KR20040094677A - 코넥신 헤미채널 조절을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

세포,조직 또는 조직 내에서의 헤미채널 기능을 조절하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 본 발명은 또한 그러한 화합물, 특히 코넥신인산화을 가능하게 하는 것들을 탐지하기 위한 유용한 스크린에 관한 것이다. 추가로 심장 부정맥과 같은 포유동물에서의 원치않는 헤미채널 기능에 의해 영향을 받는 증상을 예방 또는 치료하기 위한 치료학적 방법을 제공한다.

Description

코넥신 헤미채널 조절을 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods for modulating connexin hemichannels}

간극 연접(gap jungctions)은 세포가 그들의 환경과 의사소통하는 것을 돕는 중요한 원형질막 구조라고 인지되어 있다. 예를 들어 대부분 간극 연접은 상호연결된 세포간의 소분자 및 이온의 통과를 돕는 것으로 여겨진다. 그러한 이동은 세포 생리학의 많은 측면에 깊은 영향을 미치는 것으로 믿어지고 있다. 인접한 세포의 원형질막은 간극 연접을 형성하는 것을 돕는 소위 "코넥신"이라고 불리는 다중 결합의 단백질에 의해 형성된 헤미채널, "코넥손"을 포함하는 것으로 믿어지고 있다. 또한, 헤미채널은 세포의 세포질과 원형질막주위 또는 세포외 공간 사이의 소분자량 화합물의 교환에 있어서 독립적인 역할을 한다. 일반적으로 Bennett, M. 등 (1991) Neuron 6:305 ; Kumar, N. 및 Gilula, N. B. (1996) Cell 84 :381 ; 및 Quist, A. P 등 (2000) J. Cell Biol. 148: 1063 및 거기에서 인용된 참고문헌 참조.

특히, 많은 간극 연접은 고밀집된 채널 집단을 갖는 세포막의 특별화된 지역이라는 것이 보고된 바 있다. 그러한 간극 연접 채널은 두 개의 이웃한 세포의 세포질성 구획을 직접적으로 연결하는 것으로 생각되어지고 있다.

간극 연접 채널은 두 개의 이웃한 세포 각각에 의해 제공된 두 개의 헤미채널 (코넥손)로 구성되어 있는 것으로 인식된다. 각각의 코넥손 (헤미채널)은 코넥신이라고 불리는 6개의 단백질로 구성된 것으로 개시된 바 있다. 각각의 코넥신은 4개의 막관통 도메인, 2개의 세포외 루프, 및 하나의 세포질성 루프를 갖는 것으로 생각된다. 전기적 충격의 전도는 간극 연접을 통해 일어나며, 이로써 정상적인 심전도 및 리듬을 용이하게 하는 것으로 생각된다. 일반적으로 P. A. Guerrero, R. B. 등 J Clifa Invest 1997, 99 1991 ; D. L. Lerner, K. A. 등, Circulation 1999, 99 1508 ; S. Kirchhoff, E. 등 CurrBiol 1998, 8 295 참조.

대부분의 심장 코넥신의 분포는 기관에 걸쳐 유의적으로 변화하는 것으로 여겨진다. Cx40이 심방(atrias) 및 전도 시스템에서 가장 많은 이소폼인 반면, Cx43이소폼은 주요한 심실의 형태라고 알려져 있다.

코넥신의 비정상 및 심장 질환 간의 강한 연관에 대한 보고가 있다. A. C. deCarvalho, 등, J Cardiovasc Electrophysiol 1994, 5 686; R. R. Kaprielian, 등, Circulation 1998,97 651; N. S. Peters, 등, Circulation 1993,88 864; 및 J. E. Saffitz, R. B.등 , Cardiovasc Res 1999,42 309 참조.

간극 연접의 비정상적 발현, 분포 및 조절이 부정맥에 포함되는 것으로 이해되고 있다. Larsen, B. 등에 의해 PCT/DK01/00127(WO01/62775)에서 개시된 항부정맥성 펩티드가 척추동물 조직에서의 간극 연접 세포간 의사소통(GJIC)을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다.

특히 코넥신(Cx) 유전자 패밀리에 의해 코딩된 특정 포유동물의 간극 연접 단백질이 보고된 바 있다. Bruzzone, R. 등 (1996) Eur.J Biochem.238 :1 참조. Cx 패밀리는 Cx26, 30, 31, 32, 37, 40, 43, 45, 46 및 50를 포함한다. 간극 연접 채널은 또한 무척추동물에서도 발견되며, 여기서 단백질을 형성하는 채널은 "이넥신"이라고 불린다.

Cx26 단백질에 대한 것을 제외하곤 대부분의 코넥신은 인산화될 수 있는 것으로 이해된다. Cx43 단백질은 조직 내에서 넓게 발현된다. Cx43 단백질의 인산화는 간극 연접 세포간 의사소통 (GJIC)에 영향을 미친다는 보고가 있다. 예를 들어, Cx43 전환(turn over), 트래피킹(trafficking), 인산화 및 게이팅(gating)이 인산화에 의해 강한 영향을 받는 것으로 알려져있다. Darrow, B. J. , 등 (1995). Circ Res 76: 381 참조.

예를 들어, Saffitz 및 동료들은 전도성 측정을 이용하여 허혈 동안 15분 내에 코넥신 세린 탈인산화에 있어서 증가가 있음을 보인 바 있다. 도 1 (수개의 동정된 인산화 위치를 가진 포유동물 Cx43 막관통 단백질을 보여줌)을 참조.

코넥신의 인산화 및 용해성은 연구 관심을 끌어왔다. 특히, Cx43은 래트 젖샘의 근육상피세포에서 인산화되어 있는 것으로 발견되었다. Wang, Y. , 등 (1995). JBiol Chem 270,26581 ; 및 Yamanaka, I. , 등 (1997) Eur J Cell Biol 72 : 166 참조.

언급했듯이, 간극 연접 채널은 이웃한 세포들의 세포질을 연결하는 특수화된 구멍으로 생각된다. 헤미채널은 세포외 환경과 의사소통을 한다. 심장 세포의 대사적 저해는 코넥신헤미채널에 의해 구성될 수 있는 유입경로를 활성화시킬 수 있는 것으로 보고된 바 있다. 대사적 저해는 헤미채널을 열고, 칼륨의 손실을 향상시키고, 양자, 소듐 및 칼슘의 유입을 유도함으로써 심장조직을 손상시키는 것으로 생각된다. Kondo 등 J. MoI. Cell. Cardiol. 32: 1859-72,2000 ; Li 등 J. Mol. Cell. Cardiol. 33: 2145-55,2001) 참조.

급성 심근 허혈 동안 간극 연접에서의 전기적 연합해제(electrical uncoupling)는 전도 비정상 및 재진입 부정맥에 기여하는 것으로 여겨진다. 허혈 동안의 세포내 Ca²⁺및 H⁺의 증가된 수준 및 양극성 지질 대사체의 축적은 연합해제를 증진시킨다. 다른 메커니즘들도 역할을 할 수 있다. 예를 들면, 급성 허혈에 의해 유도된 연합해제는 코넥신43 (Cx43)의 인산화에서의 변화와 관련됨이 보고된 바 있다. 급성 허혈 동안의 심근의 연합해제 및 부정맥야기에 있어서 중요한 역할을 하는 빠른, 가역적 Cx43 탈인산화와 일치하는 결과가 보고된 바 있다. Beardslee MA 등, Circ Res. 2000; 87 : 656 및 거기에서 인용된 참고문헌 참조.

헤미채널의 구조 및 기능은 관심을 끌고 있다.

예를 들어, 원자간력현미경(AFM), 형광 염료 흡수 분석 및 레이저 공초점 면역형광 이미지법은 헤미채널이 세포 부피의 세포외 칼슘-의존성 조절에 포함되는 것을 제시한 바 있다. 보고된 바 대로, 세포 부피 변화는 코넥신43이 발현되었는지 아닌지에 의존적이다. 변화는 간극 연접 차단제(예로써, 올레아미드 및 베타-글리시르헤틴산(beta-glycyrrhetinic acid))에 의해 방해되거나, 또는 세포외 칼슘의 정상으로의 회복에 의해 역전되는 것으로 보고되었다. 비간극-연접(nongap-junctional) 헤미채널이 다른 방식의 등삼투압 상황에서 세포외 생리학적 칼슘에서의 변화에 반응하여 세포 부피를 조절하는것이 제시되었다. Quist, A. P. 등, supra 참조.

특히 허혈 또는 대사성 스트레스 동안, 열린 헤미채널이 Ca²⁺, 양자의 세포적 흡수 및 세포 종창, 세포 손상 또는 세포자멸을 야기하는, 세포에서의 양극성 지질 대사체의 축적을 이끌 수 있다는 것이 제시된 바 있다. Beardslee 등, supra 및 Quist 등 supra 참조.

Cx43가 Tyr247 (Y247), Tyr265 (Y265) 및 아마도 기타 위치에서 활성화된 Src 단백질에 의해 생체 내에서 인산화된다는 것이 보고된 바 있다. 중요하게는, 간극 연접 세포간 의사소통 (GJIC)이 v-Src에 의해 매개된 인산화에 의한 중단에 저항됨이 보고되었다. Cx43의 Y247 및 Y265 상에서의 인산화가 중요하다는 것이 알려졌다. Lin R, 등 (2001) J Cell Biol 154 (4): 815 참조. 또한 도 1 참조.

또한, 다양한 GJIC 조절 화합물을 개시하고 있는 2002년 2월 22일 출판된 PCT/US02/05773 (WO 02/077017)로서 "세포간 의사소통을 촉진하는 화합물의 새로운 의학적 용도"라는 제목의 Larsen, B. D 등의 PCT 출원 참조.

헤미채널 기능을 조절하는 화합물을 갖는 것이 필요할 것이다. 바람직한 화합물은 헤미채널의 개방 또는 폐쇄를 도울 것이다. 그러한 화합물을 동정하는 분자적 스크린(molecular screens)을 갖는 것이 특히 필요할 것이다.

관련 출원의 상호참조

본 출원은 참고문헌으로서 여기에 포함된 2002년 1월 29일 출원된 미합중국 가출원 제 60/352,717호의 우선권을 주장하고 있다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 코넥신 헤미채널을 조절하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 화합물을 검출하는데 유용한 스크린에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명은 일반적으로 헤미채널 기능을 조절하는 것 같은 것을 이용하는 화합물 및 방법을 특징으로 한다. 특정 화합물은 헤미채널 인산화를 조절한다. 본 발명의 추가적 화합물은 헤미채널 기능을 조절하며, 일부 예에서는 또한 예컨대, 간극 연접 채널을 열거나 닫음으로써, 간극 연접 의사소통 (GJIC)에 영향을 미친다. 그러한 화합물의 검출 및 특징화를 위한 유용한 스크린이 또한 제공된다. 본 발명은 부적합한 헤미채널 기능에 의해 조절되는 다양한 증상을 치료 또는 예방하기 위한 치료법을 제공하는 것을 포함하는 많은 유용한 적용을 갖는다.

헤미채널 기능을 조절(증가 또는 감소)하는 화합물을 동정하는 것이 시급히 필요하다. "헤미채널 기능"이라 함은 헤미채널을 통한 분자 또는 이온의 통과를 증진 또는 감소시키기 위한 코넥신헤미채널의 개방 또는 폐쇄를 의미한다. "간극 연접 기능"이란 간극 연접을 통한 분자 또는 이온의 통과를 증가 또는 감소시키기 위한 간극 연접의 개방 또는 폐쇄를 의미한다. 바람직한 본 발명의 화합물은 헤미채널 인산화를 조절하며, 일반적으로 또한 헤미채널의 개방 또는 폐쇄를 돕는다. 헤미채널 기능 및 간극 연접 기능은 여기서 개시된 하나 이상의 표준 분석에 의해 쉽게 탐지되고 임의로 정량될 수 있다.

보다 특별한 헤미채널 조절 화합물은 인지된 코넥신의 인산화를 조절한다(증가 또는 감소). 인산화 또는 탈인산화의 바람직한 부위는 코넥신 상의 하나 이상의 티로신, 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함한다. 아래에서 논의될 것 처럼, 하나 이상의 이들 잔기 상에서의 인산화의 조절은 특히 헤미채널을 열고 닫음으로써, 헤미채널 기능에 강한 영향을 미친다는 것이 발견되었다. 따라서, 아래에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 목적은 헤미채널 기능을 조절하는 능력을 지닌 화합물을 검출하고 임의로 특징화시킴으로써 코넥신의 인산화 상태를 관찰하는데 적합한 스크린을 제공하는 것이다.

예를 들어, 본 발명에 따른 특정 화합물은 코넥신의 적어도 하나의 티로신 잔기를 인산화할 수 있다. 이 구체예에서, 코넥신의 인산화는 헤미채널을 닫는 것을 도울 것이다. 다른 적합한 헤미채널 조절 화합물은 코넥신의 적어도 하나의 세린 잔기에서 인산화를 감소시킨다 (탈인산화시킴). 이 예에서, 세린의 탈인산화는 헤미채널을 여는 것을 도울 것이다. 본 발명의 범위 내의 또다른 화합물은 코넥신의 적어도 하나의 트레오닌 잔기의 인산화를 향상시켜, 전형적으로 헤미채널의 폐쇄를 돕는다. 추가적으로 적합한 본 발명의 화합물은: 코넥신의 세린 인산화에서의 증가 또는 감소, 티로신 인산화에서의 증가 또는 감소, 및 트레오닌 인산화에서의 증가 또는 감소 중 적어도 하나를 용이하게 한다. 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산의 수정이 헤미채널의 탐지가능한 개방 또는 폐쇄에 있어서 도움을 줄 것이다.

따라서, 그리고 한 측면에서, 본 발명은 바람직하게는 헤미채널을 닫음으로써, 헤미채널의 기능을 조절하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 그 방법은 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II로서 아래에 표현된 적어도 하나의 화합물로, 스트레스 받은 세포, 조직 또는 기관을 접촉시키는 것을 포함하는, 바람직하게는 스트레스에 노출된, 세포, 조직 또는 기관에서 헤미채널을 닫는 것을 포함한다. 이 방법 구체예에 따른 바람직한 접촉은 적합한 대조군에 비하여, 스트레스에 노출 전, 동안, 또는 후의 헤미채널의 폐쇄에 충분한 것이다. 그러한 스트레스의 예는 아래에 설명된 바와 같은 하나 이상의 대사 저해, 산소 결핍, pH 저하, 또는 세포외 칼륨 이온의 증가를 포함한다.

보다 구체적인 예에서, 그 방법은 추가로 인지된 코넥신, 바람직하게는 코넥신43 (Cx 43)의 인산화를 관찰하는 것을 포함한다. 일반적으로, 그 방법은 적어도 하나의 티로신, 세린, 및 트레오닌 잔기 상에서 Cx43 인산화의 임의의 증가 또는 감소, 바람직하게는 적어도 하나의 티로신 및 트레오닌에서의 인산화의 증가를 탐지 및 보고할 수 있을 것이다. 이 구체예에서, 그 방법은 또한 헤미채널의 폐쇄 및, 임의적으로는 적합한 대조군에 비한 간극 연접 채널의 개방 또는 폐쇄를 포함한다.

본 발명은 헤미채널 기능을 조절하는 다른 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 그 방법은 인지된 코넥신, 바람직하게는 Cx43의 인산화를 관찰하여, 적어도 하나의 티로신, 세린 및 트레오닌 잔기 상에서의 Cx43 인산화에서의 임의의 증가 또는 감소, 바람직하게는 대조군에 비하여 세린과 같은 하나 이상의 이들 잔기의 인산화에서의 감소를 탐지하는 것을 포함한다. 이 발명 실시예에서, 본 방법은 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II로 아래에서 표현된 적어도 하나의 화합물로 스트레스 받은 세포, 조직 또는 기관을 접촉시키는 것을 포함하는, 스트레스에 노출된 세포, 조직 또는 기관에서 헤미채널을 여는 것을 포함한다. 바람직한 접촉은 헤미채널을 여는데 충분한, 임의적으로는 적합한 대조군에 비하여 간극 연접 채널을 열거나 닫는데 충분한 것이다.

그러한 헤미채널 조절 화합물을 보다 특이적으로 탐지하고 특징화시키는 스크린이 필요하다. 그러한 스크린을 갖는 것은 예를 들어, 대조군 화합물보다 적어도 5% 이상에 의해, 헤미채널의 폐쇄를 돕는 능력을 탐지하는 대조군과 비교하여 후보 화합물을 시험관 내에서 테스트함으로써, 새로운 헤미채널 조절 화합물의 범위를 동정하고 특징화하는 것에 대한 중요한 첫단계가 될 수 있다. 화학식 I 또는 II로 아래에 표현된 화합물을 포함하여, 그러한 스크린에 의해 동정된 화합물은 예를 들어, 세포외 환경에의 세포 성분의 손실을 예방, 감소, 보호함으로써, 세포, 조직 및 기관 항상성을 증진시키는 요법에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 헤미채널 기능을 조절하는 능력을 가진 후보 화합물을 스크리닝 하기 위한 특이적인 시험관 내 방법을 제공한다. 일반적으로, 본 방법은 화학식 I 또는 II로 아래에 표현된 적어도 하나의 화합물로 적합한 세포, 조직 또는 기관을 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본 접촉은 인지된 코넥신, 바람직하게는 코넥신43 (Cx43)의 인산화의 조절 및 적합한 대조군에 비한 Cx43 인산화에서의 변화 탐지에 도움이 되는 조건 하에 있다. 또한 바람직하게는, 인산화에서의 변화는 헤미채널 조절 화합물을 표시하는 것으로 여겨진다. 임의로, 스크리닝 방법에 의해 검출된 그러한 화합물은 여기에 개시된 분석에 따라 간극 연접 채널을 열거나 닫을 수 있다.

앞선 방법 각각에서, 본 발명에 따른 바람직한 인산화 변화는 대개 세포내 코넥신의 C-말단에서 또는 근처에서 발생한다. Cx43의 인산화 및 탈인산화의 보다 바람직한 부위는 도 1에서 보여진다. "코넥신의 C-말단"이라 함은 도 1에서 보여지는대로 대략 아미노산 잔기 240 내지 281을 묶은 지역을 의미한다.

코넥신인산화를 탐지하기 위한 본 발명의 특정한 시험관 내 스크리닝 분석은 헤미채널 기능, 간극 연접 기능 (또는 둘다)을 관찰하기 위해 설계된 하나 이상의 단계를 포함한다. 그러한 분석은 일반적으로 하기 단계 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 포함한다:

1) 심장 또는 근육으로부터 유도된 것과 같은 세포, 조직 또는 기관의 집단의 배양,

2) 바람직하게는 산소 결핍 또는 대사 저해에 의해 세포, 조직 또는 기관에 스트레스 주기,

3) 알려진 또는 아래의 화학식 I 또는 II에 의해 표현된 것과 같은 후보 헤미채널 조절 화합물의 첨가

4) 적합한 대조군과 비교하여 코넥신 인산화 (바람직하게는 Cx 43)에서의 변화를 탐지; 그리고

5) 헤미채널 기능 및 임의로 간극 연접 기능을 조절하는 화합물을 표시하는 것으로서 변화를 임의로 측정.

이 분석은 바람직한 Cx43 단백질의 적어도 하나의 세린, 티로신 및 트레오닌 잔기의 인산화를 증가 또는 감소시키는 헤미채널 조절 화합물의 능력을 효과적으로 측정할 수 있다. "표준 시험관내 코넥신인산화 분석" 또는 관련구에의 여기에서의 참고문헌은 단계 1)에서 5)에 걸친 상기 실험과정을 언급하고 있다. 분석은 심장 또는 근육으로부터 유도된 것과 같은 일차, 이차, 또는 무한증식세포의 매우 임의의 집단으로 수행될 수 있다.

앞선 표준 시험관 내 분석은 일반적으로 유동적이다. 예를 들어, 단계 1) -5)는 스크리닝 결과가 성취되도록 계획되어 제공된 매우 임의의 순서로 수행될 수 있다. 따라서, 분석의 한 구체예에서, 후보 화합물은 단계 2)의 후 대신 단계 1), 단계 2) (또는 두 단계 모두)에서 첨가될 수 있다.

본 발명은 헤미채널 기능을 조절하는 능력에 대한 후보 화합물을 스크리닝 하기 위한 다른 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 방법은 화학식 I 또는 II로 아래에서 표현된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물로 적합한 세포, 조직 또는 기관을 접촉시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 세포, 조직 또는 기관에 의한 탐지가능한 리포터(report)의 임의의 흡수는 화합물 존재 하에서 그리고 적합한 대조군과의 비교하여 관찰된다. 바람직한 탐지가능한 리포터들은 열린 헤미채널을 통한 통과에 도움이 되는 분자 크기를 갖는다. 따라서, 분석 중 헤미채널이 열릴 때, 탐지가능 리포터들은 세포, 조직 또는 기관으로 들어간다. 그러나 헤미채널이 닫힐때, 탐지가능 리포터는 헤미채널을 통과하는 것이 방해받는다. 접촉은 바람직하게는 적합한 대조군과 관련하여 탐지가능 리포터의 흡수에 있어서의 임의의 변화를 탐지하기에 도움이 되는 조건 하에서 있다.

예를 들어 표준 시험관내 코넥신 인산화 분석에서 탐지되는 바와 같이, 코넥신의 C-말단에서의 적어도 하나의 티로신 잔기, 바람직하게는 Cx43이, 바람직하게는 위치 247 또는 위치 265에서 적어도 티로신이, 보다 바람직하게는 양쪽 모두가 인산화된다면, 헤미채널은 본 발명에 따라 "닫힌다". "닫힌다"는 또한 코넥신의 C-말단 부위에서 적어도 하나의 트레오닌 잔기가 인산화되는 것을 의미한다. 코넥신의 C-말단에서의 적어도 하나의 세린 잔기가 탈인산화된다면, 헤미채널은 "열린다". 추가적으로 바람직한 티로신, 트레오닌 및 세린 잔기는 키나아제 부위로서 도1에서 보여진다.

