CN1569226A - 一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法 - Google Patents
一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1569226A CN1569226A CN 200410037695 CN200410037695A CN1569226A CN 1569226 A CN1569226 A CN 1569226A CN 200410037695 CN200410037695 CN 200410037695 CN 200410037695 A CN200410037695 A CN 200410037695A CN 1569226 A CN1569226 A CN 1569226A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hirudin
- buffer
- hirudo
- value
- lyophilized injectable
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明公开了一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法，其特征在于从鲜水蛭提取水蛭素，纯化后加或不加药用辅料，制备成水蛭素冻干粉针制剂；其特征还在于本制备方法不采用任何有机溶剂，采用超滤、离子交换柱层析、反渗透浓缩等方法纯化，得到纯度较高的水蛭素，加入或不加药用辅料制备成冻干粉针剂，药理实验结果表明，本发明冻干粉针剂具有很好的药理作用。
Description
所属技术领域
本发明属于中药制药技术领域，具体涉及一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法。
背景技术
水蛭是我国传统中药，1800年前《神农本草经》中就有记载。中医认为它有破血、逐瘀、通经的疗效，主要用于治疗瘕症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤。西方也常用水蛭吸血以治疗某些疾病。从水蛭及其唾液腺中已提取出多种活性成分，水蛭素是其中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65～66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。半致死剂量LD50＞50mg/kg，远大于治疗所用的剂量(1mg/kg)。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用。近几年，研究重组水蛭素的越来越多，但是，重组水蛭素与天然水蛭素相比存在两方面先天性的缺陷：一方面，重组水蛭素虽然在氨基酸序列和结构与天然水蛭素极其相似，但在63位酪氨酸残基上硫酸基的缺失，使重组水蛭素对凝血酶的抑制常数比天然水蛭素降低了90％；另一方面，一个重要的原因是水蛭素良好的药用效果不仅仅在于水蛭素的作用，还有水蛭唾液中的其它活性成分的参与作用共同形成的。这些是重组水蛭素与生俱来无法克服的先天缺陷，使其进行深入的开发应用加大了难度。
凝血酶是导致血栓的主要因素之一，而血栓的形成是导致心脑血管疾病的主要原因。心脑血管疾病是目前危害人类生命和健康的主要疾病之一，据世界卫生组织(WHO)统计，全世界每年大约有1700万人死于心脑血管病，即全球每3个死亡者中就有1个死于心脑血管疾病。预计到2020年，因心脑血管疾病死亡的的人数将比该数字增加50％，高达2500万人。我国60岁以上人口已超过一亿，这个年龄层次发病率每年在5％以上，即我国每年有500万人以上需用抗凝药物来防治和治疗心脑血管疾病，并且这类疾病已经向年轻化发展。若按1％人数计算，发病率的基数会更大。
专利申请号为03113566的专利公开了提取纯化水蛭素的方法，该方法是从活体水蛭的唾液分泌物中用丙酮提取水蛭素，再用柱层析法进行纯化，该方法在实际操作过程中因为运用有机溶剂使得环境要求特别高，并且只应用了阴离子交换柱层析(凝胶过滤柱层析只是分子筛的作用)进行纯化，杂质没有分离完全，水蛭素的纯度不高，也未见该专利关于水蛭素纯度的报道；申请号为95117701的专利公开了采用亲合色谱法纯化水蛭素，但在实际应用过程中，只适用于实验室，不能进一步中试放大和生产，不利于产业化推广。
发明内容
基于上述原因，本发明采用水为溶剂提取水蛭素，不使用任何有机溶剂，采用超滤法、阴离子交换和阳离子交换柱层析法进行除杂，再用反渗透膜技术除去提取过程产生的盐类物质，使水蛭素的纯度大大提高，同时疗效得到了显著的提高。
一.工艺制法
(1)水蛭素冻干粉针剂的处方组成为：
处方1：水蛭素4.5-9.5重量份。
处方2：水蛭素为4.5-9.5重量份，冻干赋形剂为90.5-95.5重量份。
