KR20230104666A - 요산 산화효소 제제 및 이의 응용 - Google Patents

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Abstract

요산 산화효소 제제를 제공하며, 상기 요산 산화효소 제제는, 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소로부터 선택되는 활성 성분; 및 완충 시약으로부터 선택되는 부원료를 포함한다.

Description

요산 산화효소 제제 및 이의 응용
본 발명은 생물 의약 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 요산 산화효소 제제, 약학 조성물에 관한 것이다.
통풍은 장기간의 퓨린 대사 장애 또는 요산의 배설 감소로 인해 발생되는 질환으로, 고요산혈증이 그 임상 특징이며, 요산염의 용해성 저하로 인해 결정이 피하, 관절, 신장에 축적되어 통풍 결절을 형성하여 재발성 급성 관절염을 초래하고, 신장을 침범하여 요손 요로 결석증 및 간질 신염을 유발한다. 인체 내의 퓨린은 효소 작용에 의해 최종 생성물인 요산으로 전환되는데, 정상적인 경우에 남성 혈액에서 요산 함량은 149~416 mmol/L이고, 여성 혈액에서 요산 함량은 89~357mol/L이며, 체내 요산량은 약 1200 mg이고, 생성과 배설량은 약 600 mg/일으로 균형 상태이다. 그러나 체내에서 요산을 과다하게 섭취하거나 배설 기전이 장애가 발행하여 혈액 중 요산이 70 mg/L 이상 축적되면 고요산혈증이 발생한다. 요산 나트륨은 혈액이나 윤막액에서 포화 상태에 도달하면 결정화되어 석출되거나 장기간의 고요산혈증으로 인해 관절과 연조직 주위에 결정화 및 침전되어 통풍성 급성 관절염이나 통풍성 만성 관절염 및 관절 기형을 유발할 수 있다. 요산염은 신세뇨관, 신간질에 침착되어 만성 요산신병증을 일으킬 수 있으며; 중증 고요산혈증 환자(예: 백혈병 및 림프종 등 악성 종양 환자)에서는 단기간에 다량의 요산 침착이 요로 폐쇄를 일으키고, 요산 신병증이라고도 하는 급성 신부전을 일으킨다.
고요산혈증의 원인은 인간 진화 과정에서 우리카아제 유전자의 돌연변이 및 불활성화와 관련이 있어 인간 스스로 우리카아제를 합성할 수 없다. 현재 고요산혈증을 치료하는 방법 중 하나는 우리카아제를 사용하여 환자 체내의 요산 함량을 줄이는 것이다.
요산 산화효소(EC1.7.3.3)는 미생물(Bacillus fastidious, Candida monocytogenes, 아스퍼질루스 플라부스), 식물(대두, 병아리콩), 동물(돼지, 소, 개, 개코원숭이)에 널리 존재한다(Suzuki K, Sakasegawa S, Misaki H, SugiyamaM.J Biosci Bioeng.2004.98: 153-158). 이는 산소 존재 하에 요산을 촉매화하여 알란토인을 산화시키고 이산화탄소를 방출할 수 있다(Retailleau P, Colloc'h, Denis V, Francoise B.Acta Cryst D.2004.60: 453-462.). 활성을 갖는 우리카아제는 4량체 단백질로, 동일한 서브유닛으로 구성되며, 각 서브유닛의 분자량은 약 34kD이고, 301~304개의 아미노산으로 구성된다. 각 용액에서 우리카아제의 효소 활성이 가장 높을 때의 pH값은 8.0이다(Bayol A etal.Biophys Chem.1995.54: 229-235.).
활성을 갖는 우리카아제는 4량체 단백질로, 동일한 서브유닛으로 구성되며, 각 서브유닛의 분자량은 약 34kD이고, 301~304개의 아미노산으로 구성된다. 각 용액에서 우리카아제의 효소 활성이 가장 높을 때의 pH값은 8.0이다(Bayol A etal.Biophys Chem.1995.54: 229-235.). 현재 알려진 모든 유래의 우리카아제 중 활성이 가장 높은 것은 아스퍼질루스 플라부스로부터 유래되는 것으로, 27 IU/mg에 도달하고; 두번째는 Bacillus fastidious에서 유래되는 것으로 그 활성은 13 IU/mg을 유지한다(HuangS H, Wu T K.Eur J Biochem.2004.271:517-523.). 이 밖에, 콩류 식물 유래 우리카아제는 2~6 IU/mg의 활성만을 갖고 있으며; 포유동물 유래 우리카아제는 재조합 발현 후, 돼지 유래 우리카아제 활성이 5 IU/mg에 도달할 수 있으며, 개코원숭이 유래 우리카아제 활성은 1 IU/mg에 불과하고(Michael H, Susan J.K.2006.US7056713B1), 인간 유래 우리카아제는 비활성화되어 있다.
인체 응용에 있어서, 미생물 우리카아제의 높은 활성과 포유동물 우리카아제의 낮은 면역원성으로 인해 이들로부터 유래된 우리카아제는 현재 재조합 우리카아제의 개발 및 응용에서 연구 초점이 되고 있다. 그러나 아스퍼질루스 플라부스 유래 우리카아제와 추측된 인간 유래 우리카아제의 상동성은 40% 미만이다(Lee C C, Wu X, Gibbs R A, Cook R G, Muzny D M, CaskeyC T.Science.1988.239: 1288-1291.), 인체는 우리카아제에 대한 항체를 생성하기 쉽기 때문에 아스퍼질루스 플라부스 우리카아제의 효능이 급격히 약화됨과 동시에 중증 알레르기 반응을 유발하여 장기간 치료에 사용할 수 없다.
단백질로서 요산 산화효소는 약학 제제로 제조될 때 효소 활성, 안정성 및 보존 시간을 보장해야 하는데, 상이한 제조 방법, 제형, 완충제, 안정제 등은 모두 요산 산화효소의 보존 시간 및 활성에 영향을 미치며, 아울러 단백질 구조의 화학적 변형 역시 요산 산화효소 제제의 안정성에 영향을 미친다.
따라서, 안정적으로 보존할 수 있고 요산 산화효소의 활성을 보장할 수 있는 요산 산화효소 제제의 개발이 필요하다.
본원 발명은 아래 사실 및 문제점에 대한 발명인의 발견 및 이해를 기반으로 한다.
활성 요산 산화효소는 동종 4량체 단백질로, 그중 아미노산의 1/3은 강한 소수성 아미노산이고, 4량체 단백질 간에는 쉽게 응집되어 8량체 및 더 큰 응집체를 형성한다. 분자량이 100kDa 이상인 분자는 신체가 면역 반응을 일으키도록 효과적으로 유도할 수 있는 반면, 비 변형 폴리머 요산 산화효소 단백질의 분자량은 이미 140kDa에 도달하고, 분자량이 더 큰 폴리머 우리카아제는 더 높은 면역원성을 갖는다. 인체는 우리카아제에 대한 항체를 생성하기 쉽기 때문에 그 효능을 급격히 약화시키고 심한 알레르기 반응을 일으켜 장기간 치료에 사용할 수 없다. PEG로 단백질을 공유적으로 변형함으로써 단백질 면역원성을 감소시킬 수 있고 단백질 용해도를 증가시킬 수 있으며 단백질의 반감기를 연장할 수 있음이 입증되었다.
Duke University와Savient사는 돼지 유래 및 개코원숭이 유래 키메라 우리카아제에 대한 연구를 수행하였다(Michael H, Susan J.K.2006.US7056713B1). 해당 연구 방법은 효소 활성을 크게 감소시키지 않으면서 분자량이 10KDa인 메톡시 함유 폴리에틸렌 글리콜(10KDa-mPEG-NPC)로 돼지 유래 우리카아제 라이신 잔기의 ε-아미노기를 변형(얻어진 변형 생성물은 Pegloticase임)하여 인체 내 난치성 통풍 치료의 목표를 기본적으로 구현하였다. 발명인은 상기 연구 성과가 약물로 인한 면역원성을 완전히 해결할 수 없음을 발견하였는 바, 임상 피험자들은 여러 회 주사 후 우리카아제 효능의 소실 현상이 나타났는데 이는 과도하게 큰 Pegloticase 단백질 분자량과 관련이 있을 수 있는 것으로 발명인은 추측하였다(10kd의 PEG를 적용하면 Pegloticase 분자량이 540 kDa가 됨). 동시에 pegloticase는 주사에는 적합하지 않지만 정맥내 불루스 주사에 적합하므로 피험자의 장기간 사용 순응도를 감소시키고 나아가 이의 임상 응용을 심각하게 제한한다. 현재까지 면역원성이 더 낮고 피하 주사가 가능한 지속성 요산 산화효소 약물이 존재하지 않는 실정이다.
폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 요산 산화효소를 변형하면, 상이한 변형 수 및 변형 부위에 따라 요산 산화효소의 성질이 변경되고, 나아가 요산 산화효소 제제의 조성은 제제에서 상이한 요산 산화효소의 효소 활성, 안정성 및 보존 시간이 표준에 부합되도록 변경되어야 한다.
본 발명은 관련 기술의 기술적 과제 중 하나를 적어도 어느 정도 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 요산 산화효소 제제를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 요산 산화효소 제제는, 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소로부터 선택되는 활성 성분; 및 인산염, 염산염 및 탄산염 중 적어도 하나를 포함하는 완충 시약으로부터 선택되는 부원료를 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 제제의 처방은 조성이 간단하고, 요산 산화효소가 제제 처방 하에서 높은 안정성을 가지며, 상기 제제의 제조는 생산 비용을 절감할 수 있고 생산 효율이 높다.
또한, 본 발명의 상기 실시예에 따른 요산 산화효소 제제는 하기와 같은 부가적 기술특징을 더 구비한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 요산 산화효소의 하기 아미노산 부위 중 적어도 11개가 PEG 변형을 갖는다: T1, K3, K4, K30, K35, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K179, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293.
본 발명의 실시예에 따르면, 접합 반응 생성물을 한외여과 및/또는 정제 처리하는 단계를 더 포함한다. 이에 따라 비 변형 폴리에틸렌 글리콜 및 NHS와 같은 부산물을 효과적으로 제거할 수 있고, 얻어진 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 순도를 효과적으로 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 하기 4개 아미노산 부위 중 적어도 하나가 PEG 변형을 갖는다: K30, K35, K222 및 K231.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 아미노산 부위는 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열에 의해 위치 결정된다.
TYKKNDEVEFVRTGYGKDMIKVLHIQRDGKYHSIKEVATTVQLTLSSKKDYLHGDNSDVIPTDTIKNTVNVLAKFKGIKSIETFAVTICEHFLSSFKHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRSIVLQKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISLPNIHYLNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO:1).
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 요산 산화효소는 SEQ ID NO:1~7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
MAHYRNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMIKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDVIPTDTIKNTVNVLAKFKGIKSIETFAVTICEHFLSSFKHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRSIVLQKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISLPNIHYLNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGRITGTVKRKLTSRL(SEQ ID NO:2).
MYKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYVYGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHNPTGTHFCEVEQMRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATKVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVHSLSRVPEMEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO:3).
MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYVYGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHNPTGTHFCEVEQMRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATKVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVHSLSRVPEMEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGRITGTAKRKLASKL(SEQ ID NO:4).
MAHYHNDYQKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLNSRREYLHGDNSDIIPTDTIKNTVQVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSFNHVIRVQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFLKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWEAVRGIVLKKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSQLPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGRITGTVKRKLTSRL(SEQ ID NO:5).
MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHALAKFKGIKSIEAFAVNICQHFLSSFNHVIRTQVYVEEIPWKRLEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFAAQVYCKWRYHQCRDVDFEATWDTIRDVVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVVSLSQVPEIDDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO:6).
MADYHNNYKKNDELEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFGVNICEYFLSSFNHVIRAQVYVEEIPWKRLEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQCRDVDFEATWGTIRDLVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO:7).
여기서, SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열은 돼지 유래 및 개코원숭이 유래 키메라 우리카아제(돼지-개코원숭이)의 아미노산 서열이고; SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 서열은 돼지 유래 요산 산화효소의 아미노산 서열이며; SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열은 개 유래 및 개코원숭이 유래(개-개코원숭이) 키메라 요산 산화효소의 아미노산 서열이고; SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열은 개 유래 요산 산화효소의 아미노산 서열이며; SEQ ID NO:5로 표시되는 아미노산 서열은 소 유래 요산 산화효소의 아미노산 서열이고; SEQ ID NO:6로 표시되는 아미노산 서열은 원숭이의 요산 산화효소아미노산 서열이며; SEQ ID NO:7로 표시되는 아미노산 서열은 개코원숭이의 요산 산화효소아미노산 서열이다.
