JP2023548207A - 尿酸オキシダーゼ製剤及びその応用 - Google Patents

Abstract

尿酸オキシダーゼ製剤を提供し、該尿酸オキシダーゼ製剤は、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼである活性成分と、緩衝剤である補助材と、を含む。【選択図】なし

Description

本発明はバイオ医薬の分野に関し、具体的に、尿酸オキシダーゼ製剤、薬物組成物に関する。

痛風は長期にわたるプリン代謝の乱れまたは尿酸排泄の減少によって引き起こされる疾患であり、その臨床特徴は高尿酸血症であり、尿酸塩の溶解性が悪いため、結晶が皮下、関節、腎臓に沈着して痛風結節を形成し、繰り返し発作する急性関節炎を引き起こし、腎臓に及んで尿酸性尿路結石と間質性腎炎を引き起こす。人体内のプリンは酵素の作用により最終産物の尿酸に変換され、正常な場合、男性の血液中の尿酸含有量は１４９～４１６ｍｍｏｌ／Ｌであり、女性の血液中の尿酸含有量は８９～３５７ｍｏｌ／Ｌであり、体内尿酸量は約１２００ｍｇであり、生成と排泄量は約６００ｍｇ／日であり、平衡状態にある。しかし、体内に尿酸を摂取しすぎたり、排泄のメカニズムに障害が生じたりして、尿酸が血液中に７０ｍｇ／Ｌ以上蓄積すると、高尿酸血症を引き起こす。尿酸ナトリウムが血液または滑膜液中で飽和状態に達して結晶析出したり、長時間高尿酸血症が関節、軟部組織の周囲で結晶沈着したりすると、痛風性急性関節炎または痛風性慢性関節炎及び変形性関節症を引き起こす。尿酸塩の尿細管、腎間質内への沈着による炎症は慢性尿酸塩腎症を引き起こす可能性があり、重度の高尿酸血症患者（白血病やリンパ腫などの悪性腫瘍患者）は、短期間に大量の尿酸沈着が尿路閉塞を引き起こして急性腎不全を引き起こし、尿酸腎症とも呼ばれる。

高尿酸血症の原因は、ヒトが進化の過程で尿酸酵素遺伝子の突然変異・不活性化に関係しているため、ヒトは自ら活性のある尿酸酵素を合成することができない。現在、高尿酸血症を治療する方法の一つは尿酸酵素を用いて患者の体内の尿酸含有量を下げることである。

尿酸オキシダーゼ（Ｅ Ｃ １．７．３．３）は微生体（バチルス‐ファスティディオスス、モノカンジダ、アフラトキシン）、植物（大豆、ひよこ豆）、動物（豚、牛、犬、ヒヒ）に広く存在し（Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ、Ｓａｋａｓｅｇａｗａ Ｓ、Ｍｉｓａｋｉ Ｈ、ＳｕｇｉｙａｍａＭ．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ．２００４．９８ ：１５３－１５８）、酸素の存在下で尿酸アラントインを触媒し、二酸化炭素を放出することができる（Ｒｅｔａｉｌｌｅａｕ Ｐ、Ｃｏｌｌｏｃ’ｈ、Ｄｅｎｉｓ Ｖ、Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ Ｂ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ Ｄ．２００４．６０ ：４５３－４６２．）。活性を持つ尿酸酵素は四量体タンパク質であり、同じサブユニットで構成され、各サブユニットの分子量は３４ｋＤ程度であり、３０１－３０４個のアミノ酸で構成される。各溶液中の尿酸酵素の酵素活性が最も高いｐＨ値は８．０（Ｂａｙｏｌ Ａ ｅｔａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．１９９５．５４ ：２２９－２３５．）である。

活性を持つ尿酸酵素は四量体タンパク質であり、同じサブユニットで構成され、各サブユニットの分子量は３４ｋＤ程度であり、３０１－３０４個のアミノ酸で構成される。各溶液中の尿酸酵素の酵素活性が最も高いｐＨ値は８．０（Ｂａｙｏｌ Ａ ｅｔａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．１９９５．５４ ：２２９－２３５．）である。現在知られている全ての由来の尿酸酵素の中で、活性が最も高いのはアフラトキシン由来で、２７ＩＵ／ｍｇに達し、次に、バチルス‐ファスティディオススに由来し、その活性は１３ＩＵ／ｍｇに保持される（ＨｕａｎｇＳ Ｈ、Ｗｕ Ｔ Ｋ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４．２７１ ：５１７－５２３．）。また、豆類植物由来の尿酸酵素は、その活性が２～６ＩＵ／ｍｇだけであり、哺乳類動物由来の尿酸酵素は、組換え発現を経た後、豚の尿酸酵素活性は５ＩＵ／ｍｇに達することができ、ヒヒの尿酸酵素の酵素活性は１ＩＵ／ｍｇ（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈ、Ｓｕｓａｎ Ｊ．Ｋ．２００６．ＵＳ７０５６７１３Ｂ１）だけであり、ヒト由来の尿酸酵素は不活性である。

人体応用として、微生体尿酸酵素の高活性と哺乳動物の尿酸酵素の低免疫原性により、この２つの主要な由来の尿酸酵素は現在開発応用されている組換え尿酸酵素の研究の焦点となっている。しかし、アフラトキシン由来の尿酸酵素と推定されるヒト由来尿酸酵素との相同性は４０％未満であり（Ｌｅｅ Ｃ Ｃ、Ｗｕ Ｘ、Ｇｉｂｂｓ Ｒ Ａ、Ｃｏｏｋ Ｒ Ｇ、Ｍｕｚｎｙ Ｄ Ｍ、ＣａｓｋｅｙＣ Ｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８．２３９ ：１２８８－１２９１．）、人体では抗尿酸酵素抗体が発生しやすく、アフラトキシン尿酸酵素の効果が急速に弱めると同時に、深刻なアレルギー反応を引き起こし、長期治療には使用できない。

尿酸オキシダーゼはタンパク質の一つとして、薬物製剤を製造するとき、その酵素の活性、安定性及び保管時間を確保する必要があり、異なる製造方法、剤形、緩衝剤、安定剤などは尿酸オキシダーゼの保管時間及び活性に影響を与えると同時に、タンパク質構造に化学修飾を行うことも尿酸酸化酵素製剤の安定性に影響を与える。

そのため、尿酸オキシダーゼ活性を確保し、安定に保管できる尿酸オキシダーゼ製剤を開発する必要がある。

本願は、発明者の以下の事実と問題に対する発見と認識に基づいて作成されたものである。

活性尿酸オキシダーゼは相同四量体タンパク質であり、そのうちの三分の一のアミノ酸は強疎水性アミノ酸であり、四量体タンパク質同士が凝集して八量体及びより大きな重合体を形成しやすい。分子量が１００ｋＤａを超える分子は生体の免疫反応を効果的に誘導できるが、未修飾ポリ尿酸オキシダーゼタンパク質の分子量はすでに１４０ｋＤａに達しており、より大きな分子量の多量体尿酸酵素はより高い免疫原性を有する。人体は抗尿酸酵素抗体を産生しやすく、その効果を迅速に弱め、同時に深刻なアレルギー反応を引き起こし、長期治療には使用できない。ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）でタンパク質を共有結合修飾することで、タンパク質の免疫原性を低下させ、タンパク質の溶解度を増加させ、タンパク質の半減期を延長できることが証明された。

デューク（Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）と山景会社（Ｓａｖｉｅｎｔ）は、豚由来とヒヒ由来のキメラ尿酸酵素の研究（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈ、Ｓｕｓａｎ Ｊ．Ｋ．２００６．ＵＳ７０５６７１３Ｂ１）を行った。この研究の方法は、酵素活性が明らかに減少しないことを保証したまま、分子量が１０ＫＤａのメトキシ基含有ポリエチレングリコール（１０ＫＤａ－ｍＰＥＧ－ＮＰＣ）で豚由来の尿酸酵素リシン残基のε－アミノ基を修飾することで（得られた修飾製品はＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅである）、人体で頑固性痛風を治療する目標を初歩的に達成した。発明者は、上記の研究成果は薬物による免疫原性の問題を徹底的に解決するものではなく、臨床被験者が何度も注射した後、尿酸酵素の治療効果がなくなる現象が現れたことを発見し、これはＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅタンパク質の分子量が大きすぎる（１０ｋＤのＰＥＧを採用することで、Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ分子量が５４０ ｋＤａであることを引き起こす）ことに関係があるかもしれないと推測し、同時にｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅは注射に適しておらず、静脈注射に適しているため、被験者の長期間使用のコンプライアンスを低下させ、臨床応用を厳重に制限した。これまで、免疫原性がより低いものや皮下注射を採用できる長寿命尿酸オキシダーゼ薬はなかった。

ポリエチレングリコールを使って尿酸酸化酵素を修飾すると、修飾数とサイトによって、尿酸オキシダーゼの性質を変えて、さらに、尿酸オキシダーゼ製剤の処方を変えて、異なる尿酸オキシダーゼの製剤中での酵素の活性、安定性及び保管時間が基準を満たすようにする必要がある。