헤미채널을 통한 탐지가능 리포터의 통과를 탐지하기 위한 보다 상세한 시험관내 스크리닝 분석은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다:

1) 심장 또는 근육으로부터 유도된 것과 같은 세포, 조직 또는 기관의 집단의 배양,

2) 바람직하게는 산소 결핍 또는 글루코스 유도체의 첨가에 의한 것과 같은 대사 저해에 의한 세포, 조직 또는 기관에 스트레스 주기,

3) 알려진 또는 화학식 I 또는 II에 의해 아래에서 표현된 것과 같은 후보 헤미채널 조절 화합물의 첨가,

4) 칼세인 및 관련 화합물과 같은 형광 염료와 같은 형광, 화학발광 또는 인광성 화합물과 같은 탐지가능 리포터의 첨가,

5) 적합한 대조군과 비교하여 세포, 조직 또는 기관으로의 탐지가능 리포터의 흡수 변화를 탐지; 그리고

6) 헤미채널 기능을 조절하는 화합물을 표시하는 것으로서 변화를 임의로 측정.

이 분석은 탐지가능 리포터를 시각화함으로써 현미경상에서 쉽게 변화를 탐지할 수 있는, 세포, 조직 또는 기관 내에서 헤미채널을 열거나 닫는 후보 화합물의 능력을 효과적으로 측정할 수 있다. "표준 시험관내 흡수 분석" 또는 관련구에의 여기에서의 참고문헌은 단계 1)에서 6)에 걸친 상기 실험과정을 언급하고 있다. 분석은 심장 또는 근육으로부터 유도된 것과 같은 일차, 이차, 또는 무한증식세포의 매우 임의의 집단으로 수행될 수 있다. 다른 허용되는 리포터로는 또한 헤미채널을 통한 통과를 허용하는 크기를 갖는, 적합한 방사성 화합물을 포함한다. 특정 화합물은 하나 이상의 하기 방사선 핵종:³H,³⁵S, 및¹⁴C로 표지된 것을 포함한다.

중요하게는, 일반적으로 상기에서 기술된 표준 시험관내 흡수 분석은 계획된 분석 결과가 달성되기까지는 임의의 특정 순서의 단계에 결합되지 않는다. 따라서, 한 구체예에서, 적어도 하나의 후보 화합물 및 단계 3) 및 4)의 탐지가능 리포터는, 각각, 방법 중 단계 2) 전에 개별적으로 또는 함께 첨가될 수 있다. 분석의 이러한 예에서, 세포, 조직 또는 기관은 화합물 및 탐지가능 리포터의 존재하에서 스트레스를 받는다. 다르게는, 탐지가능 리포터는 헤미채널을 여는 능력을 가진 화합물을 탐지하는 단계 1)에서 세포 내로 로딩될 수 있다.

본 발명은 헤미채너 기능을 조절하는 능력에 대한 하나 이상의 후보 화합물을 스크리닝 하기 위한 추가의 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 아래의 화학식 I 또는 II에 의해 표현된 것으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물로 세포, 조직 또는 기관을 접촉시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 세포, 조직 또는 기관은 부피를 측정하기 위해 탐지가능 리포터로 로딩된다. 분석에서의 사용을 위한 바람직한 탐지가능 리포터는 열린 헤미채널을 통과하기에 적합한 분자 크기를 갖는다. 접촉은 바람직하게는 탐지가능 리포터에 의해 그리고 적합한 대조군을 나타내는 것에 의해 표시되는 세포, 조직 또는 기관의 부피에서의 임의의 변화를 탐지하는 것에 도움이 되는 조건 하에서 있다. 바람직하게는, 세포, 조직 또는 기관은 스트레스를 받고, 후보화합물은 적합한 대조군과 비교할 때 세포 부피가 유지되거나 보다 느리게 감소하도록 헤미채널을 닫는다.

세포 부피 변화를 탐지하기 위한 하나의 특정한 시험관내 스크리닝 분석은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다:

1) 심장 또는 근육으로부터 유도된 것과 같은 세포, 조직 또는 기관의 집단의 배양,

2) 칼세인 또는 관련 화합물과 같은 염료와 같은 형광, 화학 발광, 또는 인광성 화합물과 같은 탐지 가능 리포터로 세포, 조직 또는 기관을 로딩,

3) 탐지가능 리포터로부터의 신호를 탐지 및 정량함으로써 세포, 조직 또는 기관의 부피 측정,

4) 알려진 또는 아래에서 화학식 I 또는 II에 의해 표현된 것과 같은 후보 헤미채널 조절 화합물의 첨가,

5) 바람직하게는 산소 결핍 또는 글루코스 유도체의 첨가에 의한 것과 같은 대사 저해에 의한 세포, 조직 또는 기관에 스트레스 주기,

6) 적합한 대조군과 비교하여 세포 부피의 변화를 탐지; 그리고

7) 헤미채널 기능 및 임의로 간극 연접 기능을 조절하는 화합물을 표시하는 변화를 임의로 측정.

분석은 세포 부피 변화를 현미경상으로 관찰함으로써 세포, 조직 또는 기관 내에서 헤미채널을 열거나 닫는 후보 헤미채널 조절 화합물의 능력을 효과적으로 측정할 수 있다. "표준 시험관내 세포 부피 분석" 또는 관련구에의 여기에서의 참고문헌은 단계 1)에서 7)에 걸친 상기 실험과정을 언급하고 있다. 분석은 심장근세포 및 관련 세포 또는 조직과 같은 심장 또는 근육으로부터 유도된 것과 같은 일차, 이차, 또는 무한증식세포의 매우 임의의 집단으로 수행될 수 있다.

표준 시험관내 세포 부피 분석은 계획된 분석 결과가 달성되기까지 임의의 특정 순서의 단계에 결합되지 않는다. 따라서 한 구체예에서, 단계 4)의 후보 화합물은 세포 부피 감소의 낮은 속도에 의해 예증됨으로써 이미 스트레스 받은 세포에서의 해미체널을 닫는 화합물의 능력을 관찰하기 위해 단계 3)에서 세포에 스트레스를 준 후 첨가한다. 따라서, 분석의 한 구체에에서, 세포 부피 감소 또는 증가의 속도의 변화는 선-결정된 시간 틀을 거쳐 관찰된다. 그러나, 다른 구체예에서는, 세포 부피 변화는 고정된 시간 점, 예로써 세포, 조직 또는 기관을 스트레스 준 후약 1 내지 120분 사이의 시간에서 관찰될 수 있다.

논의한 바대로, 본 발명의 시험관내 분석은 유동적이며, 계획된 스크리닝 사용에 적합하도록 적용될 수 있다. 예를 들어, 아래에서 화학식 I 또는 II에 의해 표현된 것과 같은 특정한 후보 헤미채널 조절 화합물은 단독의 활성 제제로서, 또는 시험될 다른 화합물을 포함한 다른 제제와 배합하여 사용될 수 있다. 모든 예에서는 아니지만, 대부분에서, 시험관내 분석은 배양 배지에 시험되는 화합물을 첨가함 없이, 상기 단계들에서와 같은 동일한 또는 밀접히 관련된 시험 조건을 대게 포함하는, 적합한 대조군 분석과 관련하여 수행될 수 있다. 그러한 경우에서, 후보 헤미채널 조절 화합물은 대조군에 비한 분석에서 적어도 2% 더 높은 활성, 보다 바람직하게는 대조군 분석에 비해 적어도 약 5% 더 높은 활성, 더욱 보다 바람직하게는 대조군 분석에 비해 적어도 약 10% 이상의 더 높은 활성, 예컨대, 약 20% 내지 약 40% 더 높은 활성을 나타내는 것에 의해 동정될 수 있다.

논의된 바대로, 특정한 헤미채널 조절 화합물은 또한 간극 연접 채널에 중요한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 특정 화합물은 헤미채널을 닫는 것을 도울 수 있고, 간극 연접 채널의 개방을 도울 수 있다. 그러나, 다른 화합물은 간극 연접 채널의 폐쇄를 돕는 반면 헤미채널을 여는 것을 도울 수 있다. 또 다른 화합물은 다른 것들이 간극 연접 및 헤미채널을 닫을 수 있는 반면 헤미채널 및 간극 연접 모두를 열 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 세포, 조직 또는 기관에서의 간극 연접 세포간 의사소통 (GJIC)을 증가시키는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 본 방법은 치료학상유효량의 아래에서 기술되는 화학식 I 또는 II에 의해 표현되는 것으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 접촉은 적합한 대조군에 비하여 세포, 조직 또는 기관에서의 GJIC를 증가시키기에 충분한 것이다.

헤미채널 및 간극 연접을 조절하는 능력에 대해 선택된 화합물에서의 시험관내 분석의 배합이 또한 제공된다. 한 구체예에서, 표준 시험관내 코넥신인산화 분석, 표준 시험관내 흡수 분석, 및 표준 시험관내 세포 부피 분석 중 적어도 하나는 Larsen, B. 등에 의해 PCT/DK01/00127 (WO01/62775)로서 2001년 2월 22일에 출원된 신규한 항부정맥 펩티드라는 제목의 PCT 특허출원에서 또는 Larsen, B. 등에 의해 PCT/US02/05773 (WO 02/077017)로서 2002년 2월 22일 출원된 세포내 의사소통을 촉진하는 화합물의 새로운 의학적 용도라는 제목의 또다른 PCT 특허출원에서 개시된 하나 이상의 GJIC 분석과 결합된다. 그러한 적합한 GJIC 분석의 예는 패치 클램프, 칼슘 파장 측정 및 염료 이동 분석에 의한 세포 전도성을 측정하는 것들을 포함한다. PCT/DK01/00127 (WO 01/62775) 및 PCT/US02/05773 (WO 02/077017) 출원의 개시는 여기에서 참고문헌으로써 포함되어 있다.

제한이 아닌 설명의 방식으로서, 상기 기술된 표준 시험관내 코넥신인산화 분석이 하나 이상의 헤미채널 조절 화합물을 선택하기 위해 사용된다. 하나 이상의 화합물이 PCT/US02/05773 (WO 02/077017)출원에서 기술된 심장근세포 패치 클램프 분석에서 순차적으로 추가로 스크리닝 될 수 있다. 모든 분석에서 적합한 활성을 제공하는 화합물이 헤미채널 및 간극 연접을 조절하는 능력을 가질 것이다.

본 발명은 추가로 심장 부정맥을 조절하는 치료학적 능력을 탐지하고 임의로정량하는 것을 돕는 후보 헤미채널 조절 화합물의 생체내 시험을 제공한다. 논의된 바대로, 대부분의 심장 부정맥은 본 발명의 화합물 중 하나 또는 배합물의 사용에 의해 예방, 완화 또는 치료될 수 있다. 여기에서 "표준 시험관내 마우스 부정맥 분석" 또는 관련 구로 언급된, 바람직한 생체내 실험 모델은, PCT/DK01/00127 (WO01/62775) 및 PCT/US02/05773 (WO 02/077017)에 개시되어 있다. 본 발명에 따른 특정 화합물은 분석에서 적어도 약 20% (적어도 2의 스코어)에 의해 유도 심방 심실 (AV) 차단의 개시까지의 시간을 원하게는 지연시킬 것이다. 다른 화합물은 분석에서 적어도 약 60% 또는 유도 AV 차단 (적어도 3의 스코어)의 개시까지의 시간의 지연을 나타낼 것이다. 넓은 의미로, 분석은 부정맥을 유도하는 칼슘 클로라이드를 주입하고, 적합한 대조군과 비교하여 부정맥(2번째 등급의 AV 차단)의 개시의 시간을 탐지하는, 적합한 마우스에 하나 이상의 화합물을 투여하는 것을 포함한다.

중요하게는, 다중 탐지 형식의 사용 (즉, 여기에서 기술된 적어도 하나의 표준 시험관내 분석 및 생체내 부정맥 분석의 배합)은 다중 분석을 효과적으로 수행함으로써, 좋은 치료학적 능력을 갖는 헤미채널 조절 화합물 (예를 들어, 화학식 I 및 II에 의해 표현되는 것과 같은)을 동정하는 정확성 및 확률을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 이 특징은 많은 수의 화합물이 시험될 때 특히 유용하다. 예를 들어, 화학식 I 또는 II에 따른 일부 또는 거의 전부의 화합물이 시험될 수 있다. 다르게는, 또는 추가적으로, 적합한 화합물은 조합-형 화학 조작을 포함한 표준 합성 방법에 의해 만들어진 후, 본 발명에 따라 시험될 수 있다.

다중 탐지 형식이 실행되는 구체예에서, 여기에서 기술된 분석에 의해 결정된 바의 유의미한 시험관내 및 생체내 활성은 헤미채널 조절 화합물의 특성이 요구되지 않음을 주지하는 것이 중요하다. 즉, 여기에서 기술된 특정 화합물은 여기에서 기술된 적어도 하나의 표준 시험관내 분석에서 좋은 활성을 나타낼 것이나, 표준 생체내 부정맥 분석에서는 유의미한 활성을 나타내지 않을 것이다. 다르게는, 특정 다른 화합물은 생체내 부정맥 분석에서 유의미한 활성을 나타낼 것이나, 하나 이상의 표준 시험관내 분석에서는 좋은 활성을 보이지 않을 것이다. 그러나, 바람직한 헤미채널 조절 화합물은 본 출원에서 기술된 적어도 하나의 시험관내 및 생체내 분석에서 좋은 활성을 나타낼 것이다.

표준 생체내 부정맥 분석에서 좋은 활성을 보이는 화합물은 때때로 분석에서의 부정맥에 시간을 연장하는 능력을 지칭하는 "항부정맥 화합물" 또는 유사구로 불릴 것이다.

아래에서 보다 자세하게 기술될 것으로, 본 발명의 화합물은 세포막을 통과하는 분자 및/또는 이온의 원치않은 또는 비정상적인 통과와 관련된 것으로 연상 또는 추측되는 넓은 범위의 의학적 증상을 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, PCT/DK01/00127 (WO 01/62775) 및 PCT/US02/05773 (WO 02/077017)에 개시된 거의 모든 의학적 징후들이 이런 방식으로 처리될 수 있다. 상기 의학적 징후들의 일부는 여기에 개시되어 있다. 의학적 징후는 본 출원에서 개시된 화합물의 하나 또는 배합물 및 특히 여기서 제공된 적어도 하나의 시험관내 및 생체내 분석에서 좋은 활성을 보이는 것들을 사용함으로써 예방, 경감 또는 치료할 수 있다.

본 발명과 시험 및 사용에 적합한 추가적 화합물은 Larsen, B. D 등에 의해PCT/US02/05773 (WO 02/077017)에서 개시되어 있다.

또다른 면에서, 본 발명은 포유동물에서 조직 또는 기관 스트레스를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 방법은 치료학상 유효량의 상기 화학식 I 또는 II에 의해 표현되는 화합물의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 접촉은 조직 또는 기관에서 스트레스를 예방 또는 치료하기에 충분한 것이다.

본 발명은 또한 코넥신헤미채널 개방을 차단하는 치료학상 유효량의 화합물을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 화상의 치료 방법을 제공한다.

또한 혈전증의 치료 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 방법은 개방으로부터 코넥신 헤미채널을 차단하는 치료학상 유효량의 화합물을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 면에서, 본 발명은 또한 호흡 및 대사 산증의 치료 방법을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 방법은 개방으로부터 코넥신헤미채널을 차단하는 치료학상 유효량의 화합물을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 국소 부정맥의 치료 방법을 제공한다. 그 방법의 한가지 예로, 개방으로부터 코넥신헤미채널을 차단하는 치료학상 유효량의 화합물을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

혈당 수준 증가로부터 야기된 세포 및 조직손상을 치료 및 예방하는 방법이 본 발명에 의해 추가로 제공된다. 한 구체예에서, 그 방법은 개방으로부터 코넥신헤미채널을 차단하는 치료학상 유효량의 화합물을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 만성 심방 세동의 치료 방법을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 그 방법은 개방으로부터 코넥신헤미채널을 차단하는 치료학상 유효량의 화합물을 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

또한 간질의 치료 방법이 제공된다. 일반적으로, 그 방법은 코넥신헤미채널이 열리도록 촉진하는 치료학상 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함한다.

추가로, 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 의해 표현되는 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 그러한 치료를 필요로 하는 포유류의 조직 또는 기관을 세포보호하는(cytoprotecting) 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 의해 표현되는 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 재관류 손상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

앞선 치료학적 방법 각각에서, 좋은 항-부정맥 활성을 특징으로 하는 본 발명에 따른 화합물은 표준 시험관내 마우스 부정맥분석 (즉, 적어도 2의 스코어)에 의해 결정될 수 있다. 그러한 화합물은 종종 "항부정맥" 화합물 또는 관련구로서 여기에서 언급된다.

본 발명의 추가적 이용 및 이점은 하기 논의 및 실시예로부터 명백해질 것이다. 본 발명의 다른 면 또한 아래에서 논의될 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 코넥신(Cx43) 상의 인산화 위치를 보여주는 도면이다. 보이는대로, Cx43 막관통 단백질의 시토졸 도메인은 수 개의 잠재적인 세린 및 티로신 인산화 위치를 갖는다.

도 2는 글루코스 제거에 의해 유도된 대사성 스트레스를 보여주는 그래프이다. 그래프에서 볼 수 있는 것 처럼, 화합물 1의 투여는 상대적인 전도 지연에서의 감소에 의해 증명되는 것처럼 스트레스를 감소시킨다.

도 3A-B는 코넥신43 (Cx43)에서의 티로신 인산화의 탐지를 보여주는 이뮤노블롯의 묘사이다. 도 3A는 화합물 1 투여의 결과를 보여준다. 도 3B는 화합물 1 및 화합물 2의 투여의 결과를 보여준다.

도 4A-B는 Cx43의 티로신 인산화 (8A) 및 세린 인산화(8B)의 탐지를 보여주는 이뮤노블롯의 묘사이다.

도 5는 배양된 심장근세포에서의 칼세인의 허혈-유도 흡수 상에서의 1OnM 화합물 1의 효과를 보여주는 그래프이다.

도 6A은 바람직한 ELISA 분석 형식을 보여주는 도면이다. 도 6B는 HeLa 세포에서 Tyr-P에서의 인산화된 Cx43의 ELISA 결과를 보여주는 그래프이다. 도 6C는 CHO 세포에서 Tyr-P에서의 인산화된 Cx43의 ELISA 결과를 설명하는 그래프이다.

도 7A-C는 배양된 심장근세포에서의 염료 흡수를 보여주는 현미경 사진이다.

도. 7A: 광학 현미경 하의 심장근세포; 도. 7B: 대조군 조건 하에서의 형광(도. 7A에서와 동일한 세포); 도. 7C : 30분의 대사 저해 후의 형광.

도 8은 투여량-의존 방식으로 화합물 1이 스트레스-유도 칼세인 흡수를 감소시키는 것을 보여주는 그래프이다.

도 9A-B는 스트레스-유도된 세포 종창에 대한 화합물 1의 효과를 보여주는 그래프이다. 도. 9A 화합물 1(0.lnM)의 존재 또는 부존재 하에서의 대사성 저해 동안의 상대적인 부피. 도. 9B는 대조군 데이터를 보여준다.

도 10은 스트레스-유도된 세포 종창에 대한 화합물 1(0.lnM)의 효과를 보여준다.

도 11은 심근경색증에 걸린 래트에게 화합물 1을 투여한 후 심장 무게 대 체중 비율에서의 감소를 보여주는 그래프이다.

도 12는 화합물 1의 투여에 뒤따르는 래트에서의 경색 크기에서의 감소를 보여주는 그래프이다.

도 13은 심근경색증이 일어난 래트에게 화합물 1을 투여한 후 개선된 심장의 기능을 보여주는 그래프이다.

발명의 상세한 설명

논의한 바대로, 본 발명은 헤미채널 기능을 조절하는 것과 같은 것을 이용하는 화합물 및 방법을 제공한다. 보다 특정한 화합물은 헤미채널의 개방 또는 폐쇄를 도와주는 헤미채널 인산화를 조절한다. 그러한 화합물을 탐지 및 특징화하기 위한 유용한, 시험관내 분석, 생체내 분석, 또는 그의 배합을 포함하는 스크린이 또한 제공된다. 추가로 부적합한 헤미채널 기능에 의해 영향을 받는 증상의 치료 또는 예방에 유용한 치료학상 방법이 제공된다.

본 발명의 목적은 세포, 조직 및 기관 스트레스가 헤미채널의 폐쇄 및 개방에 의해 반대의 영향을 받을 수 있음을 처음으로 증명하는 것이다. 이론과 결합되는 바램없이, 허혈 동안의 산소 결핍, 글루코스 결손, HCN에 의해 야기된 산화적 인산화의 끊김(uncoupling), 또는 시트르산 싸이클의 끊김(uncoupling)과 같은 대사적 스트레스가, 세포간 간극 연접 의사소통 (GJIC)의 끊김에 모두 기여한다는 것이 믿어졌다. 추가로 이 끊김이 코넥신인산화, 보다 특히 간극 연접 채널에서의 코넥신- 티로신 잔기 및/또는 코넥신-세린 잔기 및/또는 트레오닌 잔기의 탈인산화의 조절과 관련된다고 여겨진다. 설명의 방식으로, 심방 세동 동안, 심방 세포가 고빈도 조율(high frequency pacing)에 기인한 증가된 대사적 요구를 갖는 것으로 여겨진다. 이는 락테이트 산증, 헤미채널의 개방 및 간극 연접의 끊김을 이끄는 것으로 여겨진다.

본 발명의 목적은 또한 헤미채널 기능 및, 임의로, 간극 연접 세포간 의사소통 (GJIC)을 조절하는 방법을 제공하는 것이며, 이 방법은 치료학상 유효량의 그러한 활성을 갖는 화합물 중 하나 또는 배합으로 세포, 조직 또는 기관을 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직한 화합물은 PCT/DK01/00127 (WO 01/62775) 및 PCT/US02/05773 (WO02/077017)에서 B. Larsen 등에 의해 개시된바 있다.

본 발명과의 사용을 위해 적합한 보다 바람직한 화합물은 하기 화학식 I 에의해 표현되는 것들 및 그의 염을 포함한다:

여기에서,

R₁은 H 또는 아세틸 (Ac)을 나타내고,

R₂는 아미노산 G, Y,_D-Y, F 및_D-F 중 하나의 곁사슬을 나타내며,

R₃는 임의의 아미노산 곁사슬을 나타내고,

R₄는 아미노산 G, Y,_D-Y, F 및_D-F 중 하나의 곁사슬을 나타내며,

R₅는 OH 또는 NH₂를 나타내고,

그리고 a, S, T, P 및 Q는 정수이며, 독립적으로 0 또는 1이다.