(2)水蛭，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机或胶体磨制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用连续冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液；将上清液用截留分子量为8000-10000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3-1/2时，加水至原体积，反复操作3-5次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.05-1.10(20℃)的溶液；将浓缩的透过液用缓冲液调PH值为5.0-7.0，离子强度为0.01mol/l通过阳离子交换柱，收集串柱液，用缓冲液调pH至7.0-8.0后，导入阴离子凝胶柱，进样结束后，洗4-6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为5.0-7.0，通过阴离子交换柱，分别用PH值为7.3-7.5、7.1-7.3的缓冲液各洗1倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为7.1-7.3的缓冲液加入0.01mol/l的氯化钠的溶液进行洗脱，在紫外检测下，自动收集具有抗凝血酶活性部分的洗脱液，至紫外检测器检测不到吸收为止；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，或用凝胶柱脱盐并进一步纯化，得到水蛭素半成品；
(3)将水蛭素半成品直接分装于西林瓶中冻干，或加入冻干赋形剂混匀溶解后，分装到西林瓶中，经冷冻干燥，轧盖，得到水蛭素冻干粉针剂。
用于本发明提取水蛭素的水蛭品种为蚂蝗(Whitmania Pigra whitman)、亚洲水牛蛭(菲牛蛭)、日本医蛭(Hirudo nipponica Whitman)、柳叶蚂蝗(Wh.acranulatcWhitman)、欧洲医用水蛭、印度水蛭中的任何一种。
二.检测分析
采用高效液相色谱法对水蛭素进行检测。
1.实验仪器：waters600E型高效液相色谱仪，996PDA检测器，色谱柱：日本TOSOHTSK2000SW 7.5*300
2.实验药物：水蛭素样品为本发明工艺制备的水蛭素(北京乾露春科技有限公司实验室提供)
2.色谱条件：工作站：millennium chromatogvaph
波长：260nm
流动相：0.01mol/L、PH值7.2的磷酸缓冲溶液(配制方法按照中
国生物制品主要原辅材料质控标准2000年版，中国生物制品标准
委员会编，化学工业出版社，P13-14配置)。
3.样品制备：取样品，用多肽纯化离心管，进行离心分离，取离心液体即为样品。
4.上样：取上述处理的样品用微量注射器吸取定量液体，注入进样器进行检测。
5.结果：经过计算水蛭素的纯度为91.89％。见说明书附图。
三.药理实施例
实施例一
水蛭素比活的检测
1.实验原理：天然水蛭素的活性检测国家尚未公布标准的检测方法，根据凝血酶活性的检测方法(中国生物制品规程2000年版附录1)，依据水蛭素与凝血酶是1∶1的比例结合，消耗一个凝血酶单位，相等于一个抗凝血单位(ATU)的原则，采用试管法(连续稀释法)检测水蛭素的抗凝血单位的效价。
2.实验材料：5g/L纤维蛋白原的生理盐水溶液，注射用生理盐水(北京乾露春科技有限公司实验室提供)
冷冻干燥凝血酶(安徽桑原生物技术研究所购买，每瓶含量为500IU，用时用生理盐水稀释至每毫升含凝血酶0.5IU)
3.待测样品：水蛭素样品为本发明工艺制备的水蛭素(北京乾露春科技有限公司实验室提供)
4.检测方法：取10×80mm试管8支，在每支试管中加入生理盐水0.2ml(第一管不加)，于第一管中加入待测样品0.2ml；第二管中加入0.2ml，充分混匀后吸取0.2ml加入第三管，以次例推，直至加到第7管，将多余的0.2 ml混合液废弃，此时各试管都为0.2ml，但浓度依次为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，第8管因不含水蛭素，作为试验对照，加样结束后，放到37℃水浴使样品与凝血酶作用5-10min，再于各试管中加入5g/l纤维蛋白原溶液0.2ml，再放入37℃水浴，观察记录1-24小时结果，并进行计算。计算方法为：发生凝固或沉淀的试管为无抗凝血酶活性(阴性)，不凝固或无沉淀产生的试管为具有抗凝血酶活性。
5.比活性计算 采用中国生物制品规程(一部)微量法，用BCATM Protein Assay测定分离组分的蛋白质含量，根据抗凝血酶活性测定结果计算每毫克蛋白质的抗凝血酶比活性。根据实验发现，天然水蛭素体外测定结果与体内测定结果有正相关性。
6.结果：经过计算本发明的水蛭素的比活为133IU/mg.