本発明は、関連技術における技術的問題の一つを少なくとも一定の程度で解決することを主旨とする。

本発明の第１の態様では、本発明は尿酸オキシダーゼ製剤を提供する。本発明の実施例によれば、前記尿酸オキシダーゼ製剤は、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼから選ばれる活性成分と、リン酸塩、塩酸塩及び炭酸塩のうちの少なくとも１種を含む緩衝剤から選ばれる補助材とを含む。本発明の実施例による製剤の処方構成が簡単で、尿酸オキシダーゼは製剤処方下での安定性が高く、該製剤の製造は生産コストを節約することができ、生産効率が高い。

また、本発明の上記実施例による尿酸オキシダーゼ製剤は、次の付加的な技術的特徴をさらに有する。

本発明の実施例によれば、前記尿酸オキシダーゼ中のアミノ酸サイトとして、Ｔ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３のうちの少なくとも１１つはＰＥＧ修飾を有する。

本発明の実施例によれば、カップリング反応生成物を限外濾過及び／又は精製処理することをさらに含む。さらに、未修飾のポリエチレングリコールや副生成物、例えばＮＨＳを効果的に除去し、得られたポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの純度を効果的に向上させることができる。

本発明の実施例によれば、下記４つのアミノ酸サイト、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^２２２及びＫ^２３１の少なくとも１つはＰＥＧ修飾を有する。

本発明の実施例によれば、前記アミノ酸サイト局在化はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列で局在化される。
ＴＹＫＫＮＤＥＶＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＩＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＴＶＱＬＴＬＳＳＫＫＤＹＬＨＧＤＮＳＤＶＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＮＶＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＴＦＡＶＴＩＣＥＨＦＬＳＳＦＫＨＶＩＲＡＱＶＹＶＥＥＶＰＷＫＲＦＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＹＴＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＩＲＮＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＩＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＴＱＶＹＣＫＷＲＹＨＱＧＲＤＶＤＦＥＡＴＷＤＴＶＲＳＩＶＬＱＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＬＴＬＧＱＶＰＥＩＥＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＬＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＫＩＴＧＴＶＫＲＫＬＳＳＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。

本発明の実施例によれば、前記尿酸オキシダーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７で示されるアミノ酸配列を有する。
ＭＡＨＹＲＮＤＹＫＫＮＤＥＶＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＩＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＳＶＱＬＴＬＳＳＫＫＤＹＬＨＧＤＮＳＤＶＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＮＶＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＴＦＡＶＴＩＣＥＨＦＬＳＳＦＫＨＶＩＲＡＱＶＹＶＥＥＶＰＷＫＲＦＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＹＴＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＩＲＮＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＩＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＴＱＶＹＣＫＷＲＹＨＱＧＲＤＶＤＦＥＡＴＷＤＴＶＲＳＩＶＬＱＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＬＴＬＧＱＶＰＥＩＥＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＬＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＲＩＴＧＴＶＫＲＫＬＴＳＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
ＭＹＫＮＤＥＶＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＶＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＳＶＱＬＴＬＳＳＫＫＤＹＶＹＧＤＮＳＤＩＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＨＶＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＴＦＡＭＮＩＣＥＨＦＬＳＳＦＮＨＶＩＲＡＱＶＹＶＥＥＶＰＷＫＲＦＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＨＮＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＭＲＳＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＩＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＴＫＶＹＣＫＷＲＹＨＱＧＲＤＶＤＦＥＡＴＷＤＴＶＲＤＩＶＬＥＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＨＳＬＳＲＶＰＥＭＥＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＦＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＫＩＴＧＴＶＫＲＫＬＳＳＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。
ＭＡＨＹＨＮＤＹＫＫＮＤＥＶＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＶＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＳＶＱＬＴＬＳＳＫＫＤＹＶＹＧＤＮＳＤＩＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＨＶＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＴＦＡＭＮＩＣＥＨＦＬＳＳＦＮＨＶＩＲＡＱＶＹＶＥＥＶＰＷＫＲＦＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＨＮＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＭＲＳＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＩＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＴＫＶＹＣＫＷＲＹＨＱＧＲＤＶＤＦＥＡＴＷＤＴＶＲＤＩＶＬＥＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＨＳＬＳＲＶＰＥＭＥＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＦＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＲＩＴＧＴＡＫＲＫＬＡＳＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。
ＭＡＨＹＨＮＤＹＱＫＮＤＥＶＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＶＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＳＶＱＬＴＬＮＳＲＲＥＹＬＨＧＤＮＳＤＩＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＱＶＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＴＦＡＭＮＩＣＥＨＦＬＳＳＦＮＨＶＩＲＶＱＶＹＶＥＥＶＰＷＫＲＦＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＨＴＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＬＲＳＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＬＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＴＱＶＹＣＫＷＲＹＨＱＧＲＤＶＤＦＥＡＴＷＥＡＶＲＧＩＶＬＫＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＬＳＬＳＱＬＰＥＩＥＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＦＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＲＩＴＧＴＶＫＲＫＬＴＳＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）。
ＭＡＨＹＨＮＤＹＫＫＮＤＥＶＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＶＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＳＶＱＬＴＬＳＳＫＫＤＹＬＨＧＤＮＳＤＩＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＨＡＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＡＦＡＶＮＩＣＱＨＦＬＳＳＦＮＨＶＩＲＴＱＶＹＶＥＥＩＰＷＫＲＬＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＨＴＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＬＲＳＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＩＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＡＱＶＹＣＫＷＲＹＨＱＣＲＤＶＤＦＥＡＴＷＤＴＩＲＤＶＶＬＥＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＶＳＬＳＱＶＰＥＩＤＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＦＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＫＩＴＧＴＶＫＲＫＬＳＳＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。
ＭＡＤＹＨＮＮＹＫＫＮＤＥＬＥＦＶＲＴＧＹＧＫＤＭＶＫＶＬＨＩＱＲＤＧＫＹＨＳＩＫＥＶＡＴＳＶＱＬＴＬＳＳＫＫＤＹＬＨＧＤＮＳＤＩＩＰＴＤＴＩＫＮＴＶＨＶＬＡＫＦＫＧＩＫＳＩＥＡＦＧＶＮＩＣＥＹＦＬＳＳＦＮＨＶＩＲＡＱＶＹＶＥＥＩＰＷＫＲＬＥＫＮＧＶＫＨＶＨＡＦＩＨＴＰＴＧＴＨＦＣＥＶＥＱＬＲＳＧＰＰＶＩＨＳＧＩＫＤＬＫＶＬＫＴＴＱＳＧＦＥＧＦＩＫＤＱＦＴＴＬＰＥＶＫＤＲＣＦＡＴＱＶＹＣＫＷＲＹＨＱＣＲＤＶＤＦＥＡＴＷＧＴＩＲＤＬＶＬＥＫＦＡＧＰＹＤＫＧＥＹＳＰＳＶＱＫＴＬＹＤＩＱＶＬＳＬＳＲＶＰＥＩＥＤＭＥＩＳＬＰＮＩＨＹＦＮＩＤＭＳＫＭＧＬＩＮＫＥＥＶＬＬＰＬＤＮＰＹＧＫＩＴＧＴＶＫＲＫＬＳＳＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列は、豚由来とヒヒ由来のキメラ尿酸酵素（豚ヒヒ）のアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列は豚由来の尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるアミノ酸配列は犬由来とヒヒ由来（犬ヒヒ）のキメラ尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列は犬由来の尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるアミノ酸配列は牛由来の尿酸オキシダーゼのアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されるアミノ酸配列はサルの尿酸オキシダーゼアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるアミノ酸配列はヒヒの尿酸オキシダーゼアミノ酸配列である。

なお、本願のリシンの局在化はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列に基づいて行われ、例えばＫ^４とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に基づいて、第４位に位置するリシンである。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７で示されるアミノ酸配列を有する尿酸酵素またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は添加を有するポリペプチドは構造的に相同性を有し、当業者は、配列比較により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は添加を有するポリペプチドにはＴ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３サイトに対応する対応サイトを決定することができ、さらに、上記ポリペプチドが比較する上での対応サイトにＰＥＧ修飾を起こし、本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの低い免疫原性、高い体内安定性、筋肉注射に適する利点が実現される。