보다 특별한 화합물은 하기 화학식 II를 갖는 것 및 그의 염을 포함한다 :

Rl-X1-X2-X3-R2

II

여기에서,

X1은 0, Ala, Gly, β-Ala, Tyr, D-Tyr, Asp이고,

X2는 0; Ala-Gly-T4c-Pro; Ala-Sar-Hyp-Pro;; Ala-Asn; D-Asn-D-Ala; D-Asn;; Gly, Ala; D-Ala; β-Ala ;; Asn;이거나;

X3는 Tyr; D-Tyr; Gly, , 또는 Phe;이고

R1은 X1 및 X2이 모두 0이 아닐 조건으로, H 또는 Ac이며,

R2는 OH 또는 NH₂이다.

상기 화학식 I 또는 II에 의해 표현되는 보다 특별한 화합물은 하기의:

G-(DBF)-Y-NH₂, H-GA-Sar-Hyp-PY-NH₂, H-GAG-T4c-PY-NH₂, Gly-Ala-Asn-Tyr, D-Tyr-D-Asn-D-Ala-Gly, D-Tyr-D-Asn-Gly, Gly-Gly-Tyr, Gly-Ala-Tyr, D-Tyr-D-Ala-Gly, Gly-D-Asn-Tyr, Gly-βAla-Tyr, βAla-βAla-Tyr, ,Gly-βAla-Phe, Gly-Asn-Phe, Asn-Tyr, Ac-Gly-Tyr, Ac-Ala-Tyr, (감소된Gly)-Gly-Tyr(H₂N-CH₂-CH₂-NH-CH₂-C(O)-Tyr),

; 및 그의 염을 포함한다.

본 발명의 추가적으로 바람직한 후보 화합물은 허용되는 경구 생체이용율 분석에 의해 결정되는 것으로서 약 5% 이상의 경구 생체이용율을 특징으로 한다.

일반적으로 바람직한 분석은 적합한 시험 대상에 후보 성분의 십이지장내(intraduodenal) 투여를 포함한다. 그 후, 생물학적 샘플, 바람직하게는 혈액 샘플 내에서의 화합물의 유용성이 탐지 및 바람직하게는 정량된다.

추가의 바람직한 후보 화합물는 일반적으로 리핀스키의 규칙 5(Lipinski's rule of 5)를 만족한다. 적용된 바, 그것은 생체이용율을 정의한다. 규칙에 따라, 충분한 흡착 미만은 하나 이상의 하기 특징이 특정한 후보 화합물을 특징화할 때, 보다 적당하다: 1) 5이상의 H-결합 공여체 (OH 및 NH의 합으로 표현된), 2) 500 이상의 분자량, 3) Log P가 5이상, 4) 10이상의 H-결합 수용체 ( N 및 O의 합으로 표현된), 및 5). 범위 밖의 두개의 매개 변수는 많은 발명 구체예에 대해 피해졌다.

본 발명에 따른 또 추가의 바람직한 화합물은 혈액 혈장 내에서 상대적으로 안정하다. 허용되는 분석은 원하는 후보 화합물을 혈장(예를 들어, 설치류, 래빗또는 영장류 혈청)과 접촉시키고, 혈장으로 화합물을 배양한 후, 시간을 넘어서 그 화합물의 안정성을 탐지 및 바람직하게는 정량하는 것을 포함한다. 바람직한 혈장 공급원은 래트, 개, 고양이, 마우스, 돼지, 소, 말 및 인간이다. 때때로 여기에서 "표준 혈장 안정성 분석"으로 언급되는, 바람직한 분석은 PCT 출원 PCT/US02/05773 (WO 02/077017)에 개시된 바 있다. 분석에 있어서 좋은 활성을 주는 전형적인 화합물은 C-말단 아미노화 또는 에스테르화, D-아미노산 및 천연 아미노산 유도체의 사용, N-말단 수정, 및 사이클릭 구조를 특징으로 한다. 그러한 수정의 하나 또는 배합은 실질적인 생물학적 활성을 유지하는 동안 안정성을 향상시킬 수 있다.

본 발명과 함께 사용을 위한 특히 바람직한 헤미채널 조절 화합물은: Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH₂ (화합물 1); Ac-Gly-Asn-Tyr-NH₂ (화합물 2); 및 그의 염을 포함한다.

바람직한 헤미채널 조절 화합물은 여기에서 기술된 표준 시험관내 및 생체내 분석의 하나 또는 배합에서 유의미한 활성을 나타낸다. 그러한 화합물 또한 헤미체널을 닫거나 여는, 임의로 GJIC를 조절하는 능력을 갖는다. 바람직하게는, 적합한 화합물은 표준 시험관내 코넥신인산화 분석에 의해 결정된 코넥신43 (Cx43)의 인산화를 향상시키거나 감소시킨다. 보다 특별한 분석은 도 1에서 보여지는 하나 이상의 티로신, 세린 및 트레오닌 아미노산 잔기의 인산화 및/또는 탈인산화를 관찰한다. 보다 특별한 분석 형식은 다음과 같다.

1) 배지에서 융합 또는 반-융합(semi-confluent) 래트 심장근세포 또는 H9c2세포와 같은, 약 10⁵개의 세포의 집단의 배양,

2) 같은 것을 세척하고, 그 후에 약 1시간 또는 그 미만 동안 글루코스 부족 배지에서 그들을 배양하여 세포들에 스트레스 주기,

3) 약 10분 내지 8시간 동안 약 0.1 내지 약 200 nM의 농도의 배지에서 화합물 1을 첨가,

4) 세포 용해 후, 적합한 대조군에 비한 Cx 43에서의 티로신, 세린, 및/또는 트레오닌 인산화의 변화 탐지; 및

5) 헤미채널 기능을 조절하는 화합물을 표시하는 것으로서 인산화의 변화 측정.

방법의 한 구체예로, 탐지하는 단계 4)는 추가로 면역학적 또는 세포 분류-기초 분석에서 후보 화합물을 시험하는 것을 포함한다. 면역학적 분석이 사용되는 경우에 있어서, 분석은 일반적으로 코넥신의 인산화를 증가 또는 감소시키기에 충분한 조건 하에서 후보 화합물로 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 방법은 추가로 세포의 용균물을 생산하고, 세포 용균물에서의 증가 또는 감소된 코넥신인산화를 탐지하는 것을 포함한다. 그 증가 또는 감소는 헤미채널 조절 화합물이 표시되는 것으로 추가로 여겨진다.

방법과 함께 사용을 위한 바람직한 면역학적 분석은 기술된 바 있으며, 면역침강 분석, 항체 포획 분석, 두-항체 샌드위치 분석, 항원 포획 분석, 방사선면역분석 (RIAs)등을 포함한다. 여기에서 참고문헌으로 포함된 개시물인, 많은 표준면역학적 방법과 관련된 논의에 대한 E. Harlow 및 D. Lane in Antibody: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Ausubel 등 (1989) in Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York 을 일반적으로 참조.

바람직한 면역학적 분석은 ELISA 분석이다. 따라서 한 구체예에서, 상기 방법은 추가로 다음 단계 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 포함한다:

a) 코넥신, 바람직하게는 코넥신43 (Cx43)에 특이적으로 결합하는 제1 항체로 고상 지지체를 코팅하고,

b) 제1 항체 및 코넥신 간에 결합 복합체를 형성하는 것을 도와주는 조건하에서 고상 지지체에 세포 용균물을 접촉시키며,

c) 제1 항체: 코넥신결합 복합체를 제2 항체와 제1 항체: 코넥신결합 복합체중 어느 인산화된 코넥신 간의 특이적 결합 복합체를 형성하기에 충분한 조건 하에서 접촉시키고,

d) 제1 항체: 코넥신: 제2 항체 결합 복합체를 제2 항체와 결합하는 탐지가능하게 표지된 제3 항체와 접촉시키며;

e) 화합물을 추가로 표시하는 것으로써 고상 지지체 상의 제3의 탐지가능하게 표지된 항체의 존재를 탐지하는 것을 포함하는 방법.

본 방법의 한 구체예세서, 방법의 제3 항체는 비오틴, FITC, TRITC, 방사성 요오드 또는 퍼옥시다제 중 적어도 하나로 탐지가능하게 표지된 것이다. 또다른 구체예에서, 제2 항체는 항-포스포티로신 항체이다. 더 또다른 구체예에서, 제2 항체는 항-포스포세린 항체이다. 일부 예에서, 탐지가능하게 표지된 제3 항체의 탐지는 방사선- 또는 감마 섬광 계수에 의해 수행된다.

또다른 구체예에서, 면역학적 방법은 탐지 단계가 방사선면역분석 (RIA)으로서 사용된다. 바람직하게는, 그러한 RIA는 하기 단계 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 포함한다:

a) 세포 용균물을 생산하기 전에 세포를 탐지가능하게-표지(여기에서 표지는 인산화된 코넥신, 바람직하게는 코넥신43 (Cx43)을 표지하는 것을 도와주는 조건하에서 이루어짐)하고,

b) 세포 용균물을 코넥신과 특이적 결합 복합체를 형성하는 항체와 접촉시키며,

c) 탐지가능하게 표지된 세포 용균물로부터 결합 복합체를 분리하고;

d) 간극 연접 조절 화합물을 추가로 표시하는 것으로서 표지되고 인산화된 코넥신을 탐지하는 것을 포함하는 방법.

방법의 한 구체예에서, 항체는 항-코넥신항체이다. 또다른 구체예에서, 탐지 단계는 추가로 웨스턴 이뮤노블롯 분석을 수행하는 것을 포함한다. RIA 방법는 넓은 범위의 탐지가능한 표지들과 양립가능하나, 많은 적용에 대해서 방사성 무기 인산의 투여가 바람직하게 될 것이다.

항-포스포티로신, 항-포스포세린, 및 항-Cx43 항체를 포함한 상기 발명의 방법과 함께 사용을 위한 항체는 American Type Culture Collection (ATCC); Sigma C헤미cal Co. , St. Louis, MO; Zymed Lab, Inc. , of California; 및 AmershamBiosciences, U. K 과 같은 다수의 공급원으로부터 상업적으fh 얻을 수 있다.

바람직한 헤미채널 조절 화합물은 특히 도1에서 보여지는 하나 이상의 티로신, 세린 및 트레오닌 잔기에서, Cx43의 인산화를 조절하는 좋은 능력을 보여주는 상기 표준 시험관내 시험에 의해 동정될 수 있다. 그러한 화합물 중 보다 바람직한 것은 약 0.1nM 내지 약 200nM의 화합물이 존재하는 스트레스 받은 세포에 비하여 그러한 인산화에 있어서 적어도 5%의 변화(Cx43 상의 하나 이상의 포스포티로신, 포스포세린, 및/또는 포스포트레오닌의 존재에서 감소의 증가로서 표시된), 바람직하게는 적어도 약 10%, 보다 바람직하게는 적어도 약 50%의 변화를 나타낸다.

표준 시험관내 코넥신인산화 분석의 특정 실시예에 대한 아래의 실시예 2-5를 참조.

논의한 바 대로, 본 발명은 또한 헤미채널 조절 화합물을 탐지하고 임의로 특징화하는데 사용될 수 있는 표준 시험관내 흡수 분석을 특징으로 한다. 분석은 단독으로 또는 표준 시험관내 코넥신인산화 분석과 병행하여 사용될 수 있다. 특히 표준 시험관내 흡수 분석의 분석은 다음과 같이 설명된다.

1) 배지 중에서약 10⁵개의 융합성 래트 심실 근육세포의 집단을 배양,

2) 약 2 시간, 바람직하게는 약 30 분 미만 동안 글루코스 결손 배지를 갖는 배지로 교체함으로써 세포에 스트레스를 줌,

3) 약 0.O1pM 내지 100nM의 농도로 배지에 화합물 1을 첨가,

4) 약 2 시간 및 바람직하게는 약 30 분 미만 동안 약 10 내지 약 500 마이크로몰라의 농도로 배지에 칼세인 염료를 첨가,

5) 세포에의 칼세인의 흡수에 있어서의 변화를 탐지; 및

6) 헤미채널 기능을 조절하는 화합물을 표시하는 것으로서 변화를 측정.

칼세인의 흡수 변화를 탐지하는 단계는 형광 광학 현미경 및/또는 관련된 세포 분류 방법을 포함한 표준 방법 중 하나 또는 그 배합에 의해 수행될 수 있다. 표준 시험관내 흡수 분석의 특정 실시예에 대한 실시예 6을 참조.

상기 표준 시험관내 흡수 분석에 의해 탐지된 바람직한 화합물은 시험된 화합물의 O.O1pM 내지 100nM의 존재하에서, 스트레스 받은 세포에 비해 염료 흡수(닫힌 세포 헤미채널)에 있어서 적어도 약 5% 감소, 바람직하게는 적어도 약 20% 감소 및 보다 바람직하게는 적어도 약 50% 감소를 나타낼 것이다.

또한 논의한 바대로, 본 발명은 단독의 또는 표준 시험관내 코넥신인산화 및 표준 시험관내 흡수 분석 중 하나 또는 모두와 병행된 시험관내 세포 부피 분석을 제공한다. 표준 시험관내 세포 부피 분석의 특정 구체예는 다음과 같다.

1) 배지 중에서 약 10⁵개의 융합성 래트 심실 근육세포의 집단을 배양,

2) 약 2 시간 및 바람직하게는 약 15 분 미만 동안 약 0.5 내지 약 100 마이크로몰라 칼세인-AM, 바람직하게는 약 5 마이크로몰라로 세포를 로딩,

3) 칼세인-AM으로부터의 신호를 탐지 및 바람직하게는 정량하여 세포의 부피를 측정,

4) 약 O.O1nM 내지 약 100nM의 농도로 배지에 화합물 1을 첨가,

5) 글루코스 결손 배지 중에서 배양시킴으로써 세포에 스트레스 주기,

6) 적합한 대조군에 비한 세포 부피에서의 변화를 탐지; 및

7) 헤미채널 기능을 조절하는 화합물을 표시하는 것으로서 변화를 측정.

세포 부피에 있어서의 변화를 탐지하는 단계는 레이저 공초점 현미경 및/또는 관련된 세포 분류 방법을 포함한 표준 방법 중 하나 또는 병행에 의해 수행될 수 있다. 실시예 7은 표준 시험관내 세포 부피 분석의 특정 실시예를 제공한다.

상기 표준 시험관내 세포 부피 분석에 의해 탐지된 바람직한 화합물은 테스트된 화합물의 약 O.O1nM 내지 100nM의 존재하에서, 스트레스 받은 세포에 비하여 세포 부피(닫힌 헤미채널)에 있어서 적어도 약 5% 감소, 바람직하게는 적어도 약 20% 감소, 보다 바람직하게는 적어도 약 50% 감소를 나타낼 것이다. 이 분석에 따라 선택된 화합물은 헤미채널을 통한 삼투물질의 흐름을 나타낼 것이며, 세포 종창을 만드는 조건 동안 정상적인 세포 부피를 유지하도록 도울 것이다. 중요하게는, 세포 종창은 섬유피막 (예로써, 심장, 신장, 골격근) 또는 뼈 (뇌, 척수)에 의해 둘러싸인 기관에서의 손상된 관류와 연관되므로, 헤미채널 차단 특성을 지닌 화합물은 세포 종창과 관련된 질환의 치료에 유용할 수 있다.

적합한 대조군 실험은 일반적으로 특정 분석 형식에 있어서의 사용을 위해 맞춰질 수 있다.

예를 들어, 대부분의 대조군 실험은 배지 중에서의 배양과 같은 무-스트레스조건에서의 대상 시험 샘플을 포함한다(예로써, 배양된 래트 심장근세포의 집단).

일반적으로, 물, 완충액, 인산염-완충 식염수 등이 동시에 또는 분리적으로시험되는 화합물 대신에 분석에 가해진다. 그 후, 원하는 분석이 본 방법에 따라 수행된다. 적합한 대조군의 특정한 실시예는 실시예 부분에서 제공된다.

본 발명의 실행은 넓은 범위의 통상적인 탐지 분석과 양립할 수 있다. 그러한 분석은 필요에 따라 수동적으로, 반수동적으로, 또는 자동화된 형식으로 수행될 수 있다. 신속하거나 대량 규모의 스크리닝 전략이 필요한 적용에 대해, 본 발명은 추가로 표준 "고-작업처리(high-throughput)" 및/또는"초-고 작업처리(ultra-high throughput)" 스크리닝 방법론과 양립할 수 있다. 그러한 방법의 실시예는 여기에서 기술된 것과 같은 면역학적 및 세포 분류 유형 분석을 포함한다.

논의된 바대로, 본 발명은 넓은 범위의 시험 방법과 양립할 수 있다. 따라서 일부 실시예에서, 후보 화합물의 추가적 시험이 바람직하게는 헤미채널 조절 활성 확인을 위해, 생체 내에서 시험하는 것을 수행할 수 있을 것이다. 예를 들어, 여기에 기술된 표준 시험관내 방법 중 하나 또는 병행한 것은 표준 생체내 부정맥 모델에서의 헤미채널 조절 활성에 대해 화합물을 추가로 시험하기 위해 사용될 수 있다. 참고문헌 실시예 1과 같이 아래에서 기술된 표준 생체내 마우스 부정맥 분석은, PCT/DK01/00127 (WO01/62775) 및 PCT/US02/05773 (WO02/077017)에서 B. Larsen 등에 의해 개시된 바 있다.

본 발명의 방법 중 하나 이상에 의해 동정된 후보 화합물은 세포, 조직 및 기관의 범위에서의 간극 연접 및 특히 헤미채널을 동정하기 위한 프로브 사용을 포함한 다양한 중요한 적용을 갖는다. 또한, 그러한 화합물은 다양한 발병 및 질환 상태에서의 간극 연접 및 헤미채널을 탐지하기 위한 프로브로서, 그리고 뚜렷한 탄수화물 데코레이션 및/또는 인산화 패턴을 갖는 이들 구조를 탐지하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 그러한 화합물은 표준 크로마토그래피 과정에 따라 간극 연접 성분을 정제하기 위한 고상 지지체 성분으로서 추가의 용도를 찾는다.

여기에서 시술된 시험관내 및/또는 생체내 시험에 의해 선택된 화합물은 헤미채널의 증가된 개방(세포외 구획으로의 증가된 세포막 투과성)에 의해 영향을 받는 증상, 예로써, 화상과 같은 상처, 혈전증, 호흡 및 대사 산증, 예로써 세균 또는 환경 독소에 기인한 조직종창, 및 국소 부정맥을 예방 또는 치료하기 위한 의약으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 의약은 파괴적인 부피 변화로부터 세포를 보호하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 변화는 과도한 열, 허혈, 독성, 염증, 부종, 전해질 장애, 글루코스의 증가된 수준 및 당뇨병성 만기 장해를 포함하는 요인 중 하나 또는 그 배합에 의해 촉진될 수 있다. 증가된 세린인산화와 관련된 만성 심방 세동의 치료 또한 계획될 수 있다. 추가적 화합물은 하기 증상의 심각성을 예방, 치료, 완화 또는 감소시키는 의약으로서 사용될 수 있다. PCT/DK01/00127 (WO 01/62775) 및 PCT/US02/05773 (WO 02/077017) 출원을 또한 참조.

본 발명의 치료학적 방법은 일반적으로 특히 인간과 같은 영장류와 같은 그러한 치료를 필요로 하는 대상에게, 여기서 개시된 치료학상 유효량의 헤미채널 조절 화합물 중 하나 또는 그 배합을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 치료 방법은 또한 여기서 개시된 지시를 위해 그러한 치료를 필요로 하는 대상, 특히 인간과 같은 포유동물에게, 상기 정의된 바와 같은 유효량의 화학식 I 또는 II의 투여를 포함한다.

일반적인 대상은 아래의 섹션 A-R에서 기술된 증상을 포함한 여기에서 제공된 장애의 하나 또는 그 배합으로 고통받는 포유동물을 포함한다.

A. 신경 조직

미세아교세포가 중추 신경계(CNS)의 주요 면역 작동체이며, 그들이 두부 손상 및 허혈, 신경 퇴화성 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환, 프리온 질환, 및 뇌 종양을 포함한 뇌 염증 반응을 일으키는 넓은 범위의 손상에 반응하여 활성화된다는 것은 잘 알려져 있다. 활성화된 미세아교세포는 그들이 증식하고 점진적으로 세포 잔해를 제거하는, 손상된 CNS 지역으로 이동한다. Eugenin 등은 미세아교세포가 염증성 사이토카인에 의해 유도된 간극 연접을 통해 각각 다른 것과 의사소통 할 수 있음을 보여주었다(Eugenin, E A, 등 Proc. Natl.Acad.Sci. USA, Vol. 98, 4190-4195,2001). 이것은 하기의 실험에서 증명된다. 뇌 자상 상처에서, 미세아교세포는 점진적으로 수일에 걸쳐 축적되며, 세포 간의 표면에서 Cx43 면역반응력을 빈번하게 보이는 응집체를 형성한다. 일차 배양에서, 미세아교세포는 웨스턴 블롯팅에 의해 결정된 Cx43의 낮은 수준, 확산된 세포내 Cx43 면역반응력, 및 낮은 빈도의 염료 커플링을 보였다. 면역자극 세균성 지질다당질(lipopolysaccharide,LPS) 또는 사이토카인 인터페론-감마 (INF-감마) 또는 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파) 하나씩으로의 치료는 염료 커플링의 빈도를 증가시키지 않았다.

그러나, INF-감마와 LPS로 처리된 미세아교세포는 항-TNF-알파 항체의 공적용에 의해 방해되었던 염료 커플링에서 극적인 증가를 보여 TNF-알파의 방출 및 자가분비 활동을 제시했다. INF-감마와 TNF-알파로의 치료 또한 세포-세포 접촉에의 Cx43의 전위로 염료 커플링의 빈도 및 Cx43 수준을 크게 증가시켰다. 사이토카인-유도 염료 커플링은 18-글리시르헤틴산, 간극 연접 차단제에 의해 반대로 저해되었다. 배양된 마우스 미세아교세포 또한 Cx43을 발현시켰으며, 및 사이토카인으로의 치료 상에서 염료 커플링을 발전시켰으나, 동종 Cx43 결손 마우스로부터의 미세아교세포는 INF-감마와 LPS 또는 INF-감마와 TNF-알파 중 어느 것의 치료 후에도 유의미한 염료 커플링을 발전시키지 않았다.