7.说明：
(1)由于目前文献报导中对于水蛭素的效价大部分应用检测仪器进行检测，以5分钟为判定终点。我们的研究发现，5分钟测定有抗凝活性，但30分钟至4小时仍可能发生凝固，一般4小时后不凝固，至24小时仍能保持抗凝血酶活性.因此本发明的检测结果是以37℃、24小时结果为准。
(2)研究表明24小时的检测结果1IU/mg相当于仪器检测5分钟检测结果80IU/mg.
实施例二
利用血栓法测定对大白鼠血栓形成的影响。
1.实验药物：生理盐水(空白组)由北京乾露春科技有限公司实验室提供。
水蛭注射液(吉林省药物研究所提供)
本发明水蛭素冻干粉针剂(北京乾露春科技有限公司实验室提供)
2.实验动物：体重300-400克的大白鼠30只，雌雄不分。分成三组，每组10只。
3.实验方法：将大白鼠麻醉(戊巴比妥钠30-40mg/kg，ip)，仰卧位固定，分离气管，插入一塑料套管，并分离右颈总动脉及左颈外静脉，在聚乙烯管的中段放入一根长6厘米的丝线，以肝素生理盐水溶液，充满聚乙烯管，当聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后，由聚乙烯管准确的注入肝素抗凝，然后再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹，血液从右颈总动脉流至聚乙烯管，返回左颈外静脉，开放血流15分钟后断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重量即得血栓重量。将空白组和另外两组给药组的动物血栓湿重进行记录，进行计算，如表1所示：
表1各给药组的血栓重量
| 空白组mg | 水蛭注射液mg | 本发明水蛭素冻干粉mg | |
| 血栓湿重 | 33.89±0.72 | 20.14±0.69** | 13.75±0.08**[*] |
与空白组比较**P＜0.01，与阳性对照组比较[*]P＜0.05
结论：药理实验中结果表明，本发明水蛭素冻干粉针剂、水蛭注射液与空白组比较都有极显著差异(P＜0.01)，本发明水蛭素冻干粉针剂与水蛭注射液比较有显著差异(P＜0.05)。
实施例三
对小鼠ADP诱导的血栓性死亡的影响
药品：本发明冻干粉针剂(北京乾露春科技有限公司实验室提供)
市售银杏达莫注射液(南京金陵制药股份有限公司生产，购自北京白塔寺医药批发公司)
生理盐水(北京乾露春科技有限公司实验室提供)
方法：取健康小鼠60只，雌雄各半，随机分成3组：生理盐水组、本发明冻干粉针剂组、市售银杏达莫注射液组每日尾静脉给药，连续7d，于末次给药后1h尾静脉注射ADP48.0mL/kg，记录动物死亡情况。见表2：
表2各组制剂对小鼠ADP诱导的血栓性死亡的影响比较
| 组别 | 总数/只 | 死亡数/只 | 死亡率 |
| 生理盐水组 | 15 | 15 | 100％ |
| 售银杏达莫注射液组 | 15 | 11 | 73.3％** |
| 本发明冻干粉针剂组 | 15 | 6 | 40.0％**[*] |
与空白组比较**P＜0.01，与阳性对照组比较[*]P＜0.05
结论：通过以上药理实验表明，本发明的中药冻干粉针剂具有很好的溶栓作用，对血栓具有较强溶解作用，与市售同类品种比较具有更强的药理作用。
实施例四
利用在体心肌梗死法测定本发明水蛭素冻干粉针剂和水蛭素注射液对大白鼠心肌梗死情况的影响。
1.实验药物：水蛭注射液(吉林省药物研究所提供)
本发明水蛭素冻干粉针剂(北京乾露春科技有限公司实验室提供)
2.实验动物：雄性大鼠250-300克20只，分成两组。
3.实验方法：取雄性大鼠20只，乌拉坦0.65g/kg腹腔浅麻醉后，背位固定，用大半个橡皮球连接到人工呼吸机，进行人工呼吸，大鼠胸部去毛、消毒，沿左锁骨中线切开皮肤约2厘米，在第四或第五肋间钝性分离基层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处节扎左冠脉后，把心脏放回胸腔，迅速缝合胸腔，停止人工呼吸，分别用两种制剂对10只大鼠进行实验，得到数据计算如表3所示：
表3两组制剂的药理学比较
| 组别 | 显效率 | 有效率 | 无效率 | 总有效率 |
| 水蛭注射液 | 18.3％ | 54.0％ | 27.7％ | 72.3％ |
| 本发明水蛭素冻干粉针剂** | 34.1％ | 58.2％ | 7.7％ | 92.3％ |
**P＜0.01
结论：从实验我们可以得知，本发明本发明水蛭素冻干粉针剂与水蛭注射液相比较具有更好的药理作用。
四.制备实施例
实施例1
(1)取蚂蝗(Whitmania Pigra whitman)5.3公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为8000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3时，加水至原体积，反复操作3次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.05(20℃)的溶液；将浓缩的透过液用磷酸盐缓冲液调PH值为5.0，离子强度为0.01mol/l，以5ml/min通过CM-交联葡聚糖的阳离子交换柱，用缓冲液洗4倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为5.0，以5ml/min通过DEAE-交联葡聚糖的阴离子交换柱，分别用PH值为7.3、7.1的缓冲液各洗1倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为7.1的缓冲液加入0.01mol/l的氯化钠进行洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，得到水蛭素原料(其中含水蛭素为4.5克)；
(2)水蛭素冻干粉针剂的处方组成为：
水蛭素为4.5克，冻干赋形剂甘露醇为95.5克。
