BRPI0721094A2

BRPI0721094A2 - Composições e tratamentos de cicatrização de ferida prejudicada

Info

Publication number: BRPI0721094A2
Application number: BRPI0721094-9A2A
Authority: BR
Inventors: David L Becker; Colin R Green; Bradford J Duft
Original assignee: Coda Therapeutics Inc
Priority date: 2006-12-11
Filing date: 2007-12-11
Publication date: 2014-02-11
Also published as: WO2008073479A2; JP2015063565A; CN103520197B; HK1136213A1; JP2013173796A; ES2527131T3; US20150315598A1; KR101521306B1; US8063023B2; PL2101791T3; EP2543377A1; EP2101791A2; US20080242631A1; EP2101791B1; CN103520197A; US9029339B2; RU2009126594A; US8685940B2; EP2543378A1; JP2010512404A

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES E TRATAMENTOS DE CICATRIZAÇÃO DE FERIDA PREJUDICA- DA".

CAMPO

A presente invenção refere-se a junções de hiato e a feridas e

cicatrização de feridas, em particular a feridas que não cicatrizam em taxas esperadas, tal como feridas de cicatrização retardada, feridas incompleta- mente cicatrizadas, feridas crônicas e feridas deiscentes.

BREVE ANTECEDENTE O que segue inclui informação que pode ser útil na compreensão

da presente invenção. Não é uma admissão que qualquer informação provi- da aqui seja técnica anterior, ou relevante, para as invenções presentemente descritas ou reivindicadas, ou que qualquer publicação ou documento que é especificamente ou implicitamente referido seja técnica anterior.

Em humanos e outros mamíferos lesão de ferida dispara uma

cascata complexa organizada de eventos celulares e bioquímicos que vão na maioria dos casos resultar em ferida cicatrizada. Uma ferida idealmente cicatrizada é uma que restaura estrutura, função e aparência anatômica normais nos níveis celular, de tecido, órgão e organismo. Cicatrização de 20 ferida, seja iniciada por trauma, micróbios ou materiais estranhos, prossegue através de um processo complexo compreendendo várias fases se sobre- pondo, incluindo inflamação, epitelização, angiogênese e deposição de ma- triz. Normalmente, esses processos levam a uma ferida madura e um certo grau de formação de cicatriz. Embora inflamação e reparo aconteçam princi- 25 palmente ao longo de um curso prescrito, a sensibilidade do processo é de- pendente do equilíbrio de uma variedade de fatores de modulação de cicatri- zação de ferida, incluindo, por exemplo, uma rede complexa de citocinas reguladoras e fatores de crescimento.

Junções de hiato são estruturas de membrana celular que facili- tam comunicação célula-célula direta. Um canal de junção de hiato é forma- do de duas conexões (hemicanais), cada um composto de seis subunidades de conexina. Cada conexão hexamérica ancora com uma conexão na mem- - - brana oposta para formar uma junção de hiato simples. Canais de junção de hiato são relatados ser encontrados em todo o corpo. Tecido tal como epité- Iio corneal, por exemplo, tem seis a oito camadas celulares, mesmo assim expressam canais de junção de hiato diferentes em camadas diferentes com 5 conexina 43 na camada basal e conexina 26 das camadas de células aladas basais a médias. Em geral, conexinas são uma família de proteínas, geral- mente nomeadas de acordo com seu peso molecular ou classificadas em uma base filogenética em subclasses alfa, beta e gama. Pelo menos 20 iso- formas humanas e 19 de murino foram identificadas. Tipos de tecido e célula 10 diferentes que são relatados ter padrões característicos de expressão de proteína conexina e tecidos tal como córnea foram mostrados alterar o pa- drão de expressão de proteína conexina seguindo lesão ou transplante (Qui e outros (2003) Current Biology, 13:1967-1703; Brander e outros (2004), J. Invest. DermatoL 122:1310-20).

' 15 Foi relatado que funcionamento de conexina anormal pode ser

ligado a certos estados de doença (por exemplo, doenças cardíacas) (A.C. de Carvalho e outros (1994) J. Cardiovasc. Electrophysiol. 5:686). Em certas proteínas conexinas, alterações nas propriedades de renovação e tráfego podem ser introduzidas através da adição de agentes endógenos que po- 20 dem afetar o nível de comunicação intracelular juncional de hiato (Darrow e outros (1995) Circ. Res. 76:381; Lin e outros (2001) J. CeH. Biol. 154(4):815). Tecnologia de antissenso foi também relatada para a modulação da expres- são para genes implicados em doenças virais, fúngicas e metabólicas. Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.166.195, (inibidores de oligonucleotídeo de 25 HIV), Pat. U.S. No. 5.004.810 (oligômeros para hibridização para mRNA de Vmw65 do vírus do herpes simplex e inibindo replicação). Vide também Pat. U.S. No. 7.098.190 para Beckere Green (formulações compreendendo nu- cleotídeos de antissenso para conexinas). Inibidores de peptídeo de junções de hiato e hemicanais foram também relatados. Vide, por exemplo, Berthoud 30 e outros (2000) Am. J. PhysioL Lung Cell Mol. PhysioL 279:L619-L622; E- vans, W.H. e Boitano, S. Biochem. Soc. Trans. 29:606-612 e De Vriese A.S. e outros (2001) Kidney Int. 61:177-185. Vide também Green e Becker1 W02006/134494 ("Anti-connexin compounds and methods of use").

Apesar dos avanços na compreensão dos princípios que basei- am o processo de cicatrização de ferida, permanece uma necessidade não- satisfeita significante em opções terapêuticas adequadas para cuidado de 5 ferida, incluindo feridas que não cicatrizam em taxas esperadas, tal como feridas de cicatrização retardada, feridas cicatrizadas incompletamente e feridas crônicas. Tais composições e tratamentos terapêuticos são descritos e reivindicados aqui.

BREVE SUMÁRIO

10 As invenções descritas e reivindicadas aqui têm muitos atributos

e modalidades incluindo, mas não limitado a, aqueles mostrados ou descri- tos ou referidos neste Breve Sumário. Ele não pretende ser todo inclusivo e as invenções descritas e reivindicadas aqui não são limitadas a ou pelas ca- racterísticas ou modalidades identificadas neste Breve Sumário, que é inclu- '15 ído para propósitos de ilustração apenas e não restrição.

As invenções referem-se em geral ao uso de um polinucleotídeo anticonexina incluindo, por exemplo, um polinucleotídeo de antissenso de conexina, e composições e métodos para o tratamento de feridas que não cicatrizam em taxas esperadas, tal como feridas de cicatrização retardada, 20 feridas incompletamente cicatrizadas e feridas crônicas.

A presente invenção provê aumentos e melhoras na cicatrização de feridas que não cicatrizam em taxas esperadas, tal como feridas de cica- trização retardada, feridas incompletamente cicatrizadas e feridas crônicas, através do uso de um ou mais polinucleotídeos de antissenso de conexina.

25 Elas também referem-se ao uso de um polinucleotídeo anticone-

xina em combinação com curativos, bandagens, matrizes e revestimentos. Em um aspecto, a invenção compreende uma matriz de cicatrização de feri- da sintética ou de ocorrência natural compreendendo um polinucleotídeo anticonexina. Em certas modalidades, o polinucleotídeo anticonexina é um 30 polinucleotídeo anticonexina 43, por exemplo, um polinucleotídeo anticone- xina 43. Polinucleotídeos anticonexina preferidos incluem oligodesoxinucleo- tídeos anticonexina, tal como oligodesoxinucleotídeos anticonexina 43. Elas também referem-se ao uso de polinucleotídeos anticonexi- na, sozinhos ou em combinação com curativos, bandagens, matrizes ou re- vestimentos, em aplicações repetidas, por exemplo, uma vez por semana até que cicatrização esteja completa ou conforme desejado.

Composições e métodos da invenção que empregam polinucleo-

tídeos anticonexina, incluindo polinucleotídeos de antissenso de conexina, são descritos e reivindicados.

Em um aspecto, a invenção provê uma composição farmacêuti- ca compreendendo um ou mais polinucleotídeos de antissenso de conexina. 10 De preferência, a composição farmacêutica compreende ainda um carrea- dor, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, as invenções incluem composições farmacêuticas compreendendo (a) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polinucleotídeo de antissenso de conexina farmaceuticamente aceitável e (b) um carreador ou diluente farma- 15 ceuticamente aceitável.

Em um aspecto, a invenção inclui composições farmacêuticas, incluindo formas e formulações de aplicação tópica, que compreendem um carreador farmaceuticamente aceitável e quantidades terapeuticamente a- ceitáveis de um polinucleotídeo anticonexina, de preferência um polinucleo- 20 tídeo de antissenso de conexina, e com mais preferência um polinucleotídeo de antissenso de conexina 43.

Exemplos de um polinucleotídeo de antissenso de conexina in- cluem um oligodesoxinucleotídeo anticonexina (ODN), incluindo polinucleotí- deos de antissenso (incluindo antissenso de estrutura modificada e não- modificada, por exemplo, um polinucleotídeo de antissenso de DNA que se liga a um mRNA de conexina).

Polinucleotídeos de antissenso de conexina adequados incluem, por exemplo, ODNs de antissenso contra conexina 43 (Cx43), conexina 26 (Cx26), conexina 37 (Cx37), conexina 30 (Cx30), conexina 31,1 (Cx31.1) e 30 conexina 32 (Cx32). Em certas modalidades, composições adequadas inclu- em polinucleotídeos de antissenso de conexina múltiplos em combinação, incluindo, por exemplo, polinucleotídeos se direcionando a Cx 43, 26, 30 e 31.1. Polinucleotídeos de antissenso de conexina preferidos se direcionam à conexina 43.

Deste modo, em outro aspecto, a invenção provê uma formula- ção compreendendo pelo menos um polinucleotídeo de antissenso de cone- 5 xina para uma proteína conexina junto com um carreador ou veículo farma- ceuticamente aceitável. Em uma forma preferida, a formulação contém poli- nucleotídeos para uma proteína conexina apenas. Com mais preferência, esta proteína conexina é conexina 43. Alternativamente, a formulação con- tém oligodesoxinucleotídeos para mais de uma proteína conexina.

A invenção inclui uma formulação compreendendo um polinucle-

otídeo anticonexina farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um polinu- cleotídeo de antissenso de conexina, em uma quantidade eficaz para pro- mover cicatrização de ferida em um indivíduo tendo uma ferida crônica ou uma ferida caracterizada por cicatrização retardada, ou outras feridas que 15 não cicatrizam em taxas esperadas. Tais formulações incluem, por exemplo, formas e formulações de aplicação tópica. Polinucleotídeos anticonexina preferidos e polinucleotídeos de antissenso de conexina preferidos são poli- nucleotídeos anticonexina 43 e polinucleotídeos de antissenso 43 de conexi- na.

De preferência, uma das proteínas conexina às quais oligodeso-

xinucleotídeos são direcionados é conexina 43. Outras proteínas conexinas às quais oligodesoxinucleotídeos são direcionados incluem conexina 26, co- nexina 31.1 e conexina 32.

Convenientemente, o oligodesoxinucleotídeo para conexina 43 é 25 selecionado de: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC (SEQ ID NO:1), GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC (SEQ ID NO:2); GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT (SEQ ID NO:3), um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70 por cento de homologia com SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou um polinucleotídeo que hibridiza para mRNA 30 de conexina 43 sob condições de média a alta estringência.

Convenientemente, o oligodesoxinucleotídeo para conexina 26 é: TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA (SEQ ID NO:4), um polinu- cleotídeo tendo pelo menos cerca de 70 por cento de homologia com SEQ ID NO:4; ou um polinucleotídeo que hibridiza para mRNA de conexina sob condições de média a alta estringência. Convenientemente, o oligodesoxinu- cleotídeo para conexina 31.1 é: CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C 5 (SEQ ID NO:9), um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70 por cento de homologia com SEQ ID NO:9; ou um polinucleotídeo que hibridiza para mRNA de conexina 31.1 sob condições de média a alta estringência. Con- venientemente, o oligodesoxinucleotídeo para conexina 32 é: TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A (SEQ ID NO:12), um polinucleotídeo tendo pelo 10 menos cerca de 70 por cento de homologia com SEQ ID NO: 12; ou um poli- nucleotídeo que hibridiza para mRNA 32 de conexina sob condições de mé- dia a alta estringência. Outras seqüências de polinucleotídeo de antissenso de conexina úteis de acordo com os métodos da presente invenção incluem: 5' CAT CTC CTT GGT GCT CAA CC 3' (conexina 37) (SEQ ID NO:5)

-15 5’ CTG AAG TCG ACT TGG CTT GG 3' (conexina 37) (SEQ ID NO:6)

5’ CTC AGA TAG TGG CCA GAA TGC 3' (conexina 30) (SEQ ID NO:7)

5' TTG TCC AGG TGA CTC CAA GG 3' (conexina 30) (SEQ ID ON:8)

5' AGA GGC GCA CGT GAG ACA C 3' (conexina 31.1) (SEQ ID N0:10)

5’ TGA AGA CAA TGA AGA TGT T 3' (conexina 31.1) (SEQ ID NO:11)

20 Os polinucleotídeos de antissenso são de preferência adminis-

trados topicamente (no e/ou em torno do sítio a ser tratado). Adequadamen- te os polinucleotídeos de antissenso são combinados com um carreador, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável para prover uma composi- ção farmacêutica.

25 Carreadores ou veículos farmaceuticamente aceitáveis adequa-

dos incluem qualquer um daqueles geralmente usados para administração tópica. A formulação tópica pode estar na forma de, por exemplo, um creme, unguento, gel, emulsão, loção, spray, espuma ou tinta. A formulação da in- venção pode ser também apresentada na forma de um curativo impregnado. 30 De preferência, o carreador ou veículo farmaceuticamente acei-

tável é um gel, adequadamente um gel de copolímero de polioxietileno- polioxipropileno não-iônico, por exemplo, um gel Pluronic, de preferência Pluronic F-127 (BASF Corp.) Este gel pode ser usado como um líquido em temperaturas baixas, mas rapidamente sedimenta em temperaturas fisiológi- cas, o que pode auxiliar no confinamento da liberação do componente de oligonucleotídeo anticonexina ao sítio de aplicação ou imediatamente adja- 5 cente àquele sítio. Géis de liberação lenta onde o oligonucleotídeo anticone- xina é liberado com o tempo são preferidos para aplicação tópica. Então, a composição farmacêutica pode ser formulada para prover liberação susten- tada do polinucleotídeo anticonexina, por exemplo, um polinucleotídeo de antissenso. Polinucleotídeos anticonexina preferidos e polinucleotídeos de 10 antissenso de conexina são polinucleotídeos anticonexina 43e polinucleotí- deos de antissenso de conexina 43.

Em outro aspecto, a invenção inclui métodos para administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais polinucleotídeos de antissenso de conexina farmaceuticamente aceitáveis formulados em

- 15 uma preparação de liberação retardada, uma preparação de liberação lenta, uma preparação de liberação prolongada, uma preparação de liberação con- trolada e/ou em uma preparação de ação repetida a um indivíduo com uma ferida caracterizada em geral ou em parte por cicatrização de ferida retarda- da ou incompleta, ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada. 20 Tais formulações são particularmente vantajosas para feridas que não cica- trizam em taxas esperadas, tal como feridas crônicas.

Em certos outros aspectos, as invenções referem-se também a métodos de uso de tais composições para tratar indivíduos sofrendo de vá- rias doenças, distúrbios e condições associados com uma ferida que não 25 cicatriza na taxa esperada, tal como uma ferida de cicatrização retardada e ferida incompletamente cicatrizada, ou ferida crônica. Em ainda outro aspec- to, a invenção inclui métodos para tratamento de um indivíduo tendo ou sus- peito de ter qualquer doença, distúrbios e/ou condições caracterizados em geral ou em parte por uma ferida crônica ou cicatrização de ferida retardada 30 ou incompleta, ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada. Tais composições incluem, por exemplo, formas e formulações de aplicação tópi- ca. Polinucleotídeos anticonexina e polinucleotídeos de antissenso de cone- xina preferidos são polinucleotídeos anticonexina 43e polinucleotídeos de antissenso de conexina 43.

Em um aspecto adicional, a invenção inclui emplastros trans- dermais, curativos, absorventes, coberturas, matrizes e bandagens capazes 5 de ser aderidos ou de outro modo associados com a pele de um indivíduo, os ditos artigos sendo capazes de aplicação de uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um ou mais polinucleotídeos anticonexina farmaceutica- mente aceitáveis, por exemplo, polinucleotídeos de antissenso de conexina.

A invenção inclui dispositivos contendo quantidades terapeuti- camente eficazes de um ou mais polinucleotídeos anticonexina farmaceuti- camente aceitáveis, por exemplo, polinucleotídeos de antissenso de conexi- na, por exemplo, uma membrana de controle de taxa confinando um reser- vatório de fármaco e um dispositivo de matriz monolítica. Esses dispositivos podem ser empregados para o tratamento de indivíduos com necessidade dos mesmos conforme aqui revelado. Adequadamente o curativo ou matriz de ferida é provido incluindo a forma de um substrato sólido com um polinu- cleotídeo anticonexina, por exemplo, um polinucleotídeo de antissenso de conexina, disperso sobre ou no substrato sólido. Em uma modalidade o pro- duto farmacêutico da invenção é provido em combinação com um curativo de ferida ou matriz de promoção de cicatrização de ferida. Polinucleotídeos anticonexina preferidos e polinucleotídeos de antissenso de conexina são polinucleotídeos anticonexina 43 e polinucleotídeos de antissenso de cone- xina 43.

Em ainda um aspecto adicional, a invenção provê um método de 25 promoção de cicatrização de ferida em um paciente tendo uma cicatrização de ferida retardada ou uma ferida crônica, que compreende a etapa de ad- ministração de uma formulação conforme aqui definido à dita ferida em uma quantidade eficaz para sub-regular a expressão de proteínas conexina no e imediatamente adjacente ao sítio da dita ferida. Aplicações repetidas são 30 incluídas na invenção. Sub-regulagem de conexina 43 é preferida.

Um aspecto da presente invenção refere-se a um método de tratamento de um indivíduo tendo uma ferida de cicatrização retardada ou crônica, ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada, o qual compreende administração de uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo anticonexina, por exemplo, um polinucleotídeo anticonexina. Um polinucleo- tídeo anticonexina adequado pode ser selecionado do grupo consistindo em 5 um polinucleotídeo de antissenso de conexina (por exemplo, um polinucleo- tídeo de antissenso de DNA que se liga a um mRNA de conexina), um poli- nucleotídeo de RNAi e um polinucleotídeo de siRNA. Polinucleotídeos anti- conexina preferidos bloqueiam ou inibem a expressão de conexina 43. Apli- cações repetidas estão incluídas na invenção.

Em um aspecto, a presente invenção provê um método de tra-

tamento de um indivíduo tendo uma ferida de cicatrização retardada ou in- completa ou uma ferida crônica, ou outra ferida que não cicatriz em uma ta- xa esperada, o qual compreende administração sustentada de uma quanti- dade eficaz de um polinucleotídeo de antissenso de conexina 43 à ferida. 15 Convenientemente, o polinucleotídeo de antissenso é administrado ou apli- cado por pelo menos 0,5 hora, cerca de 1-2 horas, cerca de 2-4 horas, cerca de 4-6 horas ou cerca de 6-8 horas, mas pode ser administrado por mais tempo, por exemplo, até 24 horas ou mais. Aplicação ou liberação de 1-2 horas, 2-3 horas e 4-8 horas é aqui preferida. De acordo com uma modali- 20 dade o indivíduo é diabético. Em outras modalidades, o paciente tem uma úlcera diabética, um úlcera de pé diabética, uma úlcera vasculítica, uma úl- cera venosa, uma úlcera de estase venosa, uma úlcera arterial, uma úlcera de pressão, uma úlcera de decúbito, uma úlcera infecciosa, uma úlcera in- duzida por trauma, uma úlcera de queimadura, ulcerações associadas com 25 pioderma gangrenoso ou úlcera ou úlceras mistas. Aplicações repetidas es- tão incluídas na invenção. Preferidas são aplicações repetidas até que fe- chamento da ferida seja visto estar acontecendo, seguido por uma aplicação repetida (ou aplicações) no caso de cicatrização de ferida mais uma vez pa- rar ou ficar retardada.

De acordo com um aspecto alternativo, a presente invenção pro-

vê um método de tratamento de um indivíduo tendo uma cicatrização de fe- rida retardada ou incompleta ou uma ferida crônica, ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada, que compreende administração sustentada à ferida (ou à área em ou em torno da área ferida) de um polinucleotídeo de antissenso de conexina 43 com o que a expressão da conexina 43 é sub- regulada durante um período de tempo sustentado. Convenientemente, a 5 expressão de conexina 43 é sub-regulada por pelo menos cerca de 0,5 hora, cerca de 1-2 horas, cerca de 2-4 horas, cerca de 4-6 horas ou cerca de 6-8 horas, mas pode ser administrada por mais tempo, por exemplo, até 24 ho- ras ou mais. Administrações sustentadas de 0,5, 1-2 horas e 4-8 horas são aqui preferidas. Indivíduos adequados incluem um indivíduo diabético. Em 10 outras modalidades, o paciente tem uma úlcera diabética, uma úlcera de pé diabética, uma úlcera vasculítica, uma úlcera venosa, uma úlcera de estase venosa, uma úlcera arterial, uma úlcera de pressão, uma úlcera decubitosa, uma úlcera infecciosa, uma úlcera induzida por trauma, uma úlcera de quei- madura, ulcerações associadas com pioderma gangrenoso ou uma úlcera ou 15 úlceras mistas. Aplicações repetidas estão incluídas na invenção. Preferidas são aplicações de repetição até que fechamento da ferida seja visto estar acontecendo, seguido por uma aplicação (ou aplicações) repetida no caso da cicatrização da ferida novamente parar ou ficar retardada.

De acordo com um aspecto adicional, administração sustentada à ferida de uma quantidade de um polinucleotídeo de antissenso de conexi- na 43 eficaz para sub-regular expressão de conexina 43 por um período de tempo sustentado é provida. Ainda de acordo com este aspecto, cicatrização de ferida de uma ferida que não está cicatrizando em taxas esperadas é promovida, incluindo feridas de cicatrização retardada, feridas de cicatriza- ção prejudicada e feridas crônicas. Em uma modalidade a ferida é uma úlce- ra diabética, uma úlcera de pé diabética, uma úlcera vasculítica, uma úlcera venosa, uma úlcera de estase venosa, uma úlcera arterial, uma úlcera de pressão, uma úlcera decubitosa, uma úlcera infecciosa, uma úlcera induzida por trauma, uma úlcera de queimadura, ulcerações associadas com pioder- ma gangrenoso ou uma úlcera ou úlceras mistas. Aplicações repetidas estão incluídas na invenção. Preferidas são aplicações de repetição até que fe- chamento da ferida seja visto estar acontecendo, seguido por uma aplicação (ou aplicações) repetida no caso da cicatrização da ferida novamente parar ou ficar retardada.

De acordo com outros aspectos da presente invenção reepiteli- zação da ferida e/ou formação de tecido de granulação é promovida.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método

de promoção de cicatrização de ferida em um indivíduo tendo uma ferida que não está cicatrizando em uma taxa esperada, incluindo uma ferida de cicatrização retardada ou uma ferida de cicatrização incompleta ou uma feri- da crônica, o qual compreende uma administração sustentada de um polinu- 10 cleotídeo de antissenso de conexina 43 e um polinucleotídeo de antissenso de conexina 31.1. Aplicações repetidas estão incluídas na invenção.

Um aspecto alternativo da presente invenção refere-se a um mé- todo de promoção de reepitelização de feridas na pele que compreende ad- ministrar a um indivíduo tendo uma ferida que não está cicatrizando na taxa esperada, incluindo, por exemplo, uma cicatrização retardada ou uma ferida incompletamente cicatrizada ou uma ferida crônica, um polinucleotídeo anti- conexina, por exemplo, um polinucleotídeo anticonexina em uma quantidade eficaz para promover reepitelização. O polinucleotídeo anticonexina pode ser direcionado contra uma conexina selecionada de conexina 26, conexina 30, conexina 31.1 e conexina 43. Polinucleotídeos adequados podem ser sele- cionados de um polinucleotídeo de antissenso de conexina de estrutura prin- cipal modificada ou não-modificada (por exemplo, um polinucleotídeo de an- tissenso de DNA que se liga a um mRNA de conexina), um polinucleotídeo de RNAi e um polinucleotídeo de siRNA. Aplicações repetidas estão incluí- das na invenção. Conexina 43 é aqui um alvo preferido.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método de promoção de cicatrização de ferida em um indivíduo tendo uma ferida que não está cicatrizando na taxa esperada, incluindo, por exemplo, uma ferida de cicatrização retardada ou uma ferida de cicatrização incompleta ou 30 uma ferida crônica, que compreende administração sustentada de um poli- nucleotídeo anticonexina, por exemplo, um polinucleotídeo de antissenso de conexina, que é eficaz para regular divisão e crescimento de célula basal epitelial e um polinucleotídeo anticonexina, por exemplo, um polinucleotídeo de antissenso de conexina, que é eficaz para regular secreção de queratina da camada externa. Em uma modalidade, o polinucleotídeo anticonexina, por exemplo, polinucleotídeo de antissenso de conexina, eficaz para regular 5 divisão e crescimento de célula basal epitelial é um polinucleotídeo de antis- senso de conexina 26 ou um polinucleotídeo de antissenso de conexina 43 ou uma mistura dos mesmos. De acordo com uma modalidade alternativa, o polinucleotídeo anticonexina, por exemplo, polinucleotídeo de antissenso de conexina, que é administrado para regular a queratinização da camada ex- 10 terna é um polinucleotídeo de antissenso de conexina 31.1. Aplicações repe- tidas estão incluídas na invenção.

Em outra modalidade, a ferida crônica é uma ferida de pele crô- nica e um polinucleotídeo anticonexina é administrado à pele ou um tecido associado com a pele do dito indivíduo por um período de tempo eficaz.

- 15 Uma ferida de pele crônica adequada para tratamento pode, por exemplo, ser selecionada do grupo consistindo em úlceras de pressão, úlceras decubi- tosas, úlceras diabéticas, úlceras de pé diabéticas, úlceras venosas, úlceras de estase venosas, úlceras arteriais, úlceras vasculíticas, úlceras infeccio- sas, úlceras induzidas por trauma, úlceras de queimadura, ulcerações asso- 20 ciadas com pioderma gangrenoso e úlceras mistas. A ferida crônica pode ser uma úlcera arterial que compreende ulcerações resultantes de bloqueio arte- rial completo ou parcial. A ferida crônica pode ser uma úlcera venosa ou úl- cera de estase venosa que compreende ulcerações resultantes do mau fun- cionamento da válvula venosa e doença vascular associada. A ferida crônica 25 pode ser uma úlcera induzida por trauma. Aplicações de repetição estão in- cluídas na invenção.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção provê um método de aumento da taxa de cicatrização ou fechamento de ferida em um indivíduo tendo uma ferida que não cicatriza na taxa esperada (incluindo 30 uma ferida de cicatrização retardada, uma ferida incompletamente cicatriza- da e uma ferida crônica) que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo anticonexina. Um polinucleotídeo adequado é selecionado de um polinucleotídeo de antissenso de conexina (por exemplo, um polinucleotídeo de antissenso de DNA que se liga a um mRNA de conexina), um polinucleotídeo de RNA e um polinucleotídeo de siRNA. Um polinucleotídeo de antissenso de conexina adequado é um poli- 5 nucleotídeo de conexina 43. Polinucleotídeos particularmente adequados têm de a partir de cerca de 18 a cerca de 32 nucleotídeos. Aplicações repe- tidas estão incluídas na invenção. Um oligonucleotídeo aqui preferido é SEQ IDNO.:1.

A invenção inclui métodos para o uso de quantidades terapeuti- 10 camente eficazes de um ou mais polinucleotídeos anticonexina farmaceuti- camente aceitáveis, incluindo polinucleotídeos de antissenso de conexina, na fabricação de um medicamento ou forma de dosagem. Tais medicamen- tos, formulações e formas de dosagem incluem, por exemplo, formas e for- mulações de aplicação tópica. Tais medicamentos incluem aqueles para o 15 tratamento de um indivíduo conforme aqui revelado. Polinucleotídeos antico- nexina e polinucleotídeos de antissenso de conexina preferidos são polinu- cleotídeos anticonexina 43 e polinucleotídeos de antissenso de conexina 43. De preferência, o medicamento, formulação ou forma de dosagem é uma espuma, creme, spray ou gel.

Em outro aspecto, a invenção inclui um artigo de fabricação

compreendendo um recipiente contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais polinucleotídeos anticonexina farmaceuticamente acei- táveis, por exemplo, polinucleotídeos de antissenso de conexina, e instru- ções para uso. Tais instruções podem incluir com relação ao uso para o tra- 25 tamento de um indivíduo tendo uma ferida crônica ou uma ferida caracteri- zada por cicatrização retardada. Instruções podem incluir instruções para uso com relação a feridas que não cicatrizam em taxas esperadas, tal como feridas de cicatrização retardada, feridas de cicatrização incompleta e feridas crônicas. Polinucleotídeos anticonexina e polinucleotídeos de antissenso de 30 conexina preferidos são polinucleotídeos anticonexina 43 e polinucleotídeos de antissenso de conexina 43.

A invenção inclui um artigo de fabricação compreendendo mate- rial de embalagem contendo uma ou mais formas de dosagem contendo um ou mais polinucleotídeos anticonexina farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, polinucleotídeos de antissenso de conexina, onde o material de embalagem tem um rótulo que indica que a forma de dosagem pode ser u- 5 sada para um indivíduo tendo ou suspeito de ter ou predisposto a qualquer uma das doenças, distúrbios e/ou condições descritos e referidos aqui, inclu- indo doenças, distúrbios e/ou condições caracterizados no todo ou em parte por cicatrização de ferida prejudicada ou retardada ou uma ferida crônica, ou outras feridas que não cicatrizam em taxas esperadas. Tais formas de dosa- 10 gem incluem, por exemplo, formas e formulações de aplicação tópica. Poli- nucleotídeos anticonexina e polinucleotídeos de antissenso de conexina pre- feridos são polinucleotídeos anticonexina 43 e polinucleotídeos de antissen- so de conexina 43.

Em certo outro aspecto, a invenção provê uma embalagem 15 compreendendo um polinucleotídeo anticonexina, por exemplo, um polinu- cleotídeo de antissenso de conexina, junto com instruções para uso para a promoção (por exemplo, diminuição no tempo de cicatrização, melhor resul- tado de ferida) de cicatrização de ferida para uma ferida que está cicatrizan- do incompletamente ou retardada ou uma ferida crônica.

Em todos os aspectos das invenções, o polinucleotídeo antico-

nexina é de preferência um polinucleotídeo de conexina 43, o polinucleotí- deo de antissenso de conexina ê de preferência um polinucleotídeo de antis- senso de conexina 43 e o oligodesoxinucleotídeo de antissenso de conexina é de preferência um oligodesoxinucleotídeo de conexina 43.

Esses e outros aspectos da presente invenção, que não são limi-

tados a ou pela informação neste Breve Sumário, são providos abaixo. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras 1A a 1D mostram imunotingimento de conexina nos fibroblastos dermais, folículos pilosos, vasos sanguíneos e anexos. A Figura 1A mostra tingimento para conexina 43 na epiderme e na derme e tingimen- to para conexina 26 na epiderme em peles normal (barras abertas) e diabéti- ca (barras sólidas), duas semanas após indução de diabetes. A Figura 1B mostra efeitos sobre a expressão de conexina oito semanas após indução de diabetes por STZ. A Figura 1C mostra imunotingimento em controle (C) e diabético (D) em 8 semanas onde pontas de seta marcam o limite entre epi- derme e derme. A Figura 1D mostra quantificação da distância de transfe- 5 rência de corante permanente de junção de hiato através de tecido em cinco minutos em epiderme e derme não-diabéticas (barras abertas) e diabéticas (barras sólidas).

As Figuras 2A a 2D mostram taxas de reepitelização e respostas de níveis de proteína conexina 43 e conexina 26 através da medição do tin- gimento de conexina após ferimento. A Figura 2A mostra zonas onde fingi- mento com conexina em queratinócitos foi quantificado: borda ferida (WE), uma zona adjacente 500 μιτι distante (AD) e borda principal (LE). Tingimento com conexina em WE e AD foi quantificado um e dois dias após o ferimento. Queratinócitos LE foram descritos após 5 dias. A Figura 2B mostra taxa de reepitelização em 1, 2 e 5 dias pós-ferimento em controle (C) e diabético (D). A Figura 2C mostra tingimento com conexina 43 1, 2 e 5 dias pós-ferimento em WE1 AD e LE em animais controle (barras abertas) e diabéticos (barras sólidas). A Figura 2D mostra tingimento com conexina 26 , 1, 2 e 5 dias pós- ferimento em zonas WE, AD e LE em animais controle (barras abertas) e diabéticos (barras sólidas).

As Figuras 3a a 3f e 3a' a 3f mostram tingimento com conexina 1, 2 e 5 dias pós-ferimento em animais controle e diabéticos. As Figuras 3a, 3c e 3e (controle) e 3a', 3c' e 3e' (diabéticos) mostram tingimento com cone- xina 43 1 (Figuras 3a e 3a'), 2 (Figuras 3c e 3c') e 5 (Figuras 3e e 3e') dias 25 pós-ferimento. As Figuras 3b, 3d e 3f (controle) e 3b', 3d' e 3f (diabéticos) mostram tingimento com conexina 26 1 (Figuras 3b e 3b'), 2 (Figuras 3d e 3d') e 5 (Figuras 3f e 3f) após ferimento.

As Figuras 4A a 4C mostram efeitos de aplicação de uma com- posição de oligodesoxinucleotídeo de antissenso de conexina 43 sobre ex- pressão de conexina 43 e cicatrização de ferida. A Figura 4a (controle de sentido) e a Figura 4B (antissenso de conexina 43) mostram expressão de conexina 43 em queratinócitos de WE diabética. A Figura 4C mostra porcen- tagem de reepitelização, 1, 2 e 5 dias pós-ferimento em feridas controle (c) e diabéticas (D) com tratamento com polinucleotídeos de sentido ("s") e antis- senso de conexina 43 ("as").

DESCRIÇÃO DETALHADA Feridas que não cicatrizam em taxas esperadas, incluindo feri-

das de cicatrização lenta, feridas com cicatrização retardada, feridas cicatri- zando incompletamente, feridas deiscentes e feridas crônicas frequentemen- te resultam em infecção e podem levar à amputação ou morte. Comunicação célula-célula através de junções de hiato desempenham papéis pivotais em 10 cicatrização de ferida. Foi constatado que uso de certos compostos, incluin- do aqueles descritos ou referidos aqui, pode bloquear, inibir ou alterar co- municações celulares, o que promove fechamento e cicatrização em feridas que não cicatrizam em taxas esperadas, incluindo feridas com cicatrização lenta, feridas com cicatrização retardada, feridas incompletamente cicatriza- 15 das, feridas deiscentes e feridas crônicas. Para todas as aplicações, agentes de modulação de junção de hiato conexina 43 são preferidos.

Definições

Conforme aqui usado, um "distúrbio" é qualquer distúrbio, doen- ça ou condição que se beneficiaria de um agente que promove cicatrização 20 de ferida e/ou reduz formação de cicatriz. Por exemplo, estão incluídas a- normalidades associadas com ferida em conexão com patologia neuropática, isquêmica e microvascular; pressão sobre a área óssea [cóccix (sacral), quadril (trocantérico), nádegas (isquial) ou calcanhar do pé]; lesão por reper- fusão; e condições associadas com etiologia de refluxo da válvula e condi- 25 ções relacionadas.

Conforme aqui usado, "indivíduo" refere-se a qualquer animal, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda e animais de zoológi- co, esportes ou de estimação, tal como cachorros, cavalos, gados, ovelha, porcos, vacas, etc. O mamífero preferido aqui é um humano, incluindo adul- tos, crianças e idoso.

Conforme aqui usado, "prevenção" significa prevenção total ou em parte ou melhora ou controle. Conforme aqui usado, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" em referência aos compostos ou composições da presente invenção refere- se à quantidade suficiente para induzir um resultado biológico, farmacêutico ou terapêutico desejado. Este resultado pode ser alívio dos sinais, sintomas 5 ou causas de uma doença ou distúrbio ou condição, ou qualquer outra alte- ração desejada de um sistema biológico. Na presente invenção, o resultado vai envolver a promoção e/ou melhora de cicatrização de ferida, incluindo taxas de cicatrização de ferida e fechamento de feridas, total ou em parte. Outros benefícios incluem diminuição no inchaço, inflamação e/ou formação 10 de cicatriz, total ou em parte.

Conforme aqui usado, o termo "tratando" refere-se a ambos o tratamento terapêutico e as medidas profiláticas ou preventivas.

Conforme aqui usado, "simultaneamente" é usado para significar que um ou mais polinucleotídeos anticonexina, por exemplo, polinucleotí- deos de antissenso, são administrados concomitantemente, enquanto o ter- mo "em combinação" é usado para significar que eles são administrados, se não simultaneamente ou em combinação física, então "seqüencialmente" dentro de uma estrutura de tempo que ambos estão disponíveis para agir terapeuticamente. Então, administração "seqüencialmente" pode permitir que um agente seja administrado dentro de minutos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 minutos) ou uma questão de horas, dias, semanas ou meses após o outro contanto que um ou mais polinucleotídeos anticonexina estejam concomitantemente presentes em quantidades eficazes. O retardo de tempo entre administração dos componentes vai variar dependendo da natureza exata dos componentes, da interação entre eles e suas respectivas meias-vidas.

Conforme aqui usado, um "polinucleotídeo anticonexina" diminui ou inibe expressão de mRNA de e/ou proteína conexina. Polinucleotídeos anticonexina incluem, sem limitação, compostos antissenso tal como polinu- 30 cleotídeos de antissenso, outros polinucleotídeos (tal como polinucleotídeos tendo funções de siRNA ou ribozima). Exemplos adequados de um polinu- cleotídeo anticonexina incluem um polinucleotídeo de antissenso para uma conexina. Deste modo, polinucleotídeos anticonexina adequados incluem, por exemplo, polinucleotídeos de antissenso (por exemplo, polinucleotídeos de antissenso de conexina 43) que modulam a expressão ou atividade de conexinas e junções de hiato em tecidos, células e indivíduos selecionados.

5 O termo "curativo para ferida" refere-se a um curativo para apli-

cação tópica a uma ferida e exclui composições adequadas para administra- ção sistêmica. Por exemplo, o um ou mais polinucleotídeos anticonexina (tal como polinucleotídeos de antissenso de conexina) podem ser dispersos em ou sobre uma folha sólida de material de contato com a ferida tal como um 10 material têxtil tecido ou não-tecido ou podem ser dispersos em uma camada de espuma tal como espuma de poliuretana ou em um hidrogel tal como um hidrogel de poliuretana, um hidrogel de poliacrilato, gelatina, carboximetil celulose, pectina, alginato e/ou hidrogel de ácido hialurônico, por exemplo, em um gel ou unguento. Em certas modalidades o um ou mais polinucleotí- 15 deos anticonexina são dispersos em ou sobre um material de folha biode- gradável que provê liberação sustentada dos ingredientes ativos na ferida, por exemplo, uma folha de colágeno seco por congelamento, misturas de colágeno seco por congelamento /alginato (disponíveis sob a Marca Comer- cial Registrada FIBRACOL da Johnson & Johnson Medicai Limited) ou colá- 20 geno seco por congelamento/celulose regenerada oxidada (disponíveis sob a Marca Comercial Registrada PROMOGRAN da Johnson & Johnson Medi- cai Limited).

Conforme aqui usado, "matriz de promoção de ferida" inclui, por exemplo, matrizes de sintéticas ou de ocorrência natural tal como colágeno, 25 matriz acelular, moléculas de base biológica reticuladas, estrutura principal estrutural bioengenheirada baseada em tecido, biopróteses biomanufatura- das e outras estruturas implantadas tal como, por exemplo, enxertos vascu- lares adequados para infiltração e proliferação de célula úteis na promoção de cicatrização de ferida. Material de biomatriz adequado adicional pode in- 30 cluir tecido de colágeno quimicamente modificado para reduzir antigenici- dade e imunogenicidade. Outros exemplos adequados incluem folhas de colágeno para curativos de ferida, matriz acelular livre de antígeno ou com antígeno reduzido (Wilson, G.J. e outros (1990) Trans. Am. Soc. Artif. Intern. 36:340-343) ou outra biomatriz que tenha sido engenheirada para reduzir a resposta antigênica ao material de xenoenxerto. Outras matrizes úteis em promoção de cicatrização de ferida podem incluir, por exemplo, proteínas do 5 pericárdio bovino processado compreendendo colágeno e elastina insolúveis (Courtman, D.W. e outros (1994) J. Biomed. Mater. Res. 28:544-666) e outro tecido acelular que pode ser útil para provisão de um microambiente natural para migração de célula hospedeiro para acelerar regeneração de tecido (Malone, J. M. e outros (1984) J. Vasc. Surg. 1:181-91). A invenção compre- 10 ende uma matriz sintética ou natural compreendendo um ou mais polipeptí- deos anticonexina descritos aqui, incluindo polipeptídeos anticonexina 43. Oligonucleotídeos de antissenso de conexina 43 são preferidos.

Conforme aqui usado, o termo "ferida" inclui qualquer lesão a qualquer tecido, incluindo, por exemplo, feridas de cicatrização retardada ou difíceis de cicatrizar e feridas crônicas. Exemplos de feridas podem incluir ambas feridas abertas e fechadas. O termo "ferida" pode também incluir, por exemplo, lesões à pele e tecido subcutâneo iniciadas de maneiras diferentes (por exemplo, úlceras de pressão de permanência na cama prolongada e feridas induzidas por trauma) e com características variáveis. Feridas podem ser classificadas em um de quatro graus dependendo da profundidade da ferida: i) Feridas de grau I limitadas ao epitélio; ii) Feridas de grau Il se es- tendendo para a derme; iii) feridas de Grau Ill se estendendo para o tecido subcutâneo; e iv) feridas de grau IV (ou feridas de espessura integral) onde ossos são expostos (por exemplo, um ponto de pressão do osso tal como o trocânter ou o sacro).

O termo "ferida de espessura parcial" refere-se a feridas que compreendem Graus l-lll. Exemplos de feridas de espessura parcial incluem úlceras de pressão, úlceras de estase venosa e úlceras diabéticas. A pre- sente invenção compreende tratamento de todas as feridas de um tipo que 30 não cicatriza em taxas esperadas, incluindo feridas de cicatrização retarda- da, feridas incompletamente cicatrizadas e feridas crônicas.

"Ferida que não cicatriza na/em uma taxa esperada" significa uma lesão a qualquer tecido, incluindo feridas retardadas ou difíceis de cica- trizar (incluindo feridas de cicatrização retardada ou incompleta) e feridas crônicas. Exemplos de feridas que não cicatrizam na taxa esperada incluem úlceras, tal como úlceras diabéticas, úlceras de pé diabéticas, úlceras vascu- 5 líticas, úlceras arteriais, úlceras venosas, úlceras de estase venosa, úlceras de pressão, úlceras decubitosas, úlceras infecciosas, úlceras induzidas por trauma, úlceras que queimadura, ulcerações associadas com pioderma gan- grenoso e úlceras mistas. Outras feridas que não cicatrizam em taxas espe- radas incluem feridas deiscentes.

Conforme aqui usado, uma ferida retardada ou difícil de cicatri-

zar pode incluir, por exemplo, uma ferida que é caracterizada pelo menos em parte por 1) uma fase inflamatória prolongada, 2) uma matriz extracelular de formação lenta e/ou 3) uma taxa pequena de epitelização ou fechamento.

O termo "ferida crônica" geralmente refere-se a uma ferida que não cicatriza. Feridas de que não cicatrizam dentro de três meses, por e- xemplo, são consideradas crônicas. Feridas crônicas incluem úlceras veno- sas, úlceras de estase venosa, úlceras arteriais, úlceras de pressão, úlceras diabéticas, úlceras de pé diabéticas, úlceras vasculíticas, úlceras decubito- sas, úlceras de queimadura, úlceras induzidas por trauma, úlceras infeccio- sas, úlceras mistas e pioderma gangrenoso. A ferida crônica pode ser uma úlcera arterial que compreende ulcerações resultantes de bloqueio arterial completo ou parcial. A ferida crônica pode ser uma úlcera venosa ou de es- tase venosa que compreende ulcerações resultantes de um mau funciona- mento da válvula venosa e a doença vascular associada. Em certas modali- dades um método de tratamento de ferida crônica é provido, onde a ferida crônica é caracterizada por um ou mais estágios AHCPR que seguem de ulceração de pressão: estágio 1, estágio 2, estágio 3 e/ou estágio 4.

Conforme aqui usado, ferida crônica pode se referir a, por e- xemplo, uma ferida que é caracterizada pelo menos em parte por um ou mais de (1) um estado de autoperpetuação crônica de inflamação de ferida, (2) uma matriz extracelular de ferida deficiente e defeituosa, (3) células de ferida pobremente respondentes (senescentes) especialmente fibroblastos, limitando produção de matriz extracelular e/ou (4) falha de reepitelização devido em parte à falta da orquestração de matriz extracelular necessária e falta de base para migração. Feridas crônicas podem também ser caracteri- zadas por 1) atividade de inflamação e proteolítica prolongada levando a 5 lesões ulcerativas, incluindo, por exemplo, úlceras diabéticas, de pressão (decubitosas), venosas e arteriais; 2) deposição progressiva de matriz na área afetada, 3) tempos de reparo mais longos, 4) menos contração de feri- da, (5) reepitelização mais lenta e 6) espessura maior de tecido de granula- ção.

Feridas crônicas exemplares podem incluir "úlceras de pressão".

Úlceras de pressão exemplares podem ser classificadas em 4 estágios com base nas orientações da AHCPR (Agency for Health Care Policy and Rese- arch, U.S. Department of Health and Human Services). Uma úlcera de pres- são no estágio I é uma alteração relacionada com pressão observável de 15 pele intacta cujos indicadores conforme comparado com a área adjacente ou oposta no corpo podem incluir mudanças em um ou mais do que segue: temperatura da pele (morna a fria), consistência do tecido (sensação firme ou mole) e/ou sensação (dor, coceira). A úlcera parece como uma área defi- nida de vermelhidão persistente em pele levemente pigmentada, enquanto 20 em tons de pele mais escuros, a úlcera pode aparecer com tons vermelhos, azuis ou púrpuros. Ulceração no estágio 1 pode incluir eritema nonblancha- ble (que não fica branco quando pressionado) de pele intacta e a lesão a- nunciada de ulceração da pele. Em indivíduos com pele mais escura, desco- loração da pele, verruga, edema, induração ou endurecimento pode ser 25 também indicador de ulceração de estágio 1. Ulceração de estágio 2 pode ser caracterizada por perda de pele de espessura parcial envolvendo epi- derme, derme ou ambos. A úlcera é superficial e se apresenta clinicamente como uma abrasão, bolha ou cratera superficial. A ulceração no estágio 3 pode ser caracterizada por perda de pele de espessura integral envolvendo 30 dano a ou necrose de tecido subcutâneo que pode se estender para baixo da, mas não através, da fascia de base. A úlcera se apresenta clinicamente como uma cratera funda minando ou não o tecido adjacente. A ulceração de estágio 4 pode ser caracterizada por perda de pele de espessura integral com destruição extensiva, necrose de tecido ou dano a músculo, osso ou estruturas de apoio (por exemplo, tendão, cápsula do joelho). Em certas mo- dalidades um método de tratamento de uma ferida crônica é provido onde a 5 ferida crônica é caracterizada por um ou mais dos estágios de AHCPR de ulceração de pressão que seguem: estágio 1, estágio 2, estágio 3 e/ou está- gio 4.

Feridas crônicas exemplares podem também incluir "úlceras de- cubitosas". Úlceras decubitosas exemplares podem surgir como um resulta- 10 do de pressão prolongada e sem alívio sobre uma proeminência de osso que leva à isquemia. A ferida tende a acontecer em pacientes que são incapazes de mudar de posição por si mesmo para aliviar o peso, tal como pessoas paralisadas, inconscientes ou severamente debilitadas. Conforme definido pelo U.S. Department of Health and Human Services, a principal medida 15 preventiva inclui identificação de pacientes de alto risco; avaliação freqüente; e medidas prolifáticas tal como reposicionamento programado, leito com alí- vio de pressão apropriado, barreiras de umidade e estado nutricional ade- quado. Opções de tratamento podem incluir, por exemplo, alívio de pressão, remoção cirúrgica ou enzimática, cuidado de ferida úmida e controle da car- 20 ga bacteriana. Em certas modalidades um método de tratamento de uma ferida crônica é provido onde a ferida crônica é caracterizada por úlcera ou ulceração decubitosa, que resulta de pressão prolongada, sem alívio, sobre uma proeminência óssea que leva à isquemia.

Feridas crônicas podem também incluir "úlceras arteriais". Úlce- 25 ras arteriais crônicas são geralmente compreendidas ser ulcerações que acompanham doença cardiovascular arteriosclerótica e hipertensiva. Elas são dolorosas, com margem afiada e frequentemente encontradas nas ex- tremidades inferiores laterais e dedos. Úlceras arteriais podem ser caracteri- zadas por bloqueio arterial completo ou parcial, que pode levar à necrose 30 e/ou ulceração de tecido. Sinais de úlcera arterial podem incluir, por exem- plo, falta de fluxo de sangue da extremidade; ulceração dolorosa; úlceras pequenas, pontuadas, que são geralmente bem circunscritas; pele fresca ou fria; tempo de retorno capilar retardado (pressionar rapidamente a extremi- dade do dedo e soltar, a cor normal deve retornar ao dedo em cerca de 3 segundos ou menos); pele de aparência atrófica (por exemplo, brilhante, fi- na, seca); e perda de pelo da mão e pé. Em certas modalidades, um método 5 de tratamento de uma ferida crônica é provido onde a ferida crônica é carac- terizada por úlceras ou ulcerações arteriais devido a bloqueio arterial com- pleto ou parcial.

Feridas crônicas exemplares podem incluir "úlceras venosas". Úlceras venosas exemplares são o tipo mais comum de úlcera que afeta as 10 extremidades inferiores e podem ser caracterizadas por mau funcionamento da válvula venosa. A veia normal tem válvulas que previnem o fluxo de volta de sangue. Quando essas válvulas se tornam incompetentes, o fluxo de vol- ta de sangue venoso causa congestão venosa. Hemoglobina das células de sangue vermelhas escapa e vaza para o espaço extravascular, causando 15 descoloração amarronzadas geralmente notada. Foi mostrado que a pressão de oxigênio transcutânea da pele circundando uma úlcera venosa é diminuí- da, sugerindo que há forças obstruindo a vascularidade normal da área. Drenagem e fluxo linfáticos também desempenham um papel nessas úlce- ras. A úlcera venosa pode aparecer próximo ao maléolo médio e geralmente 20 acontece em combinação com uma extremidade inferior edematosa e endu- recida; ela pode ser inchada, não muito dolorosa e pode se apresentar com uma descarga gotejante a partir do sítio afetado. Em certas modalidades um método de tratamento de uma ferida crônica é provido onde a ferida crônica é caracterizada por úlceras ou ulceração venosa devido ao mau funciona- 25 mento da válvula venosa e a doença vascular associada. Em certas modali- dades um método de tratamento de uma ferida crônica é provido onde a fe- rida crônica é caracterizada por úlceras ou ulcerações arteriais devido a blo- queio arterial completo ou parcial.

Feridas crônicas exemplares podem incluir "úlceras de estase venosa". Úlceras de estase são lesões associadas com insuficiência venosa e são mais comumente presentes no maléolo médio, geralmente com edema com sinal de cacifo, varizes, pigmentação mosqueada, eritema e petéquia não-palpável e púrpura. A dermatite e úlceras de estase são geralmente pru- ríticas ao invés de dolorosas. Úlceras de estase venosas exemplares podem ser caracterizadas por congestão venosa passiva crônica das extremidades inferiores que resulta em hipoxia local. Um mecanismo de patogênese pos- 5 sível dessas feridas inclui o impedimento de difusão de oxigênio para o teci- do através de bainhas de fibrina perivasculares espessas. Outro mecanismo é que macromoléculas vazando para o tecido perivascular aprisionam fato- res de crescimento necessários para a manutenção da integridade da pele. Adicionalmente, o fluxo de células sanguíneas brancas diminui devido à 10 congestão venosa, ocluindo capilares, ficando ativado, e danificando o endo- télio vascular para predispor à formação de úlcera. Em certas modalidades um método de tratamento de uma ferida crônica é provido, onde a ferida crônica é caracterizada por úlceras ou ulcerações venosas devido ao mau funcionamento da válvula venosa e à doença vascular associada. Em certas 15 modalidades um método de tratamento de uma ferida crônica é provido, on- de a ferida crônica é caracterizada por úlceras ou ulcerações de estase ve- nosas devido à congestão venosa passiva crônica das extremidades inferio- res e/ou hipoxia local resultante.

Feridas crônicas exemplares podem incluir "úlceras diabéticas". Pacientes diabéticos são propensos a ulcerações, incluindo ulcerações do pé, devido a ambas as complicações neurológicas e vasculares. Neuropatia periférica pode causar perda alterada ou completa de sensação no pé e/ou perna. Pacientes diabéticos com neuropatia avançada perdem toda a habili- dade em discriminação de pontudo-embotado. Quaisquer cortes ou trauma ao pé podem ficar completamente despercebidos por dias ou semanas em um paciente com neuropatia. Não é incomum ter um paciente com neuropa- tia que nota que a úlcera "apareceu" quando, de fato, a úlcera esteve pre- sente por algum tempo. Para pacientes de neuropatia, controle de glicose rígido mostrou diminuir a progressão da doença. Deformidade do pé charcot pode também acontecer como um resultado de sensação menor. Pessoas com "sensação" normal em seus pés têm a habilidade em sentir automati- camente quando muita pressão está sendo posta sobre a área do pé. Uma vez identificada, nossos corpos instintivamente mudam a posição para aliviar esse estresse. Um paciente com neuropatia avançada perde esta habilidade em sentir o insulto de pressão sustentada, como um resultado, isquemia e necrose de tecido podem acontecer levando a, por exemplo, ulcerações 5 plantares. Adicionalmente, microfraturas nos ossos do pé, se não notadas ou não tratadas, podem resultar em desfiguração, inchaço crônico e proemi- nências ossudas adicionais. Doença microvascular é uma das complicações significantes para diabetes, que podem também levar a ulcerações. Em cer- tas modalidades um método de tratamento de uma ferida crônica é provido, 10 onde a ferida crônica é caracterizada por úlceras e/ou ulcerações no pé dia- béticas devido a ambas as complicações neurológicas e vasculares do dia- betes.

Feridas crônicas exemplares podem incluir "úlceras traumáti- cas". Formação de úlceras traumáticas pode acontecer como um resultado 15 de lesões traumáticas para o corpo. Essas lesões incluem, por exemplo, comprometimentos para o sistema arterial, venoso ou linfático; mudanças na arquitetura ossuda do esqueleto; perda de camadas de tecido-epiderme, derme, tecido mole subcutâneo, músculo ou osso; dano a partes ou órgãos do corpo e perda de partes ou órgãos do corpo. Em certas modalidades, um 20 método de tratamento de uma ferida crônica é provido, onde a ferida crônica é caracterizada por ulcerações associadas com lesões traumáticas ao corpo.

Feridas crônicas exemplares podem incluir "úlceras de queima- dura", incluindo queimadura de 1o grau (isto é, área de pele avermelhada, superficial); queimadura de 2o grau (um sítio de lesão empolado que pode 25 cicatrizar espontaneamente após o fluido da bolha ter sido removido); quei- madura de 3o grau (queimadura através de toda a pele e geralmente requer intervenção cirúrgica para cicatrização de ferida); fervente (pode acontecer de água quente fervente, gordura ou fluido de radiador); térmica (pode acon- tecer de chamas, geralmente queimaduras profundas); química (pode vir de 30 ácido e álcali; geralmente queimaduras profundas); elétrica (ou de baixa ten- são perto de casa ou alta tensão no trabalho); faísca de explosão (geralmen- te lesões superficiais); e queimaduras de contato (geralmente profundas e podem acontecer de tubos de escapamento, ferros quentes e fomos). Em certas modalidades, um método de tratamento de uma ferida crônica é pro- vido, onde a ferida crônica é caracterizada por ulcerações associadas com lesões de queimadura ao corpo.

Feridas crônicas exemplares podem incluir "úlceras vasculíti-

cas". Úlceras vasculíticas também acontecem nas extremidades inferiores e são lesões dolorosas, marginadas com pontas, que podem ter bolhas púrpu- ras e hemorrágicas palpáveis. As doenças de colágeno, septicemias e uma variedade de distúrbios hematológicos (por exemplo, trombocitopenia, dis- proteinemia) podem ser a causa desta condição aguda, severa.

Feridas crônicas exemplares podem incluir pioderma gangreno- so. Pioderma gangrenoso acontece como úlceras simples ou múltiplas, mui- to dolorida das pernas inferiores. Uma borda vermelho escuro a púrpura, minada, circunda o defeito central purulento. Biópsia tipicamente falha em 15 revelar uma vasculite. Em metade dos pacientes, ela é associada com uma doença sistêmica tal como colite ulcerativa, ileíte regional ou leucemia. Em certas modalidades, um método de tratamento de uma ferida crônica é pro- vido, onde a ferida crônica é caracterizada por ulcerações associadas com pioderma gangrenoso.

Feridas crônicas exemplares podem incluir úlceras infecciosas.

Úlceras infecciosas seguem inoculação direta com uma variedade de orga- nismos e podem estar associadas com adenopatia regional significante. In- fecção por micobactéria, difteria, blastomiose, esporotricose, tularemia e fe- bre do arranhão do gato são exemplos. As úlceras genitais de sífilis primária 25 são tipicamente não doloridas, com uma base firme, limpa. Aquelas de can- croide e granuloma inguinal tendem a ser lesões mais ásperas, sujas e mais exageradas. Em certas modalidades, um método de tratamento de uma feri- da crônica é provido, onde a ferida crônica é caracterizada por ulcerações associadas com infecção.

Conforme aqui usado, o termo "ferida deiscente" refere-se a uma

ferida, geralmente uma ferida cirúrgica, que rompeu ou rachou. Em certas modalidades, um método de tratamento de uma ferida que não cicatriza na taxa esperada é provido, onde a ferida é caracterizada por deiscência. Polinucleotídeos anticonexina

Polinucleotídeos anticonexina incluem polinucleotídeos de antis- senso de conexina bem como polinucleotídeos que têm funcionalidades que 5 permitem que eles sub-regulem expressão de conexina (por exemplo, atra- vés de sub-regulagem de transcrição ou tradução de mRNA). No caso de sub-regulagem, isto terá um efeito de redução de comunicação célula-célula direta por junções de hiato no sítio onde a expressão de conexina está sub- regulada.

Polinucleotídeos anticonexina adequados incluem polinucleotí-

deos de RNAi e polinucleotídeos de siRNA.

Síntese de polinucleotídeos de antissenso e outros polinucleotí- deos anticonexina tal como RNAi1 siRNA e polinucleotídeos de ribozima bem como polinucleotídeos tendo estruturas principais modificadas e mistas é 15 conhecida daqueles de habilidade na técnica. Vide, por exemplo, Stein, C.A. e Krieg A.M. (Eds.), Applied Antisense Oligonucleotide Technology, 1998 (Wiley-Liss).

De acordo com um aspecto, a sub-regulagem de expressão de conexina pode estar baseada geralmente na abordagem de antissenso u- 20 sando polinucleotídeos de antissenso (tal como polinucleotídeos de DNA ou RNA) e mais particularmente no uso de oligodesoxinucleotídeos de antis- senso (ODN). Esses polinucleotídeos (por exemplo, ODN) se direcionam à(s) proteína(s) conexina a ser sub-regulada. Tipicamente os polinucleotí- deos são de filamento simples, mas podem ser de filamento duplo.

O polinucleotídeo de antissenso pode inibir transcrição e/ou tra-

dução de uma conexina. De preferência o polinucleotídeo é um inibidor es- pecífico de transcrição e/ou tradução do gene ou mRNA de conexina, e não inibe transcrição e/ou tradução de outros genes ou mRNAs. O produto pode se ligar ao gene ou mRNA de conexina ou (i) 5' para a seqüência de codifi- 30 cação e/ou (ii) para a seqüência de codificação e/ou (iii) 3' para a seqüência de codificação.

O polinucleotídeo de antissenso é geralmente de antissenso pa- ra um mRNA de conexina. Tal polinucleotídeo pode ser capaz de hibridiza- ção para o mRNA de conexina e pode então inibir a expressão de conexina através de interferência com um ou mais aspectos de metabolismo de mR- NA de conexina incluindo transcrição, processamento de mRNA, transporte 5 de mRNA a partir do núcleo, tradução ou degradação de mRNA. O polinu- cleotídeo de antissenso tipicamente hibridiza para o mRNA de conexina para formar um dúplex que pode causar inibição direta de tradução e/ou desesta- bilização de mRNA. Tal dúplex pode ser suscetível à degradação por nucle- ases.

O polinucleotídeo de antissenso pode hibridizar para todo ou

parte do mRNA de conexina. Tipicamente o polinucleotídeo de antissenso hibridiza para a região de ligação de ribossomo ou a região de codificação do mRNA de conexina. O polinucleotídeo pode ser complementar a toda ou uma região do mRNA de conexina. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser 15 o complemento exato de todo o parte de mRNA de conexina. No entanto, complementaridade absoluta não é requerida e polinucleotídeos que têm complementaridade suficiente para formar um dúplex tendo uma temperatu- ra de fusão de mais do que cerca de 20° C, 30° C ou 40° C sob condições fisiológicas são particularmente adequados para uso na presente invenção.

20

Então o polinucleotídeo é tipicamente um homólogo de uma se- qüência complementar ao mRNA. O polinucleotídeo pode ser um polinucleo- tídeo que hibridiza para o mRNA de conexina sob condições de média a alta estringência tal como cloreto de sódio 0,03M e citrato de sódio 0,03M em a partir de cerca de 50° C a cerca de 60° C.

Para certos aspecto, polinucleotídeos adequados são tipicamen- te de a partir de cerca de 6 a 40 nucleotídeos de comprimento. De preferên- cia um polinucleotídeo pode ser de a partir de cerca de 12 a cerca de 35 nu- cleotídeos de comprimento ou alternativamente de a partir de cerca de 12 a 30 cerca de 20 nucleotídeos de comprimento ou mais com mais preferência de a partir de cerca de 18 a cerca a cerca de 32 nucleotídeos de comprimento. De acordo com um aspecto alternativo, o polinucleotídeo pode ser de pelo menos cerca de 40, por exemplo, pelo menos cerca de 60 ou pelo menos cerca de 80, nucleotídeos de comprimento e até cerca de 100, cerca de 200, cerca de 300, cerca de 400, cerca de 500, cerca de 1000, cerca de 2000 ou cerca de 3000 ou mais nucleotídeos de comprimento.

A proteína ou proteínas conexinas direcionadas pelos polinu-

cleotídeos serão dependentes do sítio onde sub-regulagem deve ser realiza- da. Isto reflete a formação não-uniforme de junção(ões) de hiato em sítios diferentes em todo o corpo em termos de composição de subunidade de co- nexina. A conexina é uma conexina que acontece naturalmente em um hu- 10 mano ou animal em um aspecto ou acontece naturalmente no tecido onde expressão ou atividade de conexina deve ser diminuída. O gene da conexina (incluindo seqüência de codificação) geralmente tem homologia com a se- qüência de codificação de uma ou mais das conexinas específicas mencio- nadas aqui, tal como homologia com a seqüência de codificação de conexi- 15 na 43 mostrada na Tabela 2. A conexina é tipicamente uma α ou β conexina. De preferência a conexina é uma o conexina e é expressa no tecido a ser tratado.

Algumas proteínas conexina são, no entanto, mais ubíquas do que outras em termos de distribuição em tecido. Uma das mais espalhadas é conexina 43. Polinucleotídeos direcionados à conexina 43 são particular- mente adequados para uso na presente invenção. Em outros aspectos ou- tras conexinas são direcionadas.

Em um aspecto preferido, os polinucleotídeos de antissenso são direcionados ao mRNA de uma proteína conexina apenas. Com mais prefe- rência, esta proteína conexina é conexina 43. Em outro aspecto, a proteína conexina é conexina 26, 30, 31,1, 32, 36, 37, 40 ou 45. Em outros aspectos, a proteína conexina é conexina 30.3, 31, 40.1 ou 46.6.

É também compreendido que polinucleotídeos se direcionando a proteínas conexinas separadas podem ser usados em combinação (por e- xemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais conexinas diferentes podem ser direcionadas). Por exemplo, polinucleotídeos direcionados à conexina 43, e um ou mais outros membros da família conexina (tal como conexina 26, 30, 30.3, 31.1, 32, 36, 37, 40, 40.1, 45 e 46.6), podem ser usados em combinação.

Alternativamente, os polinucleotídeos de antissenso podem ser parte de composições que podem compreender polinucleotídeos para mais de uma proteína conexina. De preferência, uma das proteínas conexina às 5 quais polinucleotídeos são direcionados é conexina 43. Outras proteínas conexina às quais oligodesoxinucleotídeos são direcionados podem incluir, por exemplo, conexinas 26, 30, 30.3, 31.1, 32, 36, 37, 40, 40.1, 45 e 46.6. Polinucleotídeos exemplares adequados (e ODNs) direcionados a várias conexinas são mostrados na Tabela 1.

Polinucleotídeos de antissenso individuais podem ser específi-

cos para uma conexina particular ou podem ser direcionar a 1, 2, 3 ou mais conexinas diferentes. Polinucleotídeos específicos vão geralmente se dire- cionar a seqüências no gene ou mRNA de conexina que não são conserva- das entre conexinas, enquanto polinucleotídeos não-específicos vão se dire- cionar a seqüências conservadas para várias conexinas.

Os polinucleotídeos para uso na invenção podem ser adequa- damente oligômeros fosfodiéster não-modificados. Tais oligodesoxinucleotí- deos podem variar em comprimento. Um polinucleotídeo de 30 mer foi verifi- cado ser particularmente eficaz.

Muitos aspectos da invenção são descritos com referência a oli-

godesoxinucleotídeos. No entanto, é compreendido que outros polinucleotí- deos adequados (tal como polinucleotídeos de RNA) podem ser usados nesses aspectos.

Os polinucleotídeos de antissenso podem ser quimicamente 25 modificados. Isto pode aumentar sua resistência à nuclease e pode aumen- tar sua habilidade em entrar em células. Por exemplo, oligonucleotídeos de fosforotioato podem ser usados. Outros análogos de desoxinucleotídeo in- cluem metilfosfonatos, fosforamidatos, fosforoditioatos, N3’P5'- fosforamidatos e oligoribunucleotídeo fosforotioatos e seus análogos 2'-0- 30 alquila e 2'-0-metilribonucleotídeo metilfosfonatos. Oligonucleotídeos de es- trutura principal alternativamente misturados ("MBOs") podem ser usados. MBOs contêm segmentos de oligodesoxinucleotídeos de fosfotioato e seg- mentos apropriadamente dispostos de oligodesoxi- ouo oligorribonucleotí- deos modificados^MOBs-tênn segmehtos de ligações fosforotioato e outros segmentos de outros oligonucleotídeos modificados, tal como metilfosfonato, que são não-iônicos e muito resistentes a nucleases ou 2-0- alquiloligorribonucleotídeos. Métodos de preparação de oligonucleotídeos de estrutura principal modificada e estrutura principal mista são conhecidos na técnica.

A seqüência precisa do polinucleotídeo de antissenso usado na invenção vai depender da proteína conexina-alvo. Em uma modalidade, poli- nucleotídeos de antissenso de conexina adequados podem incluir polinucle- otídeos tal como oligodesoxinucleotídeos selecionados das seqüências que seguem conforme mostrado na Tabela 1: TABELA 1 5’ GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC 3' (conexina 43) (SEQ ID NO:1) 5' GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC 3' (conexina 43) (SEQ ID NO:2) 5’ GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT 3’ (conexina 43) (SEQ ID NO:3) 5' TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA 3' (conexina 26) (SEQ ID NO:4) 5' CAT CTC CTT GGT GCT CAA CC 3' (conexina 37) (SEQ ID NO:5) 5' CTG AAG TCG ACT TGG CTT GG 3' (conexina 37) (SEQ ID NO:6) 5' CTC AGA TAG TGG CCA GAA TGC 3' (conexina 30) (SEQ ID NO:7) 5’ TTG TCC AGG TGA CTC CAA GG 3' (conexina 30) (SEQ ID NO:8) 5' CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C 3' (conexina 31.1) (SEQ ID NO:9) 5' AGA GGC GCA CGT GAG ACA C 3' (conexina 31.1) (SEQ ID N0:10) 5' TGA AGA CAA TGA AGA TGT T 3' (conexina 31.1) (SEQ ID ΝΟ.Ί1) 5’ TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A 3' (conexina 32) (SEQ ID NO:12) Polinucleotídeos adequados para a preparação das composi- ções de polinucleotídeo combinado descritas aqui incluem, por exemplo, po- linucleotídeos para conexina 43 e polinucleotídeo para conexinas 26, 30, 31.1, 32 e 37 conforme descrito na Tabela 1 acima.

Embora a seqüência precisa do polinucleotídeo de antissenso

usado na invenção vá depender da proteína conexina direcionada, para co- nexina 43, polinucleotídeos de antissenso tendo as seqüências que seguem foram verificados ser particularmente adequados: GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC (SEQ ID NO:1); GTA ATT GCG GCA GGA GGA 10 ATT GTT TCT GTC (SEQ ID NO:2); e GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT (SEQ ID NO:3).

Por exemplo, polinucleotídeos de antissenso adequados para conexinas 26, 31.1 e 32 têm as seqüências que seguem:

5' TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA (conexina 26) (SEQ ID NO:4);

5' CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C (conexina 31.1) (SEQ ID NO:9); e 5' TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A (conexina 32) (SEQ ID NO: 12).

Outras seqüências de polinucleotídeo de antissenso de conexina úteis de acordo com os métodos da presente invenção incluem:

5' CAT CTC CTT GGT GCT CAA CC 3’ (conexina 37) (SEQ ID NO:5);

5’ CTG AAG TCG ACT TGG CTT GG 3’ (conexina 37) (SEQ ID NO:6);

5' CTC AGA TAG TGG CCA GAA TGC 3’ (conexina 30) (SEQ ID NO:7);

5’ TTG TCC AGG TGA CTC CAA GG3' (conexina 30) (SEQ ID NO:8);

5' AGA GGC GCA CGT GAG ACA C 3’ (conexina 31.1) (SEQ ID NO: 10); e 5' TGA AGA CAA TGA AGA TGT T 3' (conexina 31.1) (SEQ ID NO:11).

Polinucleotídeos, incluindo ODN's, direcionados a proteínas co-

nexinas podem ser selecionados em termos de sua seqüência de nucleotí- deo através de qualquer abordagem conveniente, convencional. Por exem- plo, os programas de computador MacVector e OligoTech (da Oligos etc. Eugene, Oregon, USA) podem ser usados. Uma vez selecionados, os ODN's podem ser sintetizados usando um sintetizador de DNA.

Homólogos de Polinucleotídeo

Homologia e homólogos são discutidos aqui (por exemplo, o po- linucleotídeo pode ser um homólogo de um complemento para uma seqüên- cia em mRNA de conexina). Tal polinucleotídeo tipicamente tem pelo menos cerca de 70% de homologia, de preferência pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% 5 ou pelo menos cerca de 99% de homologia com a seqüência relevante, por exemplo, em uma região de pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 100 nucleotídeos mais contíguos (da seqüência homóloga).

Homologia pode ser calculada com base em qualquer método na 10 técnica. Por exemplo, o Pacote UWGCG provê o programa BESTFIT, que pode ser usado para calcular homologia (por exemplo, usado em seus ajus- tes de default) (Devereux e outros (1984) Nucleic Acids Research 12, p. 387- 395). Os algoritmos PILEUP e BLAST podem ser usados para calcular ho- mologia ou seqüências de alinhamento (tipicamente em seus ajustes de de-

- 15 fault), por exemplo, conforme descrito em Altschul, S.F. (1993) J. Moi Evoi 36:290-300; Altschul, S.F. e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

Software para realizar análises BLAST está publicamente dispo- nível através do National Center for Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro identificação 20 de par de seqüência de escore alto (HSPs) através da identificação de pala- vras curtas de comprimento W na seqüência de investigação que ou combi- nam ou satisfazem algum escore limiar validado positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência de banco de dados. T é referido como o limiar de escore de palavra vizinha (Altschul e 25 outros, supra). Estes encontros de palavra vizinha iniciais agem como se- mentes para início de pesquisa para encontrar HSPs contendo-as. Os en- contros de palavra são estendidos em ambas as direções ao longo de cada seqüência até o ponto onde o escore de alinhamento cumulativo puder ser aumentado. Extensões para os encontros de palavra em cada direção são 30 paradas quando: o escore de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor atingido máximo; o escore cumulativo vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de escore nega- tivo; ou a extremidade de qualquer seqüência for atingida.

Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sen- sibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como de- faults um comprimento de palavra (W), os alinhamentos de matriz de escore 5 BLOSUM62 (vide Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Nati Acad. Sei. USA 89:10915-10919) (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4 e uma compa- ração de ambos filamentos.

O algoritmo BLAST realiza uma análise estatística da similarida- de entre duas seqüências; vide, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. 10 Nati Acad. Sei. USA 90:5873-5787. Uma medida de similaridade provida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N))t que provê uma indicação da probabilidade que uma combinação entre duas seqüên- cias de nucleotídeo ou amino ácidos aconteceria por acaso. Por exemplo, uma seqüência é considerada similar a outra seqüência se a menor probabi- 15 Iidade de soma em comparação da primeira seqüência com uma segunda seqüência for menos do que cerca de 1, de preferência menos do que cerca de 0,1, com mais preferência menos do que cerca de 0,01 e com mais prefe- rência menos do que cerca de 0,001.

A seqüência homóloga tipicamente difere da seqüência relevan- te em pelo menos cerca de (ou não mais do que cerca de) 2, 5,10,15, 20 ou mais mutações (que podem ser substituições, deleções ou inserções). Essas mutações podem ser medidas através de qualquer uma das regiões mencio- nadas acima em relação a cálculo de homologia.

A seqüência homóloga tipicamente hibridiza seletivamente para 25 a seqüência original em um nivel significantemente acima da base. Hibridi- zação seletiva é tipicamente conseguida usando condições de média a alta estringência (por exemplo, cloreto de sódio 0,03M e citrato de sódio 0,03M em a partir de cerca de 50° C a cerca de 60° C). No entanto, tal hibridização pode ser realizada sob quaisquer condições adequadas conhecidas na téc- 30 nica (vide Sambrook e outros (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Ma- nual). Por exemplo, se alta estringência for requerida, condições adequadas incluem 2 x SSC a 60° C. Formas de Dosagem e Formulações e Administração

Os agentes da invenção podem ser administrados a um indiví- duo com necessidade de tratamento, tal como um indivíduo com qualquer uma das feridas mencionadas aqui. A condição do indivíduo pode então ser 5 melhorada. O polinucleotídeo anticonexina pode ser usado no tratamento do corpo do indivíduo através de terapia. Eles podem ser usados na fabricação de um medicamento para tratar qualquer uma das feridas mencionadas aqui.

O polinucleotídeo anticonexina pode estar presente em uma forma substancialmente isolada. Será compreendido que o produto pode ser 10 misturado com carreadores ou diluentes que não vão interferir com o propó- sito pretendido do produto e será ainda considerado como substancialmente isolado. Um produto da invenção pode também estar em uma forma subs- tancialmente purificada, caso onde ele vai geralmente compreender cerca de 80%, 85% ou 90%, incluindo, por exemplo, pelo menos cerca de 95%, pelo 15 menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% do polinucleotídeo ou massa seca da preparação.

Dependendo da via de administração pretendida, os produtos farmacêuticos, composições farmacêuticas, preparações combinadas e me- dicamentos da invenção podem, por exemplo, tomar a forma de soluções, 20 suspensões, instilações, sprays, pastas, cremes, géis, espumas, unguentos, emulsões, loções, tintas, formulações de liberação sustentada ou pós, e tipi- camente contêm cerca de 0,01% a cerca de 1% de ingrediente(s) ativo(s), cerca de 1 % a 50% de ingrediente(s) ativo(s), cerca de 2% a 60% de ingre- diente(s) ativo(s), cerca de 2% a 70% de ingrediente(s) ativo(s) ou até cerca 25 de 90% de ingrediente(s) ativo. Outras formulações adequadas incluem for- mulações baseadas em gel pluronic, formulações baseadas em carboxime- tilcelulose (CMC) e formulações baseadas em hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Outras formulações úteis incluem preparações de liberação lenta ou retardada.

Géis ou geléias podem ser produzidos usando um agente de

geleificação adequado incluindo, mas não limitado a, gelatina, tragacanto ou um derivado de celulose e podem incluir glicerol como um umectante, emoli- ente e preservativo. Unguentos são preparações semi-sólidas que consistem no ingrediente ativo incorporado em uma base graxa, cerosa ou sintética. Exemplos de cremes adequados incluem, mas não estão limitados a, emul- sões água-em-óleo e óleo-em-água. Cremes água-em-óleo podem ser for- 5 mulados usando um agente emulsificante adequado com propriedades simi- lares, mas não limitado, àquelas dos álcoois graxos tal como álcool de cetila ou álcool de cetoestearila e à cera emulsificante. Cremes óleo-em-água po- dem ser formulados usando um agente emulsificante tal como cera emulsifi- cante cetomacrogol. Propriedades adequadas incluem a habilidade em mo- 10 dificar a viscosidade da emulsão e ambas as estabilidades física e química em uma faixa ampla de pH. A base de creme solúvel ou miscível em água pode conter um sistema preservativo e pode ser também tamponada para manter um pH fisiológico adequado.

Preparações em espuma podem ser formuladas para serem a- 15 plicadas a partir de uma embalagem aerossol pressurizada, através de um aplicador adequado, usando propelentes inertes. Excipientes adequados para a formulação da base de espuma incluem, mas não estão limitados a, propileno glicol, cera emulsificante, álcool de cetila e gliceril estearato. Pre- servativos potenciais incluem metilparabeno e propilparabeno.

De preferência os agentes da invenção são combinados com um

carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável para produzir uma com- posição farmacêutica. Carreadores e diluentes adequados incluem soluções salinas isotônicas, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato. Di- luentes e excipientes adequados também incluem, por exemplo, água, solu- 25 ção salina, dextrose, glicerol ou similar e combinações dos mesmos. Ainda, se desejado substâncias tal como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de estabilização ou tamponamento de pH podem também estar pre- sentes.

O termo "carreador farmaceuticamente aceitável" refere-se a qualquer carreador farmacêutico que não induz por si a produção de anticor- pos prejudiciais ao indivíduo recebendo a composição e que pode ser admi- nistrado sem toxidez indevida. Carreadores adequados podem ser macro- moléculas grandes, lentamente metabolizadas, tal como proteínas, polissa- carídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, amino ácidos poliméricos e copolímeros de amino ácido.

Sais farmaceuticamente aceitáveis podem também estar presen- 5 tes, por exemplo, sais de ácido mineral tal como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e similar; e os sais de ácidos orgânicos tal como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e similar.

Materiais carreadores adequados incluem qualquer carreador ou veículo geralmente usado como uma base para cremes, loções, sprays, es- 10 pumas, géis, emulsões, loções ou tintas para administração tópica. Exem- plos incluem agentes emulsificantes, carreadores inertes incluindo bases de hidroxicarbono, bases emulsificantes, solventes não-tóxicos ou bases solú- veis em água. Exemplos particularmente adequados incluem pluronics, HPMC, CMC e outros ingredientes à base de celulose, lanolina, parafina du- 15 ra, parafina líquida, parafina amarela macia ou parafina branca macia, cera de abelha branca, cera de abelha amarela, álcool de cetoestearila, álcool de cetila, dimeticonas, ceras emulsificantes, miristato de isopropila, cera micro- cristalina, álcool de oleíla e álcool de estearila.

De preferência, o carreador ou veículo farmaceuticamente acei- 20 tável é um gel, adequadamente um gel de copolímero de polioxietileno- polioxipropileno não-iônico, por exemplo, um gel Pluronic, de preferência Pluronic F-127 (BASF Corp.). Este gel é particularmente preferido uma vez que ele é líquido em temperaturas baixas, mas rapidamente sedimenta em temperaturas fisiológicas, que confina a liberação do agente ao sítio de apli- 25 cação ou imediatamente adjacente a este sítio.

Um agente auxiliar tal como caseína, gelatina, albumina, cola, alginato de sódio, carboximetilcelulose, metilcelulose, hidroxietilcelulose ou álcool de polivinila pode estar também incluído na formulação da invenção.

Outras formulações adequadas incluem formulações baseadas em gel pluronic, formulações baseadas em carboximetilcelulose (CMC) e formulações baseadas em hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). A composição pode ser formulada para qualquer forma de aplicação desejada, incluindo administração tópica, instilação, parenteral, intramuscular, subcutânea ou transdermal. Outras formulações úteis incluem preparações de liberação lenta ou retardada.

A formulação que é administrada pode conter agentes de trans- fecção. Exemplos de tais agentes incluem agentes catiônicos (por exemplo, fosfato de cálcio e DEAE-dextrano) e Iipofectantes (por exemplo, lipofectam® e transfectam®) e tensoativos.

Em uma modalidade, a formulação inclui ainda um tensoativo para auxiliar com penetração em célula de polinucleotídeo ou a formulação pode conter qualquer agente de carregamento adequado. Qualquer tensoa- tivo não-tóxico adequado pode ser incluído, tal como DMSO. Alternativamen- te um agente de penetração transdermal tal como uréia pode ser incluído.

A dose eficaz para um dado indivíduo de preferência se encontra dentro da dose que é terapeuticamente eficaz para pelo menos 50% da po- pulação e que exibe pouca ou nenhuma toxidez neste nível.

A dosagem eficaz de cada um dos polinucleotídeos anticonexina empregados nos métodos e composições da invenção pode variar depen- dendo de vários fatores incluindo o polinucleotídeo anticonexina particular empregado, o modo de administração, a frequência de administração, a feri- 20 da sendo tratada, a severidade da ferida sendo tratada, a via de administra- ção, as necessidades de uma sub-população de paciente em ser tratada ou as necessidades do paciente individual, necessidades diferentes que podem ser devido à idade, sexo, peso do corpo, ferida médica relevante específica para o paciente.

Uma dose adequada pode ser de a partir de cerca de 0,001 a

cerca de 1 mg/kg de peso do corpo tal como cerca de 0,01 a cerca de 0,4 mg/kg de peso do corpo. Uma dose adequada pode, no entanto, ser de a partir de cerca de 0,001 a cerca de 0,1 mg/kg de peso do corpo tal como cerca de 0,01 a cerca de 0,050 mg/kg de peso do corpo. Doses de a partir 30 de cerca de 1 a 100, 200, 300, 400 e 500 microgramas são apropriadas. Conforme aqui mencionado, aplicações repetidas são compreendidas. Apli- cações repetidas são tipicamente aplicadas mais ou menos uma vez por semana ou quando cicatrização de ferida parecer parada ou lenta.

Ainda outros níveis de dosagem entre cerca de 1 nanograma (ng)/kg e cerca de 1 mg/kg de peso do corpo por dia de cada um dos agen- tes descritos aqui. Em certas modalidades, a dosagem de cada um dos compostos objeto vai geralmente estar na faixa de cerca de 1 ng a cerca de

1 micrograma por kg de peso do corpo, cerca de 1 ng a cerca de 0,1 micro- grama por kg de peso do corpo, cerca de 1 ng a cerca de 10 ng por kg de peso do corpo, cerca de 10 ng a cerca de 0,1 micrograma por kg de peso do corpo, cerca de 0,1 micrograma a cerca de 1 micrograma por kg de peso do corpo, cerca de 20 ng a cerca de 100 ng por kg de peso do corpo, cerca de 0,001 mg a cerca de 100 mg por kg de peso do corpo, cerca de 0,01 mg a cerca de 10 mg por kg de peso do corpo ou cerca de 0,1 mg por kg de peso do corpo. Em certas modalidades, a dosagem de cada um dos compostos objeto vai geralmente estar na faixa de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,01 mg por kg de peso do corpo, cerca de 0,01 mg a cerca de 0,1 mg por kg de peso do corpo, cerca de 0,1 mg a cerca de 1 mg por kg de peso do corpo ou cerca de 1 mg por kg de peso do corpo. Se mais de um polinucleotídeo anti- conexina for usado, a dosagem de cada polinucleotídeo anticonexina não precisa estar na mesma faixa que o outro. Por exemplo, a dosagem de um polinucleotídeo anticonexina pode estar entre cerca de 0,01 mg a cerca de 1 mg por kg de peso do corpo e a dosagem de outro polinucleotídeo anticone- xina pode estar entre cerca de 0,1 mg a cerca de 1 mg por kg de peso do corpo. Conforme aqui mencionado, aplicações repetidas são compreendi- das. Aplicações repetidas são tipicamente aplicadas cerca de uma vez por semana ou quando cicatrização de ferida parecer parada ou lenta.

Outras doses úteis variam de a partir de cerca de 1 a cerca de 10 microgramas por centímetro quadrado de tamanho da ferida. Certas do- ses serão cerca de 1 a 2, cerca de 1 a 5, cerca de 2 a 4, cerca de 5 a 7 e cerca de 8 a 10 microgramas por centímetro quadrado de tamanho da ferida. 30 Outras doses preferidas são maiores do que cerca de 10 microgramas por centímetro quadrado de tamanho da ferida, incluindo cerca de 15 microgra- mas por centímetro quadrado de tamanho da ferida, cerca de 20 microgra- mas por centímetro quadrado de tamanho da ferida, cerca de 25 microgra- mas por centímetro quadrado de tamanho da ferida, cerca de 30 microgra- mas por centímetro quadrado de tamanho da ferida, cerca de 35 microgra- mas por centímetro quadrado da ferida, cerca de 40 microgramas por centí- 5 metro quadrado de tamanho da ferida, cerca de 50 microgramas por centí- metro quadrado do tamanho da ferida e cerca de 100 microgramas de cen- tímetro quadrado de tamanho da ferida. Outras doses úteis são cerca de 150 microgramas por centímetro quadrado de tamanho da ferida, cerca de 200 microgramas por centímetro quadrado de tamanho da ferida, cerca de 250 10 microgramas por centímetro quadrado de ferida ou cerca de 500 microgra- mas por centímetro quadrado de tamanho de ferida. Conforme aqui mencio- nado, aplicações repetidas são compreendidas. Aplicações repetidas são tipicamente aplicadas cerca de uma vez por semana ou quando cicatrização de ferida parecer parada ou lenta.

Por exemplo, em certas modalidades, a composição de polinu-

cleotídeo anticonexina pode ser aplicada em concentração final de cerca de 0,01 micromolar (μΜ) ou 0,05 μΜ a cerca de 20 μΜ no sítio de tratamento e/ou adjacente ao sítio de tratamento. De preferência, a composição de poli- nucleotídeo de antissenso é aplicada em cerca de 0,05 μΜ a cerca de 100 20 μΜ de concentração final, com mais preferência, a composição de polinucle- otídeo anticonexina é aplicada em concentração final de cerca de 1,0 μΜ a cerca de 50 μΜ e com mais preferência a composição de polinucleotídeo anticonexina é aplicada em concentração final de cerca de 5 a 10 μΜ a cer- ca de 30 a 50 μΜ. Adicionalmente, a composição de polinucleotídeo antico- 25 nexina é aplicada em concentração final de cerca de 8 μΜ a cerca de 20 μΜ e alternativamente a composição de polinucleotídeo anticonexina é aplicada em concentração final de cerca de 10 μΜ a cerca de 20 μΜ ou em concen- tração final de cerca de 10 a cerca de 15 μΜ. Em certas modalidades, o po- linucleotídeo anticonexina é aplicado em concentração final de cerca de 10 30 μΜ. Em ainda outra modalidade, a composição de polinucleotídeo anticone- xina é aplicada em concentração final de cerca de 1 a 15 μΜ. Quantidades de dose de polinucleotídeo anticonexina incluem, por exemplo, cerca de 0,1 a 1,1 a 2, 2a 3, 3 a 4 ou 4 a 5 microgramas (pg), de a partir de cerca de 5 a cerca de 10 pg, de a partir de cerca de 10 a cerca de 15 pg, de a partir de cerca de 15 a cerca de 20 pg, de a partir de cerca de 20 a cerca de 30 pg, de a partir de cerca de 30 a cerca de 40 pg, de a partir de cerca de 40 a cer- ca de 50 pg, de a partir de 50 a cerca de 75 pg, de a partir de cerca de 75 a cerca de 100 pg, de a partir de cerca de 100 pg a cerca de 250 pg e de a partir de 250 pg a cerca de 500 pg. Quantidades de dose de a partir de 0,5 a 1,0 miligrama ou mais são também providas, conforme acima mencionado. Volumes de dose vão depender do tamanho do sítio a ser tratado e podem variar, por exemplo, de a partir de cerca de 25-100 pL a cerca de 100-200 pL, doses de a partir de cerca de 200-500 pL a cerca de 500-1000 pL (micro- litro) são também apropriadas para sítios de tratamento maiores. Conforme aqui mencionado, aplicações repetidas são compreendidas. Aplicações re- petidas são tipicamente aplicadas cerca de uma vez por semana ou quando cicatrização de ferida parecer parada ou lenta.

Convenientemente, o polinucleotídeo anticonexina é administra- do em uma quantidade suficiente para sub-regular a expressão de uma pro- teína conexina, ou modular formação de junção de hiato por pelo menos cerca de 0,5 a 1 hora, pelo menos cerca de 1 a 2 horas, pelo menos cerca 20 de 2 a 4 horas, pelo menos cerca de 4 a 6 horas, pelo menos cerca de 6 a 8 horas, pelo menos cerca de 8 a 10 horas, pelo menos cerca de 12 horas ou pelo menos cerca de 24 horas pós-administração.

A dosagem de cada um dos polinucleotídeos anticonexina nas composições e métodos da presente invenção pode ser também determina- 25 da através de referência à concentração da composição com relação ao ta- manho, comprimento, profundidade, área ou volume da área á qual ela será aplicada. Por exemplo, em certas aplicações tópicas e outras, por exemplo, instilação, dosagem das composições farmacêuticas pode ser calculada com base em massa (por exemplo, microgramas) da concentração em uma com- 30 posição farmacêutica (por exemplo, pg/pl) por comprimento, profundidade, área ou volume da área de aplicação.

As dosagens inicial e qualquer subsequente administradas vão depender de fatores mencionados aqui. Dependendo do oligonucleotídeo, a dosagem e o protocolo para administração vão variar e a dosagem vai tam- bém depender do método de administração selecionado, por exemplo, ad- ministração local ou tópica.

As doses podem ser administradas em aplicações únicas ou di-

vididas. As doses podem ser administradas uma vez ou aplicação pode ser repetida.

Um ou mais polinucleotídeos anticonexina podem ser adminis- trados através da mesma via ou via diferente. Os vários agentes da invenção podem ser administrados separadamente em momentos diferentes durante a terapia ou concomitantemente em formas de combinação divididas ou úni- cas.

De preferência um ou mais polinucleotídeos anticonexina úteis para cicatrização de ferida são aplicados através de administração tópica 15 (perifericamente ou diretamente a um sítio), incluindo, mas não limitado a, administração tópica usando apoios sólidos (tal como curativos e outras ma- trizes) e formulações medicinais (tal como géis, misturas, suspensões e un- guentos). Em uma modalidade, o apoio sólido compreende uma membrana ou inserção biocompatível em um sítio de tratamento. Em outra modalidade, 20 o apoio sólido compreende um curativo ou matriz. Em uma modalidade da invenção, a composição do apoio sólido pode ser uma composição de apoio sólido de liberação lenta, onde um ou mais polinucleotídeos anticonexina úteis para cicatrização de ferida são dispersos em uma matriz sólida de libe- ração lenta tal como uma matriz de alginato, colágeno ou um polímero bio- 25 absorvível sintético. De preferência, a composição do apoio sólido é estéril ou de carga de microorganismos contaminantes (bioburden) baixa. Em uma modalidade, uma solução de lavagem compreendendo um ou mais polinu- cleotídeos anticonexina pode ser usada.

A aplicação de um ou mais polinucleotídeos anticonexina pode acontecer durante um período de tempo, em alguns casos por cerca de 0,5 hora, 1 a 2 horas, cerca de 2 a 4 horas, cerca de 4 a 6 horas, cerca de 6 a 8 horas ou cerca de 24 horas ou mais, pode ser uma vantagem particular em feridas mais graves. Em alguns casos, perda celular pode se estender bem além do sítio de um procedimento para células circundantes. Tal perda pode ocorrer dentro de 24 horas do procedimento original e é mediada por comu- nicação célula-célula de junção de hiato. Administração de polinucleotídeo(s) 5 anticonexina vai modular a comunicação entre as células e minimizar perda celular adicional ou lesão ou conseqüências de lesão.

Embora o período de aplicação vá depender de ambos o sítio onde a sub-regulagem deve ser induzida e o efeito terapêutico que é dese- jado, aplicação contínua ou de liberação lenta por cerca de 0,5 hora, cerca 10 de 1 a 2 horas, cerca de 2 a 4 horas, cerca de 4 a 6 horas, cerca de 6 a 8 horas ou cerca de 24 horas ou mais é provida. De acordo com a presente invenção, isto pode ser conseguido através da inclusão dos polinucleotídeos anticonexina em uma formulação junto com um carreador ou veículo farma- ceuticamente aceitável, particularmente na forma de uma formulação para 15 administração contínua ou de liberação lenta.

Conforme mencionado, o um ou mais agentes da invenção po- dem ser administrados antes, durante, imediatamente seguindo o ferimento, por exemplo, ou dentro de cerca de 180 ou mais, cerca de 120, cerca de 90, cerca de 60 ou cerca de 30 dias, do ferimento, por exemplo.

As vias e dosagens de administração descritas aqui pretendem

ser apenas um guia uma vez que um médico versado na técnica vai deter- minar a via de administração e a dosagem ótimas para qualquer paciente e ferida particular.

Qualquer um dos métodos de tratamento de um indivíduo tendo ou suspeito de ter ou uma doença, distúrbio e/ou ferida referidos ou descri- tos aqui podem utilizar a administração de qualquer uma das doses, formas de dosagem, formulações e/ou composições descritas aqui.

Curativos e Matrizes

Em um aspecto, o um ou mais polinucleotídeos anticonexina são providos na forma de um curativo ou matriz. Em certas modalidades, o um ou mais agentes da invenção são providos na forma de uma composição líquida, semi-sólida ou sólida para aplicação diretamente ou a composição é aplicada à superfície de, ou incorporada a, uma camada de contato sólida tal como uma gaze de curativo ou matriz. A composição de curativo pode ser provida, por exemplo, na forma de um fluido ou gel. O um ou mais polinucle- otídeos anticonexina podem ser providos em combinação com excipientes 5 farmacêuticos convencionais para aplicação tópica. Carreadores adequados incluem: géis Pluronic, géis Poloxamer, Hidrogéis contendo derivados de celulose, incluindo hidroxietil celulose, hidroximetil celulose, carboximetil ce- lulose, hidroxipropilmetil celulose e misturas das mesmas; e hidrogéis con- tendo ácido poliacrílico (Carbopóis). Carreadores adequados também inclu- 10 em cremes/unguentos usados para preparações farmacêuticas tópicas, por exemplo, cremes baseados em unguento emulsificante cetomacrogol. Os carreadores acima podem incluir alginato (como um espessante ou estimu- lante), preservativos tal como álcool de benzila, tampões para controlar pH tal como hidrogeno fosfato dissódio/di-hidrogeno fosfato de sódio, agentes 15 para ajustar a osmolaridade tal como cloreto de sódio e estabilizadores tal como EDTA.

Em uma modalidade um ou mais polinucleotídeos anticonexina, por exemplo, um polinucleotídeo de antissenso de conexina 43, de preferên- cia um oligodesoxinucleotídeo de antissenso de conexina 43, é administrado em uma matriz natural ou sintética.

Curativos ou matrizes adequados podem incluir, por exemplo, o que segue com um ou mais polinucleotídeos anticonexina. Um oligonucleotí- deo anticonexina 43 é preferido, por exemplo, um oligonucleotídeo de antis- senso anticonexina 43.

1) Absorsivos: absorsivos adequados podem incluir, por exem-

plo, curativos absorsivos que podem prover, por exemplo, uma cama semia- derente ou uma camada não-aderente, combinado com camadas de fibras altamente absorsivas, tal como, por exemplo, celulose, algodão ou rayon. Alternativamente, absorsivos podem ser usados como um curativo primário ou secundário.

2) Alqinatos: alginatos adequados incluem, por exemplo, curati- vos que são absorventes e faixas não-tecidas, não-adesivas, compostas de fibras de polissacarídeo naturais ou xerogel derivado de algas. Curativos de alginato adequados podem, por exemplo, formar um gel úmido através de um processo de troca de íon quando do contato com exudato. Em certas modalidades, curativos de alginato são feitos para serem macios e confor-

máveis, fáceis de embalar, dobrar ou aplicar sobre áreas de formato irregu- lar. Em certas modalidades, curativos de alginato podem ser usados com um segundo curativo.

3) Curativos antimicrobianos: curativos antimicrobianos adequa- dos podem incluir, por exemplo, curativos que podem facilitar a aplicação de

agentes bioativos, tal como, por exemplo, prata e poliexametileno biguanida (PHMB), para manter eficácia contra infecção, onde isso for necessário ou desejável. Em certas modalidades, curativos antimicrobianos adequados podem estar disponíveis, como, por exemplo, esponjas, gazes tecidas im- pregnadas, curativos de película, produtos absorsivos, curativos island, bar-

reiras não-aderentes, de tecido de náilon, ou uma combinação de materiais.

4) Biológicos & Biossintéticos: curativos biológicos ou curativos biossintéticos adequados podem incluir, por exemplo, géis, soluções ou fo- lhas semipermeáveis derivados de uma fonte natural. Em certas modalida- des, um gel ou solução é aplicado ao sítio de tratamento e coberto com um

curativo para proteção de barreira. Em outra modalidade, uma folha é posta in situ que pode agir como membrana, permanecendo no lugar após uma aplicação única.

5) Colágeno: curativos de colágeno adequados podem incluir, por exemplo, géis, absorventes, partículas, pastas, pós, folhas ou soluções

derivados de, por exemplo, fontes bovinas, porcinas ou de ave ou outras fontes ou doadores naturais. Em certas modalidades, o curativo de colágeno pode interagir com exudato do sítio de tratamento para formar um gel. Em certas modalidades, curativo de colágeno pode ser usado em combinação com um curativo secundário.

6) Compósitos: curativos compósitos adequados podem incluir,

por exemplo, curativos que combinam componentes fisicamente diferentes em um produto único para prover funções múltiplas, tal como, por exemplo, uma barreira bacteriana, absorção e adesão. Em certas modalidades, os curativos compósitos são compreendidos de, por exemplo, camadas múlti- plas e incorporam um absorvente semi- ou não-aderente. Em certa modali- dade, o compósito pode também incluir, por exemplo, uma borda adesiva de fita de tecido não-tecido ou película transparente.

7) Camadas de Contato: curativos de camada de contato ade- quados podem incluir, por exemplo, folhas finas, não-aderentes, postas em uma área para proteger tecido de, por exemplo, contato direto com outros agentes ou curativos aplicados ao sítio de tratamento. Em certas modalida-

des, camadas de contato podem ser posicionadas para se conformarem ao formato da área do sítio de tratamento e são porosas para permitir que exu- dato passe para absorção por um curativo sobreposto, secundário.

8) Bandaqens Elásticas: bandagens elásticas adequadas podem incluir, por exemplo, curativos que esticam e se conformam aos contornos

do corpo. Em certas modalidades, a composição do tecido pode incluir, por exemplo, algodão, poliéster, rayon ou náilon. Em certas outras modalidades, a bandagem elástica pode, por exemplo, prover absorção como uma cama- da ou curativo secundário, para manter uma cobertura no lugar, para aplicar pressão ou para forrar um sítio de tratamento.

9) Espumas: curativos de espuma adequados podem incluir, por

exemplo, folhas e outros formatos de soluções de polímero espumadas (in- cluindo poliuretana) com células abertas, pequenas, capazes de reter flui- dos. Espumas exemplares podem ser, por exemplo, impregnadas ou postas em camadas em combinação com outros materiais. Em certa modalidade, a

capacidade de absorção pode ser ajustada com base na espessura e com- posição da espuma. Em certas outras modalidades, a área em contato com o sítio de tratamento pode ser não-adesiva para remoção fácil. Em ainda outra modalidade, a espuma pode ser usada em combinação com uma bor- da adesiva e/ou um revestimento de película transparente que pode servir

como uma barreira anti-infectiva.

10) Curativos de Gazes e Não-tecidos: curativos de gaze ade- quados e curativos tecidos podem incluir, por exemplo, esponjas tecidas ou não-tecidas secas e tiras com graus variáveis de absorbância. Composições de tecido exemplares incluem, por exemplo, algodão, poliéster ou rayon. Em certas modalidades, curativos de gazes e não-tecidos podem estar disponí- veis estéreis ou não-estéreis a maior parte e com ou sem uma borda adesi- 5 va. Curativos de gaze e curativos tecidos adequados podem ser usados para limpeza, fechamento e cobertura de uma variedade de sítios de tratamento de ferida.

11) Hidrocoloides: curativos hidrocoloides adequados podem incluir, por exemplo, wafers, pós ou pastas compostos de gelatina, pectina

ou carboximetilcelulose. Em certa modalidade, wafers são autoaderentes e disponíveis com ou sem uma borda adesiva e em uma ampla variedade de formatos e tamanhos. Hidrocoloides exemplares são úteis em áreas que re- querem contorno. Em certas modalidades, hidrocoloides em pó ou pastas podem ser usados em combinação com um curativo secundário.

12) Hidrogéis (Amorfos): curativos de hidrogel amorfos adequa-

dos podem incluir, por exemplo, formulações de água, polímeros e outros ingredientes sem nenhum formato, feitos para doar umidade e manter um ambiente de cicatrização úmido e/ou reidratar o sítio de tratamento. Em certa modalidade, hidrogéis podem ser usados em combinação com uma cobertu-

ra de curativo secundária.

13) Hidrogéis: Curativos Impregnados: curativos de hidrogel im- pregnados adequados podem incluir, por exemplo, gazes e esponjas não- tecidas, cordões e tiras saturados com um hidrogel amorfo. Hidrogéis amor- fos podem incluir, por exemplo, formulações de água, polímeros e outros

ingredientes sem nenhum formato, feitos para doar umidade a um sítio de tratamento seco e manter um ambiente de cicatrização úmido.

14) Folhas de Hidrogel: Folhas de hidrogel adequadas podem incluir, por exemplo, redes tridimensionais de polímeros hidrofílicos reticula- dos que são insolúveis em água e interagem com soluções aquosas através

de inchamento. Hidrogéis exemplares são altamente conformáveis e perme- áveis e podem absorver quantidades variáveis de drenagem, dependendo de sua composição. Em certa modalidade, o hidrogel é não-adesivo contra o sítio de tratamento e tratado para fácil remoção.

15) Curativos Impregnados: curativos impregnados adequados podem incluir, por exemplo, gazes e esponjas não-tecidas, cordões e tiras saturados com uma solução, uma emulsão, óleo, gel ou algum outro com-

posto farmaceuticamente ativo ou agente carreador, incluindo, por exemplo, solução salina, óleo, sais de zinco, petrolato, xeroforma e vermelho escarlate bem como os compostos descritos aqui.

16) Folhas de Gel de Silicone: curativos de folha de gel de sili- cone adequados podem incluir, por exemplo, coberturas macias compostas

de polímeros reticulados reforçados com ou ligados à rede ou tecido.

17) Soluções: curativos líquidos adequados podem incluir, por exemplo, misturas de material multiproteína e outros elementos encontrados na matriz extracelular. Em certa modalidade, soluções exemplares podem ser aplicadas ao sítio de tratamento após remoção cirúrgica de corpos estra-

nhos e tecido morto da ferida e limpeza e então cobertura com um curativo absorvente ou um absorvente não-aderente.

18) Películas Transparentes: curativos de película transparente podem incluir membranas de polímero de espessura variável revestidas em um lado com um adesivo. Em certas modalidades, películas transparentes

são impermeáveis a líquido, água e bactérias, mas permeáveis a vapor de umidade e gases atmosféricos. Em certas modalidades, a transparência permite visualização do sítio de tratamento.

19) Cargas: curativos de carga adequados podem incluir, por exemplo, contas, cremes, espumas, géis, unguentos, absorventes, pastas,

travesseiros, pós, filamentos ou outras formulações. Em certa modalidade, cargas são não-aderentes e podem incluir um antimicrobiano liberado com o tempo. Cargas exemplares podem ser úteis para manter um ambiente de umidade, tratar exudato e para tratamento de, por exemplo, feridas de es- pessura parcial e integral, feridas infectadas, drenagem de feridas e feridas

profundas que requerem fechamento.

Então, de acordo com a invenção, são providas formulações a- través das quais comunicação célula-célula pode ser sub-regulada de uma maneira transiente e específica de sítio para tratamento de feridas que não cicatrizam em taxas esperadas. As formulações então têm aplicação em mé- todos de terapia.

Tratamento de Ferida 5 Em casos de dano de tecido (particularmente com feridas carac-

terizadas por cicatrização retardada e feridas crônicas) as formulações da invenção foram verificadas ser eficazes em promoção do processo de cica- trização de ferida, redução de inflamação e na minimização de formação de tecido de cicatriz. As formulações então têm benefício claro no tratamento de 10 feridas que não cicatrizam em taxas esperadas, seja o resultado de trauma externo ou estado de doença (tal como úlceras diabéticas) ou condição (tal como úlceras venosas, úlceras arteriais e úlceras vasculíticas) ou processos físicos (tal como úlceras de pressão).

Em um aspecto a invenção refere-se a um método de promoção 15 ou aperfeiçoamento de cicatrização de ferida em um indivíduo sofrendo de ou uma ferida crônica, ferida com cicatrização retardada ou ferida cicatrizan- do incompletamente ou outras feridas que não cicatrizam em taxas espera- das, compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais polinucleotídeos anticonexina. Em certas modalidades, 20 a administração de um ou mais polinucleotídeos anticonexina é eficaz para reduzir deposição de tecido de granulação, promover migração celular para acelerar fechamento e cicatrização da ferida, para facilitar crescimento epite- lial ou qualquer combinação dos mesmos.

Em um aspecto a invenção refere-se a um método de promoção 25 ou aperfeiçoamento de cicatrização de ferida em um indivíduo compreen- dendo administração de um ou mais polinucleotídeos anticonexina em uma quantidade eficaz para regular divisão e crescimento de célula basal epitelial em uma ferida crônica, ferida com cicatrização retardada ou ferida com cica- trização incompleta ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada. 30 Em uma modalidade, o polinucleotídeo anticonexina é um polinucleotídeo de antissenso de conexina eficaz para regular divisão e crescimento de célula basal epitelial. Em uma modalidade, o polinucleotídeo de antissenso de co- nexina é um polinucleotídeo de antissenso de conexina 26, um polinucleotí- deo de antissenso de conexina 43 ou uma mistura dos mesmos.

Em um aspecto a invenção refere-se a um método de promoção ou aperfeiçoamento de cicatrização de ferida compreendendo administração 5 de um ou mais polinucleotídeos anticonexina em uma quantidade eficaz para regular a secreção de queratina da camada externa em uma ferida crônica, ferida de cicatrização retardada ou ferida de cicatrização incompleta ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada. Em uma modalidade, o poli- nucleotídeo anticonexina é um polinucleotídeo de antissenso de conexina 10 eficaz para regular secreção de queratina da camada externa. Em uma mo- dalidade, o polinucleotídeo de antissenso de conexina é um polinucleotídeo de antissenso de conexina 43, um polinucleotídeo de antissenso 31.1 ou uma mistura dos mesmos.

Em um aspecto a invenção refere-se a um método de redução, prevenção ou melhora de dano a tecido em um indivíduo sofrendo de uma ferida crônica, ferida com cicatrização retardada ou ferida cicatrizada incom- pletamente ou outra ferida que não cicatriza em taxas esperadas, compre- endendo administração de um ou mais polinucleotídeos anticonexina.

Em um aspecto a invenção refere-se à administração sustentada de um ou mais polinucleotídeos anticonexina. Em uma modalidade, os poli- nucleotídeos anticonexina são administrados por pelo menos cerca de 1 a

24 horas, pelo menos cerca de 0,5 hora, pelo menos cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos cerca de 3 horas, pelo menos cerca de

4 horas, pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 7 horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de

9 horas, pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cerca de 11 horas, pelo menos cerca de 12 horas ou pelo menos cerca de 24 horas. Em uma moda- lidade, a expressão da conexina é sub-regulada durante um período prolon- gado de tempo. De preferência a expressão da conexina 43 é sub-regulada 30 por um período prolongado de tempo. Convenientemente, a expressão da conexina 43 é sub-regulada por pelo menos cerca de 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 24 horas. Recuperação de conexina integral é geralmente dentro de pelo menos cerca de 48 a 72 horas seguindo sub-regulagem de expressão. Indi- víduos adequados incluem um indivíduo diabético ou outro indivíduo tendo uma ferida que não cicatriza em uma taxa esperada.

Em um aspecto, a presente invenção provê um método de tra- 5 tamento de um indivíduo tendo uma ferida crônica, ferida de cicatrização retardada ou ferida cicatrizando incompletamente ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada, o qual compreende administração prolon- gada de uma quantidade eficaz de um ou mais polinucleotídeos anticonexi- na. Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método de 10 promoção ou aperfeiçoamento de cicatrização de ferida em um indivíduo que compreende administração sustentada de um ou mais polinucleotídeos anti- conexina a uma ferida crônica, ferida com cicatrização retardada ou ferida cicatrizando incompletamente ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada.

De acordo com outro aspecto adicional, a presente invenção

provê um método de promoção ou aperfeiçoamento de cicatrização de ferida em um indivíduo tendo uma ferida crônica, ferida com cicatrização retardada ou ferida cicatrizando incompletamente ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada, o qual compreende administração sustentada de um ou 20 mais polinucleotídeos anticonexina a uma área de ferida em uma quantidade eficaz para aumentar as taxas de reepitelização na área de ferida. Em uma modalidade, o método compreende administração sustentada de um polinu- cleotídeo de antissenso de conexina 43 e/ou um polinucleotídeo de antis- senso de conexina 31.1. Em uma modalidade, a composição ou composi- 25 ções são administradas em uma formulação de liberação sustentada. Em outra modalidade, a composição ou composições são administradas por um período prolongado de tempo. Convenientemente, a composição é eficaz para diminuir os níveis de conexina 43 e/ou 31.1 ou expressão por pelo me- nos cerca de 24 horas. Indivíduos que podem ser tratados incluem indiví- 30 duos diabéticos ou outros indivíduos tendo uma ferida que não cicatriza em uma taxa esperada.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê um método de promoção ou aperfeiçoamento de cicatrização de ferida em um indivíduo tendo uma ferida crônica, ferida com cicatrização retardada ou ferida com cicatrização incompleta ou ferida que não cicatriza em uma taxa esperada, o qual compreende administração sustentada de um ou mais polinucleotídeos anticonexina a uma área de ferida em uma quantidade eficaz para regular divisão e crescimento de célula basal epitelial e/ou eficaz para regular secre- ção de queratinócito de camada externa. Em uma modalidade, a composi- ção compreende um polinucleotídeo de antissenso de conexina eficaz para regular divisão ou crescimento de célula basal epitelial, de preferência um polinucleotídeo de antissenso de conexina 26, um polinucleotídeo de antis- senso de conexina 43 ou uma mistura dos mesmos. Em uma modalidade, a composição compreende um polinucleotídeo de antissenso de conexina efi- caz para regular queratinização da camada externa, de preferência um poli- nucleotídeo de antissenso de conexina 31.1. Em uma modalidade, a compo- sição ou composições são administradas em uma formulação de liberação sustentada. Em outra modalidade, a composição ou composições são admi- nistradas por um período de tempo prolongado. Convenientemente, a com- posição é eficaz para diminuir os níveis ou expressão de conexina 43, 26 e/ou 31.1 por pelo menos cerca de 24 horas. Indivíduos que podem ser tra- tados incluem indivíduos diabéticos.

Em um aspecto a invenção refere-se a um método para trata- mento ou profilaxia de uma ferida crônica, ferida com cicatrização retardada ou ferida cicatrizando incompletamente ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada, compreendendo administrar a um indivíduo com neces- 25 sidade do mesmo uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo anticonexina administrado à dita ferida ou um tecido associado com a dita ferida. Em ou- tra modalidade, a ferida crônica é uma ferida de pele crônica e uma compo- sição da presente invenção é administrada à pele ou um tecido associado com a pele do dito indivíduo por um período de tempo eficaz. Conveniente- 30 mente, a composição é eficaz para diminuir os níveis de conexina 43 ou blo- quear ou reduzir a abertura de hemicanal de conexina 43, por pelo menos cerca de 0,5 hora, cerca de 1 a 2 horas, cerca de 2 a 4 horas, cerca de 4 a 6 horas, cerca de 4 a 8 horas, cerca de 12 horas, cerca de 18 horas ou cerca de 24 horas. Uma ferida de pele crônica adequada para tratamento pode, por exemplo, ser selecionada de um grupo consistindo em úlceras de pres- são, úlceras diabéticas, úlceras venosas, úlceras arteriais, úlceras vasculíti- 5 cas e úlceras mistas. A ferida crônica pode ser uma úlcera arterial, a qual compreende ulcerações resultantes de bloqueio arterial completo ou parcial. A ferida crônica pode ser uma úlcera de estase venosa, que compreende ulcerações resultantes de um mau funcionamento da válvula venosa e a do- ença vascular associada. A ferida crônica pode ser uma úlcera induzida por 10 trauma. Indivíduos com outras úlceras, incluindo úlceras venosas e outras descritas aqui e conhecidas na técnica.

Composições

A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas, formulações e seus métodos de fabricação e uso onde a composição com- 15 preende quantidades terapeuticamente eficazes de um polinucleotídeo anti- conexina, incluindo, por exemplo, um polinucleotídeo de antissenso de co- nexina. As composições são úteis no aumento ou promoção de cicatrização de feridas que não cicatrizam em taxas esperadas, incluindo feridas que po- dem ser lentas para cicatrizar ou refratárias a tratamento de ferida ou terapi- 20 as de promoção de cicatrização de ferida convencionais.

Em uma forma preferida, a composição contém um ou mais poli- nucleotídeos anticonexina, por exemplo, um polinucleotídeo de antissenso de conexina, para o mRNA de uma proteína conexina apenas. Com mais preferência, esta proteína conexina é conexina 43.

Alternativamente, a composição pode compreender polinucleotí-

deos para mais de uma proteína conexina. De preferência, uma das proteí- nas conexina às quais polinucleotídeos são direcionados é conexina 43. Ou- tras proteínas conexina às quais oligodesoxinucleotídeos são direcionados podem incluir, por exemplo, conexinas 26, 30, 31.1, 32 e 37. Polinucleotí- 30 deos exemplares adequados (e ODNs) direcionados a várias conexinas são mostrados na Tabela 1.

Muitos aspectos da invenção são descritos com referência a oli- godesoxinucleotídeos. No entanto, é compreendido que outros polinucleotí- deos adequados (tal como polinucleotídeos de RNA) podem ser usados nesses aspectos. Outros oligonucleotídeos anticonexina são oligonucleotí- deos de RNAi e siRNA.

Deste modo, em um aspecto, a invenção provê composições

para uso em tratamento terapêutico, as quais compreendem pelo menos um polinucleotídeo anticonexina, de preferência um polinucleotídeo anticonexina 43. Em uma modalidade preferida, a composição compreende ainda um car- reador ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Estojos. Medicamentos e Artigos de Fabricação

Opcionalmente, um ou mais polinucleotídeos anticonexina po- dem ser também usados na fabricação do medicamento. Em uma modalida- de, o medicamento compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polinucleotídeo anticonexina, de preferência um polinucleotídeo antico- nexina 43 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

Em um aspecto, a invenção provê um estojo compreendendo uma ou mais composições ou formulações descritas. Por exemplo, um esto- jo pode incluir uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um ou mais polinucleotídeos de antissenso de conexina 43.

Artigos de fabricação são também providos, compreendendo um

recipiente contendo uma composição ou formulação da invenção conforme aqui descrito e instruções para uso para o tratamento de um indivíduo. Por exemplo, um artigo de fabricação, compreendendo um recipiente contendo um polinucleotídeo de antissenso de conexina e instruções para uso para o 25 tratamento de um indivíduo sofrendo de uma ferida crônica, de cicatrização retardada ou cicatrização incompleta ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada.

Em outro aspecto, a invenção inclui um artigo de fabricação compreendendo um recipiente contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais polinucleotídeos anticonexina e instruções para uso, incluindo uso para o tratamento de um indivíduo tendo uma ferida crônica ou uma ferida de cicatrização retardada ou incompleta ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada. Em outro aspecto, a invenção inclui um ar- tigo de fabricação compreendendo um recipiente contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais polinucleotídeos anticonexina e ins- truções para uso, incluindo uso para o tratamento de um indivíduo tendo ou 5 suspeito de ter quaisquer doenças, distúrbios e/ou condições caracterizados no todo ou em parte por uma ferida crônica ou cicatrização de ferida retar- dada ou incompleta ou outra ferida que não cicatriza em uma taxa esperada.

Conforme mencionado, cicatrização de ferida foi relatada ser lenta em diabetes, frequentemente resultando em infecção ou feridas crôni- 10 cas que podem levar à amputação. Comunicação célula-célula através da proteína de junção de hiato conexina 43 e a regulagem dinâmica de expres- são de conexina 43 são relatadas desempenhar papéis pivotais em cicatri- zação de ferida. Em tecido normal, tal como pele, nas primeiras 24 horas após ferimento, conexina 43 é normalmente sub-regulada e conexina 26 su- 15 pra-regulada em queratinócitos na borda da ferida uma vez que elas adotam um fenótipo migratório. No entanto, em tecido diabético, em geral, e pele, em particular, foi constatado pela requerente a conexina 43 estar supra-regulada imediatamente após cicatrização.

Cicatrização de ferida no rato diabético foi usada como um mo- delo de ferimento crônico. O Exemplo 1 demonstra o uso de oligonucleotídeo anticonexina para melhorar cicatrização de ferida prejudicada no rato diabé- tico. No Exemplo 1, diabetes induzido por estreptozotocina em ratos altera a expressão de conexina na pele, diminuindo a proteína conexina 43 e conexi- na 26 e comunicação na epiderme e aumentando a proteína conexina 43 e comunicação na derme. O Exemplo 1 demonstra que o diabetes altera as mudanças dinâmicas de conexinas associadas com cicatrização de ferida. Dentro de 24 horas, a conexina 43 foi supra-regulada em um bulbo espesso de queratinócitos na borda da ferida (ao invés de sub-regulada, como em controles que formaram um processo fino de células migratórias). Declínio de conexina 43 foi retardado até 48 horas quando reepitelização então co- meça. Embora conexina 26 tenha sido supra-regulada como comum em dia- betes, sua distribuição na borda da ferida foi anormal, sendo mais espalha- da. O Exemplo 1 mostra ainda a associação entre dinâmica anormal de ex- pressão de conexina 43 e reepitelização retardada conforme confirmado pe- la aplicação de um gel de antissenso específico de conexina 43 a feridas diabéticas comparado pela aplicação de um gel com o oligodesoxinucleotí-

deo de sentido correspondente. Este tratamento preveniu supra-regulagem anormal de conexina 43 e dobrou a taxa de reepitelização para níveis con- trole (não-diabéticos) e acima.

Os resultados relatados no Exemplo 1 apoiam a concepção de que mudanças induzidas por diabetes em dinâmica de expressão de conexi-

na contribuem para cicatrização de ferida retardada e que direcionamento da expressão da conexina 43 como um meio de promover cicatrização de feri- das diabéticas e outras crônicas é de valor terapêutico potencial.

O Exemplo 2 demonstra a aplicação bem sucedida de um oligo- nucleotídeo anticonexina 43 para promover cicatrização de úlcera de pele que não cicatriza em um indivíduo humano.

O Exemplo 3 demonstra a aplicação bem sucedida de um oligo- nucleotídeo anticonexina 43 para promover cicatrização de uma úlcera ve- nosa que não cicatriza em um indivíduo humano.

Vários aspectos da invenção serão agora descritos com refe- rência aos exemplos que seguem, que serão compreendidos ser providos a título de ilustração apenas e não para constituir uma limitação ao escopo da invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

Oligodesoxinucleotídeos foram preparados com as seqüências

que seguem: GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT CTC (conexina 43) (SEQ ID NO:2) GAC AGA AAC AAT TCC TCC TGC CGC ATT TAC (controle de sentido) (SEQ ID NO:7). Diabetes foi induzido em ratos Spra- gue-Dawley adultos (350-400 g) através de uma injeção intraperitoneal única 30 contendo estreptozotocina, 65 mg/kg, em tampão de citrato (Shotton, H.R. e outros (2003) Diabetes. 52:157-64) (N = seis diabéticos, seis controles). A maioria dos estudos de cicatrização de ferida diabética tem sido realizada em duas semanas após indução de diabetes e o mesmo ponto de tempo foi usado para este estudo de cicatrização de ferida. No entanto, expressão de conexina em pele de rato diabético foi também examinada em oito semanas (N = seis diabéticos, seis controles) para confirmar que as mudanças detec- 5 tadas em duas semanas permaneceram iguais. Pele das costas normal foi excisada, criosseccionada, imunotingida para conexinas, tiveram imagem feita através de microscopia confocal e o tingimento quantificado como em Saitongdee e outros (2000). Cardiovascular Res. 47, 108-115.

Os ratos foram anestesiados com halotano e suas costas foram 10 depiladas. Dois pares de feridas excisionais de espessura integral foram fei- tos, e 10 μΜ de oligodesoxinucleotídeo de antissenso específico de conexi- na 43 em gel Pluronic F-127 foram aplicados a uma ferida e gel controle (sentido) a outra (Qiu, C. e outros (2003) Cell Biol. Int. 27:525-541). Tecido foi coletado nos dias 1, 2, 5, 10 e 15 após ferimento e cortados em prepara- 15 ção para imunoistoquímica de conexina ou tingimento H&E (/d.). Mudanças dinâmicas em expressão de conexina se relacionam com eventos-chave no processo de cicatrização de ferida. N = seis ratos diabéticos, seis controle por ponto de tempo.

Comunicação intercelular foi avaliada através da aplicação de 20 uma solução a 4% de Amarelo Lucifer CH (Sigma) em uma bandagem de espuma de gel em uma incisão da pele de espessura integral, fresca. Coran- te foi deixado transferir por 5 minutos antes da remoção da espuma de gel e fixação do tecido. Um FITC-dextrano de 10 kD que vai entrar em células Ie- sionadas mas não vai passar através de junções de hiato foi usado como um 25 controle. Tecidos foram criosseccionados e tiveram imagem feita através de microscopia confocal em um Leica SP2UV (Leica, Milton Keynes, UK; N = quatro diabéticos e quatro controles).

Corantes transferidos e imunotingimento de conexina foram e- xaminados usando o microscópio confocal. Ganho e offset ótimos foram a- justados previamente e mantidos constantes durante aquisição de imagem. Uma série de imagens de seção óptica simples foi tirada para gerar uma montagem da pele do corte. As imagens digitais eram de oito bits e foram analisadas usando um software Image-J (NIH). Para avaliar transferência de corante, uma caixa de região-de-interesse de 1500x30 pixels foi posta da borda de corte na derme média e um gráfico de intensidade de imagem atra- vés da caixa foi gerado. Uma queda de intensidade de nível cinza abaixo de 5 50 foi arbitrariamente tomada como o ponto onde Amarelo Lucifer tinha via- jado. Similarmente, na epiderme, a distância do corte para onde o sinal Ama- relo Lucifer caiu abaixo de 50 foi registrada. Um mínimo de três imagens foi analisado de cada animal. Para comparar níveis de proteína conexina, seis imagens de seção óptica simples de derme e epiderme foram feitas de se- 10 ções diferentes para cada ferida. Todos os parâmetros de energia de laser, pinhole, ganhoIoffset e objetivo foram mantidos constantes em ambos gru- pos controle e diabético. Expressão de conexina foi quantificada, como em Saitongdee e outros (2000) supra, usando software Image-J (NIH). Um limiar foi ajustado para detectar as placas de junção de hiato com ruído de base 15 mínimo e foi então mantido constante para todas as imagens. O número e tamanho de placas de conexina foram registrados para cada imagem e ex- pressos por 100 pm de epiderme ou 1000 pm2 de derme. Esta abordagem provou ser muito mais precisa do que Western blot uma vez que ela gera informação sobre expressão de proteína no nível celular. Western blots seri- 20 am incapazes de distinguir entre células epidermais e dermais ou detectar efeitos de proximidade para a borda de ferida. Usando esta abordagem, ní- veis de conexina em queratinócitos em uma zona na borda de ferida (WE) e em uma zona 500 pm distante (AD) eram capazes de ser quantificados ou um ou dois dias após ferimento. Um dia após ferimento uma zona adicional

da borda principal (LE) da epiderme nascente teve também uma imagem feita. Imagens de tingimento H&E foram feitas usando um microscópio Leica

$

DMLFS com uma câmera digital DC300F. Medições para taxa de reepiteli- zação foram descritas em detalhes previamente (Qiu, C. e outros (2003) su- pra. Todas as diferenças numéricas entre tratamentos foram testadas quan- do à significância usando o teste Wilcoxon matched-pairs signed-ranks con- forme implementado em Statview 5.0.1.

As Figuras 1A e 1B mostram tingimento de conexina 43 e 26 em pele de rato normal e diabético STZ em duas semanas (Figura 1A) e oito semanas após indução de diabetes (Figura 1B). Gráficos mostram os núme- ros de placas na epiderme e derme. Tingimento com conexina 43 e conexina

26 é significantemente reduzido na epiderme diabética enquanto tingimento 5 de conexina 43 é aumentado na derme logo duas semanas após indução de diabetes, com nenhuma mudança adicional em oito semanas. A Figura 1C mostra imagens de imunotingimento de conexina 43 e conexina 23 típico em pele controle, C, e diabética, D, em oito semanas, onde pontas de seta mar- cam o limite entre a epiderme e a derme. Barra de escala 25 pm. Figura 1D 10 quantificação da distância que o corante permeante de junção de hiato, A- marelo Lucifer, viajou em cinco minutos na epiderme e derme de ratos con- trole e diabéticos. Transferência de corante foi significantemente reduzida em epiderme diabética, mas significantemente aumentada na derme diabéti- ca.

Imunotingimento com conexina 43 tipicamente pontuado foi en-

contrado na camada basal da epiderme e em fibroblastos dermais, folículos pilosos, vasos sanguíneos e anexos (Figuras 1A a 1D). No entanto, em pele diabética, tingimento com conexina 43 foi significantemente reduzido na epi- derme, em termos de ambos tamanho e número de placas de junção de hia- 20 to (Figura 1A). Tingimento para conexina 26 nas camadas superiores da e- piderme foi similarmente significantemente reduzido em epiderme diabética (Figura 1A). No entanto, esta não era uma sub-regulagem global de conexi- nas em resposta a diabetes como um efeito contrastante foi observado em fibroblastos de derme; nesses, um aumento distinto no tamanho e número 25 de placas positivas para conexina 43 foi observado. Efeitos similares sobre expressão de conexina foram vistos em pele duas semanas e oito semanas após indução de diabetes com STZ (Figura 1B).

Para avaliar comunicação célula-célula em epiderme e derme diabéticas, o grau de transferência do corante permeante de junção de hiato Amarelo Lucifer através do tecido em cinco minutos foi examinado. Isto reve- lou comunicação significantemente reduzida na epiderme diabética, mas aumentou significantemente a comunicação aumentada na derme (Figura 1 D), de acordo com as mudanças em expressão de proteína conexina. Ex- pressão elevada de proteína conexina 43 e comunicação aumentada foram relatadas em fibroblastos diabéticos humanos (Abdullah, K.M. e outros (1999) Endocrine 10:35-41) e respostas mistas de conexinas diferentes para 5 diabetes foram notadas no sistema renal (Zhang, J., Hill, C.E. (2005) Kidney Int. 68:1171-1185) e bexiga (Poladia, D.P. e outros (2005) Acta Diabetol. 42:147-152)).

As Figuras 2A e 2D mostram taxas de reepitelização e respostas dos níveis de proteínas conexina 43 e conexina 26 seguindo lesão em epi- derme controle e diabética. Tingimento foi quantificado, através de contagem de placas, em um e dois dias após ferimento da epiderme na borda da ferida (WE) e epiderme adjacente (AD)1 500 pm distante (Figura 2A). No dia cinco, uma zona adicional na borda principal (LE) da epiderme nascente foi quanti- ficada e os dados foram também incluídos. A taxa de reepitalização foi signi- ficantemente reduzida em ratos diabéticos (D) comparado com controles (C) em todos os pontos de tempo: um, dois e cinco dias pós-ferimento (Figura 2B). Tingimento com conexina 43 na zona WE normalmente reduz nas pri- meira 24 horas após lesão, mas em pele diabética ele aumenta significante- mente, retornando para níveis próximo ao controle em 2 dpw, e é encontrado em níveis significantemente reduzidos em todas as três zonas 5dpw (Figura 2C). A resposta normal de conexina 26 à lesão é aumento do nível de tingi- mento em WE e isto aconteceu em ambos os animais controle e diabéticos em 1dpw (Figura 2D). Em 2dpw, no entanto, em pele diabética, tingimento com conexina 26 foi visto ser significantemente elevados em ambas as zo- nas WE e AD, reduzindo significantemente nessas zonas apenas em 5 dpw.

As Figuras 3a a 3f e 3a' a 3f mostram tingimento de conexina 43 (a, a', c, c', e, e') e conexina 26 (b, b', d, d', f, f) (verde) e tingimento nuclear (azul) na borda da ferida epidermal de pele controle e diabética durante o processo de cicatrização de ferida. Em um dia, a expressão da proteína co- 30 nexina 43 é sub-regulada nos queratinócitos de borda principal de ratos con- trole (Figura 3a), mas foi supra-regulada nesta região, que parece inchada, em animais diabéticos (Figura 3a'). Conexina 26 pode ser vista supra-regular similarmente em ambas as epidermes controle (Figura 3b) e diabética (Figu- ra 3b'). Em dois dias, tingimento de conexina 43 foi reduzido nos queratinóci- tos de borda principal diabética (Figura 3') e é similar àquele de controles (Figura 3c) enquanto conexina 26 continuou a aumentar em todos os quera- 5 tinócitos diabéticos (Figura 3d') para níveis significantemente maiores do que controles (Figura 3d). Em cinco dias após ferimento a epiderme nascente de controle (Figura 3e) e diabético (Figura 3e') mostra tingimento de conexina 43 muito pouco pontuado entre queratinócitos enquanto tingimento de cone- xina 26 é um pouco reduzido em feridas diabéticas (Figura 3f) comparado 10 com feridas controle (Figura 3f). Pontas de seta marcam a borda da ferida. Barra de escala a, c, e, 50 μηι b, d, f 100 pm.

Para determinar as respostas dinâmicas de expressão de cone- xina à lesão, tingimento de conexina em queratinócitos na borda da ferida (WE) e em uma zona adjacente 500 pm distante (AD) foi quantificado, um e dois dias após ferimento, enquanto após cinco dias os queratinócitos na bor- da principal (LE) (Figura 2A) tiveram imagem feita. Um dia após ferimento uma redução significante no tingimento de conexina 43 em queratinócitos controle foi verificada na zona WE comparado com AD (Figuras 2C, 3a e 3a’). Em um contraste acentuado, em animais diabéticos um aumento signi- ficante em tingimento de conexina foi verificado em WE comparada com AD. Isto era o oposto da resposta de cicatrização de ferida normal e era surpre- endentemente porque os níveis de conexina 43 foram significantemente re- duzidos em pele diabética intacta. A resposta dinâmica de conexina 26 era similar em pele diabética e controle, com um aumento significante em tingi- mento na zona de WE (Figuras 2D, 3b e 3b') embora, em pele diabética, a elevação de tingimento de conexina 26 não fosse restrita à zona de WE co- mo em controles mas estendida por alguma distância para a zona de AD, implicando um espalhamento maior na resposta à lesão. Ainda queratinóci- tos na borda da ferida foram verificados formar um bulbo espesso em tecido diabético enquanto eles afinaram antes de espalharem para a frente para fechar a ferida em controles.

Feridas controle de dois dias começaram a reepitalizar (12% fe- chadas), mas feridas diabéticas eram retardadas (5% fechadas), tendo ape- nas recentemente adotado uma morfologia migratória. Acompanhando esta mudança de formato de queratinócito diabético houve uma redução signifi- cante em tingimento de conexina 43 dentro da zona de WE, que por volta 5 deste estágio lembrava aquele de controles (Figuras 2C, 3c e 3c'). No entan- to, em feridas de pele diabética, níveis de tingimento de conexina 26 conti- nuaram a aumentar em ambas zonas de WE e AD (Figuras 2D, 3d e 3d'), indicando uma resposta de tecido muito mais ampla para a lesão.

No dia cinco, reepitelização estava acontecendo bem em ambos os grupos diabético e controle, embora as feridas diabéticas fossem signifi- cantemente retardadas (20% fechadas comparado com 33% em controles; P<0,008; teste Wilcoxon matched-pairs signed-ranks\ Figura 2C). Em ambos os grupos diabético e controle, queratinócitos de LE podiam ser claramente vistos conter pouco tingimento de conexina 43. O tingimento de conexina 43 aumentou significantemente nas zonas de WE e AD, mas menos em pele diabética que, tal como pele intacta, expressou menos conexina 43 que con- troles (Figuras 2C, 3e e 3e'). Neste estágio, tingimento de conexina 26 em LE foi similarmente aumentado em ambas as peles diabética e controle (Fi- guras 2D, 3f e 3f). O tingimento com conexina 26 previamente elevado em zonas de WE e AD diabéticas retornou para níveis mais normais. Reepiteli- zação estava completa em ambos os animais controle e diabéticos por volta do dia dez, quando níveis altos de conexina 43 podem ser vistos na epider- me excessivamente espessa, proliferativa.

As Figuras 4A a 4C mostram efeito de tratamento com oligode- 25 soxinucleotídeo de antissenso de conexina 43 ("Cx43asODN") sobre ex- pressão de conexina 43 um dia pós-ferimento e sobre taxas de reepiteliza- ção em um, dois e cinco dias comparado com um controle de oligodesoxinu- cleotídeo de sentido de conexina 43 ("sODN”). Níveis elevados de tingimen- to de conexina 43 (pontos cinza) podem ser vistos no bulbo epidermal in- 30 chado na borda de uma ferida diabética 1 dpw (Figura 4A). No entanto, esta elevação em expressão da proteína conexina 43 foi prevenida através do tratamento com conexina 43asODNs que também resulta em uma camada mais fina de queratinócitos que parece mais como animais controle do que um bulbo de células (Figura 4B). Pares de tratamento de feridas em peles diabética e controle com asODNs ou sODNs controle resultam em duplica- ção da taxa de reepitelização seguindo aplicação de asODN todos os pontos 5 de tempo examinados (Figura 4C). A taxa de reepitelização de pele tratada com asODN diabética se aproxima daquela de pele controle tratada com sODN em 1dpw e 2 dpw mas é significantemente mais rápida em 5dpw. Bar- ra de escala 50 pm.

Tendo observado esses padrões anormais de imunotingimento 10 de conexina, comunicação de junção de hiato e resposta morfológica em feridas diabéticas, o efeito do aumento anormal de proteína conexina 43 em queratinócitos diabéticos de WE foi avaliado através da prevenção do au- mento com um gel de antissenso específico de conexina 43, aplicado à feri- da no momento da lesão. Isto preveniu eficazmente o aumento em conexina 15 43 (Figura 4A) e também melhorou taxas de cicatrização de ferida que do- braram, atingindo aquela de níveis controle não-tratados ou mais (Figura 4B) embora taxas de cicatrização fossem ainda maiores em feridas tratadas com antissenso em ratos controle.

O mecanismo com o qual diabetes altera a expressão de cone- xinas, com um efeito diferencial sobre diferentes proteínas conexina, é des- conhecido. Hiperglicemia e/ou estresse oxidativo induzido por hiperglicemia tem estado implicado no desenvolvimento de outras complicações do diabe- tes tal como neuropatia e angiopatia (American Diabetes Association (1990) Consensus deveiopment conference on diabetic foot wound care: 7 a 8 de abril 1999, Boston, Massachussets). Ambos glicose alta e estresse oxidativo in vitro foram relatados alterar expressão de conexina e/ou comunicação de junção de hiato em uma variedade de tipos de célula diferentes (Fukuda T. e outros (2000) J. Gastroenteroi 35:361-368; Cho, J.H. e outros (2002), Carci- nogenesis, Jul.;23(7):1163-9; Rouach, N. e outros (2004) Glia. 1;45(1):28-38) e conexina 43 e conexina 26 são conhecidas ter promotores diferentes (Hennemann, H. e outros (1992) Eur. J. Ceil Biol. 58(1):81-9); Chenz, Z.Q. e outros (1995) J. Biol. Chem. 270(8):3863-8. No entanto, cicatrização de ferida prejudicada foi demonstrada em ratos logo uma semana após indução de diabetes, antes ou de neuropa- tia ou angiopatia se desenvolver (Wittw, W.B. e outros (2002) Br. J. Surg. 89:1594-1601); Shi, H.P. e outros (2003) Wound Repair Regen. 11:198-203).

Então, as mudanças observadas nesses experimentos dentro de duas se- manas são prováveis de ser conseqüências diretas da condição diabética ao invés de conseqüências secundárias de complicações diabéticas a longo prazo.

Uma constatação significante foi a supra-regulagem anormal de conexina 43 na borda da ferida epidermal em diabetes. Isto tem o potencial em afetar o processo de fechamento de ferida de diferentes maneiras. A formação de compartimentos de comunicação dentro da epiderme de rege- neração foi proposta desempenhar um papel em cicatrização de ferida (Mar- tin, P. (1997) Science 276:75-81); Lampe, P.D. e outros (1998) J. Ceil Biol. 143(6):1735-47; Hodgins, M. (2004) J. Invest Dermatoi 122: comentário). Compartimentalização poderia ser eficazmente causada em condições nor- mais através da expressão de conexina 26 e remoção de conexina 43 em células de borda principal, uma vez que essas conexinas não formam jun- ções umas com as outras. Então, o retardo em cicatrização de ferida em di- abetes poderia refletir o tempo adicional requerido para expressão de cone- xina 43 sub-regular para um ponto onde tal compartimentalização pode a- contecer. Alternativamente, o filamento C de conexina 43 é conhecido inte- ragir com componentes citoesqueletais ou com P120ctn/Rho GTPasel então sub-regulagem de conexina 43 poderia ser necissária para mudança da mo- tilidade de queratinócitos na borda de ferida, permitindo que eles migrem e fechem a ferida (Wei, C.J. e outros (2004) Annu. Rev. Cell Dev. Bioi 20:811- 38). Com relação a isso, foi notado que, um dia após ferimento quando sua expressão de conexina 43 era alta, queratinócitos diabéticos formaram um bulbo espesso na borda da ferida ao invés de nivelarem e começar a se es- palhar através da ferida.

A requerente mostrou aqui que inativação da expressão da co- nexina 43 por uma aplicação única do gel de antissenso específico de cone- xina 43 no momento do ferimento permite que todo o processo, da migração inicial até fechamento completo da ferida, aconteça em uma taxa normal e acima apesar da presença continuada da condição diabética. Então, trata- mento de oligonucleotídeo anticonexina, por exemplo, tratamento de antis- 5 senso, tem potencial considerável como uma nova abordagem para o trata- mento de feridas que não cicatrizam em taxas esperadas, incluindo feridas crônicas em diabéticos e outros pacientes.

EXEMPLO 2

A invenção foi usada com sucesso para tratar um indivíduo hu- mano com uma ferida crônica grande, neste caso uma úlcera vasculítica, em uma base de uso compassivo.

Um homem de 49 anos com doença vascular periférica de base primeiro apresentou complicações surgindo de uma ferida na perna que não fechava. Este paciente tinha sofrido uma amputação abaixo do joelho es- 15 querdo secundária a trauma, que subsequentemente abriu como resultado de uma queda. Durante um período de mais de 6 meses a ferida era não- responsiva a todas as formas de cuidado estabelecido. O paciente sofreu tratamentos tópicos múltiplos em uma tentativa de cicatrizar a ferida, incluin- do a aplicação de fator de crescimento, curativos antimicrobianos, VAC (fe- 20 chamento auxiliado por vácuo), curativo de xenoenxerto, sem nenhuma mu- dança significante. O paciente então caiu e Iesionou mais o sítio ferido. Isto foi seguido por retiradas cirúrgicas de corpos estranhos e tecido morto múlti- plas e substituição do xenoenxerto. A ferida continuou a aumentar de tama- nho e foi considerada se tornar ameaçadora ao membro.

Então, devido à natureza da ferida e ao nível e tipo de amputa-

ção, o paciente foi considerado não ter tido nenhuma opção de tratamento alternativo exceto sofrer uma amputação acima do joelho. A Divisão de Dermatologia da FDA aprovou uso de fármaco experimental da requerente (SEQ ID NO:1) para este paciente sob uma IND de Uso de Emergência. A 30 ferida foi subsequentemente tratada com 2 mL de preparação 20 μΜ de SEQ ID NO:1 em gel pluronic (cerca de 35 cm2) com uma profundidade de aproximadamente 3 a 4 mm. Então, cerca de 12 pg/cm2 de SEQ ID NO:1 foram administrados. A ferida foi coberta e deixada coberta por um período de 7 dias. Quando descoberta no Dia 7, o médico relatou que ambos o ede- ma e o eritema não estavam mais presentes e a ferida parecia ter começado a granular embora as dimensões (comprimento e largura) fossem aproxima- damente iguais naquele estágio.

Um segundo tratamento (dose total de 400 pg) foi aplicado. Se- guindo o tratamento, a ferida continuou a cicatrizar e a lesão foi subsequen- temente relatada ser de 1 mm de profundidade (uma redução de três a qua- tro vezes) com 1 a 1,5 cm de tecido novo em todos os lados. A ferida estava 10 limpa e tecido de granulação "saudável" em aparência. O paciente foi consi- derado "pronto para enxerto" se outro tecido, por exemplo, tecido da coxa pudesse ser usado para enxerto. No entanto, isso não foi considerado uma opção para este paciente por causa de sua doença vascular periférica de base.

Quaisquer preocupações com segurança seguindo este trata-

mento experimental eram evidentes ou relatadas. O paciente foi avaliado novamente dois meses e a ferida tinha continuado a reduzir de tamanho. O tamanho aproximado da ferida tinha reduzido em 7 vezes, para 5 cm2 e pes- soal médico avaliando a ferida concluiu que ela iria continuar para fecha- 20 mento completo. Foi determinado que uma amputação acima do joelho não era mais necessária.

EXEMPLO 3

A invenção foi usada com sucesso para tratar um indivíduo hu- mano com uma ferida crônica, venosa. Um homem de 86 anos com edema 25 periférico de base apresentou complicações de uma úlcera venosa crônica não-cicatrizante, de cinco meses. Durante este período a ferida tinha sido não-responsiva a todas as formas de cuidado estabelecido na comunidade. O paciente sofreu tratamentos tópicos múltiplos em uma tentativa em cicatri- zar a ferida, incluindo antimicrobianos e a aplicação de uma bandagem de 30 pressão para reduzir edema. Durante este período de tempo, a ferida conti- nuou a aumentar de tamanho. O paciente foi programado para sofrer cirurgia de substituição do joelho, mas foi informado que a operação não poderia acontecer na presença de uma ferida crônica aberta.

Então, devido à natureza da ferida, que estava também inflama- da e inchada dentro do leito da ferida e particularmente nas bordas, o paci- ente foi considerado como um caso de uso compassivo e consentimento 5 informado foi obtido a fim de tratar o paciente. A ferida foi subsequentemente tratada com 200 μΙ_ de preparação 10 μΜ de SEQ ID NO:1 em gel pluronic (dose total de aproximadamente 20 pg). A ferida no momento da aplicação era de aproximadamente 3 cm x 3 cm (cerca de 9 cm2) com uma profundi- dade de aproximadamente 2 a 3 mm. Então, a dose total aplicada era cerca 10 de 2,2 pg por cm2. A ferida foi então coberta com um curativo não-adesivo por 24 horas.

Quando descoberta em 24 horas, inflamação e inchaço não es- tavam mais presentes e a ferida estava seca. A ferida foi então deixada des- coberta até 72 horas pós-tratamento momento quando a ferida de úlcera de 15 pele não-cicatrizante anterior estava completamente seca e uma cicatriz ti- nha se formado em toda a ferida. A ferida foi subsequentemente coberta e reexaminada em uma semana, momento quando as dimensões da ferida (comprimento e largura) tinham reduzido significantemente, inflamação e inchaço permaneceram ausentes e a ferida estava cicatrizando e progredin- 20 do para o fechamento.

Um segundo tratamento (dose total de aproximadamente 20 pg de SEQ ID NO:1) foi aplicado em um mês seguindo uma lesão adicional à ferida, que tinha levado a uma parada do fechamento. Seguindo este trata- mento, uma bandagem de pressão foi aplicada para reduzir edema e a ferida 25 começou rapidamente a cicatrizar novamente. A lesão diminuiu em profundi- dade, largura e comprimento e a nova pele onde a ferida cicatrizou era de aparência saudável.

Quaisquer preocupações com segurança seguindo este trata- mento experimental eram evidentes ou relatadas. O paciente foi avaliado novamente em seis semanas. A ferida tinha reduzido de tamanho para apro- ximadamente um quarto do tamanho original e estava progredindo para fe- chamento. TABELA 2 Tabela 2a

Conexina Humana de No. de Acesso GenBank M65188 (SEQ ID NO:13)

1 ggcttttagc gtgaggaaag taccaaacag cagcggagtt ttaaacttta aatagacagg 61 tctgagtgcc tgaacttgcc ttttcatttt acttcatcct ccaaggagtt caatcacttg

121 gcgtgacttc actactttta agcaaaagag tggtgcccag gcaacatggg tgactggagc 181 gccttaggca aactccttga caaggttcaa gcctactcaa ctgctggagg gaaggtgtgg 241 ctgtcagtac ttttcatttt ccgaatcctg ctgctgggga cagcggttga gtcagcctgg 301 ggagatgagc agtctgcctt tcgttgtaac actcagcaac ctggttgtga aaatgtctgc 361 tatgacaagt ctttcccaat ctctcatgtg cgcttctggg tcctgcagat catatttgtg 421 tctgtaccca cactcttgta cctggctcat gtgttctatg tgatgcgaaa ggaagagaaa 481 ctgaacaaga aagaggaaga actcaaggtt gcccaaactg atggtgtcaa tgtggacatg 541 cacttgaagc agattgagat aaagaagttc aagtacggta ttgaagagca tggtaaggtg 601 aaaatgcgag gggggttgct gcgaacctac atcatcagta tcctcttcaa gtctatcttt 661 gaggtggcct tcttgctgat ccagtggtac atctatggat tcagcttgag tgctgtttac 721 acttgcaaaa gagatccctg cccacatcag gtggactgtt tcctctctcg ccccacggag 781 aaaaccatct tcatcatctt catgctggtg gtgtccttgg tgtccctggc cttgaatatc 841 attgaactct tctatgtttt cttcaagggc gttaaggatc gggttaaggg aaagagcgac 901 ccttaccatg cgaccagtgg tgcgctgagc cctgccaaag actgtgggtc tcaaaaatat 961 gcttatttca atggctgctc ctcaccaacc gctcccctct cgcctatgtc tcctcctggg 1021 tacaagctgg ttactggcga cagaaacaat tcttcttgcc gcaattacaa caagcaagca 1081 agtgagcaaa actgggctaa ttacagtgca gaacaaaatc gaatggggca ggcgggaagc 1141 accatctcta actcccatgc acagcctttt gatttccccg atgataacca gaattctaaa 1201 aaactagctg ctggacatga attacagcca ctagccattg tggaccagcg accttcaagc 1261 agagccagca gtcgtgccag cagcagacct cggcctgatg acctggagat ctag

Tabela 2B

Conexina Humana 43 (SEQ ID NO:14)

1 atgggtgactggagcgcctt aggcaaactc cttgacaagg ttcaagccta ctcaactgct 61 ggagggaaggtgtggctgtc agtacttttc attttccgaatcctgctgct ggggacagcg 121 gttgagtcagcctggggaga tgagcagtct gcctttcgtt gtaacactca gcaacctggt 181 tgtgaaaatg tctgctatga caagtctttcccaatctctc atgtgcgctt ctgggtcctg 241 cagatcatat ttgtgtctgt acccacactcttgtacctgg ctcatgtgttctatgtgatg 301 cgaaaggaag agaaactgaa caagaaagag gaagaactca aggttgccca aactgatggt 361 gtcaatgtgg acatgcactt gaagcagatt gagataaagaagttcaagta cggtattgaa 421 gagcatggta aggtgaaaat gcgagggggg ttgctgcgaa cctacatcat cagtatcctc 481 ttcaagtcta tctttgaggt ggccttcttg ctgatccagt ggtacatcta tggattcagc 541 ttgagtgctg tttacacttg caaaagagat ccctgcccac atcaggtgga ctgtttcctc 601 tctcgcccca cggagaaaac catcttcatc atcttcatgc tggtggtgtc cttggtgtcc 661 ctggccttga atatcattga actcttctat gttttcttca agggcgttaa ggatcgggtt 721 aagggaaaga gcgaccctta ccatgcgacc agtggtgcgc tgagccctgc caaagactgt 781 gggtctcaaa aatatgctta tttcaatggc tgctcctcac caaccgctcc cctctcgcct 841 atgtctcctc ctgggtacaa gctggttact ggcgacagaa acaattcttc ttgccgcaat 901 tacaacaagc aagcaagtga gcaaaactgg gctaattaca gtgcagaaca aaatcgaatg 961 gggcaggcgg gaagcaccat ctctaactcc catgcacagccttttgattt ccccgatgat 1021 aaccagaatt ctaaaaaactagctgctgga catgaattac agccactagc cattgtggac 1081 cagcgacctt caagcagagc cagcagtcgtgccagcagca gacctcggcctgatgacctg 1141 gagatctag

Todas as patentes, publicações, artigos científicos, web sites e outros documentos e materiais referidos ou mencionados aqui são indicati- vos dos níveis de habilidade daqueles versados na técnica à qual a invenção pertence, e cada tal documento e material referido é então incorporado a 20 título de referência até o mesmo ponto como se ele tivesse sido incorporado a título de referência em sua totalidade individualmente ou mostrado aqui em sua totalidade. A requerente se reserva o direito de incorporar fisicamente ao presente relatório qualquer um e todos os materiais e informação de quais- quer tais patentes, publicações, artigos científicos, web sites, informação 25 eletronicamente disponível e outros materiais ou documentos referidos.

Os métodos e composições específicos descritos aqui são re- presentativos de modalidades preferidas e são exemplares e não pretendi- dos como limitações do escopo da invenção. Outros objetos, aspectos e modalidades vão ocorrer àqueles de habilidade na técnica quando da consi- 30 deração do presente pedido, e são compreendidos no espírito da invenção conforme definido pelo escopo das reivindicações. Será prontamente apa- rente a um versado na técnica que substituições e modificações variáveis podem ser feitas na invenção revelada aqui sem se afastar do espírito e es- copo da invenção. A invenção ilustrativamente descrita aqui adequadamente pode ser praticada na ausência de quaisquer elemento ou elementos, ou limitação ou limitações, que não são especificamente revelados aqui como 5 essenciais. Então, por exemplo, em cada caso aqui, em modalidades ou e- xemplos da presente invenção, qualquer um dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente em" e "consistindo em" pode ser substituído com qualquer um dos outros dois termos no relatório. Também, os termos "compreendendo", "incluindo", "contendo", etc, devem ser lidos expansiva- 10 mente e sem limitação. Os métodos e processos ilustrativamente descritos aqui podem ser adequadamente praticados em ordens de etapas diferentes, e que eles não são necessariamente restritos às ordens de etapas indicadas aqui ou nas reivindicações. Também conforme usado aqui e nas reivindica- ções apensas, as formas singulares "um", "uma" e "o, a" incluem referência 15 no plural a menos que o contexto dite claramente de outro modo. Sob quais- quer circunstâncias pode a patente ser interpretada ser limitada aos exem- plos ou modalidades ou métodos específicos ou métodos especificamente revelados aqui. Sob quaisquer circunstâncias pode a patente ser interpreta- da ser limitada por qualquer declaração feita por um examinador ou qualquer 20 outro oficial ou funcionário do Escritório de Patente e Marca a menos que tal declaração seja especificamente e sem qualificação ou reserva expressa- mente recebida em uma escrita responsiva pela Requerente.

Os termos e expressões que foram empregados são usados como termos de descrição e não limitação, e não há nenhuma intenção no 25 uso de tais termos e expressões em excluir nenhum equivalente das carac- terísticas mostradas e descritas ou porções das mesmas, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção con- forme reivindicado. Então, será compreendido que embora a presente inven- ção tenha sido especificamente revelada pelas modalidades preferidas e 30 características opcionais, modificação e variação dos conceitos revelados aqui podem ser utilizadas por aqueles versados na técnica e que tais modifi- cações e variações são consideradas estar dentro do escopo da presente invenção conforme definido pelas reivindicações apensas.

A invenção foi descrita amplamente e genericamente aqui. Cada uma das espécies e grupamentos subgenéricos mais limitados se encaixan- do na revelação genérica também forma parte da invenção. Isto inclui a des- 5 crição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa remo- vendo qualquer matéria objeto do gênero, sem importar se ou não o material excisado é especificamente mencionado aqui.

Outras modalidades estão dentro das reivindicações que se- guem. Ainda, onde características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos Markush, aqueles versados na técnica vão reconhecer que a invenção é também então descrita em termos de qualquer membro ou subgrupo individual de membros do grupo Markush. 10

15

20

25

30

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA SUBSTITUTA <110> CoDa TKèrapéutics <120> Becker, David L Green, Colin R Duft, Bradford J COMPOSIÇÕES E MÉTODOS <130> E3697-00094 <140> 12/001.498 <141> 2007-12-11 <150> US 60/874.404 <151> 2006-12-11 <160> 14 <170> PatentIn versão 3.4 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Derivado de mamífero <400> 1 gtaattgcgg caagaagaat tgtttctgtc <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Derivado de mamífero <4 00> 2 gtaattgcgg caggaggaat tgtttctgtc <210> 3 <211> 30 <212> DNA 30

30 <213> artificial <220>

<223> Derivado de mamifero

<400> 3 ggcaagagac accaaagaca ctaccagcat

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> Derivado de mamífero

<400> 4

tcctgagcaa tacctaacga acaaata

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> Derivado de mamífero

<400> 5

catctccttg gtgctcaacc

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> Derivado de mamífero

<400> 6 ctgaagtcga cttggcttgg

<210> 7

<211> 21

<212> DNA <213> Artificial ' <220>

<223> Derivado de mamifero

<400> 7

ctcagatagt ggccagaatg c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> Derivado de mamífero

<400> 8

ttgtccaggt gactccaagg 2 0

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Derivado de mamífero

<400> 9

cgtccgagcc cagaaagatg aggtc 25

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> Derivado de mamífero

<400> 10

agaggcgcac gtgagacac 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA 25

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

84 0

76

<213> artificial <220>

<223> Derivado de mamífero

<4 00> 11 tgaagacaat gaagatgtt

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial <220>

<223> Derivado de mamífero

<400> 12

tttcttttct atgtgctgtt ggtga

<210> 13

<211> 1314

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13 ggcttttagc gtgaggaaag taccaaacag cagcggagtt ttaaacttta aatagacagg tctgagtgcc tgaacttgcc ttttcatttt acttcatcct ccaaggagtt caatcacttg gcgtgacttc actactttta agcaaaagag tggtgcccag gcaacatggg tgactggagc gccttaggca aactccttga caaggttcaa gcctactcaa ctgctggagg gaaggtgtgg ctgtcagtac ttttcatttt ccgaatcctg ctgctgggga cagcggttga gtcagcctgg ggagatgagc agtctgcctt tcgttgtaac actcagcaac ctggttgtga aaatgtctgc tatgacaagt ctttcccaat ctctcatgtg cgcttctggg tcctgcagat catatttgtg tctgtaccca cactcttgta cctggctcat gtgttctatg tgatgcgaaa ggaagagaaa ctgaacaaga aagaggaaga actcaaggtt gcccaaactg atggtgtcaa tgtggacatg cacttgaagc agattgagat aaagaagttc aagtacggta ttgaagagca tggtaaggtg aaaatgcgag gggggttgct gcgaacctac atcatcagta tcctcttcaa gtctatcttt gaggtggcct tcttgctgat ccagtggtac atctatggat tcagcttgag tgctgtttac acttgcaaaa gagatccctg cccacatcag gtggactgtt tcctctctcg ccccacggag aaaaccatct tcatcatctt catgctggtg gtgtccttgg tgtccctggc cttgaatatc 960

1020

1080

1140

1200

1260

1314

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

84 0

900

960

1020

1080

1140

1149

77

attgaactct tctatgtttt cttcaagggc gttaaggatc gggttaaggg aaagagcgac ccttaccatg cgaccagtgg tgcgctgagc cctgccaaag actgtgggtc tcaaaaatat gcttatttca atggctgctc ctcaccaacc gctcccctct cgcctatgtc tcctcctggg tacaagctgg ttactggcga cagaaacaat tcttcttgcc gcaattacaa caagcaagca agtgagcaaa actgggctaa ttacagtgca gaacaaaatc gaatggggca ggcgggaagc accatctcta actcccatgc acagcctttt gatttccccg atgataacca gaattctaaa aaactagctg ctggacatga attacagcca ctagccattg tggaccagcg accttcaagc agagccagca gtcgtgccag cagcagacct cggcctgatg acctggagat Ctag <210> 14 <211> 1149 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 atgggtgact ggagcgcctt aggcaaactc cttgacaagg ttcaagccta ctcaactgct ggagggaagg tgtggctgtc agtacttttc attttccgaa tcctgctgct ggggacagcg gttgagtcag cctggggaga tgagcagtct gcctttcgtt gtaacactca gcaacctggt tgtgaaaatg tctgctatga caagtctttc ccaatctctc atgtgcgctt ctgggtcctg cagatcatat ttgtgtctgt acccacactc ttgtacctgg ctcatgtgtt ctatgtgatg cgaaaggaag agaaactgaa caagaaagag gaagaactca aggttgccca aactgatggt gtcaatgtgg acatgcactt gaagcagatt gagataaaga agttcaagta cggtattgaa gagcatggta aggtgaaaat gcgagggggg ttgctgcgaa cctacatcat cagtatcctc ttcaagtcta tctttgaggt ggccttcttg ctgatccagt ggtacatcta tggattcagc ttgagtgctg tttacacttg caaaagagat ccctgcccac atcaggtgga ctgtttcctc tctcgcccca cggagaaaac catcttcatc atcttcatgc tggtggtgtc cttggtgtcc ctggccttga atatcattga actcttctat gttttcttca agggcgttaa ggatcgggtt aagggaaaga gcgaccctta ccatgcgacc agtggtgcgc tgagccctgc caaagactgt gggtctcaaa aatatgctta tttcaatggc tgctcctcac caaccgctcc cctctcgect atgtctcctc ctgggtacaa gctggttact ggcgacagaa acaattcttc ttgccgeaat tacaacaagc aagcaagtga gcaaaactgg gctaattaca gtgcagaaca aaatcgaatg gggcaggcgg gaagcaccat ctctaactcc catgcacagc cttttgattt ccccgatgat aaccagaatt ctaaaaaact agctgctgga catgaattac agccactagc cattgtggae cagcgacctt caagcagagc cagcagtcgt gccagcagca gacctcggcc tgatgacctg gagatctag

Claims

1. Método de tratamento de um indivíduo tendo uma ferida que não cicatriza em uma taxa esperada, o qual compreende administração de uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo de anticonexina 43 à ferida.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucle- otídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de antissenso de conexina 43.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucle- otídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de RNAi.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucle- otídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de siRNA.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucle- otídeo de anticonexina 43 é administrado por pelo menos cerca de 0,5 hora, pelo menos cerca de 1 a 2 horas, pelo menos cerca de 2 a 4 horas, pelo menos cerca de 4 a 6 horas ou pelo menos cerca de 6 a 8 horas.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a ferida é uma ferida aberta.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a ferida é uma ferida de cicatrização retardada ou incompleta.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a ferida é uma ferida crônica.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a ferida é uma úlcera vasculítica.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a ferida é uma úlcera venosa ou uma ulcera de estase venosa.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a ferida é uma úlcera arterial.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a ferida é uma úlcera de pressão ou uma úlcera de decúbito.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a ferida é uma úlcera diabética.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a ferida é uma úlcera da pele resultante de trauma.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a ferida é uma úlcera da pele resultante de uma queimadura.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduo é diabético.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduo é um humano.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduo é um animal não-humano.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o animal é um cavalo.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o animal é um cachorro.

21. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o animal é um gato.

22. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polinu- cleotídeo de anticonexina 43 é administrado em uma quantidade variando de a partir de cerca de 1 a cerca de 100 pg por centímetro quadrado de tama- nho da ferida.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a admi- nistração do dito polinucleotídeo de anticonexina 43 é repetida.

24. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a admi- nistração do dito polinucleotídeo de anticonexina 43 é repetida cerca de uma vez por semana, com o que a cicatrização da ferida é promovida.

25. Método de tratamento de um indivíduo tendo uma cicatriza- ção retardada, cicatrização incompleta ou ferida crônica que compreende administração à ferida de um polinucleotídeo de antissenso de conexina 43 com o que a expressão da conexina 43 é supra-regulada durante um perío- do de tempo prolongado.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a expres- são de conexina 43 é supra-regulada por pelo menos cerca de 0,5 hora, pelo menos cerca de 1 a 2 horas, pelo menos cerca de 2 a 4 horas, pelo menos cerca de 4 a 6 horas ou pelo menos cerca de 6 a 8 horas.

27. Método de tratamento de um indivíduo tendo uma cicatriza- ção retardada, cicatrização incompleta ou ferida crônica que compreende administração a uma área de ferida de um polinucleotídeo de antissenso de conexina 43 com o que os níveis de conexina 43 na área de ferida são dimi- nuídos por pelo menos cerca de 0,5 hora, pelo menos cerca de 1 a 2 horas, pelo menos cerca de 2 a 4 horas, pelo menos cerca de 4 a 6 horas ou pelo menos cerca de 6 a 8 horas.

28. Método de promoção de cicatrização de ferida em um indiví- duo tendo uma cicatrização retardada, cicatrização incompleta ou ferida crô- nica que compreende administração à ferida de uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um polinucleotídeo de antissenso de conexina 43 eficaz para supra-regular a expressão da conexina 43 por um período de tempo prolongado.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que a expres- são da conexina 43 é supra-regulada por pelo menos cerca de 0,5 hora, pelo menos cerca de 1 a 2 horas, pelo menos cerca de 2 a 4 horas, pelo menos cerca de 4 a 6 horas ou pelo menos cerca de 6 a 8 horas.

30. Método de promoção de cicatrização de ferida em um indiví- duo tendo uma cicatrização retardada ou ferida crônica que compreende administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polinucleo- tídeo de antissenso de conexina 43 a uma área de ferida eficaz para aumen- tar as taxas de reepitelização na área da ferida.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o polinu- cleotídeo de antissenso é administrado em uma formulação de liberação sustentada.

32. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o polinu- cleotídeo é administrado por um período de tempo prolongado.

33.Método de acordo com a reivindicação 30, em que o polinu- cleotídeo de antissenso é eficaz para diminuir os níveis de conexina 43 por pelo menos cerca de 0,5 hora, pelo menos cerca de 1 a 2 horas, pelo menos cerca de 2 a 4 horas, pelo menos cerca de 4 a 6 horas ou pelo menos cerca de 6 a 8 horas.

34. Método de promoção de reepitelização de feridas na pele que compreende administração a um indivíduo tendo uma cicatrização retar- dada, cicatrização incompleta ou ferida crônica um polinucleotídeo de anti- conexina 43 em uma quantidade eficaz para promover reepitelização.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o polinu- cleotídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de antissenso de conexi- na 43.

36. Método de promoção de cicatrização de ferida em um indiví- duo tendo uma cicatrização retardada, cicatrização incompleta ou ferida crô- nica que compreende administração de uma composição farmacêutica com- preendendo um polinucleotídeo de antissenso de conexina 43 e um polinu- cleotídeo de antissenso de conexina 31.1.

37. Método de aumento da taxa de cicatrização de ferida em um indivíduo diabético tendo uma ferida que compreende administrar ao indiví- duo uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo de anticonexina 43.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o polinu- cleotídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de RNAi.

39. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o polinu- cleotídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de siRNA.

40. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o polinu- cleotídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de antissenso de conexi- na 43.

41. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o dito po- linucleotídeo tem de a partir de cerca de 18 a cerca de 32 nucleotídeos.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, em que o polinu- cleotídeo é um oligodesoxinucleotídeo.

43. Método de aumento da taxa de cicatrização de ferida em um indivíduo diabético tendo uma ferida que compreende administrar ao indiví- duo uma quantidade de um polinucleotídeo de anticonexina 43 que é eficaz para diminuir a regulagem de conexina 43 anormal na ferida ou uma área de ferida.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o polinu- cleotídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de RNAi.

45. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o polinu- cleotídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de siRNA.

46. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o polinu- cleotídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de antissenso de conexi- na 43.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, em que o polinu- cleotídeo de antissenso de conexina 43 é um oligodesoxinucleotídeo de co- nexina 43.

48. Método de acordo com a reivindicação 46, em que o polinu- cleotídeo tem de a partir de cerca de 18 a cerca de 32 nucleotídeos.

49. Método de aperfeiçoamento do fechamento de ferida em um indivíduo diabético tendo uma ferida que compreende administrar ao indiví- duo uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo de anticonexina 43.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o polinu- cleotídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de RNAi.

51. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o polinu- cleotídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de siRNA.

52. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o polinu- cleotídeo de anticonexina 43 é um polinucleotídeo de antissenso de conexi- na 43.

53. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o polinu- cleotídeo de antissenso de conexina 43 tem de a partir de cerca de 18 a cer- ca de 32 nucleotídeos.

54. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o polinu- cleotídeo é um oligodesoxinucleotídeo.

55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 25, 27, 28, 30, 34, 36, 37, 43 e 49 em que o polinucleotídeo de antissenso compreende uma seqüência selecionada de SEQ ID NO.: 1 ou 2.

56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 25, 27, 28, 30, 34, 36, 37, 43 e 49 em que o polinucleotídeo de antissenso tem pelo menos cerca de 70 por cento de homologia com a SEQ IDNO: 1 ou 2.

57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 25, 27, 28, 30, 34, 36, 37, 43 e 49, em que o polinucleotídeo de antissenso da conexina 43 hibridiza para mRNA de conexina 43 sob condições de mé- dia a alta estringência.

58. Matriz de cicatrização de ferida sintética ou de ocorrência natural compreendendo um polinucleotídeo de anticonexina.

59. Matriz de cicatrização de ferida de acordo com a reivindica- ção 58, em que o polinucleotídeo de anticonexina é um polinucleotídeo de antissenso de conexina 43.

60. Matriz de cicatrização de ferida de acordo com a reivindica- ção 58, em que o polinucleotídeo de anticonexina é um oligodesoxinucleotí- deo.

61. Matriz de cicatrização de ferida de acordo com a reivindica- ção 60, em que o oligodesoxinucleotídeo de anticonexina é um oligodesoxi- nucleotídeo de antissenso de conexina 43.