无水乙醇，2℃浸泡20h，以10000r/min的转速离心5min，去除上清；
3)加入三氯乙酸溶液，调节pH值到4.0，20℃浸提25min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；
4)每毫升上清液中加入60mg活性炭，搅拌并静置8min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；
5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5.5，加入硫酸钠粉末使得硫酸钠的饱和度为40％，处理12min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；
6)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.4 20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。
对比例2一种地龙蛋白的提取方法
一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：
1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；
2)加入3倍体积的无水乙醇，2℃浸泡20h，以10000r/min的转速离心5min，去除上清；
3)加入浓度为0.075％的高氯酸溶液，调节pH值到4.0，20℃浸提25min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；
4)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5.5，加入硫酸钠粉末使得硫酸钠浓度达到40％饱和度，处理12min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；
5)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.4 20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。
对比例3一种地龙蛋白的提取方法
一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：
1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；
2)加入3倍体积的无水乙醇，2℃浸泡20h，以10000r/min的转速离心5min，去除上清；
3)加入浓度为0.075％的高氯酸溶液，调节pH值到4.0，20℃浸提25min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；
4)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5.5，加入硫酸铵粉末使得硫酸铵的饱和度为40％，处理12min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；
5)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.4 20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。
对比例4一种地龙蛋白的提取方法
一种地龙蛋白的提取方法，包括以下步骤：
1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；
2)加入3倍体积的无水乙醇，2℃浸泡20h，以10000r/min的转速离心5min，去除上清；
3)加入浓度为0.075％的高氯酸溶液，调节pH值到4.0，20℃浸提25min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；
4)每毫升上清液中加入60mg活性炭，搅拌并静置8min，以10000r/min的转速离心5min，抽取上清；
5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5.5，加入硫酸铵粉末使得硫酸铵的饱和度为40％，处理12min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；
6)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.4 20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。
试验例1对比实施例1-4和对比例1-4提取得到的地龙蛋白的提取效果：
1、试验方法
1.1凝血酶时间(TT)的测定
取凝血酶并用生理盐水溶解，然后取待测血浆0.2mL，37℃保持2-3min，加入溶解后的凝血酶0.2mL，将实施例1-4和对比例1-4得到的地龙蛋白等量加入到上述血浆中，摇匀，开始计时。每组实验重复5次。
1.2地龙蛋白得率的测定
参照《中国药典》2010年版一部附录ⅨH水分测定法测定活体地龙含水量。按照如下计算地龙蛋白得率：
蛋白得率＝最终得到的地龙蛋白总量/[活体地龙质量×(1-r)]
其中，式中r为鲜地龙的含水量
2、试验结果
凝血酶时间和得率如表1所示，从结果中可以看出：本发明实施例1-4制备得到的地龙蛋白相对于对比例1-4可明显延长凝血酶时间和提高得率。
对比例1相对于实施例4将高氯酸替换为了三氯乙酸，结果地龙蛋白的凝血酶时间缩短了54.7％，得率降低了53.2％，颜色较白，表明高氯酸相比于三氯乙酸可明显提高了地龙蛋白的提取效果。对比例2相对于实施例4没有加入活性炭，结果显示实施例4得到的地龙蛋白的凝血酶时间是对比例2的3.17倍，而得率无明显差异；对比例3中用硫酸铵替换了对比例2中的硫酸钠后，对比例3凝血酶时间和得率均有所提高，但是实施例4和对比例4均加入活性炭的前提下，区别在于对比例4用硫酸铵、实施例4用硫酸钠进行沉淀，结果显示：实施例4的得到的地龙蛋白的凝血酶时间是对比例4的1.65倍，得率也提高了90.0％。
比较实施例4和对比例2-4得到的地龙蛋白的颜色，实施例4和对比例4较对比例2和3白，表明活性炭的加入，虽然地龙蛋白的得率有所降低，但是明显提高了地龙蛋白的纯度，说明活性炭与硫酸钠共同作用，使得地龙蛋白的提取效率和纯度明显提高。
表1地龙蛋白的提取效率
试验例2对比实施例1-4和对比例1-4提取得到的地龙蛋白的治疗效果
1、试验方法
取健康小鼠50只，体重20g左右，随机分为10组，即治疗组8组(实施例1-4和对比例1-4)、对照组和模型组，每组5只。
对照组于第一天腹腔注射生理盐水1mL，2周后用生理盐水雾化激发30min，连续28天；治疗组和模型组于第一天腹腔注射10％卵蛋白(OVA)1ml致敏，2周后以1％OVA的浓度雾化激发30min，连续28天。治疗组每次激发前30min注射本发明实施例1-4和对比例1-4所制备的地龙蛋白1mL(用生理盐水溶解成100mg/mL)；对照组于每次激发前30min注射等量生理盐水。
末次激发后处死小鼠，行气管插管，在右主支气管处结扎右肺，用0.3mL冰PBS分3次灌洗左肺并回收支气管肺泡灌洗液(BALF)，采用Sysmex-XT2000i全血细胞分析仪分析BALF中嗜酸性粒细胞(EOS)计数。
2、试验结果
各组小鼠的BALF中EOS结果见表2，从表2中可以看出：实施例1-4的小鼠的BALF中EOS总数显著低于对比例1-4；通过实施例4与对比例1-4比较发现：实施例4组的降低效果明显优于对比例2、3、4组，且对比例4优于对比例3。以上结果说明高氯酸以及活性炭和硫酸钠协同作用可明显提高地龙蛋白的提取效果和蛋白活性，进而有效降低小鼠的BALF中EOS总数，实施例1-4制备的地龙蛋白对于与BALF中EOS总数有关的疾病具有较好治疗作用。
表2各组的EOS总数测定情况
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (2)
1.一种地龙蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取活体地龙，除杂，用液氮处理后进行粉碎；
2)加入3-4倍体积的无水乙醇，0-4℃浸泡16-24h，离心，去除上清；
3)加入浓度为0.05％-0.10％的高氯酸溶液，调节pH值到3.5-4.5，15-20℃浸提20-30min，离心，抽取上清；
4)加入活性炭，搅拌并静置，离心，抽取上清；所述活性炭的添加量为50-100mg/mL，静置5-10min；
5)用磷酸缓冲液调节上清液pH值至5-6，加入硫酸钠粉末，处理10-15min，沉淀，得到地龙蛋白粗提物；所述加入硫酸钠粉末后使得硫酸钠的饱和度为40-55％；
6)将地龙蛋白粗提物用pH7.2 20mM Tris-HCl缓冲液溶解，与DEAE-Sephadex离子交换介质接触，依次用含有0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8M的NaCl的pH8.4 20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集0.6M的洗脱成分，洗脱成分经透析、浓缩、冻干，即得。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤2)、3)、4)中所述的离心均为以8000-12000r/min的转速离心3-8min。
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