간극 연접 단백질, 코넥신의 강요된 발현은, 간극 연접-결손 세포주가 세포간 칼슘 파장을 전파시키도록 할 수 있다. Cotrina 등은 불완전하게 결합된 세포주, C6 신경아교종, HeLa, 및 U373 아교모세포종으로부터의 ATP 분비가 코넥신 발현에 의한 5 내지 15 배 강력해짐을 증명했다. 이러한 관찰은 세포-대-세포 신호전달이 코넥신헤미채널을 통해 매개되는 향상된 ATP 방출로부터 생기는 코넥신 발현과 관련되어 있음을 나타낸다.(Cotrina ML 등 ProcNatl Acad Sci USA 1998 Dec 22; 95 (26): 15735-40 ; Cotrina 등: JNeurosci 2000 Apr 15; 20 (8): 2835-44). 또한, 대사적 스트레스 (예로써, 허혈)가 있는 조건 동안, 성상세포로부터 헤미채널-매개 ATP 방출은 이웃하는 뉴론에 영향을 줄 수 있고, 교대로 세포내 칼슘의 증가를 유도하며, 세포자멸 및 신경성 죽음을 일으킬 수 있다.

예를 들어, 화합물 1 및 화합물 2에 의한 Cx43 티로신의 인산화에 기인하여, 이들 화합물의 투여는 헤미채널 담힘을 돕고 미세아교세포의 세포간의 의사소통을 촉진함으로써 및 상기 언급된 질환 (두부 손상 및 허혈, 신경 퇴화성 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환, 프리온 질환, 및 뇌 종양을 포함한 뇌 염증성 반응)에서의 "치료하는" 과정을 증진 또는 증속시킬 것이다. 또한, 헤미채널의 폐쇄가 ATP 방출을 방지하고, 따라서 일차적 손상의 전파를 줄일 것으로 기대된다.

B. 폐 조직: 페포 세포

페포 세포 사이의 간극 연접을 통한 페포 세포간 의사소통은 이온 수송의 전달, 물리화학적 신호 전환, 세포 성장의 조절 및 계면활성 인자의 분비에 대해 중요하다 (Ashino Y, 등(Am J Physiol Lung Mol Physiol 2000; 279:L5-L13)). 폐의 폐포 지역의 급성 및 만성 염증성 손상 후의 생체내 수선은 세포외 기질의 일부로서의 섬유결합소의 형성을 포함한다(Charash WE, 등 (Am RevRespir Dis 1993; 148: 467-476) 및 Torikata C, 등 (Lab Invest 1985; 52: 399-408)). 페포 상피 세포 배양 연구는 세포외 섬유결합소 농도의 증가와 동시에 간극 연접의 증가된 수를 증명한다(Alford AI, Rannels DE. (Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001; 280: L680-L688)). 생체내 동물 연구는 폐포 조직, 말단 세기관지의 벽, 폐포관 및 세기관지주위 폐포 모두에서의 니트로젠 디옥사이드 유도된 심각한 폐질환 염증 후의 간극 연접의 증가된 수를 발견한 바 있다. 이러한 발견은 투여량 의존적이었다. 그러나, 타우린으로 전처리된 경우 간극 연접의 이 손실은 덜 판단된 염증성 반응과 동시에 방지될 수 있었다. 유사한 발견은 래트 폐의 방사선 조사 후 및 화학요법적 화합물, 블레오마이신으로의 치료 후 나타난다.

따라서, 폐 조직 내에서의 간극 연접 의사소통의 유지는 폐 섬유증을 예방하기 위해 중요하며, 코넥신의 감소된 양은 가스 흡입, 공중운반되는 유해 물질 및방사선 조사와 같은 다양한 독성 자극으로 염증성 과정으로의 반응으로서 보여진다. Cx43 티로신 잔기를 인산화시키고, 헤미채널 폐쇄 및/또는 간극 연접 개방 또는 간극 연접 의사소통을 촉진시키는 본 발명의 화합물로의 전처리는 예컨대, 폐암, 유방암의 치료, 갑상선 및 식도암에서의, 폐가 노출된 치료적 방사선 조사 이전에 나타날 것이다.

헤미채널 폐쇄 및/또는 간극 연접 개방을 촉진 또는 매개하는 화합물로의 처리는 폐기종, 석면증, 규소폐증, 폐 섬유증, 폐렴, 약물 유도성 폐 섬유증에서의 폐 기능의 악화 및 니트로젠 디옥사이드와 같은 폐질환 독성 가스에 노출된 환자에서의 폐 기능 악화를 추가로 예방할 수 있을 것이다. 치료는 바람직하게는 이들 증상의 통상적인 치료에 부가될 것이다. 본 화합물은 경구적, 비경구적, 비강으로 또는 폐 흡입을 통해 투여될 수 있다.

C. 민무늬 근육

1. 혈관계

간극 연접 채널을 통한 세포간 의사소통은 혈관 가지를 통한 혈관 근육세포 톤을 조정 및 조절하는 것에 있어서의 기초적인 역할을 한다(Christ GH 등, Circ Res. 1996; 79: 631-646). 간극 연접 의사소통의 또다른 중요한 역할은 혈관 이완 반응에 포함된 민무늬근 세포 중에서의 과다분극의 유포이다(Benny JL 등, Physiol Heart Circ Physiol 1994; 266: H1465-72).

내피의 특별화된 기능은 단층 내에서의 내피 세포 사이 및 내피와 혈관벽에 존재하는 다른 세포 사이의 간극 연접 세포간 의사소통을 요구한다. 모든 다른 혈관에서 뿐만 아니라 모세관에서의 간극 연접을 통한 이들 이종 세포 유형간의 의사소통은 여러 연구에서 보고된 바 있다. 적응성 동맥형성에서의 관여의 증거 또한 증명된 바 있다(Cai W-J 등, J Mol Cell Cardiol 2001; 33: 957-67), Wang H-Z 등, Am J Physiol Cell Physiol. 2001; 281: C75-88), Schuster A 등, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001;280: H1088-96)).

내피 단층이 다이어트 유도성 하이퍼콜레스테롤레믹(Hypercholestrolemic) 손상 중에서 파괴된 상이한 혈관 병리 생리학적 상황에서, 간극 연접 의사소통은 혈관 민무늬근에서 감소된다(Polacek D 등 J Vasc Res 1997; 34: 19-30). 내피 세포층에서의 손상은 정맥울혈 동안 및 혈전정맥염이 발병된 때 보여진다. Kwak BR 등, Molec Biol Cell 2001; 12: 831-845는 간극 연접 의사소통이 내피 손상 동안의 세포 이동을 조정하는 것을 도와주며, 또한 혈관 신생 동안의 모세혈관의 싹틈에 중요하다는 것을 명확하게 증명한 바 있다.

헤미채널 폐쇄 및/또는 간극 연접 의사소통을 촉진하는 본 발명의 화합물로의 치료는 피해입은 혈관 부위에서의 손상된 세포간 의사소통을 개선시킬 것이며, 특히 기관 허혈, 예컨대, 간헐 파행 및 심근경색 동안에 특히 유용할 것이다.

그러나 래트 목동맥에서의 풍선 도자 손상(baloon 카테터 injury) 후, 혈관 치료 과정은 증가된 간극 연접 의사소통에 의해 특징지워진다(Yeh hI 등, Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997;17:3174-84). 적합한 발명 화합물은 풍선 시술 전에 투여될 것이고, 바람직하게는 이 증상의 통상적인 의학 치료에 부가하는 요법이다. 화합물의 투여는 바람직하게는 비경구적인 것이다. 효과는 풍선 도자 손상전 및 후의 상이한 시간에 샘플링 된 조직에서 시험될 수 있다. 내피 표면의 더 빠는 치료는 통상적인 현미경을 이용하여 볼 수 있다. 간극 연접 의사소통의 개선 또한 찾을 수 있다. Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997;17:3174-84를 또한 참조.

2. 발기기능장애

음경 해면체에서 합포체성(syncytial) 세포 망은 간극 연접을 통해 수립되며, 발기기능에 중요하고, 단일한 형태 및 공동작용되는 형식으로 음경해면체 및 음경 기둥의 동맥 민무늬근세포를 확보해준다. (Christ GJ.(Int JImpot Res. 2000; 12 suppl.4:S15-25), Melman A,ChristJC. (Urolog ClinNorthAmerica. 2001; 28:217-31)). 장애있는 발기기능은 당뇨병, 동맥경화, 다른 신경학적 질환 및 만성 질환에서 보여진다. 당뇨병에 대한 연구로부터, 신경 분포 및 세포간 커플링 간의 반대의 상호작용이 간극 연접을 통한 기능적 세포간 의사소통을 수립하지 않음에도 불구하고 음경 해면체 환경의 잠재적 기능성 유연성을 지적했다.

헤미채널 폐쇄 및/또는 간극 연접 개방을 촉진하는 화합물로의 치료는 간극 연접을 통한 의사소통을 개선함으로써 음경 해면체 및 혈관에서의 민무늬근 세포들 간의 복합체 공동작용을 정상화할 수 있다.

Rehman J, 등(Am JPhysiol 1997 ; 272: H1960-71)에 의해 기술된 바 대로 래트(8주령)에서 스트렙토조토신(35 mg/kg i. p. ) 유도 당뇨병 후 10주, 화합물의 발기 기능의 생체내 약학적 시험이 테스트될 수 있다. 음경 반사 및 음경해면체내 압력이 상이한 헤미채널 조절 화합물의 상이한 투여량의 국소 및 전신 투여 동안에 동일한 조사 그룹에 의해 설명된 측정법 및 기술로 측정된다. 25% 이상의 음경 반사 및 음경해면체내 압력의 증가를 볼 수 있다.

발기부전의 치료는 음경 해면체에 국부적으로, 피하주사로서 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 치료는 단일요법 또는 이 증상의 통상적인 치료에 부가될 수 있다.

3. 실금

뇨 방광에서의 민무늬 근육은 위상 수축에 의해 특징지워지며, 자발적 위상 수축을 보인다. 그러나 건강한 상태에서의 방광은 증가된 방광내압을 보임없이 수백밀리미터의 뇨를 보유할 수 있다. 건강한 방광과는 대조적으로, 불안정한 방광은 절박 뇨실금과 관련된 방광내압에서의 자발적인 증가를 나타낸다 (TurnerWH, Brading AF.(Pharmacol Therap. 1997; 75: 77-110). 위장관 민무늬 근육과 비교하여, 방광 민무늬 근육은 공동작용할 수 있는 수축을 자발적으로 생성하지 않는다(Stevens RJ, 등(Am JPhysiol. 199; 2777:C448-60), Hashitani H, 등 (J Physiol. 2001; 530: 273-86) ). 방광에서의 민무늬근 세포 간의 간극 연접을 통한 전기적 및 형태학적 의사소통이 최근 증명된 바 있다(Hashitani H 등, (J Physiol.2001; 530: 273-86), Wang H-Z, 등(Urology. 2001; Suppl 6A:111)). 이들 간극 연접의 중요성은 의사소통의 특이적 저해에 의해 증명되었다. 방광 민무늬근에서의 자발적 여기의 파장은 간극 연접을 통해 전파된다.

그러므로 비조절되는 절박 뇨실금은 헤미채널 폐쇄 화합물 또는 간극 연접 오프너(opener)로의 치료를 통해 조절될 수 있다. 투여는 비경구적으로, 경구적으로 또는 방광으로 일 수 있다. 투여는 바람직하게는 뇨 방광에서의 근육 수축을정상화시키는 것으로 여겨지는 약물로의 치료에 부가적일 수 있다.

악하선관, 요도, 담즙관, 이자관, 누관내에 존재하는 근육상피세포는 간극 연접과 연관되어 있으며, 세포간 의사소통은 근육상피세포들의 수축기능의 동시성을 위해 필수적이다(Taugner R, Schiller A. (Cell Tissue Res. 1980;206:65-72). 이러한 관들에서의 장애있는 수축은 비경구적으로 또는 경구적으로 투여된 헤미채널 폐쇄 화합물 또는 간극 연접 오프너로의 치료에 의해 정상화될 수 있다.

D. 치유

화합물 1 및 화합물 2와 같은, 헤미채널 폐쇄 제제 또는 간극 연접 오프너로의 치료의 예방 효과는 Yeh HI 등(Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997;17:3174-84)에 의해 기술된 바와 같은 실험적 준비에서 시험될 수 있다. 화합물 1 또는 화합물 2는 예컨대, 상기 기술된 칼슘클로라이드 유도된 부정맥 모델에서 결정된 바대로, 화합물의 생물학적 역학에 따른 10-11 내지 10-8의 범위에서의 투여량을 사용하여 풍선 시술 전에 투여될 수 있다. 조직은 풍선 도자 손상 전 및 후의 상이한 시간에 샘플링 될 수 있다. 내피 표면의 더욱 빠른 치유는 통상적인 현미경을 이용하여 볼 수 있을 것이다. 화합물의 투여는 예컨대, 비경구적으로 할 수 있다.

치유는 지혈(응고)로 시작되는 중복되는 기의 연속으로 진행된다. 치유과정의 두번째 기는 다른 성분 중 섬유모세포 및 림프구를 포함하여 소식세포가 상처 주변에서 축척되고, 육아 조직의 형성되기 시작하는 염증성 반응의 연속단계이다. 그 후, 상피 세포는 그 지역을 회복하기 위해 상처의 가장자리로부터 이동하기 시작할 것이다. 정상 조직으로부터 상처로의 모세 혈관의 싹틈 또한 영양소, 산소 및다른 세포의 공급을 확보하기 위해 포함된다. 모든 세포 및 모세혈관 내피 세포는 간극 연접을 통한 생기있는 의사소통을 갖는다(AbdullahKM, 등 (Endocrine. 1999; 10:35-41). 괴사 조직, 당뇨병, 동맥경화, 수술 상처, 부종, 감염, 화상 상처 및 정맥 부전증에서의 상처에서 종종 볼 수 있는 낮은 산소 공급 및/또는 고농도의 자유 라디칼을 갖는 지역은 간극 연접 의사소통이 저하될 것이다 (Nagy JI, 등 세포 GrowthD 1996; 7:745-51)).

헤미채널 폐쇄 화합물 또는 간극 연접 오프너로의 치료는 복잡한 회복 과정 에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지는 상이한 세포 간의 최대의 간극 연접 의사소통을 확보함으로써 상처 회복을 개선할 수 있을 것이다. 화합물은 국소적으로, 전신적으로 또는 경구적으로 투여될 수 있다.

E. 당뇨 망막병증

당뇨 망막병증은 혈액 흐름의 속도에서의 변화(Bursell S-V,등 (Curr Eye Res. 1992; 11: 287-95), 혈액-망막 장벽에서의 파괴 (Cunha-Vaz JG, 등(BrJ Ophthalijiol. 1975; 59: 649-56), Do Carmo A, 등 (Exp Eye Res. 1998; 67: 569-75) ) 및/또는 자가조절의 손실 (Kohner EM, Patel V, Rassam SMB. (당뇨병 1995; 44: 603-607) )을 동정함으로써 병의 발병 후 매우 조기에 진단될 수 있다. 추적자 수송 및 이중 세포 패치 클램프 기술 모두를 이용하여 Oku H, 등(Invest Ophthalfnol Vis Sci. 2001; 42: 1915-1920)은 광범위한 세포-대-세포 커플링을 증명하였다. 간극 연접 경로의 폐쇄는 망막의 미세혈관의 다세포적 조직화를 파괴하고, 당뇨성 망막 혈관 기능장애에 기여한다. Zhou ZY, 등 (Neuroscience. 2001;102: 959-67)은 추가로 글루타티온이 공급될 때, 활성 산소가 망막의 간극 연접의 언커플링(uncoupling) 또는 리커플링(recoupling)에 관여함을 증명하였다.

당뇨 망막병증에 대한 헤미채널 클로저(closer)의 효과는 상기 기술된 바와 같이 스트렙토조토신 유도 당뇨병 래트 모델을 이용하여 시험관내에서 연구될 수 있다. 신선하게 격리된 망막의 미세혈관(Sakagami K, etal.JPhysiol (Lond). 1999; 521: 637-50)은 Oku H, 등 (InvestOphthalmol Vis Sci. 2001 ; 42: 1915-1920)에 의해 기술된 커버슬립으로 옮겨질 것이다. 이 제조에서 세포벽에서의 세포 간의 세포간 의사소통은 염료 또는 추적자로 측정될 것이다. 10^-10-10^-7M의 범위 내의 상이한 농도의 본 발명의 화합물은, 예컨대, 간극 연접 오프너 화합물 1 또는 화합물 2는 시험될 수 있으며, 기저선과 비교하여 세포간 의사소통에서의 유의미한 증가가 당뇨병성 망막에서 보일 것이다. 대조군과 비교할 때, 유사한 개선을 볼 수 있을 것이다(건강한 동물). 치료는 전신적, 국소적 또는 경구적일 것이다. 치료요법은 바람직하게는 통상적인 항당뇨병 치료에 부가적이다.

당뇨 망막병증 뿐만 아니라 예를 들어 동맥경화와 같은 망막에서의 다른 혈관 이상은 Cx 티로신 인산화를 도와주는 화합물로 치료함으로써 헤미채널의 증가된 폐쇄 또는 개선된 간극 연접 의사소통으로부터 이득을 얻을 수 있다. 화합물은 비경구적으로 투여될 수 있다.

F. 심장 장애

1.심방-심실(AV) 차단

심장 방실결절(cardiac av node)에서의 세포간 의사소통은 간극 연접을 통해 유지된다. 감소된 기능은 감소된 전도를 이끌며, 전체적인 a-v 차단을 이끌 수 있다.

AV 차단은 급성 심근경색증, 허혈성 심장 질환, 디지탈리스 중독, 칼슘 채널 차단제 중독에서 보여지며 헤미채널 폐쇄 화합물은 av 전도를 개선시킬 것이다. 헤미채널 폐쇄 화합물은 비경구적으로 또는 경구적으로 될 수 있다.

2. 심방 세동

Nao 등 (2001)은 만성 심방 세동 (AF)으로 고통받는 환자들의 심근세포에서 코넥신40의 감소된 세린 인산화를 발견했다. 코넥신의 감소된 세린 인산화는 AF를 이끌 수 있는 세포의 언커플링과 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 만성 AF의 이 증상이 또한 코넥신의 감소된 티로신 인산화에 특징이 있다면, 여기에서의 화합물 1 또는 2과 같은 화합물로의 치료가 티로신 인산화를 증가시키고, 헤미채널을 닫고, 간극 연접 채널을 열고 AF의 원인을 제거할 수 있을 것이다.

3.허혈/재관류 손상

국부적 허혈 동안, 심장은 차례로 조직 압력을 증가시키고, 허혈성 경계 지역 조직의 관류를 감소시키는 세포 종창을 야기하는 대사적 스트레스에 노출된다.

허혈성 경계 지역에서의 감소된 관류는 심장 기능의 추가적 손상과 관련되는, 경색의 점진적 유포에 기여하는 것으로 여겨진다. 실시예 7 및 8에서 보이는 대로, 화합물 1은 허혈 동안의 세포 종창을 예방하고 경색 크기를 감소시키며, 심근 경색 후의 심장 기능의 손상을 예방한다.

또한, 관상 관류는 혈전용해제의 투여 또는 경피경관혈관성형술 (PTCA)에 의해 심근경색증을 가진 환자들에게서 재수립될 수 있다. 혈액 흐름의 회복이 심근 구제를 위해 필수불가결함에도 불구하고, 재관류 그 자체가 "재관류 손상"으로 알려진 허혈 단독에 의해 생성된 추가적 조직 손상을 이끌 수 있다. 재관류 손상에 기여하는 것으로 제안된 메카니즘은 산소 자유 라디칼 과부하, 호중구-매개 심근 손상, 세포내 칼슘 과부하, 및 삼투압 환경에서의 변화를 포함해 다수이다(Wang 등, Cardiovasc Res. 2002 Ju1 ; 55(1) : 25-37. Review).

체액의 오스몰 농도는 대부분의 세포가 정상 조건 하의 삼투압에서의 변화를 경험하지 않으나, 삼투압 변화는 허혈, 패혈 쇼크, 및 당뇨 혼수와 같은 병리학적 상태에서 발생할 수 있다는 것이 알려져 있다. 오스몰 농도에서의 변화의 일차적 효과는 세포 부피를 빠르게 변화시키는 것이다. 세포 주위에서의 오스몰 농도가 감소된다면, 세포는 팽창하게 되며, 만일 증가한다며, 세포는 찌그러지게된다. 오스몰 농도의 변화를 용인하기 위해, 세포는 세포부피를 정상화하고 정상 기능을 유지하기위해 삼투압적 공격에 의해 활성화된 부피 조절 메카니즘을 발전시켜왔다. 심장에서, 삼투압적 스트레스는 심근 허혈동안 락테이트와 같은 대사체가 세포내적으로 및 특정 정도로 세포외적으로 축적될 때 맞딱드리게되며, 세포 종창을 야기한다. 이 종창은 고삼투압 세포외 환경이 정상삼투압 혈액(normosmotic blood)에 의해 대체될 때, 추가로 재관류로 악화될 수 있으며, 이는 심장의 세포막의 파열을 야기할 수도 있다(Wright AR, Rees SA. :Pharmacol Ther. 1998 Oct; 80(1) : 89-121. Review). 따라서, 본 발명에 따른 선택된 화합물은 재관류 동안의 심근 손상을 예컨대, 실시예 7에 기술된 효과와 유사한 메카니즘에 의해, 예방할 수 있을 것이라고 여겨진다(도 9A).

또한, 통상적으로 사용되는 PTCA 과정 동안, 죽상경화판은 파열되어 PTCA 과정의 부위의 말단의 미세순환계에서의 미세색전술을 야기하며, 이는 심장 기능부전의 증속된 진행 및 증가된 치명성과 관련된다 Henriques JP 등 :.Eur Heart J 2002 Jul ; 23 (14): 1112-7). 실시예 7 및 8에서 보이는 바대로, 화합물 1은 허혈 동안의 세포 종창을 예방하고, 경색 크기를 감소시키며, 심근경색 후의 심장 기능의 손상을 예방하고, 이러한 특성의 화합물은 재관류 동안 손상을 감소시킬 것이다.

따라서, 본 발명은 그러한 치료를 필요로 하는 포유동물의 조직 또는 기관을 세포보호하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 방법은 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 의해 표현된 화합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. "세포보호하는"이라는 구는 원치않는 세포 종창과 관련된 증상을 감소, 예방 또는 완화시키는 것을 의미한다. 그 방법으로부터 이익을 얻을 특정한 조직 및 기관은 심장 또는 신장과 같은 섬유피막에 의해 갇힌 또는 다른 방식으로 영향을 받는 것들을 포함한다. 또한 뇌, 척수 및 골수와 같은 뼈와 연관된 조직도 포함된다.

한 구체예에서, 방법은 추가로 여기에서 기술된 것과 같은 허혈성 증상에의 포유동물의 조직 또는 기관이 노출되는 것을 포함한다. 실시예는 유해한 심근세포 종창과 관련된 허혈에서의 심근 경색(심장 발작)이다. 한 구체예에서, 그러한 종창은 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH₂ (화합물 1) 및 Ac-Gly-Asn-Tyr-NH₂(화합물 2) 중 적어도 하나를 포유동물에게 투여함으로써 감소 또는 피할 수 있다.

논의한 바대로 포유동물에서의 재관류 손상을 예방 또는 치료하는 방법이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 의해 표현되는 화합물을 구성하는 그룹으로부터 적어도 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 보다 구체적인 예에서, 방법은 추가로 경색 증상으로의 포유동물의 심장을 포함한다. 본 방법에 따르면, 일반적으로 가능한한 빨리 관상 동맥 관류를 수립하는 것이 바람직하다. 일부 구체예에서, 방법은 추가로 혈전용해제 (예컨대, 조직 플라즈미노겐 활성화제 ("TPA") )의 투여 또는 경색된 심장으로 관상동맥 관류를 촉진시키기 위한 관상동맥 혈관성형술의 제공을 포함한다. 한 구체예에서, 화합물은 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH₂ (화합물 1) 및 Ac-Gly-Asn-Tyr-NH₂ (화합물 2) 중 적어도 하나이다.

G. 면역학: 세포 성숙

세포-대-세포 상호작용은 림프구 성숙 및 활성화에 결정적이다. 넓은 범위의 막 분자들은 면역계에서 세포 이동 및 활성화 동안의 세포-세포 신호전들을 가능하게 하는 것을 보장해준다. 순환하는 인간 T, B 및 NK 림프구는 Cx43를 발현하며, 세포들 사이의 활성 간극 연접은 앞서 기술된 대로 염료 방법을 이용하여 증명된 바 있다. 세포간 간극 연접 커플링에서의 감소가 면역계에서 대사적 협동에 기초하는 메카니즘의 중요한 요소인 간극 연접을 통한 세포간의 신호전달을 표시하는 IgM, IgG 및 IgA의 분비를 눈에 띄게 감소시킨다는 것이 또한 증명된 바 있다(Oviedo-Orta E, 등 (Immunology. 2000; 99: 578-90), Oviedo-Orta E, 등 (FASEB.2001; 15: 768-774) ).

준만성 또는 만성 염증에서, 이뮤노글로블린 합성에서의 국부적 증가는 원하게는 병인학에 독립적이다. 염증 동안, 조직은 종종 정상적인 건강한 조직과 구별되며, 낮은 산소 분압은 세포간 간극 연접 의사소통의 연합해제를 생산한다. GJIC 연합해제에 대한 낮은 산소 분압의 중요성은 산소 분압이 GJIC의 일반적인 조절자라는 것을 제시하는 수개의 상이한 세포들에서 증명된 바 있다. 상기 연합해제는 간극 연접 채널에서의 코넥신의 변화된 티로신 및/또는 세린 및/또는 트레오닌 인산화의 결과이며, 여기에서의 화합물 1 또는 2과 같은 본 발명의 화합물의 투여는 이 효과를 방해하고, 헤미채널을 닫고, GJIC를 복구할 수 있다.

H. GJIC의 개선

간극 연접 채널 개방의 유지 또는 헤미채널의 도킹(docking)의 촉진에 의해 기본적으로 GJIC를 유지하는 두가지 방식이 있다. 허혈 증상의 존재에 특징이 있는 질환 상태의 치료 또는 예방에 있어서, 두 방식 모두 바람직한 또는 추천할 만한 것이다.

신생 래트 심실 심장근세포의 일차적 배양에 있어서, 산소 및 글루코스의 결손은 보통의 대기 및 영양 조건의 대략(app.) 50% 수준에서 포스포이노시톨 (PI) 전환의 노르아드레날린-유도 자극에 있어서의 감소를 이끈다. 간극 연접 수정자 화합물 1은 정상 수준의 대략 90%로 PI 전환을 올림으로써 산소 및 글루코스 결핍 동안의 PI 전환의 이 손상된 노르아드레날린-유도 자극을 정상화시키는 것이 보여진다.

또한 화합물 1은 보통의 대기 및 영양 조건 동안 PI 전환의 노르아드레날린-유도 수준을 변화시키지 않는다는 것이 보여졌다(Meier, E 및 Beck, M M: 2001 International Gap Junction Conference, Aug 4-9,2001, Hawaii, USA, abstract no. 132). 유사하게, 배양된 인간 골모세포 배지 및 골모세포의 래트 골육종 세포주에서, 저산소증은 루시퍼 옐로우 주입(Lucifer Yellow injections) 후 염료 이동을 측정한 바 세포내 칼슘 파장을 감소시켰다. 이 감소는 화합물 1로의 치료에 의해 완전하게 역전될 수 있다(Teilmann, S C, 등: 2001 International Gap Junction Conference, Aug 4-9, 2001, Hawaii, USA, abstract no. 176).

염증 동안의 세포적 연합해제(uncoupling)에 기인하여, 예를 들어, 헤미채널을 닫고 간극 연접을 여는 화합물은 염증 동안의 이뮤노글로블린의 합성을 개선할 것이다.

I. 말초신경병증 및 신경병성 통증

당뇨병, 투석 동안, 간경변증 및 많은 다른 증상에서 보이는 말초신경병증 및 통증이 체신경 및 자율신경 모두에 관련됨이 보고된 바 있다. 다양한 증상에서의 말초 신경 손상의 정확한 메카니즘은 조사 중에 있으나, 신경 말단 파괴, 감소된 전도성, 탈수질 및 증가된 염증성 반응이 설명된 바 있다. 다양한 증상에 대한 실험 준비의 공통은 증가된 자유 라디칼, 증가된 니트릭 옥사이드, 산소 스트레스 및 자유 라디칼 청소부(scavengers)가 보이고 간극 연접 의사소통의 축소가 기록되는 것이다(Pitre DA, 등 (Neurosci Lett. 2001; 303: 67-71), Bolanos JP, Medina JM.(JNeurochem. 1996; 66: 2019-9), Low PA, Nickander, KK. (Diavetes. 1991;40: 873-7), Levy D, 등 (Neurosci Lett. 1999; 260: 207-9),Bruzzone R, Ressot C. JEur Neurosci. 1997; 9: 1-6)). 따라서, 헤미채널 코넥신을 인산화함으로써 헤미채널 폐쇄를 돕는 본 발명의 화합물은 말초신경병증의 치료에 유용할 것이다. 투여는 비경구적일 것이다.

J. 청각 장애

자유 라디칼의 생산과 연관되어 있는 것으로 알려진 소음 유도 청력 소실, 노인성난청은 코르티 기관으로부터의 헨센 세포 및 다이테르스 세포 둘 사이의 간극 연접 커플링의 저해와 관련된다(TodtI 등(J Membrane Biol. 2001 ; 181: 107-114), Blasits S, 등(Phlugers Arch. 2000; 440: 710-12) Lagostena L, 등(J Physiol.2001 ;531 :693-707)). 이들을 지지하는 달팽이 세포 간의 간극 연접 의사소통은 감각 세포에 대한 항상성을 제공함으로써 바깥털세포의 정상적인 신경 활성을 제공한다(Johnstone BM, 등 (J Physiol 1989 ; 408: 77-92) ). 이 의사소통은 산화적 스트레스 동안 중단된다(Todt I 등(J Membrane Biol. 2001; 181: 107-114). 후천성 또는 나이 의존성 청각 소실은 코넥신 헤미채널에서의 티로신 잔기의 인산화를 증가시키고, 지지세포에서의 간극 연접 의사소통을 유지할 수 있는 화합물로 치료될 때 예방할 수 있을 겄이다. 본 발명의 적합한 화합물은 비경구적으로 투여될 수 있다.

전정기관 흑색 세포 지역에서의 멜라닌세포는 간극 연접을 통해 대량으로 의사소통을 하고 있으며, 내림프 및 외림프간의 물질을 수송하는데 있어서 중요한 역할을 할 수 있고, 또한 내이에서의 미세환경의 항상성을 유지하는데 있어서도 중요성이 있다(Masuda M, 등 (Anat Rec. 2001; 262; 137-146) ). 내림프 수종은 현기증 및 감소된 청력에 특징이 있는 다양한 임상적 증상에 관련된다. 간극 연접 의사소통의 감소된 능력은 특별한 유형의 수송체를 통한 본래 분비된 또는 배설된 여러 물질의 막관통 수송을 조절하는데 있어 중요성이 있다.

K. 나이 의존성 빈혈(Age dependent anemia) 및 골수 이식

조혈성 선구 세포 및 조혈성 미세환경의 간질 세포 간의 기능적 간극 연접의 존재는 수년간 쟁점이었으나, 연구는 현재 인간 간극 연접 의사소통의 존재를 증명한 바 있다 (Rosendaal M, 등 Tissue Cell. 1991; 23: 457-470), Durig J, 등 (Brit J Haematol. 2000; 111: 416-25) ). 간질 세포가 조혈성 선구 세포의 증식적 행동을 조절하며, 또한 그들의 기능적 상태는 미성숙된 조혈성 세포에 의해 조절될 수 있다는 가설을 유리하게 하는, 의사소통이 양방향성임이 증명되었다(Gupta P, 등 (Blood. 1998 ; 91: 3724-3733) ).

나이를 먹음에 따라, 조혈성조직의 기능성은 감소되며, 빈혈은 나이든 사람에게서 종종 볼 수 있다. 조혈성 조직의 감소된 능력은 또한 혈액암에서 및 화학치료요법으로의 치료 후에 볼 수 있다. 공여자로부터의 골수 이식은 범혈구감소증을 예방하곤 한다.

헤미채널 폐쇄를 도와주고/거나 간극 연접 의사소통을 촉진하는 본 발명의 화합물의 효과는 높은 투여량의 사이클로포스포아미드에 노출된 전처리된 레트에서 연구될 것이다. 이들 동물에서 골수는 성숙한 조혈성 세포를 생산하기를 멈춘다. 사이클로포스포아미드 후의 다른 시간 간격에서 많은 세망세포가 전처리 되지않은동물과 비교하여, 10^-1M 내지 약 10^-8M 화합물 1의 약 100㎕의 투여량을 사용하여 코넥신 티로신 인산화된 화합물 1로 전처리된 동물에서 유의미적으로 더 높아질 것이다. 본 발명의 적합한 화합물의 투여는 비경구적일 것이다.

L. 뇌하수체 및 시상하부 기능저하

뇌하수체 전엽으로부터의 호르몬은 분, 시간, 일 및 계절 내에서 분비에 있어 일주기성의 변화를 보인다. 대부분의 일주기성 리듬에 대해 담당하는 신경계의 부분은 시신경교차상부핵으로 알려진 시상하부 내의 한쌍의 구조로 지역화되어 있다. 이것의 중심 내의 이 생물학적 시계는 각각의 세포 내에서 본질적이다. 그러나 공동작용하는 전기적 활성은 간극 연접 의사소통을 통해 이웃하는 세포에 매개된다(Col웰 CS. (JNeurobiol. 2000; 43: 379-88) ). 또한 뇌하수체 전엽은 직접적인 신경분포가 결여되어 있기 때문에, 선 내의 간극 연접-매개 세포-대-세포 의사소통은 적당하고 시간에 맞는 호르몬 분비를 보증하기 위해 필요한 알맞은 세포-대-세포 공동작용 및 동시성을 위해 필수불가결한 것일 것이다(Vitale ML 등(Biol Reporo.2001;64:625-633)). Guerineau NC 등(J Biol Chem. 1998;273:10389-95)은 자발적으로 활성인 내분비세포가 단일 단위 또는 뇌하수체 전엽에 걸쳐 흩어져 있는 동시화된 간극 연접-결합된 집합 내에 배열된 것이라는 것을 결론지었다. 자발적 흥분성 세포들 간의 동시성은 기초 분비의 패턴을 모양짓는 것을 도울 수 있다. 뇌하수체 전엽으로부터의, 성장호르몬, 프로락틴, 부신피질 호르몬, 갑상선 호르몬, 고나도트로핀 호르몬은 시상하부 자극 호르몬으로부터의 조절 하에서 합성된다. 그러므로, 하나의 축 내의 복잡한 시상하부-뇌하수체-내분비선의 리듬 장애에서의 하나의 메카니즘은 또한 간극 연접을 통한 감소된 의사소통과 관련되어 있다. 그 질병들은 요붕증, 저생식샘자극호르몬생식샘저하증, 미소에데마(myxoedema), 부신피질 기능저하증 및 소인증이다. 본 발명의 적당한 화합물, 바람직하게는 간극 연접 오프너로의 치료는 그 증상을 개선할 수 있다.

또한, 시상하부의 시신경교차상부핵 내의 뉴론은 최적의 간극 연접 의사소통에 의존한다. 상기 언급한 축 내에서 이들 지역에서의 활동의 방식으로 간극 연접 오프너는 또한 불안한 일주기성 리듬에 견디기 용이하다(Shinohara K 등(Neusosci Lett. 2000; 286: 107-10).

M. 신혈관성 고혈압 및 신독성

신장 내에 넓게 분포된 신장 및 내피의 특별한 간극 연접은 사구체내 모세혈관 및 사구체근접 세동맥을 포함한 사구체염, 세관 및 맥관계에서 찾을 수 있다 (Haefliger J-A, 등 (Kidney Int.2001 ; 60:190-201)). 그러한 연구에서 저자들은 들세동맥의 레닌-분비 세포을 연결하는 간극 연접의 존재를 증명했다. 간극 연접의 역할은 증가된 혈압에 의해 유도된 것과 같은 혈액 매개 신호의 탐지 및 전파에 기여할 것이다. 신장 내에서, 그러한 신호는 들세동맥의 내피 세포에 의해 자가분비, 측분비 및 내분비 자극으로 전환되며, 레닌-분비 세포로 전해질 필요가 있다. 따라서 간극 연접 의사소통은 상호연결된 사구체근접 기관을 형성하는데 중요한 역할을 한다. 간극 연접 채널의 변화를 닫는 빠른 개방은 추가로 생리학적 요구에서의 레닌 분비 뿐만 아니라 사구체 및 세뇨관 기능을 맞추도록 요구되는 계속되는 피드백을 보장하는 국부적인 혈관의 변화에 재빨리 대응하는 것을 암시한다. 손상된 신장의 간극 연접 의사소통에 특징이 있는 질환은 경구 또는 비경구적으로 투여되는, 본 발명의 화합물, 바람직하게는 특별한 간극 연접 오프너로의 치료로 이로울 수 있다.

중금속은 신독성이며, 신장의 손상을 야기한다.

독성 금속 카드뮴(Fukumoto M, 등 (Life Sciences. 2001 ; 69: 247-54) ) 및 래트 인접 세관으로부터의 일차 세포배양에서 수은 (Yoshida M, 등 (Arch Toxicol. 1998; 72: 192-96))이 간극 연접을 연합해제시키며, 두 그룹은 신장 기증저하가 감소된 세포간 의사소통과 관련되어 있다는 것을 제시한다는 것이 증명된 바 있다. 코넥신티로신 인산화 화합물로의 중금속 중독의 치료는 조직 손상을 감소시키고, 진행성 조직 황폐화를 예방할 것이다.

시험관내 시험은 세관 세포로부터의 세포 배양 중에서 수행될 수 있고 중금속에 노출될 때 간극 연접 연합 해제의 화합물 (약 10^-1-10^-7M의 농도의 화합물 1 또는 화합물 2) 예방이 조사될 것이다. 간극 연접 의사소통은 이전에 기술한 대로 루시퍼 염료 방법으로 시험될 것이다.

실험 동물(래트)에의 중금속 전신 투여 후, 신장의 기능은 사구체 여과율에 대한 제거 표지자로서³H-인슐린을, 신장의 혈장 흐름에 대한 제거 표지자로서¹⁴C-표지된 테트라에틸암모늄을, 그리고 인접 세뇨관 기능에 대한 표지자로서 리튬을 이용하여(Petersen JS, 등J.Pharmacol. Esp. Ther. 1991,258 : 1-7) 중금속으로의만성 치료의 전 및 상이한 시간 후에 측정했다. 화합물 1과 같은 본 발명의 특별한 화합물로의 만성 치료는 신장의 기능이 손상될 때 개시될 수 있으며, 신장의 기능 파라미터(사구체 여과율 및 혈압)의 유의미한 개선은 하기의 치료에서 보여질 수 있다. 적합한 본 발명의 화합물의 투여는 비경구적일 것이다.

비-감염성 염증 및 상이한 미생물로의 감염은 감소된 사구체 여과율, 전해질 및 물의 감소된 배설 및 혈압에서의 변화에 의해 또한 특징을 갖는 신장 기능에서의 중요한 비 특이적 만성 변화를 유도한다. 이러한 증상의 일부는 특별한 코넥신티로신 인산화 화합물로 잘 치료될 것이며, 증상은 쇠퇴할 것이다.

N. 치아의 발생 및 재형성

Murakami S 및 Muramatsu T (Anat Embryol. 2001; 203: 367-374)는 간극 연접 의사소통이 상아질모세포들 간에 존재한다는 것 및 세포적 활성이 이들 세포간 브릿지를 통해 공동작용된다(Iguchi Y, 등 (Arch Oral Biol. 1984; 29: 489-497))는 이전의 연구를 확인하였으나, 그들의 최근 연구에서 그들은 또한 이들 간극 연접 의사소통이 어린 및 나이든 상아질모세포 중의 상아질모세포에서 뿐만 아니라 치아(전-상아질모세포)의 초기 발생 동안에도 존재한다는 것을 증명했다. 또한 상아질세포의 기초가 되는 치수 세포가 간극 연접을 갖는다. 이러한 발견은 세포간 간극 연접 의사소통이 치아의 형성 동안 및 치아가 재성형되는 때 또는 썩었을 때 일생동안 모두 중요하다는 것을 나타낸다.

여기에서 기술된 골모세포 분석과 필수적으로 비교되는 분석에서 상자질모세포에 미치는 효과에 대해 시험관내에서 시험될 수 있는, 화합물 2와 같은 본발명의코넥신인산화 화합물로의 치료는 치아의 손상된 발생을 정상화시킬 것이다. 치료는 또한 치아의 재형성 및 충치에 보다 저항성있는 치아를 만들 것이다.

O. 줄기 세포

Lumelsky 등 (2001)은 마우스 배아 줄기 세포로부터 인슐린 및 기타 이자 내분비 호르몬을 분비하는 세포를 만들어냈다. Nadya Lumelsky 등 Differentiation of Enabryonic Stem Cells to Insulin-Secreting Structures Similar to Pafzcreatic Islets. Science, 292,1389-1394, 2001) 참조. 삼차 구조의 덩어리를 형성하는 세포 자체-집합은 위상기하학(topology)에 있어서 뉴런과의 닫힌 연합관계에 있는 이자세포 유형의 정상적인 이자섬과 유사하다. 글루코스는 생체내에서 사용된 이것들과 유사한 메카니즘에 의해 이들 세포 덩어리로부터 인슐린 방출을 자극한다. 당뇨병 래트에게 주사되었을때, 인슐린-생산 세포는 빠른 혈관화를 겪고, 덩어리진, 섬과 같은 조직을 유지한다.

임상적 정황에서, 이 배아 줄기 세포-기초한 시스템은 동시적 세대 및 인슐린-분비 및 인슐린 분비의 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 기타 섬 세포 유형의 기능적 구조단위로의 집합을 허용할 것이다. 이러한 단위는 인슐린 생산을 최적화하고, 글루코스 항상성의 정밀한 조절을 분석할 물질을 제공할 것이다. 유전적 도구가 섬 발달 및 기능의 분자적 근간을 정의하는데 이용될 수 있으므로 배아 줄기 세포는 이들 연구에 대해 이상적이다. 세포-기초 치료법의 잠재성은 인간 및 비인간의 줄기 및 배아 종자 세포를 포함하는 적용에 대해 분명히 매력적인 목표이다. 성인의 조직 또한 기능적 이자 세포의 유용한 공급원일 수 있다. 여기에서 기술된 분화 시스템은 당뇨병 치료를 위한 기능적 이자 섬의 공급원을 제공할 수 있다. 이는 내분비 이자의 수개의 세포 유형이 시험관내에서 배아 줄기 세포로부터 생성될 수 있음을 보여주는 첫번째 보고이다. 시체로부터 얻은 이자섬이 이식 후 간에서 기능할 수 있음에도 불구하고, 조직 거부 및 이용성의 문제는 해결되어야할 것으로 남아있다. 장기이식에 대한 면역호환적 조직의 풍부한 공급원을 생산하는 배아 줄기 세포의 공학은 당뇨병과 관련된 이러한 그리고 기타 문제들을 극복하는 증대하는 약속을 잡고 있다.