(3)将水蛭素与冻干赋形剂混匀，用注射用水溶解，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，得到水蛭素冻干粉针剂1000支。
实施例2
(1)取日本医蛭(Hirudo nipponica Whitman)11.2公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为10000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作5次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.10(20℃)的溶液；将浓缩的透过液用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCL)调PH值为7.0，离子强度为0.01mol/l，以8ml/min通过CM-琼脂糖的阳离子交换柱，用缓冲液洗6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为7.0，以8ml/min通过阴离子交换柱，分别用PH值为7.5、7.3的缓冲液各洗1倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为7.3的缓冲液加入0.01mol/l的氯化钠进行洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，得到水蛭素原料(其中含水蛭素为9.5克)；
(2)水蛭素冻干粉针剂的处方组成为：
水蛭素为9.5克，冻干赋形剂为90.5克。
(3)将水蛭素和冻干赋形剂混合，用注射用水溶解后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到水蛭素冻干粉针剂1000支。
实施例3
(1)取柳叶蚂蝗(Wh.acranulatc Whitman)5.9公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为9000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作4次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.06(20℃)的溶液；将浓缩的透过液用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCL)调PH值为5.5，离子强度为0.01mol/l，以6ml/min通过CM-纤维素的阳离子交换柱，用缓冲液洗5倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为5.5，以6ml/min通过DEAE-纤维素的阴离子交换柱，分别用PH值为7.4、7.2的缓冲液各洗1倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为7.2的缓冲液加入0.01mol/l的氯化钠进行洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，得到水蛭素原料(其中含水蛭素为5.0克)；
(2)水蛭素冻干粉针剂的处方组成为：
水蛭素为5.0克，冻干赋形剂为95.0克。
(3)将水蛭素与冻干赋形剂混匀，用注射用水溶解，分装到西林瓶中，冷冻干燥，轧盖，得到水蛭素冻干粉针剂1000支。
实施例4
(1)取欧洲医用水蛭6.5公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为10000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作5次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.07(20℃)的溶液；将浓缩的透过液用磷酸盐缓冲液调PH值为6.0，离子强度为0.01mol/l，以6.5ml/min通过SP-交联葡聚糖的阳离子交换柱，用缓冲液洗5倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为6.0，以7ml/min通过阴离子交换柱，分别用PH值为7.4、7.1的缓冲液各洗1倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为7.1的缓冲液加入0.01mol/l的氯化钠进行洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，得到水蛭素原料(其中含水蛭素为5.5克)；
(2)水蛭素冻干粉针剂的处方组成为：
水蛭素为5.5克，冻干赋形剂为94.5克。
(3)将水蛭素与冻干赋形剂混匀，用注射用水溶解，分装到西林瓶中，冷冻干燥，轧盖，得到水蛭素冻干粉针剂1000支。
实施例5
(1)取印度水蛭8.2公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为8000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3时，加水至原体积，反复操作4次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.08(20℃)的溶液；将浓缩的透过液用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCL)调PH值为6.8，离子强度为0.01mol/l，以7ml/min通过SP-琼脂糖阳离子交换柱，用缓冲液洗6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为6.8，以7ml/min通过Q-琼脂糖的阴离子交换柱，分别用PH值为7.4、7.2的缓冲液各洗1倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为7.2的缓冲液加入0.01mol/l的氯化钠进行洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，得到水蛭素原料(其中含水蛭素为7.0克)；
