KR20200044822A - 적혈구 내부에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제 및 암 및 아르기나제-1 결핍 치료에서 이의 용도 - Google Patents
적혈구 내부에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제 및 암 및 아르기나제-1 결핍 치료에서 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 치료법에서 사용하기 위한 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 아르기나제-1 결핍 치료에서 그의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 적혈구에 캡슐화된 M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제를 포함하는 신규한 약학적 조성물 및 아르기닌 고갈이 유익할 수 있는 질환, 예컨대 아르기닌 의존성 암, 구체적으로 아르기닌-영양요구성 암, 및 아르기나제-1 결핍 치료에서 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 특허 출원은 2017년 8월 31일자로 출원된 유럽특허출원 제17306122.7호 및 2017년 12월 28일자로 출원된 일본특허출원 제2017-254383호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 치료법에서 사용하기 위한 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제 (arginine deiminase)에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 아르기나제-1 결핍 (arginase-1 deficiency) 치료에서 이의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 적혈구에 캡슐화된 M. 아르기니니 (M. arginini) 유래의 아르기닌 데이미나제를 포함하는 신규한 약학적 조성물 및 아르기닌 고갈이 유익할 수 있는 질환, 예컨대 아르기닌 의존성 암, 구체적으로 아르기닌-영양요구성 암 (arginine-auxotrophic cancers), 및 아르기나제-1 결핍 치료에서 이의 용도에 관한 것이다.
아르기닌은 반-필수 아미노산 (semi-essential amino acid)이다. 이는 아르기노숙시네이트 신테타제 및 아르기노숙시네이트 리아제의 작용으로 인해 2단계로 시트룰린으로부터 우레아 사이클 과정에서 합성된다. 아르기닌은 아르기나제의 작용 하에 오르니틴 (ornithine)으로 대사되고, 오르니틴은 오르니틴 트란스카르바밀라제에 의해 촉매화된 반응에 의해 시트룰린으로 전환될 수 있다.
특정 유형의 종양 세포는 아르기닌의 공급을 필요로 하는 것으로 나타났으며, 이는 아르기닌-영양요구성 암으로 불리는 이들 암 형태에 대해 아르기닌 고갈을 가능한 치료법으로서 고려하게 되었다. 아르기닌-분해 효소인 아르기닌 데이미나제는 구아니딘기의 탈아미노화 (deamination)에 의해 아르기닌의 시트룰린 및 암모늄으로의 가수분해를 촉매화하였다. 아르기닌 데이미나제의 항암 활성은 수 많은 게시물들의 주제였다. 따라서, 아르기닌 데이미나제의 인 비보 (in vivo) 활성이 악성 흑색종 및 간암종과 관련하여 입증되었다. 그러나, 아르기닌 데이미나제 효소는 몇 가지 주요 단점이 있다.
아르기닌 데이미나제는 포유동물에서는 생성되지 않지만, 미생물에서 입수할 수 있어서, 포유동물에게는 고항원성 화합물이 된다.
더욱이, 상기 효소는 포유동물에서 약 5시간 정도의 매우 짧은 반감기를 가지므로, 효과를 얻기 위해서는 매일 고용량으로 투여해야 한다.
암 치료에 있어서 이러한 단점을 극복하기 위해서, 유럽특허 EP1874341에서는 적혈구 내부에 아르기닌 데이미나제를 캡슐화하는 것으로 이루어진 독창적인 접근법을 제안하였다. EP1874341은 특히 10페이지 실시예 3에서 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래의 아르기닌 데이미나제의 포착 (entrapment)을 개시하였다.
아르기나제-1 결핍은 간에서 우레아 사이클의 최종 단계에 영향을 미치는 희귀 유전자 장애로, 이는 암모니아 형태의 질소 폐기물을 소변으로 배출하기 위해 우레아로 전환시킨다. 이는 아르기닌의 오르니틴 및 우레아로의 가수분해를 촉매화하는 아르기나제 1 효소의 일부 또는 전부 손실을 초래하는 ARG1 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다 (도 1 참조).
아르기나제-1 결핍 환자는 과아르기닌혈증 (hyperargininemia), 진행성 신경계 및 지적 장애, 지속적인 성장 지연 및 고암모니아혈증 (hyperammonemia)의 희귀 에피소드 (infrequent episodes)를 나타낸다.
현재 아르기나제-1 결핍에 대한 치료법은 없으며, 저-단백질 식단 및/또는 질소 스캐빈저 약물 (nitrogen scavenger drug)에 의한 치료 결과는 통상 좋지 않다. 주요 생화학적 특징은 아르기닌의 축적으로 독성 수준의 구아니디노 화합물 및 산화질소를 초래하였다 (Sin et al, PLoS ONE 8(11)). 아르기닌 및 그의 대사산물이 아르기나제-1 결핍에서 신경학적 표현형을 유발하는 것으로 의심되기 때문에, 합의된 치료 목표는 저-단백질 식단, 아미노산 보충 및 질소-스캐빈저제 (nitrogen-scavenging agents)의 투여로 혈장 아르기닌을 감소시키는 것이다. 그러나, 이러한 치료 전략으로, 아르기나제-1 결핍에서 혈장 아르기닌을 정상화 또는 준-정상화하는 것은 어렵다.
그러므로 아르기나제-1 결핍에서 혈장 아르기닌 수준을 정상화하는 것은 어려워서, 아르기나제 효소 요법의 사용이 이전에 조사되었다. 예를 들어 Burrage 등은 아르기나제-결핍 마우스 모델에서 변형된 PEG화 인간 재조합 아르기나제 효소를 조사하였다 (Burrage et al. Human Molecular Genetics, 2015, 24(22)). 상기 효소는 혈장 아르기닌 수준을 감소시켰지만, 고암모니아혈증의 지속으로 인해 아르기나제-결핍 마우스의 생존을 향상시키지는 못했다. 고암모니아혈증은 아르기나제 결핍에서 주요 치료 과제이다 (Burrage et al. Human Molecular Genetics 24(22)).
그러므로, 아르기나제 결핍에서 혈장 아르기닌 수준의 고갈에 대한 대체 방법을 발견하는 것이 수년간 주요 목표였다.
아르기닌 데이미나제에 의해 촉매화된 반응은 하기와 같다:
상기는 평형화된 반응이며, 과학계에서 아르기닌 데이미나제를 사용하여 아르기나제-1 결핍을 치료할 수 없다고 제안하는 과학적 논거가 존재하며, 그 이유는 하기와 같다:
o 시트룰린은 아르기닌으로 재전환될 수 있고 (도 1에서 우레아 사이클 참조), 및
o 암모니아는 아르기나제-1 결핍과 관련하여 환자가 고암모니아혈증의 에피소드를 가진 경우에 문제가 될 수 있다.
이들 기술적 편견과는 달리, 본 발명의 출원인은 예기치 않게 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제가 아르기닌 및 그의 대사 부산물의 독성 축적을 감소시키는 신규한 치료 접근법일 수 있다는 것을 발견하고 입증하였다. 구체적으로, 본 출원인은 본 발명의 조성물을 투여하여 마우스에서 달성되는 혈청 아르기닌 수준의 고갈이 높다는 것을 발견하고, 치료적 관심을 갖게 되었다. 본 발명자는 또한 아르기닌-1 결핍 마우스에서 혈청 아르기닌 수준의 상기 고갈은 암모니아 수준의 주목할만한 변화를 수반하지 않음을 입증하였다. 이러한 결과는 아르기닌 데이미나제가 NH3 생성 및 가능한 시트룰린 역전환으로 인해 아르기나제-1 결핍을 치료할 수 없다는 기존의 기술적 편견때문에 특히 놀라운 것이다.
적혈구에 캡슐화될 수 있는 상이한 아르기닌 데이미나제 중에, 본 출원인은 PK/PD 파라미터의 예기치 않은 개선을 초래하는 특성을 갖는 특정 아르기닌 데이미나제를 확인하였다.
특히, 박테리아 미코플라스마 아르기니니 (Mycoplasma arginini)로부터 수득된 아르기닌 데이미나제는 PK/PD 파라미터를 향상시킨다. 더욱이, 미코플라스마 아르기니니 유래의 상기 아르기닌 데이미나제는 적혈구 내부에서 그의 활성에 대한 바람직한 특성인 임의의 보조인자 (co-factor)를 필요로 하지 않는다. 그러므로 미코플라스마 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제는 알려져 있는 아르기닌 데이미나제보다 기술적 이점을 가지므로, 본 발명과 관련하여 사용하기에 매우 적합하다. 또한, 미코플라스마 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제는 분자량이 92 kDa인 동종이량체이므로, 적혈구 내부에서 포착에 유리하다.
따라서, 상기 아르기닌 데이미나제를 사용하면 암, 구체적으로 아르기닌-영양요구성 암 치료법, 및 아르기나제-1 결핍 치료법과 같이 아르기닌 고갈 요법에서 크게 진보할 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 아르기나제-1 결핍 치료에 사용하기 위한, 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제를 포함하는 약학적 조성물이다.
구체적으로, 본 발명은 아르기나제-1 결핍 치료에 사용하기 위한, 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제는 M. 아르기니니로부터 유래한다.
본 발명의 다른 목적은 M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액이다. 상기 현탁액은 구체적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 중에 M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액이다.
본 발명의 추가의 목적은 아르기나제-1 결핍 또는 아르기닌-의존성 암 치료, 패혈 쇼크 (septic shock)의 치료 또는 예방, 혈관형성 (angiogenesis) 억제 및 혈관형성 관련 질환 치료에 사용하기 위한, 구체적으로 아르기나제-1 결핍 또는 아르기닌-의존성 암 치료에 사용하기 위한 본 발명의 현탁액을 포함하는 약학적 조성물이다.
본 발명의 다른 목적은 아르기나제-1 결핍을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 약학적 조성물의 유효한 양을 투여하거나 또는 이를 필요로 하는 환자에게 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제의 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 아르기나제-1 결핍 또는 아르기닌-의존성 암의 치료, 패혈 쇼크의 치료 또는 예방, 혈관형성 억제 또는 혈관형성 관련 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제를 포함하는 약학적 조성물의 유효한 양 또는 적혈구에 캡슐화된 M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제의 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다.
아르기닌
데이미나제
"아르기닌 데이미나제"는 또한 "ADI"로 지칭되고, 하기 화학 반응을 촉매화하는 효소이다: L-아르기닌 + H2O 
L-시트룰린 + NH3. 따라서, 본 발명과 관련하여 본 발명의 문맥에서 사용되는 아르기닌 데이미나제는 또한 "효소" 또는 ADI로 지칭될 수 있다.
상기 효소의 2가지 기질은 L-아르기닌 및 H2O인 반면에, 이의 2가지 산물은 L-시트룰린 및 NH3이다. 상기 아르기닌 데이미나제는 가수분해효소 (hydrolases) 과 (family)에 속하며, IUBMB 효소 명명법에서 EC 3.5.3.6에 따라 확인된다. ADI는 바실루스 피오시아네우스 (Bacillus pyocyaneus), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 할로박테리움 살리나리움 (Halobacterium salinarium), 미코플라스마 아르기니니 (Mycoplasma arginini), 미코플라스마 호미니스 (Mycoplasma hominis), 슈도모나스 아에 루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 락토바실루스 락티스속 락티스 (Lactobacillus lactis ssp . Lactis) 및 슈도모나스 플 레코글로스시시다 (Pseudomonas plecoglossicida)와 같은 상이한 미생물로부터 유래될 수 있다 (Rui-Zhi Han et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100: 4747-4760 참조).
일 구체예에서, 상기 아르기닌 데이미나제는 단백질이다.
본원에서 사용되는, 용어 "단백질"은 단쇄 (single-chain) 폴리펩티드 분자 뿐만 아니라 각 구성성분인 폴리펩티드가 공유 또는 비공유 수단에 의해 연결되는 경우 다중-폴리펩티드 복합체를 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 단량체가 아미노산이고, 펩티드 또는 디설파이드 결합을 통해 함께 결합하는 폴리머를 지칭한다. 용어 서브유닛 및 도메인은 또한 생물학적 기능을 갖는 폴리펩티드 및 펩티드를 지칭할 수 있다.
본 발명과 관련하여 사용되는 아르기닌 데이미나제는 천연, 합성 또는 인공 기원일 수 있거나 또는 유전자 조작에 의해 수득될 수 있고 (예를 들어, 효소를 코딩하는 유전자를 발현하는 벡터의 통합 후에, E. 콜리 (E. coli)와 같은 숙주 세포에서 효소 생산), 당업자는 예를 들어 E. 콜리에서 M. 아르기니니 유래의 ADI 생산에 대한 기재에 있어서 S. Misawa et al., J. of Biotechno. 36, 1994, 145-155를 참조할 수 있다. 사용될 수 있는 아르기닌 데이미나제는 예를 들면 EP-A-1 011 717, EP-A-0 414 007, US-A-5 372 942, JP-A-6062867, JP-A-2053490, JP-A-2035081에 기재되어 있다. 동등한 방식으로, 본 발명은 예를 들어 EP-A-0 981 607에 기재된 바와 같이 효소 활성을 증가시키기 위해 변형되어진 효소일 수 있는, 상기 효소의 유사체, 예컨대 변이체 및 단편의 사용을 포함한다.
본 발명은 바람직하게는 예를 들어, 아르기닌-의존성 (영양요구성) 암 및 아르기나제 결핍을 포함하는, 혈장 아르기닌의 고갈이 유익한 임의의 질환에 사용하기 위해 개선된 ADI를 사용한다.
따라서, 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 문맥에서 사용되는 아르기닌 데이미나제는 미코플라스마 아르기니니에서 유래한다. 상기 미코플라스마 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제는 분자량이 92 kDa인 동종이량체이다. 다른 아르기닌 데이미나제와 비교하여 상기 아르기닌 데이미나제의 상대적으로 작은 크기는 적혈구내 캡슐화에 유리하다.
일 구체예에서, 미코플라스마 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제는 서열번호: 1의 아미노산 서열 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함한다. 서열번호: 1의 아미노산 서열은 GenBank database로부터 2017년 8월 22일 이래로 입수가능한 NCBI 참조 번호 WP_004416214.1의 미코플라스마 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제의 아미노산 서열에 해당한다.
본원에서 아미노산 서열 (또한 폴리펩티드로 지칭함)에 대한 언급은 특정 아미노산 서열과, 상기 서열의 변이체를 포함한다.
"변이체 단백질"은 자연 발생하는 변이체, 예컨대 스플라이스 변이체 (splice variants), 대립유전자 (alleles) 및 이소형 (isoforms)일 수 있거나, 또는 이들은 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 초래하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열로의 삽입에 의해 아미노산 서열의 변형이 도입될 수 있다. 선택적으로, 단백질에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 초과의 아미노산의 임의의 다른 아미노산으로의 치환에 의한 변형이다. 추가로 또는 대안으로서, 상기 단백질내 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 초과의 아미노산의 부가 또는 결실에 의한 변형일 수 있다.
단백질의 "단편"이 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 단편은 N-말단 또는 C-말단에서 절단 (truncated)될 수 있거나, 또는 예를 들어 전장의 단백질과 비교할 때 내부 잔기가 결여될 수 있다. 소정의 단편은 효소 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여되어 있다. 바람직하게, 상기 단편은 길이가 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 250, 300, 350, 380, 400 또는 초과의 아미노산이다.
변이체 단백질은 본원에 개시된 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게, 변이체 단백질은 본원에 개시된 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 아미노산 서열 동일성은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭 (gaps)을 도입하여 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성한 후에 참조 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 변이체 서열에서 아미노산 잔기의 퍼센트로 정의되며, 상기 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않았다. 서열 동일성은 변이체와 참조 아미노산 서열 모두의 전체 서열에 대해 결정될 수 있다.
당업자라면 다수의 상이한 핵산이 유전자 코드의 축퇴 결과로서 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 일상적인 기술을 사용하여 본 발명의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 수행하여 상기 폴리펩티드가 발현되는 임의의 특정 숙주 생물체의 코돈 이용을 반영할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 문맥에서 사용되는 ADI를 코딩하는 핵산은 당 분야에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 문맥에서 사용되는 ADI를 코딩하는 핵산은 재조합으로, 합성으로, 또는 당업자가 이용가능한 임의의 수단에 의해 제조될 수 있다. 이들은 또한 PCR (polymerase chain reaction)과 같은 표준 기술에 의해 클로닝될 수 있다.
본 발명의 쿼리 (query) 아미노산 서열에 대해 적어도, 예를 들어 95% "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드라 함은, 대상의 폴리펩티드 서열이 각 100개의 아미노산의 쿼리 아미노산 서열에 대해 최대 5개의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 제외하고 대상의 폴리펩티드의 아미노산 서열이 상기 쿼리 서열과 동일하다는 것을 의도한다. 다시 말해, 쿼리 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위해, 대상 서열에서 아미노산 잔기의 최대 5% (100 중 5)가 삽입, 결실 또는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 출원의 문맥에서, 동일성 퍼센트는 전역 정렬 (global alignment)을 사용하여 산출된다 (즉, 2개의 서열을 이들의 전체 길이에 대해 비교함). 2개 이상의 서열의 동일성을 비교하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 2개의 서열의 전체 길이를 고려할 때 이들의 최적의 정렬 (갭을 포함)을 찾기 위해 Needleman-Wunsch 전역 정렬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453)을 사용하는 "needle" 프로그램이 예를 들어 사용될 수 있다. 상기 needle 프로그램은 예를 들어 ebi.ac.uk world wide 웹 사이트에서 이용가능하다. 본 발명에 따른 동일성 퍼센트는 바람직하게는 "Gap Open" 파라미터가 10.0이고, "Gap Extend" 파라미터가 0.5이며, Blosum62 매트릭스 갖는 EMBOSS::needle (global) 프로그램을 사용하여 산출된다.
참조 서열에 대해 "적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한" 아미노산 서열로 구성된 단백질은 참조 서열과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환과 같은 돌연변이를 포함할 수 있다. 결실, 삽입 및/또는 치환의 경우에, 참조 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열로 구성된 단백질은 참조 서열보다 다른 종으로부터 유래된 동종의 서열에 해당할 수 있다.
아미노산 치환은 보존적 또는 비-보존적일 수 있다. 바람직하게, 치환은 보존적 치환이며, 여기서 하나의 아미노산은 유사한 구조 및/또는 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산으로 치환된다. 상기 치환은 바람직하게는 본원에서 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 보존적 치환에 해당한다.
| 보존적 치환 | 아미노산 타입 |
| Ala, Val, Leu, lle, Met, Pro, Phe, Trp | 지방족 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 |
| Ser, Tyr, Asn, Gln, Cys | 하전되지 않았지만 극성인 측쇄를 갖는 아미노산 |
| Asp, Glu | 산성 측쇄를 갖는 아미노산 |
| Lys, Arg, His | 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 |
| Gly | 중성 측쇄 |
바람직하게, 상기 변이체 또는 단편은 서열번호: 1의 전장 아미노산 서열을 갖는 단백질의 생물학적 활성을 보유한다.
일부 구체예에서, 본 발명과 관련하여 사용된 아르기닌 데이미나제는 서열번호: 1의 전장 아미노산 서열을 갖는 단백질과 비교하여 증가된 생물학적 활성 또는 효소 활성을 갖는 변이체 또는 단편일 수 있다. 따라서, 상기 변이체 또는 단편은 그의 효소 활성을 향상시키는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 "향상된 효소 활성"은 예를 들어 pH 최적의 개선, Km 및 kcat 값의 개선 및 향상된 열안정성을 나타낸다. 이러한 돌연변이는 당업자에게 알려져 있거나 또는 예를 들어, Rui-Zhi Han 등 (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100: 4747-4760)에 개시된 바와 같은 일반적 지식으로부터 당업자가 용이하게 유도할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 아르기닌 데이미나제 변이체 또는 그의 단편은 인 비보에서 혈장 반감기를 증가시키기 위해 변형될 수 있다.
약학적 조성물 또는 현탁액
본원에서 사용되는 용어 "약학적 조성물" 또는 "치료용 조성물"은 환자에게 적절히 투여되는 경우 원하는 치료적 효과를 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물을 지칭한다.
본 발명은 적혈구내에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제를 포함하는, 약학적 조성물 및 현탁액에 관한 것이다. 본 명세서에 제공된 정의는 본 발명의 조성물 및 현탁액을 지칭한다. ADI를 캡슐화하는 적혈구는 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 부형제 중에 현탁되어 있다.
"약학적으로" 또는 "약학적으로 허용가능한"은 포유동물, 구체적으로 인간에게 적절하게 투여되는 경우 유해, 알레르기 또는 다른 원하지 않는 반응을 일으키지 않는 분자적 실재물 (molecular entities) 및 조성물을 나타낸다.
특정 구체예에 따르면, 상기 "약학적으로 허용가능한 부형제"는 "보존 용액" 또는 "적혈구용 보존 용액", 즉 효소를 캡슐화하는 적혈구를 주사할 때까지 저장에 적합한 형태로 현탁되는 용액이다. 보존 용액은 바람직하게는 글루코스, 덱스트로스, 아데닌 및 만니톨로부터 선택되는, 적혈구의 보존을 촉진하는 적어도 하나의 작용제를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 보존 용액은 NaCl 및/또는 아데닌을 포함하는 수성 용액이다. 추가의 구체예에서, 상기 보존 용액은 글루코스, 덱스트로스 및 만니톨로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 추가적으로 포함한다. 예로서, 이는 NaCl, 아데닌 및 덱스트로스를 포함할 수 있다. 일례에서, 상기 보존 용액은 AS3 매질이다. 다른 예로서, 상기 보존 용액은 NaCl, 아데닌, 글루코스 및 만니톨을 포함할 수 있다. 추가적 예에서, 상기 보존 용액은 SAGM 매질, 예컨대 SAG-만니톨, 또는 ADsol 매질이다.
약학적 조성물의 정확한 형태, 투여 경로, 투여량 및 용법은 치료될 병태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 의존한다. 본 발명의 조성물 및 현탁액은 정맥내 또는 동맥내 투여를, 바람직하게는 주사 (injection), 주입 (infusion) 또는 관류 (perfusion)로 투여를 의도한 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 정맥내 또는 동맥내 투여를 위해 제제화된다.
본 발명의 조성물은 사용 준비되거나 또는 사용 준비되지 않을 수 있다. 본 발명의 사용 준비된 약학적 조성물은 희석 없이 투여에 적합한 적혈구용적률 (hematocrit)을 갖는다. 사용 준비가 되지 않은 경우, 상기 조성물은 또한 투여 전에 희석되어야 하는 적혈구용적률 값이 더 높게 패키지될 수 있다.
"적혈구용적률 (Ht 또는 HCT)"은 일반적으로 혈중 적혈구 세포의 부피 퍼센트 (vol%)로서 알려져 있다. 본 발명의 문맥에서, 상기 적혈구용적률은 또한 적혈구의 약학적 조성물 또는 현탁액으로 언급되는 조성물 또는 현탁액 중에 적혈구 세포의 부피 퍼센트 (vol%)로 언급될 수 있다.
본 발명에 따르면, 사용 준비된 약학적 조성물의 적혈구용적률은 유리하게는 40 내지 70%, 바람직하게는 45 내지 65%, 보다 바람직하게는 45 내지 55%, 예컨대 46 내지 54%, 47 내지 53%, 48 내지 52%, 예를 들어 약 50%이다. 사용 준비되지 않은 경우, 희석될 약학적 조성물의 적혈구용적률은 더 높을 수 있고, 구체적으로 50 내지 90%, 바람직하게는 60 내지 90%이다. 연결된 구체예에서, 상기 정의된 사용 준비된 조성물의 적혈구용적률 값을 얻기 위한 약학적 조성물의 희석은 약학적으로 허용가능한 부형제로 수행될 수 있다.
"적혈구"는 적혈구 세포로도 지칭된다. 적혈구는 골수에서 발생하며, 그의 성분이 마크로파지에 의해 재생되기 전에 체내에서 약 100-120일 동안 순환한다. 혈액 부피의 거의 절반 (40% 내지 45%)이 적혈구 세포이다. 적혈구를 분리하는 방법은 당업자에게 알려져 있다.
일 구체예에서, 적혈구는 치료 대상 또는 환자와 동일한 종의 포유동물로부터 발생된다. 상기 포유동물이 인간인 경우, 적혈구는 바람직하게는 인간 기원의 적혈구이다. 일 구체예에서, 상기 적혈구는 환자 자신으로부터 유래된다.
다른 구체예에서, 적혈구를 생성하는데 줄기세포가 사용된다. 당업자는 Russeau 등 (ISBT Science Series (2016) 11 (Suppl. 1), 111-117)을 언급할 수 있다. 줄기세포는 또한 적혈구 내부에서 효소를 발현시키기 위해 전환될 수 있다. 당업자는 US2015/0182588을 또한 언급할 수 있다. 이들 문헌은 참고로 본원에 포함된다.
본 발명과 관련하여 사용되는 아르기닌 데이미나제는 매우 활성이 높다. 예를 들어, 유닛 (unit) U를 사용하여 활성을 표시할 수 있다. "유닛 (U)"은 1분당 1 μmole의 기질을 전환시키는 효소의 양을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 문맥에서, 1U는 바람직하게는 37℃에서 1분당 1 μmole의 아르기닌을 전환시키는 효소의 양을 나타낸다. 보다 바람직하게, 1U는 (Boyde and Rahmatullah, 1980, Analytical Biochemistry, vol 107, p424-431)에 명시된 버퍼와 같이 아르기닌 데이미나제의 활성을 측정하는데 통상 사용되는 버퍼 중에 존재할 때 상기 아르기닌 데이미나제의 활성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 본원에서 정의되는 바와 같은 "유닛"은 "국제 유닛 (international unit: IU)"으로도 지칭될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 1U 및 1IU는 상호교환 가능하다.
아르기닌 데이미나제의 활성을 정성적으로 및/또는 정량적으로 평가하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 전형적으로, 아르기닌 데이미나제의 활성은 하기 실험 섹션, 구체적으로 실험 섹션의 실시예 1 및 2에서 상세하게 기재된 바와 같이 측정된다. 아르기닌 데이미나제의 활성을 측정하는데 사용되는 정확한 실험 조건은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 (Boyde and Rahmatullah, 1980, Analytical Biochemistry, vol 107, p424-431)에 기재되어 있다. 일 구체예에서, 본 발명과 관련하여 사용된 아르기닌 데이미나제는 캡슐화 전에 10 내지 100 U/mg, 예컨대 20 내지 80, 30 내지 70, 40 내지 60 U/mg의 비활성 (specific activity)을 가지며, 여기서 mg은 정제된 효소의 양을 나타낸다.
본원에서 "정제된 효소"는 순도가 90 내지 100%, 예컨대 92 내지 100%, 94 내지 100%, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 예를 들어 97%인 효소를 지칭한다. 효소의 순도를 결정하는 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 SDS 겔 분석, 또는 질량 분광 분석, 바람직하게는 SDS 겔 분석을 포함한다.
"아르기닌 데이미나제가 적혈구에 캡슐화됨"은 아르기닌 데이미나제가 적혈구내에 함유되는 것을 의미한다.
일 구체예에서, 본 발명과 관련하여 캡슐화된 아르기닌 데이미나제의 농도는 아르기닌 데이미나제의 적혈구내 농도로서 지칭되고, 0.1 내지 7 mg/ml, 바람직하게는 0.5 내지 6.5 mg/ml, 예컨대 1 내지 6 mg/ml, 1 내지 5 mg/ml, 1 내지 4 mg/ml, 1 내지 3 mg/ml, 보다 바람직하게는, 1.2 내지 2.8 mg/ml, 1.4 내지 2.6 mg/ml, 1.6 내지 2.4 mg/ml이다.
일부 구체예에서, 상기 캡슐화된 아르기닌 데이미나제의 농도는 적어도 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.5, 4, 4.5, 6 mg/ml이다. 일부 구체예에서, 상기 캡슐화된 아르기닌 데이미나제의 농도는 최대 7, 6.5, 5, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2 mg/ml이다.
다른 구체예에서, 상기 캡슐화된 아르기닌 데이미나제의 농도는 1 내지 1000 U/ml, 바람직하게는 1 내지 500 U/ml, 예컨대 1 내지 400 U/ml, 5 내지 400 U/ml, 5 내지 350 U/ml이다.
일부 구체예에서, 상기 캡슐화된 아르기닌 데이미나제의 농도는 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 내지 400 U/ml이다. 일부 구체예에서, 상기 캡슐화된 아르기닌 데이미나제의 농도는 최대 1000, 800, 600, 500, 400, 350, 300, 200, 100 U/ml이다.
바람직하게, mg/ml 또는 U/ml로 표시되는, 상기 캡슐화된 아르기닌 데이미나제의 농도는 본 발명의 약학적 조성물 또는 본 발명의 현탁액 1 ml당 아르기닌 데이미나제의 적혈구내 농도로 나타내며, 보다 바람직하게는 상기 조성물 또는 현탁액의 적혈구 용액 1 ml당 적혈구의 적혈구내 농도를 나타내고, 상기 용액은 전형적으로 50%의 적혈구용적률을 갖는다.
일 구체예에서, 보존 용액 중에 본 발명의 조성물 또는 현탁액은 2 내지 8℃의 보존 온도 및 72시간에 0.5 이하, 구체적으로 0.3 이하, 특히 0.2 이하, 바람직하게는 0.15 이하, 보다 바람직하게는 0.1 g/dl 이하의 수준으로 유지되는 세포외 헤모글로빈 수준을 특징으로 한다.
특히, 보존 용액 중에 본 발명의 조성물 또는 현탁액은 2 내지 8℃의 보존 온도 및 24시간 내지 20일, 특히 24 내지 72시간 동안, 0.5 이하, 구체적으로 0.3 이하, 특히 0.2 이하, 바람직하게는 0.15 이하, 보다 바람직하게는 0.1 g/dl 이하의 수준으로 유지되는 세포외 헤모글로빈 수준을 특징으로 한다.
"세포외 헤모글로빈 수준"은 유리하게 G. B. Blakney and A. J. Dinwoodie, Clin. Biochem. 8, 96-102, 1975에 기재된 수동 참조 방법에 의해 측정된다. 이들에 특정한 감도로 측정이 수행되는 자동 장치도 존재한다.
특히, 보존 용액 중에 본 발명의 조성물 또는 현탁액은 2 내지 8℃의 보존 온도 및 72시간에 2 이하, 특히 1.5 이하, 바람직하게는 1% 이하로 유지되는 용혈 속도 (hemolysis rate)를 특징으로 한다.
특히, 보존 용액 중에 조성물 또는 현탁액은 2 내지 8℃의 온도에서 24시간 내지 20일, 특히 24 내지 72시간 동안 2 이하, 특히 1.5 이하, 바람직하게는 1% 이하로 유지되는 용혈 속도를 특징으로 한다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 현탁액이다. 일 구체예에서, 본 발명의 현탁액 및 본 발명과 관련된 현탁액은 270 내지 350 mOsm/l의 삼투질농도 (osmolarity)를 갖는다. 삼투질농도를 측정하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 일례에서, 상기 삼투질농도는 삼투압계 (Micro-Osmometer Loser Type 15)로 측정된다. 상기 삼투질농도는 바람직하게는 표준 조건 (즉 25℃ 및 1 atm)에서 측정된다.
치료 방법 및 용도
본 발명의 발명자는 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제를 포함하는 약학적 조성물이 예를 들어 8ml/kg의 용량으로 투여되는 경우, 아르기나제 결핍 마우스에서 혈중 L-아르기닌 수준이 투여 3일 후에 최대 73%까지 감소하는 것을 밝혀냈다. 당업자라면 혈청 아르기닌의 증진된 수준이 치료되는 대상 또는 환자의 임상적 병태와 직접적으로 관련되기 때문에, 이러한 결과는 본 발명의 조성물뿐만 아니라 본 발명의 현탁액이 아르기나제-1 결핍을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다고 이해할 것이다.
본 발명자는 또한 놀랍게도 본 발명의 조성물 또는 현탁액을 투여하여 치료된 마우스에서 암모니아 수준을 현저하게 변화시키지 않으므로 잠재적으로 치료되는 대상 또는 환자에서 고암모니아혈증의 최종 에피소드에 영향을 미치지 않는다는 것을 마우스에서 입증하였다.
따라서, 본 발명은 아르기나제-1 결핍 치료에 사용하기 위한, 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아르기나제-1 결핍 치료에 사용하기 위한, 아르기닌 데이미나제, 구체적으로 M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액에 관한 것이다.
"아르기나제 -1 결핍"은 체내에서 아르기닌 (단백질의 빌딩 블록)을 처리할 수 없는 유전성 대사 질환이다. 이는 우레아 사이클 장애로 알려져 있는 장애 그룹에 속한다. 이는 암모니아를 제거하는 체내 과정이 중단되는 경우 발생하며, 이는 혈중 암모니아 수준의 증가를 야기할 수 있다 (고암모니아혈증). 대부분의 경우에, 증상은 1세에서 3세 사이에 나타난다. 증상은 섭식 문제, 구토, 성장 불량, 발작 및 증가된 반사를 동반한 근육 강직 (경련)을 포함할 수 있다. 아르기나제-1 결핍을 가진 사람은 또한 발달 지연, 발달 이정표 (developmental milestones) 상실 및 지적 장애를 가질 수 있다. 아르기나제-1 결핍은 ARG1 유전자에서 돌연변이화에 의해 유발되고, 상염색체 열성 방식 (autosomal recessive manner)으로 유전된다. 아르기나제-1 결핍을 가진 대부분의 사람은 출생시에는 건강하고, 유아기에는 정상적으로 발달하는 것으로 나타났다. 아르기나제-1 결핍의 첫번째 특징은 1세에서 3세 사이에 나타난다. 경우에 따라, 증상이 더 일찍 또는 더 늦게 시작될 수 있다.
아르기나제-1 결핍은 성장 불량 (아르기나제 결핍을 가진 모든 사람에서 나타남), 근육 강직과 증가된 반사 (경련), 발달 지연, 이전에 획득된 (previously acquired) 발달 이정표 상실, 지적 장애, 발작, 작은 머리 크기 (소두증), 균형과 협동 문제 (problems with balance and coordination), 행동 이상, 디아미노산뇨증 (diaminoaciduria), 지적 장애 (중증), 신경학적 언어 장애, EEG (Electroencephalogram) 이상, 반신마비/반신불완전마비 (hemiplegia/hemiparesis), 고암모니아혈증, 진행성 경직성 사지마비 (progressive spastic quadriplegia) 및 발작을 포함하는 목록으로부터 선택되는 하나 이상의 증후 및 증상을 특징으로 할 수 있다.
"아르기닌 1 결핍을 진단하는 방법"은 당업자에게 알려져 있으며, 통상 전체-패널 확장된 신생아 스크리닝 테스트 (full-panel expanded newborn screening testing)를 포함한다. 전형적으로, 혈장 아르기닌 농도가 정상의 상한을 초과하여 3배 내지 4배 더 상승하면 진단을 암시한다. 상기 진단은 전형적으로 적혈구 세포 추출물에서 아르기나제 효소 활성을 검출하지 못하거나 (통상 정상의 <1%) 또는 분자 유전 검사 (molecular genetic testing)에서 이대립인자성 (biallelic) ARG1 병원성 변이체의 동정에 의해 추가로 확인된다.
본 발명은 또한 본 발명의 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제의 유효한 양 또는 조성물의 유효한 양을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 아르기나제-1 결핍을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 문맥에서, 본원에서 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태, 또는 이러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 역전, 경감, 이의 진행 억제, 또는 예방하는 것을 의미한다.
따라서, 용어 "치료"는 질병의 완전한 치료를 이끄는 치료뿐만 아니라, 질환의 진행을 지연 및/또는 환자의 생존을 연장시키는 치료를 포함한다.
"유효한 양"은 필요한 투여량 및 기간 동안, 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다.
본 발명의 조성물 또는 현탁액의 치료적으로 유효한 양은 원하는 치료적 결과를 유도하기 위해, 질환 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 단백질의 역량과 같은 요인에 따라 가변될 수 있다. 치료적으로 유효한 양은 저해제의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료적으로 유익한 효과를 능가하는 양을 포함한다. 치료적으로 유효한 양은 또한 임상적 유익과 같은 이익을 부여하기에 충분한 양을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 상기에 정의된 바와 같은 본 발명의 조성물을 아르기나제-1 결핍에 대한 적어도 하나의 추가적 치료와 병용하여, 순차적으로 또는 동시에 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 아르기나제-1 결핍에 대한 하나의 추가적 치료는 저-단백질 식단, 질소 스캐빈저의 투여, 보툴리늄 (botulinum) 독소 주사, 또는 오르니틴 또는 리신과 같은 아미노산의 투여를 나타낸다.
"질소 스캐빈저"는 벤조에이트, 페닐부티레이트 및 페닐아세테이트를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 발명자는 적혈구에 캡슐화된 M. 아르기 니니 유래의 아르기닌 데이미나제가 아르기나제-1 결핍 마우스에서 예를 들어 8ml/kg의 용량으로 투여되는 경우 투여 3일 후에 혈중 L-아르기닌 수준이 최대 73% 만큼 감소하는 것을 입증하였다.
따라서, 당업자라면 M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액을 포함하는 약학적 조성물이 아르기나제-1 결핍 치료뿐만 아니라 혈중 아르기닌의 농도를 낮추는 것이 유익할 수 있는 다른 질환 치료에서 효과적일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
따라서, 본 발명은 혈장 아르기닌 고갈의 유리한 효과가 입증된 아르기닌-의존성 암에서 특히 흥미로운 적용을 발견하였다 (예를 들어, 상기 인용한 F. Izzo et al., 2004, C.M. Ensor et al., 2002, F.W. Holtsberg et al., 2002, J.S. Bomalaski et al., 2003, and Curley S.A. et al., 2003 참조).
그러나, 혈장 아르기닌 고갈은 또한 패혈 쇼크의 치료 또는 예방, 혈관형성 및 관련된 질환의 억제에 유익할 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 혈중 아르기닌의 농도를 낮추는데 사용하기 위한 M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
따라서, 관련된 일 구체예에서, 본 발명은 혈중 아르기닌의 농도를 낮추는데 사용하기 위한, 적혈구에 캡슐화된 M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
"약학적 조성물", "아르기닌 데이미나제", "현탁액", "약학적으로 허용가능한 부형제"와 관련된 정의는 본원에 제공된 바와 같고, 이에 준용한다.
구체적으로, 혈중 아르기닌의 농도를 낮추는 것은 아르기나제-1 결핍 치료, 아르기닌-의존성 암 치료, 패혈 쇼크의 치료 또는 예방, 혈관형성의 억제 및 관련 질환의 치료에 유용하다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 아르기나제-1 결핍 치료, 아르기닌-의존성 암 치료, 패혈 쇼크의 치료 또는 예방, 혈관형성 및 관련 질환의 억제에 사용하기 위한, M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
따라서, 관련된 일 구체예에서, 본 발명은 아르기나제-1 결핍 치료, 아르기닌-의존성 암 치료, 패혈 쇼크의 치료 또는 예방, 혈관형성 및 관련 질환 억제에 사용하기 위한 적혈구에 캡슐화된 M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
"아르기나제 -1 결핍"은 본원에 정의된 바와 같다.
"아르기닌-의존성 암"은 복제를 위해 아르기닌을 필요로 하는 암 세포와 관련된 암을 지칭하고, 이들 종양은 대부분 생합성 효소인 아스파라긴 신테타제의 결여로 인해 이들이 필요로 하는 아르기닌의 일부 또는 전부를 합성할 수 없으므로, 아르기닌의 공급을 필요로 하고, 그러므로 이러한 암을 "아르기닌 영양요구성 암"이라고도 한다. 혈장 아르기닌 고갈은 세포 성장에 필수적인 아르기닌을 세포로부터 박탈하여, 상기 세포의 표적화된 사멸, 종양 성장의 억제 또는 종양 덩어리의 퇴행을 유도한다.
아르기닌 의존성 암은 간암종, 원발성 간암, 흑색종, 유방암, 신경모세포종, 백혈병, 중피암 (mesothelial cancer), 비뇨기 암 (urological cancer), 육종, 위암 및 뇌암 (cerebral cancer)으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
"중피암"은 예를 들어 MPM (malignant pleural mesothelioma)을 나타낸다.
"비뇨기 암"은 예를 들어 신장세포 암종, 전립선암, 결장암 및 방광암, 구체적으로 이행 세포 암종 (transitional cell carcinoma)을 포함한다.
"육종"은 예를 들어 별아교세포종 (Astrocytoma), 희소돌기아교세포종 (Oligodendroglioma)을 나타낸다.
"뇌암"은 예를 들어 골육종을 나타낸다.
일 양상에서, 상기 아르기닌 의존성 암은 간암종 또는 원발성 간암이다. 추가적 일 양상에서, 상기 아르기닌 의존성 암은 흑색종, 구체적으로 악성 흑색종으로, 이의 다양한 형태로 예컨대 표재 확산 흑색종 (superficial spreading melanoma) 및 결절성 흑색종 (nodular melanoma)이다. 추가적 일 양상에 따르면, 상기 아르기닌 의존성 암은 하기 형태의 암 중 하나이다:
- 유방암,
- 신경모세포종 (Gong H. et al., Int. J. Cancer 2003, 106: 723-8),
- 백혈병 (Gong H. et al. Leukemia 2000, Vol. 14, 826-9; Noh E.J. et al., Int. J. Cancer 2004, 112: 502-8).
"치료하는"은 본원에 정의된 바와 같다.
"예방하는" 또는 "예방"은 예방적 사용 (즉 주어진 질환이 발생하기 쉬운 개체에서)을 의미한다.
"혈관형성 억제 및 관련 질환의 치료"는 하기와 같은 질환의 치료를 나타낸다: 혈관종, 혈관섬유종, 관절염, 당뇨병성 망막병증, 조기 신생혈관 녹내장의 망막병증 (retinopathy of the premature, neovascular glaucoma), 각막 질환, 황반 변성의 갱년기 (involutional) 및 다른 형태, 익상편 (pterygium), 망막 변성, 수정체뒤 섬유증식 (retrolental fibroplasia), 건선, 모세혈관확장증 (telangiectasia), 화농성 육아종 (granuloma pyogenicum), 지루 피부염 (seborrheic dermatitis), 여드름, 암 및 혈관형성과 연결된 전이 (metastases) (WO0209741; Park I.S. et al., Br. J. Cancer 2003, 89: 907-14).
본 발명의 추가적 목적은 본원에 제시된 질환 치료를 위한 의약 제조를 위한 ADI를 캡슐화하는 적혈구 또는 이러한 적혈구의 현탁액의 용도이다.
이들 용도는 본 발명의 현탁액 및 약학적 조성물 또는 의약에 대해 제시된 특성을 고려한다.
본 발명의 다른 목적은 아르기나제-1 결핍을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 약학적 조성물의 유효한 양을 투여하거나 또는 이를 필요로 하는 환자에게 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제의 유효한 양을 투여하거나 또는 이를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 의약의 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 아르기나제-1 결핍 또는 아르기닌-의존성 암 치료, 패혈 쇼크의 치료 또는 예방, 혈관형성 억제 또는 혈관형성 관련 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제를 포함하는 약학적 조성물의 유효한 양 또는 적혈구에 캡슐화된 M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제의 유효한 양을 투여하거나 또는 이를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 의약의 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다.
상기 치료 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 "치료적으로 유효한 용량", "치료적으로 유효한 양" 또는 "유효한 양"의 투여를 포함하며, 상기에서 유효한 양은 본원에 정의된 바와 같다.
구체적으로, "치료적으로 유효한 용량", "치료적으로 유효한 양" 또는 "유효한 양"은 통상적으로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 실제 투여되는 효소의 양은 치료될 병태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물, 각 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자 증상의 중증도 등을 포함하는 관련 상황에 비추어 의사가 결정할 수 있다. 상기 유효한 양은 전형적으로 혈액 순환 중에 아르기닌 고갈을 유도하는데 충분할 수 있다. 바람직하게, 이러한 고갈은 충분한 시간 동안 역치 수준 이하로 아르기닌을 유지하는 것에 해당할 수 있다.
일부 예에서, 상기 아르기닌 수준은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 동안, 바람직하게는 적어도 3일 동안 역치 수준 이하로 유지될 수 있다.
전형적으로 효소의 유효한 양은 본원에 하기 "용량" 섹션에서 더 상세하게 기재되어 있다.
상기 약학적 조성물은 정맥내 또는 동맥내 주사, 바람직하게는 혈액 백 (blood bag) 또는 유사물로부터 주사, 주입 또는 관류에 의해 투여될 수 있다. 투여는 전형적으로 팔 (arm)에 또는 중심 카테터 (central catheter)를 통해 정맥으로 영향을 준다.
구체적으로, 본 발명에 따른 현탁액 (1회 용량), 약학적 조성물 또는 의약의 약 10 내지 약 250 ml를 투여한다. 20 ml을 초과하면, 주입 또는 관류를 사용하는 것이 바람직하다.
치료는 결정된 프로토콜에 따라 1회 용량 또는 수회 용량의 투여를 포함한다. 이는 권장되는 치료 기간에 걸쳐서, 매월, 격주 또는 매주 간격으로 수회 투여, 바람직하게는 주 1회, 2회 또는 3회로 제공할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 문맥에서 치료는 본원에서 하기 용량 섹션에서 정의되는 바와 같이 각 시점 (각 용량)에서 1회 용량의 투여로 이루어질 수 있다.
일례에서, 본 발명의 문맥에서 치료는 바람직하게는 각 시점 (각 용량)에서 체중 1 kg 당 0.001 mg/kg 내지 1000 mg/kg의 효소, 바람직하게는 체중 1 kg 당 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg의 효소의 투여로 이루어질 수 있다. 바람직하게, 체중 1 kg 당 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg의 효소가 바람직하게는 각 시점 (각 용량)에서 투여된다.
추가의 일례에서, 본원에서 하기 용량 섹션에서 추가적으로 명시되는 바와 같이, 본 발명의 문맥에서 치료는 각 시점 (각 용량)에서 환자 체중 1 kg 당 10 U/kg 내지 100000 U/kg의 효소, 바람직하게는 각 시점 (각 용량)에서 환자 체중 1 kg 당 10 U/kg 내지 15000 U/kg의 효소, 보다 바람직하게는 각 시점 (각 용량)에서 환자 체중 1 kg 당 500 U/kg 내지 3500 U/kg의 효소의 투여로 이루어질 수 있다.
용량
본 발명의 조성물은 바람직하게는 원하는 치료적 효과를 발휘하도록 산출된 활성 물질의 미리-결정된 정량을 함유하는 부피로 패키지 또는 제시된다. 당업자라면 투여되는 조성물의 부피 또는 용량은 예를 들어 투여를 위한 포유동물의 병태 (예: 체중, 연령, 성별 및 건강, 동시 치료, 특히 치료 빈도), 투여 방식 및 제제 타입에 따른다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 문맥에서, 투여용 조성물이 패키지되는 부피를 또한 용량으로 지칭한다. 일 구체예에서, 상기 부피는 10 내지 250 ml이다.
따라서, 투여용 조성물은 바람직하게는 1회 용량으로 패키지 또는 제시된다; 바람직하게 상기 용량은 본원에서 정의된 바와 같은 부피를 갖는다. 패키징은 바람직하게는 용기, 가령 예를 들어 혈액 수혈 등에 적절한 타입의 혈액 백에 한다. 의학적 처방에 해당하는 캡슐화된 효소의 전체량이 바람직하게는 상기 용기에 함유된다. 즉, 주어진 양의 효소를 캡슐화하는 적혈구의 1회 용량은 하나의 용기 또는 약학적 조성물 중에 존재할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 1회 용량은 이를 필요로 하는 환자에게 전체 투여된다. 다른 구체예에서, 상기 투여는 단회 용량 또는 수회 용량으로 수행될 수 있다.
1회 용량의 캡슐화된 효소의 양은 환자 체중 1 kg 당 0.001 mg/kg 내지 1000 mg/kg일 수 있다. 보다 바람직하게, 1회 용량의 캡슐화된 효소의 양은 환자 체중 1 kg 당 0.01 mg/kg 내지 1000 mg/kg이다. 가장 바람직하게, 1회 용량의 캡슐화된 효소의 양은 환자 체중 1 kg 당 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg이다. 가장 바람직하게, 1회 용량의 캡슐화된 효소의 양은 환자 체중 1 kg 당 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg 또는 환자 체중 1 kg 당 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg이다.
일부 구체예에서, 1회 용량의 캡슐화된 효소의 양은 환자 체중 1 kg 당 적어도 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 mg/kg이다. 일부 구체예에서, 1회 용량의 캡슐화된 효소의 양은 환자 체중 1 kg 당 최대 200, 150, 100, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 25, 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1 mg/kg이다.
1회 용량의 캡슐화된 효소의 양은 또한 환자 체중 1 kg 당 10 U/kg 내지 100000 U/kg일 수 있다. 보다 바람직하게, 1회 용량의 캡슐화된 효소의 양은 환자 체중 1 kg 당 10 U/kg 내지 80000 U/kg이다. 가장 바람직하게, 1회 용량의 캡슐화된 효소의 양은 환자 체중 1 kg 당 10 U/kg 내지 50000 U/kg이다. 가장 바람직하게, 1회 용량의 캡슐화된 효소의 양은 환자 체중 1 kg 당 10 U/kg 내지 5000 U/kg, 50 U/kg 내지 3500 U/kg, 또는 50 U/kg 내지 3500 U/kg이다.
일부 구체예에서, 1회 용량의 캡슐화된 효소의 양은 환자 체중 1 kg 당 적어도 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000 UI/kg을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 1회 용량의 캡슐화된 효소의 양은 또한 환자 체중 1 kg 당 최대 10000, 9500, 9000, 8500, 8000, 7500, 7000, 6500, 6000, 5500, 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 900, 800, 600, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 UI/kg을 가질 수 있다.
당업자라면 투여에 사용된 용량은 다양한 파라미터의 함수, 구체적으로 사용된 투여 방식, 관련 병리학 또는 대안으로서 원하는 치료 기간의 함수로서 조정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물은 암 치료와 관련하여 종래 기술에 기재되어 있다. 아르기나제-1 결핍 치료에 사용하기 위한 본 발명의 조성물에 대해 상기 확인된 공보에 기재된 투여량의 조정은 당업자의 능력안에 있다.
캡슐화 방법
적혈구는 본원에서 상기 "약학적 조성물" 섹션에 기재된 바와 같이 수득될 수 있다.
상기 효소를 적혈구에 캡슐화하는 것은 저장성 (hypotonic) 액체 매질과 접촉시켜서 적혈구 막에서 기공을 개방시키는, 적혈구 현탁액을 사용하여 수행될 수 있다. 용해-재봉합 기술 (lysis-resealing technique)에는 저장성 투석 (hypotonic dialysis), 저장성 사전팽창 (hypotonic preswelling) 및 저장성 희석 (hypotonic dilution)의 3가지 대안이 존재하며, 모두 적혈구 내부와 외부 사이의 삼투압 차이에 기반한다. 저장성 투석이 바람직하다.
상기 효소를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액은 특히 하기 방법으로 수득될 수 있다:
1 - 65% 이상의 적혈구용적률 수준에서 등장성 용액 중에 적혈구 펠렛을 현탁시키고, +1 내지 +8℃로 냉각시키는 단계,
2 - +1 내지 +8℃로 유지된 온도에서, 65% 이상의 적혈구용적률 수준에서 적혈구의 현탁액 및 +1 내지 +8℃의 냉각된 저장성 용해 용액을 투석 장치, 예컨대 코일 또는 투석 카트리지 (카트리지가 바람직함)로 통과시키는 단계를 포함하는 용해 절차 (lysis procedure);
3 - +1 내지 +8℃로 유지된 온도에서, 용해 전 또는 중에 캡슐화될 효소 (특히 사전에 제조된 용액 중)를 상기 현탁액에 바람직하게는 서서히 부가하는 캡슐화 절차 (encapsulation procedure); 및
4 - 보다 높은 온도, 특히 +30 내지 +42℃의 온도에서, 등장성 또는 고장성 용액, 유리하게는 고장성 용액의 존재하에 수행되는 재봉합 절차 (resealing procedure).
바람직한 일 대체예에서, WO-A-2006/016247 (EP 1 773 452; 이는 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 방법을 사용할 수 있다:
1 - 65% 이상의 적혈구용적률 수준에서 등장성 용액 중에 적혈구 펠렛을 현탁시키고, +1 내지 +8℃로 냉각시키는 단계,
2 - 상기 동일한 펠렛으로부터 적혈구 시료로부터 삼투압 취약성 (osmotic fragility)을 측정하는 단계,
3 - +1 내지 +8℃로 유지된 온도에서, 65% 이상의 적혈구용적률 수준에서 적혈구의 현탁액 및 +1 내지 +8℃로 냉각된 저장성 용해 용액을 투석 장치, 예컨대 코일 또는 투석 카트리지 (카트리지가 바람직함)를 통과시키는 단계를 포함하는 용해 절차로서; 상기 용해 파라미터는 초기에 측정된 삼투압 취약성에 따라; 특히 측정된 삼투압 취약성에 따라 조정되고, 상기 투석 장치를 통과하는 적혈구 현탁액의 유속이 조정되거나 또는 상기 용해 용액의 삼투질농도가 조정되는 것인 용해 절차; 및
4 - +1 내지 +8℃로 유지된 온도에서, 용해 전 또는 중에 캡슐화될 효소 (특히 사전에 제조된 용액 중)를 상기 현탁액에 바람직하게는 서서히 부가하는 캡슐화 절차; 및
5 - 보다 높은 온도, 특히 +30 내지 +42℃의 온도에서 등장성 또는 고장성 용액, 유리하게는 고장성 용액의 존재하에 수행되는 재봉합 절차.
특히, 투석의 경우, 상기 적혈구 펠렛을 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상의 높은 적혈구용적률 수준으로 등장성 용액 중에 현탁시키고, 상기 현탁액을 +1 내지 +8℃, 바람직하게는 +2 내지 +6℃, 전형적으로 약 +4℃로 냉각한다. 특정 방법에 따르면, 상기 적혈구용적률 수준은 65 내지 80%, 바람직하게는 70 내지 80%로 이루어진다.
삼투압 취약성을 측정하는 경우, 상기 삼투압 취약성은 유리하게는 캡슐화될 효소의 존재 또는 부재하에, 바람직하게는 상기 효소의 존재하에 용해 단계 직전에 적혈구에서 측정된다. 상기 적혈구 또는 이를 함유하는 현탁액은 유리하게는 용해를 위해 선택된 온도에 근접한 온도 또는 이와 동일한 온도에 있다. 본 발명의 다른 유리한 특성에 따르면, 상기 삼투압 취약성의 수행된 측정을 신속하게 이용하며, 즉 용해 절차는 시료를 채취한 후에 짧은 시간내에 수행한다. 바람직하게, 시료 채취와 용해 시작 사이의 시간 경과는 30분 이내, 더 바람직하게는 25분 이내, 심지어 20분 이내이다.
용해-재봉합 절차 및 측정의 수행 및 삼투압 취약성과 관련하여, 당업자는 보다 상세한 내용은 WO-A-2006/016247을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함한다.
상기 캡슐화 기술의 개선은 WO 2014/180897에 기재되어 있고, 이를 당업자는 참조할 수 있으며, 본원에 참고로 포함된다. 따라서, 일 구체예에 따르면, 상기 효소를 캡슐화하는 적혈구는 용해-재봉합에 의해 적혈구 내부에 활성 성분을 캡슐화하는 단계, 280 mOsmol/kg 이상, 구체적으로 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투질농도를 갖는 용액 및 효소가 혼입된 적혈구를 포함하는 펠렛 또는 현탁액을 수득하는 단계, 280 mOsmol/kg 이상, 구체적으로 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투질농도에서 상기 펠렛 또는 현탁액을 그대로 또는 인큐베이션 용액을 부가한 후에 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다. 인큐베이션은 특히 30분 이상, 구체적으로 1시간 이상 동안 수행된다. 그 다음에 인큐베이션된 용액 중 액체 매질의 제거를 진행하고, 수득된 적혈구를 현탁액을 환자에게 주사 가능하게 하는 용액, 바람직하게는 현탁액을 환자에게 주사 가능하게 하는 보존 용액 중에 현탁시킨다. 표시된 삼투질농도는 적혈구가 현탁되거나 펠렛이 현탁되는 관련 순간에서 용액의 삼투질농도이다.
"안정화된 적혈구 현탁액"은 특히 인간에서 사용될 때까지 세포외 헤모글로빈 함량이 0.2 g/dl 이하로 유지되는 현탁액을 의미하며, 후자는 활성 성분이 혼입된 적혈구 배치 (batch)를 생성한 후 1 내지 72시간에 존재할 수 있다.
"사용 준비된 안정화된 적혈구 현탁액"은 환자에게 주사 가능하게 하는 용액, 특히 보존 용액 중에 안정화된 현탁액을 의미한다. 그의 적혈구용적률은 일반적으로 35% 이상, 40% 이상 또는 45% 이상이다.
"적혈구 펠렛 "은 적혈구가 이미 현탁된 액체 매질 중에서 적혈구를 분리한 후에 수집된 적혈구의 농축물 또는 농도를 의미한다. 상기 분리는 여과 또는 원심분리에 의해 보장될 수 있다. 원심분리는 이러한 분리에 일반적으로 사용되는 수단이다. 펠렛은 소정 비율의 액체 매질을 포함한다. 일반적으로 상기 펠렛은 70 내지 85%로 이루어진 적혈구용적률을 갖는다.
"인큐베이션 용액"은 인큐베이션 단계 중에 활성 성분을 캡슐화하는 적혈구가 존재하는 용액을 의미한다. 상기 인큐베이션은 큰 범위의 적혈구용적률, 특히 10 내지 85%의 적혈구용적률에 대해 수행될 수 있다.
"취약한 적혈구 (fragile erythrocytes)"는 보존 용액 중에 현탁되는 경우, 상기 현탁액이 특히 1 내지 72시간 후에 2 내지 8℃로 보존될 때 용해될 수 있는 혼입 절차로부터 유래되는 적혈구를 의미한다.
"초기 적혈구용적률"은 인큐베이션 중에 취약한 적혈구의 용해로 인한 세포 손실 전에 적혈구용적률을 의미한다.
상기 방법은 특히 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a) 적혈구 내부에 효소를 캡슐화하는 단계로서, 상기 적혈구를 저장성 매질과 접촉시키고 (상기 적혈구 막에서 기공이 개방됨), 활성 성분과 접촉시키며 (이를 적혈구에 진입시키기 위함), 특히 등장성 또는 고장성 매질, 유리하게는 고장성 매질에 의해 상기 적혈구를 재봉합하는 것을 포함하는 단계,
(b) 280 mOsmol/kg 이상, 구체적으로 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투질농도를 갖는 용액 및 효소가 혼입된 적혈구를 포함하는 현탁액 또는 펠렛을 수득 또는 제조하는 단계,
(c) 280 mOsmol/kg 이상, 구체적으로 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투질농도에서, 상기 단계 (b)의 펠렛 또는 현탁액을 그대로 또는 인큐베이션 용액을 부가한 후에, 30분 이상, 특히 1시간 이상 동안 인큐베이션하는 단계,
(d) 상기 단계 (c)의 인큐베이션된 현탁액 중 액체 매질을 제거하는 단계,
(e) 상기 단계 (d)에서 수득된 적혈구를, 현탁액을 환자에게 주사가능하게 하는 용액, 바람직하게는 현탁액을 환자에게 주사가능하게 하는 보존 용액에 현탁시키는 단계.
제1 방법에 따르면, 용해-재봉합에 의한 캡슐화 후의 단계인, 특히 단계 (b)는 280 mOsmol/kg 이상, 구체적으로 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투질농도에서, 용액 중 용해-재봉합 단계 또는 단계 (a)의 수득된 현탁액 또는 펠렛의 희석에 의해 적어도 1회 세척 사이클, 바람직하게는 2 또는 3회 세척 사이클, 그 다음에 적혈구의 펠렛 또는 현탁액을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 펠렛 또는 상기 현탁액은 280 mOsmol/kg 이상, 구체적으로 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투질농도를 갖는 용액 및 효소가 혼입된 적혈구를 포함한다. 그 다음에 (c), (d) 및 (e)와 같은 다음 단계가 적용된다.
제2 방법에 따르면, 상기 용해-재봉합 단계 또는 단계 (a)에서, 등장성 또는 고장성 매질에 의한 상기 적혈구의 재봉합으로, 280 mOsmol/kg 이상, 구체적으로 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투질농도를 갖는 용액에서, 이후에 인큐베이션될 수 있는 적혈구의 현탁액, 예컨대 단계 (b)의 현탁액을 제조한다. 다시 말해서, 상기 용해-재봉합 단계 또는 단계 (a)는 상기 적혈구를 재봉합하는 단계를 포함하며, 상기 효소를 캡슐화하는 현탁된 적혈구를 등장성 또는 고장성 재봉합 용액, 유리하게는 고장성 용액과 혼합하여, 280 mOsmol/kg 이상, 구체적으로 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투질농도를 갖는 적혈구 현탁액을 제조한다. 상기 방법에서, 인큐베이션 단계 또는 단계 (c)는 상기 재봉합으로부터 유래된 현탁액의 인큐베이션을 포함한다. 상기 인큐베이션은 30분 이상, 특히 1시간 이상의 기간 동안 수행된다. 그 다음에 (d) 및 (e)와 같은 다음 단계가 적용된다.
(b) 내지 (e) 단계와 같은 용해-재봉합 다음 단계는 취약한 적혈구, 또는 이들 대부분, 특히 50, 60, 70, 80 또는 90%, 또는 초과의 용해를 초래하는 조건하에 수행된다. 이를 수행하기 위해서, 인큐베이션 기간, 인큐베이션 온도 및 상기 적혈구가 현탁된 용액의 삼투질농도에서 수행할 수 있다. 상기 삼투질농도가 높아지면, 인큐베이션 시간은 더 길어질 수 있다. 따라서, 상기 삼투질농도가 낮아지면, 동일한 효과를 얻기 위해서 인큐베이션 시간은 더 짧아질 수 있다. 또한, 상기 온도가 높아지면, 인큐베이션 시간은 더 짧아질 수 있고, 반대의 경우도 가능할 수 있다. 그 다음에 1회 또는 수회의 세척 사이클로 세포 조직파편 (cell debris) 및 세포외 헤모글로빈뿐만 아니라 세포외 효소의 제거를 가능하게 할 것이다.
본 발명에 따르면, 세척 사이클은 적혈구의 현탁액 또는 펠렛의 희석을 포함하며, 그 다음에 상기 적혈구과 세척 용액을 분리시킨다. 바람직하게, 세척 단계는 바람직하게는 2 또는 3회의 희석-분리 사이클을 포함한다. 상기 분리 단계는 여과 및 원심분리와 같은 임의의 적절한 수단에 의해 달성될 수 있다. 원심분리가 바람직하다.
인큐베이션은 상기 현탁액의 적혈구용적률에 의해 제한되지 않는다. 이러한 방식으로, 일반적으로 10 내지 85%, 특히 40 내지 80%로 이루어진 초기 적혈구용적률을 갖는 현탁액이 인큐베이션될 수 있다. 이는 70% 초과는 펠렛으로 및 상기 값 이하는 현탁액으로 지칭된다.
상기 제거 단계 또는 단계 (d)는 특히 세포 조직파편 및 세포외 헤모글로빈뿐만 아니라 후속하는 세포외 효소를 제거하기 위해 현탁액 또는 인큐베이션된 펠렛 중 액체 부분을 제거하는데 있다.
상기 제거 단계 또는 단계 (d)에 대한 제1 방법에 따르면, 분리, 특히 원심분리를 수행하며, 이는 특히 현탁액에 적용가능하다. 상기 분리 후에 1회 또는 수회, 예를 들어 2 또는 3회의 세척 사이클, 등장성 용액에서의 희석, 그 다음에 특히 원심분리에 의한 분리가 수행된다.
상기 제거 단계 또는 단계 (d)에 대한 제2 방법에 따르면, 분리, 특히 원심분리 전에 희석을 수행하며, 이는 현탁액 또는 펠렛에 적용가능하다. 상기 희석은 특히 등장성 세척 용액 또는 보존 용액으로 수행될 수 있다.
상기 최종 단계 또는 단계 (e)는 임의의 다른 처리 없이 환자에게 투여될 수 있도록 최종 현탁액의 제조로 이루어진다.
상기 단계에 대한 제1 방법에 따르면, 상기 제거 단계 또는 단계 (d)로부터 적혈구 펠렛의 희석은 주사 용액, 특히 보존 용액으로 수행된다.
상기 단계에 대한 제2 방법에 따르면, 상기 제거 단계 또는 단계 (d)로부터 유래되는 적혈구 펠렛을 세척하기 위한 1회 또는 수회의 사이클은 주사 용액, 특히 보존 용액으로 희석 및 분리에 의해 수행된다. 세척 후에, 상기 적혈구를 주사 용액, 특히 보존 용액 중에 재-현탁시킨다.
본 발명의 방법은 또한 하기 특성 중 하나, 수개 또는 전체를 포함할 수 있다:
- 인큐베이션 단계 또는 단계 (c)는 취약한 적혈구의 용해를 보장하기에 충분한 시간에 걸쳐서 약 2 내지 약 39℃로 이루어진 온도에서 수행됨;
- 인큐베이션 단계 또는 단계 (c)는 저온, 특히 약 2 내지 약 10℃, 구체적으로 약 2 내지 약 8℃에서 수행되고, 약 1시간 내지 약 72시간, 특히 약 6시간 내지 약 48시간, 바람직하게는 약 19시간 내지 약 30시간 동안 지속됨;
- 인큐베이션 단계 또는 단계 (c)는 약 20 내지 약 39℃로 이루어진 보다 높은 온도, 특히 실온 (25 ℃ ± 5 ℃)에서 수행되고, 약 30분 내지 약 10시간, 특히 약 1시간 내지 약 6시간, 바람직하게는 약 2시간 내지 약 4시간 동안 지속되고; 실온보다 훨씬 더 높은 온도에서 수행할 수 있지만, 이는 세포 수율, P50 및/또는 2,3-DPG 함량에 있어서 부정적인 영향을 줄 수 있음;
- 인큐베이션 단계 또는 단계 (c)에서, 상기 현탁액은 10 내지 85%, 특히 40 내지 80%로 이루어진 초기 적혈구용적률을 가지며; 예를 들어 70 내지 약 85%의 적혈구용적률을 갖는 분리로부터의 펠렛, 또는 약 40 내지 70%로 이루어진 적혈구용적률을 갖는 희석된 펠렛이 인큐베이션될 수 있음;
- 인큐베이션 단계는 현탁액의 교반을 포함함;
- 인큐베이션 단계는 임의의 교반을 포함하지 않음;
- 세척 및/또는 인큐베이션을 위한 용액으로서, 계량된 (metered) NaCl 수용액이 원하는 삼투질농도를 얻기 위해 사용되고; 예로서, 용액은 0.9%의 NaCl을 포함할 수 있으며; 상기 용액은 또한 NaCl 이외에 특히 글루코스, 특히 글루코스 모노히드레이트, 모노소듐 포스페이트 디히드레이트, 디소듐 포스페이트 도데카히드레이트를 포함할 수 있고; 예로서, 조성물은 0.9%의 NaCl, 0.2%의 글루코스 모노히드레이트, 0.034%의 모노소듐 포스페이트 디히드레이트, 0.2%의 디소듐 포스페이트 도데카히드레이트를 포함함;
- 최종 단계 또는 단계 (e)에서 세척은 보존 용액으로 수행함;
- 사용 준비된 현탁액 중 또는 환자에게 주사될 수 있는 용액 (액체 부분)의 삼투질농도는 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg으로 이루어짐;
- 사용 준비된 현탁액 또는 환자에게 주사될 수 있는 적혈구용적률은 35% 이상, 40% 이상 또는 45% 이상임;
- 세척 및 인큐베이션을 위한 모든 단계는 보존 용액으로 수행됨;
- 단계 (b)의 세척 용액 및/또는 단계 (e)의 세척 용액 및 보존 용액은 동일한 조성을 가지며, 상기 적혈구 보존을 촉진하는 화합물(들)을 포함함;
- 보존 용액 (및 필요하다면 세척 용액(들) 또는 인큐베이션 용액)은 NaCl, 아데닌 및 글루코스, 덱스트로스 및 만니톨로부터의 적어도 하나의 화합물을 포함하는 수성 용액임;
- 보존 용액 (및 필요하다면 세척 또는 인큐베이션 용액(들))은 NaCl, 아데닌 및 덱스트로스, 바람직하게는 AS3 매질을 포함함;
- 보존 용액 (및 필요하다면 세척 또는 인큐베이션 용액(들))은 NaCl, 아데닌, 글루코스 및 만니톨, 바람직하게는 SAG-만니톨 또는 ADsol 매질을 포함함.
본 발명에 따른 방법은 특히 하기 단계를 포함한다:
(a) 적혈구 내부에 효소를 캡슐화하는 단계로서, 적혈구를 저장성 매질과 접촉시켜서 상기 적혈구 막에서 기공을 개방시키고, 효소를 적혈구에 진입시키기 위해 효소와 접촉시키며, 등장성 또는 고장성 매질에 의해 상기 적혈구를 재봉합시키는 것을 포함하는 단계. 상기 효소는 후자의 용해 전에 적혈구의 현탁액 중에 존재할 수 있거나, 또는 용해 중 또는 용해 후에, 하지만 재봉합 전에는 추가적으로 부가될 수 있음에 유의해야 한다. 상기 단계 (a)의 일 구체예에서, 상기 방법은 하기의 하위 단계를 포함한다:
(a1) 60 또는 65% 이상의 적혈구용적률로 적혈구의 현탁액을 갖는 단계,
(a2) 상기 현탁액 중에 상기 적혈구의 삼투압 취약성을 측정하는 단계,
(a3) 활성 성분(들)의 용해 및 내재화를 위한 단계로서, 상기 적혈구 현탁액을 투석 장치, 특히 투석 카트리지로 용해 용액에 대항하여 통과시키고, 상기 (a2)에서 측정된 삼투압 취약성에 따라, 적혈구 현탁액의 유속을 조정하거나 또는 용해 용액의 유속을 조정하거나 또는 용해 용액의 삼투질농도를 조정하는 것을 포함하는 단계,
(a4) 상기 적혈구를 재봉합하는 단계.
본원에서 상기 "아르기닌 데이미나제", "약학적 조성물" 또는 "현탁액", "치료적 용도" 및 "용량", 예컨대 "적혈구", "적혈구용적률 수준", "아르기닌 데이미나제" 섹션에서 제공된 정의는 "캡슐화 방법" 섹션에 준용된다.
본 출원 전반에 걸쳐서, 하나의 섹션에 기재된 특성은 전체적으로 본 명세서의 다른 섹션에도 적용가능하다. 예를 들어, "아르기닌 데이미나제" 섹션에서 제공되는 "아르기닌 데이미나제"를 언급하는 설명은 전체적으로 "약학적 조성물 또는 현탁액" 섹션, "치료적 방법 및 용도" 섹션, "치료적 방법 및 용도" 섹션, "캡슐화 방법" 섹션 및 "용량" 섹션에 적용가능하다.
본 출원 전반에 걸쳐서, 용어 "및/또는"은 이들이 연결되는 하나 이상의 경우가 발생할 수 있다는 것을 포함하는 것으로 해석되는 문법적 접속어이다. 예를 들어, "저-단백질 식단 및/또는 질소 스캐빈저 약물에 의한 결과는 불량하다"라는 문구에서 "저-단백질 식단 및/또는 질소 스캐빈저 약물" 부분은 저-단백질 식단 또는 질소 스캐빈저 약물 또는 이들의 조합, 즉 저-단백질 식단과 질소 스캐빈저 약물에 의해 치료된 개체에 대한 결과는 불량하다는 것을 나타낸다.
본 출원 전반에 걸쳐서, 용어 "포함하는"은 모든 구체적으로 언급된 특성뿐만 아니라 선택적 추가의 명시되지 않은 특성을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 사용되는, 용어 "포함하는"의 사용은 또한 구체적으로 언급된 특성 이외의 특성이 존재하지 않는 (즉 "구성되는") 구체예를 개시한다. 또한, 부정 관사 "a" 또는 "an"은 복수를 배제하지 않는다. 소정의 측정이 서로 상이한 종속항에서 인용된다는 사실은 이들 측정의 조합이 유리하게 사용될 수 없다는 것을 나타내는 것은 아니다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예를 참고로 보다 상세하게 기재될 것이다. 본원에서 인용된 모든 문헌 및 특허 문헌은 참고로 본원에 포함된다. 본 발명은 상기 상세한 설명에서 예시되고 기재되었지만, 실시예는 설명하거나 또는 예시하는 것으로 본 발명을 제한하는 것으로 간주되지 않는다.
서열의 간단한 설명
서열번호: 1은 NCBI 데이터베이스로부터 수탁번호 WP_004416214.1로 입수할 수 있는 미코플라스마 아르기니니 유래의 전장 아르기닌 데이미나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 1: 우레아에서 암모니아 질소의 전환에서 효소 (NAGS, CPS1, ASS1, ASL, ARG1, OTC) 및 수송체 (ORNT1 및 시트린)의 역할을 보여주는 우레아 사이클의 개략도이다.
도 2: ADI를 캡슐화하는 CFSE-표지된 적혈구의 약동학 (PK)을 나타내는 그래프이다. ERY-ADI 6 산물은 5 mg/ml의 ADI를 함유하는 현탁액의 용해-재봉합에 의해 수득되었다. 상기 산물의 형광 표지화 (CFSE)는 인 비보에서 적혈구를 추적할 수 있게 한다. 마우스 C57BL/6에게 정맥내로 주사되는 산물 (8 ml/kg)은 투여 후에 18 내지 22일로 추정되는 반감기를 갖는 우수한 안정성을 갖는다.
도 3: 16일에 걸쳐서 ADI를 캡슐화하는 적혈구의 약력학을 나타내는 그래프이다. 산물 ERY-ADI 6은 5 mg/ml의 ADI를 함유하는 현탁액의 용해-재봉합에 의해 수득되었다. 상기 산물을 C57BL/6 마우스에게 정맥내 (IV)로 투여하였다 (8 ml/kg). 혈장 L-아르기닌 수준은 HPLC-MS-MS로 측정하였다. 치료되지 않은 C57BL/6 마우스에서 L-아르기닌 수준은 75 내지 125 μM인 것으로 평가되었다. 산물 ERY-ADI 6은 투여 15분 후에 빠르게 고갈하여 13일 동안 L-아르기닌 수준을 0 μM로 감소시켰다. 16일차에, 3마리의 마우스 중 2마리는 완전한 혈장 L-아르기닌 고갈을 나타내었다. 세번째 마우스의 혈장 L-아르기닌은 13 μM이다. 16일차에 상기 마우스 그룹에 대한 평균 혈장 L-아르기닌 수준은 4.33 ± 7.51 μM이다.
도 4: 아르기나제-결핍 마우스에서 ADI를 캡슐화하는 적혈구의 단회 정맥내 투여 후에 혈중 L-아르기닌 수준을 나타내는 그래프이다. 산물 ERY-ADI 4는 4.5 mg/mL의 ADI를 함유하는 현탁액의 용해-재봉합에 의해 수득되었다. 대조군으로서, pRBC (Processed Red Blood Cells)로 명명한 산물은 ADI 효소 없이 용해-재봉합 과정에 의해 수득되었다 (모의-로딩된 적혈구). 0일차에, 상기 2개의 산물을 아르기나제-결핍 마우스에게 정맥내로 투여하였다 (ERY-ADI 4에 대해 4 또는 8 mL/kg 및 pRBC에 대해 8 mL/kg). 모든 마우스에 대해 0일차 (ERY-ADI 4 또는 pRBC 투여 전), 1일차 및 3일차에 혈액 시료채취를 수행하였다. ERY-ADI 4를 4 mL/kg으로 투여하는 경우, 혈중 L-아르기닌은 주사 후 1일차 및 3일차에 각각 60% 및 7% 만큼 낮아졌다. ERY-ADI 4의 2배 용량 부피로 투여하는 경우 (8 mL/kg), 병리학적 혈중 L-아르기닌 수준에 대한 ADI를 캡슐화하는 적혈구의 효능은 탁월하였고; 주사 다음날, L-아르기닌 수준은 상기 마우스 모델의 L-아르기닌 농도 기저선 (baseline)보다 10-배 더 낮았다 (35 ± 22 μM 대 452 ± 45 μM 92% 혈중 고갈에 해당). ERY-ADI 4 산물의 투여 3일 후에, 혈중 L-아르기닌 수준은 여전히 병리생화학적 (pathobiochemical) 수준보다 4배 더 낮았다 (119 ± 57 μM 대 452 ± 45 μM 73% 혈중 고갈에 해당). 그러나, 모의-로딩된 적혈구 (pRBC)가 투여되는 경우, 혈중 L-아르기닌 고갈은 관찰되지 않았다. 반대로, 혈중 L-아르기닌 수준은 여전히 증가하였고, 이는 모의-로딩된 적혈구는 상기 질환의 생화학적 과정에 영향을 주지 않음을 보여주었다.
도 5: 아르기나제-결핍 마우스에서 ADI를 캡슐화하는 적혈구의 단회 정맥내 투여 후에 혈청 암모니아 수준을 나타내는 그래프이다. 산물 ERY-ADI 4는 4.5 mg/mL의 ADI를 함유하는 현탁액의 용해-재봉합에 의해 수득되었다. 대조군으로서, pRBC (Processed Red Blood Cells)로 명명된 산물은 ADI 효소 없이 용해-재봉합 과정에 의해 수득되었다 (모의-로딩된 적혈구). 0일차에, 상기 2개의 산물을 아르기나제-결핍 마우스에게 정맥내로 투여하였다 (ERY-ADI 4에 대해 4 또는 8 mL/kg 및 pRBC에 대해 8 mL/kg). 혈청 암모니아를 분석하기 위해 모든 마우스에 대해 0일차 (ERY-ADI 4 또는 pRBC 투여 전) 및 3일차에 혈액 시료채취를 수행하였다. 혈청 암모니아는 ADI에 의한 L-아르기닌의 전환으로 시트룰린 및 암모니아의 생성을 초래할 때 분석하였다. ADI를 캡슐화하는 적혈구 또는 모의-로딩된 적혈구로 마우스를 치료한 경우에 암모니아 수준의 현저한 변화는 관찰되지 않았다.
도 6: 아르기나제-결핍 마우스에서 ERY-ADI 1회 (그룹 2), 2회 (그룹 3) 또는 유리 형태의 ADI 효소 (그룹 4)를 투여한 후에 혈중 L-아르기닌 수준을 나타내는 그래프이다.
도 7: 아르기나제-결핍 마우스에서 모의 RBC (그룹 1), ERY-ADI 1회 (그룹 2) 및 2회 (그룹 3)를 투여한 후에 혈중 L-아르기닌 수준을 나타내는 그래프이다.
도 2: ADI를 캡슐화하는 CFSE-표지된 적혈구의 약동학 (PK)을 나타내는 그래프이다. ERY-ADI 6 산물은 5 mg/ml의 ADI를 함유하는 현탁액의 용해-재봉합에 의해 수득되었다. 상기 산물의 형광 표지화 (CFSE)는 인 비보에서 적혈구를 추적할 수 있게 한다. 마우스 C57BL/6에게 정맥내로 주사되는 산물 (8 ml/kg)은 투여 후에 18 내지 22일로 추정되는 반감기를 갖는 우수한 안정성을 갖는다.
도 3: 16일에 걸쳐서 ADI를 캡슐화하는 적혈구의 약력학을 나타내는 그래프이다. 산물 ERY-ADI 6은 5 mg/ml의 ADI를 함유하는 현탁액의 용해-재봉합에 의해 수득되었다. 상기 산물을 C57BL/6 마우스에게 정맥내 (IV)로 투여하였다 (8 ml/kg). 혈장 L-아르기닌 수준은 HPLC-MS-MS로 측정하였다. 치료되지 않은 C57BL/6 마우스에서 L-아르기닌 수준은 75 내지 125 μM인 것으로 평가되었다. 산물 ERY-ADI 6은 투여 15분 후에 빠르게 고갈하여 13일 동안 L-아르기닌 수준을 0 μM로 감소시켰다. 16일차에, 3마리의 마우스 중 2마리는 완전한 혈장 L-아르기닌 고갈을 나타내었다. 세번째 마우스의 혈장 L-아르기닌은 13 μM이다. 16일차에 상기 마우스 그룹에 대한 평균 혈장 L-아르기닌 수준은 4.33 ± 7.51 μM이다.
도 4: 아르기나제-결핍 마우스에서 ADI를 캡슐화하는 적혈구의 단회 정맥내 투여 후에 혈중 L-아르기닌 수준을 나타내는 그래프이다. 산물 ERY-ADI 4는 4.5 mg/mL의 ADI를 함유하는 현탁액의 용해-재봉합에 의해 수득되었다. 대조군으로서, pRBC (Processed Red Blood Cells)로 명명한 산물은 ADI 효소 없이 용해-재봉합 과정에 의해 수득되었다 (모의-로딩된 적혈구). 0일차에, 상기 2개의 산물을 아르기나제-결핍 마우스에게 정맥내로 투여하였다 (ERY-ADI 4에 대해 4 또는 8 mL/kg 및 pRBC에 대해 8 mL/kg). 모든 마우스에 대해 0일차 (ERY-ADI 4 또는 pRBC 투여 전), 1일차 및 3일차에 혈액 시료채취를 수행하였다. ERY-ADI 4를 4 mL/kg으로 투여하는 경우, 혈중 L-아르기닌은 주사 후 1일차 및 3일차에 각각 60% 및 7% 만큼 낮아졌다. ERY-ADI 4의 2배 용량 부피로 투여하는 경우 (8 mL/kg), 병리학적 혈중 L-아르기닌 수준에 대한 ADI를 캡슐화하는 적혈구의 효능은 탁월하였고; 주사 다음날, L-아르기닌 수준은 상기 마우스 모델의 L-아르기닌 농도 기저선 (baseline)보다 10-배 더 낮았다 (35 ± 22 μM 대 452 ± 45 μM 92% 혈중 고갈에 해당). ERY-ADI 4 산물의 투여 3일 후에, 혈중 L-아르기닌 수준은 여전히 병리생화학적 (pathobiochemical) 수준보다 4배 더 낮았다 (119 ± 57 μM 대 452 ± 45 μM 73% 혈중 고갈에 해당). 그러나, 모의-로딩된 적혈구 (pRBC)가 투여되는 경우, 혈중 L-아르기닌 고갈은 관찰되지 않았다. 반대로, 혈중 L-아르기닌 수준은 여전히 증가하였고, 이는 모의-로딩된 적혈구는 상기 질환의 생화학적 과정에 영향을 주지 않음을 보여주었다.
도 5: 아르기나제-결핍 마우스에서 ADI를 캡슐화하는 적혈구의 단회 정맥내 투여 후에 혈청 암모니아 수준을 나타내는 그래프이다. 산물 ERY-ADI 4는 4.5 mg/mL의 ADI를 함유하는 현탁액의 용해-재봉합에 의해 수득되었다. 대조군으로서, pRBC (Processed Red Blood Cells)로 명명된 산물은 ADI 효소 없이 용해-재봉합 과정에 의해 수득되었다 (모의-로딩된 적혈구). 0일차에, 상기 2개의 산물을 아르기나제-결핍 마우스에게 정맥내로 투여하였다 (ERY-ADI 4에 대해 4 또는 8 mL/kg 및 pRBC에 대해 8 mL/kg). 혈청 암모니아를 분석하기 위해 모든 마우스에 대해 0일차 (ERY-ADI 4 또는 pRBC 투여 전) 및 3일차에 혈액 시료채취를 수행하였다. 혈청 암모니아는 ADI에 의한 L-아르기닌의 전환으로 시트룰린 및 암모니아의 생성을 초래할 때 분석하였다. ADI를 캡슐화하는 적혈구 또는 모의-로딩된 적혈구로 마우스를 치료한 경우에 암모니아 수준의 현저한 변화는 관찰되지 않았다.
도 6: 아르기나제-결핍 마우스에서 ERY-ADI 1회 (그룹 2), 2회 (그룹 3) 또는 유리 형태의 ADI 효소 (그룹 4)를 투여한 후에 혈중 L-아르기닌 수준을 나타내는 그래프이다.
도 7: 아르기나제-결핍 마우스에서 모의 RBC (그룹 1), ERY-ADI 1회 (그룹 2) 및 2회 (그룹 3)를 투여한 후에 혈중 L-아르기닌 수준을 나타내는 그래프이다.
실시예
실시예
1. 아르기닌
데이미나제
(
ADI
)를 수득 및 특성 규명하는 방법
균주 생산 및 과대-생산 클론의 단리: E. 콜리와 M. 아르기니니 사이에 유전자 코드가 상이하기 때문에 일부 코돈을 변형시켜서 미코플라스마 아르기니니 (GenBank: X54141) 유래의 ADI의 천연 서열을 최적화하였다 (C1124-ADM-02로 코딩된 새로운 플라스미드를 형성함). 정제 과정은 Misawa and coll (Misawa, S. et al, 1994, J. of Biotechno. 36, 1994, 145-155)에 기재된 것에 몇 가지를 수정하여 수행하였고, 즉 박테리아 생산 HMS174 (DE3) T1R 균주를 JM101 균주 대신에 사용하였다. 다른 수정은 하기에 기재되어 있다.
발효:
광학 밀도 0.05에서 사전-배양물 2의 제어된 압력 및 pH에서 교반하면서, FED_Coli_9 배치 배지를 갖는 발효기에서 생산을 수행하였다. 성장 단계 (37 ℃)는 광학 밀도 (600 nm)가 100이 될 때까지 수행하고, 발현 유도는 32℃에서 1 mM IPTG를 배양 배지에 부가하여 달성하였다. 세포 침전물은 2단계로 유도되고 26-27시간 후에 수확하였다: 세포 브로스 (cell broth)를 500 kDa 중공 파이버 (hollow fiber)를 통과시켜서 5-10배 농축시키고, 그 다음에 세포 펠렛을 15900 x g로 원심분리에 의해 회수하고, 그 다음에 -20℃로 저장하였다.
정제:
ADI를 봉입체 (inclusion bodies: IB)로 제조하였다. 세포 펠렛을 용해 버퍼에 현탁시켜서 세포를 파괴하였다. 그 다음에 파괴된 세포를 세척하여 IB를 수집하고, 상기 IB를 -20℃에서 저장하였다.
ADI의 정제는 50 mM TRIS 베이스 pH 8.5, 6M 구아니디늄 히드로클로라이드, 10 mM 디티오트레이톨로 이루어진 버퍼 중에 IB 펠렛를 해동시켜서 시작하였다. 37 ± 2 ℃에서 1시간의 인큐베이션 시간으로 가용화를 달성하였다. 정화 (clarification) 후에, 리폴딩 (refolding) 단계는 3 mM 모노포타슘 포스페이트 (KH2PO4), 7 mM 디포타슘 포스페이트 (K2HPO4) pH 7.35로 이루어진 버퍼 중에서 실온에서 40-45시간 동안 수행하였다. 제2 정화 단계 후에, 매질을 Q-세파로스 컬럼에 로딩하였다. 250 및 500 mM NaCl로 용출을 수행하고, 용출 분획물을 TFF (tangential flow filtration)에 부가하였다. 2회의 연마 (polishing) 단계 (Sartobind Q 컬럼 사용) 및 2회의 TFF 단계로 ADI의 정제를 완료하였다. 최종 0.2 μM 여과를 수행하고, ADI를 -20℃로 저장하였다.
특성 규명: 실시예 2에 기재된 바와 같이 생산된 시트룰린을 측정하여 상기 효소의 비활성을 결정하였다. 단백질 함량은 280 nM에서 흡광도를 판독하여 결정하였다. 순도는 SDS-PAGE로 결정하였다. 삼투질농도는 삼투압계 (Micro-Osmometer Loser Type 15)로 측정하였다. 하나의 제조된 ADI 배치의 주요 특성을 하기 표 2에 요약하였다.
| M. 아르기니니의 ADI | |
| 제제 | -80 ℃에서 동결된 액체상 특성: 323 mOsm/Kg - 16.65 mg/mL 50 mM 포스페이트 데 소듐 pH 6.5, 수크로스 40 mg/mL, 리신 40 mM |
| 비활성 | ~ 47 U/mg |
| 순도 | 97.5% |
실시예
2. 시트룰린 측정을 사용한
ADI
비활성 분석
본 분석은 2-단계 반응에 기반한다 (Boyde and Rahmatullah, 1980, Analytical Biochemistry, vol 107, p 424-431):
- 제1 단계, L-아르기닌을 ADI에 의해 시트룰린 및 암모니아로 전환시키는 단계;
- 제2 단계, 디아세틸 모녹심 (diacetyl monoxime), 철 (III) 클로라이드, 티오세미카르바지드, 황산 및 인산의 존재하에, 시트룰린을 530 nm에서 판독가능한 유색의 발색단으로 전환시키는 단계.
530 nm의 흡광도를 판독하여, 모든 분석 시료의 ADI 효소 활성을 결정하기 위해 L-시트룰린 표준 곡선을 준비하였다. 비활성 (U/mg)은 효소 활성 (U/mL) 및 단백질 함량 (mg)을 사용하여 산출하였다.
실시예
3.
뮤린
(
murine
) 적혈구에
ADI의
캡슐화
C57BL/6 마우스 (Charles River)의 전혈을 4℃에서 10분 동안 1000 x g로 원심분리하여 혈장과 백혈구 연층 (buffy coat)을 제거하였다. 적혈구를 0.9% NaCl (v:v)로 3회 세척하였다. 동결된 ADI를 해동시키고, 적혈구 현탁액에 부가하여 ADI의 초기 농도를 2 내지 7 mg/mL로 함유하는 적혈구용적률 65%의 최종 현탁액을 수득하였다.
그 다음에 상기 현탁액을 120 ml/h의 유속으로 혈액투석기 (hemodialyzer)에 로딩하고, 역류 (counter-current)로서 15 ml/분의 유속으로 저장성 용액 (40-50 mOsmol/kg)에 대해 투석하였다. 그 다음에 상기 현탁액을 고장성 용액 (1600 - 2100 mOsmol/kg)으로 재봉합하고, 그 다음에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 0.9% NaCl, 0.2% 글루코스에서 2회 세척 후에, 20% 분해된 (decomplemented) 혈장이 보충된 보존 용액 AS3에 현탁액을 넣었다.
수득된 산물을 시점 D0 (제조 후 2시간 이내) 및 시점 D1 (즉 2-8℃에서 ~18시간-24시간 저장 후에)에서 특성을 규명하였다. 혈액학적 특성은 수의학적 오토마톤 (veterinary automaton) (Sysmex, PocH-100iV)으로 수득하였다.
결과
:
최종 산물에서 ADI 활성은 수용액 중 ADI의 외부 검정 범위에 대해 실시예 4에 기재된 방법으로 분석하였다. 상기 결과는 최종 산물에서 ADI 활성이 RBC로 도입된 효소의 양에 의해 증가하고, 우수한 안정성을 유지하면서 최종 산물의 1 ml 당 ADI의 최대 2 mg을 용이하게 캡슐화할 수 있다는 것을 보여주었다. 6개의 상이한 ERY-ADI 뮤린 최종 산물 배치 (ERY-ADI-1 내지 6)의 주요 특성을 하기 표 3에 제공하였다.
| 배치 | ERY -ADI-1 | ERY -ADI-2 | ERY -ADI-3 | ERY -ADI-4 | ERY -ADI-5 | ERY - ADI -6 | |
| 혈액학적 파라미터 | 적혈구용적률 (%) | 51.1 | 51.1 | 50.8 | 51.3 | 51.1 | 51.3 |
| 혈구 부피 (fl) | 39.5 | 40.1 | 40.6 | 41.3 | 40.0 | 38.60 | |
| 혈구 헤모글로빈 (g/dl) | 26.6 | 26.3 | 25.3 | 26.7 | 28.2 | 25.7 | |
| 총 헤모글로빈 (g/dl) | 14.8 | 14.4 | 14.0 | 14.8 | 15.6 | 13.8 | |
| 세포외 Hb (g/dl) | 0.3 | 0.4 | 0.3 | 0.8 | 0.3 | 0.3 | |
| ADI 파라미터 | 처리 전에 ADI 농도 (mg/mL) | 3 | 4.5 | 4.5 | 4.5 | 3.5 | 5 |
| ADI의 적혈구내 농도 (RBC의 mg/ml - 100% Ht) | 1.15 | 1.56 | 1.90 | 1.13 | 1.37 | 2.70 | |
| 세포외 활성 (%) | 4.8 | 5.7 | 4.8 | 6 | 4.0 | 4.1 | |
| 세포내 활성 (%) | 95.2 | 94.3 | 95.2 | 94 | 96.0 | 95.9 | |
| ADI의 캡슐화 수율 (%) | 38 | 35 | 42 | 25 | 39 | 54 |
실시예
4. 적혈구에 캡슐화된
ADI의
분석
적혈구 세포 및 상등액에 포착된 ADI 활성 분석은 L-아르기닌으로부터 ADI에 의해 생성된 NH3의 측정에 기반한다. Roche Diagnostics가 시판하는 키트 (11877984)에 따라 글루타메이트 데히드로게나제 (GLDH)의 효소 작용에 의해 NH3 이온을 간접적으로 분석하였다.
실시예
5.
C57BL
/6 마우스에서
ADI를
캡슐화하는 적혈구의 약동학
뮤린 산물 ERY-ADI 6을 CFSE (형광제)로 표지하고, C57BL/6 마우스에게 정맥내로 투여하였다. 각 시점 (D0 + 15분, D0 + 6시간, D1, D2, D5, D9, D13 및 D16)에서, 3마리의 마우스를 희생시키고, 혈액을 리튬 헤파리네이트 튜브 (lithium heparinate tube)에 수집하고, 약동학을 결정하기 위해 빛을 차단하고 +4℃로 유지하였다. 전혈에서 CFSE로 표지된 적혈구 세포의 비율을 유세포 분석 방법에 의해 결정하였다. 5 마이크로리터의 전혈을 1ml의 PBS 0.5% BSA에서 희석시키고, 각 시료를 3회 통과시켰다 (FL-1에서 10,000개 세포 계수; cytometer FC500, Beckman Coulter). 상이한 시점에서 CFSE로 표지된 ADI가 로딩된 적혈구의 비율을 T0 + 15분에서 CFSE로 표지된 ADI가 로딩된 적혈구의 비율 (100% 대조군)에 부가하여 ADI가 로딩된 적혈구 세포의 생존 평가를 수득하였다. 각 시점에 대해 상이하게 수득된 퍼센트를 도 2에 도시된 그래프에 나타내어, 순환 대 시간에서 ADI가 로딩된 적혈구의 비율을 나타내었다.
반감기 순환에 기반하여, ADI를 캡슐화하는 CFSE-표지된 적혈구는 18일 내지 22일의 추정 반감기를 갖는다.
실시예
6.
C57BL
/6 마우스에서
ADI를
캡슐화하는 적혈구의
약력학
ADI 효소를 캡슐화하는 적혈구의 산물 ERY-ADI 6을 C57BL/6 마우스에게 8 ml/kg의 용량으로 정맥내로 주사하였다. 각 시점 (D0 + 15분, D0 + 6시간, D1, D2, D5, D9, D13 및 D16)에서, 3마리의 마우스를 희생시키고, 혈액을 리튬 헤파리네이트 튜브에 수집하고, 혈장 L-아르기닌 수준을 결정하기 위해 4℃로 저장하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 완전한 혈장 L-아르기닌 고갈은 ADI를 캡슐화하는 적혈구 투여 직후 (즉 15분) 13일 동안 관찰하였다. 연구 최종 시점 (즉 16일)에서, 3마리의 마우스 중 2마리는 여전히 완전한 혈장 L-아르기닌 고갈을 나타내었다. 세번째 마우스의 혈장 L-아르기닌 수준은 13 μM로, 본 연구에서 생리학적 혈장 L-아르기닌 농도 (100 ± 25 μM)보다 훨씬 낮았다.
실시예
7.
아르기나제
-결핍
마우스에게
ADI를
캡슐화하는 적혈구의 투여 (제1 연구)
아르기나제-결핍 마우스 모델로 인 비보 연구를 셋업하였다 (전체 설명은 Sin et al, 2013, PLOS One, vol. 8 (11) 참조). 이들 마우스는 아르기나제 1 활성이 없었고, 인간에서 통상적으로 볼 수 있는 과아르기닌혈증의 심각한 병리생화학적 양상을 나타내었다. 과아르기닌혈증 (또는 아르기나제 결핍)은 타목시펜 (tamoxifen)을 5회 주사하여 유발하였다. 혈중 아르기닌 농도는 최종 타목시펜을 주사하고 몇일 후에 상승하기 시작하였다. 상기 마우스 모델에서 혈중 L-아르기닌 수준을 감소시키는데 뮤린 산물 ERY-ADI 4의 효능을 입증하기 위해, ERY-ADI 4 (4 및 8 mL/kg) 및 모의-로딩된 적혈구 (8 mL/kg)를 최종 타목시펜을 주사하고 7일 후에 15마리의 아르기나제-결핍 마우스에게 정맥내로 주사하였다. 상기 3가지 산물의 투여 당일 (D1) 및 2일 후 (D3)에 혈액을 수집하였다. 인 비보 연구 결과를 하기 도 4 및 5 및 표 4에 나타내었다.
| 고갈 % (혈중 L-Arg) |
모의 로딩된 적혈구 (8mL/kg) | ERY-ADI 4 (4 mL/kg) |
ERY-ADI 4 (8 mL/kg) |
| D1 | -10% | 60% | 92% |
| D3 | -30% | 7% | 73% |
상기 표 및 도 4에 도시된 바와 같이, ADI를 캡슐화하는 적혈구를 4 mL/kg의 용량 부피로 투여하는 경우, 혈중 L-아르기닌이 주사 1일 후 및 3일 후에 각각 60% 및 7% 만큼 감소하였다. 2배 용량 부피 (8 mL/kg)로 투여하는 경우, 병리학적 혈중 L-아르기닌 수준에 대한 ADI를 캡슐화하는 적혈구의 효능은 탁월하였고; 주사 다음날, L-아르기닌 수준은 상기 마우스 모델의 L-아르기닌 농도 기저선 보다 10-배 더 낮았다 (35 ± 22 μM 대 452 ± 45 μM 92% 혈중 고갈에 해당). ERY-ADI 4 산물의 투여 3일 후에, 혈중 L-아르기닌 수준은 여전히 병리생화학적 수준보다 4배 더 낮았다 (119 ± 57 μM 대 452 ± 45 μM 73% 혈중 고갈에 해당). 그러나, 모의-로딩된 적혈구를 투여하는 경우, 혈중 L-아르기닌 고갈은 관찰되지 않았다. 반대로, 혈중 L-아르기닌 수준은 여전히 증가하였고, 이는 모의-로딩된 적혈구가 상기 질환의 생화학적 과정에 영향을 주지 않음을 나타내었다.
ADI에 의한 L-아르기닌의 전환으로 시트룰린 및 암모니아의 생성을 초래함과 동시에 혈청 암모니아를 분석하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 상기 마우스를 ADI를 캡슐화하는 적혈구 또는 모의-로딩된 적혈구로 치료하는 경우 암모니아 수준의 현저한 변화는 관찰되지 않았다.
실시예
8.
아르기나제
-결핍
마우스에게
ADI를
캡슐화하는 적혈구의 투여 (제2 연구)
상기 마우스 모델에서 혈중 L-아르기닌 수준을 감소시키는데 뮤린 산물 ERY-ADI의 효능을 확인하기 위해, 실시예 7에 따라 타목시펜으로 치료된 마우스에서 제2 연구를 셋업하였다. ERY-ADI 산물을 최종 타목시펜을 주사하고 3일 후에 정맥내로 주사하였다. ERY-ADI (8 mL/kg)의 1회 또는 2회 정맥내 투여(들)를 계획하였다 (각각 그룹 2 및 3). 대조군 그룹에게 유리 형태의 ADI 효소를 투여하였다 (그룹 4). 아르기나제 활성을 보유하는 마우스로 구성된 제2 대조군 그룹은 본 연구의 일부이다 (그룹 1).
당일 (D3) 및 1주일 후 (10일차)에 혈액을 수집하였다. 마우스 희생 당일에, 마우스 혈액을 수집하였다 (13일차).
제2 인 비보 연구의 결과를 도 6에 나타내었다.
먼저, 본 발명자는 타목시펜 주사와 관련된 주사 계획을 변경하였기 때문에 혈중 아르기닌 수준은 본 제2 연구에서 더 낮았다. 본 연구에서, ERY-ADI의 투여는 최종 타목시펜을 주사하고 7일 후 대신에 3일 후로 계획하여, 혈중 아르기닌 수준 기저선을 더 낮추었다.
도 6에 도시된 바와 같이, ADI를 캡슐화하는 적혈구를 8 mL/kg의 용량 부피로 투여하는 경우, 10일차에 (즉 투여 7일 후)에 그룹 2 및 3에 대해 기저선 수준과 비교하여 혈중 L-아르기닌은 각각 81% 및 77% 만큼 감소하였다. 10일차에 혈액 수집 후에 ERY-ADI의 제2 투여를 계획하였다. 투여 10일 후에, 혈중 아르기닌의 고갈은 여전히 기저선 수준과 비교하여 그룹 2 및 그룹 3에 대해 각각 82% 및 68%의 고갈 퍼센트로 매우 중요하다. 대조적으로, 10일차에 유리 형태의 ADI가 주사된 마우스 (그룹 4)에서 혈중 아르기닌 고갈은 관찰되지 않았다. 반대로, 혈중 아르기닌 농도는 349 μM의 농도에 도달하였고 아르기나제-결핍 마우스 모델에서 혈중 아르기닌 수준 증가를 반영한다. 유리 형태의 ADI로 제2 주사로 모든 동물이 사망하였기 때문에 그룹 4에 대해 13일차에 혈중 L-아르기닌 수준의 측정을 수행할 수 없었다.
상기 제2 연구는 ERY-ADI 산물을 아르기나제-결핍 마우스에게 투여하는 경우 이의 약력학에 대한 몇 가지 추가적 정보와 함께 상기 제1 연구로 관찰된 결과를 확인하였다. 한번의 단회 투여로 적어도 10일 동안 혈중 아르기닌의 고갈을 허용하고, ERY-ADI 산물의 제2 주사는 상기 마우스 모델에서 어떠한 부작용도 초래하지 않았다.
실시예
9.
아르기나제
-결핍
마우스에게
ADI를
캡슐화하는 적혈구의 투여 (제3 연구)
ERY-ADI 투여가 최종 타목시펜을 주사하고 3일 후에 수행되는 경우 생존이 관찰되지 않았기 때문에, 제3 연구는 시험 항목인 투여 계획에서 중요한 변경을 가지고 디자인하였다. ERY-ADI를 제1 타목시펜 주사 전날 (0일차) 정맥내로 주사하였다. 본 연구에서, 최종 타목시펜 주사는 5일차에 수행하였다. ERY-ADI의 1회 또는 2회 정맥내 투여(들)를 계획하였다 (각각 그룹 2 및 3). 그룹 1은 모의 RBC (즉 ADI를 갖지 않는 가공된 RBC)를 투여한 아르기나제-결핍 마우스로 구성된 대조군 그룹이다. 0일차, 11일차, 14일차 (ERY-ADI의 제2 투여 전)에 혈액을 수집하고, 마우스가 과도하게 체중이 손실되면 희생시켰다 ("연구 종료"로 확인).
도 7에 도시된 바와 같이, ADI를 캡슐화하는 적혈구를 8 mL/kg의 용량 부피로 투여하는 경우, 11일차 (즉 투여 후 11일차)에 그룹 2 및 3에 대해 그룹 1 수준과 비교하여 혈중 L-아르기닌이 각각 71.4% 및 78.7% 만큼 감소하였다. 14일차에, ERY-ADI의 제2 투여 전에 (그룹 3 단독에 대해), 전혈 아르기닌은 여전히 그룹 1과 비교하여, 그룹 2 및 3에 대해 각각 27.3% 및 29.3% 만큼 고갈되었다. 대조적으로, 모의 RBC를 주사한 마우스 (그룹 1)에서 전혈 아르기닌 고갈은 관찰되지 않았다. 상기 그룹에서, 전혈 아르기닌 농도는 연구 종료 시에 844 μM의 농도에 도달하였고 상기 아르기나제-결핍 마우스 모델에서 전혈 아르기닌 수준 증가를 반영하였다.
ERY-ADI를 14일차에 재주사하는 경우 (그룹 3), 전혈 아르기닌 수준을 윤리적 이유로 희생시키는 시점인 몇일 후에 측정하였다 ("연구 종료" 확인). 혈중 아르기닌은 ERY-ADI의 제2 투여 후에도 여전히 고갈되었지만, 아르기나제-결핍 마우스는 상당한 체중 손실로 인해 희생시켜야 한다.
본 제3 연구는 ERY-ADI 산물을 아르기나제-결핍 마우스에게 주사한 경우 이의 약력학에 대한 몇 가지 추가적 정보와 함께 제1의 2가지 연구로 관찰된 결과를 확인하였다. 단회 투여로 상기 마우스 모델에서 적어도 11일 동안 혈중 아르기닌 고갈을 산출하였고, ERY-ADI의 제2 주사로 적어도 17일 동안 혈중 아르기닌 고갈을 지속시켰다 (윤리적 이유로 희생된 제1 마우스의 수명).
그러나, 상기 마우스 모델의 심각성으로 인해, 수행된 ERY-ADI 투여 횟수에 관계없이, 최종 타목시펜을 주사하고 15일 이후에는 생존이 관찰되지 않았다.
실시예
10: 아르기닌
데이미나제를
캡슐화하는 인간 적혈구 세포의 생성
백혈구-고갈된 인간 RBC의 파우치 ("Etablissement francais du sang"에 의해 제공됨)를 0.9% NaCl로 3회 세척하였다. 아르기닌 데이미나제 (ADI) 용액을 부드럽게 해동시키고, RBC 현탁액에 부가하여 3 또는 5 mg/mL의 ADI를 함유하는 60%의 적혈구용적률을 갖는 최종 농도를 수득하였다. 현탁액을 균질화하고, 90 mL/h의 유속으로 혈액투석기에 로딩하고, 30 mOsmol/kg의 저장성 용액에 대해 투석하였다. 그 다음에 현탁액을 고장성 용액으로 재봉합하고, 그 다음에 30℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 0.9% NaCl, 0.2% 글루코스에서 3회 세척 후에, 현탁액을 보존 용액 AS3 (NaCl, NaH2PO4, 시트르산, Na-시트레이트, 아데닌 및 글루코스. 삼투질농도는 288 mOs/kg 및 pH 5.88임)에 넣었다. 수득된 산물을 0일차, 1일차 및 x일차에 특성을 규명하였다. 혈액학적 특성은 수의학적 오토매트 (veterinary automat) (Sysmex, PocH-100iV)로 수득하였다.
마그네슘, 철 및 다른 효소 보조인자를 개시된 RBC-캡슐화된 아르기닌 데이미나제 (ADI) 조성물 및 현탁액에 부가하지 않았다 (또는 부가될 필요가 없다)는 것에 주목하는 것이 중요하다. 대상체의 혈류에 존재하는 마그네슘 또는 다른 보조인자를 이용할 수 있는 비-캡슐화된 ADI 제제와는 달리, 본 개시내용의 ADI는 일반적으로 RBC의 함량으로 제한된다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 출원인은 마그네슘 또는 몇몇 다른 보조인자를 산물에 보충할 필요 없이, 장기간 인 비보 ADI 활성을 지속시키기 위해 출원인은 특별히 보조인자-비의존성 ADI (예: M. 아르기니니)를 선택하였다. 출원인은 다른 보조인자-비의존성 ADI가 개시된 발명의 실시에서 효과적으로 사용될 수 있다고 구상하였다.
본원에서 사용되는, "보조인자-비의존성 ADI"는 비타민, 프로비타민, 비타민 전구물질 또는 금속 이온 (예: 마그네슘, 철, 망간 등)과 같은 효소 보조인자에 의존하지 않는 ADI를 의미한다. 본원에서 사용되는, "마그네슘-비의존성 ADI"는 그의 효소 활성을 뒷받침하기 위해 마그네슘에 의존하지 않는 ADI를 의미한다.
결과. 0일차 (제조 당일)에 6개의 최종 산물의 혈액학적 및 생화학적 특성을 하기 표 5에 정리하였다: 3개는 3 mg/mL의 ADI 농도로 제조하고, 3개는 5 mg/mL의 ADI 농도로 제조하였고, 투석 전에 RBC 현탁액에 대해 나타내었다. 모든 ERY-ADI 산물을 동일한 ADI 배치로 제조하였다. 인 비트로 (In vitro) 안정성을 0일차, 1일차 (표 6) 및 7일차 (표 7)에 평가하였다.
| 0일차 파라미터 | ADI 3 mg/mL | ADI 5 mg/mL | |||||
| ERY-ADI I | ERY-ADI II | ERY-ADI III | ERY-ADI IV | ERY-ADI V | ERY-ADI VI | ||
| 혈액학적 데이터 | 적혈구용적률 (%) | 48.2 | 50.8 | 48.0 | 50.4 | 48.0 | 49.2 |
| 적혈구 부피 (fL) | 87.5 | 82.9 | 85.7 | 85.3 | 83.3 | 86.9 | |
| 적혈구 헤모글로빈 (g/dL) | 27.6 | 28.6 | 28.6 | 28.1 | 29.4 | 27.9 | |
| RBC 계수 (106/μL) | 5.52 | 6.12 | 5.60 | 5.92 | 5.78 | 5.66 | |
| 총 헤모글로빈 (g/dL) | 13.4 | 14.4 | 13.8 | 14.2 | 14.2 | 13.8 | |
| 세포외 Hb (g/dL) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | |
| ADI | ADI의 적혈구내 농도 (RBC의 mg/mL) | 0.88 | 0.94 | 1.01 | 1.55 | 1.36 | 1.46 |
| ADI의 적혈구내 활성 (U/mL) | 42.1 | 44.9 | 48.3 | 74.1 | 65.0 | 69.8 | |
| 세포외 활성 (%) | 1.2 | 0.0 | 3.0 | 0.6 | 0.8 | 4.0 | |
| 세포내 활성 (%) | 98.8 | 100.0 | 97.0 | 99.4 | 99.2 | 96.0 | |
| ADI의 포착 수율 (%) | 29.4 | 31.5 | 33.7 | 31.0 | 27.3 | 29.3 | |
포착 전에 부가된 ADI 농도와는 무관하게, 포착 수율은 매우 재현가능하다 (27.3 내지 33.7%).
| 1일차 파라미터 | ADI 3 mg/mL | ADI 5 mg/mL | |||||
| ERY-ADI I | ERY-ADI II | ERY-ADI III | ERY-ADI IV | ERY-ADI V | ERY-ADI VI | ||
| 혈액학적 데이터 | 적혈구용적률 (%) | 46.6 | 51.4 | 47.8 | 49.4 | 49.0 | 46.4 |
| 적혈구 부피 (fL) | 85.5 | 81.6 | 83.8 | 83.8 | 81.4 | 84.7 | |
| 적혈구 헤모글로빈 (g/dL) | 28.8 | 30.3 | 29.1 | 28.3 | 29.6 | 29.1 | |
| RBC 계수 (106/μL) | 5.46 | 6.28 | 5.70 | 5.90 | 6.02 | 5.48 | |
| 총 헤모글로빈 (g/dL) | 13.4 | 15.6 | 14.0 | 14.0 | 14.4 | 13.4 | |
| 세포외 Hb (g/dL) | 0.1 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | |
| ADI | ADI의 적혈구내 농도 (RBC의 mg/mL) | 0.89 | 0.83 | 1.00 | 1.50 | 1.22 | 1.86 |
| ADI의 적혈구내 활성 (U/mL) | 42.5 | 39.7 | 47.8 | 71.7 | 58.3 | 88.9 | |
| 세포외 활성 (%) | 1.3 | 1.1 | 6.0 | 1.3 | 1.7 | 5.1 | |
| 세포내 활성 (%) | 98.7 | 98.9 | 94.0 | 98.7 | 98.3 | 94.9 | |
| 7일차 파라미터 | ADI 3 mg/mL | ADI 5 mg/mL | |||||
| ERY-ADI I | ERY-ADI II | ERY-ADI III | ERY-ADI IV | ERY-ADI V | ERY-ADI VI | ||
| 혈액학적 데이터 | 적혈구용적률 (%) | 47.6 | 51.4 | 50.4 | 50.4 | 48.0 | 47.6 |
| 적혈구 부피 (fL) | 86.4 | 82.8 | 86.6 | 85.3 | 82.6 | 87.6 | |
| 적혈구 헤모글로빈 (g/dL) | 27.4 | 28.8 | 27.3 | 28.2 | 29.6 | 27.6 | |
| RBC 계수 (106/μL) | 5.52 | 6.22 | 5.82 | 5.90 | 5.82 | 5.44 | |
| 총 헤모글로빈 (g/dL) | 13.0 | 14.8 | 13.8 | 14.2 | 14.2 | 13.2 | |
| 세포외 Hb (g/dL) | 0.3 | 0.5 | 0.5 | 0.4 | 0.5 | 0.5 | |
| ADI | ADI의 적혈구내 농도 (RBC의 mg/mL) | 0.85 | 0.80 | 0.91 | 1.35 | 1.22 | 1.54 |
| ADI의 적혈구내 활성 (U/mL) | 40.6 | 38.2 | 43.5 | 64.5 | 58.3 | 73.6 | |
| 세포외 활성 (%) | 3.7 | 5.2 | 11.5 | 4.2 | 3.7 | 12.7 | |
| 세포내 활성 (%) | 96.3 | 94.9 | 88.5 | 95.8 | 96.3 | 87.3 | |
인간 적혈구 세포에서 아르기닌 데이미나제의 포착은 매우 재현가능한 과정인 것으로 입증되었다. 주요 파라미터는 0일차와 1일차 사이에서 안정하였다 (예: 세포외 헤모글로빈, 세포내 및 세포외 효소 활성, 적혈구용적률, 적혈구 부피). 7일차에, 측정된 파라미터는 ERY-ADI 산물이 포착 과정 전에 부가된 ADI 농도와는 무관하게 인 비트로에서 매우 안정하다는 것을 나타내었다.
결론. 적혈구 세포 (RBC)에 포착된 아르기닌 데이미나제 (ADI; EC 번호 3.5.3.6)를 Erytech's proprietary ERYCAPS® 기술 플랫폼을 사용하여 입수하였다. 치료 효소의 적혈구 세포로의 포착으로 독성이 감소된, 효과적이고 장기 지속되는 치료적 활성을 제공할 수 있다.
적혈구 세포 내부에 아르기닌 데이미나제 (ERY-ADI 산물)의 포착으로 효소의 약리학적 특성을 크게 향상시켰다. 건강한 마우스에서, 혈장 L-아르기닌 고갈은 투여 15분 이내에 완료되었고, 13일 동안 지속되었다.
아르기나제-결핍 마우스에게 주사하는 경우, ERY-ADI는 이들 마우스가 나타내는 매우 높은 혈중 L-아르기닌 농도에서 놀라운 효능을 나타내었다. 실제로, 투여하고 24시간 후에, 혈중 L-아르기닌 농도는 4 또는 8 mL/kg가 투여되는 경우 각각 52 및 92% 만큼 감소하였다. 투여 3일 후에, 혈중 L-아르기닌 수준은 19 및 73% 만큼 감소하였다. 더욱이, 아르기닌 데이미나제에 의한 암모니아의 생성에도 불구하고, 혈청 수준은 모의-로딩된 RBC 대조군과 유사한 수준을 유지하였다.
이러한 결과는 제2 연구에서 단회 투여로 적어도 10일 동안 혈중 아르기닌 고갈을 발휘하고, ERY-ADI의 제2 주사는 아르기나제-결핍 마우스에 의해 잘 허용된다는 것을 확인하였다.
아르기닌 데이미나제의 포착은 우수한 재현성과 인 비트로 안정성으로 인간 적혈구 세포에서 성공적으로 수행되었다.
이러한 결과에 기반하여, ERY-ADI는 아르기나제 결핍의 희귀 유전자 장애의 원발성 생화학적 결함에 대응할 수 있는 것으로 고려되었다.
본 발명은 하기 번호의 문단으로 기재될 것이다:
1. 아르기나제-1 결핍 치료에 사용하기 위한 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제 (ADI) 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물로서, 바람직하게 상기 조성물은 아르기나제 1 (Arg1) 결핍을 앓고 있는 환자 또는 대상에서 병리학적 혈장 또는 전혈 아르기닌 수준을 정상의 생리학적 또는 근정상 (near-normal)의 생리학적 혈장 또는 전혈 아르기닌 수준으로 감소시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 조성물의 단회 용량의 투여 후에 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10 또는 11일의 기간 동안 아르기닌의 병리학적 수준을 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70 또는 약 80% 만큼 감소시킬 수 있으며;
선택적으로 상기 ADI는 보조인자-비의존성, 마그네슘-비의존성, 철-비의존성, 비타민-비의존성, 프로비타민-비의존성 중 어느 하나, 이들의 임의의 조합, 또는 이들 모두이고;
선택적으로 상기 조성물은 하기에 지시된 파라미터에 대한 값의 범위 중 임의의 범위 또는 전부를 특징으로 하는 것인 약학적 조성물:
적혈구용적률 (%): 약 48 내지 약 51;
적혈구 부피 (fL): 약 82 내지 약 88;
적혈구 헤모글로빈 (g/dL): 약 27 내지 약 30;
RBC 계수 (106/μL): 약 5.5 내지 약 6.2;
총 헤모글로빈 (g/dL): 약 13.0 내지 약 14.5;
세포외 Hb (g/dL): 약 0.1 내지 약 0.2;
ADI의 적혈구내 농도 (RBC의 mg/mL): 약 0.8 내지 약 1.6;
ADI의 적혈구내 활성 (U/mL): 약 42 내지 약 49 또는 약 65 내지 약 74;
세포외 활성 (%): 약 0.0 내지 약 4.0;
세포내 활성 (%): 약 96 내지 약 100; 및/또는
ADI의 포착 수율 (%): 약 27 내지 약 34.
2. 문단 1에 있어서, 상기 조성물은 270 내지 350 mOsm/l의 삼투질농도를 갖는 현탁액인 것인 약학적 조성물.
3. 문단 1 또는 2에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 부형제는 NaCl 및 아데닌을 포함하는 보존 용액인 것인 약학적 조성물.
4. 문단 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 ADI는 M. 아르기니니 유래인 것인 약학적 조성물.
5. 문단 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 ADI는 서열번호: 1의 아미노산 서열 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 것인 약학적 조성물.
6. 문단 5에 있어서, 상기 변이체는 서열번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 약학적 조성물.
7. 문단 5 또는 6에 있어서, 상기 변이체 또는 단편은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 ADI의 생물학적 활성을 보유하는 것인 약학적 조성물.
8. 문단 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 캡슐화된 ADI의 농도는 0.1 내지 7 mg/ml인 것인 약학적 조성물.
9. 문단 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 약학적 조성물은 10 내지 250ml의 부피를 갖는 용량으로 패키지되는 것인 약학적 조성물.
10. 문단 9에 있어서, 환자를 위한 1회 용량의 캡슐화된 ADI의 양은 상기 환자의 체중 1 kg당 캡슐화된 ADI 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg인 것인 약학적 조성물.
11. M. 아르기니니 유래의 ADI를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액.
12. 문단 11에 있어서, 상기 ADI는 서열번호: 1의 아미노산 서열 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 것인 현탁액.
13. 문단 12에 있어서, 상기 변이체는 서열번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 현탁액.
14. 아르기나제-1 결핍 또는 아르기닌-의존성 암 치료, 패혈 쇼크의 치료 또는 예방, 혈관형성 억제 및 혈관형성 관련 질환 치료에 사용하기 위한, 문단 11 내지 13 중 어느 하나에 따른 현탁액을 포함하는 약학적 조성물.
15. 문단 1 내지 14 중 어느 하나의 조성물 또는 현탁액을 이를 필요로 하는 환자 또는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 아르기나제-1 결핍 또는 아르기닌-의존성 암 치료, 패혈 쇼크의 치료 또는 예방, 혈관형성 억제 및 혈관형성 관련 질환을 치료하는 방법.
16. 문단 1 내지 14 중 어느 하나의 조성물 또는 현탁액의 1회 초과의 용량을 투여하는 단계를 포함하는, 병리학적 혈장 아르기닌 수준으로부터 만성적으로 고통받고 있는 환자 또는 대상에서 병리학적 혈장 아르기닌 수준을 정상 생리학적 혈장 아르기닌 수준으로 감소시키는 방법.
17. 문단 16에 있어서, 상기 병리학적 혈장 아르기닌 수준은 약 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590 또는 600 μM 과량인 것인 방법.
18. 문단 16 또는 17에 있어서, 상기 환자 또는 대상은 알려져 있는 Arg1 돌연변이를 갖거나 또는 약 5% 미만의 아르기나제 활성을 나타내거나 또는 실질적으로 아르기나제 활성을 나타내지 않는 것인 방법.
19. 문단 16 또는 17에 있어서, 상기 병리학적 혈장 아르기닌 수준은 병리학적 혈장 아르기닌 수준으로 고통받고 있지 않은 건강한 대상체보다 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 배수로 더 높은 것인 방법.
20. 문단 16 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 또는 현탁액의 1회 용량은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주 동안 비-병리학적, 정상 생리학적 혈장 아르기닌 수준을 유지하는데 충분한 것인 방법.
21. 문단 16 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 또는 현탁액은 생리학적 혈장 아르기닌 수준을 유지하기 위해서 2주마다 1회 또는 4주마다 1회로 투여되어야 하는 것인 방법.
본 발명은 하기 비-제한적인 청구범위에 기재될 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> ERYTECH PHARMA
<120> Arginine deiminase encapsulated inside erythrocytes and their use
in treating Cancer and Arginase-1 Deficiency
<130> BET 17L3041
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 410
<212> PRT
<213> Mycoplasma arginini
<400> 1
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Lys Gln Phe Val Ala Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Asn Asp Ile Asn Val Val Glu Leu Ile Asp Leu Val Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Lys Asp Lys Leu Ile Glu
85 90 95
Glu Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Glu His Lys Val
100 105 110
Val Val Arg Asn Phe Leu Lys Ala Lys Lys Thr Ser Arg Glu Leu Val
115 120 125
Glu Ile Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Ala
130 135 140
Asp His Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg
145 150 155 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg
165 170 175
Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Val Phe Ser
180 185 190
Asn His Pro Lys Leu Ile Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu
195 200 205
Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr
210 215 220
Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gln Thr Val Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn Ile Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile
245 250 255
Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr
260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala
275 280 285
Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala
290 295 300
Glu Pro Gln Pro Val Glu Asn Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu Leu Gln
305 310 315 320
Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Val Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Gly
325 330 335
Ala Ser Gln Met Glu Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350
Tyr Leu Ala Ile Arg Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg Asn Glu
355 360 365
Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe
370 375 380
His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser
385 390 395 400
Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405 410
Claims (14)
- 아르기나제-1 결핍 (arginase-1 deficiency) 치료에 사용하기 위한, 적혈구에 캡슐화된 아르기닌 데이미나제 (arginine deiminase) 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 270 내지 350 mOsm/l의 삼투질농도 (osmolarity)를 갖는 현탁액인 것인 약학적 조성물.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 부형제는 NaCl 및 아데닌을 포함하는 보존 용액인 것인 약학적 조성물.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제는 M. 아르기니니 (M. arginini)로부터 유래되는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제는 서열번호: 1의 아미노산 서열 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 변이체는 서열번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 변이체 또는 단편은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 아르기닌 데이미나제의 생물학적 활성을 보유하는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캡슐화된 아르기닌 데이미나제의 농도는 0.1 내지 7 mg/ml인 것인 약학적 조성물.
- 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 10 내지 250ml의 부피를 갖는 용량으로 패키지되는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 9에 있어서, 환자를 위한 1회 용량의 캡슐화된 아르기닌 데이미나제의 양은 상기 환자의 체중 1 kg 당 캡슐화된 아르기닌 데이미나제 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg인 것인 약학적 조성물.
- M. 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액.
- 청구항 11에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제는 서열번호: 1의 아미노산 서열 또는 그의 변이체 또는 단편을 포함하는 것인 현탁액.
- 청구항 12에 있어서, 상기 변이체는 서열번호: 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 현탁액.
- 아르기나제-1 결핍 또는 아르기닌-의존성 암 치료, 패혈 쇼크 (septic shock)의 치료 또는 예방, 혈관형성 (angiogenesis) 억제 및 혈관형성 관련 질환 치료에 사용하기 위한, 청구항 11 내지 13 중 어느 한 항에 따른 현탁액을 포함하는 약학적 조성물.
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