심근경색증은 조직의 손실 및 심장 기능수행의 손상을 이끈다. 남아있는 근육세포는 괴사 조직을 재건할 수 없고, 경색-후 심장은 시간에 따라 악화된다. 표적 기관에의 손상은 멀리 떨어진 줄기세포에 의해 감지되며, 줄기세포는 손상의 부위로 이동해 대리의 줄기 세포 분화를 겪는다; 이러한 현상은 구조적, 기능적 복구를 촉진한다. 높은 정도의 줄기 세포의 유연성은 Orlic 등 (Nature 410,701-705 (2001))이 경색된 래트에서 골수세포를 이식함으로써 죽은 심근이 복구되 수 있는지를 시험하도록 자극시켰다. 그들은, c-키트 발현에 근거해 분류하는, 형광 활성화된 세포에 의해 증강된 초록 형광 단백질을 발현하는, 유전자 조작 마우스로부터 혈통 부정(Lin-) 골수 세포를 분류했다. 심장 결찰 직후에, Lin-c-kitPOS 세포는 경색부에 접하는, 수축하는 벽에 주입되었다. 골수 세포를 이식한 9일 후에 새롭게 형성된 심근이 심실의 경색된 부분의 68%를 차지함이 밝혀졌다. 발생하는 조직은 증식 하는 근육세포 및 혈관 구조를 포함했다. 그들의 연구는, 국부적으로 유도된 골수 세포가 새로이 심근을 생성할 수가 있어, 관상 동맥 질병의 결과를 완화시킬수 있음을 나타낸다.

이러한 근육세포의 특성을 한층 더 특징지우기 위해서, 그들은 코넥신 43의 발현을 결정했다. 이 단백질은, 근육세포간의 원형질-막 생성을 통한 세포간 연결과 전기적인 커플링을 담당한다; 코넥신 43은, 세포 세포질 내에 있고 긴밀히 연합한 분화하는 세포의 표면에서 있는 것이 명백했다. 이러한 결과는, 심장 근육 표현의 예상된 기능적인 능력과 일치했다.

기능적인 세포가 배의 줄기 세포로부터 생성되고, 코넥신이 경색된 심장 조직 중의 이러한 세포에서 실제로발현되므로, 이것이 배아의 줄기 세포로부터 분화된 다른 세포를에 대한 경우가 될 것이라고 여겨진다. 코넥신이 이러한 조직(이자의 베타 세포 및 심장 근육 세포를 포함)의 기능에 지배적인 역할을 하기 때문이다. 코넥신 티로신 인산화 및 헤미채널 폐쇄(또한 증가한 간극 연접 의사소통에 의한 결과)를 증가시키는 화합물 1 및 화합물 2와 같은 본 발명의 화합물은 줄기 세포가 이식된 기관 중의 기능적인 세포로의 배아 줄기 세포의 증식을 향상시킬 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 당뇨병의 치료용 이자, 심장 경색의 치료 심장, 및 파킨슨의 질병의 치료용 뇌의 기초 신경절과 같은 이식된 기관에서 줄기 세포의 기능적인 세포로의 전환을 촉진하는 화합물 1 및 화합물 2와 같은 코넥신 티로신 인산화 화합물을 제공하는 것이다.

일반적으로, 이러한 화합물이 줄기 세포의 분화를 가속시키며, 이는 심장, 뇌, 피부, 뼈, 이자, 간장 및 다른 내장과 같은 모든 기관에서의 치료 과정을 가속시킬 것이라고 여겨진다. 실험은 Orlic 등에 의해 위에 기술된 바와 같이 심근경색을 갖는 일반적인 실험의 설계를 이용해, 화합물 1 및 화합물 2의 투여로, 예를 들어 증식 과정동안 반복적으로, 수행될 수 있다. 이러한 실험은, 화합물 1 및 화합물 2에 의한 코넥신 43 발현의 증가를 또는 보다 빠른 재생 과정을 보여줄 거라고 여겨진다.

P. 암

1. 종양 진행

종양형성 동안, 그들의 이웃하는 세포와 정상적인 세포의 생리학적 상호작용의 중단, 및 분화의 특성의 손실은, 종양 형성에 있어 공통적인 요소이다. 간극 연접 의사소통에서의 변화는, 세포 종양형성 동안의 가장 이른 변화 중에 있다고 여겨진다((Wolburg H,Rohlmann A.Int Rev Cytol. 1995; 157: 315-73) Klaunig JE, Ruch RJ 1990;135-46).

Kyung-Sun Kang, 등 (Cancer Letters 166 (2001) 147-153)은 TPA 치료된 래트 간 상피 세포에서 GeO2로 선- 및 공-배양이 종양 촉진의 예방 또는 저해에 GJIC의 저해를 회복시키는 물질이 이용될 수 있음을 제시하는, TPA에 의한 GJIC의 하-조절을 라기하는 것을 보인 바 있다. Suzuki J, Na H-K, 등 (Nutrition 및 Cancer, vol 36 No. 1 p. 122-8)은 잘 기록된(well-documented) 종양 프로모터 포르발 에스테르(TPA)의 그것과 유사하게 식품첨가물 람다카라제난이 래트 간 상피 세포 중의 GJIC를 저해하므로, 종양촉진제로서 발암에서 중요한 역할을 할 수 있음을 보인 바 있다. 따라서 본 발명의 화합물은 TPA 및 람다-카라제난과 같은 종양 촉진제에 의해 야기된 암의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

2. 약물 민감성 저항

증가된 간극 연접 의사소통은 종양에서의 미세환경을 개선한다. Chen 등: Chem Biol Interact 1998 Apr 24; 111-112: 263-75 참조.

3. 전이

세포간 간극 연접 의사소통의 손실은 전이적 가능서을 지닌 모든 암에서의 높은 전이적 가능성과 관련되어 있다 (Saunders MM, 등 Calicel-Res. 2001; 61:1765-1767), Nicolson GI, 등 Proc. Natl Acad Sci USA. 1988; 85: 473-6) ). 전이의 예방은 종양에서의 간극 연접 의사소통을 예벙하는데 도움을 줄 코넥신티로신 인산화 화합물로의 치료에 의해 수립될 수 있다. 치료는 통상적인 화학요법에 부가적이다.

치료학상 유효량으로 본 발명의 화합물 중 하나 또는 그 배합(예컨대, 화합물 1 또는 화합물 2)의 투여가 암을 예방 또는 치료할 수 있다고 여겨진다.

Q. 잡종 세포

간극 연접은 또한 위점막 세포에서의 세포간 의사소통, 증식 및 분화에서 중요한 역할을 한다. 간극 연접 오프너는 유도된 손상 후의 재생성 과정을 자극할 것이다(Endo K, 등 (J Gastroenterol Hepatol. 1995; 10: 589-94) ).

반월상연골 세포(meniscal cell)의 세포구축은 부분적으로 간극 연접 의사소통에 의존한다. 힘줄의 섬유연골 구조 뿐만 아니라 반월상연골의 섬유연골 일부도 세포간 의사소통에 의존한다. 손상 동안 간극 연접 오프너는 회복의 속도를 개선할것이다.

R. 간질

간극 연접 채널을 연합해제하는 것을 제공하는 약물 또는 소 조절 분자의 흡수를 허용하기 위해 바람직하게는 보조 치료법으로서, 헤미채널 오프너로 비정상적으로 높은 GJIC에 특징이 있는 간질과 같은 질환 상태를 치료하기 위해 바람직할 것이다.

본 발명의 목적은 여기에서 기술된 하나 이상의 의학적 징후 또는 증상을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 일반적으로, 배제적인 것은 아니나, 그러한 방법은 징후 또는 증상의 심각도를 치료, 예방 또는 감소시키기에 충분한 양으로, 상기 화합물 중 적어도 하나, 바람직하게는 같은 것 중 하나의 투여를 포함할 것이다. 바람직한 화합물은 여기에서 기술된 시험관내 및 생체내 분석 중 하나 또는 그 배합에 의해 선택될 수 있다. 특정 투여 전략은 당업자에게 명백하며, 예컨대, 성별, 몸무게, 일반적 건강 및 치료 또는 예방될 특별한 징후 또는 증상에 따라 변할 것이다. 논의된 바대로, 여기에서 개시된 화합물은 본 발명 방법에서 단독의 활성 제제로서 사용될 수 있다. 다르게는, 그들은 인정된 치료 방법이 지시하는 것과 결합한 화합물의 사용과 같은 "부가적" 요법으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 치료 또는 예방될 바람직한 징후 또는 증상은 일반적으로 손상된 세포적 의사소통 또는 손상된 간극 연접 기능과 관련된다. 본 발명과 관련된 보다 구체적인 징후 및 증상은 상기에서 논의했다.

본 발명에 따른 치료 방법은 단독 활성 제제로서 여기에서 기술된 하나 이상의 화합물을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 화합물 중 하나가 사용될 것이다. 필요하다면, 그러한 화합물은 예방적으로, 즉, 특정 징후 또는 증상의 심각도를 예방하거나 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 다르게는, 화합물은 인정된 치료 접근법과 함께 사용될 수 있다. 구체예에서 설명한 바대로, 방사선 조사가 치료되면, 치료 방법은 "부가적" 즉, 치료하는 증상을 위해 인정된 치료법과 함께 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 그러한 "부가적" 치료 방법은 필요에 따라 동시에 또는 인정된 치료법 뒤의 이시에 수행될 수 있다. 다양한 질환 및 의학적 증상에 대한 수립된 치료학상 접근법은 설명된 바 있다. 일반적으로, Harrison's Principles of InternalMedicine (1991) 12 ed. , McGraw-Hill, Inc. 및 Pharmacological Basis of Therapeutics (1996) Goodman, Louis S. 9th ed Pergammon Press, 예를 들어; 여기에 참고문헌으로서 포함된 개시물을 참조.

치료학적 조성물 중의 하나 이상의 치료 화합물의 농도는 투여될 헤미채널 조절 화합물의 투여량, 사용될 조성물의 화학적 특성 (예로써, 소수성) , 및 투여의 계획된 방식 및 경로를 포함한 많은 인자들에 따라 변화될 것이다. 일반적으로, 헤미채널 조절 화합물 중 하나의 하나 이상은 비경구 투여를 위한 약 0.1 내지 10% w/v 의 화합물을 포함하는 수용성 생리학적 완충 용액으로 제공될 것이다.

주여진 치료법에서 사용되는 실질적으로 바람직한 양의 활성 화합물은 예컨대, 이용될 특정 화합물, 제제화될 특정 조성물, 투여의 방식, 대상체의 특성, 예컨대, 종, 성별, 몸무게, 일반적 건강 및 대상체의 나이에 따라 변화할 것이다. 투여의 주어진 계획에 대한 최적의 투여율은 이전의 가이드라인과 관련하여 이끌어낼 수 있는 통상적인 투여량 결정 실험을 이용하여 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 적합한 투여량 범위는 일일 체중량의 약 1㎍/kg 내지 약 100mg/kg을 포함할 수 있다("치료학상 유효량").

본 발명의 치료학적 화합물은 양자화되고 수용성인 형태로, 예로써, 약제학적으로 허용되는 염, 일반적으로 무기산 부가염, 예로써, 하이드로클로라이드, 설페이트 또는 포스페이트 염, 또는 아세테이트, 말레이트, 퓨마레이트, 타트레이트 또는 시트레이트 염과 같은 유기산 부가염과 같은 산 부가염으로 적합하게 투여될 수 있다.

본 발명의 치료학적 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 또한 금속염, 특히 소듐 염 또는 포타슘 염과 같은 알칼리 금속 염; 마그네슘 또는 칼슘 염과 같은 알칼리 토금속 염; 암모늄 또는 테트라메틸 암모늄 염과 같은 암모늄 염; 또는 리신, 글리신, 또는 페닐알라닌 염과 같은 아미노산 부가 염을 포함할 수 있다. 추가적으로 적합한 염은 아래에 제공된다.

본 발명의 보다 특정한 헤미체널 조절 화합물은 약제학적으로 허용되는 염, 알킬 에스테르, 아미드, 알킬아미드, 디알킬아미드 또는 선형 화합물의 C-말단 카르복실산 기능 또는 존재한다면, 사이클릭 화합물의 자유 카르복실산 기능으로 형성된 하이드라지드의 형태로 사용될 수 있다. 선형 화합물 중 아미드 및 저급 알킬 아미드는 바람직한 본 발명의 화합물 중에 있다. 염은 산 부가염 및 염기 부가염과 같은 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 산 부가염의 예는 이미 기술된 바 있으며, 하이드로클로라이드 염, 소듐염, 칼슘염, 포타슘 염 등을 포함한다. 염기 염의 예는 양이온이 소듐 및 포타슘과 같은 알칼리 금속, 칼슘과 같은 알칼리 토금속, 및 암모늄 이온⁺N (R³)₃(R⁴)(여기서, R³및 R⁴는 임의로 C_1-6-알킬, 임의로 C_2-6-알케닐, 임의로 아릴로 치환된, 또는 임의로 헤테로아릴로 치환된 것을 나타낸다)로부터 선택되는 염이다. 약제학적으로 허용되는 염의 다른 예는; 예로써, Remington's Pharmaceutical Sciences 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed. ), Mark Publishing Company, Easton, PA, U. S. A. , 1985 및 보다 최근 판, 그리고 Encyclopedia of Pharmaceutical Technology에서 기술된 것들이다.

본 발명의 치료학적 방법에서, 치료 화합물은 여러 방식 중 임의의 것으로 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 및/또는 생체내 분석에서 제공된 하나 또는 그 배합에서 선택된 헤미채널 조절 화합물은 발명을 예방하거나 표적 증상의 심각성을 줄이기 위한 예방책으로서 투여될 수 있다. 다른게는 화합물은 표적 증상의 과정 동안 투여될 수 있다.

치료화합물은 단독으로 또는 하나 이상의 치료학적 제제와 함께 병용하여, 통상적인 부형제, 즉, 활성 화합물과 해롭게 반응하지 않고, 수용자에게 해가 되지 않는, 비경구적, 장관, 비강내 적용에 적합한 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기 담체 물질과 혼합된 약제학적 조성물로서 대상체에게 투여될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 이에 제한되는 것은 아니나, 물, 염용액, 알콜, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탁토스, 아밀로스, 마그네슘 스트레아레이트, 탈크, 실릭산, 비스코스 파라핀, 퍼퓸 오일, 지방산 모노글리세리드 및 디글리세리드, 페트로에트랄 지방산 에스테르, 하이드록시 메틸-셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다. 약제학적 제제는 멸균될 수 있으며, 필요하다면 보조 제제,예로써, 활성 화합물과 해롭게 반응하지 않는 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압을 움직이는 염, 완충액, 색소, 향료 및/또는 방향 물질 등을 포함한다.

그러한 조성물은 비경구적 투여를 위해, 특히 액제 또는 현탁제의 형태로; 경구 투여를 위해, 특히 정제 또는 캡슐제의 형태로; 비강내로, 특히 분제, 점비제 또는 에어로졸의 형태로; 질로; 일반적으로 예컨대 크림의 형태로; 직장으로, 예컨대 좌약으로, 등의 사용을 위해 제조될 수 있다.

약제학적 제제는 단위 투여량 형태로 통상적으로 제조될 수 있으며, 약제학 기술에서 잘 알려진 방법 중 임의의 것, 예로써, Remingtora's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. , Easton, Pa. , 1980)에 기술된 것과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다. 비경구적 투여를 위한 제제는 일반적인 부형제로서 멸균수 또는 식염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 수소화된 나프탈렌 등을 포함할 수 있다. 특히, 생체호환가능한, 생분해가능한 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체는 본발명의 특정한 헤미채널 조절 화합물의 방출을 조절하기 위한 유용한 부형제일 수 있다.

다른 강력하게 유용한 비경구적 운반 시스템은 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투압 펌프, 이식가능한 주입 시스템, 및 리포좀을 포함한다. 흡입 투여를 위한 제제는 부형제로서, 예를 들어, 락토오즈를 포함하거나, 또는 예를 들어, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴에테르, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 포함하는 수용성 액제, 또는 점비제의 형태로의 투여를 위한 유성 액제, 또는 비강제 적용을 위한 겔로서 일 수 있다. 비경구적 투여를 위한 제제는 또한 구강 투여를 위한 글리코콜레이트, 직장 투여를 위한 메톡시살리실레이트, 또는 질 투여를 위한 시트르산을 포함할 수 있다. 다른 운반 시스템은 외과적 부위에 직접적으로 치료학적제제를 투여할 수 있다, 예컨대 풍선 혈관성형술 후 헤미채널 조절 화합물은 스텐트의 사용을 위해 투여될 수 있다.

약어 및 화학식:

명세서 및 청구항에서, 천연 아미노산에 대해 세개의 문자 코드가 사용되었을 뿐만 아니라 사르코신 (Sar), α-아미노-이소-부타노산 (Aib), 1-나프틸알라닌(1Nal) 및 2-나프틸알라닌(2Nal)을 포함한 나프틸알라닌 (Nal), 페닐글리신 Phg, 2,4-디아미노부타노산 (Dab), 2,3디아미노프로파노산 (Dapa), 및 하이드록시프롤린 (Hyp)과 같은 다른 α-아미노산에 대해 세 개의 문자 코드가 일반적으로 허용된다. Hyp가 4-하이드록시프롤린을 나타내는 것을 명기한 곳은 없다. 천연 또는 필수 아미노산은 단백질의 아미노산 구성성분이다. 방향족 아미노산은 Phe, Tyr, Trp,1Nal, 2Nal 및 His이다. L 또는 D 형태가 명기되지 않은 경우 당해 아미노산은 천연 L 형태를 갖는 것으로 이해된다, 참고. Pure & Appl. Chem. Vol. 56 (5) pp595-624 (1984). 명기되지 않은 경우, 본 발명 화합물의 C-말단 아미노산은 유리 카복실산으로서 존재하며, 이는 또한 "-OH"로서 명기될 수 있다. 본 발명 화합물의C-말단 아미노산은 말단 기능기"-OH/NH₂"을 갖는 것으로 보여질 수 있으며, 이는 화합물의 두개의 바람직한 형태: 유리 카복실산 및 아미드화된 유도체가 있는 것을 의미한다.

다른 방식으로 명시하지 않는 한, 하기 특정한 정의가 적용된다:

ASAL는 4- 아지도살리실로일 라디칼을 말하고; AB는 4-아지도벤조일 라디칼을 말하며; Fmoc는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 라디칼을 말하고; Ac는 아세틸 라디칼을 말한다. 본 명세서를 통해, 다른 방식으로 명시하지 않는한 다음의 정의가 적용된다; Acm는 아세트아미도메틸 라디칼을 말하고; T4c는 L-티아졸리딘-4-카복시실산 라디칼을 말하며; Pc는 L-피페콜산 라디칼을 말하고; DNP는 디니트로페닐을 말하며 ; DBF는 2-아미노에틸-6-디벤조푸란프로피오산으로 정의되고 ; Acm는 아세트아미도메틸을 말하고; Sar는 사르코시닐 라디칼을 말하며; DNP 기능기는 항체 인식을 위한 합텐이고, DNP 부위를 포함하는 본 발명의 화합물은 바람직하게는 조사 도구로서 사용될 수 있다. 추가 정보를 위해 PCT/DK01/00127 (WO01/62775) 및 PCT/US02/05773 (WO 02/077017)를 또한 참조.

여기에서 기술된 모든 참고 문헌은 참고 문헌으로서 포함되어 있다. 하기 실시예는 본 발명의 설명적인 것이다.

참고 실시예 1: 표준 생체내 마우스 부정맥 분석

마우스에서 칼슘-유도 부정맥 모델을 수행함으로써 항부정맥 효과에 대해 시험하는 것이 가능하다.

요약하면, 화합물의 항부정맥 효과는 J. J. Lynch, R. G. 등 JCardiovasc. Pharmacol. 1981,3 49-60 의 모델에 따른 칼슘-유도 부정맥의 생체내 모델에서 시험될 수 있다. 마우스(25-30 g)를 신경이완 마취 배합물(힙놈(Hypnorm^ⓡ)(펜타닐 시트레이트 0.315 mg/ml 및 푸아니손 10 mg/ml) + 미다졸람 (5 mg/ml))으로 마취시켰다. 힙놈 및 미다졸람을 증류수로 희석하고 일부분의 희석된 힙놈을 일부분의 희석된 미다졸람과 함께 섞었다.

마취는 0.05- 0.075㎕/10 그램 마우스의 투여량으로 s. c. 투여에 의해 유도되었다. i.v. 캐뉼러가 꼬리정맥으로 삽입되었다. 리드 II ECG 신호(lead II signal)가 오른쪽 앞다리 및 왼쪽 뒷다리 상의 스테인레스 스틸 ECG 전극의 배치에 의해 계속적으로 기록되었다. 그라운드 전극(ground electrode)이 오른쪽 뒷다리 사엥 위치했다. 신호를 증폭시키고(x 5.000-10.000) Hugo Sachs Electronic model 689 ECG module (0.1-150 Hz)을 통해 여과시켰다.

아날로그 신호를 12 비트 데이타 포착 보드(Data Translation model DT321)를 통해 디지털화시키고, 1000 Hz에서 Windows NT에 대한 Notocord HEM 3.1 소프트웨어를 이용하여 샘플링했다. 10분의 평형 기간 후, 약물의 시험 샘플이 꼬리정맥으로 주입되었다. 마우스는 비처리된 동물에서의 대조군 수준의 측정으로 시험된 비히클로 선-시험되었다. 주사 부피는 모든 실험에서 100㎕였다. CaCl₂(30 mg/ml, 0.1 ml/min 100mg/kg/min (칼슘클로라이드-2-하이드레이트, Riedel-de Haen, Germany))의 주입은 약물 또는 비히클의 i. v. 투여의 3분 후 시작했다. 2번째 등급의 AV-차단의 개시의 시간의 지체는 CaCl₂주입의 시작으로부터 첫번째 부정맥 현상이 발생한 때까지의 시간으로써 측정되었다. 2번째 등급의 AV-차단은 부수된 QRS 복합 없는 P-파장에 특징이 있는 AV 전도의 간헐적 실패로서 정의된다.

반응은 비히클 처리된 마우스에서 2번째 등급의 AV-차단이 발생할때까지의 시간에 상대적으로 표현된다. 시험된 물질 각각의 최대 효과는 합산되었다.

좋은 간극 연접 조절 활성을 갖는 후보화합물을 검출하기 위한 보다 특정한 방법은 표준 생체내 마우스 부정맥 분석에서 적어도 약 20% (적어도 2 스코어)에 의한 유도 심방 심실 (AV) 차단의 개시까지의 시간을 지연시키는 후보화합물을 선별하는 것을 추가로 포함한다. 보다 바람직한 화합물은 분석 유도 AV 차단(적어도 3 스코어)의 개시까지의 시간의 적어도 약 60%의 지연을 나타낸다.

하기 실시예는 래트 신생아 심장근세포에서 간극 연접 채널을 열고 헤미채널을 닫는 화합물1의 능력을 보여주는 기능적 분석을 제공한다. 따라서 헤미채널 및 간극 연접 채널 모두의 티로신 인산화에 의한 GJIC의 특수화된 조절을 얻는 것이 가능하다.

실시예 1- 항부정맥 화합물

본 발명에서 사용된 화합물은 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH₂ (화합물 1) 및 Ac-Gly-Asn-Tyr-NH₂ (화합물 2)를 포함한다. 화합물은 WO01/62775에서 기술된 표준 고체상 합성에 따라 합성된다. 본 발명에서 유용한 화합물의 추가적 실시예는 트랜스-레스베라트롤 및 CAPE (카페산 펜에틸 에스테르)이다. 화합물들을 만들기 위한 방법은 기술된 바 있다. 예로써, PCT/DKO1/00127 (WO01/62775) 및 PCT/US02/05773 (WO02/077017) 출원 참조.

실시예 2 - 글루코스 제거에 의해 유도된 대사적 스트레스의 분석

심장의 부정맥은 활동전위의 형성 및 전도 모두의 방해에 의해 야기될 수 있다. 세로에서 세포로의 활동 전위의 지연은 세포간 간극 연접에 의해 매개된다. 이러한 간극 연접은 코넥신이라고 불리는 특별화된 단백질에 의해 구성된 채널로 구정되어 있다. 감소된 발현 및/또는 코넥신의 파괴된 분포가 정상적인 자극 전달에 해로울 수 있으며 그에 따라 부정맥유발적이라는 것을 보여주는 수개의 라인의 증거가 있다. 하나의 실시예가 허혈 동안 및 후 보여지는 변화이다. 급성 허혈 동안, 세포의 연합해제는 주로 세포내 산성화, 증가된 세포내 Ca²⁺, 감소된 세포내 ATP 및 증가된 장-쇄 아실카르니틴 및 지방산[1,2]의 농도에 의해 야기되는 것으로 여겨진다. 허혈의 급성 기 후, 경색된 부위 및 그의 가장자리 부위의 구성이 변화하는 재형성이 발생한다. 이러한 재형성은 부정맥유발성 기질로서 작용하는 것으로 믿어지는, 잠재적인 리엔터런트 순환의 발생 및 코넥신 재배열의 부위와 관련된다[3]. 생체내 및 시험관내 연구들은 항부정맥 펩티드의 그룹이 부정맥의 개시을 지연시키고 저해할 수 있음을 보여준 바 있으며, 그 후의 연구들은 이들 펩티드가 세포간의 전기적 커플링을 증가시킴을 보여준 바 있다[2].

A. 방법

1. 세포 배양: 요컨대 20마리의 신생아 래트(1-2일령)으로부터 무균적으로 심장을 도려냈다. 심실을 분리하고 4-6조각으로 자르고, 이를 트립신 및 DNAse와 함께 한크 완충 식염수 중에서 여러 단계에서 소화시켰다. 그리고나서 세포를 원심분리하고, 5 % FCS를 갖는 MEM 중에서 재현탁시켰다. 비-근육 세포를 제거하기 위해 현탁액을 페트리디쉬에서 30 분동안 37℃에서 프리플레이팅(preplate)했다. 현탁액 중에서 세포을 콜라겐 코팅된 커버슬립 상에 씨딩했다. 씨딩 밀도는 융합성 배양을 주기에 적당할 것이다.

2. 전자생리학: 융합성 심장근세포를 가진 커버슬립을 역전된 현미경의 상태의 개방 챔버에 설치하고, 37 ℃에서 1 ml/min의 흐름으로 주어진 비중에 의해 둘베코코스 인산 완충식염수(PBS)를 뿌렸다(superfused). 용액(PBS)은 (mM로): Na+ 152, K+ 4.2, Cl- 141.5, P043- 9.5, Ca2+ 0.9, Mg2+ 0.5, pH 7.4를 포함한다. 패치 클램프 피팻은 Sutter FlamingBrown P-87 마이크로일레트로드 풀러 상에서 1.5 mm 글래스 모세관(GC150F-15, Harvard Apparatus)으로부터 끌어냈으며, 불은 4-6 MW의 저항성으로 다듬어졌다. 피펫은 mM로: K+ 150, Na+ 15, Cl-5, Gluconate-150.2, EGTA 5, HEPES 5, Ca2+ 2 mM, Mg2+ 1.6, pH 7.2를 포함하는 세포내 유사 용액으로 채워졌다.

패치 클램프 기구는 동시적 불연속 증폭기 (SEC-05LX, NPI electronics)로 구성되며, 데이터는 INT-10 인터페이스(NPI electronics) 및 PC1200 데이터 포착보드(National Instruments)를 이용해 디지털화시켰다. 전류 및 전압 신호 모두 증폭기의 내부 필터를 이용하여 1 kHz에서 로우 패스 여과시켰으며, 10 kHz에서 디지털화했다.

세포는 PatchMan 5173 미세조작장치(Eppendorf)를 이용하여 전극으로 접근시켰다. 세포와의 접촉이 얻어졌을 때 (입력 저항에서 갑작스런 증가가 보여짐), 기가 실 구성(Giga seal configuration)이 수립될 때까지 흡입이 적용된다. 그 후, 짧은 펄스의 흡입이 피펫 아래에서 막을 깨뜨리기 위해 적용된다. 그 후, 막전위를 관찰하기 위해 제로-전류 클램프 모드로 놓는다.

일정 거리(1 cm)를 떨어뜨린 양극성 백금전극이 배양을 진행시기키 위해 사용된다. 맞춰진 세포 내에서의 자극 인공물 및 활동 전위의 양상 간의 지연은 전도 속력의 측정이다.

세포를 0.1g/㎕ BSA를 가진 컨트롤 용액으로 자극-활성화 간격(SAI)에서 안정한 기저선이 수립될 때까지 부었다. 그 후, perfusate를 15분 동안 글루코스 없는 용액으로 변화시키고, 계속해서 화합물 1 (10^-8M)로 20 분 동안 자극시켰다. 동시에, 대조금 실험이 화합물 1을 가함이 없이 유사한 시간규모에서 유도되어 수행되었다. 데이터는 배지로부터 글루코스를 제거하기 이전의 기저선에 상대적인 퍼센트 변화로서 표현되었다.

B. 결과

도 2에서 설명한 바대로, 글루코스 제거에 의한 대사적 스트레스 유도는 글루코스 제거가 전도 속력을 지연시켰음을 제시하는 자극-활성화 간격에서의 근소한 증가를 만들어냈다. 대조적으로, 10 nM 농도의 화합물로의 뿌림(superfusion)은 자극-활성화 간격을 감소시켰다, 즉, 화합물 1은 배양된 일차 심장근세포에서의 전도 속도를 증가시켰다. 이러한 데이터는 화합물 1이 심장근세포에서의 세포-대-세포 커플링을 증가시킴을 나타내는 것이다.

참고문헌: [1] Carmeliet, E. Cardiac ionic currents 및 acute isc헤미a: from channels to arrhythmias. Physiol Rev., 1999,79 : 917-1017.

[2] Dhein, S. Cardiacgapjutictions. Pliysiology, regulation, pathophysiology andphariiiacology. Karger, Basel, 1998.

[3] Peters, N. S. 및 Wit, A. L. Myocardial architecture and ventricular arrhythmogenesis. Circulation, 1998,97 : 1746-1754.

실시예 3-면역침강 및 인산화된 코넥신의 분석

이 실시예에서 사용된 화합물은 표준 고체상 Fmoc 화학을 이용하여 만들어졌다. 이전의 실시예 참조. 동정은 질량 분광계 및 RP-HPLC에 의해 결정된 순도에 의해 수행되었다. 원래 위치에(In situ) 결합 및 동물 연구는 하기 펩티드(화합물 1)가 나노-몰라 범위에서 수용체에 결합한다는 것을 보여주었다. 1nM, 1OnM, 50nM 및 100nM에서의 화합물 1로의 초기 연구는 뒤따르는 펩티드 화합물 3 (H-GAG-4-Hyp-PY-NH₂) 및 화합물 4 (H-GNY-NH₂)로의 연구가 수행될 것인지를 결정할 수 있다.

이들 연구는 또한 특이적 키나아제 저해제를 포함한 연구가 수행될 것인지를 결정할 수 있다.

H9c2 세포를 24-멀티 웰 디쉬에 7,900세포/cm(~ 15, 000 세포/웰)의 농도로 씨딩하고, 3일 동안 10% 소태아 혈청 (FCS) 및 1000 유닛 페니실린/1000 ㎍ 스트렙토마이신(pen/strep)이 보충된 MEM 중에서, 5% C0₂및 100% 습도, 37℃의 대기에서 길렀다.

표지된 세포를 트리톤 X-100 용해 완충액 (~5*10⁷세포/ml) 중에서 1시간 동안 4℃에서 배양했다. 용균물을 30분동안 20,000 * g 로 원심분리시켰다. 상청액을 200㎕ 상청액 당 10 ㎕ 세파로즈를 첨가함으로써 사전보증했다(precleared). 그리고나서, 사전보증된(precleared) 상청액을 0.5-1㎍ 포스포-티로신 또는 포스포-세린 항체 (Sigma)를 가하고, 및 오르비탈 쉐이커에서 1.5시간 동안 4℃에서 배양시켰다. 그 후, 항체-복합체를 50㎕의 1: 1 슬러리의 단백질 G 세파로즈로 1.5 시간동안 배양에 의해 포획했다. 마지막으로, 복합체를 0.1% (w/v) 트리톤 X-100,50 mM Tris, pH 7.4,300 mM NaCl 및 5 mM EDTA로 광범위하게 세척했다.

복합체를 12% SDS 겔 상에 로딩하고, PVDF 막으로 블롯팅했다. 막을 0.1% Tween 20, 50 mM Tris, pH 7. 4, 300 mM NaCl, 5% 건조유 (TBST)로 최소 2시간 동안 블록킹시켰다. 막을 순차적으로 코넥신43 특이적 항체 (Zymed)로 1.5시간 동안 실온에서 배양시키고, ECL+ (Amersham)로 발현시켰다.

도 3A-B은 항-포스포티로신 항체가 사용된 이뮤노블롯을 보여준다.

Cx43 단편 인산화는 화합물 1 (3A-B) 및 화합물 2 (3B) 농도의 기능으로서 표시된다.

도 4A-B는 항-포스포세린 항체 (4A) 또는 항-포스포티로신 (4B) 항체가 사용된 이뮤노블롯을 보여준다.

실시예 4: 융합성 심장 근육세포에서의 헤미채널 활성 상의 화합물 1 펩티드의 효과

1. 세포 배양: 요컨대 20마리의 신생아 래트(1-2일령)으로부터 무균적으로 심장을 도려냈다. 심실을 분리하고 4-6조각으로 자르고, 이를 트립신 및 DNAse와 함께 한크 완충 식염수 중에서 여러 단계에서 소화시켰다. 그리고나서 세포를 원심분리하고, 5 % FCS를 갖는 MEM 중에서 재현탁시켰다. 비-근육 세포를 제거하기 위해 현탁액을 페트리디쉬에서 30 분동안 37℃에서 프리플레이팅(preplate)했다. 현탁액 중에서 세포을 콜라겐 코팅된 커버슬립 상에 씨딩했다. 씨딩 밀도는 융합성 배양을 주기에 적당할 것이다.

2. 염료-흡수: 심장근세포를 갖는 커버 슬립을 mM 로:Na+ 152, K+ 4.2, Cl-141.5, Po43-9.5, Ca2+ 0.9, Mg2+ 0.5, 글루코스 6, pH 7.4.를 포함하는 컨트롤 용액(PBS) 또는 허혈 미믹킹(mimicking) (손상) 용액(대조군으로서 오직 K+ 8.2, 글루코스 없음, 10 mM 데옥시-글루코스, pH 6.5), 200μM 칼세인을 포함하는 두 용액으로 30분 동안 배양시켰다. 그리고 나서 세포를 컨트롤 용액으로 10분 동안 세척했다.

커버슬립을 역전된 현미경의 상태에서 오픈 챔버 중에서 설치했다. 열 개의임의의 필드가 선택되고, 각각의 필드로부터 세 개의 세포가 통상적인 광학 현미경 하에서 선택되었다. 그리고나서, 세포를 480 nm 빛으로 자극시키고, 형광 방출을 510 nm에서 측정했다, 여기에서 방출 강도는 염료-흡수의 척도이다.

염료-흡수 상에서 화합물 1의 효과는 두 가지 조건 하에서 조사되었다:

실험 1: 이 계열의 실험에서, 세포는 30분 동안 칼세인이 있는 컨트롤 용액으로 배양시키고, 10분 동안 염료 없이 세척했다. 짝지워진 실험에서, 펩티드가 30분의 배양동안 가해진 동일한 실험이 수행되었다.

실험 2: 컨트롤 용액 대신 손상 용액으로 수행되었을 뿐 실험 1과 같음

3. 결과

신생아 래트로부터의 배양된 심장근세포에서의 칼세인의 흡수를 이용한 실험은 세포가 대사적 스트레스 (낮은 pH의 형태로, 증가된 세포외 K⁺및 데옥시글루코스 5-10 mM)에 노출되었을 때, 염료흡수가 대조군 세포에서 보다 38% 더 높다는 것을 보여준다.

이 효과는 세포가 화합물 1(10 nM, 데옥시글루코스 단독에 노출된 세포에 비해 짝찌워진 티-테스트(paired t-test)에서 P < 0.017, n=6)로 공배양될 때, 유의미하게 5%로 감소될 수 있다.

이들 결과는 대사적 스트레스 후 보여진 코넥신헤미-채널을 통한 증가된 막투과성이 화합물 1에 의해 저해될 수 있음을 보여준다. 이는 이러한 효과가 세포적 기능 및 생존에 유익할 것이라는 것과 유사하다. 또한, 배양된 H9c2 심장근세포 상에서의 인산화 실험은 화합물 1이 코넥신 43의 티로신 인산화를 매개한다는 것을 보여주었다. 또한, 4 시간 동안 0, 1, 10, 50 및 100 nM 화합물 1로 노출된 심장근세포는 코넥신43 티로신 인산화가 증가되었다. 티로신 인산화는 간극 연접 세포간 의사소통의 파괴를 매개하는 것으로 보고되었으며 및 칼세인 실험에서 보여진 막 투과성에서의 감소를 쉽게 설명할 수 있었다. 일부 실험에서, 화합물 1은 Ser-인산화를 감소시키는 것으로 발견되었다.

도 5는 배양된 심장근세포에서의 칼세인의 허혈-유도 흡수에 대한 1OnM 화합물 1의 효과를 보여준다.

실시예 5 - 부위-특이적 코넥신 인산화의 ELISA 분석

ELISA 샌드위치 분석은 멀티-웰 형식 (24-96 웰)에서의 세포 배양에서 뿐만 아니라 조직 샘플에서의 코넥신의 부위 특이적 인산화의 측정을 가능하게 하는 것으로 발전되었다. 웰은 당해 코넥신 타입에 대한 항체 (포획 항체)로 코팅되었다. 그리고나서, 세포 또는 조직 추출물은 4℃ o/n에서 포획 항체-코팅된 플레이트로 반응시켰다. 인산화된 포획 코넥신은 특이적 인산화 위치에 직결되고, 비오틴, FITC, TRITC 또는 퍼옥시다제와 결합된 항체로 탐지된다.

특이적 인산화 위치에 결합한 항체의 양은 다르게는 탐지항체의 종 IgG에 대한 방사성 표지된 또는 효소 결합된 항체로 측정될 수 있다.

그 원리는 포획 항체로서 마우스 항Cx43, 탐지 항체로서 래빗 항-Tyr-P (티로신 인산화 위치) 및 결합된 항-Tyr-P의 양을 측정하기 위한 I 또는 HRP (호스 래디쉬 퍼옥시다제)로 표지된 항-래빗 IgG를 이용하여 증명될 수 있다.

원리는 또한 포획항체로서 래빗 항Cx43 (5p. g/ml ; cat. no. 710700, Zymed Lab. Inc. , California, USA), 탐지항체로서 모노클로날 마우스 항-포스포티로신 (50pg/ml ; cat. no. P-3300, clone pt66, Sigma, MO, USA) 및 결합된 항-포스포티로신의 양을 측정하기 위한¹²⁵I (양 항-마우스 Ig cat. no. IM131, Amersham Biosciences, Wales, UK) 또는 퍼옥시다제 (당나귀 항-마우스 Ig; cat. no.715-035-151)로 표지된 항-마우스 전체 항체를 이용하여 증명될 수 있다.

도 6A은 바람직한 ELISA 탐지 형식을 도식적 형태로 보여준다. 도 6B 및 6C는 이들 실시예의 결과를 보여준다.

본 실시예 및 논의는 대사적 스트레스가 심장세포에서 코넥신헤미-채널을 열고, 이 개방은 화합물 1로의 배양에 의해 회피될 수 있다는 증거를 제공한다. 또한, 실시예 2-5는 대사성 스트레스 동안 화합물 1이 헤미채널을 닫는다는 것을 보여준다. 헤미채널에 의한 칼세인 흡수 상에서의 화합물 1의 저해적 효과, 즉, 헤미채널의 폐쇄과 일치하여, 실시예는 화합물 1이 코넥신 43의 티로신 인산화 상태를 조절하는데 있어서 돕는다는 것을 보여준다. 화합물 1은 간극 연접을 여는 것으로 알려져 있으며, 참고 WO01/62775, 코넥신의 탈인산화 저해가 간극 연접 채널의 폐쇄를 방해한다는 것이 알려져 있다. 따라서, 화합물 1의 유익한 간극 연접 개방 또는 조절 효과를 갖다는 것을 보여줄 수 있는 여기에서 제공된 화합물, 즉, 모든 항부정맥 펩티드는 WO01/62775에서 개시되어 있으며, AAP, AAP10, HP5 등과 같은 펩티드가 헤미채널 개방 또는 폐쇄의 조절자로서 본 발명에서 유용한 것으로 알려져있다. 또한 화합물 1이 Cx43의 티로신 인산화를 유지하거나 증가시킴으로써, 헤미채널 기능을 조절한다고 여겨진다.

실시예 6 - 심장근 세포에서의 염료 흡수

1. 방법

심실 근육세포를 트립신 분해에 의해 신생아 래트로부터 분리시키고, 콜라겐-코팅된 커버 슬립에 플레이팅했다. 4일 후, 근육세포는 융합 및 동시에 세포의 비팅 시트(beating sheets)를 형성했다. 염료 흡수를 측정하기 위해, 세포를 200LM 칼세인을 포함한 완충액에서 30 분 동안 실온에서 배양시켰다. 그리고나서, 커버슬립을 컨트롤 완충액으로 충분히 세척하고, 오픈 배쓰 챔버(open bath chamber)에 설치하고, 컨트롤 완충액으로 뿌렸다(RT). 세포를 제논 램프(Xenon lamp) 및 단색화장치(monochromator)에 의해 480mn 빛으로 자극시켰다. 510 nm에서 방출된 형광의 이미지는 냉각시킨(cooled) CCD 카메라(Sensicam)에 의해 모았다. 자극 조절 및 이미지 포착은 이미징 워크벤츠(Imaging workbench )(Axon)를 이용하여 조절했다.

광학 현미경 하에서, 상 내에서 세 개의 지역이 심장근세포에 걸쳐 위치되었다. 그리고나서, 평균 형광 세기가 측정되고, 10개의 상 내의 30개의 지역이 측정될 때까지 과정을 반복했다. 이들 측정의 평균은 주어진 실험의 상태에 대한 값, 즉 n=1로서 사용되었다. 각각이 계열에서 하나의 대조군 배양이 수행되었으며, 모든 실험 값은 이들 값에 상대적인 것으로서 주어진다.

용액: 컨트롤 완충액 (mM로): NaCl 136, KCl 4, MgCl₂0.8, CaCl₂1.8 HEPES5, MES 5, 글루코스 6, pH 7.3 스트레스 완충액 (mM로): NaCl 136, KCl 8, MgCl₂0.8, CaCl₂1.8 HEPES 5, MES 5, 데옥시-글루코스 10, pH 6.2

2. 결과

대조군 조건 하에서의 칼세인으로의 세포 배양은 일부 형광 염색을 주었으며, 이는 대부분 국한된 미립자 특성(localized particulate nature)이었다 ( 도 7A-C, 패널 B 참조). 배양된 근육세포의 위에, 트립판 블루로 즉시 염색된 말려진(curled up) 세포가 종종 관찰되었다. 이들 세포는 칼세인으로 짙게 염색되었고, 이들 세포에 걸쳐 측정지역이 위치하지 않도록 항상 주의를 기울였다. 세포가 대사 저해에 노출되었을때, 염색의 패턴이 변화했으며, 시토졸에 걸친 확산된 염색이 발견되었다(도 7C). 스트레스 동안 평균 강도는 대조군과 비교하여 36.2± 4.18 % 더 높았다(n=5, 짝지워진 t-테스트에서 P < 0.001).

이는 대사 저해가, 바람직하게는 코넥신 헤미-채널을 통한, 형광 염료의 흡수를 활성화시킨다는, 심장 및 다른 세포 유형에서의 발견을 확인해준다. 우리는 AAP 패밀리의 펩티드가 심장 조직에 그의 긍정적 영향을 미칠 수 있고, 헤미-채널의 활성화를 방해하도록 될 수 있고, 이에 따라 세포적 항상성이 개선될 수 있다는 메카니즘의 하나를 가정했다. 이를 조사하기 위해, 세포를 0.1 pM 및 10 nM 사이의 농도에서 ZP123의 존재하에서 스트레스에 노출시켰다. 결과는 도 8에 표현되었으며, 여기에서 각각의 데이터 점은 5 개의 실험을 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이 ZP123은 투여량-의존적으로 칼세인의 흡수를 감소시켰다. S자 모양의 기능을 이용하여, ED₅₀는 2.5 ± 1.0의 힐 계수로 3.3± 5.3 pM으로 측정되었다. 화합물 1에 의한 최대 저해 동안의 평균 강도는 대조군 보다 6.9± 1.7% 이상이었다.

실시예 7 - 심장근세포에서의 부피 측정:

1. 방법: 트립신 분해에 의해 신생아 래트로부터 심실 근육세포를 분리하고, 콜라겐-코팅된 커버 슬립 상에 플레이팅했다. 4일 후 근육세포는 융합 및 동시에 세포의 비팅 시트를 형성했다. 세포 부피 측정을 위해 세포를 칼세인- AM (컨트롤 완충액에서 5μM) 15 분 동안 37℃에서 로딩하고, 커버 슬립을 오픈 배쓰 챔버에 설치했다. 뒤따르는 실험은 실온에서 수행되었다. 라이카 레이져 공초점 현미경을 이용하여, 광학 크로스-섹션(cross-section)을 실험 기간에 걸쳐 매 20초마다 수행되었다.

광학 크로스-섹션은 Metamorph (Universal Imaging)를 이용하여 분석되었다. 세포의 지역은 배경 유도 파동(background induced fluctuations)을 최소화하기 위해 선택된 출발 수치보다 더 높은 형광 강도를 지닌 픽셀의 지역으로서 결정되었다. 데이터는 대조군 조건(대사적 스트레스 전 마지막 측정) 하에서의 평균 지역에 의한 각각의 값을 나눔으로써 상대적 부피로서 주어진다.

용액: 컨트롤 완충액 (mM로): NaCl 136, KCl 4, MgCl₂0.8, CaCl₂1.8 HEPES 5, MES 5, 글루코스 6, pH 7.3 스트레스 완충액 (mM로): NaCl 136, KCl 8, MgCl₂0.8, CaCl₂1.8 HEPES 5, MES 5, 데옥시-글루코스 10, pH 6.2

2. 결과

대조군 조건 하에서, 평균 상의 세포는 시간에 따라 그들의 부피가 경미하게 감소되는 경향을 보였다(도 9B는 5개의 실험으로부터의 평균 데이타를 보여준다). 세포가 대사 저해에 의해 자극될 때, 부피에서의 감소는 넷-증가(net-increase)로 역전되었다 (도 9A에서 채워진 사각형). 평균에서 상대적 부피는 1.06± 0.02 (스트레스의 마지막 5분, n=5)였고, 반면 이 기간에서의 대조군 세포의 부피는 0.94 ±0.04였다.

근육 세포에서의 염료 흡수 측정은 화합물 1 이 코넥신헤미-채널 개방을 저해한다는 것을 보여준다. 헤미-채널이 관찰된 종창에 기여할 수 있다고 여겨진다. 이를 시험하기 위해 화합물 1 (0.1 nM)을 스트레스 베재에 포함시키고, 부피를 관찰했다. 6개의 실험으로부터의 데이타가 도 9A (열린 사각형)에서 보여지며, 볼 수 있는 바 대로, 스트레스 유도된 종창이 방지되었다. 화합물 1의 존재하에서 스트레스 동안의 평균 상대적 부피는 0.93± 0.05였다.

원-웨이(one-way) ANOVA를 이용하여, 대조군, 스트레스 및 스트레스+ 화합물 1로부터의 데이타와 비교할 때, 유의적 차이가 탐지되었다 (도 10 참조). Post. hoc.시험은(LSD) 스트레스군이 대조군(P < 0.05) 및 스트레스+화합물 1 (P < 0.05)과 유의적으로 다르며, 반면 대조군은 스트레스 + 화합물 1(P > 0. 76)과 다르지 않음을 보였다.

실시예 8- 래트에서의 심근경색증 후의 경색 크기의 감소.

1. 방법:

수컷 루이스 래트 (300-350 g; M & B, Ll. Skendsved, Denmark)를 신경이완마취 배합(힙놈 (펜타닐 시트레이트 0.315 mg/ml 및 플루아니손 10 mg/ml) + 미다졸람 (5 mg/ml) )으로 마취시켰다. 미다졸람의 상업적 용액을 증류된 물 중에서 1: 2로 희석시켰다. 희석된 미다졸람의 세 부분을 한 부분의 힙놈과 혼합한다. 마취는 100 그램 래트 당 이 용액의 0.2 ml의 s. c. 투여에 의해 유도된다. 외과적 마취가 이루어질 때, 기관내 케뉼라(endotracheal cannula)가 삽입되고, 동물은 수술동안 동맥의 pH를 7.3-7.5로 유지시키기 위해 조절된 하바드 설치류 벤틸레이터(Harvard rodent ventilator)로 인공적으로 환기시켰다.

화합물 1은 심근경색증의 유도 직전 복막내(i. p.) 공간으로 삽입된 삼투압 미니펌프(Alzet model 2ML4)에 의해 운반되었다. 펌프는 비히클(등장성 식염수) 또는 화합물 1로 채워졌으며, 수술 이전에 24시간 동안 37℃ 에서 준비되었다. 치료학상 혈정 농도를 경색의 시간에서 이미 얻어졌음을 보장하기 위해, 화합물 1의 로딩 투여량은 LAD의 결찰 이전에 s.c.로 주어졌다. s. c. 로딩 투여량으로, 안정-상태의 혈장 수준은 3분후 이미 도달되었다.

화합물 1의 s. c. 로딩 투여량의 투여 후, 및 삼투압 미니펌프의 i. p. 삽입 후, 좌측 개흉술이 수행되었으며, 왼쪽 앞쪽 디센딩(decending) 동맥이 6-0 실크 봉합사를 사용하여 결찰되었다. 흉강을 레이져 중에서 닫고, 폐를 닫기 위해 흉막의 공간 중에서 음 압력이 유도되었다. 삼-수술된(Sham-operated) 동물은 LAD의 결찰없는 동일한 과정을 조건으로했다. 수술 후, 동물은 다음 아침까지 50% 산소로 30℃의 따뜻한 캐비넷에서 회복되도록 했다. 회복 기간 동안의 탈수를 방지하기 위해, 래트 에게 수술 완료 즉시 5 ml 5% 글루코스를 s. c로 주고, 4 p.m.에 다시 5ml 5% 글루코스를 주었다. 수술후 통증을 경감시키위해, 래트를 심근 경색 후 삼일 동안 부프레노핀(20 ㎍/100 g s. c. b.i.d.) 및 멜록시캄(0.1 mg/100 g s.c. 하루 한번)으로 처리했다. 이 연구에서 심근경색증 (MI)을 가진 래트에게 주어진 주입 투여량은 0 [비히클=등장성 식염수], 1.70. 4 nM [투여량 1], 5.70. 4 [투여량 2], 또는 93.712. 3 nM [투여량]에서의 혈장 농도를 생산하기 위해 조절되었다.

화합물 1의 혈장 농도는 고체상 추출에 뒤따르는 질량 분광기에 의해 측정되었다. 사용된 투여량은 하기 표 I에서 보여진다:

표 I

LAD의 결찰 후 3주, 래트를 펜토바르비탈(50 mg/kg)의 주사로(i.p.) 마취시켰다. 동물을 체온을 유지시키기 위해 37 ℃에서 가열 담요 상에 두었다. 기관절개술이 수행되었으며, 레트를 하버드 설치류 벤틸레이터를 이용하여 산소로 통풍시켰다. 통풍기는 동맥의 pH를 7.35-7.45로 유지하도록 조절되었다. PE50 카테터를 i. v. 투여 및 동맥의 압력 측정을 위해 각각 대퇴부 정맥 및 동맥에 위치시켰다. 대퇴부의 i. v. 카테터 삽입 후, 동물을 판쿠로늄 1 mg/kg의 i. v. 투여에 의해 마비시켰다. 마취 및 호흡 마비는 등장성 식염수(50㎕/min) 중에 운반된 펜토바르비탈(2.5 mg/kg/h) 및 판쿠로늄(1 mg/kg/h)의 계속적인 i. v. 주입에 의해 유지된다.티곤(tygon) 카테터를 좌심실 확장기-말 압력 결정을 위해 오른쪽 경동맥을 통해 왼쪽 심실로 삽입했다. 좌심실 확장기-말 압력(LVEDP)의 기록 후, 심장으로부터 정맥 및 동맬 몇 mm를 절단함에 의해 심장을 몸체로부터 제거한다. 심장을 조심스럽게 등장성 식염수로 헹구고, 무게를 재고, 4% 중성 완충 포르말린 중에 두었다.

고정 후, 큰 혈관을 심장 가까이에서 잘랐다. 그 후, 심장을 1.5 mm의 거리로 병렬 면도날로 구성된 집합체를 이용하여 1.5 mm의 두께로 평행한 조각으로 잘랐다. 조각은 심장의 긴 축에 직각을 이룬다.

첫번째 조각은 임의의 수에 의한 캡슐 중 하나에 놓고, 다른 것 중 두번째, 첫번째 캡슐 중의 제3의 등을 놓아 두개의 조직학적 캡슐 중에 조각을 놓았다. 끼워넣은 후, 조각을 4㎛ 두께의 섹션으로 자르고, 헤마토실린-에오신 및 마손-트리크롬에 의해 염색시켰다.

미리 결정된 단계로 옮겨질 수 있는 단계에서 현미경을 이용하여,

마손-트리크롬 염색된 슬라이드 모두를 시험하고, 점이 찍혀진(points hitting) 섬유 조직의 수(마손-트리크롬으로 푸르게 염색됨) 및 정상 조직의 수를 계산했다. 현미경을 비디오 카메라로 연결하고, 이미지를 스크린 상에 나타냈다. 사용된 형태계측학적 시스템은 덴마트 올림푸스사의 Cast2이다. 경색 크기는 심장에서의 섬유 조직 %로서 계산되었다.

2. 결과:

도. 11에서 설명한 바 대로, 심장 무게-체중 비율은 심근경색증의 이상 발달 결과(즉, 재형성)을 감소시킨다는 것을 제시하는, 화합물 1의 두 개의 가장 높은투여량에 의해 감소되었다.

도. 12에서 볼 수 있는 것 처럼, 3주 동안의 화합물 1의 치료는 심근경색증이 일어났으나, 비히클로 처리된 래트에서의 경색 크기에 상대적으로 20-50%에 의해 경색 크기를 감소시켰다. 티히스(Tyhis)는 화합물 1이 심근의 허혈 동안 세포보호적 활동을 지님을 나타낸다.

여기서 기술된 것과 일치하여, 이들 데이터는 화합물 1이 세포 종창의 예방을 포함할 수 있는 메카니즘에 의해 심근 경색의 크리를 감소시킴을 나타낸다.

따라서, 세포 종창의 예방은 둘러쌓인 건강한 조직의 압착을 예방할 수 있으며, 그에 따라 둘러쌓인 건강한 조직 내에서의 미소순환계의 압착을 예방할 수 있다. 그러므로, 이 출원에서 우리는 이 원리가 임의의 기관, 바람직하게는 이에 제한되는 것을 아니나, 제한된 섬유피막(예로써, 심장, 신장) 또는 뼈로 둘러쌓인 조직 (예로써, 뇌, 척수, 골수)에서의 허혈적 손상의 결과를 예방할 수 있음을 청구한다.

도. 13에서 볼 수 있는대로, 심근 경색증이 일어났으나 3주 동안 화합물 1의 투여량으로 치료된 래트는 감소된 좌심실 확장기-말 압력에 의해 증명된 것과 같이 좌심실에서의 더 적은 울혈을 갖는 더 개선된 심장 기능을 갖는다. 이 데이타는 심근경색증에 뒤따른 심장기능의 손상을 예방함을 나타낸다.

여기에서 개시된 모든 참고 문헌은 참고문헌에 의해 포함되었다. 본 발명은 그의 바람직한 구체예로 참고문헌과 함꼐 기술되었따. 그러나, 그것은 이 개시를 고려해 당업자에게 예상될 수 있을 것이며, 본 발명의 정신과 범위 내에서 수정 및개선이 이루어질 수 있을 것이다.

Claims (45)

1. 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II로서 표현된 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물로, 스트레스 받은 세포, 조직 또는 기관을 스트레스 받은 세포, 조직 또는 기관 내에서 헤미채널을 닫기에 충분한 접촉을 시키는 것을 포함하는, 스트레스에 노출된, 세포, 조직 또는 기관 내에서 헤미채널을 닫는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 코넥신43 (Cx 43)의 티로신 잔기를 인산화시키고 헤미채널을 닫는 것을 추가로 포함하는 방법.
3. 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II로서 표현된 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물로, 세포, 조직 또는 기관을 세포, 조직 또는 기관 내에서 헤미채널을 열기에 충분한 접촉을 시키는 것을 포함하는, 세포, 조직 또는 기관 내에서 헤미채널을 여는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 코넥신43 (Cx 43)의 세린 잔기를 탈인산화시키고, 헤미채널을 여는 것을 추가로 포함하는 방법.
5. 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II로서 표현된 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함하고, 접촉이 조직 또는 기관 내에서의 스트레스를 예방 또는 치료하기에 충분한 것인 포유동물에서 조직 또는 기관 내에서의 스트레스를 예방 또는 치료하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 코넥신43 (Cx 43)의 티로신 잔기를 인산화시키고 헤미채널을 닫는 것을 추가로 포함하는 방법.
7. 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II로서 표현되는 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함하고, 접촉이 세포, 조직 또는 기관 내에서 간극 연접 세포간 의사소통(GJIC)를 증가시키기에 충분한 것인 세포, 조직 또는 기관 내에서의 간극 연접 세포간 의사소통을 증가시키는 방법.
8. 코넥신 헤미채널 개방을 차단하는 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 따른 화합물을 화상 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 화상의 치료 방법.
9. 코넥신 헤미채널 개방을 차단하는 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 따른 화합물을 혈전증 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈전증의 치료 방법.
10. 코넥신 헤미채널 개방을 차단하는 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 따른 화합물을 호흡 및 대사 산증 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 호흡 및 대사 산증의 치료 방법.
11. 코넥신 헤미채널 개방을 차단하는 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 따른 화합물을 국소 부정맥 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 국소 부정맥의 치료 방법.
12. 코넥신 헤미채널 개방을 차단하는 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 따른 화합물을 혈당 수준 증가로 발생하는 세포 및 조직 손상 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 혈당 수준 증가로 발생하는 세포 및 조직 손상을 치료 및 예방하는 방법.
13. 코넥신 헤미채널 개방을 차단하는 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 따른 화합물을 만성 심방 세동(atrial fibrillation) 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 만성 심방 세동의 치료 방법.
14. 코넥신 헤미채널 개방을 증진시키는 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 따른 화합물을 간질 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 간질의치료 방법.
15. 세포를 코넥신43 (Cx43)의 인산화를 조절하는데 도움이 되는 조건 하에서, 항부정맥 펩티드 및 화학식 I 또는 II로 표현되는 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물과 접촉시키고; Cx43 인산화에서의 변화(여기에서 인산화에서의 변화는 헤미채널 조절 화합물을 표시하는 것으로서 여겨짐)를 탐지하는 것을 포함하는, 헤미채널 기능을 조절하는 후보 화합물을 스크리닝하기 위한 방법.
16. 제 15항에 있어서, 시험 단계는 추가로 면역학적 또는 세포 분류-기초 분석으로 후보 화합물을 시험하는 것을 포함하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 면역학적 분석은 세포를 Cx43의 인산화를 증가 또는 감소시키기에 충분한 조건 하에서 후보 화합물과 접촉시키고, 세포의 용균물을 생산하며; 헤미채널 조절 화합물을 표시하는 것으로서 세포 용균물에서의 증가 또는 감소된 Cx43 인산화를 탐지하는 것을 포함하는 방법.
18. 제 16항 내지 제 17항에 있어서, 면역학적 분석이 ELISA 분석인 방법.
19. 제 18항에 있어서, ELISA 방법은 추가로:

    a) 코넥신에 특이적으로 결합하는 제1 항체로 고상 지지체를 코팅하고,

    b) 제1 항체 및 코넥신 간에 결합 복합체를 형성하는 것을 도와주는 조건 하에서 고상 지지체에 세포 용균물을 접촉시키며,

    c) 제1 항체: 코넥신결합 복합체를 제2 항체와 제1 항체: 코넥신결합 복합체중 어느 인산화된 코넥신 간의 특이적 결합 복합체를 형성하기에 충분한 조건 하에서 접촉시키고,

    d) 제1 항체: 코넥신: 제2 항체 결합 복합체를 제2 항체와 결합하는 탐지가능하게 표지된 제3 항체와 접촉시키며;

    e) 화합물을 추가로 표시하는 것으로써 고상 지지체 상의 제3의 탐지가능하게 표지된 항체의 존재를 탐지하는 것을 포함하는 방법.
20. 제 19항에 있어서, 제3 항체가 비오틴, FITC, TRITC, 방사성 요오드 또는 퍼옥시다제 중 적어도 하나로 탐지가능하게 표지된 것인 방법.
21. 제 19항 내지 제 20항에 있어서, 제2 항체가 항-포스포티로신 항체인 방법.
22. 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체가 항-포스포세린 항체인 방법.
23. 제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 탐지가능하게 표지된 제3 항체를 방사선 섬광 계수에 의해 탐지하는 방법.
24. 제 16항에 있어서, 면역학적 방법은 방사선면역분석 (RIA)인 방법
25. 제 24항에 있어서, 면역학적 방법은 RIA 분석이며, 추가로

    a) 세포 용균물을 생산하기 전에 세포를 탐지가능하게-표지(여기에서 표지는 인산화된 코넥신을 표지하는 것을 도와주는 조건하에서 이루어짐)하고,

    b) 세포 용균물을 코넥신과 특이적 결합 복합체를 형성하는 항체와 접촉시키며,

    c) 탐지가능하게 표지된 세포 용균물로부터 결합 복합체를 분리하고;

    d) 간극 연접 조절 화합물을 추가로 표시하는 것으로서 표지되고 인산화된 코넥신을 탐지하는 것을 포함하는 방법.
26. 제 25항에 있어서, 항체는 항-코넥신 항체인 방법.
27. 제 25항 내지 제 26항에 있어서, 탐지 단계는 추가로 웨스턴 이뮤노블롯 분석을 수행하는 것을 포함하는 방법.
28. 제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 탐지가능한 표지는 방사성 인인 방법.
29. 제 15항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 고 처리량(high throughput) 또는 초 고 처리량(ultra high throughput) 스크리닝 형식으로 수행되는 방법.
30. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 Cx43 세포내 C-말단 부위의 인산화를 촉진시키는 방법.
31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 Cx43 C-말단 부위의 탈인산화를 촉진하는 방법.
32. 제 31항에 있어서, 인산화 위치가 티로신 잔기인 방법.
33. 제 32항에 있어서, 탈인산화 위치가 세린 잔기인 방법.
34. 1) 심장 또는 근육으로부터 유도된 것과 같은 세포, 조직 또는 기관의 집단의 배양하고,

    2) 바람직하게는 산소 결핍 또는 글루코스 유도체의 첨가에 의한 것과 같은 대사 저해에 의해 세포, 조직 또는 기관에 스트레스를 주며,

    3) 알려진 또는 화학식 I 또는 II에 의해 표현된 후보 헤미채널 조절 화합물을 첨가하고,

    4) 칼세인 및 관련 화합물과 같은 형광 염료와 같은 형광, 화학발광 또는 인광성 화합물과 같은 탐지가능한 리포터를 첨가하며,

    5) 적합한 대조군과 비교하여 세포, 조직 또는 기관 내로의 탐지가능 리포터의 흡수 변화를 탐지하고;

    6) 임의로 헤미채널 기능을 조절하는 화합물을 표시하는 것으로서의 변화를 측정하는 것을 포함하는, 헤미채널 기능을 조절하는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법.
35. 1) 심장 또는 근육으로부터 유도된 것과 같은 세포, 조직 또는 기관의 집단을 배양하고,

    2) 칼세인 또는 관련 화합물과 같은 염료와 같은 형광, 화학 발광, 또는 인광성 화합물과 같은 탐지 가능 리포터로 세포, 조직 또는 기관을 로딩하며,

    3) 탐지가능 리포터로부터의 신호를 탐지 및 정량함으로써 세포, 조직 또는 기관의 부피를 측정하고,

    4) 알려진 또는 화학식 I 또는 II에 의해 표현된 후보 헤미채널 조절 화합물을 첨가하며,

    5) 바람직하게는 산소 결핍 또는 글루코스 유도체의 첨가에 의한 것과 같은 대사 저해에 의해 세포, 조직 또는 기관에 스트레스를 주고,

    6) 적합한 대조군과 비교하여 세포 부피에서의 변화를 탐지하며;

    7) 헤미채널 기능 및 임의로 간극 연접 기능을 조절하는 화합물을 표시하는 것으로서의 변화를 임의로 측정하는 것을 포함하는, 헤미채널 기능을 조절하는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법.
36. 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 의해 표현되는 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 세포보호하는(cytoprotecting) 치료를 필요로 하는 포유동물의 조직 또는 기관을 세포보호하는 방법.
37. 제 37항에 있어서, 추가로 허혈 조건에 포유동물의 조직 또는 기관을 노출시키는 것을 포함하는 방법.
38. 제 38항에 있어서, 세포보호되는 기관이 섬유피막 또는 뼈와 결합된 방법.
39. 제 39항에 있어서, 기관이 심장, 신장, 뇌, 척수 또는 골수인 방법.
40. 제 40항에 있어서, 심장에 경색이 일어나고, 허혈은 심근세포 종창과 관련된 방법.
41. 제 41항에 있어서, 화합물이 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH₂ (화합물 1) 또는 (Ac-Gly-Asn-Tyr-NH₂) 화합물 2인 방법.
42. 치료학상 유효량의 화학식 I 또는 II에 의해 표현되는 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 재관류 손상을 예방 또는 치료하는 방법.
43. 제 43항에 있어서, 경색 조건에 포유류의 심장을 노출시키고, 관상동맥 관류를 확립하는 것을 추가로 포함하는 방법.
44. 제 44항에 있어서, 혈전용해제를 투여하거나 경색된 심장으로의 관상동맥 관류를 촉진시키기 위한 관상 동맥 혈관성형술을 제공하는 것을 포함하는 방법.
45. 제 45항에 있어서, 화합물은 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH₂ (화합물 1) 또는 (Ac-Gly-Asn-Tyr-NH₂) 화합물 2인 방법.