(2)水蛭素冻干粉针剂的处方组成为：
水蛭素为7.0克，冻干赋形剂为93.0克。
(3)将水蛭素与冻干赋形剂混匀，用注射用水溶解，分装到西林瓶中，轧盖，冷冻干燥，得到水蛭素冻干粉针剂1000支。
实施例6
(1)取亚洲水牛蛭(菲牛蛭)10.0公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为10000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作4次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.09(20℃)的溶液；将浓缩的透过液用磷酸盐缓冲液调PH值为6.3，离子强度为0.01mol/l，以5-8ml/min通过SP-纤维素的阳离子交换柱，用缓冲液洗5倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为6.5，以6.5ml/min通过阴离子交换柱，分别用PH值为7.4、7.2的缓冲液各洗1倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为7.1的缓冲液加入0.01mol/l的氯化钠进行洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，得到水蛭素原料(其中含水蛭·素为8.5克)；
(2)水蛭素冻干粉针剂的处方组成为：
水蛭素为8.5克，冻干赋形剂为91.5克。
(3)将水蛭素与冻干赋形剂混匀，用注射用水溶解，分装到西林瓶中，冷冻干燥，轧盖，得到水蛭素冻干粉针剂1000支。
实施例7
(1)取蚂蝗(Whitmania Pigra whitman)10.6公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为10000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3时，加水至原体积，反复操作3次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.08(20℃)的溶液；将浓缩的透过液用磷酸盐缓冲液调PH值为6.8，离子强度为0.01mol/l，以8ml/min通过CM-交联葡聚糖的阳离子交换柱，用缓冲液洗5倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为7.4，以5ml/min通过DEAE-交联葡聚糖的阴离子交换柱，分别用PH值为7.4、7.2的缓冲液各洗1倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为7.2的缓冲液加入0.01mol/l的氯化钠进行洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，得到水蛭素原料(其中含水蛭素为9.0克)；
(2)水蛭素冻干粉针剂的处方组成为：
水蛭素为9.0克，冻干赋形剂甘露醇为91.0克。
(3)将水蛭素与冻干赋形剂混匀，用注射用水溶解，分装到西林瓶中，冷冻干燥，轧盖，得到水蛭素冻干粉针剂1000支。
实施例8
(1)取蚂蝗(Whitmania Pigra whitman)5.9公斤，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪切机制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清夜；将上清液用截留分子量为8000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原溶液体积的1/2时，加水至原体积，反复操作4次，合并透过液，浓缩至相对密度为1.10(20℃)的溶液；将浓缩的透过液用磷酸盐缓冲液调PH值为6.8，离子强度为0.01mol/l，以8ml/min通过CM-交联葡聚糖的阳离子交换柱，用缓冲液洗5倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，再用缓冲液调PH值为7.4，以5ml/min通过DEAE-交联葡聚糖的阴离子交换柱，分别用PH值为7.4、7.2的缓冲液各洗1倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH值为7.2的缓冲液加入0.01mol/l的氯化钠进行洗脱，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止，收集洗脱液；洗脱液用反渗透膜机浓缩脱盐，得到水蛭素原料(其中含水蛭素为5.0克)；
(2)水蛭素冻干粉针剂的处方组成为：
水蛭素为5.0克。
(3)将水蛭素用注射用水溶解，分装到西林瓶中，冷冻干燥，轧盖，得到水蛭素冻干粉针剂1000支。
Claims (8)
1.一种水蛭素冻干粉针剂，其特征在于不使用任何有机溶剂从鲜水蛭中提取水蛭素，纯化后加或不加药用辅料制备成冻干粉针剂，其中水蛭素占活性成分的含量不小于91％。
2.一种水蛭素冻干粉针剂的制备方法，其特征包括以下步骤：
(1)取水蛭，加入注射用水，洗去杂质，用电动绞肉机破碎，再用高速剪
切机或胶体磨制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结
24小时，再用流水解冻，再次冻结，反复冻、融5次，最后一次解冻