유의해야 할 점은, 본 발명의 라이신은 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열에 의해 위치 결정되는 바, 예를 들어 K4는 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열에 기반하여 제4 위치에 위치하는 라이신을 의미한다. SEQ ID NO:1~7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 우리카아제 또는 SEQ ID NO:1~7과 비교하여 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드; 또는 SEQ ID NO:1~7과 비교하여, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 폴리펩티드는 구조 상에서 상동성을 가지며, 당업자는 서열 비교를 통해 SEQ ID NO:2~7 또는 SEQ ID NO:1~7과 비교하여, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 SEQ ID NO:1~7과 비교하여, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 폴리펩티드에서 T1, K3, K4, K30, K35, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K179, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293　부위에 대응되는 대응 부위를 결정하고, 나아가 상기 폴리펩티드의 비교에서 대응 부위에 발생하는 PEG 변형을 결정하여 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 낮은 면역원성, 높은 생체 내 안정성, 근육내 주사에 적합한 장점을 구현할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 실시예에 따르면, SEQ ID NO:2로 표시되는 서열과 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열의 T1, K3, K4, K30, K35, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K179, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293　부위의 대응 부위는 M1, K9, K10, K36, K41, K82, K85, K103, K118, K122, K126, K158, K185, K228, K237, K272, K278, K297, K299를 포함하고; SEQ ID NO:3으로 표시되는 서열과 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열에 해당되는 부위의 대응 부위는 M1, K3, K29, K34, K75, K78, K111, K115, K119, K151, K178, K221, K230, K265, K271, K284, K290, K292를 포함하며; SEQ ID NO:4로 표시되는 서열과 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열에 해당되는 부위의 대응 부위는 M1, K9, K10, K36, K41, K82, K85, K118, K122, K126, K158, K185, K228, K237, K272, K278, K297, K299를 포함하고; SEQ ID NO:5로 표시되는 서열과 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열에 해당되는 부위의 대응 부위는 M1, K10, K36, K41, K82, K85, K118, K122, K126, K158, K185, K228, K237, K272, K278, K297, K299를 포함하며; SEQ ID NO:6으로 표시되는 서열과 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열에 해당되는 부위의 대응 부위는 M1, K9, K10, K36, K41, K82, K85, K103, K118, K122, K126, K158, K185, K228, K237, K272, K278, K297, K299를 포함하고; SEQ ID NO:7로 표시되는 서열과 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열에 해당되는 부위의 대응 부위는 M1, K9, K10, K36, K41, K82, K85, K103, K118, K122, K126, K158, K185, K228, K237, K272, K278, K297, K299를 포함한다. 발명인은 실험을 통해 상기 SEQ ID NO:2~7로 표시되는 아미노산 서열의 해당 부위 중 적어도 11개 부위를 PEG 변형시킨 후, 얻어진 PEG에 의해 변형된 요산 산화효소가 낮은 면역원성, 높은 생체 내 안정성, 근육내 주사에 적합한 장점을 갖는다는 것을 발견하였다.
본 발명의 실시예에 따르면, 폴리에틸렌 글리콜로 변형되지 않은 상기 요산 산화효소의 펩타이드 맵과 비교하여, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 펩타이드 맵은 적어도 11개의 소정의 펩타이드 단편을 갖는 피크 면적이 감소된 상대적 비율은 75% 이상이고, 바람직하게는 80% 이상이며, 보다 바람직하게는 90% 이상이다. 본 발명의 실시예에 따른 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소는 낮은 면역원성, 높은 생체 내 안정성, 근육내 주사에 적합한 장점을 갖는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 PEG 변형용 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 6KD 이하이다. 발명인은 분자량이 6KD 이하인 폴리에틸렌 글리콜로 변형하여 얻어진 요산 산화효소는 생체 내 장기 효과를 강화하고, 과도한 분자량으로 인해 심각한 항-PEG 항체가 생성되지 않는 바, 즉 면역원성이 더욱 감소됨을 발견하였다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 모노메톡실기 또는 히드록실기를 갖는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 분지형 구조이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜과 요산 산화효소는 아미드 결합을 통해 접합된다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 변형 폴리에틸렌 글리콜이고, 상기 변형 폴리에틸렌 글리콜의 변형기는, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시숙신이미딜카르보네이트, N-히드록시숙신이미딜아세테이트, N-히드록시숙신이미딜프로피오네이트, N-히드록시숙신이미딜부티레이트, N-히드록시숙시닐숙시네이트 및 비스(p-니트로페닐)카보네이트로부터 선택되는 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 변형 폴리에틸렌 글리콜의 변형기는 N-히드록시숙신이미딜프로피오네이트이다.
본 발명의 실시예의 방법에 따르면, 요산 산화효소의 면역원성을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 얻어진 생체 내 요산 산화효소의 안정성이 더욱 높으며, 작용이 더 오래 지속된다.
전술한 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 제조 방법의 부가적 기술특징의 기술적 효과는 본 발명의 실시예에 따른 상기 요산 산화효소의 면역원성을 감소시키는 방법의 부가적 기술특징에 적용될 수 있음을 이해할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 상기 요산 산화효소의 면역원성을 감소시키는 방법의 부가적 기술특징은 여기서 더 이상 설명하지 않는다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 완충 시약은 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨 일수화물 및 염화나트륨 중 적어도 하나를 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 요산 산화효소 제제는 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨 일수화물 및 염화나트륨을 부원료로 사용함으로써 요산 산화효소의 효소 비활성을 보장할 수 있고, 저온, 상온 및 고온 조건에서 30일 동안 보존된 효소 비활성, 단백질 분해 및 응집 정도 등의 지표는 모두 예상에 부합되었다. 또한, 글리신, 수크로스 등을 첨가해야 하는 종래의 요산 산화효소 제제에 비해 본 발명의 방법은 처방 이 간단하고 제제의 안정성이 높다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 완충 시약은 산-염기 공액 성분의 작용을 통해 pH 변화에 저항하는 완충제를 의미한다. 완충제는 본 발명의 액체 또는 고체 제제에 존재할 수 있고, 본 발명의 완충제는 제제의 pH를 7~9로 제어하며, pH를 7~9 범위 내로 제어하는 단독 또는 조합 형태의 완충제는 아세테이트, 숙시네이트, 글루코네이트, 히스티딘, 구연산염, 인산염, 말레산염, 디메틸아르시네이트, 2-[N-모폴리노]에탄 술폰산(MES), 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스[히드록시메틸]메탄(Bis-Tris), N-[2-아세트아미도]-2-이미노디아세트산(ADA), 글리세린 아미노아실글리신 및 기타 유기산 완충제를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 요산 산화효소 제제의 pH는 7~9, 바람직하게는 7.4~8.2이다. 반복적인 시험 및 분석 결과, 발명인은 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 제제가 상기 pH 조건에서 높은 안정성을 갖고, 요산 산화효소가 쉽게 응집, 분해되지 않으며, 효소 비활성이 높다는 것을 발견하였다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 우리카아제 제제의 pH는 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 대 완충 시약의 질량비는 (5~6):(6~37), 바람직하게는6:10이다. 본 발명의 실시예의 요산 산화효소 제제에 따르면, 상기 비율로 제제를 조제함으로써, 제제의 pH를 7.4~8.2로 보장하고, 상기 요산 산화효소의 안정성을 보장할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 대 완충 시약의 질량비는 6:10, 6:11, 5:10, 5:11, 5:9, 6:9이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 대 상기 인산염의 질량비는 (5~6):(1~7)이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 대 상기 염화나트륨의 질량비는 (5~6):(5~30)이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 인산염 대 상기 염화나트륨의 질량비는 (1~7):(5~30)이고, 여기서 상기 인산염은 인산수소이나트륨 및/또는 인산이수소나트륨이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명에 의해 제공되는 요산 산화효소 제제는 글리세린, 글루코스, 만니톨, Tween-80 등의 안정제를 첨가할 필요 없이 완충제만 사용하여 본 발명에 의해 제공되는 요산 산화효소의 안정성을 보장하여 안정성이 높은 요산 산화효소 제제를 얻을 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 요산 산화효소에 만니톨 및/또는 글리세롤을 첨가하면 요산 산화효소의 입경이 증가하지만, Tween-80의 첨가는 본 발명 실시예의 요산 산화효소의 안정성에 큰 영향을 미치지 않는다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 요산 산화효소 제제의 제형은 액체, 반고체 및 고체 중 적어도 하나를 포함한다. 본 발명의 실시예에 따른 요산 산화효소 제제는 액체 제제 또는 동결건조 제형일 수 있으며, 사용 시 액체로 용해되고, 이 밖에, 상기 요산 산화효소 제제는 주사 제제일 수 있으며, 정맥내 주사, 근육내 주사 등 방식으로 환자의 체내에 주사할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 제제는 단일 제형 형태이고, 각 제제에는 6 mg의 요산 산화효소가 함유된다. 본 발명의 실시예의 단일 용량 형태의 요산 산화효소 제제에 따르면, 상기 단일 용량 형태의 요산 산화효소는 투여 방식이 간단하고, 매일 반복 투여할 필요가 없어 환자가 사용하기에 편리하여 최대 약효를 달성하고 보존이 용이하다.
본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 고요산혈증 및 이와 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서 본 발명의 제1 양태에서 제안된 요산 산화효소 제제의 용도를 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 고요산 관련 질환은 만성 고요산혈증, 통풍, 신장 질환, 고요산 관절염, 신장결석, 통풍 결절, 고혈압, 당뇨병, 고중성지방혈증, 대사증후군, 관상동맥심장질환, 동맥경화증, 항암화학요법으로 인한 고요산혈증을 포함한다.
본 발명의 제3 양태에서, 본 발명은 약학 조성물을 제안한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 본 발명의 제1 양태에서 제안된 요산 산화효소 제제를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 하기 부가적 기술특징 중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 고요산혈증 및 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 기타 약물을 추가로 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 또는 약학 조성물을 기타 약물을 사용하는 병용 요법에 투여하는 경우, 개체에 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또는, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 동업계에 공지된 기타 치료약 또는 예방약의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 면역원성이 낮고 생체 내 안정성이 높으며 근육내 주사에 적합한 장점이 있어 고요산 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 보조제를 추가로 포함한다. 상기 보조제는 임의의 용매, 고체 부형제, 희석제, 결합제, 붕해제 또는 기타 액체 부형제, 분산제, 방취제 또는 현탁제, 계면활성제, 등장화제, 증강제 증점제, 유화제, 방부제, 고체 결합제, 유동화제 또는 윤활제 등을 포함하고, 고유한 표적 제형에 적합하다.
본 발명의 부가적 양태 및 이점은 하기에서 일부 설명될 것이며, 일부는 하기 설명으로부터 자명해지거나 본 발명의 실천을 통해 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 상기 및/또는 부가적 양태 및 이점은 하기 도면과 함께 실시예의 설명으로부터 명백해지고 쉽게 이해할 수 있다. 여기서,
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 PHC 물리 화학적 기준 물질-SEC-HPLC-UV 검출 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 PHC 물리 화학적 기준 물질-SEC-HPLC-RI 검출 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 PEG 기준 물질-SEC-HPLC-RI 검출 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 PU5 변형 생성물-SEC-HPLC-UV 검출 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 PU5 변형 생성물-SEC-HPLC-RI 검출 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 Lys-c 및 트립신 이중 효소 소화를 각각 적용한 PHC 및 PU5의 비교도이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 PU5 Lys-C의 소화도이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 0일차 처방 5의 SEC 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 37℃에서 30일차 처방 5의 SEC 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 37℃에서 30일차 처방 6의 SEC 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른37℃에서 30일차 처방 7의 SEC 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 모델 랫트에 상이한 용량을 근육내 투여 후 혈청 요산 수준을 나타내는 도면이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른 신장 손상, 괴사 및 염증 점수를 나타내는 도면이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 동일한 용량(1.0mg/kg)의 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 1회 정맥내 주사 후 각 그룹의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 15는 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 Pegloticase 및 상이한 용량의 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육내 주사 후 각 그룹의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 16은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 상이한 용량으로 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육내 주사 후 각 그룹의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 상이한 용량으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육/정맥내 주사 후 각 그룹의 시간별 평균 혈중 요산 수치-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 18은 본 발명의 실시예에 따른 S D 랫트에 먼저(Day1) 동일한 용량(1.0mg/kg)으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 정맥내 주사 후 수컷과 암컷의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 19는 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 마지막으로(Day22) 동일한 용량(1.0mg/kg)으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 정맥내 주사 후 수컷과 암컷의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 20은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 먼저(Day1) 동일한 용량(1.0mg/kg)으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 근육내 주사 후 수컷과 암컷의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 21은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 마지막으로(Day22) 동일한 용량(1.0mg/kg)으로 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 근육내 주사 후 수컷과 암컷의 평균 혈중 농도-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 22는 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 정맥내 주사 후 시간별 평균 혈중 요산 수치-시간 곡선을 나타내는 도면이다.
도 23은 본 발명의 실시예에 따른 SD 랫트에 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 근육내 주사 후 시간별 평균 혈중 요산 수치-시간 곡선도이다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세히 설명하고, 상기 실시예의 예시를 도면에 도시하되, 시종일관 동일하거나 유사한 부호는 동일하거나 유사한 구성요소 또는 동일하거나 유사한 기능을 갖는 구성요소를 나타낸다. 첨부된 도면을 참조하여 후술하는 실시예들은 예시적인 것으로, 본 발명을 해석하기 위한 것일 뿐 본 발명을 제한하는 것으로 이해해서는 안된다.
본 발명의 목적은 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 새로운 요산 산화효소 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생체 내 지속성을 구현하고 혈중 요산 수준을 유의하게 감소시킬 수 있으며 고요산혈증 및 통풍 치료에 사용할 수 있는, 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 제제의 응용을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 제제를 제공한다.
요산 산화효소는 특별히 제한되지 않는 바, 임의의 공급원으로부터 유래된 요산 산화효소 및 이의 요산 산화효소 유사체일 수 있으며, 대표적인 예로는 포유동물 유래, 미생물, 식물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 기재된 이종으로부터 유래된 요산 산화효소는 천연 추출, 화학 합성, 유전 공학 재조합 발현 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 경로를 통해 얻을 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 대장균 또는 효모를 숙주로 하여 재조합 발현 균주를 구축하는 방법을 통해 제조되며, 보다 바람직하게는 대장균을 숙주균으로 사용하여 재조합 발현을 수행한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜요산 산화효소를 활성 성분으로 사용하고, 인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨 및 염화나트륨을 첨가하여 제조된 제제는 효소 활성을 최대한 보장하고 제제의 보존 안정성을 향상시킬 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜요산 산화효소 제제는 만니톨, 글리세린, Tween-80 등의 다른 안정제를 첨가할 필요가 없이 높은 보존 안정성을 가지므로, 상기 요산 산화효소 제제는 조성이 간단하고 제조 공정이 간편하며 비용이 저렴하다.
본 발명의 일 양태에서는 상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 제제의 응용을 제공한다.
상기 폴리에틸렌 글리콜요산 산화효소 제제는 만성 고요산혈증 또는 통풍을 치료하는 약물 및 이의 조합물로 더 적합하다. 상기 고요산혈증 및 통풍의 주요 증상에는 요산 신병증 및 통풍 관절염이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
상기 폴리에틸렌 글리콜요산 산화효소의 투여 경로는 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사 및 복강 주사 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 정맥내 주사, 근육내 주사, 보다 바람직하게는 근육내 주사이다.
상기 폴리에틸렌 글리콜요산 산화효소는 보다 낮은 생체 내 면역원성을 갖는다.
상기 폴리에틸렌 글리콜요산 산화효소가 낮은 면역원성을 갖는다는 것은 인간 또는 동물 체내에 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소를 근육내 주사 후, 신체가 항-폴리에틸렌 글리콜 분자 항체를 생성하지 않거나 또는 낮은 역가의 항-폴리에틸렌 글리콜 분자 항체를 생성하며 요산 산화효소에 대한 항체를 생성하지 않음을 의미한다.
상기 폴리에틸렌 글리콜요산 산화효소는 근육내 주사 후 생체 내에 반감기가 더 길고 생체 내 요산 수준을 낮추는 효과가 있다.
이 밖에, 용어 "제1", "제2"는 설명의 목적으로만 사용될 뿐 상대적 중요성을 지시하거나 암시하거나 지시된 기술적 특징의 수를 암시적으로 지정하는 것으로 이해해서는 안된다. 따라서 "제1" 및 "제2"로 한정된 특징은 이러한 특징 중 적어도 하나를 명시적으로 또는 암시적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 설명에서, "복수"는 별도로 명확히 구체적으로 한정하지 않는 한 2개, 3개 등 적어도 2개를 의미한다.
이하, 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명을 설명하나, 이들 실시예는 설명적인 것일 뿐 본 발명을 어떠한 방식으로든 한정하지 않는다.
실시예 1: 재조합 요산 산화효소의 제조
1.1 우리카아제 발현을 위한 유전자 및 발현 플라스미드의 구축
E.coli 코돈의 사용 선호도 데이터에 따라 코돈 선호도 및 GC 함량 등 요인과 결부하여 우리카아제 단백질(코드: PHC)(SEQ ID NO: 1)의 cDNA 서열을 설계하고, 전체 유전자를 합성하여 pUC-57-PHC 플라스미드로 명명하였다. 표적 유전자 삽입 부위로 Nde I 및 BamH I를 사용하고, 발현 벡터(pET-30a-PHC)로 pET-30a 플라스미드를 사용하였다.
1.2 발현 플라스미드의 세균 숙주 세포로의 형질 전환
발현 벡터 pET-30a-PHC를 CaCl2법으로 대장균 BL21(DE3)에 도입하고, Kanamycin을 이용한 내성 스크리닝을 통해 고발현 클론을 스크리닝하였으며, 원래 종자은행 균주(E3B)를 보존하였다. 이러한 단계는 분자 생물학 분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 따라 수행되었다.
1.3 재조합 요산 산화효소의 제조
형질 전환 및 조작된 균주를 하기와 같은 제어 조건 하에 발효기에서 발효 및 발현시켰다. 먼저 30℃, pH 약 7.2에서 OD600=30 이상으로 배양하고, IPTG를 0.5 mmol/L로 첨가한 후, 요산 산화효소가 축적되도록 3h 이상 계속해서 유도하였다. 원심분리하여 세포를 수집한 후 -15℃이하에 방치하여 보존하였다.
동결 보존된 균을 취하여 25 mmol/L Tris, 5 mmol/L EDTA 완충액에 1:10(W/V)의 현탁비로 현탁시키고, 고압으로 세균 세포를 파괴한 후, 원심분리하여 요산 산화효소 침전물을 수집하였다. 침전물을 50 mmol/L NaHCO3으로 1회 세척한 후, 농축된 우리카아제 침전물을 100 mmol/L Na2HCO3(pH9.7~10.3) 완충액에 1:50(W/V)의 현탁비로 현탁시키고, 실온에서 밤새 교반하여 용해시킨 후 원심분리하여 상등액을 수집하였다.
요산 산화효소는 여러 크로마트그래피 단계를 거쳐 추가로 정제되고, SDS-PAGE에 의해 검출된 순도는 95% 이상이며, Superdex 200 컬럼에 의해 검출된 순도는 95% 이상이고, 응집체 형태가 없었다. Lowry법으로 단백질 농도를 측정하고, 분광 광도계로 요산 산화효소의 활성을 측정하였다. 여기서 1단위(U)의 효소 활성은 37℃의 최적 반응 온도에서, 최적의 pH9.0 완충액 조건 하에 분당 1μmol의 요산을 형절 전환하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다.
실시예 2: 페길화 옥시우리카아제의 제조
5K의 분자량을 갖는 N-숙신이미딜프로피오네이트 PEG(5K-PEG-SPA)와 같은 상이한 분자량(500~20000Da)의 모노메톡시 PEG 유도체를 1~5 mmol/L 산성 용액으로 100~300 mmol/L PEG 용액으로 용해시키고, 용해 후, 1:45~1:150의 몰비(요산 산화효소: 5K-PEG-SPA)로 탄산염 농도가 0.1~0.3mol/L이고 pH가 10.0인 요산 산화효소가 용해된 탄산염 완충액에 첨가하여 PEG와 요산 산화효소가 접합 반응이 일어나도록 하였다. 접합 반응하는 요산 산화효소의 농도는 10 mg/ml이고, 접합 반응은 PEG 접합 정도가 시간이 지남에 따라 더 이상 변하지 않을 때까지 5~30℃의 온도 조건 하에 60분 이상 교반 반응시켜야 한다. 반응 종료 후, 한외여과 및/또는 크로마트그래피법을 통해 비 변형 PEG 및 부산물을 반응에서 제거하였다. 적절한 분자체 크로마토그래피 매질을 선택하여 변형 부산물을 분리 제거할 수 있으며, 마지막으로 멸균 여과를 통해 5K 변형 페길화 요산 산화효소(코드: PU5)를 얻었다.
실시예 3: 페길화 옥시우리카아제의 특성 분석
3.1 평균 변형도 및 효소 활성 검출
Lowry법으로 단백질 농도를 측정하고, 분광 광도계로 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 활성을 측정하였다. 우리카아제 기질인 요산의 최대 자외선 흡수 파장은 293nm이고, 생성물 알란토인의 최대 자외선 흡수 파장은 224nm로, 일정 농도 범위 내에서 293nm에서의 요산의 흡수값은 농도에 비례하며, 요산의 정량적 측정은 분광 광도계법으로 수행할 수 있는 바, 구체적인 과정은 다음과 같다. UV-Vis 분광 광도계를 켜고 파장을 293nm로 조절한 후, 상기 기기의 워터 배스 순환 시스템을 켜서 온도를 37℃로 유지하였다. 블랭크 대조군으로 사붕산나트륨 완충액을 사용하고, 영점 보정하였으며; 2.95ml의 기질 반응액(0.1mol/L 사붕산나트륨, 100μmol/L 요산, pH 9.5, 37℃로 예열됨)을 취하여 석영 큐벳에 넣은 후, 시험 시료 50μl를 첨가하고 빠르게 혼합하여 293nm에서의 흡수값을 측정하였다. 293nm에서의 흡수도 변화를 연속적으로 측정하고; C=A/εL(여기서, A는 293 nm에서 특정 농도의 요산 흡광값이고, ε는 요산 몰 흡광 계수이며, L은 큐벳의 광로이고, C는 요산의 몰 농도임)에 따라 요산의 분해 농도 및 효소 활성을 산출하였으며; 효소 활성은 37℃의 최적 반응 온도에서 최적의 반응 pH가 9.5인 경우, 분당 1μmol의 요산을 알란토인으로 형질 전환하는데 필요한 효소량을 1 활성 단위(U)로 정의하였다.
UV/RI(자외선 및 굴절 인덱스 검출기 병용)와 직렬로 연결된 SEC-HPLC를 사용하여 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 평균 변형도를 검출하였다. 단백질은 자외선 280nm에서 최대 흡수 피크를 가지고 있으나 상기 파장에서 PEG는 흡수가 없으며 시차 굴절률 검출기에 의한 일정 범위 내에서 단백질과 PEG의 흡수값은 다양한 농도에 비례한다. 따라서 PEG 기준 물질 및 PHC물리 화학적 기준 물질을 사용하여 외부 표준 방식으로 페길화 요산 산화효소 중 PEG 부분의 함량과 단백질 부분의 함량을 얻을 수 있으며, 나아가 다음 계산 방식으로 각 요산 산화효소 단량체에서 PEG 분자의 수, 즉 평균 변형도를 구할 수 있다.
PEG 요산 산화효소 평균 변형도=(요산 산화효소 서브유닛 상대 분자량Х샘플 내 PEG의 양)/(PEG 상대 분자량Х샘플 내 단백질의 양)
여기서, PHC 물리 화학적 기준 물질, PEG 기준 물질, PU5 변형 생성물의 SEC-HPLC-UV/RI 검출 스펙트럼을 도 1 내지 도 5에 나타내었다.
실시예 2에서 상이한 공급비 하에 얻어진 폴리에틸렌 글리콜 옥시우리카아제의 효소 활성 및 평균 변형도를 표 1에 나타내었다.
표 1: 상이한 공급비에서의 5K-PEG의 효소 활성 및 평균 변형도
단백질: 5K-PEG의 공급 몰비 효소 활성 효소 활성 보유율 평균 변형도
비 변형 요산 산화효소 11.4U/mg 100% 0
1:48 10.71U/mg 94% 10.3
1:56 11.17U/mg 103.4% 11.4
1:68 12.2U/mg 107.1% 11.9
1:82 12.02U/mg 105.4% 12.3
1:94 11.75U/mg 103.1% 12.1
1:110 10.83U/mg 95% 11.5
1:150 10.03U/mg 88% 10.1
참고: 평균 변형도는 각 요산 산화효소 단량체에 결합된 PEG 분자의 수를 나타낸다. 표 1로부터 단백질:5K-PEG 공급비=1:56~1:110 범위 내에서 본원 발명의 폴리에틸렌 글리콜요산 산화효소의 평균 변형도는 11 이상에서 안정화되고, 효소 활성은 비 변형된 요산 산화효소의 효소 활성보다 보유율이 높으며, 효소 활성이 감소하지 않고 오히려 증가하고 있고 또한 상대적으로 안정적임을 알 수 있는데, 이는 시판되는 약물인 Krystexx(pegloticase)와는 완전히 다르다. Savient사의 특허(CN1264575C, 도 2A~도 3B)에 개시된 내용 및 당업자의 일반적인 인식에 따르면, 5kD PEG의 변형도가 증가함에 따라 효소 활성은 유의하게 감소된다. 그러나 예상외로 본원 발명에서 얻은 폴리에틸렌 글리콜 우리카아제는 11 이상의 평균 변형도에서 변형되지 않은 때에 비해 효소 활성이 크게 변화하지 않았다. 따라서 본원 발명의 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소는 시판되는 약물과 비교하여 폴리에틸렌 글리콜 평균 변형도가 더 높고, 효소 활성 보유 측면에서도 예상치 못한 기술적 효과를 얻었다. 발명인의 추측에 따르면, 이는 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 PEG 변형도 또는 변형 부위의 차이에 기인한 것일 수 있다.
3.2 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 부위 검출
아래 단계에서, 발명인은 실시예 2에서 얻은 요산 산화효소에 대한 변형 부위 검출을 수행하였다.
폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 PEG 변형 부위는 먼저 하나 또는 하나 이상의 효소로 비 페길화 및 페길화 요산 산화효소를 소화한 후, 크로마트그래피 검출을 통해 크로마토그램, 즉 펩타이드 맵을 획득함으로써 확인할 수 있다. 비 페길화 및 페길화 요산 산화효소는 1회 효소 소화(Lys-C 또는 Trypsin) 및/또는 이중 효소 소화(Lys-C 및 Trypsin 병용)를 통해 소화될 수 있다. 역상 컬럼으로 소화 단편을 분리하고, 내부 참조 펩타이드 단편 보정 및 펩타이드 단편의 소실 또는 감소 비율의 비교를 통해 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 변형 부위를 판단하였다.
트립신 및 Lys-C이중 효소 소화 품질 펩타이드 맵의 변형 부위 분석 원리: Lys-C는 라이신(K)의 C 말단을 특이적으로 소화할 수 있고, 트립신은 염기성 아미노산인 아르기닌(R)과 라이신(K)을 소화 부위로 사용하여 C 말단 펩타이드를 특이적으로 소화한다. PHC와 PU5의 소화 전후 대응되는 각 펩타이드 단편의 변화 상황을 비교하고, 내부 표준 펩타이드 단편과 결합하여 PEG 변형 펩타이드 단편의 감소 또는 소실의 상대적 비율을 분석하고 확인할 수 있다. 펩타이드 단편의 감소 또는 소실의 상대적 비율을 통해 펩타이드 단편의 상기 라이신 부위가 PEG에 의해 변형되었는지 여부 및 변형된 비율을 판단할 수 있다. PEG 변형은 불균일한 변형이며, 어느 부위의 변형 비율이 높다는 것은 해당 부위가 변형된 것으로 간주될 수 있음에 유의해야 한다.
구체적으로 설명하면 다음과 같다.
(1) 샘플 처리: 요산 산화효소 및 페길화 요산 산화효소를 취하여 각각 소화 완충액(25mmol/L Tris-HCl, 20% 아세토니트릴, pH 9.0)으로 용해시켜 1mg/ml로 희석하고, 각 희석 용액 100μl를 취하여 2μl의 Lys-C를 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 소화시켰다. 이어서 상기 용액을 판크레아틴 반응관(비율 1:100)에 옮기고 37℃에서 2시간 동안 소화를 계속한 후, 4μl의 TCEP환원 용액을 첨가하여 30분 동안 반응을 계속한 후, 1mol/L 염산 용액 10μl를 첨가하여 반응을 종료하였다.
(2) 분석 조건:
기기: Thermo Ultimate 3000 HPLC 및 MSQ Plus;
크로마트그래피 컬럼: Welch Materials μltimate®XB-C18(4.6mmΥ250mm, 5μm);
분석 조건: A 용액(0.1% TFA 함유 수용액), B 용액(0.1% TFA 함유 아세토니트릴 용액);
구배: 0-70min, B는 3-70%;
LC 검출 파장: 214nm.
이온 소스: ESI;
이온 유형: 양이온;
콘 전압: 50V;
스캐닝 범위: 300-2000Da;
스캐닝 시간: 1S;
컬럼후 흐름 전환: 약 0.3ml/min.
100μl의 샘플을 주입하고 크로마토그램을 기록하였다.
(3) 결과 처리:
요산 산화효소와 페길화 요산 산화효소의 크로마토그램(펩타이드 맵)을 비교하고, 차등 펩타이드 단편의 면적 감소의 상대적 비율을 산출하였다.
(4) 실험 결과를 표 2 내지 표 5, 및 도 6~도 7에 나타내었다.
표 2: Lys-C로 소화 후 PHC의 펩타이드 단편 목록
펩타이드 단편 소화 부위 서열 이론적 분자량(Da) 실제 측정된 분자량
T1 3 TYK 410.47 410.2
T2 4 K 146.189 /
T3 17 NDEVEFVRTGYGK 1513.627 /
T2+T3 KNDEVEFVRTGYGK 1641.089 1642.2
T4 21 DMIK 505.63 505.4
T5 30 VLHIQRDGK 1065.241 1065
T6 35 YHSIK 646.744 646.5
T7 48 EVATTVQLTLSSK 1376.57 /
T8 49 K 146.189 /
T9 66 DYLHGDNSDVIPTDTIK 1903.032 1903
T10 74 NTVNVLAK 858.005 857.7
T11 76 FK 293.366 293.1
T12 79 GIK 316.401 316.2
T13 97 SIETFAVTICEHFLSSFK 2059.364 2059
T14 112 HVIRAQVYVEEVPWK 1853.154 1852.8
T15 116 RFEK 578.669 578.4
T16 120 NGVK 416.478 417.2
T17 152 HVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIK 3586.088 3586.2
T18 155 DLK 374.437 374.1
T19 158 VLK 358.481 358.2
T20 169 TTQSGFEGFIK 1214.34 1213.8
T21 179 DQFTTLPEVK 1177.32 1176.8
T22 190 DRCFATQVYCK 1333.543 1333.2
T23 215 WRYHQGRDVDFEATWDTVRSIVLQK 3106.45 3106.5
T24 222 FAGPYDK 796.878 796.5
T25 231 GEYSPSVQK 994.069 993.7
T26 266 TLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISLPNIHYLNIDMSK 4046.66 4046.1
T27 272 MGLINK 674.856 /
T28 285 EEVLLPLDNPYGK 1486.685 1486.6
T27+ T28 MGLINK EEVLLPLDNPYGK 2143.54 2143.2
T29 291 ITGTVK 617.743 617.4
T30 293 RK 302.377 /
T31 298 LSSRL 574.678 574.4
표 3: Lys-C 및 트립신으로 이중 효소 소화 후 PHC의 펩타이드 단편 목록
펩타이드 단편 서열 위치 서열 이론적 상대 분자량[Da] 실제 측정된 분자량
T1 1-3 TYK 410.470 410.3
T2 4 K 146.189 /
T3 5-12 NDEVEFVR 1007.068 /
T2+3 4-12 KNDEVEFVR 1135.4
T4 13-17 TGYGK 524.574 524.5
T5 18-21 DMIK 505.630 505.5
T6 22-27 VLHIQR 764.926 764.8
T7 28-30 DGK 318.330 /
T8 31-35 YHSIK 646.744 646.7
T9 36-48 EVATTVQLTLSSK 1376.570 /
T10 49 K 146.189 /
T11 50-66 DYLHGDNSDVIPTDTIK 1903.032 1903.4
T12 67-74 NTVNVLAK 858.005 857.9
T13 75-76 FK 293.366 293.1
T14 77-79 GIK 316.401 /
T15 80-97 SIETFAVTICEHFLSSFK 2059.364 2059.6
T16 98-101 HVIR 523.636 523.6
T17 102-112 AQVYVEEVPWK 1347.534 1347.4
T18 113 R 174.203 /
T19 114-116 FEK 422.481 /
T18+19 113-116 RFEK 578.684 578.6
T20 117-120 NGVK 416.478 417.1
T21 121-141 HVHAFIYTPTGTHFCEVEQIR 2485.802 2486.8
T22 142-152 NGPPVIHSGIK 1118.301 1118.8
T21+22 121-152 3586.103 3587.7
T23 153-155 DLK 374.437 /
T24 156-158 VLK 358.481 358.3
T25 159-169 TTQSGFEGFIK 1214.340 1214.2
T26 170-179 DQFTTLPEVK 1177.320 1177.2
T27 181-181 DR 289.291 /
T28 182-190 CFATQVYCK 1062.267 /
T27+28 181-190 1333.558 1333.6
T29 191-192 WR 360.416 360.1
T30 193-197 YHQGR 659.702 659.6
T31 198-209 DVDFEATWDTVR 1453.528 1453.6
T32 210-215 SIVLQK 686.850 686.8
T33 216-222 FAGPYDK 796.878 796.8
T34 223-231 GEYSPSVQK 994.069 994.1
T35 262-266 TLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISLPNIHYLNIDMSK 4046.660 4047
T36 267-272 MGLINK 674.856 674.7
T37 273-285 EEVLLPLDNPYGK 1486.685 1486.7
T36+37 2143.541 2143.6
T38 286-291 ITGTVK 617.743 617.7
T39 292 R 174.203 /
T40 293 K 146.189 /
T41 294-297 LSSR 461.519 461.5
T42 298 L 131.175 /
PU5 펩타이드 단편의 피크 면적 감소 백분율의 계산 방법:다음 공식을 이용하여 PHC의 농도와 동일한 PU5 농도에서 대응되는 PU5 펩타이드 단편의 피크 면적을 계산할 수 있다.
A1＝A0×t
여기서, A1은 2개의 내부 참조 펩타이드 단편의 변환 후 PU5 펩타이드 단편 피크 면적이고, A0은 PU5 펩타이드 맵 펩타이드 단편의 실제 측정된 피크 면적이며, t는 T30, T31 내부 참조 펩타이드 단편에서 PHC 펩타이드 맵과 PU5 펩타이드 맵의 피크 면적 비율의 평균값, 즉 0.588이다.
표 4: PHC와 PU5 내부 참조 펩타이드 단편의 비교
펩타이드 단편 번호 서열 PHC 펩타이드 맵 PU5 펩타이드 맵 PHC와 PU5 피크 면적 비율
보유 시간 피크 면적 보유 시간 피크 면적 각 값 평균값
T30 YHQGR 7.5 13.4 7.467 22.9 0.585 0.588
T31 DVDFEATWDTVR 28.31 35.5 28.28 60.1 0.591
내부 참조로 변환된 펩타이드 단편의 피크 면적 및 PHC펩타이드 맵의 피크 면적으로 다음 공식을 이용하여 PU5펩타이드 맵에서 특정 펩타이드 단편의 피크 면적 감소의 상대적 백분율을 계산할 수 있다. P(%)＝(A2-A1)/A2×100%
여기서, A2는 PHC펩타이드 맵에서 특정 펩타이드 단편의 피크 면적이고, A1은 내부 참조로 변환 후 PU5에서 상기 펩타이드 단편의 피크 면적이다.
표 5: PU5를 이중 효소로 소화 후 펩타이드 맵에서 피크 면적이 감소된 펩타이드 단편의 요약 결과
펩타이드 단편 위치 펩타이드 단편 서열 펩타이드 단편의 감소된 피크 면적의 상대적 비율
1-3 TYK 100.00%
4-12 KNDEVEFVR 94.07%
31-35 YHSIK 100.00%
75-76 FK 82.27%
80-97 SIETFAVTICEHFLSSFK 100.00%
102-112 AQVYVEEVPWK 100.00%
113-116 RFEK 100.00%
117-120 NGVK 100.00%
121-152 HVHAFIYTPTGTHFCEVEQIRNGPPVIHSGIK 100.00%
193-197 YHQGR 내부 참조 펩타이드 단편
198-209 DVDFEATWDTVR 내부 참조 펩타이드 단편
216-222 FAGPYDK 91.37%
223-231 GEYSPSVQK 86.40%
232-266 TLYDIQVLTLGQVPEIEDMEISL
PNIHYLNIDMSK		 100.00%
273-285 EEVLLPLDNPYGK 100.00%
본 실시예의 단백질 서열(SEQ ID NO:1)의 분석으로부터 요산 산화효소의 변형을 위한 잠재적 부위는 T1, K3, K4, K17, K21, K30, K35, K48, K49, K66, K74, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K155, K158, K169, K179, K190, K215, K222, K231, K266, K272, K285, K291, K293　등 31개 부위임을 알 수 있다. 표 2, 표 3, 표 4, 표 5 및 도 6의 분석에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에서 얻은 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 변형 부위의 분석으로부터 PU5 소화 후 펩타이드 단편이 90% 이상 소실된 부위는 K3, K4, K35, K97, K112, K116, K120, K152, K222, K266, K285이고, PU5 소화 후 펩타이드 단편이 80%~90% 범위 내에서 소실된 부위는 K76, K231이며, PU5에서 이러한 부위는 모두 변형됨을 알 수 있다.
아울러 발명인은 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소는 시판되는 약물과 비교하여 더 많은 변형 부위를 가지며 유의한 차이를 갖는다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 1회 효소에 대한 소화를 통해, 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소에서 K30, K35, K222　및 K231　이 4개 부위가 위치하는 펩타이드 단편의 소실률은 80% 이상이나, 시판되는 유사 약물 Krystexx(pegloticase)를 해당 방법으로 분석한 결과, 이들 4개 부위가 위치하는 펩타이드 단편은 거의 소실되지 않았다. 즉 시판되는 유사 약물은 K30, K35, K222　및 K231　이 4개 부위에서 발생하는 변형률이 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소보다 훨씬 낮았다. 이 밖에, 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소는 시판되는 약물에 비해 유의하게 낮은 면역원성을 갖는데, 이는 변형 부위의 수 및 변형 부위의 차이와 관련이 있을 수 있다고 발명인은 추측하고 있다. 다른 변형 부위와 변형도로 인해 생체 내에서 효소의 면역원성 부위에 대한 보호와 및 효소 활성 중심의 노출은 모두 상이하다. 상기 차이는 생체 내에서 다른 변형 효소의 생물학적 성질의 차이를 유발할 수 있다.
요산 산화효소는 단백질 제제이기 ??문에 화학적 변형에 따라 안정성에 미치는 영향이 달라지므로, 제제로 제조할 때 특정 요산 산화효소 활성 성분에 따라 상이한 부원료, pH 등을 선택하여 요산 산화효소 제제를 제조할 필요가 있다. 이하, 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소를 위한 높은 안정성, 높은 생물학적 활성을 갖는 요산 산화효소 제제의 제조를 설명한다.
실시예 5: 처방 스크리닝
상기 실시예에서 얻은 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 PU5를 활성 성분으로 사용하고, 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 우리카아제 제제의 성분을 스크리닝하여 높은 우리카아제 활성과 높은 안정성을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 우리카아제 제제를 얻었다. 상기 스크리닝에는 부원료 조성 스크리닝 및 안정제 스크리닝이 포함된다.
1, 부원료 스크리닝
제제 처방 부원료에는 탄산염, 인산염, 염산염, 구연산염이 포함된다.
상기 완충액 부원료와 활성 성분제조 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 제제를 사용하되, 부원료는 동일한 농도 범위 10~50 mmol/L, 동일한 pH(pH7~9) 조건 하에 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소의 안정성이 기본적으로 일치하나, 제제 과정에서 상이한 부원료 농도 비율과 제제 삼투압 제어 난이도가 상이하며, 그 중 인산염, 염산염이 탄산염 및 구연산염보다 삼투압과 pH 제어가 더 용이하다. 완충액 스크리닝을 통해 최종적으로 인산염, 염산염을 부원료로 사용하면, 인산염 농도 범위는 10~50 mmol/L이고, 염산염 농도 범위는 100~200 mmol/L로 모두 제제 공정 요구 사항을 충족시킬 수 있으며, 그 중 15 mmol/L 인산이수소나트륨/인산수소이나트륨, 0.136mol/L 염화나트륨, pH가 7.4인 제제는 상대적으로 우수한 안정성을 갖는다. 발명인은 이를 기본 조성으로 사용하여 추가 스크리닝을 수행하였다.
2, 안정제 스크리닝 실험
기본 제제 처방에 만니톨, 글리세린 및 Tween-80을 첨가하고, 안정성 고찰을 통해 본 제제에 해당 안정제를 첨가할 필요가 있는지 여부를 결정하였다.
2.1 안정제 초기 스크리닝 실험
기본 제제 처방을 대조군으로 사용하여 기본 제제 처방에 4% 만니톨, 2% 글리세린 및 0.04% Tween-80 등 안정제를 첨가하고, 샘플 번호를 각각 샘플 1 내지 샘플 4로 기록하였으며, 샘플 1~4를 45℃에서 7일 동안 고찰하고, 입경을 검출 및 샘플링하여 PU5 제제 안정성에 대한 안정제의 영향을 연구하였다.
실험 결과로부터 글리세린 및 만니톨을 첨가한 조성의 입경(각각 19.44, 20.51)은 기본 제제 조성의 입경(18.57)보다 크고, Tween-80을 첨가한 제제 조성의 입경(18.10)은 기본 제제 조성보다 약간 작음을 보아낼 수 있는 바, 제제 조성에 Tween-80을 첨가하여 PU5 입경의 증가를 방지하는 것을 고려할 수 있다.
2.2 안정제 재스크리닝 실험
안정제 초기 스크리닝 실험으로부터 제제 조성에 Tween-80을 첨가하면 PU5 입경 증가를 방지할 수 있음을 알 수 있으며, 이는 안정성을 통해 추가로 확인된다. 초기 스크리닝하여 45℃에서 7일 동안 고찰한 샘플 1, 샘플 4 이 두 샘플을 다시 45℃ 고찰 박스에 넣고 15일 동안 계속 방치한 후 샘플링하여 입경을 검출하여 PU5 제제의 안정성에 대한 Tween-80 안정제의 영향을 연구하였다.
(1) 입경 검출 결과는 표 6에 나타내었다.
표 6: 안정제 재스크리닝 입경 결과 통계
샘플 명칭 처리 방식 평균 입경(nm) 최대 입경(nm) PDI(다분산 지수) 입경??20nm가 차지하는 백분율(%)
번호 1 대조군 18.46 20.51 0.108 4.0
45℃ 7일 18.57 20.81 0.123 3.2
45℃ 22일 18.14 20.59 0.111 2.4
번호 4 대조군 17.51 18.98 0.073 3.7
45℃ 7일 18.10 19.91 0.089 3.7
45℃ 22일 18.47 20.87 0.119 2.9
참고: 대조군은 2~8℃ 조건 하에 방치됨을 나타낸다.
(2) 결론
45℃에서 7일 및 22일 고찰군과 대조군의 데이터 분석: 0.04% Tween-80을 첨가한 경우, 45℃에서 7일 이내로 고찰한 샘플의 PDI가 훨씬 작고 샘플이 균일하였으며, 45℃에서 22일 동안 고찰하여 검출한 경우, Tween-80의 첨가 여부는 PDI에 영향을 미치지 않았는 바, 이는 고온에서 Tween-80의 첨가는 PU5 입경의 증가를 방지하거나 지연시키는 데 의미가 없음을 나타낸다.
2.3 3차 안정제 스크리닝 실험
제제 조성에 Tween-80을 첨가할지 여부를 최종적으로 결정하기 위해 Tween-80이 첨가된 처방 및 Tween-80이 첨가되지 않은 처방을 각각 25℃ 및 37℃에 두어 1개월 동안 고찰하고, 샘플링하여 입경, 고분자 및 저분자 단백질 함량, pH 및 효소 비활성을 검출하였으며, 그 결과를 표 7에 나타내었다.
표 7: 가속 안정성 고찰 결과
고찰 지표 함량(mg/ml) 고분자 단백질 함량 저분자 단백질 함량 효소 비활성(U/mg) 평균 입경(nm)
Tween-80 미첨가 고찰 전 6.15 0.31% 미검출 10.45 /
25℃ 1개월 5.98 0.17% 미검출 9.60 17.93
37℃ 1개월 5.78 0.14% 9.20% 9.60 17.78
Tween-80 첨가 고찰 전 6.46 0.37% 미검출 9.07 /
25℃ 1개월 6.04 0.18% 미검출 8.95 17.62
37℃ 1개월 6.00 0.20% 9.90% 8.75 17.32
표 7로부터, Tween-80이 첨가된 PU5 제제와 Tween-80이 첨가되지 않은 제제의 가속 안정성 고찰 결과, 고분자 및 저분자, 효소 활성 및 입경 변화 동작이 기본적으로 일치함을 알 수 있다. 많은 연구 끝에 Tween-80을 첨가하기 전과 후의 고분자 및 저분자 단백질 함량 및 입경 모두 큰 차이가 없어 제제 처방에 안정제를 첨가하지 않기로 결정하였다.
실시예 6: 제제 pH 스크리닝
1, pH 범위 최적화
(1) 연구 방법
완충염으로 제제 처방 용액의 pH를 각각 7.8, 7.0, 7.4, 8.2, 8.6으로 조절하였다. 샘플을 각각 2~8℃, 25±2℃ 및 37℃에 두어 안정성 고찰을 수행하고, 각각 30일째에 고분자 및 저분자 단백질 함량 및 효소 활성을 측정하였다. 각 처방에서 PU5단백질의 중합 또는 분해 상황 및 효소 활성의 변화를 비교하였다.
(2) 측정 결과
측정 결과는 표 8 및 도 8~11에 나타내었다.
표 8: 고분자 및 저분자 단백질 함량 및 효소 활성 측정 결과 통계표(%)
/ 처방 5 처방 6 처방 7 처방 8 처방 9
7.8 8.2 7.4 7.0 8.6
고분자 함량 0일 0.56% 0.82% 0.67% 0.33% 0.22%
2~8℃ 30일 0.19% 0.16% 0.19% 0.31% 0.26%
25±2℃ 30일 0.14% 0.12% 0.15% 0.21% 0.13%
37℃ 30일 0.04% 0.03% 미검출 0.17% 0.05%
저분자 함량 0일 ＜1.0% ＜1.0% ＜1.0% 1.3% ＜1.0%
2~8℃ 30일 ＜1.0% ＜1.0% ＜1.0% 2.3% 1.4%
25±2℃ 30일 ＜1.0% ＜1.0% ＜1.0% 4.8% 1.7%
37℃ 30일 14.7% 10.5% 23.4% 27.1% 19.6%
효소 비활성(U/mg) 0일 9.77 10.10 9.98 9.76 8.13
25±2℃ 30일 9.71 9.58 9.36 8.40 9.09
37℃ 30일 8.95 9.95 8.20 8.11 8.50
참고: "장기"는 2~8℃를 나타내고, "가속"은 25±2℃를 나타내며, "고온"은 37℃를 나타낸다. 도 8~도 11 및 표 8로부터, 2~8℃ 및 25±2℃에서30일 동안 고찰한 처방 5(pH7.8), 처방 6(pH8.2), 처방 7(pH7.4)의 고분자 단백질 함량이 감소 추세를 보였고; 저분자 단백질 함량이 소폭 증가 추세를 보였으며, 여기서 처방 7＞처방 5＞처방 6이고, 3개 처방에서 효소 활성은 모두 큰 변화를 보이지 않음을 알 수 있다. 이로부터 PU5 제제의 pH가 7.4~8.2로 제어된 것으로 결정하였다. 37℃에서 30일 동안 고온 검사한 결과, 처방 5, 6, 7의 고분자 단백질 함량은 큰 차이가 없었으나 저분자 단백질 함량은 증가하고, 처방 7＞처방 5＞처방 6이였다. 이로부터 PU5 제제의 pH 중간점은 7.8인 것으로 결정하였다.
요약하면, 본 제품의 PU5 주사액 제제의 pH 범위는 7.4~8.2인 것으로 결정된다.
본원 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소는 시판 약물과 비교하여 면역원성이 현저히 낮은데, 이는 변형 부위의 수 및 차이와 관련이 있을 것으로 발명인은 추측하고 있다. 변형 부위와 변형도의 차이로 인해 생체 내에서 효소의 면역원성 부위 보호와 효소의 활성 중심의 노출 모두 상이하며, 상기 차이는 생체 내에서 상이한 변형 효소의 생물학적 성질의 차이를 초래할 수 있다.
이하, 본원 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 제제(PU5 제제) 약물의 동물 체 내 평가를 상세히 설명하되, 실험에 사용된 pegloticase는 시판되는 유사 약물의 의미하며, 배치번호는 5085B이다.
실시예 7: 폴리에틸렌 글리콜요산 산화효소 제제의 생체 내 약력학적 연구
7.1, 모델 랫트 체내에서 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 약효 평가
옥소산칼륨 음용수에 높은 요산 식이를 병용하여 랫트의 만성 고요산혈증 모델을 유도하고, 랫트의 만성 고요산혈증에 대한 폴리에틸렌 글리콜요산 산화효소(PU5 제제)의 치료 효과를 평가하였다.
40마리의 모델 랫트를 선택하여 무작위로 4개의 그룹, 즉 모델군, 페길화 우리카아제 저용량 투여군(0.3 mg/kg), 페길화 우리카아제 중용량 투여군(1.0 mg/kg), 페길화 우리카아제 고용량 투여군(3.0 mg/kg)으로 군당 10마리씩 나누고, 다른 10마리의 정상 SD 랫트를 블랭크 대조군으로 선택하였다. 시험에서는 5주 동안 연속적으로 모델을 구축하고, 모델링 1주 후부터 근육 투여를 시작하였으며, 연속 4주 동안 주 1회 투여하여 투여 전 및 매번 투여 7일 후 랫트의 혈청 요산, 혈청 효소질소, 혈청 크레아티닌 수준을 검출하였고, 시험 종료 후 랫트 신장의 조직학적 변화를 관찰하였다.
도 12의 결과는 모델링 후 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일째에 블랭크 대조군과 비교하여 모델 대조군의 혈중 요산 수준이 모두 유의하게 증가하고, 모델링 7일 후 모델군 랫트의 혈청 요소질소, 크레아티닌 및 요산은 각각 블랭크군 랫트의 2.73배, 2.40배 및 7.83배임을 나타낸다. 신장 병리학의 관점에서 보면(도 13에 도시됨), 모델 대조군의 신세뇨관 확장, 괴사, 염증 및 섬유증의 점수가 모두 유의하게 증가했으며, 아울러 요산염 결정의 수도 유의하게 증가하였다. 시험 물질인 페길화 우리카아제의 중용량 및 고용량 모두 혈청 요산 수준을 유의하게 감소시키고, 용량 관련성을 나타냈으며, 14일~35일 동안 중용량군의 혈중 요산 수준의 평균값은 303.80-660.60μmol/L로 유지되고, 고용량군의 혈중 요산 수준의 평균값은 153.70-403.40μmol/L로 유지되었으며, 모델군과 비교하여 중용량군의 혈중 요산 감소폭은 34.46~67.94%이고; 고용량군의 혈중 요산 감소폭은 65.67~83.78%였다. 모델 대조군과 비교하여 페길화 우리카아제의 각 투여군은 신세뇨관 확장, 신장 괴사 및 염증에 대해 모두 유의한 개선 효과를 나타내었다.
7.2, 랫트 체내에서 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 1회 투여 평가
36마리의 SD 랫트(반은 암컷, 반은 수컷)를 6개 군(표 9 참조), 즉 시판 약물 Pegloticase 정맥내 주사군, 근육내 주사군, 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소 정맥내 주사군 및 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소 저용량, 중용량 및 고용량(0.5, 1.0, 2.0mg/kg) 근육내 주사군으로 무작위로 나누었다. 구체적인 투여 요법 및 용량을 표 9에 나타내었다. 경정맥에서 채혈하여 PK 및 PD를 검출하였다.
표 9: 동물 그룹화 및 용량 설계
번호 군별 투여 경로 투여 빈도 투여 용량
(mg/kg)		 투여 농도
(mg/ml)		 투여 부피
(ml/kg)		 동물의 수(마리)
수컷 암컷
1 pegloticase 정맥내 주사군 정맥내 주사 1회 1.0 0.1 10.0 3 3
2 pegloticase근육내 주사군 근육내 주사 1회 1.0 1.0 1.0 3 3
3 PU5 제제 정맥내 주사군 정맥내 주사 1회 1.0 0.1 10.0 3 3
4 PU5 제제 저용량 근육내 주사군 근육내 주사 1회 0.5 0.5 1.0 3 3
5 PU5 제제 중용량 근육내 주사군 근육내 주사 1회 1.0 1.0 1.0 3 3
6 PU5 제제 고용량 근육내 주사군 근육내 주사 1회 2.0 2.0 1.0 3 3
7.2.1, 약동학적 비교SD 랫트는 투여 전 모든 개체의 혈청 약물 농도 수준이 모두 정량 하한치(LLOQ: 312.500ng/mL)보다 낮고, 0.5, 1.0, 2.0mg/kg의 1회 근육내 주사 시, 0~168h(0~7일)의 기간 동안 페길화 우리카아제 주사액(PU5)의 혈청 약물 농도는 용량 의존적이였으며 용량이 증가함에 따라 전반적인 수준이 증가하였다. 168h 후, pegloticase 근육내 투여군의 혈중 약물 농도는 정량 하한치보다 낮은 반면, PU5 근육내 투여군은 240h 이상까지 계속 유지되었다.
투여 후, 1.0mg/kg Pegloticase 정맥내 주사 및 근육내 주사군, 1.0mg/kg 페길화 우리카아제 주사액 정맥내 주사 및 0.5, 1.0, 2.0mg/kg페길화 우리카아제 주사액 근육내 주사군 각각의 암컷과 수컷 SD 랫트 체내 Cmax(C5min) 비율은 0.75~0.99 범위 내이고, AUClast　비율은 0.54~0.94 범위 내이며, AUC0-Δ　비율은 0.58~0.97 범위 내이다. 이로부터 Pegloticase와 페길화 우리카아제(PU5) 주사액의 SD 랫트 체내 노출 수준에는 성별에 따른 유의한 차이가 없음을 알 수 있다.
그러나, SD 랫트에 동일한 용량(1.0mg/kg)의 시판 약물 Pegloticase를 투여한 정맥내 투여군의 AUClast는 426.48±65.34이고, 근육내 주사군의 AUClast는 264.19±78.22이며; PU5 주사액 정맥내 투여군의 AUClast는 565.61±161.60이고, 근육내 주사군의 AUClast는 337.86±227.34였다. 동일한 용량 및 동일한 투여 방식 조건 하에 PU5의 AUClast는 시판 약물 Pegloticase보다 높다.
SD 랫트에 동일한 용량(1.0mg/kg)의 시판 약물 Pegloticase를 투여한 정맥내 투여군의 T1/2(h)는 49.51±8.12이고, 근육내 투여군의 T1/2(h)은 55.21±13.50이며, PU5 주사액 정맥내 투여군의 T1/2(h)는 86.12±33.82이고, 근육내 투여군의 T1/2(h)는 60.45±21.37이였다. 동일한 용량 및 동일한 투여 방식 조건 하에 PU5 주사액의 T1/2(h)는 시판 약물 Pegloticase보다 길다.
상기 약동학 결과는 표 10~표 15, 도 14~도 16에 나타내었다.
표 10: SD 랫트에 1.0mg/kg Pegloticase를 1회 정맥내 주사한 개체의 혈중 약물 농도 데이터 및 통계 분석 데이터(단위: μg/mL)
채취 시간
(h)		 수컷 암컷 암컷+수컷
1M001 1M002 1M003 N Mean SD 1F001 1F002 1F003 N Mean SD N Mean SD
0 BLQ BLQ BLQ 0 / / BLQ BLQ BLQ 0 / / 0 / /
0.08333 8.03 7.466 8.078 3 7.858 0.340 6.495 6.402 7.828 3 6.908 0.798 6 7.383 0.756
0.5 8.042 7.352 7.926 3 7.773 0.369 6.257 6.141 7.618 3 6.672 0.821 6 7.223 0.830
2 5.917 7.235 6.914 3 6.689 0.687 6.056 5.875 6.836 3 6.256 0.511 6 6.472 0.591
4 7.598 7.047 6.757 3 7.134 0.427 5.595 4.922 7.164 3 5.894 1.150 6 6.514 1.031
8 7.144 5.852 6.492 3 6.496 0.646 5.005 4.121 5.748 3 4.958 0.815 6 5.727 1.069
24 4.992 3.923 4.469 3 4.461 0.535 3.764 3.341 4.862 3 3.989 0.785 6 4.225 0.654
48 3.552 2.934 3.304 3 3.263 0.311 2.988 2.415 3.836 3 3.080 0.715 6 3.172 0.503
72 3.009 2.271 2.422 3 2.567 0.390 2.223 1.994 3.103 3 2.440 0.585 6 2.504 0.450
120 1.522 1.483 1.246 3 1.417 0.149 0.985 1.098 1.734 3 1.272 0.404 6 1.345 0.284
168 0.652 0.629 0.316 3 0.532 0.188 0.497 0.672 0.726 3 0.632 0.120 6 0.582 0.151
240 BLQ BLQ BLQ 0 / / BLQ BLQ BLQ 0 / / 0 / /
336 BLQ BLQ BLQ 0 / / BLQ BLQ BLQ 0 / / 0 / /
표 11: SD 랫트에 1.0mg/kg 페길화 우리카아제 주사액을 1회 정맥내 주사한 개체의 혈중 약물 농도 데이터 및 통계 분석 데이터(단위: μg/mL)
채취 시간 수컷 암컷 암컷+수컷
(h) 3M001 3M002 3M003 N Mean SD 3F001 3F002 3F003 N Mean SD N Mean SD
0 BLQ BLQ BLQ 0 / / BLQ BLQ BLQ 0 / / 0 / /
0.08333 7.364 9.941 7.74 3 8.348 1.392 7.236 5.991 6.657 3 6.628 0.623 6 7.488 1.348
0.5 7.316 9.469 7.693 3 8.159 1.150 7.051 5.513 6.36 3 6.308 0.770 6 7.234 1.340
2 7.742 9.084 7.338 3 8.055 0.914 6.063 5.522 6.44 3 6.008 0.461 6 7.032 1.294
4 7 8.837 6.997 3 7.611 1.061 6.508 5.735 6.288 3 6.177 0.398 6 6.894 1.064
8 6.628 7.43 6.61 3 6.889 0.468 5.387 4.85 5.52 3 5.252 0.355 6 6.071 0.971
24 4.672 5.628 4.746 3 5.015 0.532 4.291 3.919 4.129 3 4.113 0.187 6 4.564 0.609
48 3.307 4.264 3.497 3 3.689 0.507 3.406 3.042 3.014 3 3.154 0.219 6 3.422 0.456
72 2.933 3.762 3.124 3 3.273 0.434 2.859 2.596 2.319 3 2.591 0.270 6 2.932 0.494
120 1.986 2.279 1.989 3 2.085 0.168 1.604 1.617 1.454 3 1.558 0.091 6 1.822 0.313
168 1.268 1.742 1.391 3 1.467 0.246 1.187 1.031 0.699 3 0.972 0.249 6 1.220 0.350
240 0.67 1.19 0.734 3 0.865 0.284 BLQ BLQ BLQ 0 / / 3 0.865 0.284
336 BLQ 0.853 0.368 2 0.611 0.343 BLQ BLQ BLQ 0 / / 2 0.611 0.343
참고: "/"는 관련 정보가 없음을 의미한다.
표 12: SD 랫트에 1.0mg/kg Pegloticase를 1회 근육내 주사한 개체의 혈중 약물 농도 데이터 및 통계 분석 데이터(단위: μg/mL)
채취 시간 수컷 암컷 암컷+수컷
(h) 2M001 2M002 2M003 N Mean SD 2F001 2F002 2F003 N Mean SD N Mean SD
0 BLQ BLQ BLQ 0 / / BLQ BLQ BLQ 0 / / 0 / /
0.5 0.652 BLQ 0.581 2 0.617 0.050 0.388 BLQ BLQ 1 0.388 / 3 0.540 0.137
2 1.337 1.249 1.62 3 1.402 0.194 1.172 1.135 BLQ 2 1.154 0.026 5 1.303 0.194
4 2.298 1.699 2.348 3 2.115 0.361 1.812 1.371 0.773 3 1.319 0.521 6 1.717 0.593
8 2.56 2.058 2.396 3 2.338 0.256 1.915 1.657 1.273 3 1.615 0.323 6 1.977 0.474
24 3.808 3.235 3.309 3 3.451 0.312 2.947 2.808 2.493 3 2.749 0.233 6 3.100 0.456
48 3.188 2.618 2.749 3 2.852 0.299 2.317 2.279 1.729 3 2.108 0.329 6 2.480 0.495
72 2.694 2.263 2.211 3 2.389 0.265 1.984 2.016 1.261 3 1.754 0.427 6 2.072 0.471
120 1.56 1.169 1.332 3 1.354 0.196 0.884 1.111 0.174 3 0.723 0.489 6 1.038 0.480
168 BLQ 0.341 0.869 2 0.605 0.373 BLQ 0.635 BLQ 1 0.635 / 3 0.615 0.265
240 BLQ BLQ BLQ 0 / / BLQ BLQ BLQ 0 / / 0 / /
336 BLQ BLQ BLQ 0 / / BLQ BLQ BLQ 0 / / 0 / /
참고: "/"는 관련 정보가 없음을 의미한다.
표 13: SD 랫트에 1.0mg/kg 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육내 주사한 개체의 혈중 약물 농도 데이터 및 통계 분석
채취 시간 수컷 암컷 암컷+수컷
(h) 5M001 5M002 5M003 N Mean SD 5F001 5F002 5F003 N Mean SD N Mean SD
0 BLQ BLQ BLQ 0 / / BLQ BLQ BLQ 0 / / 0 / /
0.5 BLQ 1.421 0.328 2 0.875 0.773 BLQ BLQ BLQ 0 / / 2 0.875 0.773
2 BLQ 2.295 0.923 2 1.609 0.970 0.593 0.905 0.674 3 0.724 0.162 5 1.078 0.695
4 0.729 2.897 1.648 3 1.758 1.088 1.356 1.222 0.762 3 1.113 0.312 6 1.436 0.798
8 1.305 3.628 2.054 3 2.329 1.186 1.559 1.249 1.266 3 1.358 0.174 6 1.844 0.926
24 2.408 4.617 3.069 3 3.365 1.134 3.01 2.339 2.216 3 2.522 0.427 6 2.943 0.895
48 2.068 3.877 2.4 3 2.782 0.963 2.739 2.298 2.189 3 2.409 0.291 6 2.595 0.668
72 1.76 3.606 2.027 3 2.464 0.998 2.385 1.761 1.863 3 2.003 0.335 6 2.234 0.712
120 1.042 2.9 1.107 3 1.683 1.054 1.169 0.811 0.926 3 0.969 0.183 6 1.326 0.782
168 0.479 2.419 0.631 3 1.176 1.079 0.595 BLQ BLQ 1 0.595 / 4 1.031 0.928
240 BLQ 1.303 BLQ 1 1.303 / BLQ BLQ BLQ 0 / / 1 1.303 /
336 BLQ 0.719 BLQ 1 0.719 / BLQ BLQ BLQ 0 / / 1 0.719 /
참고: "/"는 관련 정보가 없음을 의미한다.
표 14: SD 랫트에 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 1회 정맥내 주사 후 평균 약동학 파라미터
용량 성별 파라미터 t1/2 C5min AUClast AUC0-Δ Vz Cl MRTlast
(mg/kg) (h) (μg/mL) (h*μg/mL) (h*μg/mL) (mL/kg) (mL/h/kg) (h)
1.0
(Pegloticase)		 수컷 N 3 3 3 3 3 3 3
Mean 45.70 7.86 448.57 484.58 136.90 2.08 52.36
SD 7.57 0.34 42.16 46.96 26.57 0.19 2.58
암컷 N 3 3 3 3 3 3 3
Mean 53.32 6.91 404.38 453.63 173.91 2.26 54.64
SD 7.98 0.80 86.21 90.21 43.64 0.40 2.62
암컷+수컷 N 6 6 6 6 6 6 6
Mean 49.51 7.39 426.48 469.11 155.40 2.17 53.50
SD 8.12 0.76 65.34 66.52 38.14 0.30 2.64
1.0
(PU5)		 수컷 N 3 3 3 3 3 3 3
Mean 105.16 8.35 692.29 794.77 186.76 1.31 90.87
SD 41.08 1.39 128.22 197.50 24.94 0.29 14.06
암컷 N 3 3 3 3 3 3 3
Mean 67.09 6.63 438.93 535.17 180.63 1.88 58.58
SD 9.24 0.62 26.51 59.13 11.64 0.21 2.76
암컷+수컷 N 6 6 6 6 6 6 6
Mean 86.12 7.49 565.61 664.97 183.70 1.59 74.73
SD 33.82 1.35 161.60 192.92 17.73 0.39 19.87
표 15: SD 랫트에 Peglocticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육내 주사 후 평균 약동학 파라미터
용량 성별 파라미터 t1/2 Tmax Cmax AUClast AUC0-Δ Vz_F Cl_F MRTlast
(mg/kg) (h) (h) (μg/mL) (h*μg/mL) (h*μg/mL) (mL/kg) (mL/h/kg) (h)
1.0
(Pegloticase)		 수컷 N 3 3 3 3 3 3 3 3
Mean 58.31 24.00 3.45 318.23 405.13 203.75 2.54 60.57
SD 20.10 0.00 0.31 15.37 80.13 42.90 0.54 6.54
암컷 N 3 3 3 3 3 3 3 3
Mean 52.12 24.00 2.75 210.14 278.56 276.83 3.72 51.27
SD 4.78 0.00 0.23 79.35 60.90 50.57 0.91 15.28
암컷+수컷 N 6 6 6 6 6 6 6 6
Mean 55.21 24.00 3.10 264.19 341.85 240.29 3.13 55.92
SD 13.50 0.00 0.46 78.22 94.12 57.97 0.93 11.68
0.5
(PU5)		 수컷 N 3 3 3 3 3 3 3 3
Mean 63.57 24.00 1.93 181.10 233.11 199.06 2.21 60.26
SD 18.68 0.00 0.26 79.19 48.71 56.50 0.45 23.89
암컷 N 3 3 3 3 3 3 3 3
Mean 48.20 24.00 1.91 170.63 205.87 167.09 2.56 55.67
SD 17.38 0.00 0.14 41.99 61.41 21.47 0.67 11.48
암컷+수컷 N 6 6 6 6 6 6 6 6
Mean 55.88 24.00 1.92 175.87 219.49 183.07 2.38 57.97
SD 18.20 0.00 0.19 56.98 51.77 42.05 0.54 16.95
1.0
(PU5)		 수컷 N 3 3 3 3 3 3 3 3
Mean 70.47 24.00 3.36 439.83 504.61 225.86 2.57 84.20
SD 28.55 0.00 1.13 307.66 344.91 54.21 1.32 31.10
암컷 N 3 3 3 3 3 3 3 3
Mean 50.44 24.00 2.52 235.90 293.04 252.46 3.46 58.28
SD 5.05 0.00 0.43 58.01 45.24 46.82 0.50 6.96
암컷+수컷 N 6 6 6 6 6 6 6 6
Mean 60.45 24.00 2.94 337.86 398.83 239.16 3.02 71.24
SD 21.37 0.00 0.89 227.34 248.66 47.59 1.02 24.65
2.0
(PU5)		 수컷 N 3 3 3 3 3 3 3 3
Mean 66.65 24.00 4.84 590.58 649.31 292.61 3.10 85.42
SD 20.11 0.00 0.46 59.68 55.26 64.39 0.27 19.91
암컷 N 3 3 3 3 3 3 3 3
Mean 72.51 32.00 4.55 537.05 628.72 339.98 3.22 79.26
SD 15.56 13.86 0.91 124.85 78.17 100.19 0.42 9.60
암컷+수컷 N 6 6 6 6 6 6 6 6
Mean 69.58 28.00 4.70 563.81 639.01 316.30 3.16 82.34
SD 16.40 9.80 0.66 92.30 61.59 79.67 0.32 14.38
7.2.2, 생체 내 약효 비교(요산)0.5, 1.0, 2.0mg/kg 페길화 우리카아제 주사액을 1회 근육내 주사하여 투여 1일, 3 일 후 요산 농도는 낮은 수준으로 유지되었고, 투여 7일 후 각 용량군의 요산 수준은 회복되기 시작하였으며, 용량이 높을 수록 요산이 생체 내에서 낮은 수치를 유지하는 시간이 더 길었다. 동일한 용량의 정맥내 주사군을 비교하였을 때, PU5 정맥내 주사군은 pegloticase 정맥내 주사군에 비해 낮은 혈청 요산 농도를 더 오래 유지하였고, PU5 근육내 주사군은 pegloticase 근육내 주사군에 비해 낮은 혈청 요산 농도를 더 오래 유지하였다. 동일한 용량군을 비교하였을 때, PU5 정맥내 주사 또는 근육내 주사군은 pegloticase 정맥내 주사군 또는 근육내 주사군에 비해 낮은 혈청 요산 농도를 더 오래 유지하였는 바, 즉 PU5는 각각의 경우에 모두 pegloticase에 비해 낮은 생체 내 요산 농도를 더 오래 유지하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
7.3, 랫트 체내에서 폴리에틸렌 글리콜 요산 산화효소의 여러 회 투여 평가
해당 시험에는 4개 군, 즉 시판 약물 Pegloticase 정맥내 주사군, 근육내 주사군, 페길화 우리카아제 주사액(PU5) 정맥내 주사군, 근육내 주사군이 설정되고, 군 당 8마리(반은 수컷, 반은 암컷)씩 총 32마리의 SD 랫트로 구성되었다. Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액 정맥내 주사군은 정맥내 주사를 시행하고; Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액 근육내 주사군은 근육내 주사를 시행하였다. 투여량은 모두 1.0mg/kg이고, 주 당 1회씩 연속 4회 투여하였다.
결과 분석으로부터,
SD 랫트에 1.0mg/kg Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 정맥/근육내 주사한 랫트의 일반적인 상황은 약물과 관련된 비정상적인 변화가 없었음을 알 수 있다.
7.3.1 항-PEG 항체 검출
SD 랫트에 연속 4회 투여하였다. 1차 투여 전에는 모든 개체 동물에서 항-PEG 항체 및 항-PHC 항체가 모두 검출되지 않았고; 투여 종료 후에 모든 동물에서 항-PHC 항체가 검출되지 않았으며, Pegloticase 정맥내, 근육내 주사군, 페길화 우리카아제 주사액 정맥내 주사군, 근육내 주사군에서 각각 항-PEG 항체가 검출되었고, 양성 결과 비율은 각각 3/8, 1/8, 1/8, 1/8이였다. PEG 면역 조직 화학적 검사 결과, pegloticase 정맥내 주사군 및 근육내 주사군의 비장, 간 및 신장에서는 약한 PEG양성 발현이 관찰되었고, 페길화 우리카아제 주사액 정맥내 주사군 및 근육내 주사군에서는 PEG 양성 발현이 관찰되지 않았으며, 그 결과를 표 13에 나타내었다.
이상 분석으로부터 PU5 및 pegloticase에 의해 생성된 항체는 요산 산화효소 부분에 대한 항체가 아니라 주로 PEG 부분에 대한 항체임을 알 수 있으며, 이는 둘 다 요산 산화효소의 면역원성 부위를 효과적으로 은폐할 수 있음을 의미한다. PEG 항체의 생성은 생체 내에서 일부 부작용을 일으킬 수 있는데, 표 16의 결과에 따르면 본원 발명의 PU5 면역원성은 시판 생성물 pgeloticase보다 낮음을 알 수 있다.
PEG 항체 및 PEG 면역 조직 화학적 검사 결과로부터 근육내 투여에서 PU5 제제 및 pegloticase 모두 정맥내 투여군보다 우수하였으며, 그중 정맥내 투여군에서 생성된 항-PEG 항체는 PU5 제제가 pegloticase보다 우수하였고; 근육내 투여군에서 생성된 항-PEG 항체는 PU5 제제가 pegloticase보다 우수하였다.
표 16: PEG 면역 조직 화학적 양성 발현 결과
발생율(Incidence)
pegloticase 정맥내 주사군 pegloticase근육내 주사군 PU5 정맥내 주사군 PU5 근육내 주사군
현미경 관찰 수컷 암컷 수컷 암컷 수컷 암컷 수컷 암컷
비장 총 검사 횟수: 4 4 4 4 4 4 4 4
--PEG, 백색 펄프 1 0 1 1 2 0 0 0 0
총 발생예의 수: 0 1 1 2 0 0 0 0
--PEG, 적색 펄프 1 0 1 0 0 0 0 0 0
총 발생예의 수: 0 1 0 0 0 0 0 0
간 총 검사 횟수: 4 4 4 4 4 4 4 4
--PEG, 혈관 내피세포/쿠퍼세포 1 4 4 1 3 0 0 0 0
총 발생예의 수: 4 4 1 3 0 0 0 0
신장 총 검사 횟수: 4 4 4 4 4 4 4 4
--PEG, 신세뇨관 1 3 1 1 1 0 0 0 0
총 발생예의 수: 3 1 1 1 0 0 0 0
-- PEG, 혈관 내피세포 1 0 1 0 0 0 0 0 0
총 발생예의 수: 0 1 0 0 0 0 0 0
양성 등급: 1=매우 약한 양성, 2=약한 양성, 3=중간 양성, 4=강한 양성. 4.3.2 약동학 검출
SD 랫트에 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 정맥내, 근육내 주사 후, 각 그룹 동물의 주요 약동학 파라미터는 유의한 성별 차이를 나타내지 않았다. 4회 연속 투여 후, 2종의 약물은 랫트 체내에 약간 축적되었다.
SD 랫트에 동일한 용량(1.0mg/kg)의 시판 약물 Pegloticase를 여러 회 정맥 /근육내 주사 투여한 경우, 1차 투여 후, 랫트 체내에서의 절대 생체 이용률은 각각 51.35%이였고; 마지막 투여 후, 랫트 체내에서의 절대 생체 이용률은 각각 45.98%이였다. SD 랫트에 동일한 용량(1.0mg/kg)의 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 정맥 /근육내 주사 투여한 경우, 1차 투여 후, 랫트 체내에서의 절대 생체 이용률은 각각 58.29%이였고; 마지막 투여 후, 랫트 체내에서의 절대 생체 이용률은 각각 52.60%이였다.
4.3.3 생체 내 약효 비교(요산)
SD 랫트에 1.0mg/kg Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 4회 연속(1회/주) 정맥내, 근육내 주사하였다. 혈청 요산 농도는 각각의 투여 후에 모두 낮은 수준으로 유지되었고, Pegloticase 근육내 주사군은 마지막 투여 14일 후 회복되었으며, 나머지 각 그룹은 마지막 투여 18일 후 회복되었다. 동일한 용량의 시판 약물 Pegloticase와 비교하여 2종 약물 정맥내 주사군의 보유 시간은 비교적 일치하였으나, 페길화 우리카아제 주사액 근육내 주사군의 보유 시간은 시판 약물보다 길었는 바, 즉 근육내 투여에서 PU5 제제의 효능은 Pegloticase보다 우수하였다.
상기 결과는 표 17~표 19, 도 18~도 22에 나타내었다.
표 17: SD 랫트에 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액의 연속 정맥내 주사 후 평균 약동학 파라미터 결과
시험 시간 용량 성별 파라미터 t1/2 Tmax Cmax AUClast AUC0-Δ Vz Cl MRTlast
약물 명칭 (h) (h) (μg/mL) (h*μg/mL) (h*μg/mL) (mL/kg) (mL/h/kg) (h)
Day1 1.0 mg/kg
Pegloticase		 수컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 72.17 2.13 11.12 632.58 778.65 133.74 1.29 56.91
SD 4.53 1.44 0.28 25.32 45.00 4.49 0.07 1.17
암컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 66.24 0.50 8.84 514.21 633.80 149.07 1.59 54.93
SD 17.91 0.00 1.07 50.98 64.84 27.23 0.16 7.58
암컷+수컷 N 8 8 8 8 8 8 8 8
Mean 69.21 1.31 9.98 573.40 706.22 141.41 1.44 55.92
SD 12.51 1.28 1.42 73.43 93.08 19.84 0.20 5.13
1.0 mg/kg
PU5		 수컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 67.98 1.75 9.47 527.73 634.48 158.66 1.60 55.50
SD 8.87 1.66 0.91 91.07 91.12 39.53 0.22 0.89
암컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 79.29 1.38 6.42 369.05 481.09 238.12 2.16 59.68
SD 17.07 1.75 0.61 49.11 98.31 15.34 0.53 2.84
암컷+수컷 N 8 8 8 8 8 8 8 8
Mean 73.63 1.56 7.94 448.39 557.79 198.39 1.88 57.59
SD 13.97 1.59 1.78 108.54 120.10 50.74 0.48 2.96
Day22 1.0 mg/kg
Pegloticase		 수컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 135.63 1.75 12.33 1159.18 1300.99 149.28 0.78 118.29
SD 40.45 1.66 0.94 134.20 208.65 28.13 0.13 9.91
암컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 96.09 0.88 8.02 672.95 747.61 186.89 1.35 92.46
SD 7.69 0.75 0.87 78.50 78.66 24.21 0.14 9.52
암컷+수컷 N 8 8 8 8 8 8 8 8
Mean 115.86 1.31 10.17 916.07 1024.30 168.09 1.07 105.37
SD 34.25 1.28 2.45 279.12 329.86 31.53 0.33 16.48
1.0 mg/kg
PU5		 수컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 149.80 2.25 9.00 840.78 947.08 229.16 1.07 117.99
SD 24.68 2.02 0.73 91.96 104.82 36.69 0.11 6.88
암컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 103.90 1.25 6.63 576.81 636.52 236.33 1.63 101.66
SD 21.25 0.87 0.72 128.81 128.02 17.98 0.39 20.03
암컷+수컷 N 8 8 8 8 8 8 8 8
Mean 126.85 1.75 7.82 708.79 791.80 232.75 1.35 109.82
SD 32.51 1.54 1.44 175.05 198.21 27.02 0.40 16.38
표 18: SD 랫트에 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액의 연속 근육내 주사 후 평균 약동학 파라미터 결과
시험 시간 용량 성별 파라미터 t1/2 Tmax Cmax AUClast AUC0-Δ Vz_F Cl_F MRTlast
약물 명칭 (h) (h) (μg/mL) (h*μg/mL) (h*μg/mL) (mL/kg) (mL/h/kg) (h)
Day1 1.0 mg/kg
Pegloticase		 수컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 59.68 24.00 3.16 318.22 395.66 217.53 2.54 62.05
SD 13.70 0.00 0.38 29.92 29.26 49.49 0.19 6.59
암컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 80.53 24.00 2.80 270.69 415.60 282.07 2.48 57.80
SD 16.48 0.00 0.36 66.91 84.31 37.74 0.52 6.21
암컷+수컷 N 8 8 8 8 8 8 8 8
Mean 70.11 24.00 2.98 294.46 405.63 249.80 2.51 59.92
SD 17.91 0.00 0.39 54.29 59.39 53.39 0.36 6.35
1.0 mg/kg
PU5		 수컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 82.25 6.00 3.06 290.64 403.89 294.92 2.50 61.83
SD 9.79 2.31 0.25 34.67 48.73 29.13 0.31 6.88
암컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 70.44 48.00 2.21 232.11 306.59 340.32 3.50 66.28
SD 13.41 19.60 0.26 59.53 90.62 46.97 1.09 10.28
암컷+수컷 N 8 8 8 8 8 8 8 8
Mean 76.34 27.00 2.63 261.38 355.24 317.62 3.00 64.06
SD 12.57 25.90 0.51 54.89 85.10 43.56 0.91 8.44
Day22 1.0 mg/kg
Pegloticase		 수컷 N 3 4 4 4 3 3 3 4
Mean 198.20 25.00 3.18 486.70 799.90 353.52 1.35 112.01
SD 83.85 18.00 0.85 298.21 293.71 23.56 0.42 60.30
암컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 97.92 20.00 2.69 355.77 427.75 344.97 2.65 94.51
SD 33.98 8.00 0.71 134.18 155.69 88.41 1.19 30.45
암컷+수컷 N 7 8 8 8 7 7 7 8
Mean 140.90 22.50 2.93 421.23 587.25 348.64 2.09 103.26
SD 76.12 13.17 0.77 225.23 283.63 64.14 1.12 45.20
1.0 mg/kg
PU5		 수컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 140.04 15.00 2.52 395.82 478.83 610.95 9.64 102.76
SD 90.61 10.52 1.15 255.45 300.26 419.13 16.09 61.50
암컷 N 4 4 4 4 4 4 4 4
Mean 122.51 30.00 2.41 349.84 428.61 416.41 2.82 103.39
SD 59.33 12.00 0.50 178.08 204.30 72.32 1.36 44.91
암컷+수컷 N 8 8 8 8 8 8 8 8
Mean 131.27 22.50 2.46 372.83 453.72 513.68 6.23 103.08
SD 71.52 13.17 0.82 205.33 239.26 297.23 11.18 49.85
표 19: SD 랫트에 Pegloticase 및 페길화 우리카아제 주사액을 여러 회 근육/정맥내 주사 후 각 용량군에서 요산의 통계 결과(Mean+SD)
성별 측정 시간 1.0 mg/kg
Pegloticase
정맥내 주사군		 1.0 mg/kg
Pegloticas
근육내 주사군		 1.0 mg/kg
PU5
정맥내 주사군		 1.0 mg/kg
PU5
근육내 주사군
n
Figure pct00001
 n
Figure pct00002
 n
Figure pct00003
 n
Figure pct00004
수컷
1차 투여 전 4 71.250± 19.103 4 62.250± 5.315 4 58.750± 7.632 4 50.750± 6.850
1차 투여 후 3일 4 0.250± 0.500 4 0.500± 0.577 4 0± 0 4 0± 0
2차 투여 전 4 0.500± 0.577 4 69.750± 46.133 4 0.500± 0.577 4 0.250± 0.500
2차 투여 후 3일 4 1.000± 0 4 20.750± 40.178 4 0.500± 0.577 4 17.500± 33.670
3차 투여 전 4 1.000± 0 4 26.500± 30.116 4 1.250± 0.957 4 18.000± 32.680
3차 투여 후 3일 4 1.000± 0.816 4 19.000± 37.336 4 0.500± 0.577 4 20.500± 38.336
4차 투여 전 4 0± 0 4 15.500± 31.000 4 0.250± 0.500 4 19.250± 37.170
4차 투여 후 1일 4 0.750± 0.500 4 1.750± 1.500 4 0.750± 0.500 4 9.750± 16.840
4차 투여 후 3일 4 0.500± 0.577 4 10.500± 21.000 4 0± 0 4 12.750± 24.838
4차 투여 후 7일 4 0.250± 0.500 4 22.250± 44.500 4 0± 0 4 16.250± 31.837
4차 투여 후 10일 4 0± 0 4 20.000± 38.670 4 0.250± 0.500 4 16.000± 30.681
4차 투여 후 14일 4 1.250± 0.500 4 29.250± 28.123 4 2.000± 0.816 4 19.250± 30.015
4차 투여 후 18일 4 25.000± 10.296 4 53.500± 14.933 4 24.000± 13.614 4 50.000± 29.833
암컷
1차 투여 전 4 61.250± 8.057 4 63.000± 15.470 4 50.250± 7.500 4 43.250± 9.743
1차 투여 후 3일 4 0± 0 4 0± 0 4 0.250± 0.500 4 0± 0
2차 투여 전 4 42.000± 48.132 4 38.250± 44.507 4 0.500± 0.577 4 4.000± 7.348
2차 투여 후 3일 4 0.250± 0.500 4 40.250± 41.080 4 0.250± 0.500 4 0.500± 0.577
3차 투여 전 4 19.500± 35.01 4 46.750± 28.547 4 1.000± 0.816 4 13.500± 25.000
3차 투여 후 3일 4 1.250± 0.500 4 0.500± 0.577 4 0.750± 0.500 4 0.750± 0.500
4차 투여 전 4 0.250± 0.500 4 33.750± 40.285 4 0.500± 0.577 4 3.750± 6.850
4차 투여 후 1일 4 0.750± 0.500 4 3.000± 2.708 4 0.500± 0.577 4 1.250± 0.500
4차 투여 후 3일 4 0.250± 0.500 4 0± 0 4 0± 0 4 0± 0
4차 투여 후 7일 4 0.250± 0.500 4 6.750± 12.842 4 1.000± 0 4 1.750± 1.258
4차 투여 후 10일 4 0± 0 4 8.500± 16.340 4 0.250± 0.500 4 2.000± 2.828
4차 투여 후 14일 4 6.750± 7.089 4 33.500± 19.689 4 1.500± 0.577 4 9.500± 8.699
4차 투여 후 18일 4 48.000± 24.993 4 54.750± 4.031 4 14.000± 6.00. 4 32.000± 13.638
본 명세서의 설명에서, 용어 "일 실시예", "일부 실시예", "예시", "구체 예시" 또는 "일부 예시"등을 참조한 설명은 해당 실시예 또는 예시를 결부하여 설명된 구체적 특징, 구조, 재료 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시예 또는 예시에 포함됨을 의미한다. 본 명세서에서 상기 용어에 대한 개략적 표현은 반드시 동일한 실시예 또는 예시를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 설명된 구체적 특징, 구조, 재료 또는 특성은 적합한 방식으로 임의의 하나 또는 하나 이상의 실시예 또는 예시에서 결합될 수 있다. 이 밖에, 당업자는 서로 모순되지 않는 한 본 명세서에 설명된 상이한 실시예 또는 예시 및 상이한 실시예 또는 예시의 특징을 결합 및 조합할 수 있다. 이상 본 발명의 실시예를 도시하고 설명하였으나, 상기 실시예는 예시적이며 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안됨을 이해할 수 있다. 당업자라면 본 발명의 범위 내에서 상기 실시예를 변경, 수정, 대체 및 변형할 수 있다.

Claims (24)

  1. 요산 산화효소 제제로서,
    폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소로부터 선택되는 활성 성분; 및
    인산염 및 염산염 중 적어도 하나를 포함하는 완충 시약으로부터 선택되는 부원료를 포함하는 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 요산 산화효소의 하기 아미노산 부위 중 적어도 11개가 PEG 변형을 갖고: T1, K3, K4, K30, K35, K76, K79, K97, K112, K116, K120, K152, K179, K222, K231, K266, K272, K285, K291 및 K293, 상기 아미노산 부위는 SEQ ID NO:1로 표시되는 아미노산 서열에 의해 위치 결정되는 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 요산 산화효소의 하기 4개의 아미노산 부위 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개가 PEG 변형을 갖는 요산 산화효소 제제: K30, K35, K222 및 K231.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글리콜은 모노메톡실기 또는 히드록실기를 갖는 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 분지형 구조인 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글리콜과 요산 산화효소는 아미드 결합을 통해 접합되는 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글리콜은 변형 폴리에틸렌 글리콜이고, 상기 변형 폴리에틸렌 글리콜의 변형기는,
    N-히드록시숙신이미드, N-히드록시숙신이미딜카르보네이트, N-히드록시숙신이미딜아세테이트, N-히드록시숙신이미딜프로피오네이트, N-히드록시숙신이미딜부티레이트, N-히드록시숙시닐숙시네이트 및 비스(p-니트로페닐)카보네이트 중 적어도 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 변형 폴리에틸렌 글리콜의 변형기는 N-히드록시숙신이미딜프로피오네이트인 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 요산 산화효소는 SEQ ID NO:1~7로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나; 또는 SEQ ID NO:1~7과 비교하여 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 갖거나; 또는 SEQ ID NO:1~7과 비교하여 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 폴리펩티드를 갖는 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 요산 산화효소는 SEQ ID NO:1~4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 완충 시약은 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨 및 염화나트륨으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 요산 산화효소 제제의 pH는 7~9인 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 요산 산화효소 제제의 pH는 7.4~8.2인 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  14. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 대 완충 시약의 질량비는 (5~6):(6~37)인 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 대 완충 시약의 질량비는 6:10인 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  16. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 대 상기 인산염의 질량비는 (5~6):(1~7)이되, 상기 인산염은 인산수소이나트륨, 인산이수소나트륨인 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  17. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 대 상기 염화나트륨의 질량비는 (5~6):(5~30)인 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  18. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 인산염 대 상기 염화나트륨의 질량비는 (1~7):(5~30)이되, 상기 인산염은 인산수소이나트륨 및/또는 인산이수소나트륨인 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 요산 산화효소 제제의 제형은 액체, 반고체 및 고체 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 단일 제형 형태이고, 각 제제에는 6 mg의 요산 산화효소가 함유된 것을 특징으로 하는 요산 산화효소 제제.
  21. 고요산혈증 및 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 요산 산화효소 제제의 용도.
  22. 약학 조성물로서,
    제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 요산 산화효소 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  23. 제22항에 있어서,
    고요산혈증 및 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 기타 약물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  24. 고요산혈증 및 관련 질환의 치료 또는 예방 방법으로서,
    피험자에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 요산 산화효소 제제 또는 제22항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물의 약학적으로 허용 가능한 양을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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