例如、本発明の実施例によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列のＴ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３サイトの対応するサイトはＭ^１、Ｋ^９、Ｋ^１０、Ｋ^３６、Ｋ^４１、Ｋ^８２、Ｋ^８５、Ｋ^１０３、Ｋ^１１８、Ｋ^１２２、Ｋ^１２６、Ｋ^１５８、Ｋ^１８５、Ｋ^２２８、Ｋ^２３７、Ｋ^２７２、Ｋ^２７８、Ｋ^２９７、Ｋ^２９９を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列の対応するサイトの対応サイトはＭ^１、Ｋ^３、Ｋ^２９、Ｋ^３４、Ｋ^７５、Ｋ^７８、Ｋ^１１１、Ｋ^１１５、Ｋ^１１９、Ｋ^１５１、Ｋ^１７８、Ｋ^２２１、Ｋ^２３０、Ｋ^２６５、Ｋ^２７１、Ｋ^２８４、Ｋ^２９０、Ｋ^２９２を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列の対応するサイトの対応サイトはＭ^１、Ｋ^９、Ｋ^１０、Ｋ^３６、Ｋ^４１、Ｋ^８２、Ｋ^８５、Ｋ^１１８、Ｋ^１２２、Ｋ^１２６、Ｋ^１５８、Ｋ^１８５、Ｋ^２２８、Ｋ^２３７、Ｋ^２７２、Ｋ^２７８、Ｋ^２９７、Ｋ^２９９を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列の対応するサイトの対応サイトはＭ^１、Ｋ^１０、Ｋ^３６、Ｋ^４１、Ｋ^８２、Ｋ^８５、Ｋ^１１８、Ｋ^１２２、Ｋ^１２６、Ｋ^１５８、Ｋ^１８５、Ｋ^２２８、Ｋ^２３７、Ｋ^２７２、Ｋ^２７８、Ｋ^２９７、Ｋ^２９９を含み、ＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列の対応するサイトの対応サイトはＭ^１、Ｋ^９、Ｋ^１０、Ｋ^３６、Ｋ^４１、Ｋ^８２、Ｋ^８５、Ｋ^１１８、Ｋ^１２２、Ｋ^１２６、Ｋ^１５８、Ｋ^１８５、Ｋ^２２８、Ｋ^２３７、Ｋ^２７２、Ｋ^２７８、Ｋ^２９１、Ｋ^２９７、Ｋ^２９９を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示される配列とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列の対応するサイトの対応サイトはＭ^１、Ｋ^９、Ｋ^１０、Ｋ^３６、Ｋ^４１、Ｋ^８２、Ｋ^８５、Ｋ^１１８、Ｋ^１２２、Ｋ^１２６、Ｋ^１５８、Ｋ^１８５、Ｋ^２２８、Ｋ^２３７、Ｋ^２７２、Ｋ^２７８、Ｋ^２９１、Ｋ^２９７、Ｋ^２９９を含む。発明者は試験により、上記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～７で示されるアミノ酸配列の対応するサイトの少なくとも１１つのサイトにＰＥＧ修飾を発生させた後、得られたＰＥＧ修飾の尿酸オキシダーゼは低い免疫原性、高い体内安定性、筋肉注射に適する利点を有すると発見した。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのペプチドマップはポリエチレングリコールで修飾されていない前記尿酸オキシダーゼのペプチドマップと比べて、少なくとも１１つの所定のペプチドセグメントを有するピーク面積が減少する相対割合は７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。本発明の実施例によるポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは低い免疫原性、高い体内安定性、筋肉注射に適する利点を有する。

本発明の実施例によれば、前記ＰＥＧ修飾用ポリエチレングリコールの分子量は６ＫＤ以下である。発明者は、分子量が６ＫＤ以下であるポリエチレングリコールで修飾し、得られた尿酸オキシダーゼの体内での長寿命性がさらに向上し、且つ分子量が大きすぎるために深刻な抗ＰＥＧ抗体が産生されることはなく、すなわち免疫原性がさらに低下すると発見した。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコールはモノメトキシまたは水酸基を有する。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコールは直鎖または分岐鎖構造である。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコールと尿酸オキシダーゼとはアミド結合によりカップリングされる。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコールは修飾性ポリエチレングリコールであり、前記修飾性ポリエチレングリコールの修飾基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドカーボネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドアセテート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドプロピオン酸エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド酪酸エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドコハク酸エステル及びｐ－ニトロフェニルカーボネートから選ばれた少なくとも１つを含む。

本発明の実施例によれば、前記修飾性ポリエチレングリコールの修飾基はＮ－ヒドロキシスクシンイミドプロピオン酸エステルである。

本発明の実施例の方法によれば、尿酸オキシダーゼの免疫原性を効果的に低下させることができ、得られた尿酸オキシダーゼの体内安全性がより高く、作用がより長寿命である。

理解できることとして、以上のようなポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造方法の付加的な技術的特徴と付加的な技術的特徴が備える技術的効果は本発明の実施例による上記尿酸オキシダーゼの免疫原性を低下させる方法の付加的な技術的特徴に適用し、本発明の実施例による上記尿酸オキシダーゼの免疫原性を低下させる方法の付加的な技術的特徴について、ここで繰り返して説明しない。

本発明の実施例によれば、前記緩衝剤は、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物及び塩化ナトリウムの少なくとも１つを含む。本発明の実施例による尿酸オキシダーゼ製剤は、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物及び塩化ナトリウムを補助材として採用することにより、尿酸オキシダーゼの酵素比活性を確保することができ、低温、常温、高温の条件下で３０日間保存した酵素比活性、タンパク質の分解及び凝集の程度などの指標はずべて期待通りである。また、通常の尿酸オキシダーゼ製剤にグリシン、蔗糖などを添加する必要があるのに対して、本発明の方法処方は簡単であり、且つ製剤の安定性が高い。

本発明の実施例によれば、前記緩衝剤とは、その酸塩基共役成分の作用によりｐＨ変化に抵抗する緩衝剤を指す。緩衝剤は、本発明の液体または固体製剤中に存在でき、本発明の緩衝剤は製剤のｐＨを７～９に調整し、ｐＨを７～９の範囲内に制御した単独または組み合わせ形態の緩衝剤は、酢酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、ジメチルヒ酸塩、２－［Ｎ－モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリ（ヒドロキシメチル）メタン）（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－［２－アセトアミド］－２－イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、グリシルグリシン及びその他の有機酸緩衝剤を含む。

本発明の実施例によれば、前記尿酸オキシダーゼ製剤のｐＨは７～９であり、好ましくは７．４～８．２である。発明者は、繰り返し試験及び分析により、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ製剤は上記ｐＨの条件下での安定性が高く、尿酸オキシダーゼが凝集、分解しにくく、酵素比活性が高いと発見した。

本発明の実施例によれば、前記尿酸酵素製剤のｐＨは７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２である。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼと緩衝剤の質量比は（５～６）：（６～３７）であり、好ましくは６：１０である。本発明の実施例による尿酸オキシダーゼ製剤は、上記の割合で製剤を調製することによって、製剤のｐＨを７．４～８．２に保つことができ、前記尿酸オキシダーゼの安定性を確保することができる。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼと緩衝剤の質量比は６：１０、６：１１、５：１０、５：１１、５：９、６：９である。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼと前記リン酸塩の質量比は（５～６）：（１～７）である。

本発明の実施例によれば、前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼと前記塩化ナトリウムとの質量比は（５～６）：（５～３０）である。

本発明の実施例によれば、前記リン酸塩と前記塩化ナトリウムとの質量比は（１～７）：（５～３０）であり、前記リン酸塩はリン酸水素二ナトリウム及び／又はリン酸二水素ナトリウムである。

本発明の実施例によれば、本発明で提供される尿酸オキシダーゼ製剤は、グリセリン、グルコース、マンニトール、Ｔｗｅｅｎ－８０などの安定剤を添加する必要がなく、緩衝剤を使用するだけで、本発明で提供される尿酸オキシダーゼの安定性を確保し、安定性が高い尿酸オキシダーゼ製剤を取得する。本発明の実施例による尿酸オキシダーゼはマンニトール及び／又はグリセリンを添加すれば、逆に、尿酸オキシダーゼの粒径を増大させたが、Ｔｗｅｅｎ－８０を添加しても、本発明の実施例による尿酸オキシダーゼの安定性に大きな影響を与えない。本発明の実施例によれば、前記尿酸オキシダーゼ製剤の剤形は、液体、半固体、固体の少なくとも１つを含む。本発明の実施例による尿酸オキシダーゼ製剤は液体製剤または凍結乾燥剤形であってよく、使用時に溶解して液体とすることができ、なお、前記尿酸オキシダーゼ製剤は注射製剤であり、静脈注射、筋肉注射などの方法で患者の体内に注射することができる。

本発明の実施例によれば、前記製剤は単剤形の形態であり、製剤ごとに尿酸オキシダーゼを６ｍｇ含む。本発明の実施例による単剤量の形態の尿酸オキシダーゼ製剤によれば、前記単剤量の形態の尿酸オキシダーゼの投与方式は簡単で、毎日繰り返し投与する必要がなく、患者に使いやすく、最大の薬効を達成し、且つ保存しやすい。

本発明の第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様で提供される尿酸オキシダーゼ製剤の、薬物の製造における使用を提供し、前記薬物は、高尿酸血症及びその関連疾患を治療または予防するために使用される。本発明の実施例によれば、前記高尿酸関連疾患は、慢性高尿酸血症、痛風、腎臓疾患、高尿酸性関節炎、腎臓結石、痛風結節、高血圧、糖尿病、高トリグリセリド血症、メタボリックシンドローム、冠状動脈性心臓病、アテローム性動脈硬化、癌化学療法による高尿酸血症から選ばれる疾患を含む。

本発明の第３の態様では、本発明は薬物組成物を提供する。本発明の実施例によれば、前記薬物組成物は本発明の第１の態様で提供される尿酸オキシダーゼ製剤を含む。

本発明の実施例によれば、前記薬物組成物は、次の付加的な技術的特徴の少なくとも１つをさらに含む。

本発明の実施例によれば、上記薬物組成物は、高尿酸血症及び関連疾患を治療または予防するための薬物をさらに含む。

本発明の実施例によれば、本発明のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼまたは薬物組成物を他の薬物の併用療法で投与する場合、それらを、順次または同時に個体に投与することができる。または、本発明の薬物組成物は、本発明のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ、薬学的に許容できる担体または薬学的に許容できる賦形剤及び当分野で公知の他の治療薬または予防薬の組み合わせを含むことができる。

本発明の実施例によれば、前記薬物組成物は低い免疫原性、高い体内安定性、筋肉注射に適する利点を有し、高尿酸関連疾患の治療または予防に使用できる。

本発明の実施例によれば、前記薬物組成物は薬学的に許容できる補助剤をさらに含む。前記補助剤は、任意の溶媒、固体賦形剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、または他の液体賦形剤、分散剤、矯味剤または懸濁剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、防腐剤、固体結合剤、流動補助剤または潤滑剤などが含み、特有の目的に適した剤形である。

本発明の付加的な態様と利点を以下の説明から部分的に示し、部分的に以下の説明から明らかになったり、または本発明の実践を通じて了解したりする。

本発明の上記及び／又は付加的な態様と利点は、以下の図面を参照して実施例の説明から明らかになり、理解しやすい。
本発明の実施例によるＰＨＣ理化学対照品－ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＵＶ検出図である。 本発明の実施例によるＰＨＣ理化学対照品－ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＲＩ検出図である。 本発明の実施例によるＰＥＧ参照品－ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＲＩ検出図である。 本発明の実施例によるＰＵ５修飾産物－ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＵＶ検出図である。 本発明の実施例によるＰＵ５修飾産物－ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＲＩ検出図である。 本発明の実施例によるＰＨＣとＰＵ５の、それぞれＬｙｓ－ｃとトリプシンを用いた二酵素切断比較図である。 本発明の実施例によるＰＵ５ Ｌｙｓ－Ｃ酵素切断図である。 本発明の実施例による処方５の０日時のＳＥＣ図である。 本発明の実施例による処方５の３７℃での３０日のＳＥＣ図である。 本発明の実施例による処方６の３７℃での３０日のＳＥＣ図である。 本発明の実施例による処方７の３７℃での３０日のＳＥＣ図である。 本発明の実施例によるモデルラットに異なる用量で筋肉投与した後の血清尿酸レベルである。 本発明の実施例による腎損傷壊死及び炎症スコア図である。 本発明の実施例によるＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）のＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を１回静脈注射した後の各群の平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅと異なる用量のポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を１回筋肉注射した後の各群の平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットに異なる用量のポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を１回筋肉注射した後の各群の平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットに異なる用量のＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を１回筋肉／静脈注射した後の各群の異なる時間血尿酸平均値－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）のＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を初めて（Ｄａｙ１）静脈注射した後の雄性と雌性の平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）のＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を最後（Ｄａｙ２２）静脈注射した後の雄性と雌性平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）のＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を初めて（Ｄａｙ１）筋肉注射した後の雄性と雌性平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）のＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を最後（Ｄａｙ２２）筋肉注射した後の雄性と雌性平均血中濃度－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を複数回静脈注射した後の異なる時間血尿酸平均値－時間曲線図である。 本発明の実施例によるＳＤラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を複数回筋肉注射した後の異なる時間血尿酸平均値－時間曲線図である。

以下、本発明の実施例を詳細に説明し、前記実施例の例が図面に示され、全図面において、同一又は類似の符号は同一又は類似の構成要素或いは同一又は類似の機能を有する構成要素を示す。以下の参考図面を介して説明する実施例は例示的なものであり、本発明を説明するためのものであり、本発明に対する制限として理解すべきではない。

本発明の目的は、新しいポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ製剤を提供することである。

本発明の他の目的は、上記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ製剤の応用を提供することであり、体内の長期的かつ顕著な血液尿酸レベルの低下効果を実現でき、高尿酸血症及び痛風の治療に用いることができる。

本発明の一態様では、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ製剤を提供する。

尿酸オキシダーゼは特に制限されなく、任意の由来の尿酸オキシダーゼ及びその尿酸オキシダーゼ類似物であってもよく、代表的な例として、哺乳動物由来、微生体、植物などを含むが、これらに制限されない。

本発明に記載の異種由来尿酸オキシダーゼは、天然抽出、化学合成、遺伝子工学的組換え発現などの様々な方法で得られることができるが、これらに限定されるものではない。

他の好ましい例において、大腸菌または酵母を宿主として、組換え発現菌株を構築する方法によって製造される。大腸菌を宿主菌として組換え発現を行うことがより好ましい。

他の好ましい例において、前記ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼを活性成分として、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム及び塩化ナトリウムを添加し、製造された製剤は、酵素の活性に最大限に確保し、且つ製剤の保管安定性を向上させることができる。

他の好ましい例において、前記ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼ製剤に、例えばマンニトール、グリセリン及びＴｗｅｅｎ－８０などの他の安定剤を添加する必要せずに、高い保管安定性を有することができ、これにより、前記尿酸オキシダーゼ製剤の処方は簡単で、製造プロセスが簡便であり、コストが低い。

本発明の一態様では、上記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ製剤の応用を提供する。

前記のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼ製剤は、慢性高尿酸血症または痛風の治療薬物及びその組成物としてより適する。前記高尿酸血症及び痛風の主要な症状は尿酸性腎症と痛風性関節炎を含むが、これらに制限されない。

前記のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼの投与経路は静脈注射、皮下注射、筋肉注射及び腹腔内注射などを含むが、これらに制限されなく、好ましくは静脈注射、筋肉注射であり、より好ましくは筋肉注射である。

前記のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼはより低い体内免疫原性を有する。

前記のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼは低い免疫原性を有するのは、人または動物の体内にポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼを筋肉注射した後、生体がポリエチレングリコール分子に対する抗体を産生しなく、または低力価のポリエチレングリコール分子に対する抗体を産生することを指す。尿酸オキシダーゼに対する抗体を産生しない。

前記のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼは、筋肉注射後に体内でより長い半減期と体内尿酸レベルの低下効果を有する。

なお、「第１の」、「第２の」といった用語は目的を説明するためのものにすぎず、相対的に重要性を示す若しくは暗に示す、または技術的特徴を明示する数を暗に示すとみなすことはできない。したがって、「第１の」、「第２の」と限定している特徴は少なくとも１つの該特徴を含むことを明示するまたは暗に示すことができ、本考案の説明において、特に明確かつ具体的に限定している場合を除き、「複数」の概念は少なくとも２つ、例えば２つまたは３つなどである。

以下、具体的な実施例を参照して、本発明を説明し、なお、これらの実施例は説明的なものに過ぎず、本発明を何ら制限するものではない。

実施例１ 組換え尿酸オキシダーゼの製造

１．１ 尿酸酵素発現のための遺伝子と発現プラスミドの構築
Ｅ．ｃｏｌｉコドン使用嗜好データに基づき、コドン嗜好性及びＧＣ含有量などの要素を組み合わせて、尿酸酵素タンパク質（コードネーム：ＰＨＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のｃＤＮＡ配列を設計し、全遺伝子合成を行い、ｐＵＣ－５７－ＰＨＣプラスミドと名付けた。Ｎｄｅ ＩとＢａｍＨ Ｉを目的遺伝子としてサイトに挿入し、ｐＥＴ－３０ａプラスミドを発現担体（ｐＥＴ－３０ａ－ＰＨＣ）として使用する。

１．２ 発現プラスミドの細菌宿主細胞への変換
ＣａＣｌ_２法を用いて発現担体ｐＥＴ－３０ａ－ＰＨＣを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に導入し、Ｋａｎａｍｙｃｉｎが耐性スクリーニングを行い、高発現クローンをスクリーニングし、且つ元の種子バンク菌種（Ｅ３Ｂ）を保存し、これらのステップは分子生物学分野でよく用いられる方法に従って実施される。

１．３ 組換え尿酸オキシダーゼの製造
変換したエンジニアリング菌種を発酵槽で発酵発現させ、まず３０℃で、ｐＨが約７．２でＯＤ_６００＝３０以上に培養し、ＩＰＴＧを０．５ｍｍｏｌ／Ｌまで添加し、尿酸オキシダーゼが蓄積するように引き続き３ｈ以上誘導することを制御条件とする。細胞を遠心分離して収集し、次に、－１５℃以下で保存する。

凍結保存菌体を取り、２５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ緩衝液に懸濁し、懸濁割合は１：１０（Ｗ／Ｖ）である。高圧で細菌細胞を破いた後、尿酸オキシダーゼの沈殿を遠心分離して収集し、沈殿を５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ_３で一回洗浄した後、濃縮した尿酸酵素沈殿を１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａ_２ＨＣＯ_３（ｐＨ９．７～１０．３）緩衝液に懸濁し、懸濁割合は１：５０（Ｗ／Ｖ）であり、室温で攪拌して一晩溶解し、その後遠心分離して上清を収集する。

尿酸オキシダーゼはいくつかのクロマトグラフィーステップを経てさらに精製され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの検出純度は９５％以上で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムで純度が９５％以上で、凝集体の形態がないと検出され、Ｌｏｗｒｙ法でタンパク質濃度を測定し、分光光度計で尿酸オキシダーゼ活性を測定し、１単位（Ｕ）酵素活性は、最適な反応温度が３７℃で、最適ｐＨが９．０の緩衝液条件下で、毎分１μｍｏｌの尿酸を変換するには必要な酵素の量と定義される。

実施例２ ポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼの製造

異なる分子量の（５００～２００００Ｄａ）モノメトキシＰＥＧ誘導体、例えば５Ｋ分子量のＮ－スクシンイミドプロピオン酸エステルＰＥＧ（５Ｋ－ＰＥＧ－ＳＰＡ）を１～５ｍｍｏｌ／Ｌの酸溶液で１００～３００ｍｍｏｌ／ＬのＰＥＧ溶液に溶解し、溶解後、１：４５～１：１５０のモル比（尿酸オキシダーゼ：５Ｋ－ＰＥＧ－ＳＰＡ）で、尿酸オキシダーゼを溶けた炭酸塩濃度が０．１～０．３ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨが１０．０の炭酸塩緩衝液に入れ、ＰＥＧと尿酸オキシダーゼをカップリング反応させ、カップリング反応の尿酸オキシダーゼの濃度は１０ｍｇ／ｍｌであり、カップリング反応は、ＰＥＧカップリング程度が経時的に変化しなくなるまで、５～３０℃の条件下で６０分間以上攪拌して反応させる。反応終了後、限外濾過及び／又はクロマトグラフィー法により未修飾のＰＥＧ及び副生成物を反応から除去する。修飾副生成物の分離除去は、適切な分子篩クロマトグラフィー媒体を用いて行うことができる。最後に、無菌濾過で５Ｋ修飾のポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼ（コードネームがＰＵ５である）が得られる。

実施例３ ポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼの特性分析

３．１ 平均修飾度及び酵素活性検出
Ｌｏｗｒｙ法でタンパク質濃度を測定し、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼ活性は分光光度計で測定される。尿酸酵素基質尿酸の最大紫外線吸収波長は２９３ｎｍであるのに対して、生成物であるアラントインの最大紫外線吸収波長は２２４ｎｍであり、一定の濃度範囲内で、尿酸の２９３ｎｍでの吸収値はその濃度に比例し、分光光度計法で尿酸の定量測定を行うことができる。具体的な過程は以下の通りであり、紫外可視分光光度計を開き、波長を２９３ｎｍに調整し、該装置の水浴循環システムを開いて温度を３７℃に保つ。四ホウ酸ナトリウム緩衝液をブランク対照として、ゼロ点を校正し、基質反応液（０．１ｍｏｌ／Ｌの四ホウ酸ナトリウム、１００μｍｏｌ／Ｌの尿酸、ｐＨが９．５で、３７℃で予熱）を２．９５ｍｌ取って石英キュベットに入れ、次に、５０μｌの供試品を入れて迅速に均一に混合した後２９３ｎｍで吸収値を測定する。２９３ｎｍでの吸収度の変化を連続的に測定し、Ｃ＝Ａ／εＬ（ここで、Ａは特定の濃度の尿酸が２９３ｎｍでの吸光値であり、εは尿酸のモル吸光係数であり、Ｌはキュベットの光路であり、Ｃは尿酸のモル濃度である）によって尿酸分解濃度を計算し、酵素活性を計算し、酵素活性は、最適な反応温度３７℃で、最適な反応ｐＨが９．５である場合、毎分１μｍｏｌの尿酸をアラントインに変換するには必要な酵素の量が１つの活性単位（Ｕ）として定義される。

ＳＥＣ－ＨＰＬＣタンデムＵＶ／ＲＩ（紫外と屈折率検出器の併用）を用いてポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼの平均修飾度の検出を行う。タンパク質によると、紫外２８０ｎｍで最大の吸収ピークがあり、該波長でＰＥＧが吸収されないと同時に、示差屈折率検出器はタンパク質とＰＥＧに対して一定の範囲内で吸収値がその各種濃度に比例する。このため、ＰＥＧ参照品とＰＨＣ理化学対照品の外標準方式でポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼ中のＰＥＧとタンパク質部分のそれぞれの含有量を得ることができ、更に、以下の計算方式で尿酸オキシダーゼ単体あたりのＰＥＧ分子数、即ち平均修飾度を取得することができる。
ＰＥＧ尿酸オキシダーゼ平均修飾度＝（尿酸オキシダーゼサブユニットの相対分子量×サンプル中のＰＥＧの量）／（ＰＥＧ相対分子量×サンプル中のタンパク質の量）。

ここで、ＰＨＣ理化学対照品、ＰＥＧ参照品、ＰＵ５修飾生成物ＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＵＶ／ＲＩ検出図を図１～図５に示す。

実施例２において、異なる投入比下で、得られたポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼの酵素活性と平均修飾度を表１に示す。

表１から分かるように、本願のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼは、タンパク質において、５Ｋ－ＰＥＧの投入比が１：５６－１：１１０である平均修飾度が１１個以上に安定し、且つ酵素活性が未修飾の尿酸オキシダーゼに比べて、酵素活性保留率が高く、酵素活性が低下せず、上昇し、且つ酵素活性が相対的に安定する。これは、市販されている薬物Ｋｒｙｓｔｅｘｘａ（ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ）と全く異なり、山景会社の特許に開示されている内容（ＣＮ１２６４５７５Ｃ、図２Ａ－図３Ｂ）と当業者の一般的な認識によると、５ｋＤ ＰＥＧ修飾度の向上に伴い、酵素の活性が顕著に低下する。しかし、意外に、本願で得られたポリエチレングリコール尿酸酵素は１１を超える平均修飾度で、酵素の活性は未修飾の場合と比べて有意な変化はなかった。このため、本願のポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼは市販薬と比べて、ポリエチレングリコールの平均修飾度がより高く、酵素活性保留上でも予想外の技術的効果が得られた。発明者は、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼのＰＥＧ修飾度または修飾サイトの違いに起因する可能性があると推測している。

３．２ ポリエチレングリコール修飾サイトの検出

以下のステップでは、発明者は実施例２で得られた尿酸オキシダーゼに対して修飾サイトの検出を行う。

ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼのＰＥＧ修飾サイトは、非ポリエチレングリコール化とポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼに対して１種または複数種の酵素で酵素切断を行い、次に、クロマトグラフィー検出により、クロマトグラム、即ちペプチドマップを取得することによって確認される。非ポリエチレングリコール化とポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼに対して単酵素切断（Ｌｙｓ－ＣまたはＴｒｙｐｓｉｎ）及び／又は二酵素切断（Ｌｙｓ－ＣとＴｒｙｐｓｉｎの併用）で酵素切断を行うことができる。逆相カラムで酵素切断断片を分離し、内部参照ペプチドセグメントにより校正してペプチドセグメントの消失または低下割合を比較し、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼの修飾サイトを判断する。

トリプシンとＬｙｓ－Ｃ二酵素切断質量ペプチドマップにおける修飾サイトの分析原理：Ｌｙｓ－Ｃがリシン（Ｋ）のＣ末端に特異的に酵素切断を行うことができ、トリプシンは塩基性アミノ酸－アルギニン（Ｒ）とリシン（Ｋ）を酵素切断サイトとして、そのＣ末端のペプチド結合に特異的に酵素切断を行う。ＰＨＣとＰＵ５中の酵素切断前後の対応する各ペプチドセグメントの変化状況を比較し、内標準ペプチドセグメントと結合することで、ＰＥＧ修飾ペプチドセグメントの減少または消失の相対割合を分析して確認することができる。ペプチドセグメントの減少または消失の相対割合により、ペプチドセグメント上の該リシンサイトがＰＥＧで修飾されるか及び修飾割合を判定することができる。指摘する必要があるのは、ＰＥＧ修飾は非均一な修飾であり、あるサイト修飾割合が高いと、該サイトが修飾されると考えられる。

具体的に以下の通りである。
（１）サンプル処理：尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼをそれぞれ酵素切断緩衝液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０％アセトニトリル、ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌに溶解希釈し、それぞれ１００μｌを取り、２μＬのＬｙｓ－Ｃを入れ、３７℃で４時間酵素切断する。即ち該溶液を膵酵素反応管（１：１００の割合）に移り、３７℃で２時間引き続き酵素切断し、４μｌのＴＣＥＰ還元溶液で３０分間引き続き反応し、さらに１０μｌの１ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液を加えて反応を終了する。
（２）分析条件：
装置：Ｔｈｅｒｍｏ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣ、ＭＳＱ Ｐｌｕｓ、
クロマトグラフィーカラム：月旭 Ｗｅｌｃｈ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ μｌｔｉｍａｔｅ(R)ＸＢ－Ｃ_１８ （４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）、
分析条件：Ａ液（０．１％ＴＦＡを含む水溶液）、Ｂ液（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル溶液）、
勾配：０－７０ｍｉｎ、Ｂ ３－７０％、
ＬＣ検出波長：２１４ｎｍ、
イオン源：ＥＳＩ、
イオンタイプ：プラスイオン、
テーパ電圧：５０Ｖ、
走査範囲：３００－２０００Ｄａ、
走査時間：１Ｓ、
ポストカラム誘導体化：約０．３ｍｌ／ｍｉｎ、
サンプル量を１００μｌ注入し、クロマトグラムを記録する。

（３）結果処理：
尿酸オキシダーゼとポリエチレングリコール化尿酸オキシダーゼのクロマトグラム（ペプチドマップ）を比較し、差分ペプチドセグメントの面積が減少する相対割合を計算する。

（４）実験結果を表２～表５、及び図６～図７に示す。

ＰＵ５ペプチドセグメントのピーク面積の低下パーセントの計算方法：
下式によってＰＵ５及びＰＨＣの同じ濃度での対応するＰＵ５ペプチドセグメントのピーク面積を計算することができる。
Ａ_１＝Ａ_０×ｔ
ここで、Ａ_１は２つの内部参照ペプチドセグメントによる換算後のＰＵ５ペプチドセグメントのピーク面積であり、Ａ_０はＰＵ５ペプチドマップペプチドセグメントの実測ピーク面積であり、ｔはＴ３０、Ｔ３１番号の内部参照ペプチドセグメント中のＰＨＣペプチドマップとＰＵ５ペプチドマップのピーク面積比の平均値、即ち０．５８８である。

内部参照による換算後のペプチドセグメントピーク面積とＰＨＣペプチドマップピーク面積は下式によって、ＰＵ５ペプチドマップ中のあるペプチドセグメントピーク面積が減少する相対割合を計算することができる。
Ｐ（％）＝（Ａ_２－Ａ_１）／Ａ_２×１００％
ここで、Ａ_２はあるペプチドセグメントがＰＨＣペプチドマップにおけるペプチドセグメントピーク面積であり、Ａ_１は内部参照による換算後の該ペプチドセグメントのＰＵ５ペプチドセグメントピーク面積である。

本実施例のタンパク質配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）分析から分かるように、尿酸オキシダーゼが修飾される潜在的なサイトはＴ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^１７、Ｋ^２１、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^４８、Ｋ^４９、Ｋ^６６、Ｋ^７４、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１５５、Ｋ^１５８、Ｋ^１６９、Ｋ^１７９、Ｋ^１９０、Ｋ^２１５、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１、Ｋ^２９３などの３１個のサイトがある。

実施例２で得られたポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの修飾サイトに対する分析から分かるように、表２、表３、表４、表５及び図６の分析に示されるように、ＰＵ５酵素切断後のペプチドセグメントが９０％以上で消失したサイトはＫ^３、Ｋ^４、Ｋ^３５、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^２２２、Ｋ^２６６、Ｋ^２８５があり、ＰＵ５酵素切断後のペプチドセグメントが８０％～９０％の範囲内で消失したサイトはＫ^７６、Ｋ^２３１がある。ＰＵ５では、これらのサイトはすべて修飾される。

同時に、発明者は、本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの修飾サイトが、市販されている薬物よりも、修飾サイトがより多く、顕著な違いがあると発見し、単酵素切断により、本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^２２２及びＫ^２３１の４つのサイトの存在するペプチドセグメントで消失割合が８０％以上であり、方法により市販されている類似薬Ｋｒｙｓｔｅｘｘ （ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ）を分析することによって、この４つのサイトの存在するペプチドセグメントでほとんど消失しなく、即ちＫ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^２２２及びＫ^２３１の４つのサイトでの市販されている類似薬の修飾率は本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼよりはるかに低い。また、本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは、市販されている薬物に比べて、免疫原性が顕著に低下し、発明者は、修飾サイトの多少と修飾サイトの違いに関係している可能性があると推測している。修飾サイトの違いと修飾度の違いにより、酵素の体内の免疫原性サイトでの保護と酵素の活性センターでの暴露に違いがあり、上記の違いは異なる修飾酵素の体内での生物学的性質の違いを引き起す。

尿酸オキシダーゼはタンパク質製剤であり、異なる化学修飾によってその安定性に異なる影響を及ぼすため、製剤を製造する際に、特定の尿酸オキシダーゼ活性成分に対して異なる補助材、ｐＨなどを選択して尿酸オキシダーゼ製剤を製造し、以下、本発明のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの製造に対する安定性が高く、生物活性が高い尿酸オキシダーゼ製剤について説明する。

実施例５：処方スクリーニング

上記実施例に言及されたポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼＰＵ５を活性成分として、ポリエチレングリコールで修飾される尿酸酵素製剤の成分をスクリーニングし、尿酸酵素活性が高く、安定性が高いポリエチレングリコール尿酸酵素製剤を取得する。前記スクリーニングは補助材処方のスクリーニングと安定剤のスクリーニングを含む。

１、補助材のスクリーニング
製剤処方補助材は、炭酸塩、リン酸塩、塩酸塩、クエン酸塩を含む。

上記緩衝液補助材と活性成分を使用してポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ製剤を製造し、補助材は同じ濃度範囲１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、同じｐＨ（ｐＨ７～９）条件下で、ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼの安定性は基本的に一致するが、製剤中に異なる補助材濃度の割合と製剤浸透圧制御の難易度は異なり、リン酸塩、塩酸塩は炭酸塩とクエン酸塩よりも浸透圧とｐＨを制御しやすい。緩衝液のスクリーニングの結果、リン酸塩、塩酸塩を補助材として使用し、リン酸塩の濃度範囲は１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌで、塩酸塩の濃度範囲は１００～２００ｍｍｏｌ／Ｌであり、製剤プロセスのニーズを満たすことができ、１５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム、０．１３６ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４の製剤は比較的良い安定性を有する。発明者はそれを基礎処方として、さらなるスクリーニングを行う。

２、安定剤のスクリーニング実験
基礎製剤の処方にマンニトール、グリセリン及びＴｗｅｅｎ－８０を添加し、安定性の考察により、本製品の製剤に相応の安定剤を添加する必要があるかどうかを決定する。

２．１ 安定剤の初期スクリーニング実験
基礎製剤の処方を対照として、基礎製剤の処方の上で４％マンニトール、２％グリセリン及び０．０４％Ｔｗｅｅｎ－８０などの安定剤をそれぞれ添加し、サンプル番号はそれぞれサンプル１～サンプル４として記録し、サンプル１－４は４５℃で７日間考察し、粒径をサンプリングして検出し、安定剤がＰＵ５製剤の安定性に対する影響を研究する。

実験の結果から分かるように、グリセリンとマンニトールを加えた処方は、その粒径（それぞれ１９．４４、２０．５１）が基礎製剤処方の粒径（１８．５７）より大きく、Ｔｗｅｅｎ－８０を加えた製剤処方は、その粒径（１８．１０）が基礎製剤処方よりやや小さく、製剤処方にＴｗｅｅｎ－８０を加えることによって、ＰＵ５粒径の増加を防止できると考えられる。

２．２ 安定剤の再スクリーニング実験
安定剤の初期スクリーニング実験から分かるように、製剤処方にＴｗｅｅｎ－８０を加えることによって、ＰＵ５粒径の増加を防止でき、安定性によりさらに確認する。初期スクリーニングされた４５℃で７日間考察した２つのサンプル、即ちサンプル１、サンプル４を４５℃の考察箱に改めて入れ、１５日放置し続けた後、粒径をサンプリングして検出し、Ｔｗｅｅｎ－８０安定剤がＰＵ５製剤の安定性に対する影響を研究する。

（１）粒径の検出結果を表６に示す。

（２）結論
４５℃で７日、２２日での考察と対照組のデータ分析から分かるように、０．０４％Ｔｗｅｅｎ－８０を加えて、４５℃で７日間考察したサンプルのＰＤＩが有意に小さく、サンプルが均一であり、４５℃で２２日考察して検出する時に、Ｔｗｅｅｎ－８０を加えるに関わらず、ＰＤＩに影響を与えなく、高温時に、Ｔｗｅｅｎ－８０を添加することは、ＰＵ５粒径増加を阻止または遅らせる上で意味がないことを示している。

２．３ ３回目の安定剤スクリーニング実験
製剤処方にＴｗｅｅｎ－８０を添加するかどうかを最終的に決定するために、Ｔｗｅｅｎ－８０を添加した処方とＴｗｅｅｎ－８０を添加しない処方の２つの処方を、それぞれ２５℃で１ヶ月と３７℃で１ヶ月考察し、粒径、高低分子タンパク質含有量、ｐＨ及び酵素比活性をサンプリングして検出し、結果を表７に示す。

表７から分かるように、ＰＵ５製剤にＴｗｅｅｎ－８０を添加した製剤とＰＵ５製剤にＴｗｅｅｎ－８０を添加しない製剤に対して、加速安定性の考察を行い、その高低分子、酵素の活性及び粒径変化の行動は基本的に一致する。

研究を重ねた結果、Ｔｗｅｅｎ－８０を添加する前後でその高、低分子タンパク質含有量と粒径に有意な差がないため、製剤処方に安定剤を添加しないことを決定する。

実施例６ 製剤ｐＨのスクリーニング

１、ｐＨ範囲の最適化
（１）研究方法
緩衝塩で製剤処方溶液のｐＨをそれぞれ７．８、７．０、７．４、８．２、８．６に調整する。サンプルをそれぞれ２～８℃、２５±２℃及び３７℃に放置して安定性考察を行い、それぞれ３０日に高、低分子タンパク質含有量と酵素の活性を測定する。各処方中のＰＵ５タンパク質の重合または分解状況及び酵素の活性の変化を比較する。

（２）測定結果

測定結果を表８と図８～１１に示す。

図８～１１と表８から分かるように、２～８℃と２５±２℃で３０日考察し、処方５（ｐＨ ７．８）、処方６（ｐＨ ８．２）、処方７（ｐＨ ７．４）の高分子タンパク質含有量が低下する傾向があり、低分子タンパク質含有量はわずかに増加する傾向があり、処方７＞処方５＞処方６であり、３つの処方中の酵素の活性は有意な変化がない。これにより、ＰＵ５製剤のｐＨを７．４～８．２に制御する。３７℃で３０日間高温考察し、処方５、６、７の高分子タンパク質含有量の三者の間に有意な差がないが、低分子タンパク質含有量が増加し、処方７＞処方５＞処方６である。これにより、ＰＵ５製剤のｐＨ中点は７．８である。

以上のように、本製品のＰＵ５注射液製剤のｐＨ範囲は７．４～８．２であることが確認された。

本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼは、市販されている市薬物よりも、免疫原性が顕著に低く、発明者は、修飾サイトの多少と修飾サイトの違いに関係している可能性があると推測している。修飾サイトの違い及び修飾度の違いにより、酵素の体内の免疫原性サイトでの保護と酵素の活性センターでの曝露に違いがあり、上記の違いは異なる修飾酵素の体内での生物性質の違いを引き起こす可能性がある。

以下、本願のポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼ製剤（ＰＵ５製剤）の薬物の動物体内評価について詳しく説明し、実験に用いるｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとは、既に市販されている類似薬であり、バッチ番号は５０８５Ｂである。

実施例７ ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼ製剤の体内薬効学研究

７．１、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼのモデルラットでの体内薬効評価
オキサジン酸カリウム飲用水と高尿酸飼料を併用してラット慢性高尿酸血症モデルを誘導し、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼ（ＰＵ５製剤）がラット慢性高尿酸血症に対する治療作用を評価する。

モデルラットを４０匹選択し、ランダムに４群に分け、即ちモデル群、ポリエチレングリコール化尿酸酵素低用量投与群（０．３ｍｇ／ｋｇ）、ポリエチレングリコール化尿酸酵素中用量投与群（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ポリエチレングリコール化尿酸酵素高用量投与群（３．０ｍｇ／ｋｇ）であり、群ごとに１０匹であり、正常なＳＤラットを１０匹別途に選択してブランク対照群とする。試験は５週間連続的にモデル作製し、１週モデル作製した後に筋肉投与を開始し、週に１回投与し、４週連続投与し、投与前及び投与後７日間ごとのラット血清尿酸、血清尿素窒素、血清クレアチニンレベルをそれぞれ検出し、試験終了後にラット腎臓組織学的変化を観察した。

図１２の結果から示すように、モデル作製後の７、１４、２１、２８及び３５日目には、ブランク対照群と比較して、モデル対照群の血尿酸レベルはすべて顕著に増加し、モデル作製後７日目にモデル群のラットの血清尿素窒素、クレアチニン及び尿酸はそれぞれブランク群ラットの２．７３倍、２．４０倍及び７．８３倍である。腎臓病理から見ると（図１３に示すように）、モデル対照群の尿細管拡張、壊死、炎症及び線維化のスコアはすべて顕著に増加し、同時に尿酸塩の結晶数も顕著に増加した。被験物のポリエチレングリコール化尿酸酵素中高用量はすべて血清尿酸レベルを顕著に低下させ、且つ用量との相関性を示し、１４日～３５日の間、中用量群の血尿酸レベルの平均値は３０３．８０－６６０．６０μｍｏｌ／Ｌに維持され、高用量群の血尿酸レベルの平均値は１５３．７０－４０３．４０μｍｏｌ／Ｌに維持され、モデル群と比べて、中用量群の血尿酸の低下幅は３４．４６－６７．９４％であり、高用量群の血尿酸の低下幅は６５．６７－８３．７８％である。モデル対照群と比べて、ポリエチレングリコール化尿酸酵素の各投与群は尿細管拡張、腎臓壊死及び炎症に対してすべて顕著に改善な作用がある。

７．２、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼのラットの体内での単回投与評価
ＳＤラットを３６匹取り、雌雄各半分をランダムに６群に分け（表９参照）、即ち市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈注射群、筋肉注射群、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼ静脈注射群及びポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼ低、中、高（０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｋｇ）用量筋肉注射群であり、投与の具体的な手段と用量を表９に示す。頚静脈採血によりＰＫとＰＤを検出する。

７．２．１、薬物動態比較
ＳＤラットの投与前の全ての個体の血清薬物濃度レベルは定量下限（ＬＬＯＱ：３１２．５００ｎｇ／ｍＬ）より低く、０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｋｇ１回に筋肉注射し、０～１６８ｈ（０～７日）範囲内で、ポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液（ＰＵ５製剤）投与後の血清薬物濃度は用量の相関性があり、全体のレベルが薬用量の増加に伴って増加し、１６８ｈを超えた後、ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ筋肉投与群の血中濃度は定量下限より低く、ＰＵ５製剤筋肉投与群は２４０ｈ以上引き続き維持することができる。

投与後、１．０ｍｇ／ｋｇ Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ 静脈注射と筋肉注射群、１．０ｍｇ／ｋｇポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液静脈注射及び０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｋｇポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液筋肉注射群の各群の雌性と雄性ＳＤラット体内のＣ_ｍａｘ（Ｃ_５ｍｉｎ）比は０．７５～０．９９範囲内であり、ＡＵＣ_ｌａｓｔ比が０．５４～０．９４範囲内で、ＡＵＣ_０－∞比が０．５８～０．９７範囲内である。これから分かるように、Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素（ＰＵ５製剤）注射液がＳＤラットの体内での曝露レベルは明らかな性差がなかった。

しかしながら、ＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）の市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅを投与し、静脈投与群のＡＵＣ_ｌａｓｔは４２６．４８±６５．３４であり、筋肉注射群のＡＵＣ_ｌａｓｔは２６４．１９±７８．２２であり、ＰＵ５製剤注射液静脈投与群のＡＵＣ_ｌａｓｔは５６５．６１±１６１．６０であり、筋肉注射群のＡＵＣ_ｌａｓｔは３３７．８６±２２７．３４である。同量で、同じ投与方式条件下で、ＰＵ５製剤のＡＵＣ_ｌａｓｔは市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅよりも高い。

ＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）の市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅを投与し、静脈投与群ｔ１／２（ｈ）は４９．５１±８．１２であり、筋肉投与群ｔ１／２（ｈ）は５５．２１±１３．５０である。ＰＵ５製剤注射液静脈投与群ｔ１／２（ｈ）は８６．１２±３３．８２であり、筋肉投与群ｔ１／２（ｈ）は６０．４５±２１．３７である。同量で、同じ投与方式条件下で、ＰＵ５製剤注射液のｔ１／２（ｈ）は市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅより長い。

上記薬物動態結果を表１０～表１５、図１４～図１６に示す。

７．２．２、体内薬効の比較（尿酸）
０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｋｇ ポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を１回筋肉注射した後、投与後１日、３日に尿酸濃度はいずれも低いレベルに維持され、投与後７日に各用量群の尿酸レベルが回復し始め、薬用量が高いほど、尿酸が体内で低レベルを維持する時間は長くなる。同量の静脈注射群と比較して、ＰＵ５製剤静脈注射群の血清尿酸が低濃度レベルを維持する時間はいずれもｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈注射群より長い。同量の筋肉注射群と比較して、ＰＵ５製剤筋肉注射群血清尿酸が低濃度レベルを維持する時間はいずれもｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ筋肉注射群より長い。同量群と比較して、ＰＵ５製剤静脈注射または筋肉注射群の血清尿酸が低濃度レベルを維持する時間はいずれもｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈注射群または筋肉注射群よりも長く、即ちＰＵ５製剤が体内で低濃度レベルを維持する時間はいずれもｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅよりも長い。結果を図１７に示す。

７．３、ポリエチレングリコール尿酸オキシダーゼのラットの体内での複数回投与評価
本試験では、４個の群を設定し、それぞれ市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈注射群、筋肉注射群、ポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液（ＰＵ５）静脈注射群、筋肉注射群であり、群ごとに８匹であり、雌雄各半分、合計３２匹のＳＤラットである。Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ及びポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液静脈注射群には静脈注射を採用し、Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液筋肉注射群には筋肉注射を採用する。薬用量はいずれも１．０ｍｇ／ｋｇである。週に１回投与し、４回連続投与する。

結果の分析から分かるように、
ＳＤラットに１．０ｍｇ／ｋｇ Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を複数回静脈／筋肉注射した。ラットの一般的な状况に薬物関連の異常な変化が見られなかった。

７．３．１ 抗ＰＥＧ抗体検出
ＳＤラットに４回連続投与した後、初めて投与する前に、全ての個体動物から抗ＰＥＧ抗体と抗ＰＨＣ抗体が検出されなく、投与終了後、全ての動物から抗ＰＨＣ抗体が検出されなく、Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈、筋肉注射群、ポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液静脈、筋肉注射群の各群から抗ＰＥＧ抗体が検出され、陽性結果の割合はそれぞれ３／８、１／８、１／８、１／８である。ＰＥＧ免疫組織化学検査により、ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ静脈注射群と筋肉注射群の脾臓、肝臓及び腎臓にＰＥＧの弱い陽性発現が見られた。ポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液静脈注射群と筋肉注射群にはＰＥＧ陽性発現が見られなかった。結果を表１３に示す。

以上の分析から分かるように、ＰＵ５製剤とｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅにより産生された抗体は尿酸オキシダーゼ部分に対する抗体ではなく、主にＰＥＧ部分に対する抗体であり、両者とも尿酸オキシダーゼの免疫原性サイトを効果的に遮蔽できることを説明した。ＰＥＧ抗体の産生は体内で一部の副作用を引き起こすが、表１６の結果によると、本願のＰＵ５製剤の免疫原性は市販品のｐｇｅｌｏｔｉｃａｓｅより低い。

ＰＥＧ抗体及びＰＥＧ免疫組織化の結果から分かるように、ＰＵ５製剤とｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅはいずれも筋肉投与群が静脈投与群より優れ、その中、静脈投与群で産生された抗ＰＥＧ抗体は、ＰＵ５製剤がｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅより優れ、筋肉投与群で産生された抗ＰＥＧ抗体は、ＰＵ５製剤がｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅより優れる。

４．３．２ 薬物動態検出
ＳＤラットにＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を複数回静脈、筋肉注射で投与した後、各群の動物の主な薬物動態パラメータに明らかな性差がない。４回連続投与した後、２種の薬物がラットの体内でわずかに蓄積されている。

ＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）の市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅを複数回静脈／筋肉注射で投与し、初めて投与後、ラット体内での絶対的バイオアベイラビリティはそれぞれ５１．３５％であり、最後投与後、ラット体内での絶対的バイオアベイラビリティはそれぞれ４５．９８％である。ＳＤラットに同量（１．０ｍｇ／ｋｇ）のポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を複数回静脈／筋肉注射で投与し、初めて投与後、ラット体内での絶対的バイオアベイラビリティはそれぞれ５８．２９％であり、最後投与後、ラット体内での絶対的バイオアベイラビリティはそれぞれ５２．６０％である。

４．３．３ 体内薬効比較（尿酸）
ＳＤラットに１．０ｍｇ／ｋｇ Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅとポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液を４回（１回／週）連続静脈、筋肉注射し、投与後ごとに血清尿酸濃度はいずれも低いレベルに維持され、最後投与後の１４日にＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅ筋肉注射群が回復し始め、他の各群は最後投与後の１８日に回復し始める。同量の市販薬Ｐｅｇｌｏｔｉｃａｓｅと比べて、２種の薬物静脈注射群の維持時間が比較的一致し、ポリエチレングリコール化尿酸酵素注射液筋肉注射群の維持時間は市販薬よりも長く、即ちＰＵ５製剤は筋肉投与の治療効果がＰｅｇｌｏｔｉｃａｓｅより優れる。

上記結果を表１７～表１９、図１８～図２２に示す。

本明細書の説明では、「一実施例」、「いくつかの実施例」、「例」、「具体例」、または「いくつかの例」という参考用語などの説明は、該実施例または例を組み合わせて説明する具体的な特徴、構造、材料または特点は本発明の少なくとも１つの実施例または例に含まれる。本明細書では、上記用語例示的な叙述は必ずしも同じ実施例または例を対象とする必要がない。また、説明する具体的な特徴、構造、材料または特点はいずれかまたは複数の実施例または例では適切な方式で結合することができる。なお、互いに衝突しない場合、当業者は本明細書に説明される異なる実施例または例以及び異なる実施例または例の特徴を結合と組み合わせることができる。

本発明の実施例を提示し記述したが、上記実施例は例示的なものであり、本発明を制限するためのものとして理解することができなく、当業者であれば、本発明の範囲で上記実施例について様々な変化、修正、置換および変形が可能であることが理解できる。

Claims (24)

1. 尿酸オキシダーゼ製剤であって、
   ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼから選ばれる活性成分と、
   リン酸塩及び塩酸塩のうちの少なくとも１種を含む緩衝剤から選ばれる補助材と、を含む、ことを特徴とする尿酸オキシダーゼ製剤。
2. 前記尿酸オキシダーゼ中のアミノ酸サイトとして、Ｔ^１、Ｋ^３、Ｋ^４、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^７６、Ｋ^７９、Ｋ^９７、Ｋ^１１２、Ｋ^１１６、Ｋ^１２０、Ｋ^１５２、Ｋ^１７９、Ｋ^２２２、Ｋ^２３１、Ｋ^２６６、Ｋ^２７２、Ｋ^２８５、Ｋ^２９１及びＫ^２９３のうちの少なくとも１１つはＰＥＧ修飾を有し、前記アミノ酸サイトの局在化はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列で局在化される、ことを特徴とする請求項１に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
3. 前記尿酸オキシダーゼ中のアミノ酸サイトとして、Ｋ^３０、Ｋ^３５、Ｋ^２２２及びＫ^２３１のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは４つはＰＥＧ修飾を有する、ことを特徴とする請求項２に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
4. 前記ポリエチレングリコールはモノメトキシまたは水酸基を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
5. 前記ポリエチレングリコールは直鎖または分岐鎖構造である、ことを特徴とする請求項１に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
6. 前記ポリエチレングリコールと尿酸オキシダーゼとはアミド結合によりカップリングされる、ことを特徴とする請求項１に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
7. 前記ポリエチレングリコールは修飾性ポリエチレングリコールであり、前記修飾性ポリエチレングリコールの修飾基は、
   Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドカーボネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドアセテート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドプロピオン酸エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド酪酸エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドコハク酸エステル及びｐ－ニトロフェニルカーボネートから選ばれる少なくとも１つである、ことを特徴とする請求項１－６のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
8. 前記修飾性ポリエチレングリコールの修飾基はＮ－ヒドロキシスクシンイミドプロピオン酸エステルである、ことを特徴とする請求項７に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
9. 前記尿酸オキシダーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７で示されるアミノ酸配列、または、
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド、または
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７と比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は添加を有するポリペプチドを有する、ことを特徴とする請求項１に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
10. 前記尿酸オキシダーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～４で示されるアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
11. 前記緩衝剤は、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム及び塩化ナトリウムから選ばれる少なくとも１つを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
12. 前記尿酸オキシダーゼ製剤のｐＨは７～９である、ことを特徴とする請求項１に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
13. 前記尿酸オキシダーゼ製剤のｐＨは７．４～８．２である、ことを特徴とする請求項１２に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
14. 前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼと緩衝剤との質量比は（５～６）：（６～３７）である、ことを特徴とする請求項９または１０に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
15. 前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼと緩衝剤との質量比は６：１０である、ことを特徴とする請求項１４に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
16. 前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼと前記リン酸塩との質量比は（５～６）：（１～７）であり、前記リン酸塩はリン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムである、ことを特徴とする請求項９または１０に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
17. 前記ポリエチレングリコール修飾尿酸オキシダーゼと前記塩化ナトリウムとの質量比は（５～６）：（５～３０）である、ことを特徴とする請求項９または１０に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
18. 前記リン酸塩と前記塩化ナトリウムとの質量比は（１～７）：（５～３０）であり、前記リン酸塩はリン酸水素二ナトリウム及び／又はリン酸二水素ナトリウムである、ことを特徴とする請求項９または１０に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
19. 前記尿酸オキシダーゼ製剤の剤形は、液体、半固体及び固体の少なくとも１つを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
20. 前記製剤は単剤形の形態であり、製剤ごとに６ｍｇの尿酸オキシダーゼを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の尿酸オキシダーゼ製剤。
21. 請求項１～２０のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼ製剤の、高尿酸血症及びその関連疾患を治療または予防するための薬物の製造における使用。
22. 請求項１～２０のいずれか１項に記載の尿酸オキシダーゼ製剤を含む、ことを特徴とする薬物組成物。
23. 高尿酸血症及び関連疾患を治療または予防するための薬物をさらに含む、ことを特徴とする請求項２２に記載の薬物組成物。
24. 高尿酸血症及び関連疾患を治療または予防する方法であって、
    被験者に薬学的に許容できる量の請求項１～２０に記載の尿酸オキシダーゼ製剤または請求項２２～２３のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、ことを特徴とする方法。

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