后，用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液备用；
(2)将上清液用截留分子量为8000-10000的中空纤维柱进行超滤，超滤至
原溶液体积的1/3-1/2时，加水至原体积，反复操作3-5次，合并透
过液，20℃时浓缩至相对密度为1.05-1.10的溶液；
(3)将浓缩的过滤液用缓冲液调PH值为5.0-7.0，离子强度为0.01mol/l
通过阳离子交换柱，用缓冲液洗4-6倍的柱体积洗脱，收集洗脱液，
再用缓冲液调PH值为5.0-7.0通过阴离子交换柱，分别用PH值为
7.3-7.5、7.1-7.3的缓冲液各洗1倍柱体积，洗脱液弃去，最后用PH
值为7..1-7.3的缓冲液加入0.01mol/l的氯化钠进行洗脱，收集洗脱
液，洗脱至紫外检测器检测不到吸收为止；
(4)洗脱液浓缩脱盐，得到水蛭素半成品；
(5)将水蛭素半成品加或不加药用辅料，用注射用水调整浓度后，分装到
西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到水蛭素冻干粉针剂。
3.根据权利要求1或2所述的水蛭品种为选自蚂蝗(Whitmania Pigra whitman)、亚洲水牛蛭(菲牛蛭)、日本医蛭(Hirudo nipponica Whitman)、柳叶蚂蝗(Wh.acranulatc Whitman)、欧洲医用水蛭、印度水蛭中的任何一种。
4.根据权利要求1或2所述的药用辅料为甘露醇、蔗糖、乳糖的一种。
5.根据权利要求2所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液和三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCL)的一种。
6.根据权利要求2所述的阳离子交换柱为选自CM-交联葡聚糖、CM-琼脂糖、CM-纤维素、SP-交联葡聚糖、SP-琼脂糖、SP-纤维素中的一种。
7.根据权利要求2所述的阴离子交换柱为选自DEAE-交联葡聚糖、DEAE-琼脂糖、DEAE-纤维素、Q-交联葡聚糖、Q-琼脂糖、Q-纤维素中的一种。
8.根据权利要求2所述的透过液浓缩，是采用反渗透膜法浓缩。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410037695 CN1261159C (zh) | 2004-04-29 | 2004-04-29 | 一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410037695 CN1261159C (zh) | 2004-04-29 | 2004-04-29 | 一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1569226A true CN1569226A (zh) | 2005-01-26 |
| CN1261159C CN1261159C (zh) | 2006-06-28 |
Family
ID=34481718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200410037695 Expired - Fee Related CN1261159C (zh) | 2004-04-29 | 2004-04-29 | 一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1261159C (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102139092A (zh) * | 2011-03-21 | 2011-08-03 | 中山大学 | 一种注射用水蛭冻干粉针剂及制备方法 |
| CN102153645A (zh) * | 2010-12-24 | 2011-08-17 | 南宁乙翔生物科技有限公司 | 用电渗析除去水蛭素中重金属离子的方法 |
| CN103405375A (zh) * | 2013-08-09 | 2013-11-27 | 宋延坤 | 菲牛蛭活性提取物及其制备方法和应用 |
| CN104958268A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-10-07 | 广西复鑫益生物科技有限公司平南分公司 | 一种水蛭素冻干粉针剂的制备方法 |
| CN106366184A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-01 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种水蛭素粗提液的制备方法 |
| CN106918650A (zh) * | 2015-12-24 | 2017-07-04 | 成都中医药大学 | 菲牛蛭冻干粉的挥发性成分的检测方法 |
| CN107365381A (zh) * | 2017-09-01 | 2017-11-21 | 荆州市民康生物科技有限公司 | 一种超生波辅助提高日本医蛭素提取收率的方法 |
| CN107827978A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-03-23 | 广西博白县琼达农业科技有限公司 | 一种水蛭素的提取方法 |
-
2004
- 2004-04-29 CN CN 200410037695 patent/CN1261159C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102153645A (zh) * | 2010-12-24 | 2011-08-17 | 南宁乙翔生物科技有限公司 | 用电渗析除去水蛭素中重金属离子的方法 |
| CN102139092A (zh) * | 2011-03-21 | 2011-08-03 | 中山大学 | 一种注射用水蛭冻干粉针剂及制备方法 |
| CN103405375A (zh) * | 2013-08-09 | 2013-11-27 | 宋延坤 | 菲牛蛭活性提取物及其制备方法和应用 |
| CN104958268A (zh) * | 2015-06-19 | 2015-10-07 | 广西复鑫益生物科技有限公司平南分公司 | 一种水蛭素冻干粉针剂的制备方法 |
| CN106918650A (zh) * | 2015-12-24 | 2017-07-04 | 成都中医药大学 | 菲牛蛭冻干粉的挥发性成分的检测方法 |
| CN106918650B (zh) * | 2015-12-24 | 2019-09-24 | 成都中医药大学 | 菲牛蛭冻干粉的挥发性成分的检测方法 |
| CN106366184A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-01 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种水蛭素粗提液的制备方法 |
| CN107365381A (zh) * | 2017-09-01 | 2017-11-21 | 荆州市民康生物科技有限公司 | 一种超生波辅助提高日本医蛭素提取收率的方法 |
| CN107827978A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-03-23 | 广西博白县琼达农业科技有限公司 | 一种水蛭素的提取方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1261159C (zh) | 2006-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1927363B1 (en) | An extract for preventing or treating thrombotic diseases | |
| CN103980347B (zh) | 一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用途 | |
| US10005823B2 (en) | Peptides having effects on promoting wound healing, collagen production, angiogenesis, activation of immunocytes and applications thereof | |
| JPS6030291B2 (ja) | 人顆粒球の分化増殖を促進するｈｇｉ糖蛋白質、ｈｇｉ糖蛋白質の製造法及びｈｇｉ糖蛋白質を含有する白血球減少症治療剤 | |
| CN1261159C (zh) | 一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法 | |
| CN109527270A (zh) | 水蛭特异性营养诱导液及天然水蛭素的提取方法 | |
| CN1891235A (zh) | 一种地龙注射制剂及其制备方法 | |
| CN103275181A (zh) | 一种金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子及其制备方法和用途 | |
| CN102167725A (zh) | 一种孔鳐血管生成抑制因子rcaif-i的制备方法 | |
| CN111100191A (zh) | 源于人胎盘的活性蛋白质或多肽及其用途 | |
| CN104356218B (zh) | 少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm‑A及其产物Ssm‑A1和Ssm‑A2的制备和应用 | |
| CN103113456A (zh) | 具有抗血小板聚集活性的僵蚕多肽及其制备方法和应用 | |
| CN112156112A (zh) | 一种动物骨髓有效部位的制备方法及其应用 | |
| CN1651079A (zh) | 一种疏血通冻干粉针制剂及其制备方法 | |
| CN104958268A (zh) | 一种水蛭素冻干粉针剂的制备方法 | |
| CN111748024A (zh) | 美洲大蠊多肽的制备方法 | |
| CN1192782C (zh) | 治疗心脑血管疾病的注射剂的制造方法及其产品 | |
| CN113845565A (zh) | 一种地龙生物活性小肽及其制备方法和应用 | |
| CN101948439A (zh) | 鹿茸活性生物碱类化合物的提取方法及在医药上的应用 | |
| CN1679884A (zh) | 一种脑心康注射制剂及其制备方法 | |
| CN116987181B (zh) | 高生物学活性的天然水蛭素和高收率制备它们的方法 | |
| KR102180261B1 (ko) | 돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 방법 | |
| Mathieson et al. | The isolation of minimally degraded hyaluronate from rat skin. | |
| CN1259035C (zh) | 一种抗血栓疾病的中药制剂及其制备方法 | |
| US4041022A (en) | Process for the manufacture of thyrocalcitonin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |