KR20040004538A

KR20040004538A - 세포간 커뮤니케이션을 촉진시켜주는 화합물의 신규한의약적 용도

Info

Publication number: KR20040004538A
Application number: KR10-2003-7011099A
Authority: KR
Inventors: 비야르네 듀 라르센; 요르겐 소베르그 페테르센; 에디 마이어; 안네 루이제 키욜비에; 니클라스 리에 요르겐센; 모르텐 샤크 닐센; 닐스-헨릭 홀스타인-라틀로우; 제임스 비. 마틴스
Original assignee: 질랜드 파마 에이/에스
Priority date: 2001-08-23
Filing date: 2002-02-22
Publication date: 2004-01-13
Also published as: CN1988914A

Abstract

안정성이 개선된 항부정맥성 펩타이드를 비롯한 신규한 펩타이드가 개시된다. 또한 이러한 벱타이드를 포함하는 조성물과 이를 조성물을 특히 의약으로서 사용하는 방법도 개시된다.

Description

세포간 커뮤니케이션을 촉진시켜주는 화합물의 신규한 의약적 용도{NEW MEDICAL USES OF INTERCELLULAR COMMUNICATION FACILITATING COMPOUNDS}

간극 결합 (gap junctions)은 이웃하는 두개의 세포의 세포질 구획을 직접 연결해주는 조밀하게 패킹된 간극 결합 채널이 수백 내지 수천개 모여 이루어진 클러스터를 갖는 세포막의 특화된 대역이다. 간극 결합 채널은 이웃하는 두개의 세포각각에 의해 제공되는 두개의 헤미채널 (코넥손)로 이루어진다. 각각의 코넥손은 코넥신 (connexin:Cx)이라 칭해지는 6개의 단백질로 구성된다. 코넥신은 4개의 트랜스막 도메인, 2개의 세포외 루프, 및 세포질 루프의 기본 구조를 함께 공유하는 커다란 단백질군이다. 종 및 코넥신 이소형태마다 세포외 루프와 트랜스막 도메인은 고도로 보존적이다. 그러나 C-말단의 길이는 분자량 기준으로 코넥신의 종류에 따라 상당히 다르다. 간극 결합 채널은 트위스트 모션에 의해 개방 상태와 폐쇄 상태 사이를 왔다갔다 할 수 있다. 개방 상태에서는 이온과 작은 분자들이 포어를 통해 통과할 수 있다. 간극 결합을 통해서 전기 충격의 전달과 시그날 분자들의 세포간 확산이 일어나기 때문에, 정상적인 세포간 커뮤니케이션을 위해서는 정상적으로 기능하는 간극 결합들이 필수적이다. 세포간 커뮤니케이션은 세포의 항상성, 증식 및 분화에 필수적이다.

후술하는 섹션에서 드러나는 바와 같이, 사람에 있어서 코넥신의 비정상성과 질병 사이의 관계가 정립되었다. 그 한가지 예는 원생동물성 기생충인트리파노조마 크루찌(Trypanosoma cruzi)에 의해 발생하는 샤가스(Chagas)병이다. 이 질환은 라틴 아메리카에 있어서의 심장기능 장애의 주요원인이다.트리파노조마 크루찌(Trypanosoma cruzi)에 의해 감염된 세포에서, 변형된 Cx43 분포가 관찰되었으며 이러한 변형이 이 질환의 특징인 전도 장해 (conduction disturbance) 발생과 관련이 있을 수 있다^[7].

다세포 생명체에 있어서, 세포들 간의 공조는 더할 나위 없이 중요하다. 세포간의 상호 소통의 다양한 수단 중에서도, 간극 결합은 가장 직접적인 경로를 제시해준다. 간극 결합은 인접 세포들 사이에 형성되는 간극 복합체의 일종으로서 이웃하는 세포들의 내부 (세포질)을 직접 연결시켜주는 응집된 채널이다. 다 자란 포유류에 있어서는, 대부분의 세포 종류에서 간극 결합이 발견되는데, 알려진 한가지 예외가 있다면, 그것은 순화중의 혈액 요소들이다.

코넥신의 유전자 구조에 대해서는 알려진 것이 비교적 거의 없다. 마우스의 Cx43에 관해 보고된 결과에 의하면 Cx43은 5'-미번역 대역에 위치하는 두개의 엑손과 하나의 인트론을 함유하는 것으로 나타났다. 5' 중앙부의 프로모터 (proximal promotor)에서 몇가지 추정적인 전사인자 결합 부위가 동정된 바 있다. 생체외 연구결과, 서로 다른 여러쌍의 코넥신으로 이루어진 헤미채널에 의해 투과성 채널이 만들어질 수 있는 것으로 나타났다. 예컨대, Cx43은 Cx43, Cx37, Cx40 및 Cx45, 그리고 난모세포의 내인성 Cx (Cx38)와는 기능성 채널을 만들 수 있지만, Cx26 난모세포와는 그럴 수 없다. 그러나, 이들 헤테로채널의 투과성 조절에 관해서 뿐만 아니라 이들의 특성에 관해서는 극히 일부만 알려져있을 뿐이다. Cx는 대부분의 조직에서 발현되고 단일 세포가 여러가지 서로 다른 Cx를 발현시킬 수 있다. 투과성 간극 결합은 서로 다른 유형의 Cx를 발현하는 세포들 간에 형성될 수 있다. 따라서 조직 중에서의 간극 결합 세포간 커뮤니케이션 (GJIC: gap junction intercellular communication)은 그 조직의 인테그리티를 유지하는데 있어서 매우 중요한 것으로 보인다. 몇몇 유전자들은 이들 유전자 중 어느 하나의 돌연변이로 인해 GJIC가 손상되는 것을 방지하기 위해, 동등한 생성물을 만드는 것으로 보인다.

형성된 간극 결합 채널의 포어 직경은 0.8 - 1.4 nm 범위인 것으로 보고되었다. 간극 결합은 비교적 비-선택성이며 약 1000 달톤 이하의 분자들을 통과시킨다. 이러한 물질의 예로는 특히 이온, 물, 슈가, 뉴클레오타이드, 아미노산, 지방산, 소형 펩타이드, 약물 및 발암성 물질을 들 수 있다. 채널을 통과하는데는 ATP가 필요하지 않으며 이는 수동 확산의 결과인 것으로 보인다. 간극 결합 채널을 경유한 세포들간의 이러한 물질 이동은 간극 결합 세포간 커뮤니케이션 (GJIC: gap junctional intercellular communication)으로서 알려져 있으며, 세포 대 세포의 시그널링, 세포 증식 및 세포 대사를 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다. GJIC가 갖는 가장 중요한 생리적 의미 중 하나는 조직 중에서 간극 결합에 커플링된 세포들이 개별적으로 불연속적인 개체가 아니라, 자신들의 이웃들과 고도로 긴밀히 통합되어 (integrated) 있다는 것이다. 이러한 특성은 항상성을 촉진시켜주며 세포들 간에 2차 메신저를 신속하고 직접적으로 전달해 줌으로써 조직중에서의 세포 응답을 공조해주는 역할도 해준다.

GJIC 프로세스는 몇가지 주요 카테고리로 대별될 수 있는 다양한 메카니즘에 의해 조절된다. 한가지 조절 유형에서는, 발현, 분해, 플라즈마 막에 대한 코넥신의 세포성 트래피킹 (cellular trafficking)에 영향을 미치거나, 또는 기능적 간극 결합으로의 코넥신의 어셈블리에 영향을 미침으로써 간극 결합의 세포량이 제어된다. 예컨대 종양 세포에서와 같이, 코넥신 발현의 다운-레귤레이션에 의해 일어나는 손상된 GJIC가 이러한 조절 모드의 한 예이다. 또 다른 조절 유형은 일반적으로, 간극 결합이나 코넥신의 세포 수준의 전체적인 변경에 의하지는 않으나, 기존의 간극 결합의 개방 (opening)또는 폐쇄 (closure) (게이팅)을 포함한다. 세포외 용해성 인자들, 예컨대 마이토젠 (예컨대 DDT), 호르몬 (예컨데 카테콜아민), 마취제 (예컨대 할로쎄인), 세포내 바이오분자 (예컨대 cAMP), 및 세포 스트레스 (예컨대 기계적 또는 대사적 스트레스)가 이러한 유형의 조절을 일으킬 수 있다. 또한, GJIC는 세포 사이클 및 세포 이동시에도 조절된다.

간극 게이팅 또는 GJIC 조절 모드는 특히 Cx43으로 구성된 간극 결합에 대해 광범위하게 연구되었다. 몇몇 인자들은 예컨대, 지질 환경을 변화시킨다던가, 세포막 유동성을 변화시키는 방식으로 GJIC에 대한 그들의 억제 효과를 간접적으로 발휘하는 반면, 다른 GJIC 저해제들은 Cx43의 여러가지 변형을 유도하는 온코진, 성장 인자 및 종양 프로모터를 포함한다. 이들 후자의 그룹의 특이적인 생물학적 기능을 매개하기 위해서는, 간극 투과성의 파괴가 요구될 수 있다. 이 물질들은 키나제, 포스파타제 및 상호작용하는 단백질로 이루어진 복잡한 시그널링 경로를 개시한다. 이들 GJIC 모듈레이터들의 작용 메카니즘을 이해할 수만 있다면 간극 조절에 책임이 있는 그들 각각의 시그널링 경로를 정의할 수 있을 뿐만 아니라, GJIC 및 코넥신의 생물학적 기능을 특징화할 수 있는 실험적 도구도 제공할 수 있을 것이다.

Cx43의 세포질 카르복시 말단의 특정 부위에서의 포스포릴화의 변화는 간극 결합 채널의 개방과 폐쇄에 있어서 중추적인 것으로 보인다. 카르복시 말단 도메인의 포스포릴화는 또한 Cx43 간극 결합 헤미컴플렉스를 세포막에 연결시키는 과정, 그의 세포내 흡착 (internalisation) 및 분해에 있어서도 중요한 것일 수 있다. 코넥신의 반감기 (몇시간)는 대부분의 플라즈마막 단백질의 반감기 (며칠)에 비해 훨씬 짧다; 예컨대, 래트 심장 중의 Cx43의 반감기는 1 ½시가 미만이다. 따라서, 턴오버 (turnover) 속도를 조절하는 것이 GJIC를 조절하는데 있어서 중요한 인자가 될 것이다.

카르복시 말단 도메인은 여러가지 단백질 키나제 (PKA, PKC, PKG, MAPK, CaMkII 및 티로신 키나제)에 있어서 추정적인 포스포릴화 부위를 포함한다. 카르복시 말단 도메인의 이들 부위에서의 포스포릴화는 간극 결합 채널의 폐쇄를 초래하며 Cx43 간극 결합 채널의 여러가지 저해제들은 여러가지 서로 다른 시그널링 경로를 이용하여 카르복시 말단 도메인의 포스포릴화를 유도한다. 세포의 종류와 특정 저해제가 어떤 시그널링 경로가 사용될 것인지를 정하며, 연관된 단백질 키나제의 종류가 사용된 세포내 메신저 시스템을 지정한다. 따라서, PKA의 활성화는 cAMP 2차 메신저 시스템의 관여를 요구하는 반면, PKC는 포스포이노시톨 세포내 시그널링 시스템의 관여를 요구하는 것으로 보고되어 있다.

채널 게이팅을 조절하는 다른 메카니즘들은 수소 칼슘 이온 농도, 트랜스정션 전압 및 자유 래디칼과 관련이 있다. pH나 pCa의 저하는 세포- 및 코넥신-특이적인 방식으로 채널의 폐쇄를 유도한다.

GJIC는 성장 조절 이외에도 많은 생리적 역할을 하는 것으로 제시되어왔다.

항상성: GJIC는 세포내 유액, 이온 및 영양소의 신속한 평형을 달성하게 해준다. 이것은 이들 채널의 가장 오래되고, 광범위하면서도 가장 중요한 기능일 것이다. 전기적 커플링: 간극 결합은 심근세포, 평활근 세포 및 뉴론과 같은 전기적으로 여기될 수 있는 세포들에 있어서 전기적 시냅스 역할을 한다. 이들 조직에서는, 전기적 커플링이 화학적 시냅스보다 활동 전위의 세포 대 세포 전달을 더욱 신속하게 해준다. 심근세포와 평활근 세포에 있어서는 이것이 이들의 동시적 수축을 가능케 해준다. 조직은 호르몬에 응답한다: GJIC는 외부 자극에 대한 조직의 응답성을 향상시킬 수 있다. 사이클릭 뉴클레오타이드, 칼슘 및 이노시톨 포스페이트와 같은 2차 메신저들은 간극 채널을 통해서, 호르몬적으로 활성화된 세포로부터 무활동성 세포로 통과할만큼 충분히 작아서 후자를 활성화시킨다. 이러한 효과는 아고니스트에 대한 조직 응답을 증가시킬 수 있다. 배(胚) 발달의 조절: 간극 결합은 배에 있어서의 화학적 및/또는 전기적 발달의 시그널 및, 발달적 콤파트먼트의 한계를 정하는 세포간 경로 역할도 할 수 있다. GJIC는 배 세포에서 특이적인 패턴으로 발생하며 GJIC의 장애는 비정상적 발달 및 많은 화학물질의 기형발생 효과와 관련이 있다.

세포간 커뮤니케이션은 개개 세포의 활동이 서로 조화를 이룰 수 있는 방식으로 일어나게 해주며, 이들 활동을, 당해 유기체에 속하며 그 유기체를 부양하는 일 조직의 운동력으로 통합시킨다. 따라서 광범한 병생리학적 증상이 GJIC의 저하와 연관되어 있다는 것은 그다지 놀랄만한 일이 아니다. 코넥신의 비정상성과 여러가지 질병 상태 사이의 연관성이 생체외 및 생체내 모두에서 정립된 바 있다. 그 한가지 예는 기도 상피에 있어서, 전-염증성 (pro-inflammatory) 시토카인에 의한 간극 결합 커뮤니케이션의 조절인데, 여기서 Chanson M, Berclaz PY, Scerri I, Dudez T, Wernke-Dollries K, Pizurki L, Pavirani A, Fiedler MA, Suter S. (AM JPathol 2001 May; 158 (5): 1775-84)는 TNF-알파에 의해 유도된 감소된 세포간 커뮤니케이션이 점진적으로 염증을 일으킨다는 것을 발견하였다.

요약하면, 간극 결합의 게이팅이나 폐쇄 또는 심지어는 부재와 같은 기능장애가, 질병에 걸릴 위험성의 증가와 연관이 있다는 증거는 수도 없이 많다. 상기 질환을 치료하는데 현재 이용가능한 약물 중 어떠한 것도 간극 결합의 기능을 촉진시켜주거나 기능을 증진시킴으로써 세포간 커뮤니케이션을 촉진시켜주는 물질로서 작용하는 것은 없다. 그러나, 간극 결합의 전도를 증가시킬 수 있는 일군의 펩타이드 (항부정맥성 펩타이드)가 종전에 설명된 바 있었다. 그 내용이 PCT/DK01/00127에 요약되어 있으며 본 발명에서 참고되었다. 본 발명의 개요는 2001년 2월 22일 출원된 미국특허출원 제 09/792,286호에 개시되어 있다. USSN 09/792,286호의 기재 내용은 본 발명에 통합되었다.

항부정맥성 펩타이드 (antiarrhythmic peptide)는 간극 결합에 대해 선택적으로 그 효과를 발휘하는 일군의 펩타이드이므로 세포들의 언커플링 (uncoupling)을 감소시켜줄 뿐만 아니라 활동전위지속시간의 분산도 감소시킨다. 그러나, 합성 AAP10 뿐만 아니라 천연의 AAP 역시 몇가지 바람직하지 못한 특성, 예컨대, 안정성이 저조하고 유효 농도가 높다는 결점을 가짐으로 해서, 이제까지 이들이 의약으로 사용되지 못했었다. Grover 및 Dhein^[21]은 핵자기 공명 스펙트럼을 이용해서 AAP10의 두가지 세미 고리형 배열을 특징화시켰다. 따라서, 안정한 항부정맥성 펩타이드를 얻기 위한 한가지 접근방식은 항부정맥성 펩타이드의 고리형 유도체를 제공하는것일 수 있다. DE19707854는 AAP 및 AAP10과 동일한 항부정맥성 특성을 갖는 고리형 CF₃C(OH)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH와 고리형 CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH를 개시하고 있으나, 수용액에서, 그리고 동결 및 해동 사이클을 반복한 후에 안정성이 증강되는 것으로 설명되어 있다. 그러나, DE19707854에 설명된 실험조건은 상기 고리형 화합물의 제조에 불충분하며, HPLC를 이용하여 제공된 화학적 동정 자료도 상기 고리형 화합물을 동정하는데 충분치 못하다. 미국특허 제 4,775,743호에는 N-3-(4-히드록시페닐)프로피오닐-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH의 서열을 가지며 혈소판 응집에 대해 활성적인 펩타이드 유도체인 HP5가 기재되어 있다. Dhein 및 Tudyka^[22]는 활성과 농도 측면에서, 항부정맥성 펩타이드에 속하는 펩타이드 유도체를 비롯한 펩타이드에 대해 상기 문헌을 검토하였으나 (예컨대 상기 문헌의 표 1), 겨우 7개의 화합물만이 활성적인 것으로 밝혀졌고 추가의 4개의 화합물만이 약한 활성이 있는 것으로 나타났다. 그러나, 이들 펩타이드 또는 펩타이드 유도체 중 어느 것도 실제 치료양생에 효과적일 정도로 충분히 안정하지는 않은 것으로 나타났다.

후술하는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 척추동물의 조직, 특히 포유동물의 조직에서 간극 결합 세포간 커뮤니케이션 (GJIC)을 증대시키며, 예컨대 포유동물과 같은 척추동물에 있어서, 세포간 간극 결합 커뮤니케이션의 기능 저하와 관련이 있거나 그에 기인하는 광범위한 질병이나 증상을 치료하는데 효과가 있다.

따라서, 본 발명의 한가지 목적은 간극 결합 세포간 커뮤니케이션 장애 또는간극 결합을 통한 커플링 장애에 기인하는 것과 같은, 세포성 커뮤니케이션의 저하나 장애로 특징지어지는 질병 또는 의학적 증상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 질병 및 의학적 증상의 예로는 상기한 바와 같이, 기도 상피의 염증, 페포 조직의 기능부전, 방광 실금, 달팽이관 질환으로 인한 난청, 상피세포 병변, 당뇨성 망막증 및 당뇨성 신경장애, 중추신경계와 척수의 허혈, 치주질환을 비롯한 치아 조직 질환, 고혈압으로 이어지는 사구체근접 장치로부터의 분비저하와 같은 신장 질환을 비롯한 여러 질환, 및 골수이식 실패를 들 수 있다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 항부정맥성 펩타이드 화합물을 비롯한 본 발명의 펩타이드에 의해 달성된다.

본 발명에 따라 세포성 커뮤니케이션의 장애 또는 간극 결합 기능 장애에 기인하는 여러 질병의 예방 또는 치료법이 제공된다. 이러한 질환의 예로는 호흡계, 순환계 또는 신경계, 시각 및 청각, 치아 조직, 평활근 및 세포와 조직의 이식에 영향을 미치는 질병을 들 수 있다. 이러한 방법은 그 단독의 치료법으로 이용될 수도 잇고 특정 질환 또는 증상에 대응하는 한가지 이상의 다른 확립된 프로토콜과 병용될 수도 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에는 예컨대 유인원, 설치류 (마우스, 래트, 햄스터 및 토끼와 같은 토끼목 동물을 포함), 개, 돼지 및 염소와 같은 포유동물의 치료방법이 포함된다. 바람직한 유인원인 인간 환자이다. 본 발명의 방법에 유용한 화합물은 GJIC의 촉진제로서 기능한다는 특징을 갖는다.

더욱 구체적으로 본 발명은 간극 결합을 통해 발생하는, 질병 상태의 세포와조직에 있어서 세포간 커뮤니케이션을 촉진 (유지)시킴으로써, 바람직하게는, 간극 결합 기능 장애에 의해 일어나는 비증식성 질환에 걸린 환자에게, 간극 결합 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 적어도 한가지의 화합물을 치료적 유효량으로 투여함으로써, 간극 결합 기능 장애에 의해 일어나는 비증식성 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 유용한 화합물들은 모두 세포와 조직에서 GJIC를 촉진 또는 매개한다는 특징을 공유한다. 이 GJIC가 매개되는 메카니즘은 여러가지일 수 있는데, 이는 코넥신 기능에 영향을 미치고/미치거나 간극 결합 기능을 매기하는 세포성 메카니즘이 많기 때문이다. 이러한 메카니즘으로는 예컨대 다음을 들 수 있다:

●코넥신의 발현을 업레귤레이션시키거나 정상화시킴으로써 간극 결합의 세포량을 제어하는 것,

●반감기를 연장시킴으로써 코넥신의 턴오버 속도를 조절하는 것을 비롯하여, 간극 결합 및 코넥신의 분해를 억제하는 것

●플라즈마 막으로의 코넥신의 세포성 트래피킹을 증대시키는 것

●코넥신의 기능성 간극 결합으로의 어셈블리를 매개하는 것

●기존의 간극 결합이 예컨대 폐쇄되어 있거나, 저해제에 의해 게이팅되어 있을 경우, 간극 결합의 개방을 유도하는 것. 이 메카니즘은 예컨대 Cx43과 같은 코넥신의 세포질 카르복시 말단 도메인의 과포스포릴화와 같이, 직간접적인 메카니즘을 통해 작용하는 GJIC의 저해제에 의해 영향을 받는, 간극 결합 폐쇄의 역전으로서 설명될 수 있다.

카르복시 말단 도메인은 다수의 단백질 키나제 (PKA, PKC, PKG, MAPK, CaMkII 및 티로신 키나제)에 대해 추정적인 포스포릴화 위치를 포함한다. 카르복시 말단 도메인의 이러한 위치에서의 포스포릴화는 간극 결합 채널의 폐쇄를 야기하며 Cx43 간극 채널의 여러가지 저해제들이 카르복시 말단 도메인의 포스포릴화를 유도하기 위해 상이한 시그널링 경로를 이용한다. 세포 종류와 특정 저해제가 어떤 시그널링 경로를 이용할 것인지를 결정하며 연관된 단백질 키나제의 종류가, 사용된 세포내 메신저 시스템을 정한다. 따라서, PKA의 활성화는 cAMP 2차 메신저 시스템의 관여를 요구하는 반면, PKC는 포스포이노시톨 세포내 시그널링 시스템의 관여를 요구하는 것으로 보고된 바 있다.

채널 게이팅을 조절하는 다른 메카니즘에는 수소 및 칼슘 이온의 세포내 농도, 트랜스정션 전압, 저산소 이용성 및 저글루코스 이용성, 및 자유 래디칼이 포함된다. 감소된 pH 또는 pCa는 세포- 및 코넥신-특이적 방식으로 채널 폐쇄를 유도한다.

본 발명에 따라 펩타이드, 예컨대 항부정맥성 펩타이드, 바람직하게는 다음에 상세히 설명되는 (2001년 2월 22일 출원된 PCT/DK01/00127 및 USSN 09/792,286호에 설명됨. USSN 09/792,286 출원은 2000년 2월 23일 출원된 덴마크 출원 DK PA 2000 00288 및 2000년 5월 4일 출원된 DK PA2000 00738에 대한 우선권 주장 출원인 2000년 12월 6일자 미국임시출원 60/251,659의 계속출원이다. 상기 USSN 09/792,286, 60/251,659 및 덴마크 출원 DK PA2000 00288 및 DK PA 2000 00738은 각각 본 발명에 참조되었다) 바와 같이, 기도 상피의 염증, 폐포 조직 질환, 상처,발기부전, 방광 뇨실금, 달팽이관 질환으로 인한 난청, 상피 병변, 당뇨성 망막증 및 당뇨성 신경 장애, 신경증 통증, 중추신경계의 허혈, 척수 손상, 치주질환을 비롯한 치아 조직 질환, 신장 질환, 아만성 및 만성 염증, 암 및 골수 이식 실패 및 줄기 세포 이식 실패를 비롯한 특징 질환의 치료를 위한 AAP 수용체에 대한 아고니스트인 펩타이드인 것이 바람직하다.

PCT/DK01/00127에 설명된 항부정맥성 펩타이드 및 그의 기능적 유사체는 본 발명에 유용하다.

상기 항부정맥성 펩타이드는 간극 결합에 대해 선택적으로 효과를 발휘하기 때문에 항부정맥성 펩타이드 AAP10에 상기 설명된 효과와 유사한 작용 잠재 기간의 분산 및 세포성 언커플링을 감소시킨다. 항부정맥성 펩타이드의 분자 표적 또는 수용체는 현재 알려져 있지 않다. 그러나, 추정적 수용체 상의 AAP10에 대한 결합부위의 구조는 R. Grover 및 S. Dhein에 의해 가설이 세워진 바 있다 (Peptides 2001, 22 1011-1021). 본 발명에서 유용한 펩타이드는 AAP10과 같은 항부정맥성 펩타이드에 대한 수용체의 아고니스트이고, 펩타이드와 수용체 간의 상호작용의 생리적 효과에 의해 GJIC의 매개 또는 약효 증강 또는 간극 결합을 경유해서 세포성 커플링이 증가되는 것으로 추정되고 있다. 그러나, 간극 결합 기능을 조절할 수 있는 이론적인 시그널링 경로는 훨씬 더 많기 때문에, 본 발명자들은 GJIC 모듈레이션의 생물학적 작용의 배후를 특정 이론에 한정시키고자 할 의사는 전혀 없다.

일반적으로, 본 발명은 과도한 양의, 반응성 산소 종류 및/또는 자유 래디칼 및/또는 일산화질소에 의해 일어나는 질병 및 조직 장애의 치료방법을 제공한다.그 한가지 예는 자유 래디칼이 글루타치온의 고갈을 초래함으로 해서 종국적으로 간극 결합의 감소, 또는 간극 결합 커뮤니케이션의 언커플링을 초래하는, 당뇨성 신경 장애 및 상처이다. 저산소 공급 및/또는 높은 자유 래디칼 농도는 괴사조직의 상처, 당뇨병, 동맥경화증, 수술외상, 부종, 감염, 화상 및 정맥부전에서 현저하며, 간극 결합 커뮤니케이션을 저하시킨다. 자유 래디칼은 신경 말단의 파괴, 전도율 감소, 수초탈락 및 염증성 응답의 증가에 있어서 중요하다. 소음에 의해 유도된 청각 상실, 노인성난청은 자유 래디칼의 발생과 관련이 있는 것으로 알려져 있으며 간극 결합 커플링의 저해와 연관이 있다. 자유 래디칼 과다는 또한 상피세포의 복구 및 혈관형성시 모세관의 발생을 저하시킬 수도 있다.

예컨대, 그리고 본 발명의 한가지 구체예에서, 기도 염증의 치료 또는 예방법이 제공된다. 바람직한 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 간극 결합 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 적어도 한가지 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명에 따라, 방광 실금의 치료 또는 예방법도 제공된다. 한가지 구체예에서, 이 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 간극 결합 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 적어도 한가지 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 달팽이관 질환으로 인한 난청의 치료 또는 예방법도 제공한다. 예컨대, 한가지 구체예에서, 이 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 간극 결합 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 적어도 한가지 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

특히, 본 발명은 질병, 바람직하게는 비증식성 질환, 예컨대 기도 상피의 염증, 폐포 조직의 장애, 외상, 발기부전, 방광 뇨실금, 달팽이관 질환에 의한 난청, 상피 병변, 당뇨성 망망증 및 당뇨성 신경 장애, 신경증 통증, 중추신경계의 허혈, 척수 손상, 치주질환을 비롯한 치아 조직 질환, 신장 질환, 아만성 및 만성 염증, 암 및 골수 이식 실패와 줄기세포 이식 실패를 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물을 제조하기 위해, 간극 결합 세포간 커뮤니케이션과 같은 세포성 커뮤니케이션을 촉진시켜주는 화합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 생체외 및/또는 생체내에서 개선된 안정성을 갖는 선형 또는 고리형 구조의 신규한 항부정맥성 펩타이드를 비롯한 신규한 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 조성물, 및 의약을 제조하는데 있어서의 상기 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포간 간극 결합 커뮤니케이션이 손상됨을 특징으로 하는 일련의 질병을 치료하기 위한 의약을 제조하는데 있어서의, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시켜주는 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 방광 실금, 폐포 조직 및 기관지 조직과 관련된 질환, 달팽이관 질환으로 인한 난청, 상피세포 병변, 당뇨성 망막증 및 당뇨성 신경장애, 중추신경계와 척수의 허혈, 치주질환을 비롯한 치아 조직 질환, 고혈압으로 이어지는 사구체근접 장치로부터의 분비저하와 같은 신장 질환을 비롯한 여러 질환의 치료방법, 및 골수이식 실패를 방지하기 위한 방법에 관한 것이기도 하다.

본 발명에서 유용한 펩타이드에는 다음 일반식을 갖는 화합물, 식 I의 거울상, 또는 레트로 유사체, 또는 약학적으로 허용가능한 염, 알킬, 아릴, 아르알킬, 에스테르, 아미드, 일 또는 이치환 아미드 (여기서 치환기는 알킬, 아릴, 또느 ㄴ아르알킬임), 히드라지드 또는 알코올이 포함된다:

식 중, 점선은 식 I이 임의로 고리형 일 수 있음을 나타내고, 식에 나타난 결합들은 공유결합이며; A는 A를 X와 B에 연결시켜주는 펩타이드 결합의 일부를 형성하는 아미노기 (래디칼)와 카르복시기 (래디칼)을 갖는 화학적 부분 (chemical moiety)을 나타내고; B는 B를 A와 Y에 연결시켜주는 펩타이드 결합의 일부를 형성하는 아미노기 (래디칼)와 카르복시기 (래디칼)을 갖는 화학적 부분을 나타내며; X는, Y가 독립적으로 L- 또는 D-형일 수 있는 2 내지 5개의 아미노산 잔기로 된 C-말단 펩타이드 서열을 나타낼 경우 독립적으로 L 또는 D형일 수 있는 1 내지 3개의 아미노산 잔기로 된 펩타이드 서열을 나타낸다; 또는 X는, Y가 독립적으로 L- 또는 D-형일 수 있는 2 내지 5개의 아미노산 잔기로 된 C-말단 펩타이드 서열을 나타낼 경우 그룹 A-B의 N-말단 변형을 나타내거나; 또는 X는, Y가 독립적으로 L- 또는 D-형일 수 있는 1 내지 3개의 아미노산 잔기로 된 C-말단 펩타이드 서열을 나타낼 경우 독립적으로 L- 또는 D-형일 수 있는 2 내지 5개의 아미노산 잔기로 된 펩타이드 서열을 나타낸다; 식 I이 선형 펩타이드인 경우 X는 그의 N-말단에서 임의로 화학적으로 변형되고, L은 0 내지 9개의 골격 (backbone) 원자를 포함하는 임의의 연결기이다;

단, 다음 화합물:

은 상기 일반식의 화합물로부터 배제된다. 공유결합은 펩타이드 결합, 이설파이드 결합, 에스테르 결합, 환원 아미드 결합, 알콕시 결합, 옥시카르보닐 결합 및 아실옥시알콕시 결합 중에서 선택되는 것이 바람직하다. A와 B의 예로는 다음 식 Z를 들 수 있다.

식 중, n은 3, 4, 또는 5의 정수이고, R은 광학적 치환기, 바람직하게는 할로겐, 페닐, 히드록시, NH₂및 C(1-6)알킬 중에서 선택된 기이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 A와 B는 각각 아미노 및 카르복실 관능기를 갖는 아미노산 또는 아미노산 유도체를 나타낸다. A와 B의 또 다른 예로는 다음 식 Za를 들 수 있다.

식 중, n은 0, 1, 2 또는 3의 정수이고, p는 0, 1, 2 또는 3의 정수이며, Z는 O 또는 S를 나타내고, R은 광학 치환기, 바람직하게는, 할로겐, 페닐, 히드록시, NH₂, 및 C(1-6)알킬 중에서 선택된 기를 나타낸다. 본 발명의 혜시적인 화합물에서 식 Za로 나타내지는 A 또는 B는

및 그의 염이다.

A 및 B의 예로는 다음 화합물의 N- 및 C(O)-래디칼을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다:

D/L-아제티딘-3-카르복실산,

D/L아제티딘-2-카르복실산,

D/L-인돌린-2-카르복실산,

D/L-1,3-디히드로-이소인돌-1-카르복실산,

D/L-티아졸리딘-4-카르복실산,

D/L-피페콜린산,

D/L-니페코틴산,

이소니페코틴산,

L/D-2-카르복시모르폴린,

L/D-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린-3-카르복실산,

L/D-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린-3-카르복실산, 및

4-카르복실-4-페닐-페피리딘.

바람직하게는, A와 B의 화학적 부분이 각각 N 및 S와 같은 이종원자를 하나 이상 갖는 4, 5 또는 6원 포화 카르복실 구조를 갖는 아미노산 잔기를 나타내는 것이 좋다. 상기 아미노산에는 L 및 D형, 천연 및 비천연 아미노산 및 그의 유도체, 예컨대 3, 4, 또는 5 위치에 하나 이상의 치환기 (여기서 치환기는 히드록시, 아미노 또는 페닐 중에서 선택됨)를 갖는 프롤린 (Prolin) 잔기; 및 사르코신 (Sarcosin), N-시클로헥실글리신 및 N-페닐글리신과 같은 N-치환 아미노산이 포함된다. 바람직하게는 서열 A-B가 Sar-Sar, Sar-Hyp, Hyp-Sar, Pro-Sar, Sar-Pro, Pro-Hyp, Pro-Pro, Hyp-Pro, 및 Hyp-Hyp 중에서 선택된 디펩타이드인 것이 좋고, 상기 중, Pro와 Hyp는 독립적으로 L 또는 D형일 수 있고, Pro와 Hyp의 고리 구조는 임의로 할로겐, 니트로, 메틸, 아미노, 또는 페닐로 치환될 수 있으며, Hyp는 3-히드록시프롤린 또는 4-히드록시프롤린을 나타내거나, 또는 아미노산 잔기 A-B 중 하나 또는 두가지 모두가 Sar이거나 또는 N-시클로헥실글리신 잔기이다.

상기한 일반식은 선형 펩타이드로서, 그것의 X의 N-말단의 상기한 화학적 변형이 임의로 치환된 C(1-22)알킬 칼복실산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 부티르산 및 다른 지방산 또는 임의로 치환된 C(2-22)알케닐 카르복시산, 또는 아릴 카르복실산, 예컨대 벤조산 (여기서 치환기는 히드록시, 할로겐, C(1-6)알킬, 니트로 또는 시아노 중에서 선택되며 탄소 사슬 또는 방향족 부분 상에 위치할 수 있음)에 의한 아실화이거나; 또는 화학적 변형이 임의로 치환된 C(1-22)알킬, C(2-22)알케닐, 또는 아릴 C(1-22)알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 페닐프로필, 2-히드록시페닐프로필 및 4-히드록시페닐프로필 (여기서 치환기는 히드록시, 할로겐, C(1-6)알킬, 니트로 또는 시아노 중에서 선택되고 탄소 사슬 또는 방향족 부분 상에 위치할 수 있음)에 의한 알킬화인 선형 펩타이드일 수 있다. 더욱 바람직하게는, Y가 상기한 바와 같이 2 내지 5개의 아미노산 잔기로 된 C-말단 펩타이드 서열인 경우, X는 C(1-4)카르복실산, 바람직하게는 아세트산에 의해 임의로 아실화된 L-Tyr과 D-Tyr 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 또한 X가 그룹 A-B의 N-말단 변형을 나타내는 것도 바람직한데, 여기서 상기 변형은 4HPP 및 2HPP와 같은 페닐프로피온산 및 그의 유도체; 4HPA, 3HPA 및 2HPA와 같은 페닐아세트산 및 그의 유도체; 4HPPA, 2HPPA 및 4HMPA와 같은 페녹시아세트산 및 그의 유도체; 4HBG, 3HBG 및 2HBG와 같은 벤조일글리신 및 그의 유도체; 및 아미드 결합을 통해 A에 결합된 페닐글리신 및 그의 유도체 중에서 선택되는 것이 바람직하다.

A-B는 또한 Pro-Hyp, Pro-Pro, Hyp-Pro, 및 Hyp-Hyp 중에서 선택되는 것이더욱 바람직하며 여기서 Pro와 Hyp는 독립적으로 L 또는 D형일 수 있고 Hyp는 바람직하게는 4HYp인 것이 좋다. 바람직하게는, Y가 3 내지 5개의 아미노산 잔기 또는 3 또는 4개의 아미노산 잔기로 된 펩타이드로서, 독립적으로 L- 또는 D-형이고, 바람직하게는 그의 C-말단에 Sar 또는 Gly를 갖는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 Y가 다음 중에서 선택되는 것이 좋다.

Gly-L-Ala-Gly-OH,

Gly-L-Ala-Gly-NH₂,

Gly-D-Ala-Gly-OH,

Gly-D-Ala-Gly-NH₂및

Sar-Aib-Sar-OH/NH₂

식 중 X는 단일 아미노산임.

식 I의 선형 화합물의 예로는:

및 그의 거울상 이미지, 레트로 유사체 및 약학적으로 허용되는 그의 염; 그의 알킬, 아릴 및 알킬 에스테르; 치환기가 알킬, 아릴 및 아르알킬 중에서 선택되는 일치환 및 이치환 아미드; 히드라지드; 및 알코올 중에서 선택되는 그의 유도체를 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 식 I은 A-B가 Sar-Sar, Sar-Hyp, Hyp-Sar, Pro-Sar, Sar-Pro, Pro-Hyp, Pro-Pro, Hyp-Pro, 및 Hyp-Hyp 중에서 선택되고 Pro와 Hyp는 각각 L 또는 D 형이며 Hyp는 바람직하게는 4-히드록시프롤린인 시클릭 펩타이드를 나타낸다. 더욱 바람직하게는, A-B가 치환되지 않은 L-Pro-L-4Hyp, L-4Hyp-L-Pro, D-Pro-D-4Hyp, 또는 D-4Hyp-D-Pro인 것이 좋다.

Y가 독립적으로 L- 또는 D-형의 3 또는 4개의 아미노산 잔기로 된 펩타이드로서, 바람직하게는 Asp 또는 Glu를 그의 C-말단에 갖고, 더욱 바람직하게는 Y가다음, 즉

중에서 선택된 펩타이드 서열을 나타낼 경우, X는 바람직하게는 L-Tyr 또는 D-Tyr와 같은 단일 아미노산 잔기로서 임의로 할로겐, 페닐, 히드록시, NH₂및 할로겐으로 임의 치환된 C(1-6)알킬에 의해 그의 방향족 고리에서 추가 치환될 수 있고,

또는, Y가 단일 아미노산 잔기, 바람직하게는 임의로 Cl과 같은 할로겐에 의해 그의 방향족 고리에서 추가 치환된 아미노산 잔기를 나타낼 경우, X는 바람직하게는 다음, 즉

중에서 선택된 펩타이드 서열을 나타낸다.

식 I은 모두 L-형, 모두 D-형 또는 L-형과 D-형의 아미노산 잔기가 혼합된 서열을 포함하느 시클릭 펩타이드 서열을 나타낼 수 있다. 도 1은 본 발명의 범위 중에서 서로 다른 일곱가지 시클릭 구조의 일반적인 개략도를 도시한다.

식 I의 시클릭 화합물의 예로는 다음;

및 그의 거울상 이미지, 그의 레트로 유사체, 및 약학적으로 허용되는 염 및 아미드와 같은 그의 유도체를 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서 식 I은 X기와 Y기가 아미노 카르보닐 결합, 알콕시 결합, 에스테르 결합, 환원된 아미드 결합 또는 디설파이드 결합을 통해 연결되어 있는, 시클릭 화합물을 나타낸다. X와 Y가 다음 식

(식 중, R'와 R"은 각각 수소 또는 저급 알킬 및/또는 저급 아릴, 바람직하게는 메틸 및 페닐을 나타냄)

의 링커 L을 갖는 알콕시 결합을 통해 연결되어 있는 화합물의 예로는 다음, 의 화합물:

및 그의 거울상 이미지, 그의 레트로 유사체, 및 약학적으로 허용되는 그의 염 및 아미드와 같은 그의 유도체를 들 수 있다.

X와 Y가 다음 식

의 링커 L을 갖는 아미노 카르보닐 결합을 통해 연결되어 있는 화합물의 예로는 다음의 화합물:

및 그의 거울상 이미지, 그의 레트로 유도체, 및 약학적으로 허용되는 그의 염 및 아미드와 같은 그의 유도체를 들 수 있다.

화합물 X와 Y가 다음 식

(식 중, R'과 R"은 각각 수소 또는 저급 알킬 및/또는 저급 아릴, 바람직하게는 메틸 및 페닐을 나타내고, 바람직하게는 R'≠R"이다)

의 링커 L을 갖는 에스테르 결합을 통해 연결되어 있는 화합물의 예로는 다음의 화합물:

및 그의 거울상 이미지, 그의 레트로 유도체, 및 약학적으로 허용되는 그의염 및 아미드와 같은 그의 유도체를 들 수 있다.

에스테르 결합이 본 발명의 시클릭 화합물의 골격의 일부일경우, L은 히드록시 C(3-6)알킬 카르복실산과 같은 히드록시-카르복실산으로부터 유도될 수 있다. 한가지 구체예에서, L은 바람직하게는 일반식 HO-C-(R1)(R2)-COOH를 갖는 α-히드록시0카르복실산으로부터 유도된다. 상기 식에서 R1과 R2는 독립적으로 H, C(1-6)-알킬, C(2-6)-알케닐, 아릴, 아릴-C(1-4)-알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴-C(1-4)-알킬이고; 또는 R1과 R2는 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 시클로펜틸, 시클로헥실, 또는 시클로헵틸기를 형성하고; 여기서 알킬 또는 알케닐기는 아미노, 시아노, 할로겐, 이소시아노, 이소티오시아노, 티오시아노, 설파밀, C(1-4)-알킬티오, 모노- 또는 디-C(1-4)-알킬-아미노, 히드록시, C(1-4)-알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아릴옥시, 카르복시, C(1-4)-알콕시카르보닐, C(1-4)-알킬카르보닐옥시, 아미노카르보닐, 모노- 또는 디-C(1-4)-알킬-아미노카르보닐, 모노- 또는 디-C(1-4)-알킬-아미노, 모노- 또는 디-C(1-4)-알킬-아미노-C(1-4)-알킬, C(1-4)-알킬카르보닐아미노, 설포노, 및 설피노 중에서 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환될 수 있고; 아릴 또는 헤테로아릴기는 C(1-4)-알킬, C(2-4)-알케닐, 니트로, 아미노, 시아노, 할로겐, 이소시아노, 이소티오시아노, 티오시아노, 설파밀, C(1-4)-알킬티오, 모노- 또는 디-C(1-4)-알킬-아미노, 히드록시, C(1-4)-알콕시, 아릴옥시, 카르복시, C(1-4)-알콕시카르보닐, C(1-4)-알킬카르보닐옥시, 아미노카르보닐, 모노- 또는 디-C(1-4)-알킬아미노카르보닐, 모노- 또는 디-C(1-4)-알킬-아미노, 모노- 또는 디-C(1-4)-알킬-아미노-C(1-4)-알킬, C(1-4)-알킬카르보닐아미노, 설포노 및 설피노 중에서 선택된 1 내지 3개의 치환기로 치환될 수 있다. 또 다른 구체예에서, L은 히드록시 아릴-C(3-6)-알킬-카르복실산으로부터 유래하거나, 또는 L은 히드록시 C(2-6)알케닐-카르복실산으로부터 유래하거나, 또는 L은 히드록시 C(3-6)알킬 카르복실산으로부터 유래된다. R1과 R2가 서로 다른 기를 나타내는 것이 바람직하다.

고리화가 에스테르 결합으로서 형성되고 아미노산 잔기의 수가 5개인 본 발명의 시클릭 화합물에서, A-B기는 Sar-Hyp, Hyp-Sar, Pro-Hyp, Pro-Pro, Hyp-Pro 및 Hyp-Hyp 중에서 선택되고, 여기서 Pro와 Hyp는 독립적으로 L 또는 D형일수 있고, Hyp는 바람직하게는 4-히드록시프롤린을 나타낸다. 더욱 바람직하게는 A-B가 치환되지 않은 L-Pro-L-4Hyp, L-4Hyp-L-Pro, D-Pro-D-4Hyp, 또는 D-4Hyp-D-Pro를 나타내는 것이 좋다.

본 발명의 화합물의 예로는

시클로-(O-(CH₂)₅C(O)-Tyr-Pro-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) 및

시클로-(O-(CH₂)₅C(O)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly) (L이 히드록시 C(3-6)알킬 카르복실산일 때), 및

시클로-(O-(4-히드록시메틸벤조일)C(O)-Tyr-Pro-4-Hyp-Gly-Ala-Gly) 및

시클로-(O-(4-히드록시메틸벤조일)C(O)-Tyr-4-Hyp-Pro-Gly-Ala-Gly) (L이 히드록시아릴-C(1-4)알킬 카르복실산일 때),

세린 (Serine)에 의해 고리화가 달성된 본 발명의 시클릭 화합물은 다음과 같고:

쓰레오닌 (Threonine)에 의해 고리화가 달성된 본 발명의 시클릭 화합물은 다음과 같다:

디설파이드 결합을 갖는 본 발명의 시클릭 화합물의 예로는 L 및 D 아미노산, Sar에 의해 치환된 아미노산 및 기타의 N-치환된 천연 아미노산을 비롯하여 다음 화합물:

및 이들 각각의 거울상 이미지, 이들의 레트로 유사체 및, 이들의 약학적으로 허용되는 염 및 아미드와 같은 유도체를 들 수 있다.X와 Y가 다음 식

의 링커 L을 갖는 환원된 아미드 결합에 의해 연결되어 있는 화합물의 예로는:

및 그의 거울상 이미지, 그의 레트로 유사체 및 약학적으로 허용되는 염 및 아미드와 같은 그의 유도체를 들 수 있다.

X와 Y가 다음 식

의 링커 L을 갖는 환원된 아미드 결합을 통해 연결되어 있는 화합물의 예로는:

더욱 바람직하게는, 본 발명은 다음 일반식 I을 갖는 펩타이드 및 펩타이드 유도체 및 일반식 I의 펩타이드 서열의 레트로 형태, 모든 D 형, 모든 레트로-D형및 그의 염 및 아미드에 관한 것으로,

아미노산 잔기가 D- 및/또는 L-형이고, N*에 N-말단과 C*에 C-말단을 가지며, 파선에 의해 표시되는 바와 같이 N*과 C*사이에 공유결합을 통해서 또는 파선 U에 의해 표시되는 바와 같이 R_d와 C* 사이의 공유 결합을 통해서 임의로 고리형을 나타내는 펩타이드 서열을 나타내며

상기 식 중, X는 아미노 말단 N*에 결합할 수 있는 포토프로브, 또는, 히드록시, 할로겐, C(1-6)알킬, 니트로 및 시아노 중에서 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있는, 아세트산, 프로피온산, 부티르산 및 기타 지방산, 예컨대 베헨산과 같은 C(2-22)알킬 카르복실산으로부터 유도된 아실기와 같은 N-말단 부분을 나타내거나; 또는 X는 수소를 나타내고;

R_a은 Hyp 또는 Pro의 아미노산 측쇄를 나타내고;

R_b는 Hyp 또는 Pro의 아미노산 측쇄를 나타내며,

R_c는 R_c의 방향족 고리 중의 하나 이상의 히드록시, 할로겐 또는 저급 알콕시기로 임의로 치환된 방향족 아미노산 측쇄, Gly, Sar의 아미노산 측쇄를 나타내며,

R_d는 Ala, Gly, Glu, Asp, Dab, Dapa, Lys, Asn, Gln, Orn 또는 Cys의 아미노산 측쇄를 나타내고;

R_e는 Ala의 아미노산 측쇄를 나타내고;

R_f는 Ala, Sar, 또는 Gly의 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_g는 식 Z 또는 Za의 일부 또는 L-4Hyp의 측쇄를 제외한 모든 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_h는 Ala의 아미노산 측쇄를 나타내거나, 또는 R_h는 식 Z 또는 Za의 일부, 바람직하게는 Pro를 나타내며;

R_i는 Gly의 아미노산 측쇄를 나타내거나, 또는 R_i는 바람직하게는 Tyr, Phe, Trp 또는 Nal과 같이, 방향족 고리 중에 하나 이상의 할로겐기가 임의 치환된 방향족 아미노산을 나타내고;

R_j는 Asn, Gln, Asp, Glu, Cys, 또는 Tyr을 나타내며;

각각의 j, k, l, m, n, p 및 q는 독립적으로 0 또는 1임.

바람직한 식 I의 구체예에서 X는 바람직하게는 2-히드록시-4-아지도-5-요오도 벤조일 및 AB 및 아실기 예컨대 Ac와 같이, 5 위치에 임의로 요오드화된 ASAL과 같은 포토 프로브로 구성된 기 중에서 선택되는 것이 좋다. R₇은 NH₂인 것이 좋다. R_a는 바람직하게는 Pro의 아미노산 측쇄인 것이 좋다. R_b는 바람직하게는 Hyp의 아미노산 측쇄인 것이 좋다. R_c는 바람직하게는 Gly 또는 Tyr의 바람직한 측쇄인 것이 좋다. R_d는 바람직하게는 Gly, Asp, Glu, Dapa, 또는 Dab와 같은 아미노산 측쇄인 것이 좋다. R_e는 바람직하게는 Ala인 것이 좋다. R_f는 바람직하게는 Gly 또는 Ala의 아미노산 측쇄인 것이 좋다. 식 I이 선형 펩타이드인 경우 R_g는 바람직하게는 Asn, Gly, D-4Hyp 또는 L-/D-Pro를 나타내는 것이 바람직하고, 식 I이 N*와 C* 사이에 고리화된 펩타이드를 나타낼 경우에는 R_g는 L-D-4Hyp 또는 L-D-Pro인 것이 좋다. U가 생략되어 있을 경우, R_h는 바람직하게는 Ala의 아민노산 측쇄이거나 또는 R_h는 U가 존재하면 Pro 또는 Hyp이다. R_i는 바람직하게는 하나 이상의 히드록시 또는 할로겐기, 바람직하게는 방향족 고리 중에서 F 또는 Cl로 임의치환될 수 있는 Tyr, Phe, Trp, Nal인 것이 좋다. R_j는 Asp 또는 Glu의 아미노산 측쇄인 것이 바람직하다. R₈은 H, 벤질, 3차-부틸 또는 CH₃을 나타낸다.

U가 존재할 경우 j 및 k는 0인 것이 바람직하고, U가 부재하고 식 I이 시클릭 펩타이드를 나타낼 경우에는 j와 k는 1인 것이 바람직하며, U가 부재하면 m은 0인 것이 좋고, U가 존재하면 p는 1인 것이 바람직하며, U가 존재하면 q는 바람직하게는 0이다. 식 I의 비-고리형 또는 선형 펩타이드는 레트로 올-D형 (retro all-D form)인 것이 바람직하다. 식 I이 시클릭 펩타이드를 나타낼 경우, 이 펩타이드는 3 내지 9개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 3 내지 7개의 아미노산 잔기로 구성되는 것이 좋다.

당업자들이라면, 단지 펩타이드 결합 중 하나 이상이 디설파이드 결합, 에스테르 결합, 환원된 아미드 결합, 알콕시 결합, 옥시카르보닐 결합 및 아실옥시알콕시 결합 중에서 선택된 공유 결합으로 변경되어 있을 뿐인, 식 I에 필적할만한 구조를 갖는 펩타이드-유사 화합물이 본 발명의 화합물들처럼 동일한 증상과 질환을 치료하는데 효과가 있을 것임을 충분히 이해할 수 있을 것이다.

한가지 바람직한 구체예에서 본 발명은 아미노산 잔기가 L 및/또는 D형일 수 있는 펩타이드 서열을 특정하는, 다음 일반식 II의 화합물:

(II) X-(G')_a-A-G'-(PX)₂-(Y')_b-R₇

(식 중, X는 또는 Ac이고; 모든 아미노산 잔기가 L-형이면 X는 Ac를 나타내고;

G'은 글리신 잔기 또는 Sar과 같은 글리신 유사체이며, G'는 글리신인 것이 바람직하고;

A는 알라닌을 나타내고;

Px는 Hyp 또는 Pro, 바람직하게는 프롤린과 같이, 식 Z 똔느 Za의 아미노산잔기를 나타내며;

Y'은 그의 페닐 고리가 할로겐이나 히드록시로 임의치환될 수 있는 페닐알라닌 또느 sxl로신을 나타내고; Y'은 티로신인 것이 바람직하며;

a와 b는 독립적으로 0 또는 1이고;

R₇은 OH, NH₂, NHNH₂, Asn-NH₂, 또는 Gln-NH₂를 나타냄); 및 일반식 IIa, 즉 X-(Y')_b-(Px)₂-G'-A-(G')_a-R₇을 갖는 그의 레트로 형태 (식 중 모든 아미노산 잔기는 바람직하게는 D-형이고 여기서 모든 기호는 상기 식 II에서 정의한 바와 같음);

및 적어도 하나의 Px 잔기는 D-아미노산이고 나머지는 L-아미노산인 식 II의 펩타이드 화합물;

및 X는 H이고 R₇은 Y에 대해 공유결합을 갖는 Asn 또는 Gln을 표시하고, b는 1, a는 1인 식 II의 시클릭 서열

및 그의 염에 관한 것이다.

식 I의 바람직한 시클릭 펩타이드 화합물은 일반식 III 또는 IV 중 어느 하나 및 그의 염이라는 특징을 갖는다:

식 중, X는 H 또는 히드록시, 할로겐, C(1-6)알킬, 니트로 및 시아노 중어세 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 임의 치환된, 베엔산과 같은 기타 지방산, 아세트산, 프로피온산, 및 부티르산과 같은 C(2-22)알킬 카르복실산에 의해 아실화되거나 또는 N-말단에 결합가능한 포토 프로브와 같은 N-말단 부분이고;

R₁은 H 또는 CH₃, 바람직하게는 H이며;

R₂와 R₃은 서로 다르거나 같고 가능한 모든 아미노산 측쇄, 바람직하게는 H 또는 CH₃을 나타내며;

은 임의의 결합을 나타내고;

R₅와 R₄는 가능한 여하한 아미노산 측쇄를 나타내거나 또는 임의의 결합이 존재할 경우 R₅와 R₄는 그에 결합된 C 및 N 원자와 함께 OH에 의해, 바람직하게는 4-위치에 임의로 치환된 프롤린 고리를 나타내거나, 또는 R₅와 R₄는 그에 결합된 C 및 N 원자와 함께 상기한 식 Z 또는 Za 부분, 바람직하게는 Pro 또는 Hyp를 나타내고;

R₆은 방향족 아미노산 측쇄, 바람직하게는 페닐 고리에 할로겐, 니트로 및 히드록시 중에서 선택된 하나 이상의 치환기가 임의로 치환되어 있는 벤질이고, 바람직하게는 R₆은 Tyr이며;

p는 0 또는 1;

n은 1, 2, 3, 또는 4이고; 바람직하게는 n은 1이다.

식 III의 화합물의 예로는 다음, 즉:

및 그의 염을 들 수 있다.

IV

식 중, R₈은 상기 정의한 바와 같고, 바람직하게는 H이며;

R₆은 H 또는 CH₃, 바람직하게는 H 이며;

R₄와 R₅는 다르거나 같고 가능한 여하한 아미노산 측쇄, 바람직하게는 Gly 또는 Ala이고;

은 임의의 결합을 나타내며;

R₂와 R₃은 가능한 여하한 아미노산 측쇄를 나타내거나, 또는 임의의 결합이 존재할 경우 R₂와 R₃은 그에 결합되어 있는 C 및 N 원자와 함께 바람직하게는 4-위치에 OH가 임의로 치환되어 있는 프롤린 고리를 나타내거나 또는 R2와 R3은 식 Z또는 Za의 부분을 나타내고;

R₁은 방향족 아미노산 측쇄, 바람직하게는 Tyr 측쇄를 나타내며;

p는 0 또는 1;

n은 1, 2, 3 또는 4; 바람직하게는 n은 1이다.

식 IV의 화합물의 예로는 다음을 들 수 있다:

또한, 놀랍게도, AAP10에서 Hyp-Pro 서열을 아스파라긴이나 글루타민 잔기로 대체시키면 후술하는 신규한 항부정맥 펩타이드인 실시예 21의 화합물 21이 얻어지는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 바람직한 한가지 구체예는 아미노산 잔기가 D- 및/또는 L-형일 수 있고, 다음 일반식 V로 표시되는 펩타이드 화합물, 및 그의 레트로 유사체, 레트로 올-D 유사체 (레트로-인버스 유사체) 및 그의 염에 관한 것이다:

식 중, R₁은 펩타이드의 N 및 C 말단 사이의 임의의 아미드 결합, H 또는 Ac이고;

Aa₁은 0 내지 4개의 아미노산 잔기로 된 펩타이드 서열로서, Aa₁이 1 내지 4개의 아미노산 잔기로 된 펩타이드 서열일 경우에는, Aa₁은 바람직하게는 Ala Gly-Ala, Gly-Asn-Tyr, 및 Gly-Asn-Tyr-Ala 중에서 선택되고;

Al은 Gly, 베타 알라닌 및 Sar 중에서 선택된 아미노산 잔기이며;

Aa₂는 Asn, Gln, Gly, Tyr 또는 화학 단위, 예컨대 히드록시산, 아미노 설폰산, 포스페이트기 또는 G와 Ar을 4개의 공유 결합을 통해 연결해주는 탄화수소 사슬 중에서 선택되는 아미노산 잔기이며;

Ar은 하나 이상의 할로겐, 예컨대 F, Cl, Br, I, OH, NO2, NH2, COOH, CONH로 임의 치환된 Tyr, Trp, Phe, His, 또는 Nal과 같은 방향족 아미노산 잔기이며;

R₂는 OH, NH₂를 나타내거나 또는 부재한다.

식 V의 화합물의 예로는 다음, 즉:

및 본문에 정의된 바와 같은 그의 염을 들 수 있다.

빛/열에 불안정한 펩타이드 유도체

친화성 라벨링 (affinity labeling)은 생물학적 활성 분자들의 상호반응을 연구하는데 흔히 이용되는 기술이다. 이러한 조사에는 그 화합물의 빛 또는 열에 불안정한 유사체가 사용된다.

암실에서 안정한, 연구하고자 하는 화합물의 광불안정성 유사체를, 광조사에 의해, 삽입 반응에 참여할 수 있는 반응성 중간체로 전환시킨다. 공유 결합의 형성에 의해 이것은 생물학적 친화성에 기초한 상호반응을 안정화시킨다. 포토 프로브로서 방향족 아자이드와 안정화된 디아조 화합물은 광분해에 의해, 삽입 반응에 참여할 수 있는 매우 반응성이 높고 비특이적인 중간체들인 니트렌 (nitrenes)과 카르벤 (carbenes)을 각각 생산한다. 따라서, 포토 프로브로서 아릴 아자이드와 안정화된 디아조 화합물을 이용하는 광 친화성 라벨링은 탄소-수소 결합을 함유하는 모든 결합 부위에 대해 수행할 수 있으며 굳이 결합 부위에 특정한 반응성 관능기가존재할 것을 요구하지 않는다. 따라서 라벨링의 특이성은 결합 부위의 라벨링을 보장해주는 반응을 형성하는 비특이적 공유결합을 수반하는, 리간드 대 수용체의 특이적 결합에만 의존한다. 광친화성 프로브는 반응성 관능기가 존재하지 않을 수 있는, 그러나, 탄소-수소 결합만큼은 확실히 함유하는 라벨링 호르몬 수용체 부위에 대해 특히 유용하다. 광활성 관능기로서 아지도, 디아지리노, α-디아조 케톤, 티아- 및 셀레노디아졸, 벤조페논, 니트로페닐이 특히 유용하다. 아릴 아자이드를 이용하는 라벨링 공정은 λ_ex=300-320nm에서 약 0.5-2 시간동안 실온에서, 광불안정성 펩타이드 유사체와 수용체를 함유하는 수용액을 광분해시키는 것을 포함한다.

열 불안정성 화합물은 아미노기나 머캅토기에 대해 열적으로 제어된 반에서 특이적으로 공유결합을 형성할 수 있는 반응성기를 함유한다. 열 프로브로는 지방족 할라이드, 특히 요오드와 브롬, 활성 에스테르, 예컨대 N-히드록시석신이미드, 산 클로라이드, 피리딜디설파이드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 카르보디이미드 및 말레이미도가 사용될 수 있다.

생체외 적용을 위한 라벨로는 방사성 동위원소가 가장 많이 선택되는데 그 예로는 요오드-125 및 131, C-14 및 삼중수소 (tritium) 또는 형광성 프로브 또는 바이오틴이나 합텐을 들 수 있다. 수용체 친화성이 유지되는지를 확실히 하기 위해서는, 리간드의 결합 활성에 미치는 라벨의 영향을 조사할 필요가 있다. 방사성 라벨로서 요오드-125가 생체외 적용시 흔히 사용되는데, 이는 이것이 60일의 반감기를 가지며 저에너지 포톤 방출을 하기 때문이다. 반감기가 길면 라벨링된 광활성유사체 및 결과적인 라벨링된 단백질 산물을 제조하여, 사용 또는 분석하기 전 오랫동안 보관할 수 있다.펩타이드에 요오드 (I-125)를 인코포레이션시키는 것은 예컨대 티로신이나 히스티딘이 그 펩타이드 서열중에 존재하면 쉽게 수행할 수 있다. 생물학적 활성이 유지되도록 하기 위해, 리간드의 생물학적 활성에 미치는 펩타이드 라벨링의 영향을 조사할 필요가 있다. Dhein 등 (WO96/21674)은 Tyr 잔기의 페닐 고리가 요오드-125 치환기를 갖는 AAP10 유도체가 생물학적 활성을 갖는다는 것을 보인바 있다. 그러나, 상기 AAP10 변형체를 친화성 프로브로써 사용할 수는 없는데, 이는 이것이 가능한 리간드나 수용체로 가역적으로 결합할 수 있기 때문이다. 아릴 아자이드를 이용한 광친화성 라벨링은 대개, 표적 단백질 (수용체)에 비-가역적으로 부착된 50-60%의 펩타이드 리간드를 결과시킨다. 따라서, 본 발명의 한가지 목적은 포토 프로브나 열 프로브에 알맞게 변형된 항부정맥성 펩타이드 및 임의로 항부정맥성 펩타이드의 가능한 리간드나 수용체의 동정을 위한 분석에 사용될 수 있는 방사성 라벨을 제공하는 데 있다. 상기한 목적은 상기한 포토 프로브들 중 하나, 바람직하게는 4-아지도살리실로일 (ASAL) 및 AB(4-아지도벤조일)에 의해 유도화된 본 발명의 식 I, II 또는 9의 화합물을 이용함으로써 달성된다. 바람직하게는, 상기 유도된 화합물들은 요오드-125와 같은 방사성 라벨에 의해 추가로 치환시키는 것이 좋다:

포토 프로브에 의해 변형되어 방사능 라벨링된 식 I, 또는 9의 화합물의 예로는 다음, 즉;

및 그의 염, 예컨대 후술하는 합성 실시예 31-34의 화합물을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 다음 일반식의 화합물들 중에서 선택된 펩타이드 화합물 및 그의 염에 관한 것이다:

2: H-GAG-(Pa)₂-NH2, 여기서 Pa는 여하한 아미노산 잔기이거나 또는 식 Z 또는 Za의 부분이고; Pa 중 적어도 하나는 D 아미노산이며; 바람직하게는 Pa는 Hyp, P, G 또는 A임;

3: H-GAG-(Px)₂-Y-NH2, 여기서 Px는 식 Z 또는 Za의 부분이고, 여기서 Px 중 하나는 식 II, IIa의 부분이며, 다른 Px는 P 또는 Hyp임;

4: Ac-Y'-(Px)₂-GAG-OH, 여기서 Y'는 Y 또는 F이고, Px는 P 또는 Hyp임;

5: Cys(Acm)-AAp10*-Cys(Acm) 또는 Cys(Acm)-레트로 AAP10*-Cys(Acm), 여기서 Acm은 아세트아미도메틸 래디칼이고 AAP10*은 AAP10 서열 또는 그의 트렁케이트 형태임;

6: X-d-Y-(D-Px)₂-G-D-A-G-NH₂또는 그의 레트로 형태인 X-G-D-A-G-(D-Px)₂-D-Y-NH₂또는 X-G-D-A-G-(D-Px)₂-D-Y-D-(Asn)-NH₂, 여기서 X는 H 또는 Ac이며; Px는 식 Z 또는 Za의 부분이고, 바람직하게는 Hyp 또는 P이며; (Asn)은 임의의 기이고,여기서 두가지 식 모두 임의로 하나 이상의 C 또는 N 동위원소를 갖는다;

7: H-(Px)_n-Y(N/Q)G-AG-(Px)_m-NH₂여기서 Px는 P 또는 Hyp이고, n은 1 또는 2이며, m은 0 또는 1, 바람직하게는 n=2일때 m=0이고, n=1이면 m=1이다;

8: H-G'-A-G'-(Px)₂-Y-NH₂, 여기서 G'은 Sar 또는 Gly이고 적어도 하나의 G'은 Sar이며, Px는 P 또는 Hyp임;

9: X-(Y)_p-(Px)₂-GAG-NH₂, 여기서 X는 ASAL 또는 AB이고, p는 0 또는 1, Y의 페닐고리는 임의로 하나 이상의 할로겐 치환기, 바람직하게는 I로 치환되고, Px는 P 또는 Hyp임;

10: 시클로 (-GAG-(Px)₂-Y-N/Q-),여기서 Px는 P 또는 Hyp임;

11: 시클로 (-Y-(Px)₂-GA-(G)_q-N/Q-), 여기서 q는 0 또는 1이고, Y의 페닐 고리는 임의로 하나 이상의 할로겐 치환기, 바람직하게는 I로 치환되고, Px는 P 또는 Hyp임;

12: X-Zd-G(N/Q)Y-NH₂, 여기서 Zd는 G 또는 A 중에서 선택된 0, 1, 또는 2개의 아미노산 잔기로 된 서열이고, X는 H 또는 Ac임;

본 발명에 따른 추가의 화합물들로는 다음 일반식 VI을 갖는 화합물과 그의 염을 들 수 있다:

R1: H, Ac, HAA, THAA (티오히드록시아세트산), Tfa, 아로일, 아세틸

R2: H

R3: G, A, N, K, C의 측쇄로서 여하한 아미노산

R4: OH, NO₂, 할로겐 (F, Cl, Br, I) NH₂또는 H

R5: (4-히드록시페닐 또는 4-니트로페닐 또는 4-프루오로페닐 또는 4-클로로페닐 또는 4-브로모페닐 또는 4-요요도페닐 또는 4-아미노페닐 또는 4-알콕시페닐 또는 H

R6: OH, NO₂, 할로겐 (F, Cl, B가 I) NH₂또는 H

R7: OH, NO₂, 할로겐 (F, Cl, B가 I) NH₂또는 H

s: 0 또는 1

t: 0 또는 1

본 발명의 방법에 유용한 또 다른 바람직한 화합물들은 일반식 VII로 표시되는 화합물들 및 그의 염이다:

R1은 H 또는 아세틸 (Ac)를 나타낸다

R2는 여하한 아미노산 G, Y, D-Y, F 및 D-F 중 어느 하나의 측쇄를 나타낸다.

R3은 O 또는 H를 나타낸다

R4는 여하한 아미노산 측쇄를 나타낸다.

R5는 O 또는 H를 나타낸다.

R6는 C(1-4)알킬기, 예컨대, CH₂, (CH₂)₂, (CH₂)₃, 및 (CH₂)₄를 나타낸다.

R7은 O 또는 H를 나타낸다.

R8은 O 또는 H를 나타낸다.

R9는 여하한 아미노산 G, Y, D-Y, F 및 D-F 중 어느 하나의 측쇄를 나타낸다.

R10은 OH 또는 NH2를 나타낸다.

S, T, U, V 및 Z는 다음에 정의된 정수를 나타낸다:

S: 0, 1 또는 2

T: 0, 1 또는 2

U: 0 또는 1

V: 0 또는 1

Z: 0 또는 1.

더욱 구체적으로, 본 발명에 유용한 화합물은 다음 식 VIII을 갖는 화합물 또는 그의 염이다:

R1-X1-X2-X3-R2

(VIII)

식 중,

X1은 0, Ala, Gly, β-Ala, Tyr, D-Tyr, Asp, HAA

X2는 0; Ala-Gly-T4c-Pro; Ala-Sar-Hyp-Pro; Ala-6원 고리-; Ala-Asn; D-Asn-D-Ala; D-Asn; yAbu; Gly, Ala; D-Ala; β-Ala; Pamh; Asn; 또는 HAA;

X3은 Tyr; D-Tyr; Gly, Pamb, 또는 Phe; 이고

R1은 H 또는 Ac이며, 단, X1과 X2는 두가지 모두 0은 아님.

특정 구체예에서, 상기 식 VII 또는 VIII로 표시되는 특정 화합물이 다음 표 1에 제시된다.

아래 식의 화합물 Gly-Ala-6원 고리-Tyr과 그의 염도 개시된다:

염

본 발명의 화합물들은 약학적으로 허용가능한 염으로서 사용되는 것이 바람직하며, 예컨대 선형 화합물의 C-말단 카르복실산 관능기, 또는 존재할 경우 시클릭 화합물의 유리 카르복실산 관능기를 갖는, 알킬 에스테르, 아미드, 알킬아미드, 디알킬아미드 또는 히드라지드 형태로 사용되는 것이 바람직하다. 선형 화합물의 저급 알킬 아미드 및 아미드는 그 중에서도 본 발명의 바람직한 화합물이다. 염에는 산부가염 및 염기성 염과 같은 약학적으로 허용되는 염이 포함된다. 산부가염의 예로는 히드로클로라이드염, 소듐염, 칼슘염, 포타슘염, 등을 들 수 있다. 염기성 염의 예로는 그 양이온이 소듐 및 포타슘과 같은 알칼리 금속, 칼슘과 같은 알칼리토금속, 및 암모늄 이온⁺N(R³)₃(R⁴) (여기서 R³과 R⁴는 독립적으로 임의 치환된 C_1-6알킬, 임의로 치환된 C_2-6알케닐, 임의 치환된 아릴 또는 임의 치환된 헤테로 아릴 중에서 선택됨) 중에서 선택되는 염을 들 수 있다. 약학적으로 허용되는 염의 다른 예로는 예컨대 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed), Mark Publishing Company, Easto, PA, U.S.A. 1985) 및 그의 최신판, 그리고 약학기술 백과사전 (Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)에 기재된 것들을 들 수 있다.

정의

본 발명의 상세한 설명과 청구범위에서는 천연 아미노산의 3문자 코드와 일반적으로 사용되고 있는 다른 α-아미노산의 3문자 코드, 예컨대 사르코신 (Sar), α-아미노-이소-부타논산 (Aib), 1-나프틸알라닌 (1Nal) 및 2-나프틸알라닌 (2Nal)를 비롯한 나프틸알라닌 (Nal), 페닐글리신 Phg, 2,4-디아미노부타논산 (Dab), 2,3-디아미노프로파논산 (Dapa) 및 히드록시프롤린 (Hyp)이 사용된다. 달리 표시되지 않는 한 Hyp는 4-히드록시프롤린을 나타낸다. 천연 또는 필수 아미노산은 단백질의 아미노산 구성원이다. 방향족 아미노산은 Phe, Tyr, Trp, 1Nal, 2Nal 및 His이다. L 또는 D 형이 특정되지 않을 경우 그 아미노산은 천연의 L형인 것으로 본다. Pure & Appl. Chem. Vol. 56(5) pp 595-624 (1984). 달리 특정되지 않는 한, 본 발명의 화합물의 C-말단 아미노산은 유리 카르복실산으로서 존재하는 것으로 이해되어야 하며 이것은 또한 " -OH"로서 표시될 수도 있다. 본 발명의 화합물의 C-말단 아미노산은 말단 관능기 "-OH/NH₂"를 갖는 것으로 나타날 수 있으며, 이는, 바람직한 형태의 화합물이 두가지 형태: 즉 유리 카르복실산과 그의 아미드화 유도체임을 의미하는 것이다. 서열 Ala-Gly-Hyp를 가지며 C-말단에 -NH₂기를 갖는 본 발명의 헥사펩타이드 화합물은 C-말단 Phe 또는 Tyr 또는 페닐 고리에 할로겐 치환기를 갖는 그의 유도체를 포함하지 않는다.

항부정맥성 펩타이드의 "기능적 유사체 (functional analogues)"라 함은 본래의 AAP가 갖는 한가지 이상의 이로운 항부정맥 특성 또는 항혈전 특성을 제공하는, 본래의 AAP와 충분히 유사한 구조적 배열 및/또는 결합 특성을 갖는 화학적 물질 또는 화합물을 통칭한다.

"헤테로아릴"이라 함은 예컨대, 피롤릴, 푸릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 피리딜과 같이, 질소, 산소 및 황 중에서 선택된 이종원자를 1-4개 함유하는 5- 또는 6-원 방향족 모노시클릭 헤테로시클릭 기, 및 예컨대 퀴놀리닐과 같이, 질소, 산소 및 황 중에서 선택된 이종원자를 1 내지 6개 함유하는 방향족 바이시클릭 헤테로시클릭기를 의미한다.

"레트로 유사체 (retro analogue)"라 함은 해당 펩타이드의 서열의 역전된 서열을 갖는 펩타이드를 의미한다.

"할로겐"이라 함은 F, Cl, Br 및 I를 의미하며 F와 I가 바람직하다.

"알킬"이라 함은 알칸의 여하한 탄소 원자로부터 수소 원자 하나를 제거함으로써 알칸으로부터 유도된 1가의 기를 의미한다: CnH_2n+1-. 가지가 달리지 않은 알칸의 말단 탄소 원자로부터 수소 원자 하나를 제거함으로써 유도된 기는 보통 알킬 (n-알킬)기의 서브클래스를 형성한다:H[CH₂]_n-. RCH₂-, R₂CH- (R은 H가 아님) 및 R₃C- (R은 H가 아님)은 각각 일차, 이차 및 삼차 알킬기이다. C(1-22)알킬이라 함은 탄소 원자 1 내지 22개를 갖는 모든 알킬기를 나타내며, 여기에는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실과 같은 C(1-6)알킬 및, 그의 가능한 모든이성질체가 포함된다. "저급 알킬"이라 함은 C(1-6)알킬, 바람직하게는 C(1-4)알킬, 더욱 바람직하게는 메틸과 에틸을 가리킨다.

"알케닐"이라 함은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 가지달린 탄화수소기 또는 시클릭 탄화수소기를 의미한다. C(2-22)알케닐이라 함은, 탄소 원자 1 내지 22개를 갖는 모든 알케닐기를 나타내며, C(2-6)알케닐, 비닐, 알릴, 1-부테닐 등이 여기에 속한다.

"아르알킬"이라 함은 아릴 C(1-22)알킬을 나타내며 본 명세서를 통털어 "아릴"이라는 용어는 페닐이나 나프틸을 의미한다.

HPP는 히드록시페닐프로피오닐을 나타낸다.

4HPP는 3-(4-히드록시페닐)프로피오닐을 나타낸다.

2HPP는 3-(2-히드록시페닐)프로피오닐을 나타낸다.

HAA는 히드록시아세트산을 나타낸다.

4HPPA는 4-히드록시페녹시아세트산을 나타낸다.

2HPPA는 2-히드록시페녹시아세트산을 나타낸다.

4HNPA는 4-(히드록시메틸)페녹시아세트산을 나타낸다.

4HPA는 4-히드록시페닐아세트산을 나타낸다.

3HPA는 3-히드록시페닐아세트산을 나타낸다.

2HPA는 2-히드록시페닐아세트산을 나타낸다.

4HBG는 N-(4-히드록시벤조일)글리신을 나타낸다.

3HBG는 N-(3-히드록시벤조일)글리신을 나타낸다.

2HBG는 N-(2-히드록시벤조일)글리신을 나타낸다.

4HPG는 N-(4-히드록시페닐)그리신을 나타낸다.

Ac는 아세틸 래디칼을 나타낸다.

Pc 또는 PC는 L-피페콜린산 래디칼을 나타낸다.

Tfa는 트리플루오로아세틸 래디칼을 나타낸다.

T4c는 L-티아졸리딘-4-카르복실산 래디칼을 나타낸다.

ASAL은 4-아지도살리실코일 래디칼을 나타낸다.

AB는 4-아지도벤조일 래디칼을 나타낸다.

HOBt는 1-히드록시벤조트리아졸을 나타낸다.

HOAt는 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸을 나타낸다.

Acm은 아세트아미도메틸 래디칼을 나타낸다.

Pd(PPh₃)₄는 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)을 나타낸다.

DNP는 디니트로페닐을 나타낸다.

Pamh는 4-아미노-6-메틸헵타논산을 나타낸다.

Pamb는 4-아미노메틸 벤조산을 나타낸다.

DBF는 2-아미노에틸-6-디벤조푸란프로피온산을 나타낸다.

"6-환"은 3-아미노-1-카르복시메틸발레로락탐을 나타낸다.

yAbu는 감마 아미노부티르산을 나타낸다.

"아미노산 잔기"라 함은 천연 아미노산과 비천연 아미노산 단위를 모두 의미하는 것으로, 본 명세서에서는 아미노산에 대해 일반적으로 사용되고 있는 3문자 코드, 예컨대 사르코신 (Sar), 알파-아미노-이소-부타논산 (Aib), 1-나프틸알라닌 (1Nal) 및 2-나프틸알라닌 (2Nal)를 비롯한 나프틸알라닌 (Nal), 페닐글리신 Phg, 2,4-디아미노부타논산 (Dab), 2,3-디아미노프로파논산 (Dapa) 및 히드록시프롤린 (Hyp) 및 베타-알라닌 (베타-Ala)를 들 수 있다. 천연 또는 필수 아미노산은 단백질의 아미노산 구성원이며 일반적으로 사용되는 1문자 코드로 표시될 수 있다. 방향족 아미노산은 Phe, Tyr, Trp, 1Nal, 2Nal 및 His이다. L 또는 D 형이 특정되지 않을 경우 그 아미노산은 천연의 L형인 것으로 본다. Pure & Appl. Chem. Vol. 56(5) pp 595-624 (1984). 달리 특정되지 않는 한, 본 발명의 화합물의 C-말단 아미노산은 유리 카르복실산으로서 존재하는 것으로 이해되어야 하며 이것은 또한 " -OH"로서 표시될 수도 있다. 본 발명의 화합물의 C-말단 아미노산은 말단 관능기 "-OH/NH₂"를 갖는 것으로 나타날 수 있으며, 이는, 바람직한 형태의 화합물이 두가지 형태: 즉 유리 카르복실산과 그의 아미드화 유도체임을 의미하는 것이다. 아미노산 잔기의 이 정의에는 아미노산과 유사한 DBF, T4c, Pc, DNP 및 3-아미노-1-카르복시메틸발레로락탐 등의 화합물이 포함된다. DNP는 항체 인식에 있어서 합텐으로서 기능하며 DNP 부분을 포함하는 본 발명의 화합물들은 연구용 수단으로서 바람직하게 이용될 수 있다.

"모방 펩타이드 (peptide mimetic")라 함은 펩타이드 화합물과 비-펩타이드 성격의 화합물을 모두 가리킨다. 모방 펩타이드 (peptidomimetics)를 만드는 배후목적은 펩타이드 골격을 대체할 수 있는 스캐폴드 (scaffolds)를 만드는데 있다. 펩타이드 중의 이차 아미드 결합은 세포막을 통한 펩타이드 이동 특성의 불안정성과 가능하게는 불량성의 원인이 되는 것으로 추정되고 있다. 적절한 궤적을 갖는 아미노산 사슬의 적합한 위치선정은 생물학적 활성을 달성하기 위한 펩타이드 모방 펩타이드에 있어서 핵심적인 디자인 입체규칙성 (tactic)인 것으로 여겨진다. 골격 변형에는 환원 아미드 결합과 알킬화 아미드 결합의 이용, 그리고 티오아미드 결합, CH₂-CH₂, CH=CH 등과 같은 이소스테릭 결합의 이용이 포함된다.

"펩토이드 (peptoid)"라 함은 그 구조식이 모(parent) 펩타이드와 위상학적 유사성을 갖는다는 특징이 있는 화합물을 가리킨다. 따라서, 펩토이드는 진짜 펩타이드에서와 같은 알파-탄소가 아닌, 골격 질소 원자 상에 측쇄를 갖는 아미노산의 펩타이드-유사 사슬로 이루어진 화합물일 수 있다. 모방 펩타이드와 펩토이드는 Nal, Dab 및 Dapa와 같이 변형된 측쇄를 갖는 아미노산 유닛을 포함할 수 있으며, 이들은 D-아미노산을 포함할 수 있다. El Tayar, N. 등 (Amino Acids (1995) 8: 125-139)에 의해 설명된 바 있는 펩타이드와 모방펩타이드 구조에 대한 여러가지 다양한 변형도 본 정의에 포함된다.

"세포간 커뮤니케이션 촉진 화합물 (intercellular communication facilitating compound)", "간극 결합 촉진제 (gap junction facilitator)", "간극 결합 커뮤니케이션을 촉진시키는 화합물 (compound that facilitates gap junction communication)" 및 "간극 결합 오프너 (gap junction opener)" 등과 같은 용어는모두, 결과적으로 개선되거나 정상화된 GJIC의 개선 또는 정상화에 이른 특정 메카니즘과 관계없이 GJIC를 촉진 또는 매개시키는 화합물을 칭한다. 더욱 구체적으로, "간극 결합 오프너"라는 용어는 코넥신을 발현하는 세포가 자극될 경우 간극 결합 채널의 전도율을 증강시키고, 그에 따라, 세포외 및 세포내 공간 사이의 간극 결합을 통해 통과할 수 있는 분자들의 교환을 증대시키고/또는 GJIC를 증대시키는 물질을 가리키는 것일 수 있다.

"아고니스트"라는 용어는 수용체와 상호반응하여 그 수용체에 특징적인 생리학적 또는 약학적 응답 (수축, 이완, 분비, 효소 활성화 등)을 개시할 수 있는 내인성 물질을 가리킨다. 본 발명에서 "항부정맥성 펩타이드 수용체 아고니스트 (antiarrhythmic peptide receptor agonist)" 또는 "AAP-R 아고니스트"라 함은 그 화합물의 효과를 일으키는 특정 생물학적 메카니즘에 따라 "간극 결합 오프너"와 동등하거나 동등하지 않을 수 있다.

간극 결합의 일반적 배경

다세포 생명체에서는, 세포간의 공조가 가장 중요하다. 세포들의 다양한 상호 소통 수단 중에서도, 간극 결합은 가장 직접적인 경로를 제공한다. 간극 결합은 인접 세포들 간에 형성되는 간극 복합체의 한 유형으로서 이웃하는 세포들의 내부 (세포질)을 직접 연결시키는 응집된 채널들 (aggregated channels)로 구성된다. 다 자란 포유동물에 있어서는, 간극 결합은 대부분의 세포 종류에서 발견되며, 순환 혈액 요소만이 그 유일한 예외인 것으로 알려져있다.

간극 결합 채널의 구조 단위는 코넥손 또는 헤미-채널이다. 각각의 코넥손은6개의 코넥신 폴리펩타이드 (Cx)로 이루어져있고 이들은 올리고머화하여 단일 플라즈마 막에 이어지는 수성 포어를 형성한다. 완전한 간극 결합 채널을 형성하기 위해, 인접 세포들로부터 두개의 코넥손이 정렬하여 서로 도킹함으로써 두 세포들의 세포질을 연결해주는, 연속적인 채널을 형성한다.

간극 결합 채널-형성 코넥신은 복수-유전자 패밀리를 포함하며, 이제까지 적어도 14개의 포유류 코넥신이 발견되었다. 발현된 코넥신은 조직 및 세포에 특이적이며, 어떤 세포들은 복수개의 코넥신 이소형태를 발현하기도 한다. 실험적 증거에 따르면 두가지 서로 다른 하이브리드 배열이 가능한 것으로 나타났다. 즉: 각각의 코넥손 또는 헤미채널이 특이적인 코넥신 이소형태로 구성되어 있는 헤테로타이픽 세포-대-세포 채널이나; 또는 각각의 코넥손이 특정한 세포 유형에서 발현되는 서로 다른 코넥신 이소형태의 혼합물인 헤테로머 채널이 그것이다. 코넥신은 세포-, 조직-, 및 발달-특이적 방식으로 발현된다.

코넥신의 유전자 구조에 대해서는 알려진 바가 비교적 거의 없다. 마우스의 Cx43에 관해 보고된 결과에 의하면 Cx43은 5'-미번역 대역에 위치하는 두개의 엑손과 하나의 인트론을 함유하는 것으로 나타났다. 5' 중앙부의 프로모터 (proximal promotor)에서 몇가지 추정적인 전사인자 결합 부위가 동정된 바 있다. 생체외 연구결과, 서로 다른 여러쌍의 코넥신으로 이루어진 헤미채널에 의해 투과성 채널이 만들어질 수 있는 것으로 나타났다. 예컨대, Cx43은 Cx32, Cx37, 및 난모세포의 내인성 Cx (Cx38)와는 기능성 채널을 만들 수 있지만, Cx26 난모세포와는 그럴 수 없다. 그러나, 이들 헤테로채널의 투과성 조절에 관해서 뿐만 아니라 이들의 특성에관해서는 극히 일부만 알려져있을 뿐이다. Cx는 대부분의 조직에서 발현되고 단일 세포가 여러가지 서로 다른 Cx를 발현시킬 수 있다. 투과성 간극 결합은 서로 다른 유형의 Cx를 발현하는 세포들 간에 형성될 수 있다. 따라서 조직 중에서의 간극 결합 세포간 커뮤니케이션은 그 조직의 인테그리티를 유지하는데 있어서 매우 중요한 것으로 보인다. 몇몇 유전자들은 이들 유전자 중 어느 하나의 돌연변이로 인해 GJIC가 손상되는 것을 방지하기 위해, 동등한 생성물을 만드는 것으로 보인다.

형성된 간극 결합 채널의 포어 직경은 0.8 - 1.4 nm 범위인 것으로 보고되었다. 간극 결합은 비교적 비-선택성이며 약 1000 달톤 이하의 분자들을 통과시킨다. 이러한 물질의 예로는 특히 이온, 물, 슈가, 뉴클레오타이드, 아미노산, 지방산, 소형 펩타이드, 약물 및 발암성 물질을 들 수 있다. 채널을 통과하는데는 ATP가 필요하지 않으며 이는 수동 확산의 결과인 것으로 보인다. 간극 결합 채널을 경유한 세포들간의 이러한 물질 이동은 간극 결합 세포간 커뮤니케이션 (GJIC)으로서 알려져 있으며, 세포 대 세포의 시그널링, 세포 증식 및 세포 대사를 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다. GJIC가 갖는 가장 중요한 생리적 의미 중 하나는 조직 중에서 간극 결합에 커플링된 세포들이 개별적으로 불연속적인 개체가 아니라, 자신들의 이웃들과 고도로 긴밀히 통합되어 (integrated) 있다는 것이다. 이러한 특성은 항상성을 촉진시켜주며 세포들 간에 2차 메신저를 신속하고 직접적으로 전달해 줌으로써 조직중에서의 세포 응답을 공조해주는 역할도 해준다.

GJIC 프로세스는 몇가지 주요 카테고리로 대별될 수 있는 다양한 메카니즘에 의해 조절된다. 그 첫번째 조절 유형에서는, 발현, 분해, 플라즈마 막에 대한 코넥신의 세포성 트래피킹 (cellular trafficking)에 영향을 미치거나, 또는 기능적 간극 결합으로의 코넥신의 어셈블리에 영향을 미침으로써 간극 결합의 세포량이 제어된다. 종양 세포에서 코넥신 발현의 다운-레귤레이션에 의해 일어나는 손상된 GJIC가 이러한 조절 모드의 한 예이다. 두번째 조절 유형은 일반적으로, 간극 결합이나 코넥신의 세포 수준의 전체적인 변경에 의하지는 않으나, 기존의 간극 결합의 개방 (opening) 또는 폐쇄 (closure) 또는 게이팅 (gating)을 포함한다. 세포외 용해성 인자들, 예컨대 마이토젠 (예컨대 DDT), 호르몬 (예컨데 카테콜아민), 마취제 (예컨대 할로쎄인), 세포내 바이오분자 (예컨대 cAMP), 및 세포 스트레스 (예컨대 기계적 또는 대사적 스트레스)가 이러한 유형의 조절을 일으킬 수 있다. 또한, GJIC는 세포 사이클 및 세포 이동시에도 조절된다.

Cx43의 세포질 카르복시 말단의 특정 부위에서의 포스포릴화의 변화는 간극 결합 채널의 개방과 폐쇄에 있어서 중추적인 것으로 보인다. 카르복시 말단 도메인의 포스포릴화 역시 Cx43 간극 결합 헤미컴플렉스를 세포막에 연결시키는 과정, 그의 세포내 흡착 (internalisation) 및 분해에 있어서 중요한 것일 수 있다. 코넥신의 반감기 (몇시간)는 대부분의 플라즈마막 단백질의 반감기 (며칠)에 비해 훨씬 짧다; 예컨대, 래트 심장 중의 Cx43의 반감기는 1 ½시가 미만이다. 따라서, 턴오버 (turnover) 속도를 조절하는 것이 GJIC를 조절하는데 있어서 중요한 인자가 될 것이다.

GJIC는 성장 조절 이외에도 많은 생리적 역할을 하는 것으로 제시되어왔다:

항상성: GJIC는 세포내 유액, 이온 및 영양소의 신속한 평형을 달성하게 해준다. 이것은 이들 채널의 가장 오래되고, 광범위하면서도 가장 중요한 기능일 것이다.

전기적 커플링: 간극 결합은 심근세포, 평활근 세포 및 뉴론과 같은 전기적으로 여기될 수 있는 세포들에 있어서 전기적 시냅스 역할을 한다. 이들 조직에서는, 전기적 커플링이 화학적 시냅스보다 활동 전위의 세포 대 세포 전달을 더욱 신속하게 해준다. 심근세포와 평활근 세포에 있어서는 이것이 이들의 동시적 수축을 가능케 해준다.

조직은 호르몬에 응답한다. GJIC는 외부 자극에 대한 조직의 응답성을 향상시킬 수 있다. 사이클릭 뉴클레오타이드, 칼슘 및 이노시톨 포스페이트와 같은 2차 메신저들은 간극 채널을 통해서, 호르몬적으로 활성화된 세포로부터 무활동성 세포로 통과할만큼 충분히 작아서 후자를 활성화시킨다. 이러한 효과는 아고니스트에 대한 조직 응답을 증가시킬 수 있다.

배(胚) 발달의 조절: 간극 결합은 배에 있어서의 화학적 및/또는 전기적 발달의 시그널 및, 발달적 콤파트먼트의 한계를 정하는 세포간 경로 역할도 할 수 있다. GJIC는 배 세포에서 특이적인 패턴으로 발생하며 GJIC의 장애는 비정상적 발달 및 많은 화학물질의 기형발생 효과와 관련이 있다.

세포간 커뮤니케이션은 개개 세포의 활동이 서로 조화를 이룰 수 있는 방식으로 일어나게 해주며, 이들 활동을, 당해 유기체에 속하며 그 유기체를 부양하는 일 조직의 운동력으로 통합시킨다. 따라서 광범한 병생리학적 증상이 GJIC의 저하와 연관되어 있다는 것은 그다지 놀랄만한 일이 아니다.

약물학

심장학적 응용

본 발명의 배경란에서 개략한 바와 같이, 정상 상태와 병리학적 상태에서 GJIC가 심근세포에서 중요한 역할을 한다는 증거는 매우 많다. GJIC 장애와 연관된 특정 심장 증상이 후술되며, 심장에서 GJIC를 증대시키는 화합물들이 심장의 일련의 병리학적 증상을 예방 및/또는 치료하는데 유용함을 입증해주는 생체외 및 생체내 증거가 제시된다.

재입 부정맥 (reentry arrhythmias)

심장 부정맥은 비정상적인 충격 개시 (impulse initiation)나 또는 비정상적인 충격 전도 (impulse conduction)에 의해 일어난다. 비정상적인 충격 전도에 의한 부정맥 중에서도, 재입 메카니즘에 의한 부정맥이 가장 심각하다.

심실성 재입 (ventricular reentry):

재입은 지속형 심실성 세동 및 돌연 심장사의 주요 원인이다. 재입은 광범성 충격 (propagating impulse)이 심장의 완전한 활성화 후에도 가라앉지 않고, 지속됨으로 해서 호흡기간이 끝난 후에도 심장을 재흥분시킬 때 발생한다. 재입 유도는 느린 전도, 재분극의 증가된 분산, 비-균질적 이방성 및 비방향성 전도 폐색에 의해 촉진된다. 심실 재입의 대부분의 경우의 원인이 되는 질병은 허혈성 심장질환 (예컨대, 급성 심근경색, 만성 심근경색, 안정성 협심증 및 비안정성 협심증)이다. 급성 허혈이 일어나는 동안 간극 결합 채널은 폐쇄되어 이웃하는 세포들의 언커플링을 야기시킨다. 이온 채널 및 간극 결합 기능에 있어서의 이질적인 변화는 특히 허혈 대역을 정상적인 심근세포로부터 이격시키는 경계 대역에서 유효 불응기 (effective refractory period)와 활동전위지속시간의 증가된 분산을 초래한다. 활동전위지속시간의 증가된 분산은 오래전부터 심실성 세동의 유도를 촉진하는 것으로 알려져 왔다^[23]. 정상적으로는, 잘-커플링된 세포에서 활동전위지속시간의 차이는 전기 커플링에 의해 평활화된다. 그러나, 언커플링은 이러한 평활화를 방지하여 활동전위지속시간과 불응기의 분산을 언마스킹시킬 것이다^[24]. 허혈이 장기화되면 Cx43의 발현도 감소 및 분포 패턴 변화가 관찰될 수 있다. 만성 허혈에서의 발현 및 분포 패턴의 변화 뿐만 아니라 급성 허혈시 간극 결합 채널의 폐쇄도 전도속도 저하, 분산 증대, 비-균일한 이방성, 및 비방향성 전도 폐색을 일으킬 수 있고, 따라서, 재입 부정맥의 유도가 촉진될 것이다. 따라서, 많은 실험적 연구 결과가, 비정상적 코넥신 발현 부위와 재입 심실성 빈맥 서킷간의 상관관계를 보여주고 있다^[25]. 재입의 발달에 알맞는 조건, 즉, 느린 전도, 재분극성 분산 증가, 비-균일한 이방성 및 비방향성 전도 폐색이 다른 많은 심장 질환에서도 존재한다. 따라서, 감염성 또는 자율성 심근증에 있어서, 발생하는 염증은 심근층에 있어서 섬유 조직의 고갈을 초래하여 저속 전도성 분산 증가의 중심을 만들 수 있고 가능하게는 비방향성 전도 폐색을 일으킬 수도 있다. 비후성 심근증 (예컨대, 고혈압, 대동맥판협착증, 선천성)은 대량의 심근 조직과 비교적 소량의 전도성 조직간의 불일치로 인해 재입 부정맥을 야기할 수 있고, 이는 느린 전도, 분산 증가 및 비방향성 전도 폐색을 초래할 수 있다. 선천성 질환 (예컨대, 롱-QT 증후군) 및 QT 간격을 연장시키는 약물 (예컨대 항부정맥성 약물, 항정신성 약물, 항히스타민제, 항생제 등) 역시 서로 다른 심근층에 걸쳐 분산된 이온 채널의 이질성으로 인해 활동전위지속시간의 분산을 증가시키며, 젊은 사람들에 있어서 재입-유도성 돌연사의 주요원인이 된다.

심방성 재입 (atrial reentry)

심박수 상승 또는 대사성 발작에 대한 전기카디오그래프 교호성 T-파의 모양이 거의 지난 백년동안 관찰되어 왔다. 육안관찰되는 교호성 T-파는 종종 부정맥성 돌연사의 조짐으로서 인식되어 왔다. 최근의 연구는, 기질의 해부학적 특성에 따라, 역향성 교호 재분극의 존재를 다양한 재입성 항부정맥의 개시에 연결지을 수 있는 공통된 메카니즘을 제시하고 있다^[28]. 변시성 또는 대사성 스테레스가 가해지면, 심근 활동전위의 재분극 페이즈의 형태학 및 기간이 변경된다. 부가적인 스트레스가 가해지거나 또는 구조적 배리어가 존재할 경우, 교호성 재분극은 공간적으로 역향성으로 된다. 교호성 역향은 충분히 큰 재분극 구배를 일으켜 일방향성 폐색 및 재입을 발생시킨다. 구조적 배리어 없이, 재입은 기능성이며 심실성 세동 또는 다형성 심실성 빈맥을 발생시킨다. 구조적 배리어의 세팅시, 재입은 해부학적으로 고정되어 단형성 심실성 빈맥을 야기하게 된다^[29].

요약하면, 간극 결합 전도도를 증대시키고 비방향성을 더욱 균일하게 만드는, 본 발명의 화합물과 같은 물질은 일방향성 폐색 및 재입 부정맥을 예방해줄 것이다. 이러한 물질은 심방성 및 심실성의 두가지 모두에 기인하는 재입 서킷을 앓고 있는 환자에게 유용할 것이다. T-파 교호성을 나타내는 환자들은 재입 부정맥에 걸리기 쉬우며, 간극 결합 커플링을 증가시키고 이방성을 감소시키는 물질은 이들 환자에 있어서 치명적인 심실성 부정맥을 예방하는데 유용할 수 있다.

부정서맥

부정서맥 (bradyarrhythmias)은 동방결절, 방실결절, His 속지 또는 우측 또는 좌측 속지의 느린 전도 또는 전도 폐색에 의해 일어날 수 있다. 전도계를 통털어 전도에 책임이 있는 주요 코넥신은 Cx40이다. Cx40 유전자의 녹-아웃시 마우스의 호모접합성은 심방 전도, 방실 전도 및 히스-푸르키니에 (His-Purkinje) 전도를 현저히 저하시키고 부정맥과 속지 폐색의 위험성을 증대시킨다^[4-6]. 따라서, 정상적으로 기능하는 Cx40 간극 결합이 정상적인 리듬을 유지하는데 필수적이다.

간극 결합 전도를 증대시키는 본 발명의 화합물과 같은 물질은 심장의 느린 전도를 예방 및/또는 치료하는데 유용함.

수축성 저하

수축성 저하 (reduced contractility)는 많은 만성 심장 질환의 공통적인 특성이다. 최악의 시나리오에서는 (즉, 심장 발작의 말기 단계), 박출율이 너무 낮아서 기관 관류에 필요한 최저치조차 더 이상 유지되지 못할 정도로 수축성이 감소된다. 임상적 증거와 여러가지 실험결과는 이러한 심장 발작 말기환자의 심장에서의 코넥신의 발현 및 분포가 변화함을 보여주고 있다. 따라서, Cx43은 비정상적인 조직에서는 고도로 불규칙적으로 분포하며 현저히 다운-레귤레이션된다. 정상 상태에서는 매우 제한적인 Cx45의 발현이 심장 발작시에는 크게 증가한다; 그러나, Cx45의 전도 특성은 Cx45의 특성보다 열등하기 때문에, Cx43의 감소를 상쇄할 수 없다. 최근의 연구에 따르면 몇몇 조절 이온 채널과 수용체가 세포간 간극 부위에 집중되고 그에 따라 Cx43의 발현 및 분포 변화가 흥분-수축 (excitation-contraction) 커플링에 영향을 미치고 따라서 수축성에도 영향을 미친다는 것을 가리키고 있다^[30]. Cx43-무력화 배 줄기 세포 및 야생형 포배세포로부터 형성됨으로 해서, Cx43의 이질적 손상을 발현하는 키메라 마우스가 심각한 수축 장애를 겪는다는 것은 간극 결합의 기능과 수축성의 관련성에 대한 강력한 증거가 된다.

본 발명자들은 간극 결합 전도율을 증대시키는 물질이 흥분-수축 커플링에 관여하는 매개자들의 세포간 커뮤니케이션을 증대시키고 따라서 수축성도 향상시킨다고 주장하는 바이다.

실험 실시예 1

심근세포의 GJIC에 미치는 화합물 2의 효과

세포 준비: Langendorf의 방법에 따라 콜라게나제를 이용하여 관류에 의해 기니픽의 심장으로부터 세포를 분리하였다. 요약하면, 기니픽에게 헤파린 (1000IU/kg)을 복강내 주소하여 기니픽을 헤파린화시켰다. 30분 후 기니픽의 목을 세게 친 다음 목 부분에서 척추를 절단함으로써 기니픽을 희생시켰다. 가슴을 열고 동맥에 캐뉼러를 삽입하였다. 이어서, 봉합사로 캐뉼러를 대동맥에 고정시킨 다음 절개하여 몇분동안 타이로드(Tyrode) 용액을 관류시켰다. 타이로드 용액은 mM 단위로 다음의 조성을 가졌다.: Na⁺135.33, K⁺4, Cl^-145, PO₄ ^-0.33, Mg²⁺1, Ca²⁺2, 헤페스(Hepes) 10, 글루코스 10, pH 7.4. 모든 관류매질을 100% 산소로 버블링시켰다. 이어서 Ca²⁺없이 타이로이드 용액으로 심장을 2분간 관류시킨 다음 mM 단위로 다음을 함유하는 고 K⁺용액으로 2분간 관류시켰다: K⁺120, Cl^-22, 글루타메이트 120, Mg²⁺1, Ca²⁺25 μM, 헤페스 10, 글루코스 10, pH 7.4. 이어서, 심장을 0.6 mg/ml의 콜라게나제를 함유하는 고 K⁺용액으로 심장의 모양을 판단하면서 10-15분간 관류시켰다. 심방을 절제하고, 심실을 잘게 다진 다음, 100% 산소로 살살 버블링시키면서 콜라게나제 용액 중에서 교반시켰다. 이어서 세포들을 체를 통해 통과시켜 유리된 세포들을 분리하고 콜라게나제는 원심분리에 의해 제거하였다. Ca²⁺가 없는 타이로드 용액에 세포를 재현탁시키고 Ca²⁺를 서서히 0.65 mM까지 증가시켰다. 다음 실험실로 옮길 때까지 세포들을 이 용액 중에 실온에서 유지시켰다.

전기생리학: 도립현미경의 스테이지 상의 열린 챔버에 커버 슬립을 장착한다. 여기서, 세포는 1 ml/분, 37℃에서 Dulbeccos 인산염 완충염수 (PBS)로 수퍼퓨즈되어 있다. 이 용액은 다음을 함유한다 (mM):Na⁺152, K⁺4.2, Cl^-141.5, PO₄ ^3-9.5, Ca²⁺0.9, Mg²⁺0.5, pH 7.2. 팻치 클램프 피펫을 Sutter Flaming-Brown P87 미세전극 풀러 상의 1.5mm 유리 모세관 (GC150F-15, Havard Apparatus)으로부터 뽑아서 4-6 MΩ의 저항까지 불꽃연마하였다. mM 당 K⁺145, Na⁺15, Cl^-5, 글루코네이트^-153, 피루베이트 5, EGTA 1, 헤페스 5, Ca²⁺0.42 mM, Mg²⁺1.6, pH 7.2를 함유하는 세포내 유사 용액으로 피펫을 충전시켰다. 이 용액에 암포테리신 B (240 μg/ml)를 60 mg/ml 원액 (용매: DMSO)로부터 첨가한다.

팻치 클램프 셋-업은 두개의 동기화된 불연속 증폭기 (SEC-05LX, NPI 일렉트로닉스)로 구성되며 데이타는 INT-10 인터페이스 (NPI 일렉트로닉스) 및 PC1200 데이터 포착보드 (National Instruments)를 이용하여 디지털화된다. 전류 시그널과 전압 시그널 모두 증폭기의 내부 필터를 이용하여 1 kHz에서 로우 패스 필터링시켜 10 kHz에서 디지털화시킨다.

한쌍의 세포 하나에 PatchMan 5173 마이크로매니퓰레이터 (Eppendorf)를 이용하여 전극을 접근시킨다. 세포와 접촉되면 (인풋 저항의 급격한 증가로 나타남), 기가 (Giga) 씨일 배열이 확립될 때까지 석션을 가한다. 이 단계를 다른 세포에 대해서도 반복하여 수행한다. 이어서 간단히 석션을 가해서 피펫 아래의 막을 파괴시킨 다음 세포 내부 전위를, 세포의 자연적인 막 전위와 근사한 값인 -70 mV까지 클램프시킨다. 매 10초마다 각각의 세포를 1초 동안 10 mV로 연속적으로 과분극화시키고, 다른 세포에서의 결과적인 전류 변화를 이용하여 다음 방정식에 따라 세포간 전도율 (Gj)를 산출할 수 있다.

식 중,I _p,pulse 및I _p,rest 는 각각 펄스시 및 펄스전의 수동 세포 (passive cell) 중의 전류를 나타내고,U _p 및U _a 는 수동 세포와 능동 세포의 전압을 나타낸다. 이러한 유형의 실험은 세포 대 세포 접촉의 차이로 인해 절대적인 G_j값의 비교를 가능케하지는 못하기 때문에, 기능적인 간극 결합 채널의 양도 비교할 수는 없다. 그러나, 약물과 같이 표준화된 개입에 대한 G_j값의 변화는 G_j의 상대적인 변화를 비교함으로써 분석할 수 있다.

결과:도 2에 9회의 연속 실험으로부터 얻은 결과를 요약하였다. 이 도면은 화합물 2 (10^-8M)에 의한 자극전 및 자극시 시간에 따른 함수로서의 상대적 G_j를 도시한다. 화합물 2로 세포를 처리한 5회의 실험 모두에서, 화합물은 약 400초간의 자극 후 정상 상태 수준에 도달할 정도로 G_j를 크게 증가시켰다 (ΔG_j= +120 ±46%). 전도도는 4개의 비히클로 처리된 조제물 모두에 있어서 불변하였다 (ΔG_j= -3 ±5%).

자극 후 심근세포들 간의 전기적 커플링이 증가함을 보여주는 이러한 발견은, 합성 AAP 유사체 AAP10을 이용한 종래 문헌의 실험 결과 보고와 잘 일치하는것이다^[32]. 그러나, Muller 등의 연구^[32]에 의하면, 간극 결합 전도도는 컨트롤 조건 하에서는 안정하지 않았다. 따라서, AAP10을 적용하는 실험에서 6회 중 3회에서는 전도가 증가하지 않았고, 단지 간극 결합 전도의 런-다울은 방지하였을 뿐이고 6회의 실험 중 2회에서는 컨트롤 기간 중 간극 결합 전도가 실질적으로 증대되었다. 본 명세서에 제시된 실험에서, 화합물 2는 안정한 컨트롤 조건 하에서 조제물의 간극 결합 전도를 증대시켰다.

실험 실시예 2

쥐의 심장의 조직 조제물에 대한 화합물 2의 결합

조제물

마우스 (Balb/cJ, 20 g)로부터 심장을 절제하여 빙냉 (0℃), 0.32M 수크로스로 2회 헹군다음 Ultra Turrax 호모지나이저 (1000 rpm)을 이용하여 2분 동안 수크로스의 10배 부피의 얼음 상에서 균질화시킨다. 균질화물을 1000 g_mean으로 10분간 4℃에서 원심분리시킨 다음 상등액을 수집하여 4겹의 거어즈를 통회 여과시킨다. 이어서 여액을 50,000 g_mean에서 45분간 4℃에서 원심분리하고 펠릿을 10 vol_{org.wet.weight}의 빙냉시킨 증류수에 재현탁시켜 0℃에서 60분간 인큐베이션시킨 다음 50,000 g_mean에서 45분간 4℃에서 재-원심분리시킨다. 얻어진 펠릿을 2 vol_{org.wet.weight}의 PBS(포스페이트 완충염수)에 재현탁시키고 -80℃에서 사용전까지 보관한다.

화합물 2를 이용한 디스플레이스먼트 실험

40 - 250 μg의 여액 또는 막 물질을 테스트 화합물인 AAP와 화합물 2의 농도를 증가시키면서, 0.8 nM [¹²⁵I] AAP10을 함유하는 총 부피 100 μl의 D-PBS (1 g/l의 MgCl₂·6H₂O & CaCl₂를 함유하는 둘베코' 인산염 완충염수)에 인큐베이션시킨다. 비-특이적인 결합을 10 μM AAP10 (CE2)에서 측정한다.

계산

디스플레이스먼트 실험으로부터의 데이타를 다음 방정식에 대입한다:

f=(Total - ns) / (1+s/IC₅₀) + ns

식 중,Total은 라벨링된 리간드의 농도 s에서의 총 결합 방사능값이고,ns는 비-특이적 결합이며IC ₅₀ 은 특이적 결합 (Total-ns)을 최대 특이적 결합의 50%까지 감소시키는, 테스트 화합물의 농도이다.

결과

쥐의 심장 조제물로부터의 0.8 nM [¹²⁵I]AAP10의 디스플레이스먼트 (n.t.=시험되지 않음)

테스트 화합물	여액 IC₅₀(nM)	막 IC₅₀(nM)
AAPAAP10 (CE2)화합물 2	1.21.23,6	n.t.n.t.1.2

상기 표 2에 나타난 값들은 토끼 심장으로부터의 막을 이용한 Dhein 등^[33]에 의한 AAP10에 대해 주어진 것과 동일한 매그니튜드의 순서이다 (0.2nM).

본래의 세포상의 인 시투 결합 방법

CHO 세포 배양체

CHO 세포들을 7,900 세포/cm²(~ 15,000 세포/웰)의 밀도로 24-멀티 웰 디쉬에 접종한 다음 10% 소의 배아 혈청 (FCS)과 1000 유닛의 페니실린/1000μg의 스트렙토마이신 (pen/strep)이 보강된 F-12K 영양 혼합물 1ml/웰에서, 5% CO₂및 100% 습도 분위기 하에 37℃에서 3일간 생체외 (DIV: Days In Vitro) 배양시킨다. 이 때의 세포 밀도는 295,000 세포/cm²까지 증가하였다 (152 pg_prot/세포 ~ 85 μg_prot/웰).

전-처리

분석 당일에 세포들을 인큐베이터로부터 제거하고 각각의 웰을 시험에 따라 2ml의 미리 덥히거나 (37℃) 빙냉시킨 (0℃) D-PBS로 2회씩 세정하여 세럼을 제거한다. 세척 공정시 세포가 건조되는 것을 피하기 위해, 세포가 생리용액 없이 방치되는 기간을 최소화시키는 것이 중요하다. 차갑게 세척된 세포들은 결합 분석에 직접 사용하는 반면, 따뜻하게 세척된 세포들은 글루코스 및 산소 결핍 실험에 사용한다.

글루코스 및 산소 결핍

37℃에서 적어도 10분간 N₂로 미리 평형시킨 글루코스가 없는 D-PBS (pH 7.2)에서 N₂-분위기 하에 10분간 세포를 인큐베이션시킨다. 정상 분위기 조건 및 글루코스 (6 mM) 함유 D-PBS 중에서, 컨트롤 세포들을 마찬가지 방식으로 10분간 37℃ 인큐베이션시킨다.

결합 분석

Koenig^[34]의 방법에 기초한 변형 프로토콜을 이용하여인 시투결합을 수행한다. 세포 배양체로부터 D-PBS를 제거하고, 표지되지 않은 리간드나 테스트 화합물의 존재 또는 부재 하에 0.50 ml[¹²⁵I]AAP10 용액을 첨가한다. 세포를 밤새 4℃에서 인큐베이션시켜 평형에 도달하게 한다. 이어서, 한번에 하나씩 각각의 웰을 2 x 1 ml D-PBS로 신속히 헹군다음 건조시킨다.

각각의 웰에 0.5% Triton-X-100 (v/v) 0.25 ml를 첨가한 다음 세포들을 적어도 1시간 동안 용해시킨다. 추출물을 계수용 바이알에 옮기고, 웰을 0.25 ml 물로 헹군 다음 헹군 추출물을 대응하는 바이알에 첨가한다. 감마-계수기로 바이알을 계수한다.

인 시투결합, IC₅₀(nM)

테스트 화합물	IC ₅₀ (nM)
AAP (CE1)AAP10 (CE2)화합물 2화합물 32화합물 24	0.81300.50.565

상기한 결과들은 본 발명에 따른 몇가지 상이한 물질들이 종래기술의 펩타이드에 필적할 정도로 CHO 세포에 대해 고도의 친화성 결합을 함을 입증해준다.

실험 실시예 3

CHO 세포에 있어서 cAMP 생성에 미치는 화합물 2의 영향

상기 섹션에 기재된 바와 같이, CHO 세포들을 6,000 세포/cm²(~ 2,000 세포/웰)의 밀도로 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 접종한 다음 200 μl/성장배지 웰에서 생체외에서 4일간 배양시킨다.

전-처리

분석 당일에 세포들을 인큐베이터로부터 제거하고 200 μl의 미리 데운 (37℃)D-PBS로 2회씩 세정하여 세럼을 제거한다. 상기 섹션에 설명된 바와 같이, 세포들을 글루코스가 없는 D-PBS 중에서 N₂-분위기 하에 10분간 인큐베이션시킨다.

cAMP 효능 분석

6 mM 글루코스, 2.0 mM IBMX (포스포디에스터라제 블로커), 10 μM 포스콜린 (cAMP 생성을 촉진함)를 함유하는 D-PBS (pH 7.2) 중에 테스트 펩타이드의 농도를 증가시키면서 CHO 세포들을 37℃에서 인큐베이션시킨다. 20분 후에 20 μl의 0.5 M HCl을 첨가함으로써 반응을 중지시킨 다음 실온에서 적어도 20분간 방치시킨다.

180 μl [¹²⁵I]cAMP 트레이서 용액을 함유하는 FlashPlate^TM웰 (NEN 어세이 키트 SMP001) 내로 산성 세포 추출물 20 μl을 혼합함으로써 cAMP의 함량을 분석한다. FlashPlate^TM을 4℃에서 밤새 인큐베이션시키고 플레이트 결합 방사능을 TopCount (Packard Instrument)를 이용하여 계수한다. 데이터는 전술한 섹션에서처럼 계산한다.

결과

CHO 세포에 있어서의 APP-유사 화합물의 포스콜린-자극 cAMP 형성 억제는 AAP 수용체들이 cAMP 2차 메신저 시스템에 네가티브하게 커플링되었음을 가리킨다. 뿐만 아니라, 이것은 CHO 세포에 있어서 기능적인 AAP 수용체가 존재함을 입증하는 것이다.

CHO 세포에 있어서 포스콜린 자극된 cAMP 형성의 억제

테스트 화합물	EC₅₀(nM)
AAPAAP10 (CE2)화합물 2	53116.2

실험 실시예 4

래트의 원발성 심근세포에 있어서의 포스포이노시톨-분석

원발성 심근세포 배양

신생아 Wistar 래트 (생후 1-2일)를 이용한다. 세포 분리 공정시, 10mM HEPES로 완충된 Hank' 무칼슘 및 무마그네슘 밸런스 염 용액을 이용하여 세정한다. 심장을 절제하고, 심실을 분리하여 작은 조각이 되도록 이 조직을 절단한다.^[35]에 설명된 바와 같이 콜라게나제 0.05%를 이용하는 단계적 효소분해에 의해 심근 세포들을 분리시킨다. 원심분리 및 세척단계를 반복 수행한 후, 침전 세포들을 Earle' 염, 10% NCS, 페니실린 (75 U/mL) 및 스트렙토마이신 (75 U/mL)가 함유된 배양배지 M199에 재현탁시킨 다음 페트리 디쉬에서 90분간 예비-플레이팅시킨다. 배양 배지중 비-부착성 세포들을 모아서 2.5 * 10⁵세포/웰의 수준으로 복수개의 디쉬에 플레이팅시킨다. 37℃에서 물로 포화된 CO₂-인큐베이터에서 계속 배양시킨다. 6~7일 후에 이들 심근세포 배양체를 분석한다.

포스포이노시톨-턴오버 분석

이노시톨 인지질을 라벨링시키기 위해, 4 μCi/mL 미오-[2-³H]이노시톨을 함유하는 배양 배지 중에서 심근세포 배양체를 48시간 인큐베이션시킨다. Meier 등의 방법^[36]에 따라, 분석 당일 배지를, 리튬을 함유하는 완충용액으로 대체시키고 37℃에서 인큐베이션시킨다. 적어도 5분이 지난 후 이 완충액을 테스트 화합물을 함유하는 동 부피의 완충액으로 갈아주고 정확히 20분간 인큐베이션시킨다. 완충액을 빙냉 4% v/v 퍼클로르산 (PCA)으로 급속히 갈아줌으로써 반응을 중단시키고 적어도 20분 동안 0℃에서 인큐베이션시킨다. PCA- 추출물을 중화시키고, 100 mg SAX 사차 아민을 함유하는 Amprep^TM컬럼을 이용하여, [³H]이노시톨 포스페이트를 분리한다. [³H]이노시톨 모노-포스페이트를 용리시키고 액체 섬광계수기에 의해 분획 중의 방사능을 측정한다.

글루코스 및 산소 결핍

테스트 물질을 배양체에 첨가하기에 앞서, 세포들을 N₂-분위기 하, 글루코스가 없는 리튬-완충액 중에서 10분간 37℃에서 인큐베이션시킴으로써 세포로부터 글루코스와 산소를 결핍시킨다. 대조군 세포들은, 정상 분위기 하에서, 글루코스를 함유하는 완충액을 이용한 것을 제외하고 마찬가지 방식으로 인큐베이션시킨다.

노르아드레날린 (NA)은 농도-의존적 방식으로, 심근세포 배양체에서의 포스포이노시톨 턴오버를 자극한다. 그러나, 포스포이노시톨 턴오버를 자극하는 노르아드레날린 (300 nM NA)의 능력은 도 3에 도시된 바와 같이, 10분간 글루코스 및 산소 결핍된 배양체에서는 현격히 감소된다.

정상적 분위기 및 영양 조건 하에서, 본 발명자들은 3852 ±266 cpm의 E_max값과 203 nm (SD_R=1.2)의 EC₅₀값을 얻은 반면, N₂분위기 및 글루코스를 결핍시킨 세포에서는, 2248 ±702 cpm의 E_max값과 303 nm (SD_R=1.7)의 EC₅₀값을 얻었다.

허혈 및 글루코스 단식 (starvation)에 의해 유도된 세포 스트레스시, 포스포-이노시톨 턴오버에 있어서 약화된 노르아드레날린-유도성 증가에 미치는 본 발명의 물질의 효과를 시험하기 위해, 화합물 2 또는 AAP10 (CE2)을 심근세포 배양체에 첨가하였다. 두가지 물질 모두 포스포-이노시톨 턴오버를 매우 강하게 향상시켰으며 그 중에서도 화합물 2가 가장 강력했다. 하기 표 5에 나타난 바와 같이, AAP10 (CE2)의 EC₅₀값은 화합물 2의 EC₅₀값에 비할 때, 정상산소증시의 값보다 200배 높았고, 산소결핍증 및 글루코스 결핍에 의해 유도된 대사성 스트레스시에는 10배 더 높았다.

산소결핍증 및 글루코스 결핍에 의해 유도된 대사성 스트레스시 화합물 2와 AAP10에 의한 포스포-이노시톨 턴오버의 증대

	EC₅₀(nM)AAP10 (CE2)	EC₅₀화합물 2
정상 조건글루코스 및 산소 결핍	2000100	1010

도 4에 도시된 바와 같이, 컨트롤 조건하에서 신생아 래트의 심근세포중의 포스포-이노시톨 턴오버에 있어서의 노르아드레날린 (300nM) 유도성 증가에는 화합물 2 (100 nM)의 첨가는 추가적인 영향을 미치지 않은 반면, 산소결핍증 및 글루코스 결핍 (대사성 스트레스)에 처한 세포들에 있어서는, 화합물 2 (100nM) + 노르아드레날린 (300 nM)을 첨가하자 손상된 포스포-이노시톨 턴오버가 정상화되었으며, 이러한 증가는 노르아드레날린 단독에 의해 영향받은 증가정도보다 약 70%가 더 높은 것이었다.

실험 실시예 5

마우스에 있어서 칼슘-유도성 부정맥 모델

Lynch 등의 모델^[37]에 따라 칼슘-유도성 부정맥의 생체내 모델에서 본 발명의 화합물의 항부정맥 효과를 테스트하였다. 마우스 (25-30g)를 신경이완성 마취제 배합물 (Hypnorm^?(펜타닐 시트레이트 0.315 mg/ml 및 푸아니선 10 mg/ml) + 미다졸람 (5 mg/ml))을 이용해서 마취시켰다. 시판되는 하이프놈 및 미다졸람 용액을 증류수에 1:1로 희석하고 희석된 Hypnorm^?1부를 희석된 미다졸람 1부와 혼합한다.

0.05 ~ 0.075 μl/10그램 마우스의 투여량으로 피하 투여함으로써 마취시켰다. 꼬리 정맥에 정맥내 캐뉼러를 삽입하였다. 우측 앞다리와 좌측 뒷다리에, 스테인레스 스틸 ECG 전극을 위치시킴으로써 선도 II ECG 시그널을 연속적으로 기록하였다. 접지전극을 우측 뒷다리에 위치시켰다. Hugo Sachs Electronic model 689 ECG 모듈을 경유하여 시그널을 증폭시키고 (x 5.000-10.000) 필터링 (0.1-150 Hz)하였다. 12 비트 데이터 포착 보드 (Data Translation 모델 DT321)을 경유해서 아날로그 시그널을 디지털화하고 Windows NT용 Notocord HEM 3.1 소프트웨어를 이용해서 1000 Hz에서 샘플링하였다. 10분의 평형기간 경과 후, 약물의 테스트 샘플을 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 비히클로 전-처리된 마우스를 미처리 동물에서의 컨트롤 수준의 척도로서 테스트하였다. 모든 실험에서 주사용량은 100 μl이었다. CaCl₂의 주입 (30 mg/ml, 0.1 ml/분 ≒ 100 mg/kg/분 (칼슘클로라이드-2-하이드레이트, Riedel-de Haen, 독일)은 약물 또는 비히클을 정맥투여한지 3분 후부터 시작하였다.

2등급 (2nd degree)의 AV-블록이 개시될 때까지의 시간 지연을, CaCl₂주입을 개시한 때부터, 최초의 부정맥이 발생할 때까지의 기간으로서 측정하였다. 2등급의 AV-블록 발발을 부대적 QRS 컴플렉스가 없는 P-파에 의해 특징지어지는 AV 전도의 간헐적 실패로서 정의하였다.

비히클로 처리된 마우스에 있어서 2등급 AV-블록이 일어날때까지의 시간에 상대적으로 응답을 표시하였다. 테스트된 물질 각각의 최대 효과를 다음 표 6에 정리하였다.

표 6에 나타낸 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 광범위한 신규한 화합물들은 종래기술의 화합물인 AAP, AAP10 및 HP5에 필적할만한 항부정맥 활성을 나타낸다.

실험 실시예 6

분리 관류된 토끼 심장에 대한 화합물 2의 효과

랑겐도르프 (Langendorff)기술의 원리

랑겐도르프 기술은 분리된 심장에 대해 적절한 대사요구성을 유지시키는 방법을 제공함으로써, 심장 전체에 대한 생체외 실험을 수시간 동안 가능케 해준다. 랑겐도르프 셋업에서는 대동맥에 삽입된 캐뉼러를 통해 심장을 역순으로 (retrogradely) 관류시킨다. 관류용액이 대동맥으로 들어가게 되면, 대동맥 내의 결과적인 압력이 대동맥 밸브에 근접하게 되므로, 심장 챔버내로 용액이 들어가는 것이 방지된다. 그 대신, 관류 용액은 심장에 공급되는 관상 순환 (coronary circulation)으로 유입된다. 랑겐도르프 기술에서는, 따라서, 대동맥 내에서의 총체적인 유량이 관상 유량과 동등하게 된다. 랑겐도르프 실험은 Hygo Sachs Elektronik (독일)사가 제조한 ISOLATED HEAR SIZE 5, Type 833 장치를 이용하여 수행한다. 이 장치의 중심 요소는 캐뉼러에 의해 심장과 부착되는 대동맥 블록이다. 대동맥 블록은 회전식 놉에 의해 작동하는 인공 유량 저항기에 직접 연결되기 때문에 후부하의 조절이 가능하며 따라서 관류압도 조절할 수 있다. 관류액은 롤러 펌프에 연결된 튜브에 의해, 항온 저장용기로부터 대동맥 블록으로 전달된다. 펌프에 전달되는 용량은 여러가지 필요에 부응하도록 조절될 수 있다. 과량의 유액은대동맥 블록으로부터 저장용기로 역류한다. 대동맥 블록 밑에는 심장을 덮도록 상승될 수 있는 항온 심장 챔버가 있다. 이와 같은 셋업은 관상 유량, 좌심실내압 (LVP: left ventricular pressure), 관류압, 12-리드 ECG, 및 8가지 단상성 활동전위 (MAP's: mohophase action potentials)의 연속적 기록을 가능케 해준다. 이러한 복수개의 기록 출력은 NOTOCORD HEM 3.3 소프트웨어를 이용하여 분석한다. 이 소프트웨어는 광범위 심장 전기생리학 및 혈류역학적 변수를 산출할 수 있게 해준다.

관류 기술 및 관류 매체

정압 관류 모드로 실험을 수행한다. 유량 펌프는 70 ml/분으로 설치하고 후부하는 50 mmHg로 세팅하여, 관류압이 대략 60 mmHg가 되도록 한다. 달리 언급하지 않는 한, 심장은 다음의 조성 (mmol/l), 즉: NaCl: 118, KCl: 4.7, CaCl₂,2H₂O: 2.52, KH₂PO₄: 1.18, Mg₂S₄,7H₂O: 1.64, 소듐 피루베이트: 2.0, NaHCO₃: 24.88, 글루코스 5.55의 조성을 가지며 예비-가온 (38℃)시킨, 변형 크렙스-헨젤라이트 (Krebs-Henseleit) 용액으로 관류시킨다. 이 용액은 사용 전에 45 μm 보틀톱 필터를 통해 여과시킨다.

카르보젠 (95% O₂/5% CO₂)를 끊임없이 버블링시킴으로써 이 용액이 약 7.4의 pH 및 적절한 산소 함량을 갖도록 한다. 2 리터 이상의 용량은 카르보젠을 이용하여 적어도 20분간 평형시키는 한편, 1 리터 미만의 용량은 10분간 평형시킨다.

마취, 외과수술 및 실험 공정

수컷 Ssc: Hvidesten, Allerod (덴마크)로부터 얻은 CPH 토끼 (2.5 - 4.0kg)를 사용한다. 1.2 ml의 Hypnorm? (펜타닐 시트레이트 0.315 mg/ml 및 플루아니손 10 mg/ml) i.m.에 의해 토끼들을 진정시킨다. 10분 후 0.55 ml의 Dormicum?(미다졸람 5 mg/ml)를 서서히 정맥투여함으로써 마취를 유도한다. 이에 더해, 응혈을 막기 위해 토끼들에게 500 IU의 헤파린을 정맥투여한다.

토끼를 등을 바닥쪽으로 하여 눕히고 앞다리를 옆구리에 고정시키고 기관 (trachea)을 노출시킨다. 기관절제술을 수행하고 Ugo Basile 설치류용 통풍기 (1회 환기량 : 18 ml, 빈도: 60 pr. min)를 이용하여 산소를 통기시킨다. 검상 돌기까지 꼬리쪽으로만 복강을 열고 복부 근육을 양측면 모두에서 절단한다. 흉강에 접근하기 위해 흉골하에서 횡경막을 열고 늑골 만곡부를 따라 양쪽 모두에서 확장 절개시킨다. 종격동 (mediastinum)을 가능한 한 흉골에 가까운 위치에서 절단하고 갈비뼈를 흉골에 평행하게 양쪽 모두에서 잘라내어 흉벽을 두개골 방향으로 들어올린다. 흉강 전체를 관찰할 수 있도록, 들어올린 흉벽을 토끼의 머리에 고정시킨다. 심막 주머니 (pericardial sac)을 열어서 대동맥을 노출시킨다. 대동맥 주위에 봉합사를 느슨하게 늘어놓는다. 심장으로의 역류를 감소시키기 위해 꼬리의 대정맥 (caudal vena cava)을 두개방식으로 간쪽으로 죄고, 두개 대정맥과 폐동맥을 열어 심장의 용량 과부하를 감소시킨다. 대동맥을 열고 관류액으로 충전된 확장 튜브에 의해 대동맥 블록에 연결된 커뉼러를 대동맥에 즉시 삽입하여 인공 관류시킨다. 봉합사를 팽팽하게 하고 심장을 절제하여 관류 기구에 옮긴다. 꼬리 대정맥을 조인 후부터 캐뉼러 삽입시까지 걸린 시간은 약 30초이다.

심장을 기구에 옮길때 심이(oricle)의 좌측에 절개부를 만들어, 좌심실압을측정하기 위해 유액이 충전된 풍선 (사이즈 12)을 좌심실에 삽입시킨다. 말기-심장확장압력이 약 10 mmHg가 되도록 풍선의 부피를 조절한다. 12-리드 ECG의 측정을 위한 전극 고리를 관상 고랑 높이로 위치시키고, 좌측 심이의 끝부분을 5번째 흉부유도와 6번째 흉부유도 사이로 한다. 심외막과 직접 접촉되도록 심장에 8 MAP 전극을 위치시킨다. MAP5와 MAP6을 우심실에 위치시키는 한편, 다른 MAP 전극은 좌심실에 균일하게 분포시킨다. 이 방법은 Zabel 등이 사용한 방법^[38]과 유사한 것이다. 모든 전극을 위치시킨 후 심장 챔버를 상승시켜 심장이 38℃ 크렙스-헨젤라이트 용액 중에 항상 침적되도록 한다.

실험 개시전에, 좌심실의 대부분의 공급을 담당하는 궁상만곡 동맥의 주가지 근처에 봉합사를 위치시킨다. 심장에 대해 플라스틱 튜브를 눌러서 봉합사 말단을 조임으로써, 허혈을 유도시킬 수 있는 소형 플라스틱 튜브를 통해 봉합사의 양 말단을 통과시킨다. 실험을 시작하기 전에 모든 심장을 15분간 평형시킨다.

실험 시간표는 다음과 같다:

1. 보통의 크렙스-헨젤라이트 완충액으로 15분간 관류시킨다 (평형 기간)

2. 보통의 크렙스-헨젤라이트 완충액에 첨가된 화합물과 함께 15분간 관류시킨다 (정상칼륨형 대조군 기간; t=0-15분).

3. K⁺농도가 감소된 (2.5 mM) 크렙스-헨젤라이트 용액에 첨가된 화합물과 함께 15분간 관류시킨다 (저칼륨혈증 대조군 기간: t=15-30분).

4. K⁺농도가 감소된 (2.5 mM) 크렙스-헨젤라이트 용액에 첨가된 화합물과함께 30분간 관류시킨 후 지엽적 허혈을 유도한다 (저칼륨혈증 허혈 기간; t=30-60분).

실험 말기에 심장을 에반스 블루 (Evans Blue) 염료와 함께 관류시켜 경색 위험 대역을 평가한다. 심방 및 우심실을 절단하고 남아있는 좌심실을 에반스 블루에 의해 염색된 대역과, 염색되지 않은 대역, 즉, 위험한 대역으로 나눈다. 이 두 대역을 종이 수건을 이용하여 건조 블로팅시키고 칭량하여 경색 위험이 있는 대역의 백분율을 구한다.

기록

다음의 변수들을 연속적으로 기록한다: 관상 동맥 혈류량, 좌심실압, 관류압, 12-리드 ECG, 및 8 MAP 개록. ECG와 MAP'은 2000 Hz에서 샘플링하고, 압력과 유동 변수들은 500 Hz에서 샘플링한다. 최대 탈분극화 시간 (dV/dT Max 시간)으로부터 90%의 재분극화가 일어난 시간까지의 평균 기간으로서 평균 활동전위지속시간을 8 MAP으로부터 산출한다. 이 기간을 APD₉₀이라 칭하며, APD₉₀분산을 APD₉₀의 8회 측정값의 표준편차로서 측정한다.

결과

도 5에 도시된 바와 같이, 3개의 그룹을 연구하였다. 토끼의 심장을 크렙스-헨젤라이트 완충액 단독 (비히클; n=11 실험), 10^-10mol/l 화합물 2, (n=10 실험) 또는 10^-10mol/l AAP10 (CE2; n=3 실험)을 이용하여 관류시켰다. 비히클-처리된 토끼 심장에서의 급성 심근허혈증, 저칼륨혈증이 일어나는 동안 관찰된 APD₉₀분산에 있어서의 증가는 10^-10mol/l의 화합물 2에 의해서는 방지되었으나, 10^-10mol/l의 AAP10 (CE2)에 의해서는 방지되지 못했다. 이러한 발견은 화합물 2가 허혈시 전기적 분산의 증가를 예방해준다는 것을 입증하는 것으로서, 화합물 2의 항부정맥 특성이 이 메카니즘과 관계가 있음을 시사하는 것이다. AAP10 (CE2)가 심외막 활성화-복구 간격의 분산을 감소시킬 수 있고, 토끼에서 국소적 허혈에 의해 유도된 심외막 활성화 패턴의 변경을 감소시킬 수 있다는 것이 이미 보고된 바 있다 (10^-8mol/l의 농도에서 최대 효과)^[39]. 우리의 실험에서는, 화합물 2는 10^-10mol/l의 농도에서 허혈시 유도된 전기적 분산의 증가를 효과적으로 방지하는 반면, AAP10 (CE2)는 이 농도에서 효과가 없었다. 허혈시 관상동맥혈류의 감소와 위험대역의 감소가 모든 그룹에서 유사하였기 때문에, 이러한 차이는 심근경색의 크기의 차이에 기인하는 것이 아니었다. 이러한 결과는 화합물 2가 AAP10 (CE2)보다 약효가 더 강력함을 가리키는 것이다.

실험 실시예 7

개에 있어서 심실 재입성 부정맥에 미치는 화합물 2의 효과

심실의 전도 특성에 있어서 코넥신 43 (Cx43)의 영향에 대한 연구를 통해 부정맥에 있어서의 간극 결합의 영향력이 밝혀졌다^[33]. Cx43이 결핍된 헤테로접합 녹아웃 마우스에는, 관상동맥혈류 폐색 (CAO: coronary artery occlusion)의 자연발색적 심실성 빈맥 (VT) 빈도가 두배나 높다^[3]. 허혈은 엔드-투-엔드 Cx43의 60% 감소를 나타내고 사이드-투-사이드 Cx43의 49% 감소를 나타내는 개에 있어서 6시간 후, Cx43의 효과를 다운-레귤레이션하는데, 이는 아마도 탈포스포릴화에 부수적인 듯 하다. 개에 있어서 아급성 허혈시, Cx43이 감소된 대역에서는 심외막 재입이 쉬워진다^[25]. 따라서, 재입 메카니즘은 허혈에 의해 매개된 Cx43의 다운 레귤레이션 및 아마도 전도 특성과 회복의 이질성을 VT 및 VF에 걸리기 쉽게 하는 간극 결합의 저항에 임계적으로 (critically) 의존하는 것일 수 있다.

후술하는 연구에서, 본 발명자들은 정면 하방 동맥 (anterior descending artery)의 CAO에 의해 유도된 심근 허혈시 재입성 부정맥에 미치는 화합물 2의 효과를 시험하였다.

동물 준비

맵 작성을 위해 전극을 꽂기 쉽게끔 마취시켜, 가슴을 열어 젖힌 상태의 세마리의 개를 대상으로 연구하였다. α- 클로랄로스를 큰 환약 (200mg/kg) 형태로 투여한 다음 8 mg/kg/시간 (폴리에틸렌 글리콜 중에 용해시킴, MW=200)으로 일정하게 주입하였다. 플루이드와 약물의 투여및 상승 대동맥 압력을 측정하기 위해, 각각 대퇴골 정맥과 동맥에 캐뉼러를 삽입하였다.

전기생리학적 방법

동방결절을 조이고 심방 속지를 2배 확장기 역치에서 일정 전류 출력을 갖는 프로그램가능한 자극제를 이용하여 박동시켰다. 심박수를 조절하기 위해 박동 속도는 ≥200 b/분이 되도록 하였다. 심실 박동 정상 대역 중 다극침의 일극 박동 심실은 복부 근육 중 음극 (7 cm²스테인레스 스틸)을 사용하였다. 표준 엑스트라자극 기술을 이용하여 심장내 유효불응기 (ERP: effective refractory period)를 측정하였다. 각각의 개입시 늦은 심실 확장역치를 측정하였다; 박동 전류는 역치의 4배였다.

전위도 기록

16 극침의 골간을 따라 테스트 부위를 선택하였다 (J. Kassell, Fayetteville, NC); 각각의 극은 인접 푸르키니에 스트랜드 기록값으로부터의 바늘 오리엔테이션의 지향성을 방지하기 위해 바늘 골간 주변을 완벽히 감싼다. 1000배까지 증폭시켜, 3-1300 Hz로부터 필터링하고 심방 박동시 오실로스코프를 통해 기록함으로써 바늘 골간을 따라 순서적으로 아래쪽으로 6개의 쌍극 전위도 (1 mm 간격)을 기록하였다. 4개의 벽내의 (intramural) 전위도를 각각의 다극침 상에 기록한다. 각 바늘에 대해 심외막 전위도를 활성화시킨다. Xing 및 Martins^[41]이 설명한 바와 같이, 정면의 하방 관상혈류동맥 중 17곳의 경색 위험 대역과 주변의 정상 대역 중 6곳에 대해 23개의 다극성 전극의 어레이를 이용하였다. 심외막 상에서 측정된 바늘간 거리는 12 ~ 16 kg의 개에 있어서 6-10 mm 범위였다.

부정맥 유도

심외막을 위험대역 바로 바깥의 측면 유리벽과 베이스, 첨단 격막에서 박동시켰다. ERP 측정 후, S1-S2 간격을 4 msec>ERP에 의해 연장시키고 최초에 S2-S3간격이 50 msec>S1-S2와 동일한 프로토콜에 S3을 부가하였다. 부전이 포획될 때까지 이 간격을 단축시켰다. 심실성 빈맥이 어떠한 박동 부위에서도 유도되지 않으면, 세번째 (S4)와 네번째 (S5) 엑스트라 자극을 가하였다. 본 발명자들은 혈류를 손상시키는 바늘로 인한 허혈이나 바늘 매스에 기인하는 인공산물 심실성 빈맥을 배제하기 위해, CAO에 앞서 완전한 심실성 빈맥 유도 프로토콜을 수행하였다. 생리적 혈액 기체 및 적절한 마취를 확인 한 후, 정면 하방 CAO를 접합시켰다. 60분 후 경색 크기는 위험 대역의 거의 75%였으며 경색 대역의 추가 확장은 무시할만 하였다. 이어서 개입 전 심실성 빈맥을 적어도 2회 유도시켰다. 반복 테스팅을 매 20분마다 수행하였고 CAO 후에 3시간 동안 지속하였다. 정상적인 심장 근육 ERP를 각 개입마다 기록하였다.

부정맥 지도작성

BARD Electroophysiology Inc.사로부터의 컴퓨터 시스템을 이용하여 심외막의 지도작성 (mapping)을 수행하였다. 이 소프트웨어는 1 kHz/채널의 샘플링 주파수화 함께 12-비트 레절루션에서 64개의 데이터 채널을 처리한다. 필터링은 30-300 Hz였다. 트리거 시그널에 앞서 8 초까지의 데이터를 포함하여 8-초 윈도우가 외부적으로 트리거된다. 이 시스템은 각각의 기록 전극 상에서 외부의 심외막의 2-3 쌍극으로부터 기록하는데 이용된다.

채널 당 3 kHz에서 샘플링함으로써 각각의 심내막의 다극성 전극 상에서 내부의 3개의 쌍극으로부터의 푸르키니에 시그널을 해석하는기 위해, 사용자 편의에 맞게 설정된 컴퓨터 소프트웨어 시스템을 이용하였다. 필터는 푸르키니에 주파수(3-1300 Hz)를 인코포레이션한다. 샘플링 속도는 235 kHz였다. 아날로그 시그널 멀티플렉서와 64개의 인스트루먼트 증폭기 회로로 이루어진 증폭기와 PC를 인터페이스시켰다. 각각은 선택가능한 진폭비 (1000 이하), 대역폭 컷오프를 가졌다. 소프트웨어를 이용하여 전기생리학적 데이터를 포착, 가공 및 가시화시켰다. 고속 포착이 가능하였기 때문에 트리거 시그널 전 8초까지를 포함하여 14초의 데이터를 처리할 수 있었다.

지도작성 분석

지도작성 분석은 오프라인으로 실시하였다. 컴퓨터는 최초의 최대 dv/dt를 이용하여 활성화 시간을 선택한다. 전위도는 자극으로 재생불가능할 때만 해석 불가능한 것으로 고려하여 지도작성시 배제하였다; 전위도의 전압에 기초해서는 어떠한 배제도 하지 않았다.

커플링 간격이 불응기 (refractoriness)보다 짧은 컴플렉스에서 실질적인 전압 및 dv/dt 손실이 발생할 경우 전자적 또는 원거리계 전위가 존재하는 것으로 교라된다. 등시선을 손으로 그린다. 심실성 빈맥의 메카니즘은 다음과 같이 정의된다: 재입성 심실성 빈맥은, 전극이 일방향성 블록이 이전의 컴플렉스로부터의 최근의 활동 부위에 바로 인접하여 위치한 후에 발생하는 최초 활동을 기록하고, 컴플렉스들 간에 이완 활동이 기록되는 지점에서 발생한다. 심외막 재입은 대부분 항상 급성 허혈에서 기록되므로, 벽의 역행성 활성화 (심외막에서 심내막으로)가 관찰된다.

실험 프로토콜

심장 계측 및 1시간의 CAO를 수행한 후, 심실성 빈맥을 유도하기 위한 박동 프로토콜을 수행하여 유도 실패인지 (한시간 동안 심실성 빈맥없이 3곳 모두에서 2회씩 박동) 또는 재생성 유도 (유사한 표면 형태학을 갖는 심실성 빈맥을 2회 유도)인지를 확인하였다. 재유도성 심실성 빈맥을 나타낸 세마리의 개에 있어서 재입 매카니즘이 동정되었다. 이 세마리 개들에게 화합물 2를 정맥 볼러스로서 주사 투여한 후 30분 후에 2마리에 있어서는 세가지 투여량 레벨로 30분간 일정하게 주입하고, 세번째 개는 염수로 처리하였다. 심실성 빈맥이 존재하는지 여부를 가리기 위해 모든 부위에서 전체 프로토콜을 통해 엑스트라 자극 테스트를 반복수행하였다. 화합물 2를 3가지 투여량 수준으로 정맥주사 투여하여 각각 10^-10M (볼러스: 0.1 μg/kg; 주입: 2 ng/kg/분), 10^-9M (볼러스: 1.1 μg/kg; 주입: 21 ng/kg/분), 및 10^-8M (볼러스: 11μg/kg; 주입: 210 ng/kg/분)의 혈장농도를 얻었다.

결과

CAO에 이어 2시간 10분 후에 발생하고 연속적으로 2시간 20분 후에 반복된 측생 심실성 박동 부위로부터만 지속형 단형성 심실성 빈맥 (VT)이 유도된 후, 첫번째 개에 대해 연구를 수행하고 도 6~9로 표시하였다. 도 6에, VT를 유도하는데 실패한, 격벽 자극 후의 활성화 지도가 제시되어 있다. 이것은 자극한지 6 msec후의 PURK 박동부위의 조기 활성화 및 107 msec에서 활성화된 심외막 부위의 늦인 활성화를 나타내는 정상적인 오르토급 활성화 패턴을 보여준다. 심외막 상의 가장 늦은 활성화의 바로 동쪽 및 바로 남쪽의 86 msec에서의 인접 활성화 시간이 도 7의E-S임을 주목한다. 표면 QRS 개시 전 -44msec에 개시되고 도 7의 E-C에 기록된 전위도에 대응하는 VT의 최초 컴플렉스의 심외막 활성화.

도 7에, 재입 서킷을 일으키는 측생 심외막 심실 박동에서의 자극에 의해 유도된 지속형 단형성 심실성 빈맥 (VT)이 도시되어 있다. 활성화는 -17 msec에서 이중 루프 재입 활성화로 진행한 다음 북서쪽 루프 상에서 57 msec로 진행한다. 남동쪽 루프 활성화는 먼저 2 msec, 31msec, 그리고 57 msec에서 일어난다. 심실성 빈맥을 유도하는 프로토콜은 S1-S2=150, S1-S3=280, S1-S4=390, S1-S5=490 msec여ㅕㅆ다. 이 도면은 확실한 4가지 VT 컴플렉스와 함께 제 2의 50번째 조발성 엑스트라-자극 (E-L 상에서 가장 잘 보임)이 일어나는 동안 표면 리드 ECG II 및 VR5와 함께 기록된 심외막 (E-) 전위도를 도시한다. 이 전위도는 측부, 경계 대역 (L) 박동 부위 및 동쪽 (E), 북쪽 (N), 중심부 (C), 외피막하 (SE), E-C 아래 뿐만 아니라 E-C의 남쪽 (S) 및 북동쪽 (NW) 및 남서쪽 (SW)으로부터 기록된 것이다. E-C는 점차 해리되는 전위도를 보여주며 가장 마지막의 조발성은 2차 요소 차단을 나타낸다 (수직선). ES 상의 인접한 전도 지연은 전도가 진행되도록 하여 EC와 ES(직선 및 화살표 표시선) 사이에 계속되는 재입 흥분과 함께 중심부 (EC)로 돌아오도록 한다.

도 8은 표면 QRS 개시 전 -44 msec에서 개시되며, 도 7의 E-C에 기록된 전위도에 대응하는, 심실성 비맥의 최초 컴플렉스의 심외막 활성화시의 활성화 지도를 도시한 것이다. 활성화는 -17 msec에서 최초로 이중 루프 재입 활성화 진행한 다음, 북서쪽 루프 상에서 57 msec로 진행한다. 남동쪽 루프는 처음 2 msec, 31 msec이어서 57 msec에서 활성화한다. 이 활성화 지도는 또한 재입 부정맥이 일어나는 동인 심실벽의 역행성 활성화도 도시한다.

화합물 2를 점진적으로 증가되는 IV 투여량으로 투여하였다. 이것은 평균 동맥압을 변경시키지 않았다 (MAP = 80 mmHg). 대조군에 있어서의 유효 불응기은 최저량 투여 후 150 msec, 154 msec였고 최고량 및 최후 투여 후에는 148 msec였다. 유도성 VT는 도 7과 도 8에 도시된 전형적인 심외막 재입이었다. 화합물 2의 투여 전, 유도 프로토콜에 의해 유도된 VT가 재생적으로 달성된다는 사실에도 불구하고, 화합물 2의 최초 투여 (볼러스: 0.1 μg/kg; 주입: 2 ng/kg/분) 후에는 VT가 더 이상 유도되지 않았다; 약물 투여 전 VT를 유도한 프로토콜은 S1-S2=150, S1-S3=280, S1=S4=390, S1-S5=490 msec였으며 화합물 2의 주입시 그 간격은 각각 150, 270, 370 및 470 msec였다. 화합물 2의 최저 투여량 주입 개시 후 1시간 30분 전에는 VT가 유도되지 않았다. 화합물 2의 최저 투여량을 정맥 투여한 후의 심전도 기록값을 도 9에 나타내었다. 이러한 결과들은 화합물 2가 이 개에 있어서 재입성 VT를 효과적으로 차단함을 입증하는 것이다.

두번째 개에 대해서는 유도성 VT에 대해 연구하였다. 이번에는 2개의 경계 대역, 즉 측부 (laaterally)와 격벽쪽 (septally)에 위치한 박동 부위에 대해 연구하였다. 이 실험에서도 화합물 2는 90 mmHg에서 시작하여 90 mmHg에서 종결된 MAP에 있어서 아무런 변화를 일으키지 않았다. 2개의 유도 부위에서의 유효 불응기는 CAO 후 85분에서 시작하여 2시간 더 지속된, 화합물 2의 테스트 기간 내내 각각 1643 및 144 msec로 유지되었다. 화합물의 최저량 투여 후, 측부벽으로부터 유도된VT는 더 이상 유도성이 아니었으며; 이 VT의 메카니즘은 도 7-9에 도시된 것과 매우 유사한, 심외막 재입이었다. 격벽 부위로부터 유도된 VT 역시 화합물 2의 투여 전에는 심외막 재입이었으나, 화합물 2의 정맥 투여 후에는 심외막 재입이 완전히 차단되었다. 따라서 이들 두가지 실험에서 심외막 재입 VT는 화합물 2의 최저량 투여 유도 전에는 유도가능하나 기질 투여 후에는 어떠한 투여량에서도 재입이 재유도되지 않았다. 마지막으로 남은 개 한마리에 대해서는 화합물 2가 아니라 염수를 이용하여 상술한 두가지 실험을 수행함으로써 타임 프레임에 따른 전기생리학적 테스트를 수행하였다. CAO 1시간 후에 심외막 재입이 유도되고, CAO 1 ½- 2½후에 동일한 VT 형태와 재입 메카니즘이 유도되었다. 따라서, 이 통제 실험에서의 재입 VT의 재생성은 재입 부정맥 증상이 진행되는 동안 화합물 2가 효과적인 항부정맥 화합물이라는 것과 잘 일치한다.

이러한 실험들은 화합물 2가 치명적인 재입 부정맥의 예방 및/또는 치료에 효과적임을 입증해주는 것이다. 따라서, 본 발명의 한가지 목적은 상심실 (supraventricular)의 또는 심실 기원의 심장 재입 부정맥의 예방 및/또는 치료에 유용한 약제를 제조하기 위한 화합물을 제공하는 데 있다. 이러한 목적은 본 명세서에 개시된 본 발명의 펩타이드 화합물, 예컨대 식 I 내지 VIII, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물, 더욱 구체적으로는, 이하의 합성 실시예 1-55에 더욱 구체적으로 제시된 화합물에 의해 달성된다.

실험 실시예 8

골 세포에 대한 간극 결합 오프너의 효과

배경

골-형성 세포인 골아세포 (osteoblasts), 및 골세포는 긴밀히 연결되어 있다. 골아세포-골아세포, 골아세포-골세포, 및 골세포-골세포 연결이 골편에서 발견되어 전자 현미경으로 조사되었다^[42]. 뼈와 관련한 가장 흥미로운 코넥신은 심장에서와 마찬가지로 Cx43이다. 골 세포에 있어서, 이들 단백질의 발현은 몇몇 골아세포 특이적 단백질의 발현과 관련이 있다. 칼슘 지향성 (calciotropic) 호르몬 역시 간극 결합 단백질의 발현을 조절할 수 있다.

인간의 골아세포 (HOB: human osteoblasts)와 골수 유도 기질 세포 (BMSC: bone marrow derived stromal cells)는 두가지 모두 Cx43과 Cx45를 발현하는 것으로 나타났다. 이들은 루시퍼 옐로우 (LY: Lucifer Yellow) 염료 전이 기술^[43]에 의해 입증된 바와 같이 기능적으로 커플링되어 있다. 래트의 골아세포주는 인간의 일차 배양체와 다르다; ROS 17/2.8 세포들은 Cx43만을 발현하며, 잘 커플링되는 반면, UMR 106-01은 Cx45를 우세하게 발현시키고 염료와는 거의 커플링되지 않는다^[44]. 이들 두가지 쥐의 골아세포는 전기적으로 커플링된다. Cx43을 UMR 세포에 트랜스펙션시키면 염료에 잘 커플링되는 세포가 얻어진다. 따라서, Cx43은 LY와 기타 큰 세포의 전이를 가능하게 하는 반면, Cx45는 이러한 이동을 허락하지 않는다. 이와 대조적으로, Cx45를 Cx43 발현 세포에 도입하면 염료 커플링이 저하된다. 골아세포 분화시, Cx43 발현이 변화한다; 따라서, 골아세포가 더 성숙해질수록,Cx43 발현도 더 높아진다^[45].

골 세포에 대한 상이한 여러가지 자극의 효과와 간극 결합 커뮤니케이션에 있어서의 변화에 대한 관계가 연구되었다. 뼈에 대해 온화한 기계적 스트레스를 가하면 골 밀도가 증가된다는 것이 잘 알려져 있다. 이러한 상황을 모방하기 위해, ROS 17/2.8 세포들에게 사이클릭 스트레스를 가하자, 세포의 염료 커플링이 증가되었다. 커플링이 저조한 UMR 106-01에 사이클릭 스트레스를 가하자 염료 커플링이 역시 증대되었으나, ROS 세포에서만큼 현저히 증가한 것은 아니었다. Cx43에 있어서는 mRNA 증가가 발견되지 않았으나, Cx43이 보다 많이 포스포릴화된 형태로서 관찰되었으며, 이는 골아세포에 대한 사이클릭 스트레스가 간극 결합 단백질 Cx43의 세포내 위치를 변경시킴으로써 세포들간의 간극 결합 커뮤니케이션을 증가시킴을 가리키는 것이다. Cx43을 커플링이 제조한 UMR 106-01 세포내로 트랜스펙션시킬 경우 염료 커플링 증가 뿐만 아니라^[46], 성숙한 골아세포, 오스테오칼신 및 골 시알로단백질 (BSP: bone sialoprotein)의 산물 발현도 증가된다는 것이 동일한 그룹에 의해 밝혀졌다. Cx45의 세포 트랜스펙션에 의한 골아세포들 (ROS) 간의 커플링 감소는 오스테오칼신 및 BSP, 골 매트릭스 형성 석회화에 중추적 역할을 하는 유전자들의 발현을 감소시킨다. 최근의 연구결과에 따르면 Cx43 녹-아웃 마우스는 야생형 마우스에 비해 골 형성 및 골 발달이 저조한 것으로 나타났다^[47]. 따라서, 정상적인 골 형성 및 턴 오버 뿐만 아니라 분화된 골아세포 표현형을 완전히 이해하는데 있어서도 커뮤니케이팅 세포간 네트웍이 요구된다.

간극 결합은 또한 골 세포에 있어서 세포간 칼슘 시그널의 전파에도 일부 책임이 있는 것으로 나타났다. 생체외에서 세포 단층 중 인간 골아세포를 기계적으로 자극하면, 칼슘 펄스가 유도되며, 이것은 곧 주변의 여러 세포로 전파된다. 이러한 시그널 전파는 이웃 세포들의 후속적 활성화와 더불어, 간극 결합을 통한 메신저 분자의 이동과 연관이 있다^{[48; 49]}. 이러한 시그널은 기계적 자극에 응답하여 생체내에서 골중 세포 네트웍을 통해 전파되는 듯 하며, 뼈에 대한 기계적 부하에 응답하여 일어나는 골 형성 증가의 원인이 될 수 있다.

간극 결합 커뮤니케이션과 칼슘지향성 호르몬의 효과는 연관이 있다. 인간의 피부아세포를 1,25 (OH)₂비타민 D₃로 자극하면 Cx43 단백질 농도와 mRNA의 농도가 증가할 뿐만 아니라 기능성 비타민 D 수용체 (VDR: vitamn D receptors)의 존재시에도 간극 결합을 통한 커뮤니케이션이 증가되는 것으로 나타났다^[50]. Cx43의 발현이 손상되면 PTH 수용체의 숫자나 cAMP 응답에는 아무런 변화 없이, PTH에 대한 세포의 응답성이 감소하는 것으로 나타났다^[51]. 다른 한편, PTH와 PGE2는 두가지 메카니즘을 통해 골아세포 배양체에서 간극 결합 커뮤니케이션을 증대시킨다; 그 하나는 세포막으로의 Cx43의 초기의 신속한 재분포이고, 다른 하나는 Cx43 유전자 발현의 후기 자극이 그것이다^[52]. 따라서, 세포간 커뮤니케이션의 변형은 골지향성 인자들이 골 형성 세포의 활성을 조절하는 메카니즘을 대표한다.

간극 결합 세포간 커뮤니케이션은 골 세포들이 그들의 활성 및 기계적 자극과 호르몬 자극에 대한 그의 응답을 조화시키는 가장 중요한 메카니즘의 하나일 수 있음을 잘 입증해주는 것일 수 있다. 따라서, 골 세포들 간의 간극 결합 커뮤니케이션이 약리학적으로 증가될 수 있다면, 골아세포 활성도 증가될 것이고, 생체내에서의 골 형성도 촉진될 것이다.

골아세포에서처럼, 심근 세포들도 간극 결합에 의해 연결되며 가장 우세한 코넥신은 Cx43이다. 어떤 화합물들은 심근 세포들간의 간극 결합 커뮤니케이션을 증가시키는 것으로 밝혀졌는데, 그 중에서도, 인공 합성된 AAP10 (CE2)는 가장 많이 연구되었다. 심근세포는 세포 커플링 감소와 더불어 허혈에 응답한다. 생체외 실험에서, 허혈에 노출된 심근 세포에 AAP10 (CE2)를 첨가하자, 손상된 세포 커플링이 어느 정도 복구되었다. 이들 화합물 군에 대해 심근세포가 간극 결합 커플링의 증가와 더불어 응답할 수만 있다면, 골아세포들도 같을 것이다. 이 경우, 세포 커플링의 증가가 골아세포 성숙 및 활성화, 그리고 그에 따른 골 형성 증대를 수반할 것임이 자명하다. 이러한 추론을 연구하기 위해, 본 발명자들은 인간 골아 세포와 래트의 골육종 세포에 있어서 GJIC에 대한 화합물 2의 효과를 연구하였다. 뿐만 아니라, 본 발명자들은 인간의 골아세포 활성과 골 형성에 있어서 마커 (즉, 알칼라인 포스파타제)에 미치는 화합물 2의 효과에 대해서도 연구하였다.

방법

세포 배양

인간의 골아세포 (hOB): 건강한 지원자 (20-36세)의 배면 장골척추에 천공함으로써 얻은 인간의 골수로부터 세포를 분리하였다: 10-25 ml의 골수 물질을 100U/ml 헤파린 (Sigma, Cat.No. H-3149)와 함께 15 ml PBS+Ca,Mg (Life Technologies, Cat. No. 14040)에 수집하였다. 2200 rpm에서 30분간 원심분리함으로써 골수의 단핵성 단편을 Lymphopreg 구배 (Nycomed Pharma, Cat. No. 1001967)상에 분리시켰다. 수확 후, 단핵성 분획을 배양배지로 한번 세척하고 1800 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 이어서 세포를 계수하고 8 x 10⁶세포/100 mm 디쉬로 배양 배지에 플레이팅시켰다. hOB 배지 (모든 시약은 Life Technologies사 제품이었음): 0.5% 페니실린/스트렙토마이신 (Cat.No. 15140)과 10% 열불활성화된 소의 태아 혈청 (Cat.No. 10106)이 보강된 MEM w/o 페놀 레드 w/Glutamax (Cat.No. 041-93013). 다음날 배지를 갈아주고 세포를 5% CO₂중, 37℃에서 매 7일마다 배지를 갈아주면서 배양하였다. 배양 3-4주일 후, 세포들은 70% 컨플루언스에 도달하였다. 이어서 7일간 100 nM 덱사메타손 (Sigma, Cat.No. D-4902)을 배지에 보강하였다. 이어서 세포를 비디오 영상 실험을 위해 플레이팅하였다: 25 mm #1 유리 커버슬립을 35 mm 디쉬 (또는 6-웰 멀티디쉬의 각각의 웰)에 위치시키고, 세포를 2.5 x 10⁵세포/커버슬립으로 플레이팅시킨 다음 사용하기 전에 2-3일간 배양하였다.

ROS 17/2.8 세포: 세포를 5% CO₂중 37℃에서 100 mm 디위 중에서 배양하고 배지를 매 2-3일마다 갈아주었다. ROS 배지 (모든 시약은 Life Technologies사 제품이었음): 10% 열불활성화된 소의 태아 혈청 (Cat.No. 16170), 1% NEAA (Cat.No. 11140), 1% 소듐 피루베이트 (Cat.No. 11360), 1% L-글루타민 (Cat.No. 25030) 및0.1% 페니실린/스트렙토마이신 (Cat.No. 15140)이 보강된 MEM (Cat.No.31095). 비디오 영상 실험을 위해 세포를 2 - 3 x 10⁵세포/커버슬립으로 커버슬립 상에 플레이팅시키고 사용하기 전 2-3일간 배양하였다.

칼슘 웨이브의 측정

커버슬립 상에 배양된 세포에 37℃에서 30분간 5 μM 푸라(fura)-2-AM (Molecular probes, Cat.No. F-1221)을 로딩시키고 신선한 배지에서 20분간 인큐베이션시켰다. 이어서, 커버슬립을 PDMI-2 배양 챔버 (Medical Systems Corp.)에 고정시키고, 37℃에서 수퍼퓨징된 CO₂와 함께 Zeiss Axiovert 현미경 상에서 유지시켰다. Eppendorf 5171 마이크로매니퓰레이터에 고정된 보로실리케이트 유리 마이크로 피펫을 이용하여 단일 세포를 기계적으로 자극함으로써, 세포간 칼슘 웨이브 (intercellular calcium waves)를 유도하였다. MetaMorph 영상화 시스템 (Universal Imaging)을 이용하여 영상화시켰다. 단색화장치 (T.I.L.L. Photonics GmbH)를 이용하여 여기광 (340 및 380 nm)을 제공하였다. 보력 CCD 카메라 (Dage MIT)로 영상을 얻고 Matrox MVP 이미지 프로세싱 보드를 이용하여 디지털화하였다.

마이크로인젝션

커버슬립 상에서 배양된 세포들을 상기한 바와 같이 현미경에 놓았다. Eppendorf 5171 마이크로매니퓰레이터 및 Eppendorf Transjector 5346 시스템을 이용해서 마이크로인젝션을 수행하였다. 마이크로피펫에 10 mM 루시퍼 옐로우 (LY) 용액 (Sigma, Cat.No.L-0259)를 로딩하였다. 단층 중의 세포에 LY를 30초간 조심스럽게 주사하고, 마이크로피펫을 세포로부터 제거한 다음 30초 후에 염료 이동을 나타낸 세포의 수를 세었다. LY에 대한 여기광은 430 nm였고, 상술한 바와 같이 영상을 얻었다.

알칼라인 포스파타제 분석

제 1일: 200 μl 정상 배양배지 중에 8000 세포/웰 (hOB) 또는 3000 세포/웰 (ROS)의 농도로 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅시켰다.

제 2일: 세포 배지를 갈아주었다.

제 4일: (ROS의 경우 제 3일): 세포를 200 μl MEM, 0.1% BSA (Sigma, Cat.No. A-9418)로 세척하였다. 화합물 2를 여러 농도로 함유하는 0.1% BSA, 200 μㅣMEM을 세포에 첨가하고 4일간 계속 배양하였다 (ROS 세포의 경우 2일간).

제 8일: (ROS의 경우 제 5일): 알칼라인 포스파타제 (ALP) 분석은 효소 활성을 측정하기 위한 비색종말점 방법으로서, 알칼라인 포스파타제 키트 (Sigma, Cat.No.104-LL)을 이용하여 수행하였다: 세포들을 200 μl PBS + Ca,Mg로 1회 세척하였다. 100 μl 알칼라인 완충용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 10분간 방치하였다. 100 μl의 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 30분간 인큐베이션시켰다. 100 μl의 2.0N NaOH를 각 웰에 첨가하여 반응을 중단시켰다. 405 nm에서 플레이트 리더를 이용하여 흡수도를 측정하였다.

GJIC에 대한 화합물 2의 효과

간극 결합 매개 세포간 칼슘 시그널을 경유한 커뮤니케이션을 증대시킬 수 있는 간극 결합 변형제의 능력을 평가하기 위해, 유리 커버슬립 상의 인간의 골아세포의 단층을 푸라-2로 로딩하였다. 실시간 영상화가 진행되는 동안, 유리 마이크로피펫을 이용하여 기계적 자극을 주었다. 세포내 칼슘 증가가 나타났으며 후속적으로 주변 세포로 시그널이 전파되었다. 웨이브 (wave) 중의 세포의 평균 수는 6.5개였다. 이어서, 퓨린계 (purinergic) 수용체를 탈감작화시키기 위해 100 μM 아데노신 트리-포스페이트 (ATP)를 첨가하였다. 탈감작 (desensitization) 후, 칼슘 웨이브 전파는 GJIC에만 의존한다. ATP 자극 후, 관찰가능한 대역의 대부분의 세포에서 세포내 칼슘이 증가된 것으로 관찰되었다. 다시 한번, 하나의 단일 세포를 기계적으로 자극하였다. 이제, 웨이브 전파는 웨이브 당 단지 평균 4.5개의 세포만으로 제한되었다. 화합물 2를 10^-8mol/l의 농도로 배딩 용액에 첨가하였다. 관찰가능한 대부분의 세포에서 세포내 칼슘 농도의 증가가 관찰되었다. 화합물 2와 함께 10분 동안 인큐베이션시킨 후, 하나의 단일 세포를 기계적으로 자극하였다. 이번에도, 자극된 세포는 이어지는 웨이브 전파와 함께, 세포내 칼슘 농도가 증가되었다. 이번에는, 웨이브가 평균 6.2개의 세포로 확장되었는데(도 10), 이는 화합물 2를 첨가하기 전에 비해 현저히 증가한 것이다.

억압된 간극 결합 커플링을 복구하는 화합물의 능력을 시험하기 위해, 골아세포주 ROS 17/2.8 (ROS)에 대해 수행한 것과 유사한 실험을 수행하였다. 단 이때, 세포 커플링을 감소시키는 것으로 알려진 조건인 단지 3-6% O₂를 이용하는 저산소 조건 하에서 세포를 48시간 동안 인큐베이션시킨 후에 사용하였다. 단층 중의 ROS 세포에 푸라-2를 로딩시키고 상기한 것과 동일한 조건 하에서, 기계적 자극을 수행하였다. ROS 세포는 퓨린계 수용체를 발현하지 않기 때문에, ATP에 의한 전-처리는 행하지 않았다. 자극을 가한 후, 세포내 칼슘 농도는 자극된 세포에서 증가하였으며, 웨이브가 개시되어 총 평균 2.2 세포로 확장되었다 (n=18). 이어서, 화합물 2를 최종 농도 10^-8M이 되도록 배딩 용액에 첨가하였다. 10분 후, 기계적 자극을 반복시켰다. 웨이브가 평균 5.4개의 세포 (n=18)로 확장하였으며 (도 11), 이는 이 화합물을 첨가하기 전에 비해 현저히 증가된 것이다. 따라서, 화합물 2는 간극 결합 매개된 세포간 칼슘 웨이브를 효과적으로 증대시킨다.

이 화합물이 직접 적인 세포 커플링에 미치는 효과를 평가하기 위해, 상기 설명된 방법에 따라 마이크로인젝션 실험을 수행하였다. 염료 루시퍼 옐로우 (LY)를 단층 중 하나의 단일 인간 골아세포내로 주입하였다. 30초 후, 염료를 함유하는 세포의 수를 세었다. 생리적 조건 하에서는, 염료가 평균 14개의 세포 (n=19)로 퍼졌다. 세포 커플링을 억제하기 위해, 세포를 저산소증 (3-6% O₂) 분위기에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다.이어서, LY를 마이크로인젝션함으로써 세포 커플링을 재평가하자 이 시점에서, 염료는 오직 평균 7개의 세포 (n=10)로만 이동하였다. 화합물 2를 배지에 첨가하고, 10분 후, 염료 커플링을 다시 평가하였다. 화합물2와 함께 인큐베이션된 10분 후, 세포 커플링은 9개의 세포로 염료가 이동 (n=11)됨과 함께 증가하였다.

ROS 세포에 대해서도 유사한 실험을 수행하였다. ROS 세포에 있어서 생리적 조건 하에서 기본적 커플링은 12개 세포 (n=19)였다. 3-6% O₂에서 48시간 인큐베이션 후, 염료 이동의 감소는 9개의 세포에서 관찰되었다 (n=27). 다시, 화합물 2를 배딩 용액에 첨가하고, 세포 커플링을 저산소증 이전의 수준으로 복구시키자 평균 12개의 세포로 염료가 이동하였다 (n=27), (도 12). 따라서, 화합물 2는 간극 결합 커뮤니케이션을 증가시켜 저산소증-유발된 세포 커플링의 감소를 회복시킬 수 있다.

저혈당증에 의해 유도된 대사성 스트레스 역시 간극 결합 커뮤니케이션을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 화합물 2가 세포 커플링에 있어서 저혈당증-유도된 이러한 감소를 역전시킬 수 있는지를 평가하고자 하였다. 인간의 골아세포를 유리 커버슬립 상에서 단층 배양시켜 푸라-2를 로딩시켰다. 상기한 바와 같이 ATP 탈감작 후, 하나의 단일 세포를 기계적으로 자극하고, 웨이브 중의 세포 수를 기록하였다. 이 일련의 실험에서, 웨이브는 평균 3.2개의 세포로 확장되었다 (n=19). 글루코스가 없는 배지로 배지를 갈아주고, 8분 후, 또 다른 기계적 자극을 주었다. 이번에는 웨이브가 거의 차단되었으며, 단지 1.4개의 세포에만 웨이프가 전파되었다 (n=20). 화합물 2를 최종 농도 10^-8M이 되도록 배지에 첨가하였다. 최종 자극을 수행하자, 웨이브가 거의 복구되었으며, 평균 2.9개의 세포에로 확장되었다 (n=18), (도 13). 따라서, 화합물 2는 저혈당증-유도된 세포의 언커플링을 복구할 수 있다.

마지막으로, 골 형성 및 골아세포 활성에 미치는 화합물 2의 효과를 알아보기 위해, 본 발명자들은 세포의 알칼라인 포스파타제 (ALP) 활성에 미치는 이 화합물의 효과를 측정하였다. 인간의 골아세포를 1 x 10^-13내지 1 x 10^-6에 달하는 여러가지 농도의 화합물 2로 자극하고, 미처리 대조군의 경우와 비교하였다. 정상적인 배양 조건 하에서, 화합물 2는 유독할 수도 있는 (도 14) 최종 농도 (10^-6mol/l)를 제외하고는, 테스트된 대부분의 농도에서 ALP 활성을 증가시켰다. 뿐만 아니라, ALP 활성에 미치는 이 화합물의 효과도 저산소증 조건 하에서 평가하였다. 인간의 골아세포를 5% O₂중에서 4일간 배양하였다. 화합물 2를 여러가지 농도로 하여 배지에 보강하고, 정상산소 조건시의 응답과 비교하였다. 10^-11내지 10^-8mol/l에 달하는 전 농도 범위에서, 저산소증 하에서 화합물 2-유도된 ALP 활성의 자극은 정상산소 조건의 값보다 약 15% 더 높았다 (도 15).

요약하면, 이러한 결과는 화합물 2가 저산소증 동안 인간의 골아세포 간의 약화된 GJIC를 정상화시킬 수 있음을 입증해주는 것이다. 뿐만 아니라, 화합물 2가 알칼린 포스파타제의 생산을 자극한다는 것은 화합물 2가 골아세포의 활성을 촉진하고, 나아가 골 형성을 촉진할 수 있음을 시사하는 것이다. 따라서, 화합물 2는 골 재흡수에 상대적으로 골 형성이 손상된 골질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 저산소증 조건 하에서 세포 대 세포 커플링에 미치는 화합물 2의 효과는 본 발명의 물질이 골 조직에 있어서 저조한 혈관신생, 저산소증 및 허혈과관련된 골 질환을 치료 및/또는 예방하는데 효과적일 수 있음을 시사하는 것이다.

이들 실험으로부터, GJIC를 증대시키는 본 발명의 물질들이 골다공증을 예방및/또는 치료하기 위한 의약을 제조하는데 있어서 유용한 것으로 결론지을 수 있다. 몇가지 경우에 있어서, 골다공증은 예컨대 Cushing' 증후군 또는 골형성 부전증과 같은 다른 질환의 증상이 발현된 것이다. 그러나, 골다공증의 대부분에 있어서, 그 외의 다른 증상은 뚜렷하지 않다. 한가지 유형은 정상적인 성기능을 갖는 양성 모두의 성인과 아동이나 청년에서 발생하며 흔히 특발성 골다공증이라고 칭해지지만, 대부분의 다른 유형은 그 병인이 알려져 있지 않다. 타잎 1 골다공증은 51세 내지 75세의 폐경기 여성 서브셋에서 발생하며 소주골 (trabecular bone)의 급속하고도 불균형한 손실에 의해 특징지어진다. 척추체 및 원위 하박부 (distal forearm)의 골절은 흔한 합병증이다. 부갑상선 기능 저하는 항진된 골재흡수에 대한 보상일 수 있다. 타잎 II 골다공증은 70세 이상의 여성과 남성에서 발생하며 피질성 뼈와 소주성 뼈를 모두 함유하는 부위들인, 대퇴부 목, 근위 상박골, 근위 경골, 및 골반의 골절과 연관이 있다. 골다공증에 더해, GJIC를 증대시키는 물질은 구루병과 골연화증과 같은 대사성 골 질환 및 만성 글루코코르티코이드 투여 또는 만성 신부전에 기인하는 골다공증에 있어서도 골 형성을 증대시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 한가지 목적은 골다공증을 예방 및/또는 치료하는데 유용한 의약을 제조하기 위한 화합물을 제공하는 것이다. 이러한 목적은 본 명세서에 개시된 본 발명의 펩타이드 화합물, 예컨대 식 I 내지 VIII, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물, 더욱 구체적으로는, 이하의 합성 실시예 1-55에 더욱 구체적으로 제시된 화합물에 의해 달성된다.

연골에 미치는 간극 결합 오프너의 효과

인공연골은 관절이 움직이는 동안의 압박을 지탱하기 위해 고안된 조직으로서, 생체내에서, 광범위하게 기계적인 부하력을 받게된다. 기계적감작성 (mechanosensitivity)은 연골세포 대사 및 연골 항상성에 영향을 미치는 것으로 입증된 바 있다. 많은 종류의 세포에서 기계적 자극은 세포간 Ca²⁺웨이브로서 세포에서 세포로 전파되는 세포질의 Ca²⁺농도의 증가를 유도한다. 간극 결합을 통한 세포 대 세포 커뮤니케이션은 대사 공조 및 세포외 자극에 대한 감작성의 기초가 된다: 세포내 2차 메신저에 대한 간극 결합의 투과성은 여러 세포들에 의해 공유되는 시그널 트랜스덕션 경로를 가능케하고, 궁극적으로는 공조된 세포 응답을 야기시킨다. 연골세포에 있어서 기계적으로 유도된 Ca²⁺시그널링이 연구된 바 있으며 간극 결합 커뮤니케이션이 연골세포에 있어서의 기계적-유도된 Ca²⁺시그널링에 필수적임이 밝혀졌다^[53]. 뿐만 아니라, 기계적 자극은 포스포리파제 C를 활성화시키기 때문에, 세포내 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트의 증가를 일으킨다. 2차 메신저는 간극 결합을 통과함으로써, 이웃 세포에서 세포내 Ca²⁺의 방출을 촉진하는데 이 시스템은 기계적 왜곡시 연골세포에서의 공조된 시그널링에 있어 매우 중요한 것으로 여겨지며, 연골세포에서 기계적 스트레스가 일어나는 동안 대사활성을 공조하느 메카니즘을 제공하는 것일 수 있다^[53:54]. 연골세포에서의 주요 코넥신은 Cx43이며, 대사의 세포 대 세포 조절 및 시그널링에 있어서의 그의 역할에 더해, Cx43은 정상적인 연골형성에 있어서도 필수적이다^[47;55].

또한, 반월 세포의 세포구축은 간극 결합 커뮤니케이션에 부분적으로 의존한다. 힘줄의 섬유연골 구조 뿐만 아니라 반훨 세포의 섬유연골 부분은 세포간 커뮤니케이션에 의존한다. 손상시 간극 결합 오프너는 복구속도를 향상시킬 것이다.

따라서, GJIC를 증대시키는 본 발명의 물질은 손상된 세포 대 세포 커플링과 관련된 관절 질환을 예방 및/또는 치료하는데 유용할 것이다. 인간의 골아세포에 대해 본 발명자들이 입증한 바와 마찬가지로, 본 발명자들은 GJIC를 증대시키는 물질이 대사성 스트레스와 관련된 관절 질환을 예방 및/또는 치료하는데 있어서도 유용할 수 있을 것으로 주장하는 바이다. 여기에는 골절된 연골조직의 치유 또는 저조한 혈관신생과 관련된 여하한 형태의 관절염도 포함된다. 인간의 연골세포에 있어서 DDT에 의해 유도된 간극 결합 커뮤니케이션의 감소에 미치는 화합물 2 및 화합물 40의 효과를 후술하는 골아세포에 대해 설명된 것과 동일한 방식으로 테스트할 것이다. 테스트 화합물은 10-10 - 10-6 mol/kg의 농도 범위로 사용할 것이며, 테스트 화합물은 종양촉진제인 DDT에 의해 유도된 간극 결합 커뮤니케이션의 저하를 역전시킬 것으로 기대된다. 따라서, 본 발명의 한가지 목적은 관절염을 비롯한 관절 질환을 예방 및/또는 치료하는데 유용한 의약물을 제조하기 위한 화합물을 제공하는 데 있다. 이러한 목적은 본 명세서에 개시된 본 발명의 펩타이드 화합물, 예컨대 식 I 내지 VIII, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물, 더욱 구체적으로는, 이하의 합성 실시예 1-55에 더욱 구체적으로 제시된 화합물에 의해달성된다.

투여는 경구, 비경구 및 관절내 투여이다.

암에 미치는 간극 결합 오프너의 효과

간극 결합 투과성과 GJIC의 조절은 세포의 여러가지 상이한 레벨에서 발생한다. GJIC의 저하 또는 부재는 전사 및 번역 동안의 Cx 발현의 변화, 후번역 프로세싱의 변경 및 코넥손 어셈블리의 변경 및 플라즈마막 내로의 삽입의 결과일 수 있다. Cx의 독특한 특성은 다른 막 단백질에 비해 이들의 반감기가 짧다는 것이다. 코넥신의 급속한 턴 오버는 1.5시간 내지 2시간인 것으로 밝혀졌다. Cx의 분해는 몇몇 코넥신 서브타잎을 불안정하게 만드는, 포스포릴화에 의존하는 것으로 나타났었다. 신속한 턴오버 속도는 Cx mRNA 반감기, 번역, 세포내 이동 및 Cx의 간극 결합으로의 어셈블리에 영향을 미치는 물질에 의해 GJIC가 신속하게 조절될 수 있도록 하는 부가적인 메카니즘을 제공해준다. 간극 결합 투과성을 조절하는 또 다른 방식은 코넥손의 6개의 서브유닛을 기계적으로 왜곡시킴으로서 특정 환경 하에서 간극 결합 채널을 완전히 또는 부분적으로 폐쇄하는 것이다. 간극 결합의 게이팅은 GJIC를 감소시키는 종양 프로모터에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 종양 프로모터는 종양 개시후 반복적으로 주어지는 발암현상을 촉진 또는 가속화시키는 물질들이다. 종양 프로모터가 GJIC를 변형시키는 메카니즘은 완전히 이해되지는 않고 있으나, 종양 프로모터가 Cx의 포스포릴화 및/또는 Cx 발현 및 어셈블리의 억제를 변경함으로써 GJIC에 영향을 미치는 것일 수 있음을 뒷받침하는 증거가 있다. 최근의 연구 결과는 GJIC 캐패시티가 저하된 악성 종양에 있어서 레트로바이러스-매개된 생체내 코넥신 43 유전자 전달이 종양발생을 현저히 감소시켰음을 보여주고 있다^[56]. 암을 예방하는데 있어서 정상적인 Cx32 결핍 마우스에 있어서, 자연발생적으로 간 종양이 매우 잘 발생할 뿐만 아니라 화학적-유도된 간 종양의 발생 감수성도 증가한다는 것은 GJIC의 필수적인 역할을 뒷받침하는 또 다른 예이다^[57]. 뿐만 아니라, 페노바르비탈의 종양 촉진 작용은 종양 진전시 기능적인 Cx32를 요구한다^[58]. 이것은, GJIC의 언커플링이 페노바르비탈의 온코진 작용에 있어서 중요함을 시사하는 것이다^[58].

발암현상은 성장 인자, 온코진 및 종양 서프레서 유전자가 관여하는 성장 제어 메카니즘이 점진적으로 손상됨을 특징으로 한다. GJIC의 변형은 성장 제어의 변형을 초래할 수 있기 때문에, 성장 인자와 온코진이 GJIC에 대해 갖는 효과는 종양발생학에 있어서 매우 중요한 것일 수 있다. 몇가지 온코진이 GJIC의 다운 레귤레이션을 매개하는 것으로 알려져있다^[59]. pp60^v-src는 MAP 키나아제에 의한 C-말단 세린 잔기의 포스포릴화를 포함하는 볼 앤드 체인 메카니즘을 경유하여 Cx43 간극 결합의 폐쇄를 매개하는 것으로 나타났다^[59]. 흥미롭게도, 몇가지 경우에 있어서 온코진으로 트랜스펙션된 세포들은 서로 커뮤니케이션할 수 있었지만, 인접하는 정상 세포들과의 이질적 커뮤니케이션은 하지 못하였다.

염료-전달 분석을 이용한 종양 세포에서의 간극 결합 투과성은 주변의 간 조직에서 GJIC보다 더 낮았다. 흥미롭게도, 많은 종양이 세포외 매트릭스-유사 구조에 캡슐화되어 있으며 정상적인 조직으로부터 물리적으로 격리되어 있다.

정상적인 인간의 조직에서의 종양성 형질전환은 유전적 변형이 축적된 결과로서 일어난다. 그러나, 발암현상과 종양생성에 있어서 주요 테마는 GJIC의 다운 레귤레이션이다. 여러가지 코넥신들이 조직 특이적 방식으로 발현된다. Cx43, Cx26, Cx32이 정상적인 유방조직에서 검출되었다. 인간 유방암 패널에 있어서 Cx43의 발현 정도를 분석하였다. Cx43 간극 결합은 인 시투에서 관형 (ductal) 암종, 침윤성 관형 암종 및 침윤성 소엽 암종에서 관찰되지 ㅇ낳았으며 이들은 에스트로겐, 프로게스테론 및 erb32 수용체 상태에 대해 독립적인 것으로 보인다. 이와 대조적으로, 인간의 유방암종 세포주와 설치류의 유선암종 조직은 mRNA 수준에서의 Cx43의 다운 레귤레이션을 나타냈으며, 이는, 유방암종에 있어서 Cx43 단백질의 감소의전사적 메카니즘을 시사하는 것이다^[60]. 암과 GJIC 간의 관계에 대한 또 다른 예는 간세포성 암종으로서 여기서는 코넥신 32 녹 아웃이 이 특이적인 암 종류와 관련이 있다^[57]. 난자 세포를 이용한 연구 결과 이들이 간 세포로 분화되고 난자 세포의 종양 유도체가 간세포 종양 및 담관 종양을 생성시킬 수 있는 것으로 나타났다. 분화중의 난자 세포에 의해 발현되는 특정 코넥신은 간세포와 커뮤니케이션할지 또는 담관 상피 세포와 커뮤니케이션할지를 결정한다. 이러한 커뮤니케이션은 추가의 분화에 필요할 수 있으며, 분화중의 난자 세포의 조절된 성장과 GJIC의 손상은 간세포 종양 및 담관세포 종양 형성에 기여하는 것일 수 있다. 따라서, GJIC는 난자 세포의 분화의 핵심 요소일 수 있고, 차단된 GJIC는 이들의 종양발생적 형질전환을 촉진할 수 있을 것이다. 뿐만 아니라, 말로틸레이트 (malotilate)를 이용하여 처리된 래트의 폐 상피세포에서의 종양 침입을 생체외 분석한 결과, 종양 세포의 침입 억제를 초래한 간극 결합에 의한 세포 대 세포 부착의 발달을, 말로틸레이트가 촉진시킨 것으로 나타났다^[61]. 이러한 일련의 발견들은 GJIC의 변형이 발암현상에 있어서 중요한 현상이며 GJIC를 증대시키는 본 발명의 물질들이 암 치료시 유용할 것이라는 가설을 강력히 뒷받침해주는 것이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 GJIC를 증대시키는 신규한 화합물을 제공하는 것이다. 본 발명자들은 본 명세서에 따른 식 I 내지 VIII, 식 2 내지 12의 펩타이드 화합물, 및 표 1 및 표 8의 화합물이 낮은 유효 농도 및 결과적으로 낮은 독성으로 인해 암을 치료하기 위한 의약으로서 특히 유용할 수 있다고 제안한다.

본 발명의 펩타이드들의 특정 용도는 다음의 암 관련 의학적 증상을 치료하는 것을 포함한다:

종양 진행: 종양 발생시, 정상 세포와 그들과 이웃하는 세포들 간의 생리적 상호반응의 간섭 및 분화 특성의 손상은 종양 진행에 있어서 공통분모이다. 간극 결합 커뮤니케이션에 있어서의 변경은 그 중에서도 세포 종양발생시 최초의 변화인 것으로 믿어진다 (Wolburg H, Rholmann A. Int Rev Cytol. 1995; 157:315-73). Klaunig JE, Ruch RJ. 1990; 135-46)). Kyung-Sun Kang, Jun-Won Yun, Byoungsu Yoon, Yoon-Kyu Lim 및 Yong-Soon Lee (Cancer Letters 166 (2001)147-153)은 TPA처리된 래트의 간 상피세포에 있어서 GeO₂를 이용하여 예비-배양 및 공동-배양하면 TPA에 의한 GJIC의 다운-레귤레이션이 회피됨을 보여주었는데 이는 GJIC의 억제를 복구하는 물질이 종양 생성촉진을 예방 또는 억제하는데 이용될 수 있음을 시사하는 것이다. Sujuki J, Na H-K, Upharm BL, Chang C-C 및 Trosko JE (Nutrition and Cancer, vol 36 No. 1 p. 122-8)는 식품 첨가제인 람다-카라기난인 이미 잘 문서화되어 있는 종양 프로모토인 포볼 에스테르 (TPA)의 그것과 유사하게 래트의 간 상피 세포에서 GJIC를 억제하고, 따라서, 발암현상에 있어서, 종양 촉진제로서 작용할 수 있음을 보여준 바 있다. 따라서, 본 발명의 화합물들은 TPA 및 람다-카라기난과 같은 종양 촉진제에 기인하는 암을 예방 또는 치료하는데 유용할 수 있다.

약물 감수성 내성: 간극 결합 커뮤니케이션의 증대는 종양과 카리스티노스 GD에서의 마이크로환경을 향상시켜준다, Alaoui_jamali MA, Phipps J, Yen L, Batist G.

전이: 세포간 간극 결합 커뮤니케이션의 손상은 잠재적 전이성을 갖는 모든 암에 있어서의 높은 전이 잠재성과 연관이 있다 (Saunders MM, Seraj MH, Li Z, Zhou Z, Winter CR, Welch DR Donahue HJ. (Cancer Res. 2001; 61; 1765-1767), Nicolson GI, Dulski KM, Trosko JE, Porc Natl Acad Sci USA, 1988: 85:473-6)). 전이의 방지는 종양에 있어서 간극 결합 커뮤니케이션을 보존해줄 간극 결합 오프너를 이용한 치료에 의해 수립된다.

치료는 종래의 화학요법에 부가된다.

실험 실시예 9

인간의 골아세포에 있어서 DDT에 의해 유도된 간극 결합 커뮤니케이션의

감소에 미치는 화합물 2의 효과

프로토콜 및 결과

살충제 DDT로도 알려진 화합물 1,1-비스(p-클로로페닐)-2,2,2-트리클로로에탄은 간극 결합 커뮤니케이션의 저해제로서, 종양 촉진능력을 갖는다. 이것은 간극 결합의 수와 크기를 감소시킬 뿐만 아니라, 간극 결합 단백질인 Cx43의 포스포릴화된 (활성) 형태의 세포 레벨을 저하시킴으로써 세포 대 세포 커뮤니케이션을 저해하는데, 이러한 작용들은 온코진 특성을 갖는 화합물에 있어 핵심적인 특징인 것으로 여겨지고 있다^[62-64]. 따라서, 종양 프로모터-유도된 GJIC의 감소를 예방할 수 있는 능력을 갖는 화합물들은 종양 촉진에 대한 방책과 암 치료에 유용한 잠재적인 후보가 될 수 있을 것이다^[65]. 본 발명의 물질들이 종양 프로모터-유발된 GJIC의 감소를 예방할 수 있는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 인간의 골아세포에 있어서 DDT-유발된 언커플링에 미치는 화합물 2의 효과를 시험하였다.

방법

세포 배양

인간의 골아세포:

건강한 지원자 (20-36세)의 배면 장골척추에 천공함으로써 얻은 인간의 골수로부터 세포를 분리하였다: 10-25 ml의 골수 물질을 100 U/ml 헤파린 (Sigma,Cat.No. H-3149)와 함께 15 ml PBS+Ca,Mg (Life Technologies, Cat. No. 14040)에 수집하였다. 2200 rpm에서 30분간 원심분리함으로써 골수의 단핵성 단편을 Lymphopreg 구배 (Nycomed Pharma, Cat. No. 1001967)상에 분리시켰다. 수확 후, 단핵성 분획을 배양배지로 한번 세척하고 1800 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 이어서 세포를 계수하고 8 x 10⁶세포/100 mm 디쉬로 배양 배지에 플레이팅시켰다. hOB 배지 (모든 시약은 Life Technologies사 제품이었음): 0.5% 페니실린/스트렙토마이신 (Cat.No. 15140)과 10% 열불활성화된 소의 태아 혈청 (Cat.No. 10106)이 보강된 MEM w/o 페놀 레드 w/Glutamax (Cat.No. 041-93013). 다음날 배지를 갈아주고 세포를 5% CO₂중, 37℃에서 매 7일마다 배지를 갈아주면서 배양하였다. 배양 3-4주일 후, 세포들은 70% 컨플루언스에 도달하였다. 이어서 7일간 100 nM 덱사메타손 (Sigma, Cat.No. D-4902)을 배지에 보강하였다. 이어서 세포를 비디오 영상 실험을 위해 플레이팅하였다: 25 mm #1 유리 커버슬립을 35 mm 디쉬 (또는 6-웰 멀티디쉬의 각각의 웰)에 위치시키고, 세포를 2.5 x 10⁵세포/커버슬립으로 플레이팅시킨 다음 사용하기 전에 2-3일간 배양하였다.

마이크로인젝션

세포를 커버슬립 상에서 배양하고, PDMI-2 배양 챔버 (Medical Systems Corp.)에 고정시키고, 37℃에서 수퍼퓨징된 CO₂와 함께 Zeiss Axiovert 현미경 상에서 유지시켰다. Eppendorf 5171 마이크로매니퓰레이터 및 Eppendorf Transjector5346 시스템을 이용해서 마이크로인젝션을 수행하였다. 마이크로피펫에 10 mM 루시퍼 옐로우 (LY) 용액 (Sigma, Cat.No.L-0259)를 로딩하였다. 단층 중의 세포에 LY를 30초간 조심스럽게 주사하고, 마이크로피펫을 세포로부터 제거한 다음 30초 후에 염료 이동을 나타낸 세포의 수를 세었다. 단색화장치 (T.I.L.L. Photonics GmbH)를 이용하여 여기광 (340 및 380 nm)을 제공하였다. 보력 CCD 카메라 (Dage MIT)로 영상을 얻고 MetaMorph 영상화 시스템 (Universal Imaging)을 이용하여 Matrox MVP 이미지 프로세싱 보드로 디지털화하였다.

결과

간극 결합 변형제 (modifier)가 종양 촉진을 예방하는 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 간극 결합 변형제가 잘 알려진 종양 촉진제인 DDT에 의해 유발된 간극 결합 커뮤니케이션의 감소를 역전시킬 수 있는지 테스트하고자 하였다. 이를 위해, 유리 커버슬립 상의 인간의 골아세포 단층을 5% CO₂를 함유하는 습한 분위기 하, 37℃에서 인큐베이션시켰다. DDT를 13μM의 최종 농도로 하여 배지에 첨가하고 60분간 방치시켰다.

DDT 처리 후, 직접적인 세포 커플링에 미치는 화합물 2의 효과를 평가하기 위해, 상기 방법에 따라 마이크로인젝션 실험을 수행하였다. 염료인 루시퍼 옐로우 (LY)를 단층 중의 하나의 단일 인간 골아세포에 주입하였다. 30초 후, 염료를 함유하는 세포수를 평가하였다. 대조군 조건 (DDT 무처리) 하에서는, 염료가 평균 14.5개의 세포로 확산하였다 (n=12). DDT-노출 세포에 대해 동 실험을 수행하였다. 이세포들은 세포 커플링이 평규 7개로 감소하였다 (n=13). 화합물 2를 최종 농도 10^-8mol/l이 되도록 배딩 용액에 첨가하고 10분 후, 다시 마이크로인젝션을 수행하엿다. 화합물 2는 평균 8.3개의 세포의 값으로 모든 프레퍼레이션에서 세포 대 세포 염료 전달을 증가시켰다 (도 15). 이러한 증가는 Wilcoxon 비-변수적 통계 테스트를 이용할 때 p<0.01로서 매우 유의적인 것이다. 따라서, 간극 결합 오프너는 종양 촉진과 관련하여 감소된 세포간 커플링을 역전시킬 수 있고, 이는, 본 발명의 물질이 암을 화학적 예방 및/또는 치료하는데 유용할 수 있는 것임을 시사하는 것이다. 본 발명의 화합물은 암을 화학예방 및/또는 치료하기 위한 의약을 제조하는데 유용하다. 본 발명의 화합물은 또한 다른 항암제와 조합하여 이용될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 한가지 목적은 암을 예방 및/또는 치료하는데 유용한 의약물을 제조하기 위한 화합물을 제공하는 데 있다. 이러한 목적은 식 I 내지 VIII, 식 2 내지 12의 펩타이드 화합물, 및 표 1 및 표 8의 화합물과 같은 본 발명에 펩타이드 화합물, 더욱 구체적으로는 합성 실시예 1-55의 화합물에 의해 달성된다.

추가적인 약리학적 방법

치료방법에 있어서 본 발명에 설명된 펩타이의 유용성은 이하의 부가적인 실시예로부터 더욱 명확해질 것이다.

상처의 치유에 있어서의 간극 결합 오프너의 효과

상처란 피부와 연관된 정상적인 해부학의 불연속으로서 외과수술적 또는 외상성 상처일 수 있거나 또는 당뇨병, 동맥경화증, 영양실조증과 같은 심각한 질환의 부대적인 증상일 수도 있다. 정상적인 상처 치유는 전식적 프로세스로서, 단계별로 일어나며 지혈과 염증이 포함된다. 수년간 지속될 수 있고 상처 조직 형성의 원인이 될 수 있는 이러한 프로세스에 리모델링이 수반된다. 피브린에 의해 지혈이 되면 피부 표면 아래에서 상처 가장자리의 이동 및 움직임이 일어난다. 치유중인 상처로의 상피화, 섬유조직형성 및 모세관 증식이 즉각적으로 개시된다. 맥관성 모세관 스프라웃은 피브린 상처 혈병에 침입하여 수일 안에 역시 백혈구와 식세포성 단핵 세포로 이루어진 과립화조직을 통해 미세혈관망으로 조직화된다. 상처 치유 프로세스에는 다양한 조직 요소들 간에 매우 역동적인 상호반응이 일어난다. 맥관형성 프로세스는 성공적인 상처 치유를 위해 필수적이다. 신시티움 생성 및 모세관 네트워크의 증식에는 세포간 커뮤니케이션, 간극 결합이 섬유아세포의 필수적이다. 코넥신 43의 정상적 분포가 여러가지 조직 요소의 이와 같은 성장에 필요하다.

부종, 허혈, 저산소장력 및 감염과 같이 질병 증상하에서 종종 관찰되는 여러가지 국소적 요소가 상처 치유 프로세스를 지연시킬 수 있다. 상처 치유는 많은 종류의 세포들이 상호작용하는 것으로서, 간극 결합에 의해 매개되는 세포간 커뮤니케이션은 조직 및 기관이 성장 발육하는 동안의 세포 대사 공조에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고 있다^[66-68].

본 발명자들은 GJIC를 증대시키는 본 발명의 물질이 상처의 치료, 특히 상처 치유를 가속화시키는데 이용될 수 있을 것으로 제안한다. 심장 및 골 조직에 행한 실험 결과 이 물질들이 대사 스트레스 (예컨대 저혈당증, 저산소증, 허혈)가 가해지는 동안 증강된 효능을 나타냈다는 점을 고려할 때, 이 물질들은 허혈성 궤양을 치료하는데 특히 유용할 것으로 추측할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한가지 목적은 상처, 특히 허혈성 궤양을 치료하는데 유용한 의약의 제조를 위한 화합물을 제공하는 것이다. 이러한 목적은 식 I 내지 VIII, 식 2 내지 12의 펩타이드 화합물, 및 표 1 및 표 8의 화합물과 같은 본 발명에 펩타이드 화합물, 더욱 구체적으로는 합성 실시예 1-55의 화합물에 의해 달성된다.

상처 치유 프로세스

치유 프로세스는 지혈 (응혈)과 더불어 개시되는 일련의 중복적인 상(페이즈)들이다. 치유 프로세스의 제 2상은 상처 부위에 소식세포가 축적되어 무엇보다도 섬유아세포와 임파구와 관련된 과립화 조직 형성이 개시되는, 염증성 응답 캐스캐이드이다. 이어서 상피 세포가 상처 경계부로부터 이주하기 시작하여 상처 부위를 덮는다. 영양소, 산소 및 다른 세포들의 공급을 공고히 하기 위해 정상 조직으로부터 상처로의 모세관 스프라우팅 역시 관여한다. 모든 세포와 모세관 내피세포는 간극 결합을 통해 생생한 세포간 커뮤니케이션을 한다 (Abdullah KM, Luthra G, Bilski JJ, Abdullah SA, Ryenolds LP, Grazul-Bilska AT. Endocrine. 1999; 10; 35-41). 괴사조직을 갖는 상처, 당뇨병, 동맥경화증, 외과수술적 상처, 부종, 감염, 화상 및 정맥부전에서 종종 관찰되는, 산소 공급이 저조하고/저조하거나 자유 래디칼 농도가 높은 대역은 간극 결합 커뮤니케이션을 저하시킬 것이다 (Nagy JI, Hossain MZ, Lynn BD, Cupern GE, Yang S, Turley EA. Cell Growth Diff. 1996; 7:745-51)).

생체외 섬유아세포 배양시 간극 결합 오프터의 효과를 테스트한다. Arora KK, Lee W, McCullock C. (Am J Physiol Cell Physiol. 2000; 279: C147-57)에 설명된 바와 같이 인간의 치육으로부터 섬유아세포를 수확한다. 세포 배양체를 10^-10- 10^-8nM의 간극 결합 오프너에 노출시키면 세포 성장이 현저하게 빨라지는 것을 볼 수 있다. 시간 경과에 따른 티미딘의 핵 업테이크를 측정하는 통상적인 방법으로 이러한 성장을 테스트한다.

Ashton AW, Yokota R, John G, Zhao S, Suadicani SO, Spray DC, Ware JA. (J Biol Chem. 1999:274:35562-70)에 의해 설명된 바와 같이, 화합물에 노출전 및 노출 후에 상피 세포 성장 및 상피 튜브 형성에 대한 간극 결합 오프너의 자극을 연구한다.

간극 결합 오프너는 구강 점막 내에서 상처 치유 프로세스를 촉진한다. Hara A, 등 (J Gastroenterol 1999 Feb 34:1-6)은 인간의 구강 점막 내에서 코넥신 26 및 32를 동정했는데 이는, 이 조직 중에 간극 결합이 존재함을 가리키는 것이다. 그러나, 면역형광 연구 결과, 아프타성 구내염을 앓는 환자와 대조군 환자 간에는 코넥신 발현에 있어서 어떠한 유의적인 차이도 발견되지 않았다. 생체외에서 간극 결합 세포간 커뮤니케이션을 강화시키는 이르소글라딘 말리에이트는 일과성 및 회귀성 아프타성 구내염의 치료에 효과적일 뿐만 아니라, 대증성 및 약물-유발된 아프타성 구내염을 치료하는데도 효과가 있었다. 이것은 구내염 재발을 방지하도록 매일 투여되면, 회귀성 아프타성 구내염 에피소드를 예방하는데도 유용하였다. 본발명의 펩타이드는 구강점막 세포 중 간극 결합 세포간 커뮤니케이션을 강화시킴으로써 구강 점막에서의 상처 치유 프로세스를 가속화시키는데 동일한 방식으로 이용될 수 있으므로; 본 발명의 펩타이드는 또는 아프타성 구내염을 치료 및 예방하는데 유용하다.

생체내에서의 상처 치유효과를 시험하기 위해, 화합물 2와 화합물 40을 국소적 (수성 젤 중 농도 범위 10^-9- 10^-6mol/l) 및 비경구적으로 (10^-10- 10^-6mol/l), 마우스에게 1일 2 내지 4회 투여하였다. 각 마우스의 등 표면에 6-mm 펀치 생검을 이용해서 근육층 아래에 2개의 둥근 절제 상처를 냈다. 화합물 2와 화합물 40을 이용한 5일간의 치료 후 생검 현미경에 의해 피부에 대한 효과를 조직학적으로 평가하고 상처의 직경을 매일 측정함으로써 상처 치유 정도를 평가한다. 본 발명자들은 화합물 2와 화합물 40이 피부 구조에 단독으로는 영향을 미치지 않을 것으로 예상하나 두 화합물 모두 생검 후에 상처 치유를 가속화시킨다.

간극 결합 오프터에 의한 치료는 복잡한 회복 경과에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지는 여러가지 상이한 세포들 간에 최대 수준의 간극 결합 커뮤니케이션을 보장해주기 때문에, 상처의 회복을 촉진시킨다. 이 화합물을 비경구적, 국소적, 전신적 또는 경구적으로 투여된다.

위궤양 및 십이지장 궤양 치유에 대한 간극 결합 오프너의 효과

간극 결합은 또한 위점막 세포의 세포간 커뮤니케이션, 증식 및 분화에 있어서도 중요한 역할을 한다. 간극 결합 오프너는 상처 유도 후 재생 프로세스를 촉진할 것이다 (Endo K, Watanabe S, Nagahara A, Hirose M, Sato N. (J Gastroenterol Hepatol. 1995;10: 589-94)).

Mine 등은 정상적인 인간의 위점막이 코넥신 32와 코넥신 43을 모두 함유한다는 것을 입증한 바 있다^[69;70]. 이와 대조적으로, 만성 위염 병변 주위의 위점막은 보다 적은 양으로 코넥신 32와 코넥신 43을 함유한다. Mine 등의 연구에서, 코넥신의 출현과 궤양 치유간의 관계가 조사되었다. 궤양의 치유가 관찰됐을 때, 활성 궤양 단계로 감소된 코넥신 32와 코넥신 43은 정상적인 위점막에서 관찰되는 수준으로 거의 복구되었다. 이러한 자료는 코넥신 32와 코넥신 43의 두가지 모두가 사라지는 것이 만성 위궤양 병변의 진행 단계와 밀접하게 관련이 있음을 보여주는 것이다. 뿐만 아니라, 아세트산-유도된 만선 위궤양을 래트 모들을 이용하여, 상기 동 연구진은 항궤양약물인 시메티딘의 임상적 효과가 코넥신 32의 재출현과 깊은 관계가 있음을 입증하였다^[69].

간극 결합은 위점막 방어계 및 산-유도성 상해로부터의 회복에 있어서 중요하다. Takahashi N, Joh T, Yokoyama Y, Seno K, Nomura T, Ohara H, Ueda F, Itoh M. (J Lab Clin Med 2000 Aug; 136(2):93-9) 간극 결합 세포간 커뮤니케이션 (GJIC)이 GJIC가 위점막에서의 회복 프로세스를 매개하는지 여부를 결정한다는 증거는 많이 축적되어 있다. 수컷 Sprague-Dawley 래트를 굶긴 다음 마취시켰다. 0.2N HCl을 10분간 내강에 관류시킴으로써 위에 손상을 유발시켰다. 크롬 51-라벨링된 에틸렌디아민테트라아세트산의 제거를 측정함으로써 (상처로부터의 회복을 분석하는데 이용됨) 점막의 인테그리티를 계속 모니터링하였다. 산에 의한 손상 후에, 0.25% 옥탄올 (OCT; GJIC 저해제)을 이용한 관류를 개시하여 회복에 미치는 그의 효과를 평가한다. 이르소글라딘 (IG; GJIC의 활성화제)의 효과도 시험하였다. 모노클로날 항체 간극 결합 단백질 (코넥신 32)을 이용하여 위점막의 GJIC를 면역조직학적으로 평가하였다. 산 관류를 중단하자 (약 60분 이내) 산-유발성 점막 손상 회복이 신속히 일어났다. 정상적인 위점막에 아무런 손상도 일으키지 않은 OCT가 회복을 현저히 억제하였다. IG는 이러한 억제를 투여량-의존적 방식으로 역전시켰다. 면역조직학적 연구에 의해, 간극 결합의 OCT-유도성 손상이 입증되었으나, IG 전처리 후에는 그렇지 않았다. 이러한 발견은 GJIC가 래트의 위점막의 회복에 중요한 역할을 함과 본 발명의 펩타이드가 위궤양 및 십이지장 궤양과 같은 궤양을 치료하는데 있어서 유용함을 시사하는 것이다. 이러한 추정을 뒷받침하기 위해, 화합물 2와 화합물 40을 10^-11- 10^-7M의 농도 범위에서 안정한 산 용액으로서 래트에게 투여함으로써 상기한 Takahasi N. 등의 2000년도 일반 실험디자인을 이용하여 래트에 대한 실험을 수행할 수 있다. 이러한 실험은 간극 결합 커플링에 미치는 화합물 2와 화합물 40의 촉진 효과를 보여주고, 세룰레인의 효과를 방해함으로써 위궤양 치유를 결과시킬 것으로 기대된다.

펩타이드는 경구 또는 비경구, 예컨대 정맥내로 투여된다.

따라서, GJIC를 증대시키는 본 발명의 물질들은 위궤양 및 십이지장궤양의 치유를 촉진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 한가지 목적은 위궤양 및 십이지장궤양을 치료하는데 유용한 의약의 제조를 위한 화합물을 제공하는 데 있다. 이러한 목적은 식 I 내지 VIII, 식 2 내지 12의 펩타이드 화합물, 및 표 1 및 표 8의 화합물과 같은 본 발명에 펩타이드 화합물, 더욱 구체적으로는 합성 실시예 1-55의 화합물에 의해 달성된다.

혈관 생물학에 있어서 간극 결합의 역할

혈액과 하부 조직 사이의 내피계면에서의 세포성 응답의 공조는 간극 결합을 경유한 직접적인 세포간 커뮤니케이션을 비롯한, 여러가지 시그널링 메카니즘에 의해 매개된다. 내피성 간극 결합 세포간 커뮤니케이션이 수행하는 기능으로는 손상, 혈관형성, 내피 성장 및 노화 후의 내피 세포의 이동 양태 및 혈관운동인자의 응답 공조를 들 수 있다^[71].

넓은 다이내믹한 범위에서의 혈류의 조절은 동맥에의 공급과 저항의 잘 조화된 응답을 필요로 한다. 혈관들간의 이러한 공조는 누출 (streaming) 혈액이나 혈관벽의 세포를 따른 혈관운동 효과에 의해 발휘되는 전단응력의 맥관 효과에 의해 달성될 수 있다. 실제로, 아세틸콜린 (ACh)이나 노르에피네프린 (NE)와 같은 어떤 혈관작용성 화합물은 국부적인 이완이나 수축 뿐만 아니라 수밀리미터 위아래의 혈관운동성 응답을 유도하였다^[71]. 혈관운동 응답은 모세관으로부터 세동맥까지 수행될 수도 있고 조직에 의한 수요와 혈액에 의한 공급을 일치시켜주는데도 기여할 수 있다. 이것은 다음과 같은 방식으로 입증되었다: 단일 근육 섬유가 수축되도록 자극을 받으면, 이들 섬유에 공급되는 모세관 상류의 세동맥이 이완되는 것으로 관찰되었다^[72].

높은 전도속도는 혈관벽을 따라 일어나는 시그널의 전자전달과 일치한다. 실제로, 국부적으로 유도된 저분극 및 탈분극화는 내피 및 혈관 평활근 세포에 있어서 수 밀리미터 상류로 전도된다는 것이 입증된 바 있다. 전기 시그널의 전도는 세포들 간의 낮은 전기 저항의 도관을 제공하는 간극 결합에 의한 혈관 세포의 커플링을 필요로 한다. 혈고나 조직에서는, 간극 결합을 형성하는 적어도 세가지 코넥신 (Cx) 단백질 (Cx37, Cx40, 및 Cx43)이 발현된다. Cx40은 대동맥 내피 세포에서 가장 우세한 코넥신 이소형태인 반면, 평활근에서는 Cx43 발현이 많다.

Cx40 결핍 마우스 (Cx40-/-)를 이용한 연구 결과 아세틸콜린이나 브래디키닌을 국소투여하여 유도된 혈관확장은, Cx40-/- 동물에서는 정상적인 야생형 (Cx+/+) 동물에 비해 현저하게 약화된 것으로 증명되었다^[73]. 뿐만 아니라, 세동맥의 혈압은 정상적인 야생형 (Cx+/+) 마우스에 비해 Cx40-/- 동물에서 현저하게 상승되었다. 이러한 결과는 혈관성 세포간 커뮤니케이션에 있어서 Cx40이 중요한 역할을 한다는 것을 뒷받침해 주는 것으로서, 혈관벽에서의 손상된 간극 결합 커뮤니케이션이, 혈관 저항을 증가시켜 고혈압을 일으키는 내피-의존성 혈관확장 응답 전달의 저하와 관련이 있음을 가리키는 것이다. 최근의 생체내 연구결과 신장에서의 정상적인 압력 오실레이션이 혈압 조절에 극히 중요함을 시사하고 있다^[74]. 따라서, 저조한 세포 대 세포 커플링에 기인하는 손상된 혈관운동 응답은 Cx40 결핍성 동물에 있어서의 고혈압 발병에 기여하는 것일 수 있다.

노화된 내피 세포 중의 단백질 수준과 Cx43 mRNA의 다운-레귤레이션은 손상된 간극 결합 세포간 커뮤니케이션이 혈관 노화 과정에서 어떤 역할을 하 수도 있음을 시사한다^[75].

혈관 응답에 있어서의 간극 결합의 역할에 관한 그간의 정보에 기초할 때, 혈관벽에서의 간극 결합 커플링을 증대시키는 약리학적 화합물은 전도된 혈관 응답을 촉진하고, 증가된 대사 요구도를 나타내는 증상 (예컨대, 물리적 운동, 빈맥) 및 허혈시 혈액 공급을 증대시킬 수 있는 것 같다. 뿐만 아니라, 이러한 물질은 고혈압을 예방시키고/예방시키거나 치료하는 것 같다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 혈관벽에서 간극 결합 커플링 및/또는 GJIC를 증대시키고, 그에 따라, 고혈압을 예방 또는 치료하는데 유용한 화합물을 제공하는데 있다. 이러한 목적은 식 I 내지 VIII, 식 2 내지 12의 펩타이드 화합물, 및 표 1 및 표 8의 화합물과 같은 본 발명에 펩타이드 화합물, 더욱 구체적으로는 합성 실시예 1-55의 화합물에 의해 달성된다.

실험과정

모든 실험에 있어서, 래트의 장간막으로부터 분리한 내성 동맥(내경 약 200 mm)을 사용한다. 상기 동맥은 장간막 동맥의 3 번째 순위의 분지이며 14 - 18 주령의 수컷 위스타 래트(Wistar rates)의 장간막으로부터 잘라낸다. 상기 동맥을 동일한 크기의 힘을 측정하기 위한 근수축 기록기에 준비하고, 최대의 힘이 생기도록 수동적으로 잡아당긴다. 조직 배쓰(bath)를 2 등분하고 동맥을 상기 두 개의 반쪽부분에 각각 놓는다. 상기 동맥을 생리적 바이카르보네이트 완충 염 용액에 담궈놓거나, 그렇지 않으면 21% 0₂내의 5% CO₂로 가스처리한다.

혈관 운동(vasomotion)을 측정하기 위하여, 동맥을 준최대 농도의 노르아드레날린으로 활성화시킨다. 이는 내피를 제거한 후 혈관운동과 세포간 커뮤니케이션 정도를 증가시킨다고 알려진 cGMP의 농도를 증가시키면서 수행한다.

내피 기능을 측정하기 위하여, 동맥을 최대 농도에 가까운 농도의 노르아드레날린으로 활성화시키고, 부분적으로는 NO-의존적이고 부분적으로는 EDHF-의존적 경로를 통하여, 이들 동맥에 있어서 내피-의존적으로 동맥을 이완시키는 것으로 알려진 아세틸콜린의 농도를 증가시키면서 노르아드레날린의 존재하에서 이완시킨다.

화합물 2 및 화합물 40의 10-8 M 및 10-6 M의 혈관운동 및 아세틸콜린에 대한 반응에 대한 효과를 측정하였다. 상기 약물이 적어도 5 분 이상 지속되는 경우 예비 인큐베이션을 사용한다.

혈관운동의 측정을 위하여, 조직 배쓰 내의 하나의 동맥을 대조군으로 사용하고 다른 동맥을 화합물 2 및 화합물 40 중 하나로 처리한다.

저산소증(hypoxia) 실험에 있어서, 실험 수행 전에 조직을 N₂내의 5% CO₂에 적어도 5 분 동안 노출시킨다. 이러한 과정에 의하여 배쓰 PO₂가 약 5 mmHg로 감소된다.

본 발명의 화합물이 아세틸콜린-유도 혈관확장 및 혈관운동을 증가시킬 것으로 예상된다. 결론적으로, 이러한 물질들은 고혈압 및 혈관수축과 관련된 혈관성질환의 치료에 유용할 것이다. 투여 방식은 경구 또는 비경구(장관외)일 것이다.

신경 조직에서의 간극 결합 오프너(gap junction opener) 효과

8 가지의 코넥신이 CNS에서 발현된다 (Cx 26, 30, 32, 37, 40, 43, 45, 46). 게다가, Cx36는 뉴런에서 우선적으로 발현되는 것으로 보인다. 상기 서로 다른 코넥신은 다양한 세포 개체군들 사이의 커뮤니케이션을 가능하게 하거나 서포들을 그들의 코넥신 발현 패턴에 따라서 분리된 구획으로 분리한다. 이형 커플링이 기능적 관련성을 가져야 하는 구획 경계면은 희돌기교세포(oligodendrocytes) (Cx32, Cx45)와 성상교세포 (astrocytes) (Cx43, Cx45, Cx40, Cx30) 또는 뉴런 (Cx26, Cx32, Cx43) 사이이다.

일련의 특정 코넥신들이 특정 뇌 구획에 기능적 이점을 제공할 수 있을 것 같다; 즉, 높거나 낮은 단위 전도성이 동시적 신경입력량 또는 전도 속도를 기능적으로 촉진하거나 제한할 것이다.

미성숙 신경아세포와 생후 뉴런에 있어서, 세포간 커플링에 매개되는 확장된 간극 결합이 보고되었다^[76;77]. 뉴런 간극 결합의 생후 증가 및 이들의 피질 구성은 피질형성(corticogenesis)의 중요한 시기에 기초가 되는 형태형성(morphogenetic events)에 있어서의 이들 결합의 필수적인 역할을 암시하는 것이다. 뉴런 트래피킹(neuronal trafficking)에 있어서의 간극 결합의 수반성은 신경전달물질들이 간극 결합 커플링을 변형시킬 수 있다는 사실에 의하여 강화된다.

따라서, GJIC를 증가시키는 것으로 알려진 본 발명의 물질이 신경 손상 후또는 미성숙 세포(원시세포)를 뇌 조직으로 이식하는 동안의 회복을 촉진시킬 수 있다고 생각된다. 현재 수행되고 있는 기술 중에서 중추신경계의 세포 회복에 대한 실험적 측정은 파킨슨 병, 헌팅턴 병 및 다른 신경퇴행성 뇌질환의 치료에 사용되는 바이러스 벡터, 태아조직 및 원시세포를 사용하여 이식하는 것이다.

축색 손상은 액소토마이즈된(axotomized) 뉴런에 인접한 성상교세포 및 소교세포(microglial cells)를 급속하게 활성화시킨다. 운동 축색 손상 후, 성상교세포는 수 시간 내에 간극 결합 단백질 코넥신-43을 제어하고, 하루 이내에 GFAP(glial fibrillary acidic protein)을 제어한다. 이와 동시에, 소교세포는 증식하고 액소토마이즈된 뉴런 주핵체(perikarya) 쪽으로 이동한다. 축색 손상 후의 신경교세포(glial cell) 활성에 대한 가설적 개요는 손상된 뉴런이 GJIC를 통하여 인접한 성상교세포와 처음으로 상호작용한다는 것을 암시한다. 그리고 나서, 이웃하는 나머지 소교세포가 활성화된다. 이러한 신경교세포 반응은 파라분비(paracrine) 및 자율분비(autocrine) 메카니즘에 의하여 증폭되며, 이 때, 사이토카인이 중요한 매개물질인 것으로 보인다. 활성화된 신경교세포의 특이적 기능적 특성은 뉴런 생존, 축색 재생 및 시냅스 유연성에 대한 이들의 영향을 결정할 것이다. 따라서, 이러한 반응의 유도 및 진행의 조절은, 예컨대, 신경외상(neurotrauma), 뇌의 허혈 및 만성 신경퇴행성 질병의 결과에 중요한 것으로 보인다^[78].

간극 결합이 신경교세포 분획의 각각의 멤버들 사이의 공동으로 작용하는 장거리 시그널 작용을 위한 분자 연결을 제공하는 것으로 생각된다. 이와 유사하게, 성상교세포는, 혈관 베드(bed)와 극단적으로 접촉하는 한 쪽 극과 뉴런 유조직과 인접한 다른 쪽 극으로 기능적으로 분극되기 때문에, 뉴런의 대사 지원에 이론상 적합하다^[76]. 따라서, 이와 같은 지원 메카니즘의 기능부전은 통합 뉴런 경로의 기능부전에 영향을 미칠 수 있고, 이에 의하여, 중추신경계에서의 질병의 결과를 낳을 수 있을 것이다. 따라서, GJIC를 증가시키는 것으로 나타난 본 발명의 물질은 신경교세포와 뉴런 사이의 대사 지원을 증가시킴으로써 뇌에서의 허혈 손상을 예방할 수 있을 것으로 생각된다. 게다가, 본 발명의 물질은 우울증, 분노, 학습 및 기억 장애, 공포 및 환각과 같은 소견으로 존재할 수 있는 기질적 정신증(organic psychoses) 환자에 있어서 매우 중요하다. 따라서, 본 발명의 목적은 뇌에서의 허혈성 손상을 예방하는데 사용되는 약제의 제조 및 우울, 분노, 학습 및 기억 장애, 공포 및 환각을 포함하는 기질적 정신증의 치료를 위한 화합물을 제공하는 것이다. 이러한 목적은, 본 발명의 펩타이드 화합물이 중추신경계에 사용가능하도록 선택되고 제제화된 경우, 이를 사용하여 달성한다.

신경 조직

소교세포가 중추신경계(CNS)의 주요한 면역 작용인자이고, 두부 손상 및 허혈, 신경퇴행성 질환, 자가면역질환, 전염성 질환, 프리온 질병, 및 뇌종양을 포함하는 뇌 염증성 반응을 유발하는 광범위한 손상에 반응하여 활성화된다는 것이 잘 알려져 있다. 활성화된 소교세포는 손상된 CNS 부위로 이동하여, 증식하고 점차적으로 세포 단편들을 제거한다. Eugeninet al.은 소교세포가 염증성 사이토카인에 의하여 유도되는 간극 결합을 통하여 서로 커뮤니케이션 할 수 있다는 것을 보여준다 (Eugen n, E A, Eckardt, D, Theis, M, Willecke, K, Bennett, M V L and Saez, J C: Microglia at brain stab wounds express connexin 43 and in vitro form functional gap junctions after treatment with interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 98,4190-4195, 2001). 이러한 사실은 다음의 실험들에서 입증되었다. 뇌 자상(stab wounds)에서, 소교세포는 수 일에 걸쳐서 점진적으로 축적되어 세포들 사이의 경계면에서 Cx43 면역반응성을 빈번하게 나타내는 응집체를 형성하였다. 초기 배양에 있어서, 소교세포는 웨스턴 블라팅에 의하여 측정되는 낮은 수준의 Cx43, 확산 세포간 Cx43 면역반응성, 및 낮은 빈도의 염료 커플링(dye coupling)을 나타낸다. 면역촉진 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 사이토카인 인터페론-감마(INF-감마) 또는 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파)를 한번에 하나씩 사용하는 처리는 염료 커플링의 빈도를 증가시키지 않았다. 그러나, INF-감마와 LPS를 함께 사용하여 처리된 소교세포는 염료 커플링의 극적인 증가는 나타내며, 이 때, 항-TNF-알파 항체의 공동적용에 의하여 염료 커플링을 예방할 수 있고, 이는 TNF-알파의 방출 및 자가분비 작용을 암시한다. INF-감마와 TNF-알파를 함께 사용하는 처리 또한 Cx43을 세포-세포 접촉부위로 이동시키면서 Cx43 수준과 염료 커플링 빈도를 매우 증가시킨다. 사이토카인-유도 염료 커플링은 간극 결합 차단제인 18-글리시레틴(glycyrrhetinic) 산에 의하여 가역적으로 억제된다. 배양된 마우스의 소교세포 역시 Cx43을 발현하였고, 사이토카인으로 처리시 염료 커플링을 일으켰지만, 동형접합 Cx43 결핍 마우스로부터 얻은 소교세포는 INF-감마와 LPS를 함께 처리하거나 INF-감마와 TNF-알파를 함께 처리한 후 눈에 띄는 염료 커플링을 나타내지 않았다.

화합물 2 및 화합물 40에 의하여 간극 결합 커뮤니케이션이 활성화되기 때문에, 이들 화합물이 소교세포의 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키고, 그럼으로써 상기한 질환(두부 손상 및 허혈, 신경퇴행성 질환, 자가면역질환, 전염성 질환, 프리온 질환 및 뇌종양을 포함하는 뇌 감염성 반응)에서의 "치유" 진행을 증대시키거나 가속시킬 것이라고 예상된다 .

이러한 내용을 구체화시키기 위하여, 병에 걸린 소교세포에 화합물 2 및 화합물 40을 10^-11- 10^-8M 범위의 농도로 투여하면서, 상기한 "Eugenin et al. 2001"의 실험 설계를 사용하는 소교세포 배양 실험을 수행할 수 있다. 이러한 실험은 간극 결합 커플링에 대한 화합물 2 및 화합물 40의 촉진 효과를 보여주고 18알파-글리시레틴산 효과를 중화시킬 것으로 예상된다. 본 발명의 화합물은 또한 성상교세포 간극 결합 제어에 대한 허혈 작용의 연구를 위한 Nagy JI and Li WE (Eur J Neurosci 2000 Dec; 12 (12): 4567-72)에 기재된 생체외 모델에 사용될 수 있다.

폐 조직 - 폐포 세포

폐포 세포 간의 간극 결합을 통한 폐포 세포간 커뮤니케이션은 이온 수송 전달, 기계화학적 시그널 변환, 세포성장의 제어 및 계면활성 인자의 분비에 중요하다 (Ashino Y, Ying X, Dobbs LG, Bhattacharya J. (Am J Physiol Lung MolPhysiol 2000; 279: L5-L13)). 폐의 폐포 부위의 급성 또는 만성 감염성 손상 후의 생체내 회복은 세포외 기질의 일부분으로서의 피브로넥틴의 생성을 수반한다 (Charash WE, Vincent PA, Saba TM, Minnear FL, Mc Keown-Longo PJ, Migliozzi JA, Lewis MA"Lewis E, Giunta C. (Am Rev Respir Dis 1993; 148: 467-476) 및 Torikata C, Villiger B, Charles Kuhn I, McDonald JA. (Lab Invest 1985; 52: 399-408)). 폐포 상피 세포 배양 연구는 세포외 피브로넥틴 농도 증가와 함께 간극 결합의 수가 증가한다는 것을 보여준다 (Alford AI, Rannels DE. (Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001; 280: L680-L688)). 동물 생체내 실험에 의하여 이산화질소가 폐포조직, 말단 기관세지 벽, 폐포도관 및 기관세지 주위 폐포 모두에 있어서의 심각한 폐 감염을 유도한 후 간극 결합의 수가 감소한다는 것이 발견되었다. 이러한 연구결과는 분량 의존적(dose dependent)이었다. 그러나, 타우린으로 전처리된 경우, 이러한 간극 결합의 감소는 뚜렷한 감염 반응의 감소와 함께 억제된다. 래트의 폐의 방사선 치료 후 및 화학요법 화합물, 블레오마이신(Bleomycin)으로 처리 한 후 유사한 결과가 관찰되었다.

따라서, 폐 조직에서 간극 결합 커뮤니케이션을 유지하는 것은 폐 섬유증(fibrosis)을 예방하는데 중요한 것으로 보이고, 방사선 조사, 공기 유래 파괴 물질, 가스 흡입과 같은 여러가지 독성 자극 및 감염 진행에 대한 반응으로서 코넥신의 양의 감소가 나타난다. 간극 결합 개방 또는 간극 결합 커뮤니케이션을 촉진시키는 화합물을 사용하는 전처리는, 예컨대, 폐암에 노출된 폐의 방사선 치료, 갑상선암, 식도암 및 유방암 치료 전에 지시될 것이다.

본 발명에 따른 치료방법은 단독 활성제로서 본 명세서에 기재된 화합물을 한 가지 이상 사용할수 있다. 바람직하게, 상기 화합물 중 한 가지를 사용할 수 있다. 원하는 경우, 이러한 화합물을 예방적 차원에서, 즉, 특정 징후 또는 증상의 심각성을 예방하거나 감소시키는데 사용할 수 있다. 대안적으로, 상기 화합물을 승인된 치료적 접근과 함께 사용할 수 있다. 방사선 처리된 구체예의 일례로서, 상기 치료방법은 "부가(add on)", 즉, 증상의 치료를 위하여 승인된 치료법과 함께 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 이와 같은 본 발명의 "부가" 치료 방법은 필요한 승인된 치료법 후 상이한 시간에 수행하거나 승인된 치료법과 동시에 수행할 수 있다. 다양한 질병과 의학적 증상에 대한 확립된 치료적 접근들이 개시되어 있다. 통상적으로, 예컨대, "Harrison's Principles oflnternal Medicine (1991) 12 ed., McGraw-Hill, Inc."과 "The Pharmacological Basis of Therapeutics (1996) Goodman, Louis S. 9th ed Pergammon Press"를 참조하라; 이들의 기재는 참조로서 본 명세서에 포함된다.

간극 결합 개방을 촉진하거나 매개하는 화합물을 사용하는 치료는 폐기종, 석면침착증(asbestosis), 규폐증(silicosis), 폐 섬유증, 폐렴, 약물 유도 폐 섬유증 및 이산화질소와 같은 폐 독성 가스에 노출된 환자에서의 추가적인 폐 기능 감퇴를 예방할 것이다. 이러한 치료는 이들 증상의 통상적인 치료에 "부가"하여 하는 것이 바람직할 것이다.

래트의 폐로부터 분리된 세포 또는 상업적으로 입수가능한 인간 세포주를 포함하는 폐포 상피 세포 배양물에서 상기 화합물을 생체외적으로 시험할 수 있다(Rannels SR, Rannels DE. (In: Cell Biology. A Laboratory Handbook, ed by Celis JE. San Diego, CA: Academic 1994, p 116-123), Abraham V, Chou ML, DeBolt KM, Koval M (Am J Physio) Lung Cell Mol Physiol 1999 ; 276: L825-L834)). 항생제와 소의 태아 혈청을 함유하는 Earle의 최소 필수 배지 내의 표준 조직 배양 콜라겐 코팅 플라스틱 디쉬에서 세포를 배양할 수 있다. 세포를 융합층까지 성장시킨다. 간극 결합 커뮤니케이션은 마이크로인젝션법을 통하여 세포내로 투여된 150 mM LiCl 내의 4% 루시퍼 옐로우 용액에 의하여 직접적으로 측정한다. 상기 추적자는 3 분 동안에 단순 확산에 의하여 세포를 채울 수 있다. 주입 단계 후, 피펫을 제거하고 형광 세포의 수를 측정한다. 형광 세포의 수는 상기한 간극 결합 촉진제를 10^-10-10^-7M (펩타이드) 범위 내에서 상이한 분량으로 사용하거나 사용하지 않고 다양한 간극 결합 억제제 동안에 측정한다.

화합물 2와 같은, 본 명세서의 바람직한 간극 결합 오프너를 또한 약물 유도 폐 섬유증 및 방사선 유도 폐 섬유증 동안의 동물 실험에서 생체내적으로 시험할 것이다. 동물을 유도인자에 노출시키고 그 결과를 측정하고, 화합물 2로 전처리된 동물에서의 결과와 비교한다. 투여 분량은, 예컨대, 상기한 염화칼슘 유발 부정맥 모델에서 결정되는, 화합물의 생물학적 역학에 따라, 10^-10내지 10^-7mol/kg 범위일 것이다. 상기 화합물은 경구적, 비경구적, 코속 또는 폐 흡입을 통하여 투여한다.

평활근

혈관계. 간극 결합 채널을 통한 세포간 커뮤니케이션은 전체혈관수(vascular tree)의 혈관 근육세포 긴장상태(tone)을 제어하고 조절하는데 기본적인 역할을 한다 (Christ GJ, Spray DC, Moore LK, EI-Sabban ME, Brink PR. (Circ Res. 1996; 79: 631-646)). 간극 결합 커뮤니케이션의 또 다른 중요한 역할은 혈관 확장 반응에 수반되는 평활근 세포 간 과분극의 확산이다 (Benny JL, Paicca C. Am J Physiol Heart Circ Physiol 1994; 266: H1465-72)). 내피의 특수화된 기능은 단일층 내의 내피 세포 간 및 내피와 혈관벽에 존재하는 다른 세포 간의 간극 결합 세포간 커뮤니케이션을 필요로 한다. 관상 모세혈관 뿐 아니라 다른 혈관 내에서의 간극 결합을 통한 이들 상이한 세포 유형 간의 커뮤니케이션이 몇 몇 연구에서 입증되었다. 적응성 동맥형성의 수반성의 증거 또한 입증되었다 (Cai W-J, Koltai S, Kocsis E, Scholz D, Shaper W, Schaper J (J Mol Cell Cardiol 2001; 33: 957-67), Wang H-Z, Day N, Valcic M, Hsieh K, Serels S, Brink PR, Christ GJ. (Am J Physiol Cell Physio. 2001; 281: C75-88), Schuster A, Oishi H, Benny J-L, Stergiopulos N, Meisater J-J. (Am J Physiol Heart Circ Physio. 2001; 280: H1088-96)).

다이어트 유발 고콜레스테롤(hypercholestrolemic) 손상에서와 같이 내피 단일층이 붕괴된 상이한 혈관 병리생리학적 상황에 있어서, 혈관 평활근 내의 간극 결합 커뮤니케이션이 감소한다 (Polacek D, Bech F, McKinsey JF, Davies PF. (J Vasc Res 1997; 34: 19-30). 내피 세포층에서의 손상은 정맥 울혈 동안 및 혈전성 정맥염의 발달시 나타난다. Kwak BR, Pepper MS, Gros DB, Meda P (Molec Biol Cell 2001; 12: 831-845)는 간극 결합 커뮤니케이션이 내피 회복 동안에 세포 이동을 조화시키는 역할을 하고, 또한, 혈관형성 동안의 모세혈관 발생에 중요하다는 것이 명백하게 입증되었다.

간극 결합 커뮤니케이션을 촉진하는 화하물을 사용하는 치료는 혈관 환부에서의 손상된 세포간 커뮤니케이션을 개선시킬 것이고, 특히 기질성 허혈, 예컨대, 간헐성 파행(claudicatio intermittens) 및 심근경색 동안에 유용할 것이다.

그러나, 래트 경동맥의 풍선 카테테르 손상 후의 혈관 치유 진행은 증가된 간극 결합 커뮤니케이션에 의하여 특징화된다 (Yeh HI, Lupu F, Dupont E, Severs NJ, (Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997;17:3174-84). 상기 화합물은 풍선 삽입 전에 투여할 것이고, 이러한 증상의 통상적인 의학적 치료에 부가한 요법이 바람직하다. 화합물의 투여는 비경구적으로 수행할 것이다.

그 결과는 풍선 카테테르 손상 전 및 풍선 카테테르 손상 후의 상이한 시점에서 샘플링된 조직에서 검사하였다. 통상적인 현미경을 사용하여 내피 표면의 보다 빠른 치유가 관찰될 것이다. 또한, 간극 결합 커뮤니케이션의 향상도 관측될 것이다 (Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997 ; 17: 3174-84). 간극 결합 오프너를 사용한 치료는 치유 진행을 증가시킬 것이다.

화합물 2 및 화합물 40과 같은 간극 결합 오프너를 사용하는 치료의 예방효과를 "Yeh HI, Lupu F, Dupont E, Severs NJ, (Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997 ; 17: 3174-84)"에 기재된 바와 같이 설계된 실험에서 검사하였다. 화합물 2 또는 화합물 40을, 예컨대, 상기한 염화칼슘 유발 부정맥 모델에서 결정된 바와 같은,화합물의 생물 역학에 따라 10^-1l내지 10^-8범위내의 분량을 사용하여 풍선 삽입 전에 투여할 것이다. 풍선 카테테르 손상 전 및 풍선 카테테르 후 상이한 시점에서 조직을 샘플링할 것이다. 통상적인 현미경을 사용하여 내피 표면의 보다 빠른 치유가 관찰될 것이다. 또한, 간극 결합 커뮤니케이션의 향상이 관찰될 것이다. 화합물은, 예컨대, 비경구적으로 투여할 것이다.

다른 질병에 있어서, 평활근 세포 간의 간극 결합 커뮤니케이션이 저해된다.해면체(Corpus cavernosum)에 있어서, 병합세포망(syncytial cellular network)이 간극 결합에 의하여 만들어지고, 발기 기능에 중요하고, 성기의 동맥 평활근 세포 및 체 평활근 세포가 일정하고 조화된 방법으로 반응할 수 있도록 한다 (Christ GJ. (Int J Impot Res. 2000; 12 suppl. 4: S15-25), Melman A, Christ JC. (Urolog Clin North America. 2001; 28: 217-31)). 당뇨병, 동맥경화증, 다른 신경학적 질환 및 많은 만성 질환에서 저해된 발기 기능이 관찰된다. 당뇨병 연구로부터, 간극 결합을 통하여 기능적 세포간 커뮤니케이션을 확립하지는 않지만, 신경 자극전달과 세포간 커플링 지점 사이의 역상관성이 신체 환경의 잠재적인 기능적 유연성을 향한다.

간극 결합 개방을 촉진시키는 화합물을 사용하는 치료는 간극 결합을 통한 커뮤니케이션을 향상시켜서 혈관과 해면체의 평활근 세포 간의 복잡한 공동작용을 정상화시킨다.

래트로부터 체 평활근을 분리하고 "Christ GJ, Moreno AP, Melman A, SprayDC. (Am J Physiol 1992; 263: C373-83)"에 기재된 바와 같이 준비한다. 간극 결합 커뮤니케이션은, 예컨대, "Juul MH et al. Cell Adhes Commun 2000; 7 (6): 501-12"에 기재된 바와 같은 FACS 방법을 사용하거나 상기한 바와 같은 마이크로인젝션 기술을 사용하여 루시퍼 옐로우 도는 다른 형광 염료로 측정한다. 형광세포의 수는 개시된 간극 결합 오프너, 예컨대 화합물 2 또는 화합물 40을 10^-10- 10^-8nM 범위에서 서로다른 분량으로 사용하거나 사용하지 않는 다양한 간극 결합 억제 동안에 측정한다. 간극 결합 오프너에 의한 노출 후의 간극 결합 커뮤니케이션의 25 내지 50 % 이상의 향상은 주어진 범위 내의 화합물 농도로 확인할 것이다.

상기 화합물의 발기 기능의 생체내 약리학적 시험은 "by Rehman J, Cheven E, Brink P, Peterseon B, Walcott B, Wen YP, Melman A, Christ G. (Am J Physiol 1997; 272: H1960-71)"에 기재된 바와 같이 래트(8 주령)에 스트렙토조토신(35 mg/kg i.p.)으로 당뇨병을 유발시킨 후 10 주에 검사하였다. 동일한 조사군에 의하여 개시된 측정 및 기술을 사용하여 서로 다른 간극 결합 오프너를 서로 다른 분량으로 국부 및 전신 투여하는 동안에 음경 이완 및 해면체내(intracavernous) 압력을 측정한다. 25% 이상의 음경 이와 및 해면체내 압력의 증가가 관찰될 것이다.

발기 기능부전의 치료는 피하주사로 음경체에 국부적으로 투여하거나 경구투여하여 행할 수 있다. 치료는 단독치료 또는 이러한 증상의 통상적인 치료에 부가한 것일 수 있다.

당뇨성 망막증은 혈류 속도의 변화 (Bursell S-V, Clermont AC, Shiba T,King GL. (Curr Eye Res. 1992; 11 : 287-95), 혈액-망막 장벽의 파손 (Cunha-Vaz JG, Faria de Abrue JR, Campos AJ, Figo GM. (Br J Ophthalmol. 1975; 59: 649-56), Do Carmo A, Ramos P, Reis A, Proenca R, Cunha-Vaz JG. (Exp Eye Res. 1998; 67: 569-75)) 및/또는 자기조절의 감소 (Kohner EM, Patel V, Rassam SMB. (Diabetes 1995; 44: 603-607))를 확인함으로써 질병의 발병 후 초기에 진단할 수 있다. 추적자 운송 및 이중 세포 패취 클램프 기술 (Oku H, Koda T, Sakagami K, Puro DG. (Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42: 1915-1920)) 모두를 사용하여 광범위한 세포-세포 커플링을 입증하였다. 간극 결합 경로의 폐쇄는 망막 미세혈관의 다세포 조직을 붕괴시키고 당뇨성 망막 혈관 기능부전을 일으킨다. "Zhou ZY, Sugawara K, Hashi R, Muramoto K, Mawatari K, Matsukawa T, Liu ZW, Devadas M, Kato S. (Neuroscience. 2001; 102: 959-67)"는 반응성 산소가 간극 결합 비결합 및 글루타치온 공급시의 재결합에 수반된다는 것을 추가적으로 보여주었다.

당뇨성 망막증에 대한 간극 결합 오프너의 효과를 상기한 바와 같은 스트렙토조토신 유발 당뇨 래트를 사용하여 생체외에서 연구할 것이다. 새롭게 분리한 망막 미세혈관 (Sakagami K, Wu DM, Puro DG. J Physiol (Lond). 1999; 521: 637-50)을 "Oku H, Koda T, Sakagami K, Puro DG. (Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 ; 42: 1915-1920)"에 기재된 바와 같이 커버글라스로 옮길 것이다. 이러한 준비에 있어서, 혈관 내 세포간의 세포간 커뮤니케이션을 염료 또는 추적자를 사용하여 측정할 것이다. 10^-10-10^-7M 범위내의 서로 다른 농도의 간극 결합 오프너 화합물 2 또는 화합물 40을 테스트하고 기준선과 비교하여 세포간 커뮤니케이션에 있어서의 현격한 증가가 당뇨성 망막에서 관찰될 것이다. 대조군(건강한 동물)과 비교하는 경우 유사한 향상이 관찰될 것이다. 간극 결합 오프너를 사용하는 치료에 의하여 증상의 진행이 정지하거나 늦추어질 것이다. 치료는 전신적, 국부적 또는 경구적일 것이다.

치료법은 통상적인 항당뇨 치료에 부가하는 것이 바람직하다.

당뇨성 망막증 뿐 아니라예컨대 동맥경화증과 같은 망막 내의 다른 혈관 이상은 간극 결합 오프너를 사용하는 치료에 의하여 간극 결합 커뮤니케이션이 향상됨으로써 호전될 것이다. 간극 결합은 수평세포들을 서로 연결시키고 뉴런 간의 전기적 커플링을 일으킨다고 나타났다 (Raviola E, Gilula NB. (Proc Natl Acad Sci USA. 1975; 65: 192-222), Raviola E, Dacheux RF. (J Neurocytol. 1990; 19: 731-36), Schneeweis DM, Schnapf JL. (Science 1995 ; 268: 1053-56)). 또한, 간극 결합을 통한 간상체와 원추체 간의 암순응(scotopic) 시그널 전달이 나타나 있다 (Bloofield SA, Dacheux RF. (Retinal Eye Res. 2001; 20: 351-384)). 따라서, 간극 결합 오프너는 뉴런 간의 커뮤니케이션을 증가시킬 뿐 아니라 보다 덜 중요한 간상체 또는 원추체를 우회할 수 있고 여전히 암순응 시그널을 시신경으로 전달할 것이다.

다이어트 유발 동맥경화성 망막증에 대한 간극 결합 오프너의 효과를 상기한 바와 같은 래트 모델 (비-당뇨성)을 사용하여 생체외적으로 연구할 것이다. 혈관벽의 세포들 간의 세포간 커뮤니케이션을 마이크로인젝션 후의 루시퍼 옐로우 염료전달 방법 또는 FACS 방법을 사용하여 측정할 것이다. 10^-10- 10^-7M 범위 내의 서로 다른 농도의 간극 결합 오프너 화합물 2 또는 화합물 40을 테스트하고 기준선과 비교하여 세포간 커뮤니케이션에 있어서의 현격한 증가를 관찰할 것이다. 대조군(건강한 동물)과 비교하는 경우 유사한 향상이 관찰될 것이다.

화합물을 비경구적으로 투여할 것이다.

방광(urine bladder)내의 평활근은 위상성 수축(phasic contractions)에 의하여 특징화되며 자발적인 위상성 수축을 보인다. 그러나, 방광은 건강한 상태에서 방광내 압력 증가를 나타냄 없이 수 백 밀리리터의 소변을 포함할 수 있다. 정상 방광과 대조적으로, 불안정한 방광은 절박 요실금(urge incontinence)과 관련된 방광내 압력의 자발적 증가를 나타낸다 (Turner WH, Brading AF. Pharmacol Therap. 1997; 75: 77-110). 위장관 평활근과 비교하여, 방광 평활근은 자발적으로 조화된 수축을 보이지 않는다 (Stevens RJ, Weinert JS, Publcover NG. (Am J Physiol. 199; 2777: C448-60), Hashitani H, Fukuta H, Takano H, Klemm MF, Suzuki H. (J Physio. 2001; 530: 273-86)). 최근 방광 내의 평활근 세포 간의 간극 결합을 통한 전기적 및 형태학상의 커뮤니케이션이 모두 입증되었다 (Hashitani H, Fukuta H, Takano H, Klemm MF, Suzuki H. (J Physio. 2001 ; 530: 273-86), Wang H-Z, Lee SW, Day NS, Christ GL (Urology. 2001; Suppl 6A: 111)). 커뮤니케이션의 특이적 억제에 의하여 이러한 간극 결합의 중요성이 입증되었다. 방광 평활근에서의 자발적 흥분파는 간극 결합을 통해서 전파된다.

따라서, 비-제어 절박 요실금을 간극 결합 오프너를 사용하는 치료를 통해서 제어할 수 있을 것이다.

간극 결합 오프너를 사용하는 치료 후의 간극 결합 커뮤니케이션의 향상을 FACS 분석을 사용하여 방광으로부터 취한 평활근 세포의 배양에서 연구한다. 화합물은 10^-10- 10^-7M 범위의 농도로 투여하고, 낮은 산소 또는 산소 스트레스에 노출된 세포 배양물에서 현격한 커뮤니케이션의 증가를 관찰할 수 있을 것이다.

정상 기니 피그(guinea pigs) 및 실험적으로 방광 기능이 저해된 동물들에서 간극 결합 오프너, 바람직하게는 화합물 2 또는 화합물 40을 사용하여 전처리 및 급성 치료한 후, 방광내 압력을 측정할 것이다. 동물들을 페노바르비탈로 마취시키고 물 유입 및 유출을 가능하게 하는 뇨 카테테르 및 팁-트랜스듀서(tip-transducer)를 갖는 카테테르 모두를 사용하여 방광에 카테테르를 삽입한다. 간극 결합 오프너는 정상적인 체적-압력 관계를 변화시키지 않는 반면, 저해된 방광에서는 이러한 관계가 정상화될 것이다.

비경구, 경구 또는 방광내 투여할 수 있다. 이러한 투여는 방광 내의 근육 수축을 정상화 시키기 위한 약물을 사용하는 치료에 부가하여 행하는 것이 바람직하다.

턱밑샘관, 요도, 담즙관, 췌장관, 눈물관에 존재하는 것과 같은 근상피 세포들은 간극 결합과 연결되어 있으며, 근상피 세포의 수축이 동시에 일어나기 위해서 세포간 커뮤니케이션이 필수적이다 (Taugner R, Schiller A. (Cell Tissue Res.1980; 206: 65-72). 이러한 관에서의 저해된 수축은 간극 결합 오프너의 비경구 또는 경구 투여에 의한 치료에 의하여 정상화될 수 있다.

심장 방실결절(cardiac av node)에서의 세포간 커뮤니케이션은 간극 결합을 통하여 유지된다. 저하된 기능은 전도를 감소시키고 전체적인 방실 차단을 야기할 수 있다. 방실 차단은 급성 심근경색, 허혈성 심장질환, 디기탈리스 중독, 칼슘 채널 차단제 중독에서 관찰되며, 간극 결합 오프너가 방실 전도를 향상시킬 수 있다.

신경차단 마취된 마우스를 CaCl₂(100 mg/kg/min)로 정맥내 주입하여 2 등급 방실 차단을 유발하였다. 10^-11내지 10^-6mol/kg 분량의 간극 결합 오프너로 정맥내 전처리하였을 때, CaCl₂의 투여량이 방실 차단이 관찰되기 전에 보다 현격하게 높았다.

또 다른 측정된 효과는 CaI 유발 2 등급 방실 차단이 관찰되기까지의 부족한 시간이 30 - 65 % 감소되었다는 것이다. 방실 차단의 CaCl₂유도는 "Ronsberg M, Saunders TK, Chan PS, Cervoni P. Med Sci. 1986; 14: 350-51)"에 개시되어 있다.

다양한 등급의 방실차단이 증가되면 간극 결합 커뮤니케이션이 방실 전도를 정상화시킬 것이고, 정상적인 동리듬(sinus rhythm)이 재확립될 것이다.

간극 결합 오프너의 투여는 비경구 또는 경구적일 수 있다.

간극 결합 오프너의 백내장(cataract)에 대한 효과

척추동물의 수정체는 표면에 새로운 세포가 첨가되면서 일생 내내 성장하는 세포들의 고체 낭(cyst)이다. 오래된 세포들은 새로 생겨난 세포들에 의하여 묻히고, 긴 다면체 섬유로 분화되고, 자신의 세포소기관을 잃고, 세포질이 고농도의 용해성 단백질, 크리스탈린으로 채워진다. 오래된 수정체 섬유는 간극 결합에 의하여 자신들과 수정체 표면의 단순 입방형 상피 세포의 앞쪽 층 모두와 상호 연결되어 있다. 이러한 간극 결합망은 소분자와 관련하여 수정체 세포를 융합세포(syncytium)에 연결시키고, 대사 공조: 이온, 대사물 및 물의 세포간 확산을 가능하게 한다. 수정체 표면에서 영양분과 접촉하여, 상피 세포는 그들의 세포내 소기관들을 유지하고, 대사 에너지를 제공하여, 크리스탈라인을 용액내에 유지시키고 응집(백내장)시키지 않는 것과 같이, 수정체 섬유 세포질 내의 정확한 이온 및 대사물 농도를 유지시킬 수 있다. 세 종류의 코넥신이 수정체에 존재하고: Cx43, Cx46 및 Cx50, 이들 각각의 간극 결합 단백질에서의 돌연변이는 백내장과 관련되어 있다^[79-81]. 이러한 연구결과는 GJIC가 수정체의 정상적인 대사 및 기능에 필수적이라는 것을 보여준다. 따라서, GJIC을 증가시키는 것으로 알려진 본 발명의 물질이 백내장의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다는 것을 제안한다.

Cx46 및 Cx50 코넥신에 의하여 형성되는 세포간극 채널은 정상적인 투명한 수정체의 섬유 세포들 간의 커뮤니케이션을 위한 경로를 제공한다. 이들 코넥신이 결여된 녹아웃(knockout) 마우스에서는 크리스탈린의 단백질 분해와 관련된 핵 백내장이 발생된다. 이러한 연구는 세포-세포 시그널화 경로 또는 수정체막과 세포질 단백질의 적절한 구성을 위한 구조적 성분을 제공함에 의한 정상적 수정체 투명도 유지에 있어서의 간극 결합의 중요성을 확립하였다 (Gong et al., Cell 1997 Dec12; 91 (6): 833-43). 세포간 칼슘 농도의 증가는 백내장 발생(cataractogenesis) 과정의 중요한 개시자인 칼슘-의존성 시스테인 프로테아제 Lp82의 활성화에 대한 주된 자극이다 (Baruch et al., J Biol Chem 2001; 276 (31): 28999-9006). 본 발명의 화합물 2 및 40의 백내장 억제 능력을 시험하기 위하여, "Churchill et al. (J Cell Sci 1996 ; 109 (Pt 2): 355-65))"에 개시된 바와 같이 배양된 양 수정체 세포 모델에서의 상기 화합물 (10^-10-10^-6mol/l)의 효과를 시험한다. 요컨대, 세포-대-세포 Ca²⁺시그널화를 Ca(2+)-리포터 염료 푸라(fura)-2 및 형광 현미경을 사용하여 양 상피세포의 초기 배양물에서 조사한다. 마이크로피펫을 사용하는 단일 세포의 기계적 자극에 의하여 2 - 8 층의 주변 세포를 통하여 자극된 세포로부터 확산된 사이토졸의 유리 Ca²⁺이 전달적으로 증가하기 시작한다. 본 발명의 화합물 2 및 40이 수정체 섬유 세포 간의 세포-대-세포 커플링을 증가시키고 백내장을 억제시킬 것이라고 예상된다.

투여 방식은 국소 투여일 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 백내장의 예방 및/또는 치료에 사용가능한 약제의 제조를 위한 화합물을 제공하는 것이다. 이러한 목적은 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1과 8의 화합물, 보다 구체적으로는 합성 실시예 1 내지 55의 화합물과 같은 본 발명의 펩타이드 화합물로서 달성할 수 있다.

귀 질환에 있어서의 간극 결합 오프너의 효과

Cx32의 다양한 많은 돌연변이가 유전성 말초 신경증-난청 X-결합 샤르코-마리-투스 증후군(hereditary peripheral neuropathy-deafness X-linked Charcot-Marie-Tooth syndrome)에서 발견되었고, Cx26과 Cx31의 몇 몇 돌연변이가 난청에서 탐지되었다^[80]. 따라서, GJIC를 증가시킨다고 알려진 본 발명의 물질을 귀 내의 손상된 GJIC와 관련된 특정 종류의 난청의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있음을 제안한다. 따라서, 본 발명의 목적은 손상된 GJIC와 관련된 난청의 예방 및/또는 치료에 사용가능한 약제의 제조를 위한 화합물을 제공하는 것이다. 이러한 목적은 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1과 8의 화합물, 보다 구체적으로는 합성 실시예 1 내지 55의 화합물 및 표8, 표1 및 식 I 내지 VIII의 화합물과 같은 본 발명의 펩타이드 화합물로서 달성할 수 있다.

장 내에서의 간극 결합 오프너의 역할

Cx43와 Cx45 모두 소장벽에서 발현된다^[82]. 소장의 심부 근육총(plexus)을 따라서 있는 Cx45-발현 세포가 특정 종류의 간극 결합을 통한 세포망 조작을 형성함에 의하여 전도 시스템을 유도할 수 있는 페이스메이커(pacemaker)의 성분으로서 작용할 것이라고 생각된다. 장 및 결장에서, 카잘 장세포(Interstitial Cells of Cajal, ICC)가 장 평활근 사이에 위치하는 페이스메이커 세포이다; 이들은 평활근 층에서 자발적인 느린 파동을 발생시켜서 신경전달을 매개한다. ICC의 3-차원적 세포망이 ICC 사이 및 ICC와 평활근 세포 사이 모두에서의 Cx43 간극 결합에 의하여 연결되어 있다^[83]. 히르쉬스프룽병(Hirschsprung's disease) 환자에 있어서, 신경절세포결손 내장(aganglionic bowel)에서의 Cx43 발현의 결여는 ICCs와 평활근 세포간의 손상된 세포간 커뮤니케이션이 부분적으로 이러한 장애의 운동성 기능부전을 초래한다는 것을 암시한다^[83]. 샤가스병(Chagas's disease, 원생동물 트리파노조마 크루지(trypanosoma Cruzii)의 감염에 의한) 환자는 이러한 환자들에서 나타나는 과다하게 확장된 거대결장 뿐 아니라 심근증 모두를 초래하는 것으로 생각되는 현저한 Cx 발현 감소를 나타낸다^[7]. 따라서, ICC 사이 및 ICC와 평활근 사이의 정상적인 간극 결합 커뮤니케이션이 소장 및 결장의 정상적인 운동성을 위하여 필수적인 것으로 생각된다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 목적은 장에서의 세포간극 전도성을 향상시켜 위장 운동성 장애를 치료하는데 사용가능할 수 있는 물질을 제공하는 것이다.

생식기관과 간극 결합

난소

과립막 세포(granulosa cells) 사이 및 난모세포와 주위 과립막 세포 사이의 간극 결합은 난포(ovarian follicle) 발생 동안에 중요한 역할을 한다. 출생시, 난소는 단일층의 지지(과립막) 세포에 의하여 둘러싸인 감수분열 정지 난모세포로 구성된 원시 여포를 포함한다. 정기적으로, 일부 원시 여포가 난모세포의 크기가 증가하고 과랍막 세포가 증식하고 층을 형성하여 체액으로 채워진 강(fluid-filled antrum)을 발달시키는 동안에 추가적인 발생을 거친다. 배란 후, 난모세포가 감수분열을 다시 시작하고 여포 내에 보유된 과립막 세포가 스테로이드합성 세포로 분화되고, 황체를 형성한다.

간극 결합은 인접하는 세포에 직접적으로 연결되어 있어서 이온, 대사물 및 난소 주기와 여성 수정능력을 조절하는데 중요한 다른 잠재적 시그널 분자의 확산 운동을 가능하게 한다. 정상적인 난소 기능에 대한 간극 결합의 필수적 역할을 지지함에 있어서, Cx37-결핍 마우스는 성숙 (Graafian) 여포가 부족하고, 배란을 하지 못하고, 많은 비적합 황체를 발생시킨다는 것이 입증되었다. 게다가, 감수분열 적격 전에서의 난모세포 발생 정지가 달성된다. 따라서, 세포간 채널을 통한 세포-세포 시그널화는 성공적인 난자형성 및 배란에 요구되는 고도로 조화된 일련의 세포 상호작용을 결정적으로 조절한다^[84].

여포-자극 호르몬(FSH)은 난포의 성장 및 발생의 주요한 조절자이다. FSH의 여포 성숙에 대한 많은 작용 중에서, FSH는 과립막 세포 사이의 세포-대-세포 커플링을 증진시키고 Cx43 유전자 발현 및, 가능하게는, 새로운 간극 결합의 형성을 강화시킨다^[85]. 반대로, 황체형성 호르몬(LH)는 난포 내의 세포-대-세포 커뮤니케이션을 저지시켜서 감수 분열의 재개 전 난모 세포 내의 cAMP 농도의 감소를 초래한다^[86].

이러한 데이타는 Cx37 및 Cx43를 통한 정상적인 간극 결합 커뮤니케이션의 존재가 정상적인 여포 성장 및 배란에 필수적이라는 것을 보여준다. 따라서, 여성 불임의 몇몇 유형은 난소 내의 불충분한 세포-대-세포 커플링에 기인하는 것으로 보인다.

그러므로, 세포-대-세포 커플링을 증가시키는 물질은 난소 간극 결합 기능의발현 및/또는 조절이 손상된 여성의 여성 불임 치료를 위하여 사용될 수 있다. GJIC를 증가시키는 능력을 갖는 본 발명의 화합물은 난소 내의 불충분한 세포-대-세포 커플링에 기인하는 여성 불임을 치료하는데 사용가능하다.

자궁

분만에서의 자궁의 강력한 동시적 수축은 간극 결합에 의한 자궁근 평활근 세포의 전기적 커플링에 의존한다. 인간 및 다른 포유류에 있어서, 간극 결합은 임신하지 않은 자궁의 자궁근에서는 얼마 없지만, 출산 예정시기(term) 및/또는 분만 개시시에는 점점 많아진다. 인간 자궁근 평활근 세포에서 발현되는 우세한 간극 결합 단백질은 Cx43이지만, Cx26, Cx40 및 Cx45 또한 인간 자궁근에서 확인된다^[87;88].

분만 동안의 조화된 근육 수축이 매우 중요하기 때문에, 본 발명의 또 다른 목적은 동시적인 근육 수축에 양성적인 영향을 갖는 것으로 예측되는 자궁근에서의 세포-대-세포 커플링을 증가시키는 물질을 제공하는 것이며, 상기 물질은 분만 유도 및 촉진을 위하여 옥시토신과 함께 사용될 수 있을 것이다. 상기 목적은 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1과 8의 화합물, 보다 구체적으로는 합성 실시예 1 내지 55의 화합물 및 표8, 표1 및 식 I 내지 VIII의 화합물과 같은 본 발명의 펩타이드 화합물로 달성된다. 본 발명은 분만 유도 및 촉진을 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 펩타이드 화합물의 용도에 관한 것이다.

Huidobro-Toro JP, Gonzalez R, Varas JA, Rahmer A, Gonzalez R. (Rev Med Chil 2001 Oct; 129 (10) : 1105-12)는 인간 태반 혈관의 율동적 운동 활성과 관련된 페이스메이커 메카니즘의 존재를 평가하고, 간극 결합의 차단이 자발적 수축의 진동수와 진폭을 제거한다는 것을 발견하였다. 이들은 융모막 및 제대 혈관의 순환층에서의 율동적 수축이 혈관 평활근의 순환층에 위치하는 페이스메이커 세포에 의하여 유발되고 간극 결합을 통하여 확산된다고 결론 내렸다; 이는 혈류 제어에 기여하는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 태반 혈액 순환과 태아 발생에 양성적 영향을 미치는 것으로 예상되는 태반 혈관 내의 세포-대-세포 커플링을 증가시키는 물질을 제공하는 것이다. 상기 목적은 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1과 8의 화합물, 보다 구체적으로는 합성 실시예 1 내지 55의 화합물 및 표8, 표1 및 식 I 내지 VIII의 화합물과 같은 본 발명의 펩타이드 화합물로서 달성할 수 있으며, 본 발명은 또한 감소된 태반 혈액 순환의 치료에 사용가능한 약제의 제조를 위한 상기 본 발명의 펩타이드 화합물의 용도와 관련된 것이다.

남성 생식기관

Cx43은 정소 내의 가장 많은 코넥신이며, 흥미롭게도, Cx43 발현이 감소된 래트 계통은 정자형성이 손상된다 (ebo/ebo, jun-d-/-, Cx43 +/- 마우스)^[89]. 게다가, 초기 연구는 저정자증 및 무정자증 환자들은 정소내 간극 결합이 감소되어 있다는 것고 제시하였다^[90]. 이러한 데이터는 정소 내 세포-대-세포 커플링의 감소가 남성 불임을 초래한다는 제안을 지지하는 것이며, 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 세포-대-세포 커플링을 증가시켜서 손상된 세포-대-세포 커플링과 관련된 남성불임의 치료에 있어서 유용한 치료제가 될 수 있는 물질을 제공하는 것이다.

췌장에서의 간극 결합의 역할

Cx43으로 만들어진 간극 결합 채널은 췌장섬 및 래트 인슐리노마 세포주의 글루코스-감수성 세포를 기능적으로 연결시킨다^[91]. 반대로, 인슐린을 비정상적으로 분비하는 몇 몇 세포주의 세포는 Cx43을 발현시키지 아니하며, 간극 결합을 거의 갖지 않고, 잘 커플링되어 있지 않다. Cx43 cDNA의 안정적인 트랜스펙션에 의하여 이러한 결함이 교정된 후, 천연 베타-세포에서 관찰되는 바와 같이, 적당한 수준의 Cx43 및 커플링을 발현하는 세포는 인슐린 유전자의 발현 및 야생형 (언커플링) 세포와 Cx43을 과발현하는 트랜스펙션된 세포 모두에서 관찰되는 바와 비교하여 현저하게 상승된 인슐린 함량을 보인다. 이러한 연구결과는 적절한 인슐린 생산 및 저장에 Cx43의 적절한 커플링이 필요하다는 것을 보여준다^[91]. 또한, 글리벤클라미드(glibenclamide)에 의한 인슐린 분비의 생체내 자극이 증가된 Cx43 발현 및 췌장섬 내의 이웃하는 β-세포들 간의 증가된 세포-대-세포 커플링과 관련있다^[92].

비-인슐린 의존성 당뇨병(diabetes mellitus)에 대한 화합물 2와 화합물 40의 효과를 시험하기 위하여, 6 내지 16 주령의 db/db를 사용한다. 상기 동물들을 오전 6시에 점등하는 12시간/12시간 명/암 주기 후, 통제된 외부 조건(20 ℃, 55-75 % 습도) 하에서 사육한다(3 마우스/사육상자). 이들은 Altromin No. 1324 표준식으로 처리하며, 수도물을 자유롭게 섭취할 수도록 한다. 모든 동물은 적어도 1주일 동안 순응되며, 글루코스 관용성 테스트 전 2 일동안 매일 처리된다. 또한, 스트레스-유발 글루코스 편기운동(excursion)을 감소시키기 위하여, 시험 전에 하기하는 바와 같은 화합물을 사용하지 않고 상기 동물들을 한 가지 이상의 경구 내당능에 대해 테스트하였다.

5 M NaOH를 첨가하여 pH가 7.4로 조절된 0.1 % 소 알부민을 함유하는 0.1 M 포스페이트-완충 염수 (PBS)에 펩타이드를 용해시킨다. 모든 용액을 실험 직전 아침에 새롭게 준비한다. 화합물을 10^-10-10^-6mol/kg의 투여량으로 비경구 투여한다. 비히클(vehicle)-처리 동물에 0.1% 알부민만을 포함하는 PBS를 투여한다.

내당능 시험 전 17 시간 동안 동물들을 금식시킨다. 오전 9시에 시작하여 꼬리 끝에서 혈액을 채취하고(t=~15 min), 혈당을 측정한다. 소량의 혈액 (< 5 ml, Elite Autoanalyser, Bayer, Denmark)을 사용하는 고정화 글루코스 산화효소법에 의하여 전체 혈당 농도(mM)를 분석한다. 시험 당일 아침에 심하게 상승된 혈당 (> 10.5 mM)을 갖는 동물은 제외시킨다. 혈액 샘플 개시 직후, 상기 동물들에게 용제 또는 서로 다른 분량의 화합물을 i.p. 주입한다. 상기 물질의 i.p. 투여 15 분 후, 물에 용해된 글루코스 (200 ml/50 g 체중) 1 g/kg 분량을 p.o. 또는 i.p. 투여하고, 상기 동물들을 다시 사육상자에 넣는다 (t=0). 혈당량은 t = 30 분, t = 60 분, t = 120 분 및 t = 240 분에 측정한다. 동물들을 관찰기간 동안 계속 금식시켰다.

내당능에 대한 화합물의 효과를 분석하기 위하여, 혈당에 있어서의기준치(t=0)와의 절대적 및 상대적 차이를 글루코스 로딩 후 각각의 시점에서 계산한다. 모든 시험에 있어서 곡선 아래 면적 트라페조이드(trapezoid) 방법을 이용하여 측정한다. 따라서, 두 세트의 AUCO-240 분 값이 생기고, 하나는 절대적 혈당치 (단위: mM x 분)에 기초하며, 다른 하나는 혈당의 상대적 차이 (단위: % x 분)에 기초한다.

본 발명의 화합물 2와 40이 db/db 마우스의 글루코스 로드에 응답하는 혈당량의 증가를 감소시킬 것이라고 예상된다.

투여는 경구 투여 또는 비경구 투여가 될 것이다.

이러한 관찰결과는 인슐린의 생산 및 분비를 위한 췌장섬 β-세포 간의 간극 결합 커플링의 중요한 역할을 보여준다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 간극 결합의 전기전도성 및/또는 간극 결합 세포간 커뮤니케이션을 증가시켜서 비-인슐린 의존성 당뇨병에서의 내당능을 개선시키는 물질을 제공하는 것이다. 이러한 목적은 식 I 내지 VIII, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 8의 화합물, 보다 구체적으로는, 본 명세서의 합성 실시예 1 내지 55의 화합물과 같은 본 발명의 펩타이드 화합물에 의하여 달성된다.

또한, Ito T, Ogoshi K, Nakano I, Ueda F, Sakai H, Kinjo M, Nawata H (Pancreas 1997 Oct 15: 297-303)는 쥐의 세룰레인(cerulein)-유발 급성 췌장염에서의 간극 결합에 대한 이르소글라딘(Irsogladine)의 효과를 발견하였다. 간극 결합을 통한 세포간 커뮤니케이션(IC: intercellular communication) 능력이 정상 췌장 선방(acinar) 세포에서 발견되며, 간극 결합을 통한 IC의 증진자인 이르소글라딘을 사용하여 세룰레인(Cn)-유발 급성 췌장염에서의 IC의 역할을 조사하였다. 40 ㎍/kg의 Cn을 두 번 복막내 주입함으로써 래트에서 급성 부종성(edematous) 췌장염을 유발시켰다. 첫 번째 Cn 주입 전 15 및 2 시간 전에 이르소글라딘을 다양한 분량(25, 50 또는 100 mg/kg 체중)으로 래트에 투여하였다. 정상 대조군에는 용제만을 투여하였다. 첫 번째 Cn 주입 5 시간 후 췌장염의 증세를 효소적 및 조직학적으로 평가하였다. Cn-유발 급성 췌장염에 있어서, 이르소글라딘은 분량-의존적 방식으로 혈청 아밀라아제 농도, 췌장 습중량 및 췌장 아밀라아제 및 DNA 함량을 현격하게 감소시킨다. 특히, 아밀라아제 함량이 정상 대조군 수준으로 개선된다. 조직학적으로, 이르소글라딘으로 치료함으로써 췌장염의 증세가 현격하게 감소하였으며, 100 mg/kg 이르소글라딘 치료를 받은 군에서 인식가능한 공포형성(vacuolization)이 관찰되었다. 항-코넥신 32 (Cx32: 간극 결합 단백질) 항체로 췌장을 면역형광염색함으로써, 대조군에서는 췌장 소포(acini)가 Cx32에 대하여 확산적으로 양성적이지만, 췌장염 군에서는 Cx32-양성 그레인의 수가 현저하게, 19%까지 감소하였다. 100 mg/kg 이르소글라딘 치료로써, Cx-32 그레인 수가 정상 대조군 수치인 70%까지 회복되었다. 이러한 연구결과는 간극 결합을 통한 IC가 Cn-유발 췌장염에서 저지되며, 이는 조직 항상성의 붕괴 및 급성 췌장염의 진행을 초래할 수 있다.

따라서, 본 명세서에 기재된 펩타이드는 췌장염의 치료에 유용하다. 이러한 기재를 구체화하기 위하여, 상기한 "Ito T et al. 2001"의 일반적인 실험설계를 사용하여, 화합물 2와 화합물 40을 10^-11-10^-8M 범위의 농도로 래트에 투여하여, 래트에서의 실험을 수행할 수 있다. 이러한 실험은 간극 결합 커플링에 대한 화합물 2와 화합물 40의 촉진 효과를 보여주고 세룰레인의 효과를 방해할 것으로 예상된다.

상기 펩타이드는 정맥내 투여할 수 있다.

혈전증에서의 간극 결합 오프너 (항부정맥 펩타이드)의 효과

본 발명의 물질과 밀접한 관련이 있는 두 펩타이드는 이미 항혈전 활성을 갖는다고 나타나 있다. 따라서, Dikshit et al.^[15]은 펩타이드 Gly-Pro-Prp-Gly-Ala-Gly 및 Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly가 콜라겐과 아드레날린이 i.v. 투여된 마우스에서 폐 색전증의 발생을 억제시킨다는 것을 발견하였다. US 4,775,743는 서열 N-3-(4-히드록시페닐)프로피오닐-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH를 가지며 항 혈소판 응집 활성을 갖는 AAP의 펩타이드 유도체 HP5를 기재한다. 본 발명의 화합물은 현저한 유사성을 가지며 혈전증에 대하여 유사한 효과를 가질 수 있는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명의 물질은 혈전증 예방에 사용될 수 있다.

면역학

세포-대-세포 상호작용은 림프구 성숙 및 활성화를 위하여 중요하다. 광범위한 막 분자는 면역계에서의 세포 이동 및 활성화 동안의 세포-세포 시그널화를 보증한다. 순환하는 인간 T, B 및 NK 림프구는 Cx43을 발현시키며, 상기한 바와 같은 염색 방법을 사용하여 세포 간의 간극 결합을 입증하였다. 또한, 세포간 간극 결합 커플링의 감소는 IgM, IgG 및 IgA의 분비를 현저하게 감소시키며, 이는 간극 결합을 가로지르는 세포간 시그널화가 면역계의 대사 협력에 기본이 되는 메카니즘의 중요한 구성성분이라는 것을 나타낸다 (Oviedo-Orta E, Hoy T, Evans WH. (Immunology. 2000 ; 99: 578-90), Oviedo-Orta E, Gasque P, Evans WH. (FASEB. 2001; 15: 768-774)).

아만성적 또는 만성적 염증에 있어서, 이뮤노글로불린 합성의 국부적 증가 병인(aethiology)에 관계없이 바람직하다. 염증 동안의 조직은 종종 정상적인 건강한 조직과 다르며 낮은 산소 장력이 세포간 간극 결합 커뮤니케이션의 언커플링(uncoupling)을 생산한다. GJIC 언커플링에 대한 낮은 산소의 중요성이 산소 장력이 GJIC의 보편적인 조절자라는 것을 제안하는 몇 몇 다른 세포계에서 입증되었다.

신생 래트 심실 심근세포의 초기 배양에 있어서, In primary cultures of neonatal rat ventricular cardiomyocytes, 산소 및 글루코스 결핍은 정상 대기 및 영양 상태에서 약 50% 까지의 포스포이노시톨(phosphoinositol, PI) 대사치환(turnover)의 노르아드레날린-유발 자극의 감소를 초래한다. 간극 결합 변형인자 화합물 2는 PI 대사치환을 약 90 %까지 상승시킴으로써 이러한 산소 및 글루코스 결핍 동안의 손상된 PI 대사치환의 노르아드레날린-유발 자극을 정상화시킨다. 또한, 화합물 2가 정상 대기 및 영양 조건 동안 PI 대사치환의 노르아드레날린-유발 수준을 변화시키지 않는 다는 것이 나타났다 (Meier, E and Beck, M M: ZS42-0123 enhances norepinephrine (NE)-induced phosphoinositol (PI) turnover in cultured cardiomyocytes during metabolic stress. 2001International Gap Junction Conference, Aug 4-9,2001, Hawaii, USA, abstract no. 132). 또한, 배양된 인간 골아세포 배양물 및 골아세포 래트 골육종 세포주에 있어서, 저산소증은 루시퍼 옐로우 주입 후 염료 이동으로서 측정되는 바와 같이 세포간 칼슘 웨이브 전달을 감소시킨다. 이러한 감소는 화합물 2로 치료함으로서 완전하게 역전될 수 있다 (Teilmann, S C, Henriksen, Z, Meier, E, Petersen, J S, Srensen, O H and Jorgensen, N R: The gap junction opener ZS42-0123 enhances intercellular communication in osteoblastic cells. 2001 International Gap Junction Conference, Aug 4-9,2001, Hawaii, USA, abstract no. 176).

염증 동안의 세포 언커플링 때문에, 간극 결합 오프너는 염증 동안의 이뮤노글로불린의 합성을 향상시킬 것이다. 이뮤노글로불린 합성에 대한 간극 결합 오프너 효과의 생체내 테스트는 인간 편도선으로부터 분리되고 "Oviedo-Orta E, Gasque P, Evans WH. (FASEB. 2001; 15: 768774)"에 기재된 바와 같이 정제된 자극 및 비자극된 T 림프구와 B 림프구에서 시험할 것이다. 이뮤노글로불린은 ELISAs에 의하여 측정되고 간극 결합은 FACS 분석에 의하여 측정될 것이다. 간극 결합 오프너는 10^-10내지 10^-7M 농도에서 시험될 것이다. 생체내 약리학적 테스팅은 비-전염성 및 전염성 모델 모두의 실험적 염증 모델에서 수행할 것이다. 생체내 약리학적 테스팅을 다음과 같은 일련의 동물 모델에서 실험적으로 수행할 수 있다: 1) 카라기난(carrageenan)-유발 래트 후족 부종의 억제 (발 부피), 2) 래트에서의 공기낭으로의 카라기난-유발 세포 보충(recruitment)의 감쇠 (백혈구 보충 및 삼출물 부피), 3) 래트 경골-족근골(tibia-tarsal) 관절에서의 스트렙토코커스 세포벽 (SCW)-유발 관절염의 감쇠 (발목관절 팽창), 및 4) 래트에서의 콜라겐-유발 관절염 진행의 감쇠 (임상적 징후 및 관절 팽창).

Ye P, Chapple CC, Kumar RK, 및 Hunter N (J Pathol 192: 58; 2000 Sep)는 염증성 잇몸(gingiva)의 내층 상피에서의 코넥신 26과 43의 현저한 감소가 있다는 것을 보여주었으며, 이는 상피의 조직 내로의 미생물 산물에 대한 효과적인 장벽으로서 작용하는 능력이 치주염에서 심하게 손상된다는 개념을 지지하는 것이다. 따라서, 간극 결합 오프너를, 예컨대, 항생제와 조합하여 사용하는 염증성 잇몸의 치료는 GJIC를 회복시키고 상피를 치유하는데 이점이 있을 수 있다.

말초 신경병 및 신경병 통증

당뇨병, 투석 중, 간경변 및 많은 다른 증상에서 보여지는 바와 같은 말초 신경병과 통증은 체신경과 자율신경을 모두 포함한다고 보고된다. 다양한 증상에서의 말초 신경 손상의 정확한 메카니즘은 여전히 확실하지 않지만, 신경 말단 파괴, 감소된 전도성, 탈수초화(demyelination) 및 증가된 염증 반응이 설명되어 있다. 실험적 설계에 있어서 다양한 증상에 대한 공통점은 증가된 자유 래디칼, 증가된 산화질소, 산소 스트레스 및 자유 래디칼 소거 결함이 나타나고 간극 결합 커뮤니케이션의 감소가 기록된다는 것이다 (Pitre DA, Seifert JL, Bauer JA (Neurosci Lett. 2001; 303: 6771), Bolanos JP, Medina JM. (J Neurochem. 1996; 66: 2019-9), Low PA, Nickander, KK. (Diabetes. 1991; 40: 873-7), Levy D, Hoke A,Zochone DW. (Neurosci Lett. 1999; 260: 207-9), Bruzzone R, Ressot C. J Eur Neurosci. 1997; 9: 1-6)). 래트의 성상세포 또는 슈반 세포의 배양물에서 생체외 연구를 수행하고, 산화질소 공여자로서 소듐 니트로프루사이드(sodium nitroprusside)를 사용하여(Blasits S, Maune S, Santos-Sacchi J. (Phlugers Arch. 2000; 440: 710-12)), "Bolanos JP, Medina JM. (J Neurochem. 1996; 66: 2019-9)"에 기재된 바와 같이 화합물 2 및 화합물 40과 같은 간극 결합 오프너를 시험할 것이다. 화합물의 농도는 10^-10및 10^-7M 범위일 것이고, 분량 의존적 간극 결합 개방은 FACS 분석을 사용하여 측정할 것이다.

투여는 비경구적일 것이다

청각 장애

소음 유발 청각 손실, 자유 래디칼 생산과 관련있는 것으로 알려진 노인성 난청(presbycusis)은 달팽이관(cochlea) 내의 코르티 기관으로부터 다이터 세포(Deiters cells)와 헨센 세포(Hensen cells) 모두 간의 간극 결합 커플링의 억제와 관련있다 (Todt I, Ngezahayo A, Ernst A, Kolb H-A. (J Membrane Biol. 2001; 181: 107-114), Blasits S, Maune S, Santos-Sacchi J. (Phlugers Arch. 2000; 440: 710-12) Lagostena L, Ashmore JF, Kachar B. (J Physio. 2001; 531: 693707)). 이들 지지 달팽이관 세포 간의 간극 결합 커뮤니케이션은 감각 세포에 있어서 중요한 항상성을 제공하여 외부 헤어(hair) 세포의 정상적인 신경 활성을 제공한다 (Johnstone BM, Pantuzzi R, Syka J, Sykova E. (J Physiol 1989; 408:77 92)). 이러한 커뮤니케이션은 산화 스트레스 동안에 저해된다 (Todt I, Ngezahayo A, Ernst A, Kolb H-A. (J Membrane Biol. 2001; 181: 107-114). 후천적 또는 나이가 들어감에 따른 청력 손실은 상기 지지 세포의 간극 결합 커뮤니케이션을 유지시킬 수 있는 화합물로 치료함으로써 억제할 수 있다.

"Todt I, Ngezahayo A, Ernst A, Kolb H-A. (J Membrane Biol. 2001; 181: 107-114)"에 기재된 바와 같이 기니 피그로부터 얻은 헨센 세포에서 간극 결합 오프너의 생체외 테스팅을 수행할 것이다. 10^-10-10^-8M 농도 범위의 화합물 2 또는 화합물 40을 사용하여 조사하고, 산소 스트레스 및 기계적 스트레스 조건에 대한 이들의 효과를 연구할 것이다. 상기 화합물을 유발된 간극 결합 언커플링을 현저하게 상쇄시킬 것이다.

화합물 2가 i.v. 주입된 래트를 DPOAE(distortion product otoacoustic emissions) 테스트하였다. 주파수 (f1과 f2)에 있어서 인접한 두 개의 사인-파 톤이 동시에 귀에 존재하였다. 내이에서 방출되는 음은 외부 헤어 세포에 의하여 생산된 굴곡음(distortion products)으로 구성된다. 이들 굴곡음중에서 가장 강한 음은 통상적으로 진동수 2fl-f2이다. 예컨대, 사용된 톤이 1000 Hz (fl) 및 1200 Hz (f2)인 경우, 가장 강한 굴곡음은 2x1000-1200, 또는 800 Hz이 될 것이다. 굴곡음의 상대적인 강도를 두 사인-파와 비교하여 외부 헤어 세포의 보전(integrity)을 측정하는데 사용할 수 있다. kHz.

화합물은 비경구적으로 투여될 것이다.

척추동물 기관 어두운 세포 부분의멜라닌세포들은 간극 결합을 통하여 주로 커뮤니케이팅하고, 엔도림프(endolymph)와 페리림프(perilymph) 간의 물질 수송 역할을 하며, 내이의 미시환경의 항상성을 유지하는데 또한 중요한 역할을 한다 (Masuda M, Usami S-I, Yamazaki K, Takumi Y, Shinkawa H, Kurashima K. (Anat Rec. 2001; 262; 137-146)). 엔도림프 수증(hydrops)은 현기증과 청력 감소로 특징지어지는 다양한 임상적 증상과 관련있다. 간극 결합 커뮤니케이션 능력의 감소는 특정 유형의 수송자를 통하여 근원적으로 분비되거나 방출되는 몇 몇 물질의 트랜스멤브레인 수송을 조절하는데 중요할 수 있다.

연령 의존적 빈혈증과 골수 이식

조혈 원시세포 및 조혈 미시환경의 기질세포 간의 기능적인 간극 결합의 존에 대하여 수 년간 논쟁이 있었지만 현재 인간 간극 결합 커뮤니케이션의 존재가 입증되었다 (Rosendaal M, Gregan A, Green C. Tissue Cell. 1991; 23: 457-470), Durig J, Rosenthal C, Halfmeyer K, Wiemann M, Novotny J, Bingmann D, Duhrsen U, Schirrmacher K. (Brit J Haematol. 2000; 111 : 416-25)). 또한, 상기 커뮤니케이션이 양-방향성이라는 것이 입증되어, 기질세포가 조혈 모세포의 증식 거동을 조절하지만 이들의 기능적 상태는 미성숙 조혈 세포에 의하여 조절된다는 가설을 지지하였다 (Gupta P, Blazar B, Gupta K, Verfaillie C. (Blood. 1998; 91: 3724-3733)).

나이가 들어감에 따라 조혈조직의 기능은 감소되고 중장년층 사람들에게서 빈혈증이 자주 나타난다.

또한, 조혈조직 능력의 감소가 혈액학적 악성종양에서 및 화학적 치료제를 사용하는 치료 후에 나타난다. 범혈구감소증(pancytopenia)을 예방하는데 공여자로부터의 골수이식이 사용된다.

많은 양의 시클로포스파미드(cyclophosphamide)에 노출된 전처리 래트에서 간극 결합 커뮤니케이션을 촉진시키는 화합물의 효과를 연구할 것이다. 이들 동물에서, 골수의 성숙한 조혈세포 생산아 중단되어 있다. 시클로포스파미드 처리 후 서로 다른 시간 간격에서의 망상적혈구의 수는 화합물 2 10^-10M의 내지 약 10^-8M의 약 100 ㎕ 분량을 사용하여 간극 결합 오프너 화합물 2로 전처리된 동물에서 전처리되지 않은 경우와 비교하여 현저하게 높게 나타났다.

상기 약물의 투여는 비경구적일 것이다.

뇌하수체 및 시상하부의 기능감퇴

뇌하수체 전엽에서 분비되는 호르몬은 분, 시, 일 및 계절 내에서 주기 다양성을 보인다. 대부분의 주기적 리듬을 관장하는 신경계 부분은 시교차상 핵(suprachiasmatic nucleus)으로 알려진 시상하부 내의 한 쌍의 구조에 위치한다. 이러한 중추에 있어서 이와 같은 생체시계는 각각의 세포마다 고유한 것이다. 그러나, 조화된 전기적 활성이 간극 결합 커뮤니케이션을 통하여 인접한 세포에 중개된다 (Colwell CS. (J Neurobiol. 2000; 43: 379-88)). 또한, 뇌하수체 전엽이 직접적 신경자극전달을 할 수 없기 때문에, 뇌하수체 내의 간극 결합 매개 세포-대-세포 커뮤니케이션은 충분한 세포-대-세포 조화(coordination) 및 적절하고 적시의호르몬 분비를 가능하게 하기 위하여 요구되는 동시화(synchronization)에 필수불가결하다 (Vitale ML, Cardin J, Gilula NB, Carbajal ME, Pelletier R-M. (Biol Reporo. 2001; 64: 625-633)). Guerineau NC, Bonnefont X, Stoeckel L, Mollard P. (J Biol Chem. 1998; 273: 10389-95)는 자발적으로 활성화된 내분비 세포는 단일 단위이거나 또는 뇌하수체 전엽에 걸쳐서 퍼져있는 동시에 일어나는 간극 결합-커플링된 어셈블리에 배치된다. 자발적 여기 세포 간의 동시성은 기본적 분비의 패턴을 구체화시키는 것을 도와줄 것이다. 뇌하수체 전엽으로부터, 성장호르몬, 프로락틴, 부신피질자극 호르몬, 티레오이드(thyreoid) 호르몬 및 생식선자극호르몬이 시상하부의 자극 호르몬의 조절 하에서 합성된다. 따라서, 하나의 축 내의 복잡한 시상하부-뇌하수체-내분비선의 부정리듬에 있어서의 하나의 메카니즘은 또한 간극 결합을 통한 커뮤니케이션의 감소와 관련있다. 이러한 질환에는 요붕증(diabetes insipidus), 저생식선자극호르몬성 생식선부전증(hypogonadotrope hypogonadism), 점액수종(myxoedema), 부신피질 기능감퇴, 및 왜소증이 있다. 간극 결합 오프너로 치료함으로써 이러한 증상들이 개선될 것이다.

시상하부의 시교차상 핵의 뉴런 또한 최적의 간극 결합 커뮤니케이션에 의존한다. 상기한 축에 있어서, 이러한 부위에서의 작용 모드를 갖는 간극 결합 오프너 또한 주기적 리듬이 저해된 환자에게 이로울 것이다 (Shinohara K, Funabashi T, Mitsishiba D, Kimura F. (Neusosci Lett. 2000; 286: 107-10).

신혈관성 고혈압 및 신장독성

신장 및 내피 특이적 간극 결합은 사구체, 소관 및 사구체내 모세혈관과 방사구체 세동맥(juxaglomerular arterioles)을 포함하는 혈관구조에서 발견되는 신장내에 광범위하게 분포한다 (Haefliger J-A, Demotz S, Braissant O, Suter E. (Kidney Int. 2001; 60: 190201)). 본 발명자들은 구심성 세동맥의 레닌-분비 세포를 연결시키는 간극 결합의 존재를 입증하였다. 간극 결합의 역할은 혈압 증가에 의하여 유도되는 것과 같은 혈액 유래 시그널의 탐지 및 전파에 기여할 것이다. 신장 내에서, 이러한 시그널들은 구심성 세동맥의 내피세포에 의한 자율분비, 파라분비 및 내분비 자극으로 변환되고 레닌-분비 세포로 전달될 필요가 있다. 따라서, 간극 결합 커뮤니케이션은 상호연결된 방사구체를 형성하는데 중요한 역할을 한다. 또한, 간극 결합 채널의 폐쇄 변이에 대한 급속한 개방은 레닌 분비 뿐 아니라 사구체 및 소관 기능을 생리학적 요구에 맞추기 위하여 요구되는 지속적인 피드백을 가능하게 하는 국부적 혈관 변화에 빠르게 반응하는 것을 암시한다. 신장 간극 결합의 손상에 의하여 특징지어지는 질병에는 특정 간극 결합 오프너를 경구적 또는 비경구적으로 투여하는 치료가 유리할 것이다.

중금속은 신장독성이 있고 신장 손상을 유발한다. 래트의 기부(proximal) 소관으로부터 얻은 초기 세포 배양물에 있어서 독성 금속 수은 (Yoshida M, Kujiraoka T, Hara M, Nakazawas H, Sumi Y. (Arch Toxicol. 1998; 72: 192-96)) 뿐 아니라 카드뮴 (Fukumoto M, Kujiraoka T, Hara M, Shibasaki T, Hosoya T, Yoshida M. (Life Sciences. 2001 ; 69: 247-54))도 간극 결합을 언커플링시킨다는 것이 입증되었고, 두 그룹 모두 신장 기능감퇴가 세포간 커뮤니케이션의 감소와 관련있다는 것을 제시한다.

간극 결합을 사용하는 중금속 중독의 치료는 조직 손상을 감소시키고 진행성 조직 황폐화를 예방할 것이다.

소관 세포의 세포 배양물에서 생체외 테스트를 수행하여 중금속에 노출시의 화합물 (10^-10-10^-7M 농도의 화합물 2 또는 화합물 40)의 간극 결합 언커플링의 예방을 조사할 것이다. 상기한 바와 같은 루시퍼 염색법을 사용하여 간극 결합 커뮤니케이션을 시험할 것이다.

실험 동물 (래트)에 중금속을 전신 투여한 후, 사구체 여과율에 대한 클리어란스 마커로서 3H-인슐린을 사용하고, 신장 플라즈마 흐름에 대한 클레어란스 마커로서¹⁴C-표지된 테트라에틸암모늄을 사용하고, 기부 소관 기능에 대한 마커로서 리튬을 사용하여 (Petersen JS, Schalmi M, Lam HR, Christensen S, J. Pharmacol. Esp. Ther. 1991,258: 1-7), 중금속에 대한 장기간 치료 전 및 그 후 서로 다른 시점에서 신장 기능을 측정할 것이다. 화합물 2와 같은, 특정 간극 결합 오프너를 사용하는 장기간 치료는 신장 기능이 손상될 때 시작하며, 치료 후 신장기능 파라미터 (사구체 여과율 및 혈압)의 현저한 개선이 나타날 것이다.

화합물은 비경구적으로 투여될 것이다.

서로 다른 미생물에 의한 전염 뿐 아니라 비-전염성 염증은 신장 기능에 사구체 여과율 감소, 전해물과 물의 배출 감소 및 혈압 변화에 의하여 특징지어지는 현저한 비 특이적 만성적 변화를 유발한다.이들 증상 중 일부는 또한 특정한 간극 결합 오프너로 치료되고 증상이 감소될 것이다.

치아의 발달 및 리모델링

Murakami S 및 Muramatsu T (Anat Embryo. 2001 ; 203 : 367-374)는 간극 결합 커뮤니케이션이 치아모세포(odontoblasts) 간에 존재하고 세포 활성이 이들 세포간 브리지를 통하여 조화된다는 이전 연구를 확인하였다 (Iguchi Y, Yamamura T, Ichikawa T, Hashomot O S, Houriuchi T, Shimono M. (Arch Oral Biol. 1984; 29: 489-497)) 그러나, 이들의 최근 연구에 있어서, 이들 간극 결합 커뮤니케이션이 어린 치아모세포 또는 오래된 치아모세포 뿐 아니라 치아의 초기 발생 동안(전-치아모세포, pre-odontoblast)에도 존재한다는 것을 입증하였다. 또한, 치아모세포의 기초를 이루는 수(pulp) 세포는 간극 결합을 갖는다. 이러한 연구결과는 세포간 간극 결합 커뮤니케이션은 치아 발생 동안 및 치아가 리모델링되고 부식되는 생활주기 동안 모두에 중요하다는 것을 보여준다.

간극 결합 오프너를 사용하는 치료는 저해된 치아의 발달을 정상화시킬 것이다. 치료는 또한 치아의 리모델링을 촉진시켜 치아를 충치에 대하여 보다 저항성 있게 만들 것이다.

화합물 2와 같은 본 발명의 간극 결합 촉진 화합물의 치아모세포 세포간 커뮤니케이션에 대한 효과를 본 명세서에 기재된 골아세포 검사법과 본질적으로 유사한 검사법에서 생체외 시험할 수 있다.

줄기 세포(stem cells)

Lumelsky et al (2001)는 마우스 배아 줄기 세포로부터 인슐린 및 다른 췌장 내분비 호르몬을 발현하는 세포를 얻었다 (Nadya Lumelsky, Olivier Blondel,Pascal Laeng, Ivan Velasco, Rea Ravin, Ron McKay: Differentiation of Embryonic Stem Cells to Insulin-Secreting Structures Similar to Pancreatic Islets. Science, 292,1389-1394, 2001). 상기 세포들은 자가-어셈블리하여 위상 기하학적으로 췌장 세포 유형이 뉴런과 밀접하게 연관되어 있는 정상적인 췌장섬에 유사한 삼-차원적 클러스터를 형성한다. 글루코스는 생체내에서 사용되는 것과 유사한 메카니즘에 의하여 이들 세포로부터의 인슐린 분비를 유발시킨다. 당뇨병 마우스에 주입될 때, 인슐린-생산 세포는 급속한 혈관형성을 거치고 클러스터화된 섬(islet)-유사 구조를 유지한다.

이러한 임상적 상황에서, 배아 줄기 세포-기초 시스템은 인슐린-분비 및 인슐린-분비 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 다른 섬 세포 유형을 동시적으로 생성하고 기능적 구조적 단위로 어셈블리할 수 있도록 할 수 있다. 이러한 단위는 인슐린 생성을 최적화하고 글루코스 항상성의 미세한 제어를 분석하는 물질을 제공할 수 있다. 배아 줄기 세포는 유전적 수단이 섬 발생 및 기능의 분자적 기초를 규명하는데 사용될 수 있기 때문에 이러한 연구에 이상적이다. 세포-기초 치료의 잠재성은 인간 및 인간 이외의 배앙 줄기 세포 및 배아 생식세포를 포함하는 적용을 위한 흥미로운 목적임이 분명하다. 성인 조직 또한 기능적 췌장 세포의 소스로서 사용할 수 있다. 본 명세서에 개시된 분화 시스템은 당뇨병 치료를 위한 기능적 췌장 섬의 소스를 제공할 수 있다. 본 발명자가 알고 있는 바로는, 이것이 내분비 췌장 세포 중 일부 유형은 생체외에서 배아 줄기 세포로부터 생성될 수 있다는 것을 보여주는 첫 번째 보고이다. 사체로부터 얻은 췌장 섬은 이식 후 간에서 작용할 수있지만, 조직거부 문제와 유용성이 해결해야 할 문제로 남아있다. 이식을 위한 면역적합(immunocompatible) 조직의 소스를 많이 생산하기 위한 배아 줄기 세포 공학은 이들 문제점과 당뇨와 관련된 다른 문제점을 극복하기 위한 증대된 전망을 갖는다.

심근 경색은 조직의 손실 및 심장 기능의 손상을 야기한다. 남아있는 근세포는 괴저 조직을 재구성할 수 없고, 경색-후 심장은 시간이 지남에 따라 악화된다. 목적 기관에 대한 손상은 원거리 줄기 세포에 의하여 감지되고, 줄기 세포는 손상 부위로 이동하며 선택적인 줄기 세포 분화를 거친다; 이러한 사건은 구조적 및 기능적 회복을 촉진시킨다. 이러한 간세포의 고도의 유연성은 경색 마우스에서 괴사 심근이 골수 세포 이식에 의하여 회복될 수 있는지 여부를 시험하기 위한 "Orlic et al (Orlic, D, kajstura, J, Chimenti, S, Jakoniuk, I, Anderson, S M, Li, B, Pickel, J, McKay, R, Nadal-Ginard, B, Bodine, D M, Leri, A and Anversa, P: Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 410,701-705 (2001))"를 촉진한다.

이들은 c-키트 발현에 기초한 형광-활성 세포 분류에 의하여 강화된 녹색 형광 단백질을 발현하는 트랜스제닉 마우스로부터 얻은 계통(lineage)-음성적(Lin-) 골수 세포를 분류하였다. 관상동맥 결찰(ligation) 직후, Lin-c-kitPOS 세포를 경색과 접하는 수축성 벽에 주입하였다. 이들은 골수 세포 이식 후 9 일 되는 때의 심실의 경색된 부위의 68%를 새롭게 형성된 심근이 차지한다는 것을 발견하였다. 발생중인 조직은 증식성 근세포와 혈관형성 구조를 포함하였다. 이들의 연구는 국부적으로 이식된 골수 세포가 새로운 심근을 생성하고 관상동맥질환의 결과를 개선시킬 수 있다는 것을 보여준다.

이들 근세포의 특성을 보다 특징화하기 위하여, 이들은 코넥신 43의 발현을 측정하였다. 상기 단백질은 근세포 간의 플라즈마-멤브레인 채널의 형성을 통한 전기적 커플링과 세포간 연결에 관여한다; 코넥신 43은 세포질 및 근접하여 정렬되어 있는 분화중인 세포의 표면에서 나타난다. 이러한 결과는 심장 근육 표현형의 기대되는 기능적 능력과 일치하는 것이었다.

배아 줄기 세포로부터 기능적 세포가 생성되고, 코넥신이 실질적으로 경색된 심장 조직의 이러한 세포에서 발현되기 때문에, 이것이 배아 줄기 세포로부터 분화된 다른 세포들에 대한 일례가 될 것이라고 추측된다. 또한, 코넥신이 이들 조직(췌장 베타 세포와 심장 근육세포를 포함)의 기능에 있어서 지배적인 역할을 하기 때문에, 간극 결합 커플링에 의하여 화합물 2 및 화합물 40과 같은 화합물이 줄기 세포가 이식된 기관에서 배아 줄기 세포가 기능적 세포들로 증식하는 것을 증진시킬 것이라고 추측된다.

따라서, 화합물 2 및 화합물 40과 같은 간극 결합 오프너가 당뇨병 치료에 있어서 췌장, 심장 경색 치료에 있어서 심장 및 파킨슨병 치료에 있어서 뇌의 기초 신경절과 같은 이식된 기관에서 줄기 세포가 기능성 세포로 변이하는 것을 촉진할 것이라고 주장한다.

이러한 기재를 구체화시키기 위하여, 증식 과정 동안 화합물 2와 화합물 40을 반복적으로 투여하면서, 상기 "Orlic et al (Nature 410,701-705 (2001))"에 기재된 바와 같은 심근경색에 대한 일반적인 실험설계를 사용하여 실험을 수행할 수 있다. 이러한 실험은 화합물 2 및 화합물 40에 의한 코넥신 43 발현의 증가와 보다 빠른 재생 과정을 보일 것으로 기대된다.

담배 관련 질병

McKarns SC, Doolittle DJ (Toxicol Appl Pharmacol 1991 Oct 111: 58-68)는 세포간 커뮤니케이션에 대한 담배 연기 농축물의 효과를 연구하였다. 이들 연구의 목적은 생체외에서 세포간 커뮤니케이션 총량과 속도 모두에 대한 담배-가열 및 담배-연소 담배의 메인스트림 담배 연기 농축물(CSC)의 활성을 정량하고 비교하는 것이었다. 플라즈마 멤브레인 독성을 평가하기 위하여 루시퍼 옐로우 흡수 및 락테이트 탈수소효소 방출 분석을 사용하였다. 플라즈마 멤브레인에 독성이 없는 CSCs 농도에 1 시간 노출시킨 다음 광표백 후 형광 재분포(FRAP)를 정량함으로써 간극 결합 세포간 커뮤니케이션 (GJIC)을 측정하였다. 세포주기 G1기에서 동시화된 인간 피부 섬유아세포((MSU-2 세포)와 래트 간 상피세포(WB 세포)에서 GJIC를 정량하였다. 시험된 각각의 세포에 있어서, 담배-가열 담배로부터 얻은 CSC는 담배-연소 담배로부터 얻은 CSC가 GJIC의 총량 및 속도 모두를 현저하게 억제시킨 농도에서 GJIC를 억제하지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 화합물 2와 화합물 40 또는 본 명세서의 식 I 내지 VIII과 표 1 및 8과 같은 간극 결합 오프너가 담배 연기 농축물에 의하여 야기되는 GJIC 억제를 예방하거나 완화시킬 것이라고 주장한다. 간극 결합의 언커플링과 관련된 담배 관련 질병은, 특히 외과수술 후의, 손상된 상처 치유 및 피부 노화를 포함한다.

본 발명의 목적은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 의학적 징후 및 증상을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하는 것이다. 전형적으로, 이러한 방법은 상기한 화합물을 한 가지 이상, 바람직하게는 상기 화합물 중 한 가지를 징후 또는 증상의 정도를 치료, 예방 또는 감소시키는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적인 투여 방법은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이고, 예컨대, 성별, 체중, 일반적 건강상태 및 치료 또는 예방할 특정 징후 또는 증상에 따라서 달라질 것이다. 논의된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 화합물은 본 발명의 방법에 있어서 단독 활성제로서 사용할 수 있다. 또한, 이들은 공지의 치료방법과 함께 화합물 I을 사용하는 것과 같은 "부가적" 치료법에 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서 치료 또는 예방할 바람직한 징후 또는 증상은 일반적으로 손상된 세포 커뮤니케이션 도는 손상된 간극 결합 기능과 관련된 것이다. 본 발명과 관련된 보다 상세한 징후 및 증상은 상기한 바와 같다.

AAP 수용체로부터의 시그널 도입을 통하여 GJIC를 증진시킬 것으로 예상되는 AAP 수용체 아고니스트(agonist), 또는 다른 방법으로 간극 결합 및 코넥신의 정상적 기능을 촉진하는 물질 또는 화합물과 같이, 간극 결합 기능에 보다 구체적으로 영향을 미치는 물질을 사용하여 손상된 세포 커뮤니케이션 또는 GJIC 감소와 관련된 질병을 치료하는 것이 유리하다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진하는 화합물은 펩타이드 서열을 나타내는 일반식 I의 화합물, 식 I의 펩타이드 서열의 레트로형, 모든 D 형, 또는 레트로 올(all)-D 형, 및 그들의 염 및 아미드 중에서 선택된다:

식 중, 아미노산 잔기들은 D- 및/또는 L-형이고, N*에 N-말단을 갖고 C*에 C-말단을 가지며, 점선에 의하여 보여지는 바와 같은 N*와 C* 사이 또는 점선 U에 의하여 보여지는 바와 같은 R_d와 C* 사이의 공유결합에 의하여 임의적으로 고리형일 수 있으며; 상기 N*와 C* 사이의 점선은 존재시 결합 U가 배제되고, 임의적 공유 결합을 나타내며, 상기 결합이 존재하지 않으면 N*이 수소 원자에 결합하며; R_d와 C* 사이의 임의적 공유결합 U가 존재하면 R7은 부재하며, R7의 존재는 결합 U를 배제하고; 여기서

X는 아미노 말단 N8에 결합할 수 있는 포토프로브와 같은 N-말단 부분, 또는 아세트산, 프로피온산, 부티르산 및 베헤닉산과 같은 다른 지방산과 같은 C(2-22) 알킬 카르복시산으로부터 유래된 아실기를 나타내며, 임의적으로 히드록시, 할로겐, C(1-6) 알킬, 니트로 및 시아노로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나; X는 수소를 나타내고;

R₇는 N*와 C* 사이에 결합이 결여되면 OH, NH₂, NHNH₂, NHR₈또는 OR₈을 나타내고 N*와 C* 사이에 결합이 존재하면 R₇은 부재하며;

R₈은 직쇄 또는 측쇄 C(1-6) 알킬기, 아릴기 또는 아르아릴기를 나타내며;

R_a는 Hyp 또는 Pro 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_b는 Hyp 또는 Pro 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_c는 Gly, Sar 아미노산 사이드 체인, 임의적으로 방향족 링 내에서 하나 이상의 히드록시, 할로겐, 니트로, 시아노, 아지도, 아미노, 벤조일 또는 저급 알콕시 또는 티오알콕시기로 치환된 방향족 아미노산 측쇄를 나타내고;

R_d는 Ala, Gly, Glu, Asp, Dab, Dapa, Lys, Asn, Gln, Orn, Thr, Ser 또는 Cys 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_e는 Ala 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_f는 Ala, Sar 또는 Gly 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_gL-4Hyp 측쇄 또는 식 Z 또는 Za 부분을 제외한 모든 아미노산 측쇄를 나타내고;

R_h는 Ala 아미노산 측쇄를 나타내거나, R_g는 식 Z 또는 Za 부분을 나타내고;

R_i는 Gly 아미노산 측쇄를 나타내거나 R_i는 임의적으로 방향족 링 내에서 하나 이상의 히드록시, 할로겐, 니트로, 시아노, 아지도, 아미노, 벤조일 또는 저급 알콕시 또는 티오알콕시기로 치환된 방향족 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_j는 Asn, Gln, Asp, Glu, Cys 또는 Tyr 아미노산 측쇄를 나타내고;

각각의 j, k, l, m, n, p 및 q는 독립적으로 0 또는 1임.

식 I의 화합물에 있어서, R₇은 NH₂이고, Ra는 Pro 아미노산 측쇄가고, Rb는 Hyp 아미노산 측쇄가고, Rc는 Gly 또는 Tyr 아미노산 측쇄가고, Rd는 Gly, Asp or Glu, Dapa 및 Dab로 구성된 군 중에서 선택된 아미노산 측쇄가고, Rf는 Ala 또는 Gly 아미노산 측쇄가고, Rg는 Pro, Asn 또는 Gly 아미노산 측쇄가고, 식 I이 선상 펩타이드를 나타내는 경우에 Rg는 Asn, Gly, D-4Hyp 또는 L-/D-Pro 아미노산 측쇄를 나타내고, 식 I이 N* 및 C* 사이에 고리화된 펩타이드를 나타내는 경우에 Rg는 L-/D-4Hyp 또는 L-/D-Pro 아미노산 측쇄를 나타내고, U가 결여된 경우 Rh는 Ala 아미노산 측쇄가고, U가 존재하는 경우 Rh는 Pro 또는 Hyp 아미노산 측쇄가고, Ri는 바람직하게는 Tyr, Phe, Trp 또는 Nal이며 임의적으로 방향족 링 내에서 하나 이상의 히드록시, F 또는 Cl로 치환되며, Rj는 Asp, Glu, 및 Tyr, 및 레트로 올-D 형인 식 I의 선상 펩타이드 중에서 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 식 I의 펩타이드 화합물은 3 내지 9 개, 보다 바람직하게는 3 내지 7 개의 아미노산 잔기로 구성되는 것이 바람직하며, 여기서 U가 존재시 j와 k는 0인 것이 바람직하고 U 결여시 j와 k는 1이 바람직하며, 식 I은 고리형 펩타이드를 나타내고, U 결여시 m은 0이 바람직하고, U 존재시 p는 1이 바람직하고, U 존재시 q는 0이 바람직하다.

일반식 II의 화합물이 보다 바람직하며:

상기 식은 아미노산 잔기가 L 및/또는 D 형인 펩타이드 서열을 나타내며, 식 중,

X는 H 또는 Ac를 나타내고;

G'는 글리신 잔기 또는 Sar와 같은 글리신 유사체를 나타내고;

A는 알라닌을 나타내고;

Px는 Hyp 또는 Pro와 같은 식 Z 또는 Za의 아미노산 잔기를 나타내고;

Y'는 임의적으로 페닐 고리에서 할로겐 또는 히드록시로 치환된 페닐알라닌 또는 티로신을 나타내고;

a 및 b는 독립적으로0 또는 1이고,

R7은 OH, NH₂, NHNH₂, Asn-NH₂, 또는 Gln-NH₂; 및 이들의 레트로 형, 및 이들의 염을 나타내며,

바람직하게는,

X는 Ac이고 모든 아미노산 잔기는 L-형이며, G'는 글리신이고, Px는 Pro이고, Y'는 Tyr이고, R7는 NH₂이다.

모든 아미노산 잔기는 D-형이고, 모든 기호는 상기 식 II에서 정의된 바와 동일한 의미를 갖는 식 X-(Y')_b-(Px)₂-G'-A-(G')_a-R₇로 표현되는 식 II의 레트로 화합물, 적어도 하나의 Px 잔기가 D-아미노산이고 나머지는 L-아미노산인 식 II의 펩타이드 화합물, 및 X가 H를 나타내고, R7가 Tyr를 나타내는 Y'와의 공유결합을 갖는 Gln 또는 Asn을 나타내고, b는 1이고, a는 1인 식 II의 고리형 서열이 바람직하다.

식 2의 화합물: H-GAG-(Pa)₂-NH₂, 예컨대,

H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Pro-Tyr-NH₂,

H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Pro-Tyr-NH₂,

H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Ala-Tyr-NH₂,

H-Gly-Ala-Gly-Gly-D-Pro-Tyr-NH₂,

H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Ala-Tyr-NH₂,

H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-Tyr-NH₂,

또는 이들의 염.

식 3의 화합물: H-GAG-(Px)₂-Y-NH₂, 예컨대,

H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-NH₂,

H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-NH₂,

H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH₂,

H-Gly-Ala-Gly-Pc-Pro-Tyr-NH₂,

및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염.

식 8의 화합물: H-G'-A-G'-(Px)₂-Y-NH₂, 예컨대, H-Sar-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH₂, H-Gly-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH₂, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염.

식 6의 화합물: X-D-Y-(D-Px)₂-G-D-A-G-NH₂또는 이들의 레트로형 X-G-D-A-G-(D-Px)₂-D-Y-D-(Asn)-NH₂, 예컨대,

H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-NH₂,

H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-D-Asp-OH,

Ac-D-Tyr-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH₂,

및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염.

식 10의 화합물: 시클로(-GAG-(Px)₂-Y-N/Q-), 예컨대, 시클로(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Gln-), 시클로(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Asn-), 시클로(-Gly-Ala-Gly-Pro-Pro-Tyr-Asn-), 및 본 명세서에 정의된 바와 같은 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 및 이들의 염.

식 11의 화합물: 시클로(-Y-(Px)₂-GA-(G)_q-N/Q-), 예컨대, 시클로(-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn-), 시클로(-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Asn-), 시클로(-Tyr(3-I, 5-I)-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn), 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염.

식 12의 화합물: X-Zd-G(N/Q)Y-NH₂, 예컨대, H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH₂, Ac-Gly-Asn-Tyr-NH₂, H-Gly-Asn-Tyr-NH₂, Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH₂, H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH₂, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염.

식 I의 고리형 펩타이드 화합물은 일반식 III 및 그의 염으로 표시되는 것으로추가적으로 특징화된다:

R₁은 H 또는 CH₃, 바람직하게는 H이며;

은 임의의 결합을 나타내고;

p는 0 또는 1;

n은 1, 2, 3, 또는 4이고;

바람직하게는 R₁은 H, R₂와 R₃는 같거나 다르고 H 또는 CH₃을 나타내며, R₅와 R₄는 그에 부착된 C 및 N 원자와 함께 Pro 또는 Hyp을 나타내고, R₆은 Tyr, p는 1, n=1을 나타내는 것이 좋다.

식 III의 화합물의 예로는 다음, 즉:

및 약학적으로 허용되는 그의 염을 들 수 있다.

IV

식 중, R₈은 상기 정의한 바와 같고, 바람직하게는 H이며;

R₆은 H 또는 CH₃, 바람직하게는 H 이며;

은 임의의 결합을 나타내며;

R₂와 R₃은 가능한 여하한 아미노산 측쇄를 나타내거나, 또는 임의의 결합이 존재할 경우 R₂와 R₃은 그에 결합되어 있는 C 및 N 원자와 함께 바람직하게는 4-위치에 OH가 임의로 치환되어 있는 프롤린 고리를 나타내거나 또는 R2와 R3은 식 Z 또는 Za의 부분을 나타내고;

p는 0 또는 1;

n은 1, 2, 3, 또는 4이고;

식 IV의 화합물의 예로는 다음의 화합물:

및 약학적으로 허용되는 그의 염을 들 수 있다.

따라서, 더욱 바람직한 화합물은 아미노산 잔기가 D- 및/또는 L-형일 수 있고, 다음 일반식 V로 표시되는 펩타이드 화합물, 및 그의 레트로 유사체, 레트로 올-D 유사체 (레트로-인버스 유사체) 및 그의 염:

(식 중, R₁은 펩타이드의 N 및 C 말단 사이의 임의의 아미드 결합, H 또는 Ac이고;

R₂는 OH, NH₂를 나타내거나 또는 부재한다)이고, 더욱 바람직하게는, Aa₁이 Ala, Gly-Ala, Gly-Asn-Tyr, 및 Tly-Asn-Tyr-Ala 중에서 선택되고 여기서 Al은 Gly 또는 Sar, Aa₂는 Asn 또는 Gln, 여기서 Ar은 I와 같은 할로겐이 하나 이상 임의로 치환된 Tyr 또는 Phe, 이 화합물이 비시클릭인 경우 R₂는 NH₂이거나 이 화합물이 시클릭인 경우 R₂는 부재하는 화합물인 것이 좋다.

식 V의 대표적인 화합물은

및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염이다.

본 발명의 방법에 사용가능한 다른 화합물은 항부정맥(antiarrhythmic) 펩타이드 및 이들의 기능적 유사체, 예컨대, AAP, AAP10, [Pro⁴]AAP10-NH₂, HP5 및 신규한 펩타이드 접합체

H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH

H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH₂

3(4-히드록시페닐)프로피오닐-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH 및

3(4-히드록시페닐)프로피오닐-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH₂를 포함한다.

안정성

본 발명의 화합물의 안정성

또한, 본 발명의 화합물은 효소적 분해에 대하여 안정하다는 것, 및/또는 혈장에서의 분해에 대하여 안정하다는 것, 및/또는 생체내에서 향상된 반감기를 갖는 것으로 특징화된다. 본 발명의 항부정맥 화합물을 포함하는 화합물이 효소적 분해 및/또는 혈장 내에서 안정적인 것이 바람직하다. 본 발명에 의하여 제시된 AAP의 천연 펩타이드 서열의 다양한 유도체 및, 예컨대, C-말단 아미드화 또는 에스테르화와 같은 화학적 변형, D-아미노산 및 천연 아미노산 유도체의 사용, N-말단 변형, 및 고리형 유사체는 모두 천연 AAP의 본질적인 항부정맥 및/또는 항혈전 성질을 유지하면서 안정성을 증진시키기 위하여 설계된 변형을 나타낸다.

펩타이드는 일반적으로 위장계 및 살아있는 조직 및 체액에서 존재하는 단백질 분해효소에 의하여 쉽게 분해된다. 따라서, 본 발명에 있어서, 안정성이 증가되도록 변형된 펩타이드를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항부정맥 화합물을 포함하는 화합물은 효소적 분해에 대하여 및/또는 혈장 내에서 안정한 것이 바람직하다. 본 발명의 발명에 사용하기 위하여 바람직한 펩타이드의 용액내 반감기는 표준 안정성 검사로 측정시 50 분 이상이고, 4 시간 이상인 것이 더욱 바람직하다. 다음의 표 7 및 8에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 표준 안정성 검사에서 5 시간 이상의 분해 반감기를 갖는다. 안정성은 약물 효과에 중요한 매개변수이며, 본 발명의 펩타이드의, 예컨대, 300분 이상의 T1/2과 같이 연장된 반감기가 바람직하다. 본 발명에 사용된 표준 안정성 검사는 하기되는 생체외 혈장 안정성 검사를 의미한다.

생체내 혈장 안정성 분석 방법

펩타이드의 안정성을 혈청과 혈장 내에서 분석한다. 펩타이드를 혈장 또는 혈청내에서 37℃에서 인큐베이팅하고 t=0에서 t=156 사이의 약 9 개의 일정한 시간 간격에서 취한 샘플을 HPLC에 의하여 분석한다.

HPLC 분석을 위한 적절한 조건(컬럼, 용매, 농도구배 및 온도)을 측정하여 약물 피크 및 혈장 피크가 동일한 체류 시간을 갖지 않는다는 것을 확인하였다. 이는 연속적으로 약물 주입, 혈장 주입 및 약물과 혈장의 동시 주입 후, 만족할만한 분리가 얻어지도록 LC법의 매개변수를 최적화시킴으로써 수행한다. 3 가지의 병행되는 실험을 각각의 혈장 유형마다 실시한다. t=0에서 100 ml의 펩타이드를 900 ml의 혈장과 혼합하고 37 ℃에서 인큐베이팅한다 (약물-혈장 혼합물 농도 0.1 mg/ml). 약물-혈장 혼합물 샘플 100 ml를 적절한 시간간격에 취하고 샘플을 10 ml의 MeCN:TFA 50:50 (v/v)로 침전시킴으로써 분해를 중지시킨다. 동일한 방법으로 처리된 약물을 포함하지 않는 대조군 혈장 샘플을 또한 준비한다. 혈장 샘플을 상온에서 12,000 rpm (Eppendorf 원심분리기)으로 15 분 동안 원심분리한다.

얻어진 상청액을 300 ml HP 오토샘플러 바이알로 옮기고 HPLC로 분석한다. 샘플은 다음과 같은 순서로 분석한다: 빈 칼럼, 0.1 mg/mL의 펩타이드, 펩타이드를 포함하지 않는 혈장, t=0 에서의 상기 3 개의 병행하는 샘플, t=5분 에서의 상기 3 개의 병행하는 샘플, t=10분 에서의 상기 3 개의 병행하는 샘플 등. 그리고, 마지막으로 t=0 에서의 상기 3 개의 병행하는 샘플을 반복하여 분석 동안 분해 또는 다른 결함이 없음을 확인한다. 샘플 농도 (피크 높이, mAU)를 시간에 대하여 플라팅하고 모노 지수함수형 붕괴(mono exponential decay, Excel)를 나타내는 함수에 피팅시킨다. 인간 혈장 내의 AAP10, AAP 및 HP5와 비교한 본 발명의 다양한 화합물의 분해 반감기(Tl/2)(분)를 평균(n=3) ±표준 편차로서 다음의 표 7에 나타내었다. 본 발명의 화합물 2, 3, 27, 48 및 49는 10 분 이하의 반감기를 갖는 AAP10 및 12 분 이하의 반감기를 갖는 HP5과 비교하여 혈장 및 혈청에서 현저하게 보다 안정적이었다.

혈장 및 혈청에서의 생체외 안정성 시험 결과, T1/2 (분 및 시간)
배지 및 화합물	혈장, 헤파린	혈청
배지 및 화합물	래트	래빗	인간	래빗	인간
AAP		4.4 분±12 %	7.6 분±6 %
AAP10	8.2 분±13 %	9.5 분±12 %	-	2.7 분±4 %	-
HP5		3.7 분±1 %	11.9 분±11 %
시클로(레트로-AAP-10-Asn)	-	*> 5 시간	-	-	*> 5 시간
Ac-레트로-(AAP-10)-(allD)-NH2	-	*> 5 시간	*> 5 시간	-	*> 5 시간
CF₃C(O)-AAP10-NH2	-	3.8 시간±0.5 %	-	-	3.1 시간±10 %
시클로(GAG-HYP-PYN)	-	30 시간±8 %	9 시간±1 %	-	-
시클로(GAG-HYP-PYQ)	-	14 시간±2 %	15 시간±1 %	-	-
H-D-Y-D-N-G-NH2	-		296 분±34 %

다음의 표 8은 염화칼슘 유발 부정맥 모델에서의 화합물의 활성 및 반감기를 보여준다.

* EDTA 혈장에서 측정된 인간 혈장에서의 반감기,

HPP는 3(4-히드록시페닐)프로피오닐 라디칼을 의미한다.

본 발명의 방법에 사용되는 보다 바람직한 화합물은 다양한 다이머, 트라이머, 테트라머를 포함하는 레즈베라트롤(레스베라트롤, 트랜스-3,5,4'-트리히드록시스틸벤 및 시스-3,5,4'-트리히드록시스틸벤) 및 이들의 유도체 및 구조적으로 관련된 화합물 카페인산 페네틸 에스테르(caffeic acid phen에틸 ester) 및 이들의 유도체; 및 아포르피노이드 알칼로이드(aporphinoid alkaloids) 볼딘(boldine) 및 타스핀(taspine)과 같이, 문헌에 보고된 바와 같은 GJIC를 촉진시키는 비-펩타이드 화합물이다. 레즈베라트롤의 GJIC에 대한 효과를 본 명세서에 개시된 CaCl₂-유발 AV 차단의 생체내 모델에서 시험하였다. 레즈베라트롤, 100 nmol/kg i.v. (n=6 마우스)은 용제담체로 처리된 동물(n=7 마우스)와 비교하여 칼슘-유발 칼슘 차단까지의 시간이 억제되었다 (136 ±9% 대 100 ±7%; p < 0.01).

미국특허 제6,008,260호는 화학적으로 유발되는 암에 대한 예방약으로서 포유류에 투여되는 레즈베라트롤에 관한 것이고, Nielsen M, Ruch RJ, Vang O (Biochem Biophys Res Commun 2000 Sep 7; 275 (3): 804-9)는 자연적으로 발생하는 스틸벤/알렉신, 그 중에서도 트랜스-레즈베라트롤 (트랜스-3,5,4' 트리히드록시스틸벤)과 같은 레즈베라트롤이 간극 결합 세포간 커뮤니케이션의 종양-프로모터-유발 억제를 역전시킨다는 것을 보여주고, 그것의 암 예방을 위한 제제로서의 용도를 제시한 바 있다. GJIC 억제가 종양 촉진의 중요한 메카니즘이기 때문에 WB-F344 래트 간 상피 세포에서의 간극 결합 세포간 커뮤니케이션 (GJIC)에 대한 레즈베라트롤의 효과를 조사하였다. WB-F344 세포가 6 시간 동안 레즈베라트롤에 노출시 17내지 50 μM 레스베라트롤은 용매 용제 대조군과 비교하여 계수 1.3 만큼 현저하게 GJIC을 증가시켰다. 포르볼 에스테르(phorbol ester) TPA 및 살충제 DDT를 포함하여, 대부분의 종양 프로모터는 GJIC을 차단한다. 17 내지 50 μM의 레스베라트롤 역시 TPA 및 DDT에 의한 GJIC의 하향-조절을 각각 계수 2.7 및 1.8 만큼 현저하게 억제하였다. 이러한 TPA 억제로부터의 GJIC의 회복은 억제된 Cx43의 과인산화와 부분적으로 상호 관련있다. 결론적으로, 레스베라트롤이 GJIC를 증진시키고 GJIC에 대한 종양 프로모터 효과를 방해하는 것으로 나타났고, 이는 레스베라트롤의 항발암성에 기여하는 메카니즘인 것으로 보인다.

WO 0059466 (LVMH Recherche)는 피부 노화 징후의 개선을 위한 화장용 조성물에 알칼로이드 볼딘을 포함하는 스켈레토네마 코스타툼(Skeletonema costatum)의 지질 추출물의 용도를 개시한다. 상기 지질 추출물 및 볼딘 화합물은 케라틴 세포, 섬유아세포 및 전-지방세포에서의 간극 결합 세포간 커뮤니케이션을 향상시킨다. 발명은 최적화된 50 nM의 볼딘 농도를 사용하여 분량 의존적 방법으로 행하는 볼딘 치료에 의하여 중년 및 장년의 케라틴 세포내 코넥신 43 함량이 청년의 케라틴 세포에서 발견되는 함량까지 증가된다는 것을 보여준다. 코넥신 43의 세포 함량의 증가가 간극 결합 세포간 커뮤니케이션의 촉진에 기여하는 것이 분명하기 때문에, 볼딘 화합물은 본 발명에 사용가능하다.

따라서, 본 발명의 목적은, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 한 가지 이상의 본 발명의 식 I 내지 VIII 또는 표 1 및 8의 펩타이드를 치료적으로 유효량으로 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 피부 노화, 셀룰라이트 및 주름 개선 방법을 제공하는 것이다.

볼딘 구조를 공유하는 다른 화합물은 미국특허 제5,156,847호 (1992년 10월 20 공개)에 상처의 치료에 사용 가능하다고 보고된 바 있는, 타스핀과 같은 아포르피노이드 알칼로이드(aporphinoid alkaloid)를 포함한다.

제제 및 조성물

상기한 질병 및 의학적 징후의 치료를 위한 본 발명에 개시된 화합물을 함유하는 제제를 의료요원 또는 환자에 의하여 필요에 따라서 투여될 수 있는 적절한 모든 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, i.v. 투여용 주사제, 타블렛 및 캡슐을 포함하는 경구 투여용 제제, 및 좌약 등이 있다. 본 발명의 화합물은 독립적 약제로서 또는 특정 질병의 치료에 적적한 다른 약제와 함께 복합 치료로 투여할 수 있다. 본 발명에 개시된 화합물은 상대적으로 낮은 구강내 생체이용률을 가질 수 있는 상대적으로 낮은 분자량의 펩타이드이며, 이러한 경우 비-경구 제제, 예컨대, 주사 투여 또는 코 또는 직장 상피를 통한 투여 또는 예컨대 전리요법으로 보조되는 피부를 통한 투여용 제제가 바람직할 것이다.

본 발명의 치료요법에 있어서, 치료 화합물을 환자에게 투여할 수 있으며, 전신내적 또는 국부적인 것을 포함하는 몇 가지 방법 중 어떤 것을 사용하여도 된다. 또한, 본 발명의 바람직한 화합물, 예컨대, 화합물 3. 화합물 2, 화합물 40을 표적 증상의 발병을 예방하거나 또는 그 증세를 감소시키는 예방약으로서 투여할 수 있다. 또한, 상기 바람직한 화합물을, 예컨대, 증상의 개선을 보조하기 위하여 표적 증상 진행 동안 투여할 수 있다.

치료 화합물을 통상적인 부형제, 즉, 활성 화합물에 대하여 유해하게 작용하지 않고 투여받는 자에게 해롭지 않은 장관외, 장내 또는 코속 적용에 적합한 약학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 담체(carrier) 물질과의 혼합물 내의 약학적 조성물로서, 하나 이상의 치료제와의 조합 또는 단독으로 환자에게 투여할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 물, 염 용액, 알코올, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 향료 오일, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 페트로에트랄(petroethral) 지방산 에스테르, 히드록시메틸-셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적 제제를 살균할 수 있고 원하는 경우 활성 화합물과 유해하게 작용하지 않는, 예컨대, 윤활제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치기 위한 염, 완충, 염료, 향료 및/또는 방향물질 등과 같은 보조제와 혼합할 수 있다.

상기 조성물은 다음과 같은 용도를 위하여 제조할 수 있다: 특히 액상 용액 또는 현탁액 형태의 비경구 투여용; 타블렛 또는 캡슐 형태의 경구 투여용; 특히 분말, 코 점적약 또는 에어로졸 형태의 코속 투여용; 질내 투여용; 예컨대 크림 형태의 국부 투여용; 최근들어, 예컨대, 좌약 형태, 등.

상기 약학적 제제는 단위 투약 형태로 간편하게 투여할 수 있으며, 예컨대, "Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980)"에 개시된 바와 같이, 제약 분야에 잘 알려진 어떤 방법으로도 제조할 수 있다. 비경구 투여용 제제는 일반적인 부형제로서 멸균수 또는 염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은폴리알킬렌 글리콜, 식물 기원 오일, 수소화 나프탈렌 등을 포함할 수 있다. 특히, 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체를 본 발명의 특정 화합물, 특히, 화합물 3, 화합물 2, 화합물 40 등의 방출을 제어하기 위한 부형제로서 사용할 수 있다.

다른 잠재적으로 사용가능한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이드 공중합체 입자, 삼투 펌프, 삽입가능한 주입 시스템 및 리포좀을 포함한다. 흡입 투여용 제제는 락토오스와 같은 부형제로서 포함하거나, 또는, 예컨대, 폴리에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 디옥시콜레이트를 함유하는 수용액, 또는 코 점적액 형태로 투여하기 위한 유성 용액 또는 코속 적용되기 위한 젤 형태일 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 또한 구강(buccal) 투여의 경우 글리코콜레이트를, 직장 투여의 경우 메톡시살리실레이트를, 또는 질내 투여의 경우 시트르산을 포함할 수 있다. 다른 전달 시스템으로 치료제를, 예컨대, 스텐트의 사용하여 투여하는 것과 같이 직접적으로 수술 부위에 투여할 수 있다.

치료적 조성물 내의 하나 이상의 치료 화합물의 농도는 투여될 본 발명의 화합물 분량, 사용되는 조성물의 화학적 특성 (예컨대, 소수성) 및 의도하는 투여 방식 및 경로를 포함하는 많은 인자들에 따라서 달라질 것이다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 화합물 하나 또는 하나 이상을 및 바람직하게는 화합물 3, 화합물 2, 화합물 40 중 적어도 하나 이상을 약 0.1 내지 10 % w/v의 화합물을 함유하는 비경구 투여용 생리적 완충 수용액 내에 제공할 수 있다.

주어진 치료법에 사용되는 활성 화합물의 실질적으로 바람직한 양은, 예컨대, 사용될 특정 화합물, 제제화된 특정 조성물, 투여 방식 및, 예컨대, 환자의 종족, 성별, 체중, 일반적 건강상태 및 연령과 같은 환자의 특성에 따라 달라질 것이라고 인식될 것이다. 상기한 가이드라인에 관하여 수행되는 통상적인 분량 결정 테스트를 사용하여 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 주어진 투여 프로토콜에 대한 최적 투여 속도를 용이하게 확인할 수 있다. 적절한 분량 범위는 체중을 기준으로 하루에 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 포함할 수 있다.

본 발명의 치료적 화합물은, 예컨대, 히드로클로라이드, 설페이트 또는 포스페이트 염 등의 무기산 첨가 염, 또는 아세테이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르트레이트 또는 시트레이트 염 등의 유기산 첨가 염과 같은 전형적인 산 첨가 염과 같은 약학적으로 허용가능한 염으로서, 프로토네이팅된 수용성 형태로 적절하게 투여한다. 본 발명 치료적 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 또한 금속 염, 특히 소듐 염 또는 포타슘 염과 같은 알칼리금속 염; 마그네슘 염 또는 칼슘 염과 같은 알칼리토금속 염; 암모늄 또는 테트라메틸 암모늄 염과 같은 암모늄 염; 또는 리신 염, 글리신 염 또는 페닐알라닌 염과 같은 아미노산 첨가 염을 포함할 수 있다.

조성물

또한, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 약리학적 활성 항부정맥 펩타이드를 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제와의 조합으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 경구, 피하, 비경구 (정맥내, 복막내), 근육내, 직장, 경막외(epidural), 기관내(intratracheal), 코속, 피부, 질내, 구강내, 눈,직접적 뇌 또는 폐 투여에 적합한 형태, 바람직하게는 피하, 정맥내 또는 경구 투여에 적합한 형태일 수 있으며, 상기 조성물은, 예컨대, "Remington's Pharmaceutical Sciences" (17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U. S. A., 1985)과 보다 최근판, 및 "Drugs and the Pharmaceutical Sciences" 시리즈의 모노그래프 (Marcel Dekker)에 일반적으로 기재된 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 방법으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은, 예컨대, i.v. 주사 농축액, 캡슐 및 타블렛을 포함하는 주입을 위한 통상적인 현탁액 또는 용액의 형태, 바람직하게는, 예컨대, 미국특허 제5,350,741호에 경구 투여용으로 기재된 바와 같은 장 제제 형태일 수 있다.

사용되는 약학적 담체 또는 희석제는 통상적인 고체 또는 액체 담체일 수 있다. 고체 담체의 예로서 락토오스, 테라 알바(terra alba), 수크로오스, 시클로덱스트린, 탈크, 젤라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 셀룰로오스의 저급 알킬 에테르를 들 수 있다. 액체 담체의 예로서 시럽, 피너트 오일, 올리브 오일, 인지질, 지방산, 지방산 아민, 폴리옥시에틸렌 및 물을 들 수 있다.

유사하게, 담체 또는 희석제는, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같이, 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 지속적 방출 물질을 단독 또는 왁스와 함께 혼합하여 포함할 수 있다.

고체 담체를 경구 투여용으로 사용하는 경우, 제제는 타블렛화되거나, 딱딱한 젤라틴 캡슐, 분말 또는 펠렛 형태 내에 들어있을 수 있거나 또는 트로키 또는 로젠지(lozenge) 형태일 수 있다. 고체 담체의 양은 광범위하게 변할 수 있지만 일반적으로 약 25 mg 내지 약 1 g일 것이다.

통상적인 타블렛화 기술에 의하여 제조될 수 있는 전형적인 타블렛은 다음을 포함한다:

코어: 활성 화합물 (유리 화합물 또는 그의 염으로서) 100 mg; 콜로이드 실리콘 디옥사이드 (Aerosil) 1.5 mg; 셀룰로오스, 마이크로크리스트 (Avicel) 70 mg; 변형 셀룰로오스 검 (Ac-Di-Sol) 7.5 mg; 마그네슘 스테아레이트.

코팅: HPMC 약. 9 mg; *Mywacett 9-40T 약 0.9 mg; *필름 코팅을 위한 가소제로서 아실화된 모노글리세라이드.

액체 담체를 사용하는 경우, 제제는 시럽, 에멀젼, 부드러운 젤라틴 캡슐 또는 수용성 또는 비-수용성 액체 현탁액 또는 용액과 같은 주입 가능한 멸균액 형태일 수 있다.

또한, 상기 조성물은 국부적 또는 전신 주사 또는 주입에 적합한 형태일 수 있고, 예컨대, 멸균수 또는 등장 염수 또는 글루코스 용액으로 제제화될 수 있다. 상기 조성물을 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 통상적인 살균 기술에 의하여 살균할 수 있다. 얻어진 수용액을 용도에 따라 포장하거나 무균 조건 하에서 여과하고 동결건조시킬 수 있으며, 상기 동결건조된 제제를 적용 전에 멸균 수용액과 혼합할 수 있다. 상기 조성물은, 예컨대, 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드 등의 완충제,삼투성(tonicity) 조절제 등과 같은, 유사 생리적 환경에 요구되는 바와 같은 약학적으로 허용가능한 보조물질을 포함할 수 있다.

정맥내 주입을 위한 펩타이드의 제제화

본 발명의 화합물을 멸균, 등장 염수에 용해시킨 용액으로서 다-분량 (multi-dose) 제제를 제조하고 뚜껑있는 바이알에 저장하고, 필요한 경우, 보존제 (예컨대, 벤조에이트)를 첨가할 수 있다. 본 발명의 화합물을 멸균, 등장 염수에 용해시킨 용액으로서 고정 분량 제제를 제조하고, 유리 앰플에 저장하고, 필요한 경우, 불활성 기체로 채울 수 있다. 화합물의 각각의 분량을 앰플 또는 뚜껑있는 바이알에 건조상태로 저장하고, 필요한 경우, 불활성 기체로 채운다. 다-분량 제제는 최고도의 화합물 안정성을 요구한다. 화합물의 안정성이 낮은 경우, 고정 분량 제제를 사용할 수 있다. 또한, 펩타이드를 i.v. 주입 농축액으로 제제화할 수 있다.

코 투여용 제제는 에어로졸 적용을 위하여 본 발명의 화합물을 액체 담체, 특히 수용성 담체에 용해시키거나 현탁시켜서 포함할 수 있다. 상기 담체는 프로필렌 글리콜과 같은 용해제, 담즙산 염 또는 폴리옥시에틸렌 고급 알콜 에테르롸 같은 계면활성제, 레시틴(포스파티딜콜린) 또는 시클로덱스트린과 같은 흡수 강화제, 또는 파라빈과 같은 보존제와 같은 첨가제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 작은 크기의 펩타이드 화합물은 큰 펩타이드와 비교하여 상대적으로 빠른 점막을 통한 흡수가 특히 십이지장과 회장에서의 효소적 분해를 최소화하기 때문에 경구 및 코 투여에 유리하다.

화합물 2를 함유하는 장용 타블렛 (enteric tablet)의 제조

400 mg L-타르타르산 및 40 mg 폴리에틸렌 글리콜-수소화 아주까리(castor) 오일을 5 ml 메탄올에 용해시킨다. 상기 용액을 30℃로 예열시킨 막자사발에 넣는다. 상기 용액에 화합물 1.5 mg을 첨가한다. 화합물 2의 첨가 직후, 40 ℃의 뜨거운 기류하에서 혼합물을 막자로 저은 다음 진공하의 데시케이터에 하룻밤동안 넣어 용매를 제거한다. 얻어진 고체 덩어리를 막자로 부수고 30 mg의 소듐 비카르보네이트와 소량의 70% 에탄올과 혼합한다. 그리고 나서, 상기 혼합물을 나눠서 타블렛으로 성형하고 건조시킨다. 상기 건조된 타블렛을 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트로 코팅하여 장용 타블렛을 얻는다.

또한, 본 발명은 치료용으로 사용되는 본 명세서에 기재된 바와 같은 약리적 활성 항부정맥 펩타이드 또는 펩타이드 유도체 또는 이들의 기능적 유사체, 및 예컨대, 급성 허혈성 심장 질병 (예컨대, 안정 협심증, 불안정 협심증, 급성 심근 경색), 충혈성 심장 기능부전 (예컨대, 심장수축, 심장확장, 고-방출량, 저-방출량, 오른쪽 또는 왼쪽 심장 기능부전), 선천적 심장 질병, 폐인성 심장장애(cor pulmonale), 심근병증, 심근염(myocarditides), 고혈압 심장질환과 같은 심혈관 장애 동안, 및 관상혈관재형성 (coronary revascularization) 동안의 부정맥 및 혈전성 합병증의 치료에서와 같이 치료용으로 사용되는 약학적 조성물의 제조를 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 이들의 용도에 관한 것이다.

특정 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 항부정맥 펩타이드를 단독으로 또는 클래스 I 제제(예컨대, 리도카인), 클래스 II 제제 (예컨대, 메토프롤롤 또는 프로프라놀롤), 클래스 III 제제 (예컨대, 아미오다론 또는 소탈롤) 또는 클래스 IV 제제 (예컨대, 베라파밀)과 같은 다른 항부정맥 화합물과 조합하여 재진입 (예컨대, 심방 조기 박동 (atrial premature complexes), 심실 접합부 조기박동 (AV junctional complexes), 심실 조기박동 (ventricular premature complexes), 심방 세동 (atrial fibrillation), 심방 조동 (atrial flutter), 발작성 상심실성 빈맥 (paroxymal supraventricular tachycardia), 동결절 회귀성 빈맥 (sinus node reentrant tachycardia), 방실결절 회귀성 빈맥 (AV nodal reentrant tachycardia), 및 비-지속형 심실빈맥(non-sustained ventricular tachycardia), 등)과 관련된 부정속맥 (tachyarrhythmias)과 부정서맥 (bradyarrhythmias, 예컨대, 동결절 (sinus node), 방실결절, His속, 오른쪽 또는 왼쪽 속지에 기인)을 치료 및/또는 예방하는데 사용할 수 있다.

특정 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 항부정맥 펩타이드는 단독으로 또는 GP IIb/IIIa 억제제 (예컨대, c7E3 Fab; abciximab), 시클로옥시게나아제 억제제 (예컨대, 아스피린), 트롬복산 A2 길항제, 코우마딘 유도체 (예컨대, 와르파린) 또는 합성 펩타이드, 인테그릴린과 조합하여 혈관벽 질병 (예컨대, 아테롬성 동맥경화증), 혈소판 생성 증가 (전반적인 적혈구증가), 및/또는 혈류 감소 (심장병, 혈관병) 환자에서의 혈전 현상을 예방하는데 사용할 수 있다.

특정 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 항부정맥 펩타이드는, 세포간 간극 결합 채널에 대한 효과 때문에, 뼈 손실의 치료 및/또는 예방 및 뼈 골절의 치유증대^[93]; 연골 및 관절의 불충분한 혈관형성 질환의 치료 및/또는 예방^[94]; 백내장의 치료 및/또는 예방^[81]; 각막의 부족한 영양상태의 질병에 있어서의 각막의 혈관형성의 치료 및/또는 예방 및 각막 손상의 치유 증대^[95]; 상피세포계에서 유래하는 암세포와 같은, 암 세포의 성장 및 확산 치료및/또는 예방^[96]; 혈관 운동을 증가시킴에 의한 고혈압의 치료 및/또는 예방^[74]; 생물체 내에서 세포와 기관과 같은 이식체의 이탈 예방에 사용할 수 있다.

펩타이드 합성

일반적으로 바람직한 방법을 하기한다. 그러나, 고상 펩타이드 합성의 보다 자세한 설명은 본 명세서에 전체로 포함된 W0 98/11125에 기재되어 있다.

기구 및 합성 방법

펩타이드를 여과를 위하여 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에서 사이드-체인 관능기에 대하여 적절한 일반적 보호기 및 N-α-아미노 보호기로서 9-플루오르에틸메틸옥시카르보닐 (Fmoc)을 사용하여 회분식으로 합성하였다.

용매

용매 DMF (N,N-디메틸포름아미드, Riedel de-Haen, Germany)를 강 양이온 교환 수지 (Lewatit S 100 MB/H 강산, Bayer AG Leverkusen, Germany)로 채운 컬럼에 통과시킴으로써 정제하고, 유리 아민이 존재하는 경우 노란색 (Dhbt-O-음이온)을 발생시키는 3, 4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (Dhbt-OH)를 첨가함으로써 사용전에 유리 아민을 분석하였다. 용매 DCM (디클로로메탄, 분석 등급, Riedel de-Haen, Germany)를 정제하지 않고 직접 사용하였다. 아세토니트릴 (HPLC-등급, Lab-Scan, Dublin Ireland)을 정체하지 않고 직접 사용하였다.

아미노산

Fmoc-보호된 아미노산을 적절한 사이드-체인 보호 형태로 Advanced ChemTech (ACT)로부터 구입하였다. 아니면, NovaBiochem (Switzerland)로부터 보호된 아미노산 (Fmoc-Glu(OH)-OAllyl; Fmoc-Asp(OH)-OAllyl)을, Bachem (Switzerland)로부터 Fmoc-4-Hyp (OtBu)-OH를 구입한다.

커플링 시약

커플링 시약 디이소프로필카르보디이미드(diiso프로필carbodiimide, DIC)을 Riedel de-Haen (Germany)에서 구입하였고, PyBop를 Advanced ChemTech로부터 구입하였다.

링커

(4-히드록시메틸페녹시) 아세트산 (HMPA)을 Novabiochem (Switzerland)에서 구입하고; DIC에 의하여 생성된 예비형성 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt) 에스테르로서 수지에 커플링시켰다.

고체 지지체

TentaGel S 수지 0, 22-0, 31 mmol/g (TentaGel-S-NH₂; TentaGel S-Ram, TentaGel S RAM-Lys (Boc) Fmoc; Rapp polymere, Germany) 상에서 Fmoc-방법에 따라서 합성된 펩타이드;

촉매 및 다른 시약

디이소프로필에틸아민 (DIEA)은 Aldrich (Germany)에서, 에틸렌디아민은 Fluka에서, 피페리딘과 피리딘은 Riedel-de Haen (Frankfurt, Germany)에서 구입하였다. 4-(N,N-디메틸아미노) 피리딘 (DMAP)을 Fluka (Switzerland)에서 구입하고 대칭 무수물을 수반하는 커플링 반응에 촉매로서 사용하였다. 에탄디티올을 Riedel-de Haen (Frankfurt, Germany)로부터 구입하였다. 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (Dhbt-OH), 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt) (HOAt)은 Fluka (Switzerland)로부터 입수하였다.

커플링 과정

첫 번째 아미노산을 적절한 N-α-보호된 아미노산 및 DIC로부터 생성된 DMF 내의 대칭적 무수물로서 커플링시켰다. 다음 아미노산을 DMF에서 DIC에 의하여 적절한 N-α-보호된 아미노산 및 HOBt 또는 HOAt로부터 만들어진 본래 위치에 생성된 HOBt 또는 HOAt 에스테르로서 커플링시켰다. 테스트 동안 Fmoc 탈보호화를 방지하기 위하여 80 ℃에서 수행되는 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 조사하였다.

N-α-아미노 보호기 (Fmoc)의 탈보호화

DMF 내 20 % 피페리딘으로 처리(1x5 및 1x10 분)한 후, 드레인된(drained) DMF에 Dhbt-OH 첨가 후 노란색이 검출되지 않을 때까지 DMF로 세척 (5x15 ml, 각각 5 분)함으로써 Fmoc기의 탈보호화를 수행하였다.

Allyl의 탈보호화

15 - 20 ml CHCl₃, AcOH, NMM (37:2:1)에 용해된 3 eq. Pd(PPh₃)₄용액을 펩타이드 수지에 첨가하였다. 혼합물을 통하여 N₂스트림을 기포화시키며 실온에서 3 시간 동안 처리를 계속하였다.

HOBt-에스테르의 커플링

3 eq. N-α-아미노 보호된 아미노산을 3 eq. HOBt 및 3 eq. DIC와 함께 DMF에 용해시킨 후 수지에 첨가하였다.

예비형성 대칭적 무수물

6 eq. N-α-아미노 보호된 아미노산을 DMF에 용해시키고 0 ℃까지 냉각시켰다. DIC (3 eq.)를 첨가하고 반응을 10 분 동안 지속시켰다. 용매를 진공에서 제거하고 잔류믈을 DMF에 용해시켰다. 용액을 즉시 수지에 첨가한 후 DMAP 0.1 eq.를 첨가하였다.

수지 상에서의 펩타이드의 고리화

1,5 eq. PyBop을 1,5 eq. HOBt와 함께 DMF에 용해시키고 3 eq. NMM을 펩타이드 수지에 첨가하였다. 반응을 하룻밤 동안 지속시켰다.

산으로 수지에서 펩타이드 절단

95 % 트리플루오로아세트산 (TFA, Riedel-de Haen, Frankfurt, Germany)-물 v/v 또는 95 % TFA 및 5 % 에탄디티올 v/v로 실온에서 2 시간동안 처리함으로써 수지에서 펩타이드를 절단하였다. 여과된 수지를 95% TFA-물로 세척하고 여과액과 세척액을 감암하에서 증발시켰다. 잔류물을 에테르로 세척하고 아세트산-물로부터 동결 건조시켰다. 미정제 동결 건조 산물을 고성능 액체 크로마토그래피 (highperformance liquid chromatography, HPLC)로 분석하고 일렉트로스프레이 이온화 질량분석기 (electrospray ionisation mass spectrometry, ESMS)로 확인하였다.

TentaGel 수지 (PEG-PS) 상에서의 회분식 펩타이드 합성

TentaGel 수지 (1 g, 0.22 - 0.31 mmol/g)를 여과를 위하여 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣었다. 상기 수지를 DMF (15ml)에서 팽창시키고 DMF 내 20 % 피페리딘으로 처리하여 수지 상의 비-양성자첨가 아미노기의 존재를 확실하게 하였다. 수지를 드레인시키고 드레인된 DMF에 Dhbt-OH 첨가 후 노란색이 검출되지 않을 때까지 DMF로 세척하였다. HMPA (3 eq.)를 상기한 바와 같은 예비형성 HOBt-에스테르로서 커플링시키고 상기 커플링을 24 시간 동안 지속시켰다. 수지를 드레인시키고 DMF (5x5 ml, 각각 5 분)으로 세척하고 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 조사하였다. 상기한 바와 같이 첫 번째 아미노산을 예비형성 대칭적 무수물로서 커플링시켰다. 순서에 따라 다음 아미노산을 상기한 바와 같이 Fmoc-보호된 HOBt 에스테르 (3 eq.)로서 커플링시켰다. 다른 조건이 주어지지 않는 한, 상기 커플링을 2 시간 동안 지속시켰다. 수지를 드레인시키고 과량의 반응물을 제거하기 위하여 DMF (5x15 ml, 각각 5 분)으로 세척하였다. 80 ℃에서 수행되는 닌히드린 테스트에 의하여 모든 아실화를 조사하였다. 합성이 완결된 후 펩타이드-수지를 DMF (3x15 ml, 각각 5 분), DCM (3x15 ml, 각각 1 분), 마지막으로 디에틸 에테르 (3x15 ml, 각각 1 분)으로 세척하고 진공에서 건조시킨다.

HPLC 조건

HP 1100 Quaternary Pump, HP 1100 Autosampler, HP 1100 Column Thermostat 및 HP 1100 Multiple Wavelength Detector로 구성된 Hewlett Packard HP 1100 HPLC 시스템을 사용하여 농도구배 HPLC 분석을 수행하였다. LC 소프트웨어 (rev. A.06.01)용 Hewlett Packard Chemstation을 계기 제어 및 데이터 획득을 위하여 사용하였다.

다음과 같은 컬럼 및 HPLC 완충 시스템을 사용하였다:

Column Kromasil, Phenomenex OOF-3033-EO, 329889 (new); 5pm C-18, IOOA 150 x 4,6 mm;

Batch nr. 5243-10.

완충 시스템: A: 0,1% TFA in MQV; B: 0,085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN.

농도구배:

1 - 1,5 분 25 % B

1,5 - 13,5 분 25 - 50 % B

13,5 - 14,5 분 50 - 100 % B

14,5 - 15,5 분 100 % B

15,5 - 17,5 분 100 - 25 % B

17,5 - 20 분 25 % B

유속 1,5 ml/min

오븐 온도 40 ℃

UV 검출: λ = 215 nm

Micro-mass LCT 계기 상에서 질량 스펙트럼을 얻었다.

상기 발명의 상세한 설명은 2001년 2월 22일 출원된 USSN 09/792,286 출원에 개시되어 있다.

본 발명에 있어서, 세포간 커뮤니케이션의 감소 또는 손상과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 일반적으로 적용가능하다. 간극 결합 세포간 커뮤니케이션 (GJIC)은 포유류 세포 및 조직의 정상적인 기능에 매우 중요하며, 간극 결합의 폐쇄 또는 게이팅은 종종 질병 상태와 상호관련 있다. 질병 상태와 관련된 세포간 간극 결합 커뮤니케이션 감소의 몇 가지 예가 문헌에 보고되어 있다. 간극 결합을 차단하는 물질이 알려져 있는 반면, 비증식성 질병의 치료에 있어서 GJIC를 증가시키거나 간극 결합 커뮤니케이션을 촉진 또는 매개하는 물질의 사용에 대한 보고는 GJIC이 억지된 M1 무스카린성 아세틸콜린 수용체를 통하여 간극 결합 세포간 커뮤니케이션을 활성화킨다고 보고된 화합물 이르소글라딘 (6-(2,5-디클로로페닐)-2,4-디아미노-1, 3,5-트리아진)의 사용에 한정되지만 10(-10) 내지 10(-6) M 이소글라딘은 단독으로 GJIC에 영향을 미치지 않는다 (Ueda, F. et al. 3 Pharmacol Exp Ther 1995 Aug; 274 (2): 815-9).

따라서, 본 발명은 또한 약제의 제조를 위한 세포간 커뮤니케이션 촉진 화합물, 특히, 바람직하게는 본 발명의 식 I-VI의 AAP 수용체 아고니스트의 용도에 관한 것이다. 약제의 추가적인 성분은, 예컨대 상기된 것들 중에서 선택되는, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.

개별 펩타이드의 펩타이드 합성.

합성 실시예 1.TentaGel-S-NH₂(Rapp polymere, 독일) 상에서의 Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (화합물 1)의 펩타이드 합성.

제 1 배치(batch): 건조 TentaGel-S-NH₂(0.27 mmol/g, 1g)를 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지 상에서의 회분식(batchwise) 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 N-말단 티로신의 커플링 반응이 완결될 때까지 처리하였다. 모든 커플링 반응이 밤새도록 계속되었다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, 무수 아세트산 (1 ml, 10.5 mmol)과 2 ml의 DMF에 용해시킨 100 ㎕의 피리딘을 함께 사용하여, N-말단 아미노기를 아세틸화하였다. 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서 닌히드린 시험(ninhydrin test)으로 아실화를 점검하였다. 합성이 완결된 다음, 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 수지로부터 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 분리시키고, 아세트산으로부터 냉동 건조하였다. 조(crude) 냉동 건조 생성물을 HPLC로 분석하였고, 그 순도 70 % 이상이라는 것이 밝혀졌으며, 펩타이드의 정체(identity)를 ES-MS (실험치 MH⁺619.24, 계산치 MH⁺619. 26)로 확인하였다. 조 생성물(crude material)의 수득량은 137.7 mg 이었다. 상술한 것과 같은 제조용(preparative) HPLC로 정제하여, 순도 95 % 이상의 펩타이드 생성물 58 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 35% 이었다.

제 2 배치: 건조 TentaGel-S-NH₂(0.27 mmol/g, 1g)를 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 N-말단 티로신의 커플링 반응이 완결될 때까지 처리하였다. 모든 커플링 반응이 밤새도록 계속되었다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, 무수 아세트산 (1 ml, 10.5 mmol)과 2 ml의 DMF에 용해시킨 100 ㎕의 피리딘을 함께 사용하여, N-말단 아미노기를 아세틸화하였다. 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. 합성이 완결된 다음, 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 수지로부터 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 분리시키고, 아세트산으로부터 냉동 건조하였다. 조 냉동 건조 생성물(crude freeze dried product)을 HPLC로 분석하였고, 그 순도 70 % 이상이라는 것이 밝혀졌으며, 펩타이드의 정체를 ES-MS (실험치 MH⁺619.25, 계산치 MH⁺619. 26)로 확인하였다. 조 생성물의 수득량은 137.3 mg 이었다. 상술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 91 % 이상의 펩타이드 생성물 27.9 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 15.5% 이었다.

합성 실시예 2.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH₂(화합물 2)의 펩타이드 합성.

제 1 배치: 건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 N-말단 D-티로신의 커플링 반응이 완결될 때까지 처리하였다. 모든 커플링 반응이 밤새도록 계속되었다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, 무수 아세트산 (1 ml, 10.5 mmol)과 2 ml의 DMF에 용해시킨 100 ㎕의 피리딘을 함께 사용하여, N-말단 아미노기를 아세틸화하였다. 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. 합성이 완결된 다음, 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 수지로부터 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 분리시키고, 아세트산으로부터 냉동 건조하였다. 조 냉동 건조 생성물의 수득량은 119.7 mg 이었다. 펩타이드의 정체를 ES-MS (실험치 MH⁺618.25, 계산치 MH⁺618.28)로 확인하였다. 상술한 것과 같은 예비 HPL로 정제하여, 순도 95 % 이상의 펩타이드 생성물 42 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 30% 이었다.

제 2 배치: 건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 N-말단 D-티로신의 커플링 반응이 완결될 때까지처리하였다. 모든 커플링 반응이 밤새도록 계속되었다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, 무수 아세트산 (1 ml, 10.5 mmol)과 2 ml의 DMF에 용해시킨 100 ㎕의 피리딘을 함께 사용하여, N-말단 아미노기를 아세틸화하였다. 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. 합성이 완결된 다음, 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 수지로부터 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 분리시키고, 아세트산으로부터 냉동 건조하였다. 조 냉동 건조 생성물의 수득량은 119.7 mg 이었다. 펩타이드의 정체를 ES-MS (실험치 MH⁺618.29, 계산치 MH⁺618.28)로 확인하였다. 상술한 것과 같은 예비 HPL로 정제하여, 순도 99 % 이상의 펩타이드 생성물 100 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 71% 이었다.

합성 실시예 3.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 시클로(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) (화합물 3)의 펩타이드 합성

제 1 배치: 건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 제 1 아미노산 Fmoc-Asp(OH)-OAII를, 분리(cleavage) 후에 최종적으로 아미드화 (Asn)으로 종결될 측쇄(side-chain) 카르복실산을 통하여 TentaGel-S-Ram 수지와 결합시켰다. 이어서, "TentaGel 수지상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 절차를 N-말단 티로신의 커플링 반응이 완결될 때까지 수행하였다. 모든 커플링 반응이 밤새도록 계속되었다. (상술한 절차에 따라) Fmoc 기 및 알릴기를 탈보호한 다음, 펩타이드에 결합된 수지를 PyBop를 커플링제(coupling reagent)로 사용하여 앞에서 기술한 것과 같이 고리화하였으며, 고리화 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. 합성이 완결된 다음, 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하여, 조 생성물 57 mg을 얻었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 95 % 이상의 고리형 펩타이드 생성물 2.7 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 1.3 % 이었다. 펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺673.32, 계산치 MH⁺673.28)로 확인하였다.

제 2 배치: 건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 제 1 아미노산 Fmoc-Asp(OH)-OAII를, 분리 후에 최종적으로 아미드화 (Asn)으로 종결될 측쇄 카르복실산을 통하여 TentaGel-S-Ram 수지와 결합시켰다. 이어서, "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 절차를 N-말단 티로신의 커플링 반응이 완결될 때까지수행하였다. 모든 커플링 반응이 밤새도록 계속되었다. (상술한 절차에 따라) Fmoc 기 및 알릴기를 탈보호한 다음, 펩타이드에 결합된 수지를 PyBop를 커플링제로 사용하여 앞에서 기술한 것과 같이 고리화하였으며, 고리화 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. 합성이 완결된 다음, 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하여, 조 생성물 57 mg을 얻었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 99 % 이상의 고리형 펩타이드 생성물 10 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 7 % 이었다. 펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺673.30, 계산치 MH⁺673.29)로 확인하였다.

합성 실시예 4.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 시클로 (Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Asn) (화합물 4)의 펩타이드 합성.

제 1 배치: 건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 제 1 아미노산 Fmoc-Asp(OH)-OAII를, 분리 후에 최종적으로 아미드화 (Asn)으로 종결될 측쇄 카르복실산을 통하여 TentaGel-S-Ram 수지와 결합시켰다. 이어서, "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 절차를 N-말단 티로신의 커플링 반응이 완결될 때까지 수행하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. (상술한 절차에 따라) Fmoc 기 및 알릴기를 탈보호한 다음, 펩타이드에 결합된 수지를 PyBop를 커플링제로 사용하여 앞에서 기술한 것과 같이 고리화하였으며, 고리화 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. 합성이 완결된 다음, 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하여 조 생성물을 얻었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 고리형 펩타이드 생성물을 회수하였다.

제 2 배치: 건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 제 1 아미노산 Fmoc-Asp(OH)-OAII를, 분리 후에 최종적으로 아미드화 (Asn)으로 종결될 측쇄 카르복실산을 통하여 TentaGel-S-Ram 수지와 결합시켰다. 이어서, "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 절차를 N-말단 티로신의 커플링 반응이 완결될 때까지 수행하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. (상술한 절차에 따라) Fmoc 기 및 알릴기를 탈보호한 다음, 펩타이드에 결합된 수지를 PyBop를 커플링제로 사용하여 앞에서 기술한 것과 같이 고리화하였으며, 고리화 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. 합성이 완결된 다음, 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하여, 조 생성물 58.6 mg을 얻었다.

앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 98 % 이상의 고리형 펩타이드 생성물 5.7 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 4.4 % 이었다. 펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺616.25, 계산치 MH⁺616.27)로 확인하였다.

합성 실시예 5.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Pro-Tyr-NH₂(화합물 5) 의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 글리신의 커플링 반응이 완결될 때까지 "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 수행되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 99 % 이상의 펩타이드 생성물 46.6 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 28.6% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺576.27, 계산치 MH⁺576.26)로 확인하였다 .

합성 실시예 6.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Pro-Tyr-NH₂(화합물 6)의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 글리신의 커플링 반응이 완결될 때까지 "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 98 % 이상의 펩타이드 생성물 26 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 16.3% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺560. 25, 계산치 MH⁺560.28)로 확인하였다 .

합성 실시예 7.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Ala-Tyr-NH₂(화합물 7)의 펩타이드 합성.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 98 % 이상의 펩타이드 생성물 18.9 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 12.2% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺534.25, 계산치 MH⁺534.26)로 확인하였다.

합성 실시예 8.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-Ala-Gly-Gly-D-Pro-Tyr-NH₂(화합물 8)의 펩타이드 합성.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 130 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 94 % 이상의 펩타이드 생성물 70.1 mg을 회수하였다.

정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 48.2% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺520,25, 계산치 MH⁺520.56) 로 확인하였다.

합성 실시예 9.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Ala-Tyr-NH₂(화합물 9) 의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 글리신의 커플링 반응이 완결될 때까지"TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 131 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 92 % 이상의 펩타이드 생성물 72.4 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 49% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺550.28, 계산치 MH⁺550.59)로 확인하였다 .

합성 실시예 10.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-Tyr-NH₂(화합물 10)의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 글리신의 커플링 반응이 완결될 때까지 "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 150.8 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 99 % 이상의 펩타이드 생성물 93.1 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 58% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺576. 63, 계산치 MH⁺576.63)로 확인하였다.

합성 실시예 11.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-NH₂(화합물 11) 의 펩타이드 합성.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 24.3 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 91 % 이상의 펩타이드 생성물 10.2mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 4 % 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺602,23, 계산치 MH⁺602.32)로 확인하였다.

합성 실시예 12.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-NH₂(화합물 12)의 펩타이드 합성.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 29.9 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 97 % 이상의 펩타이드 생성물 19 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 50% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺578,18, 계산치 MH⁺578.23)로 확인하였다.

합성 실시예 13.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH₂(화합물 13)의 펩타이드 합성.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 27.3 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 97 % 이상의 펩타이드 생성물 12.7 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 34% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺546,28, 계산치 MH⁺546.55) 로 확인하였다.

합성 실시예 14.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-Ala-Gly-PC-Pro-Tyr-NH₂(화합물 14) 의 펩타이드 합성.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 23.4 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 97 % 이상의 펩타이드 생성물 13.5 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 34.6% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺574,32, 계산치 MH⁺574.29) 로 확인하였다.

합성 실시예 15.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 Ac-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH₂(화합물 15)의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 티로신의 커플링 반응이 완결될 때까지 "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, 무수 아세트산 (1 ml, 10.5 mmol)과 2 ml의 DMF에 용해시킨 100 ㎕의 피리딘을 함께 사용하여, N-말단 아미노기를 아세틸화하였다. 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. 합성이 완결된 후에, 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 89.9 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 99 % 이상의 펩타이드 생성물 80.1 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 58.9% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺618.30, 계산치 MH⁺618.28) 로 확인하였다.

합성 실시예 16.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Cys(Acm)-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys(Acm)-NH₂(화합물 16)의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 시스틴(Acm)의 커플링 반응이 완결될 때까지 "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 47.3 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 97 % 이상의 펩타이드 생성물 29.1 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 12.9% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺924.50, 계산치 MH⁺924.36) 로 확인하였다.

합성 실시예 17.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Cys(Acm)-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys(Acm)-NH₂(화합물 17)의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 시스틴(Acm)의 커플링 반응이 완결될 때까지 "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 45.67 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 94 % 이상의 펩타이드 생성물 29.15mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 14.9 % 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺796.25, 계산치 MH⁺796.30) 로 확인하였다.

합성 실시예 18.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Cys(Acm)-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Cys(Acm)-NH₂(화합물 18)의 펩타이드 합성.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 동결 건조 조 생성물을 HPLC로 분석 및 정제하고, 화합물 17에서와 유사한 방법으로 특성화하였다.

합성 실시예 19.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Cys(Acm)-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys(Acm)-NH₂(화합물 19)의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 시스틴(Acm)의 커플링 반응이 완결될 때까지"TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 94 % 이상의 펩타이드 생성물 2.76 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 17.9 % 이었다.

합성 실시예 20. (화합물 20)의 합성

19 mg의 펩타이드 H-Cys-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys-NH₂를 1.5 ㎖ (5% 아세트산 수용액과 DMSO 4 : 1, 부피/부피, pH ~6)에 용해시켜 산화시킨다. 이 혼합물을 냉동고에 6일 동안 넣어둔다.

앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 97 % 이상의 펩타이드 생성물 91 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 47 % 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺652.29, 계산치 MH⁺652.21) 로 확인하였다.

합성 실시예 21. (화합물 21)의 합성.

32 mg의 펩타이드 H-Cys-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-Cys-NH₂를 1.5 ㎖ (5% 아세트산 수용액과 DMSO 4 : 1, 부피/부피, pH ~6)에 용해시켜 산화시킨다. 이 혼합물을 냉동고에 6일 동안 넣어둔다.

앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 99 % 이상의 펩타이드 생성물 6.13 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 3 % 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺652.23, 계산치 MH⁺652.21) 로 확인하였다.

합성 실시예 22.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-NH₂(화합물 22)의 펩타이드 합성.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 94 % 이상의 펩타이드 생성물 47 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 30% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺576,26, 계산치 MH⁺576.26) 로 확인하였다.

합성 실시예 23.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-D-Asn-OH (화합물 23)의 펩타이드 합성.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 93.7 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 93 % 이상의 펩타이드 생성물 60.7mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 47.5 % 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺690.32, 계산치 MH⁺690.30) 로 확인하였다.

합성 실시예 24.Ac-D-Tyr(3,5-디-I)-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH₂(화합물 24)의 합성.

40.6 mg (64 μmol)의 펩타이드 (화합물 2)를 10 ml의 0.1M 포스페이트 완충용액 pH 6.5 에 용해시킨다 (용액 A).

75.6 mg의 KI (400 μmol)를 10 ml의 포스페이트 완충용액 pH 6.5 에 용해시키고, 120 요도비드(IODO-BEADS, N-클로로-벤젠술폰아미드, 산화 용량 0.55 μmol/비드; PIERCE, 28665ZZ)를 첨가한 다음, 용액을 실온에서 10 분 동안 방치한다(용액 B).

용액 A와 B를 합친 다음, 15 분 동안 서서히 교반한다. 요오드화된 펩타이드를 분리하고, 상술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 90 % 이상의 펩타이드 생성물 39.5 mg을 회수하였다. 펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺870.09, 계산치 MH⁺870.08)로 확인하였다.

합성 실시예 25.Ac-D-Tyr(모노-요오도)-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH₂(화합물 25)의 합성.

용액 A와 B를 합친 다음, 15 분 동안 서서히 교반한다. 요오드화된 펩타이드를 분리하고, 상술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 90 % 이상의 펩타이드 생성물 3.3 mg을 회수하였다. 펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺744.19, 계산치 MH⁺744.18)로 확인하였다.

합성 실시예 26.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-(1,2¹³C,¹⁵N-Gly)-D-Ala-(1,2¹³C,¹⁵N-Gly)-NH₂(화합물 26)의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 D-티로신의 커플링 반응이 완결될 때까지 "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, 무수 아세트산(1 ml, 10.5 mmol)과 2 ml의 DMF에 용해시킨 100 ㎕의 피리딘을 함께 사용하여, N-말단 아미노기를 아세틸화하였다. 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. 합성이 완결된 후에, 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 142.4 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 99 % 이상의 펩타이드 생성물 79.7 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 50 % 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺624.25, 계산치 MH⁺624.26) 로 확인하였다.

합성 실시예 27.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-Hyp-NH₂(화합물 27)의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 프롤린의 커플링 반응이 완결될 때까지 "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 98 % 이상의 펩타이드 생성물 135.7 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 82.7 % 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺690.38, 계산치 MH⁺690.31) 로 확인하였다.

합성 실시예 28.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Hyp-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-NH₂(화합물 28)의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 4-히드록시프롤린의 커플링 반응이 완결될 때까지 "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드-수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 98 % 이상의 펩타이드 생성물 127 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 69.8 % 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺690.25, 계산치 MH⁺690.31) 로 확인하였다.

합성 실시예 29.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Sar-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH₂(화합물 29)의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 사코신(Sarcosine)의 커플링 반응이 완결될 때까지 "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 150 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 93 % 이상의 펩타이드 생성물 85.5 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 57 % 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺604.33, 계산치 MH⁺604.30) 로 확인하였다.

합성 실시예 30.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 H-Gly-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH₂(화합물 30)의 펩타이드 합성.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 조 생성물의 수득량은 124 mg 이었다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 96 % 이상의 펩타이드 생성물 64.8 mg을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총 수율은 41.6% 이었다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺590.19, 계산치 MH⁺590.29) 로 확인하였다.

합성 실시예 31.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 ASAL-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH₂(화합물 31)의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 프롤린의 커플링 반응이 완결될 때까지 "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기를 아지도 살리실산(azido salicylic acid)으로 앞에서 설명한 것과 같은 표준 커플링 반응 절차에 따라 아세틸화하였다. 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. 합성이 완결된 다음, 펩타이드 수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 94 % 이상의 펩타이드 생성물 15.9 mg을 회수하였다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺575.23, 계산치 MH⁺575.56) 로 확인하였다.

합성 실시예 32.ASAL (모노-요오도)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH₂(화합물 32)의 펩타이드 합성.

10.3 mg의 펩타이드 (화합물 31)를 2.5 ml의 0.1M 포스페이트 완충용액 pH 6.5에 용해시킨다 (용액 A).

18.9 mg의 KI (100 μmol)를 2.5 ml의 포스페이트 완충용액 pH 6.5 에 용해시키고, 30 요도비드 (IODO-BEADS, N-클로로-벤젠술폰아미드, 산화 용량 0.55 μmol/비드; PIERCE, 28665ZZ)를 첨가한 다음, 용액을 실온에서 10 분 동안 방치한다(용액 B).

용액 A와 B를 합친 다음, 1 시간 동안 서서히 교반한다. 요오드화된 펩타이드를 분리하고, 상술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 99 % 이상의 펩타이드 생성물 4.4 mg을 회수하였다. 펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺701.13, 계산치 MH⁺701.46) 로 확인하였다.

합성 실시예 33.TentaGel-S-Ram (Rapp polymere, 독일) 상에서의 AB-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH₂(화합물 33)의 펩타이드 합성.

건조 TentaGel-S-Ram (0.23 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장치된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 티로신의 커플링 반응이 완결될 때까지 "TentaGel 수지 상에서의 회분식 펩타이드 합성" 항목에서 기술된 것과 같이 처리하였다. 모든 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기를 아지도벤조산(Azido Benzoicic acid)으로, 상술한 것과 같은 표준 커플링 반응 절차에 따라, 아세틸화하였다. 커플링 반응은 밤새도록 계속되었다. 아실화를 앞에서 기술한 것과 같은 80℃에서의 닌히드린 시험으로 점검하였다. 합성이 완결된 다음, 펩타이드-수지를 DMF (3 x 15 ml, 각각 1 분), DCM (3 x 15 ml, 각각 1 분), 디에틸 에테르 (3 x 15 ml, 각각 1 분)로 세정하고, 진공 건조하였다.

펩타이드를 앞에서 기술한 것과 같은 방법으로 수지로부터 분리시키고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다. 앞에서 기술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 90 % 이상의 펩타이드 생성물 20.5 mg을 회수하였다.

펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺721.28, 계산치 MH⁺721.26) 로 확인하였다.

합성 실시예 34.AB-Tyr(3,5-디-요오도)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH₂(화합물 34)의 펩타이드 합성.

10.3 mg의 펩타이드 (화합물 34)를 2.5 ml의 0.1M 포스페이트 완충용액 pH 6.5에 용해시킨다 (용액 A).

용액 A와 B를 합친 다음, 1 시간 동안 서서히 교반한다. 요오드화된 펩타이드를 분리하고, 상술한 것과 같은 제조용 HPLC로 정제하여, 순도 90 % 이상의 펩타이드 생성물 1.2 mg을 회수하였다. 펩타이드의 정체를 ES-MS (측정치 MH⁺973.08, 계산치 MH⁺973.46) 로 확인하였다.

합성 실시예 35

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Cyclo(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Gin-)(화합물 35)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제 1 아미노산 Fmoc-Asp(OH)-OAII를, 분리(cleavage) 후에최종적으로 아미드화 (Gin)으로 종결될 측쇄 카르복실산을 통하여 TentaGel-S-Ram 수지와 결합시켰다. 이어서, N-말단 글리신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 공정을 수행하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. (상술한 절차에 따라) Fmoc 기 및 알릴기를 탈보호한 다음, 펩타이드에 결합된 수지를 PyBop를 커플링제(coupling reagent)로 사용하여 앞에서 기술한 것과 같이 고리화하였으며, 상기 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트(ninhydrin test)에 의하여 아실화를 체크하였다. 합성 종결 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다. 상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조질의 (crude) 물질 135.3mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC(preparative HPLC)을 사용하여 정제한 후, 순도가 98% 보다 우수한 19.1mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 6.6% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다 (측정값 MH⁺687.38, 계산값 MH⁺687.32)

합성 실시예 36

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Cyclo(-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Asn-)(화합물 36)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제 1 아미노산 Fmoc-Asp(OH)-OAII를, 분리 후에 최종적으로 아미드화 (Asn)으로 종결될 측쇄(side-chain) 카르복실산을 통하여 TentaGel-S-Ram 수지와 결합시켰다. 이어서, N-말단 글리신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 공정을 수행하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. (상술한 절차에 따라) Fmoc 기 및 알릴기를 탈보호한 다음, 펩타이드에 결합된 수지를 PyBop를 커플링제로 사용하여 앞에서 기술한 것과 같이 고리화하였으며, 상기 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. 합성 종결 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 63.4mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 97% 보다 우수한 13.2mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 6.2% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다 (측정값 MH⁺673.38, 계산값 MH⁺673.30)

합성 실시예 37

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Cyclo(-Gly-Ala-Gly-Pro-Pro-Tyr-Asn-)(화합물 37)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제 1 아미노산 Fmoc-Asp(OH)-OAII를, 분리 후에 최종적으로 아미드화 (Asn)으로 종결될 측쇄 카르복실산을 통하여 TentaGel-S-Ram 수지와 결합시켰다. 이어서 N-말단 글리신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 공정을 수행하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. (상술한 절차에 따라) Fmoc 기 및 알릴기를 탈보호한 다음, 펩타이드에 결합된 수지를 PyBop를 커플링제로 사용하여 앞에서 기술한 것과 같이 고리화하였으며, 상기 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. 합성 종결 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 85.1mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 98% 보다 우수한 9.8mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 6.2% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다 (측정값 MH⁺657.38, 계산값 MH⁺657.31)

합성 실시예 38

Cyclo(-Tyr(3,5-diiodo)-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn)(화합물 38)의 합성

펩타이드(화합물 3) 10.8mg을 pH 6.5의 2.5ml 0.1M 포스페이트 완충 용액에 용해 시켰다(용액 A).

18.9mg KI(400μmol)을 pH 6.5의 2.5ml 포스페이트 완충 용액에 용해시키고 30 요오도비드(IODO-BEADS, N-클로로벤젠설폰아미드, 산화 용량(Oxidative capacity) 0.55μmol/bead;PIERCE, 28665ZZ)를 첨가하고 이 용액을 실온에서 10분간 방치한다(용액 B).

용액 A 및 용액 B를 조합하고 2시간 동안 서서히 교반한다. 요오드화된 펩타이드를 상기 기술된 바와 같이 분취용 HPLC를 사용하여 분리 정제하여, 순도가 95% 보다 우수한 9.8mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다 (측정값 MH⁺925.10, 계산값 MH⁺925.30)

합성 실시예 39

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH₂(화합물 39)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 글리신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 124mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 96% 보다 우수한 26.5mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 20.5% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다 (측정값 MH⁺480.24, 계산값 MH⁺480.50)

합성 실시예 40

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Ac-Gly-Asn-Tyr-NH₂(화합물 40)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 글리신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, 무수 아세트산 (1 ml, 10.5 mmol)과 2 ml의 DMF에 용해시킨 100 ㎕의 피리딘을 함께 사용하여, N-말단 아미노기를 아세틸화하였다. 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. N-말단 아미노기의 아실화 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 90.4mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 99% 보다 우수한 63.4mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 65.1% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다 (측정값 MH⁺394.16, 계산값 MH⁺394.20).

합성 실시예 41

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 H-Gly-Asn-Tyr-NH₂(화합물 41)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 글리신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 91.4mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 95% 보다 우수한 62.1mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 54.5% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다 (측정값 MH⁺352.16, 계산값 MH⁺352.18).

합성 실시예 42

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH₂(화합물 42)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 알라닌의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, 무수 아세트산 (1 ml, 10.5 mmol)과 2 ml의 DMF에 용해시킨 100 ㎕의 피리딘을 함께 사용하여, N-말단 아미노기를 아세틸화하였다. 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. N-말단 아미노기의 아실화 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 105mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 98% 보다 우수한 52mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 45% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다 (측정값 MH⁺465.22, 계산값 MH⁺465.30).

합성 실시예 43

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH₂(화합물 43)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 알라닌의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 104.5mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 96% 보다 우수한 77.8mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 58.8% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺423.19, 계산값 MH⁺423.28).

합성 실시예 44

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Cyclo(-Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn-)(화합물 44)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제 1 아미노산 Fmoc-Asp(OH)-OAII를, 분리 후에 최종적으로 아미드화 (Asn)으로 종결될 측쇄 카르복실산을 통하여 TentaGel-S-Ram 수지와 결합시켰다. 이어서, N-말단 티로신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 공정을 수행하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. (상술한 절차에 따라) Fmoc 기 및 알릴기를 탈보호한 다음, 펩타이드에 결합된 수지를 PyBop를 커플링제로 사용하여 앞에서 기술한 것과 같이 고리화하였으며, 상기 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. 합성 종결 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 60.2mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 87% 보다 우수한 5.0mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 4.3% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺564.25, 계산값 MH⁺564.57).

합성 실시예 45

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Cyclo(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Gly-Asn-)(화합물 45)의 펩타이드 합성

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 79.1mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 90% 보다 우수한 20mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 14.0% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다 (측정값 MH⁺569.25, 계산값 MH⁺569.67).

합성 실시예 46

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Cyclo(-Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn-)(화합물 46)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제 1 아미노산 Fmoc-Asp(OH)-OAII를, 분리 후에 최종적으로 아미드화 (Asn)으로 종결될 측쇄 카르복실산을 통하여 TentaGel-S-Ram 수지와 결합시켰다. 이어서 N-말단 티로신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 공정을 수행하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. (상술한 절차에 따라) Fmoc 기 및 알릴기를 탈보호한 다음, 펩타이드에 결합된 수지를 PyBop를 커플링제로 사용하여 앞에서 기술한 것과 같이 고리화하였으며, 상기 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. 합성 종결 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 58.9mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 98% 보다 우수한 15.9mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 11% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺740.31, 계산값 MH⁺740.75).

합성 실시예 47

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Cyclo(-Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn-)(화합물 47)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제 1 아미노산 Fmoc-Asp(OH)-OAII를, 분리 후에 최종적으로 아미드화 (Asn)으로 종결될 측쇄 카르복실산을 통하여 TentaGel-S-Ram 수지와 결합시켰다. 이어서, N-말단 티로신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 공정을 수행하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. (상술한 절차에 따라) Fmoc 기 및 알릴기를 탈보호한 다음, 펩타이드에 결합된 수지를 PyBop를 커플링제로 사용하여 앞에서 기술한 것과 같이 고리화하였으며, 상기 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. 합성 종결 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 54.1mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 95% 보다 우수한 19.6mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 15% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺649.10, 계산값 MH⁺649.68).

합성 실시예 48

TentaGel-S-NH-₂(Rapp 폴리머, 독일)상에서의 H-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-OH(화합물 CE-1)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-NH-₂(0.27mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 글리신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 92% 보다 우수한 16.9mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 10.1% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺471.22, 계산값 MH⁺471.21).

합성 실시예 49

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH₂(화합물 CE-2)의 펩타이드 합성

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 159mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 98% 보다 우수한 101mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 60% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺576.26, 계산값 MH⁺576.26).

합성 실시예 50

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 3-(4-히드록시페닐)프로피온일-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH₂(화합물 CE-3)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 프롤린의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새도록 계속하였다. Fmoc기의 탈보호 후, N-말단 아미노기를 상술된 표준 커플링 공정을 사용하여 3-(4-히드록시페닐)프로피온산으로 아세틸화하였다. 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. 펩타이드-수지각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조 생성물 143mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 95% 보다 우수한 73.7mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 50% 이었다.

펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺561.30, 계산값 MH⁺561.24).

본 발명의 화합물 합성

실시예 51:K6 확장 펩타이드 합성

TentaGel-S-NH₂(Rapp 폴리머, 독일)상에서의 H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH(화합물 48)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-NH₂(0.27mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 글리신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺1344.7, 계산값 MH⁺1344.82). 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 99% 보다 우수한 121mg 펩타이드 생성물을 회수하였다.

TentaGel-S-NH₂상에서의 3-(4-히드록시페닐)프로피온일-Pro-Hyp-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH(화합물 49)의 펩타이드 합성;Rapp 폴리머, 독일.

건조 TentaGel-S-NH₂(0.27mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 프롤린의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새도록 계속하였다. Fmoc기의 탈보호 후, N-말단 아미노기를 상술된 표준 공정을 사용하여 3(4-히드록시페닐)프로피온산으로 아세틸화 하였다. 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. 합성을 종결한 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺1329.88, 계산값 MH⁺1329.81). 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 98% 보다 우수한 99.7mg 펩타이드 생성물을 회수하였다.

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH₂(화합물 50)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 글리신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여아실화를 체크하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, N-말단 아미노기 펩타이드 수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺1343.6, 계산값 MH⁺1343.84). 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 98% 보다 우수한 84.7mg 펩타이드 생성물을 회수하였다.

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 3(4-히드록히페닐)프로피온일-Pro-Hyp-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH₂(화합물 51)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 프롤린의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새도록 계속하였다. Fmoc기의 탈보호 후, N-말단 아미노기를 상술된 표준 공정을 사용하여 3(4-히드록시페닐)프로피온산으로 아세틸화 하였다. 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. 합성을 종결한 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다. 조질의 동결 건조 생성물 299mg을 산출하였다. 펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺1328.9, 계산값 MH⁺1329.1). 상술된 바와 같이 분취용 HPLC을 사용하여 정제한 후, 순도가 94% 보다 우수한 155mg 펩타이드 생성물을 회수하였다.

실시예 52:H-Gly-Ψ(CH₂-NH)-Asn-Tyr-OH xTFA(화합물 52)의 합성

1)Boc-Asn-Tyr(tBu)-OtBu

Boc-Asn-OH(3.5g, 15mmol)을 디클로로메탄에 용해시키고 (알코올 없이 100ml 아밀렌을 안정화시킴) HOBt(2.24g 건조 16.5mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 아이스/워터 배쓰에서 냉각시키고 DIC(2.45ml, 16mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 20분간 반응시킨다. 하부의 HOBt는 반응하여 DIU의 침전물(상부)이 형성된다. H-Try(tBu)-OtBu×HCl(5.1g, 15.4mmol)을 DMF(30ml 건조)에 용해시킨다. 활성 에스테르를 함유하는 디클로로메탄 혼합물을 DMF 용액에서 직접 DIU로부터 여과시킨다. 조합된 혼합물을 아이스/워터에서 냉각시키고 NMM(1.75ml, 15.8mmol)을 첨가한다. 상기 혼합물을 밤새도록 반응시킨다. 용매를 진공하에 제거시킨다. 에틸아세테이트 200ml를 첨가하고 침전물을 제거하여, 용액을 시트르산 (2×50ml, 10%), 소듐 하이드로겐 카보네이트 (2×50ml, 포화) 및 소금물(2×50ml)로 세정하였다. 용액을 마그네슘 설페이트로 건조하고 0.2mBar에서 30분 내에 종결되도록 용매를 진공하에 제거한다. 원료 물질을 펜탄(40ml)에서 현탁시키고 DIU의 침전물로부터 여과한다. 표제 화합물을 얻도록 펜탄올을 진공하에 제거한다.

2)Asn-Tyr×TFA

Boc-Asn-Tyr(tBu)-OtBu(7.1g, 14mmol)을 TFA/EDT 19/1(30ml)에서 용해하고 2시간 동안 방치한다. TFA를 진공하에서 제거하고 에테르 (200ml)를 첨가하여 생성물을 침전시킨다. 에테르(3×100ml)로 세정된 생성물로부터 에테르를 가만히 따른다. 생성물을 진공 건조하여 추가 정제 없이 사용할 수 있는 생성물을 얻는다.

3)Boc-Gly-Ψ(CH ₂ -NH)-Asn-Tyr-OH

Asn-Tyr×TFA(5.6g, 13.7mmol) 및 아세트산 (1ml)를 메탄올 (100ml 건조)에 용해하고 Boc-glycinal(2.72g, 17mmol)을 첨가한다. 상기 혼합물을 10분간 교반한다. 그 다음, 소듐 시아노보로하이드라이드(2.15g)을 조금씩(potion wise) 30분 이상 첨가한다. 상기 혼합물을 추가 2 시간 동안 더 교반한다. 대부분의 메탄올을 진공하에 제거한다. 에틸아세테이트 (200ml)를 첨가하고 보론 복합체를 포화 소듐 바이카보네이트 (100ml)와 15분간 흔들어 가수분해시킨다. 에틸아세테이트를 추가 포화 소듐 바이카보네이트(100ml)로 세정한다. 조합된 물상을 에틸 아세테이트(100ml)로 추출하고, 조합된 유기 상을 소금물(2×50ml)로 세정하고 마스네슘 설페이트로 건조한다. 에틸아세테이트를 진공하에 제거하여 목적 생성물을 얻는다.

4)H-Gly-Ψ(CH ₂ -NH)-Asn-Tyr-OH×TFA

2)와 유사하게 Boc-Gly-Ψ(CH₂-NH)-Asn-Tyr-OH(5.20g, 11.9mmol)에서 개시하고 약 5.37g(100%)(기대값)을 산출한다. RP HPLC에 의하여 1g 정제함으로써 분석순수 샘플을 얻을 수 있다. 기대 수율 약 90%. 순도 >98%.

실시예 53:Ac-Gly-Asn-Tyr-NH₂(화합물 53), Cylo(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn)(화합물 54), Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH₂(화합물 55), Ac-Asn-Tyr-NH₂(화합물 56), Ac-Gly-Tyr-NH₂(화합물 57), Hydroxyacetyl-Asn-Tyr-NH₂(화합물 58), H-Gly(YCH₂NH)-Gly-Tyr-NH₂(화합물 59) 및 H-Gly-Asn-Phe(pNO₂)-NH₂(화합물 60)의 고체상 합성

고체상 합성의 일반적인 방법은 Larsen, B.D 외에 의해 활용된 표제 Novel peptide인 PCT 출원 PCT/US01/19113에 보고된 바 있다.

TentaGel S-Ram(Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Cyclo(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn)(화합물 54)의 펩타이드 합성

첫번째 배치: 건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제 1 아미노산 Fmoc-Asp(OH)-OAII를, 분리 후에 최종적으로 아미드화 (Asn)으로 종결될 측쇄 카르복실산을 통하여 TentaGel-S-Ram 수지와 결합시켰다. 이어서, N-말단 티로신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 공정을 수행하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. (상술한 절차에 따라) Fmoc 기 및 알릴기를 탈보호한 다음, 펩타이드에 결합된 수지를 PyBop를 커플링제로 사용하여 앞에서 기술한 것과 같이 고리화하였으며, 상기 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. 합성 종결 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켜, 조 생성물 57mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC(preparative HPLC)을 사용하여 정제한 후, 순도가 95% 보다 우수한 2.7mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 1.3% 이었다. 펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺673.32, 계산값 MH⁺673.28).

두번째 배치:건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 제 1 아미노산 Fmoc-Asp(OH)-OAII를, 분리 후에 최종적으로 아미드화 (Asn)으로 종결될 측쇄 카르복실산을 통하여 TentaGel-S-Ram 수지와 결합시켰다. 이어서, N-말단 티로신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 공정을 수행하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. (상술한 절차에 따라) Fmoc 기 및 알릴기를 탈보호한 다음, 펩타이드에 결합된 수지를 PyBop를 커플링제로 사용하여 앞에서 기술한 것과 같이 고리화하였으며, 상기 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. 합성 종결 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켜, 조 생성물 57mg을 산출하였다. 상술된 바와 같이 분취용 HPLC(preparative HPLC)을 사용하여 정제한 후, 순도가 99% 보다 우수한 10mg 펩타이드 생성물을 회수하였다. 정제된 펩타이드 생성물의 총수율은 7% 이었다. 펩타이드 정체를 ES-MS로 확인하였다(측정값 MH⁺673.30, 계산값 MH⁺673.29).

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Ac-Asn-Tyr-NH₂(화합물 56)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 아스파라긴의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. Fmoc 기를 탈보호한 다음, 무수 아세트산 (1 ml, 10.5 mmol)과 2 ml의 DMF에 용해시킨 100 ㎕의 피리딘을 함께 사용하여, N-말단 아미노기를 아세틸화하였다. 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. N-말단 아미노기의 아실화 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

상술된 바와 같이 펩타이드를 수지로 부터 분리하고 아세트산으로 부터 동결건조시켰다.

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Ac-Gly-Tyr-NH₂(화합물 57)의 펩타이드 합성

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Hydroxyacetyl-Asn-Tyr-NH₂(화합물 58)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 아스파라긴의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. Fmoc기의 탈보호 후, N-말단 아미노기를 상술된 표준 커플링 공정을 사용하여 하이드록시아세트산으로 아세틸화시켰다. 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. N-말단 아미노기의 아실화 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 H-Gly(YCH₂NH)-Gly-Tyr-NH₂(화합물 59)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, C-말단 티로신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. Fmoc기의 탈보호 후, N-말단 아미노기를 상술된 표준 커플링 공정을 사용하여 브로모아세트산으로 아세틸화시켰다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. N-말단 아미노기의 아실화 후, 펩타이드-수지를 DMF에 용해된 과량의 에틸렌디아민으로 처리하였다. 상기 반응을 밤새도록 계속하였다. 그 다음 펩타이드 수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

TentaGel-S-Ram (Rapp 폴리머, 독일)상에서의 H-Gly-Asn-Phe(pNO₂)-NH₂(화합물 60)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-Ram(0.23mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 글리신의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기재된 바와 같이 처리하였다. 커플링을 밤새도록 게속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. Fmoc기의 탈보호 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

실시예 54: Gly-(DBF)-Tyr-NH₂×TFA(화합물 61)의 합성

고체상 합성의 일반적인 방법은 다음의 변경과 함께 Larsen, B.D외에 의해 표제Novel Peptide Conjugates인 PCT 출원 PCT/US01/19113에 기록된 바 있다.

TentaGel-S-RAM 수지(PEG-PS)상에서의 배치식 펩타이드 합성

건조 TentaGel 수지(1g, 0.22-0.31mmol/g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣었다. Deprotection of the N-α-amino protecting group(Fmoc)에 보여진 바와 같이 상기 수지를 DMF(15ml)에서 스웰링하고, Fmoc기를 제거하였다. 서열에 따른 아미노기를 상술된 바와 같이 미리 형성된 Fmoc-보호HOBt 에스테르(3 당량)로서 커플링 시켰다. 언급이 없는 한, 커플링을 2시간 동안 계속하였다. 과량의 제제를 제거하기 위하여 상기 수지를 DMF(각각 5×15ml, 5분)으로 흘려 세정하였다. 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 모든 아실화를 체크하였다. 합성 종결 후, 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다.

아미노산

4(Fmoc-2-아미노에틸)-6-디벤조퓨란프로피온산 (Fmoc-DBF-OH)를 네오시스템, 프랑스 스트라스부르로부터 구입하였다.

HPLC 분석

컬럼:VYDAC238TP5415 150×4.6mm 모노머의 RP C18 5㎛ 300Å

유속:1.00ml/분

온도:40℃

검출:215nm

구배 1:0-1.5분 A

1.5-25분50%B에 대한 선형 구배

25-30분100%B에 대한 선형 구배

30-35분B

35-40분 A에 대한 선형 구배

40-45분A

산으로 수지로 부터 펩타이드 분리

95% 트리플루오로아세트산(TFA, Riedel-de Haen, Frankfurt, 독일) 및 5% 에탄디티올 v/v로 실온에서 2 시간 동안 처리하여 수지로 부터 펩타이드를 분리시켰다. 여과된 수지를 TFA로 세정하였다. 환산 압력에서 여과 및 세정을 5-10%까지 감소시켰다. 10배의 에테르를 잔여물에 첨가하여 펩타이드를 침전시켰으며, 이를 소결 유리 여과기에서 세정 여과하고 에테르로 세정하고 P₂O₅에 의하여 엑시케이터(excicator)에서 진공 건조하였다. 조 생성물을 고속 액체 크로마토그래피(HPCL)에 의해 분석 하였고, 전기분무 이온화 질량 분석법(ESMS:electro spray ionisation mass spectrometry)에 의해 동정하였다.

Gly-(DBF)-Tyr-NH₂×TFA(화합물 61)의 합성

건조 TentaGel-S-RAM-FMOC(0.23mmol/g, 1.02g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, DMF에서 상기 수지를 스웰링(swelling)하고, 상기 수지를 N-말단 글리시닌의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel-S-RAM 수지 상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기술된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새도록 계속하였다. Fmoc-DBF-OH는 DMF에서 잘 용해 할 수 없으며, DMF에서 보호된 아미노산 및 HOBt의 현탁액을 50℃에서 가열하고 10% NMP를 첨가하여 DIC와 반응시켰다. 펩타이드를 상술된 바와 같이 수지로부터 분리시켰고, 수율은 101.3mg(70%)였다. HPLC는 93% 순도를 나타내었다.

자동화 분류 콜렉팅(automated fraction collecting)으로 Biocad상에 RP-HPLC를 사용하여 정제하였다.

컬럼:Kromasil RP C8;K 100-10-C8 250×50.8mm.

온도:주위 온도 약 20℃

유속 35ml/분

검출 215nm 및 280nm에서의 UV

완충 용액 A:물중 0.10% TFA. 완충 용액 B: 0.10% TFA, 9.9% 물, 90% 아세토니트릴

구배(gradient):순수 A에서 출발한다. 5분에 걸쳐 20% B까지의 구배의 경사로 올린 다음 50분에 걸쳐 60% B까지의 구배의 경사로 올린다. 순수 생성물을 함유하는 단편(fraction)을 모으고 동결 건조하여 HPLC에 따른 순수 흰색 물질 99%의 79.4mg(수지 로드(resin load) 55%)를 얻었다. 머무름 시간 10.2분(분석 구배기 1). MS는 기대한 502.21의 단일 동위원소 질량(monoisotopic mass)을 나타낸다.

화합물을 다음의 식으로 나타낸다.

PCT/US01/19113 출원은 본 명세서에서 참고 문헌으로 병합된다.

실시예 55

TentaGel-S-NH₂(Rapp 폴리머, 독일)상에서의 Gly-Dapa-Gly-Hyp-Pro-Tyr(화합물 62)의 펩타이드 합성

건조 TentaGel-S-NH₂(0.27mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기에 넣고, N-말단 Fmoc-Glycine의 커플링이 끝날때 까지 "TentaGel 수지 상에서의 배치식 펩타이드 합성"에 기술된 바와 같이 처리하였다. 커플링을 밤새도록 계속하였다. 전술한 바와 같이 80℃에서 수행된 닌히드린 테스트에 의하여 아실화를 체크하였다. 합성 종결 후 펩타이드-수지를 DMF(각각 3×15ml, 1분), DCM (각각 3×15ml, 1분), 디에틸 에테르 (각각 3×15ml, 1분)으로 세정하였고 진공 건조시켰다. 펩타이드를 상술된 바와 같이 수지로 부터 분리시켰고, 아세트산으로부터 동결 건조하였다.

Fmoc-보호된 펩타이드를 DMF에서 용해시켰고, 상술된 바와 같이 커플링제로 PyBOP(벤조트리아졸-1-일옥시-트리포스포늄 헥사플루오로포스페이트)를 사용하여 고리화하였다. 고리화 반응(cyclisation reaction)을 밤새도록 계속하였다. 에테르 첨가후 고리화된 펩타이드를 침전시켰고 여과하여 분리시켰다. 조질의 고리화된 펩타이드를 에테르(x3)로 세정한 다음, N-말단 Fmoc-기를 제거하기 위하여 DMF v/v에서 20% 피페리딘에 용해시켰다. 조질의 탈보호된 펩타이드를 에테르 첨가 후 여과에 의하여 분리시킨다. 상기 침전물을 아세트산에 용해시키고 동결 건조한다. 조질의 펩타이드를 상술된 바와 같이 분취용 HPLC를 사용하여 정제한다.

Claims

의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
부정맥 치료용 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
전술한 항에 있어서, 상기 부정맥은, 상심실성 (supraventricular) 또는 심실성 (ventricular) 부정속맥의 두가지 모두가 빈맥, 조동 또는 세동으로서 존재할 수 있는 재분극성 교효성 부정맥을 비롯한, 심방성 또는 심실성 기원의 재입 부정맥인 용도.
심장에 있어서 둔화된 전도를 예방 및/또는 치료하기 위한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
심장의 수축성을 향상시키기 위한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
글루코스 및 산소 결핍을 비롯한 대사성 스트레스가 일어나는 동안 GJIC 장애와 연관된 질병 상태를 치료하기 위한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
항혈전 치료용 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
골다공증을 예방 및/또는 치료하는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
관절염을 비롯한 관절 질환을 예방 및/또는 치료하는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
관절염을 비롯한, 혈관분포가 제대로 이루어지지 않은 연골 및 관절의 질환을 예방 및/또는 치료하는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
뼈 손실의 예방 및/또는 치료, 그리고 골절 치유를 촉진시키는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표1 및 표 8의 화합물의 용도.
각막의 부실한 영양상태와 관련된 질병 상태에서의 각막의 혈관형성의 예방 및/또는 치료, 그리고 각막 병변의 치유를 촉진하는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
상처, 특히 허혈성 궤양을 치료하는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
위궤양 및 십이지장궤양을 치료하는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
고혈압을 예방 및/또는 치료하기 위한 의약을 제조하는데 있어서의, 맥관 벽 중에서 간극 결합 커플링 및/또는 GJIC를 증대시키는 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
뇌의 허혈성 손상 예방 및, 우울증, 분노, 학습 및 기억 장애, 공포 또는 환각과 같은 증상을 나타내는 기질적 정신증(organic psychoses)을 치료하는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
백내장의 예방 및/또는 치료에 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
GJIC 장애와 연관된 청각상실을 예방 및/또는 치료하는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
위장관의 운동성 장애를 예방 및/또는 치료하는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
난소에서의 부진한 세포 대 세포 커플링에 기인하는 여성 불임을 치료하는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
분만의 유도 및 촉진을 위해 옥시토신과 함께 사용되는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
손상된 세포 대 세포 커플링과 연관된 남성 불임을 치료하는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
β- 세포들간의 GJIC 장애에 기인하는 비-인슐린 의존성 당뇨병 환자에 있어서 내당능을 향상시키는데 유용한 의약을 제조하는데 있어서의 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 용도.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 부정맥 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 부정맥의 치료방법.
전술한 항에 있어서, 상기 부정맥은, 상심실성 (supraventricular) 또는 심실성 (ventricular) 부정속맥의 두가지 모두가 빈맥, 조동 또는 세동으로서 존재할 수 있는 재분극성 교효성 부정맥을 비롯한, 심방성 또는 심실성 기원의 재입 부정맥인, 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 부정맥 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여이루어지는 부정맥의 치료방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 글루코스 및/또는 산소 결핍에 처한 포유동물 세포의 간극 결합 세포간 커뮤니케이션을 증대시키는 방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 항혈전 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 항혈전 치료방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 골다공증 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 골다공증의 치료방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 뼈 손실의 치료 또는 예방 및 골절 치유 촉진을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 뼈 손실의 치료 또는 예방 및 골절 치유를 촉진하는 방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 관절염 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 관절염의 치료방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 암종 및 간세포성 및 담관세포성 신생물 및 골암을 비롯한 내배엽, 중배엽 또는 외배엽 기원성 조직의 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 암종 및 간세포성 및 담관세포성 신생물 및 골암을 비롯한 내배엽, 중배엽 또는 외배엽 기원성 조직의 암의 치료방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 상처, 특히 허혈성 궤양의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 상처, 특히 허혈성 궤양의 치료방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 피부의 상처 또는 병변 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 피부의 상처 또는 병변의 치료방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 구강 점막의 상처 또는 병변 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 구강 점막의 상처 또는 병변의 치료방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 위궤양 및 십이지장 궤양 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 위궤양 및 십이지장 궤양의 치료방법.
맥관 벽 중에서 간극 결합 커플링 및/또는 GJIC를 증대시킴으로써 고혈압을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 고혈압의 치료 또는 예방방법.
뇌의 허혈성 손상 예방 및, 우울증, 분노, 학습 및 기억 장애, 공포 또는 환각과 같은 증상을 나타내는 기질적 정신증(organic psychoses)을 치료하는 방법으로서, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, GJIC 장애와 연관된 청각상실의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 청각상실의 치료방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 위장관의 운동성 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 위장관의 운동성 장애를 치료하는 방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 난소에서의 부진한 세포 대 세포 커플링에 기인하는 여성 불임의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 여성 불임의 치료방법.
분만의 유도 및 촉진 처리를 필요로 하는 환자에게 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을 옥시토신과 함께 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 분만을 유도 및 촉진하는 방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 손상된 세포 대 세포 커플링과 연관된 남성 불임의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 남성 불임의 치료방법.
β- 세포들간의 GJIC 장애에 기인하는 비-인슐린 의존성 당뇨병 환자에 있어서 내당능을 향상시키는 방법으로서, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 내당능을 향상시키는 방법.
혈관분포가 제대로 이루어지지 않은 연골 및 관절의 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 방법.
전술한 항에 있어서, 상기 질환이 관절염인 방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을, 백내장의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 백내장의 치료 또는 예방방법.
각막의 부실한 영양상태와 관련된 질병 상태에서의 각막의 혈관형성을 치료 또는 예방하고 각막 병변의 치유를 촉진하기 위한 방법으로서, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 방법.
암 세포의 성장 및 확산을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 방법.
췌장염을 앓고 있는 환자에게 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 췌장염의 치료방법.
세포, 조직 또는 기관의 글루코스 및 산소 결핍을 앓는 환자에게 식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물 및 표 1 및 표 8의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포, 조직 또는 기관의 글루코스 및 산소 결핍의 치료방법.
상기 항에 있어서, 상기 기관이 심장인 방법.
CaCl₂부정맥 마우스 모델에 있어서의 효과에 의해 측정되는 바와 같이 세포간 커뮤니케이션을 촉진시켜주는 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것으로 포함하여 이루어지는, 비증식성 질환의 예방 또는 치료방법.
제 52항에 있어서, 상기 화합물이 상기 마우스 모델에서 2 또는 3점의 점수를 갖는 방법.
제 52항에 있어서, 상기 화합물이 간극 결합 세포간 커뮤니케이션을 촉진시켜주는 것인 방법.
제 52항 내지 54항에 있어서, 상기 화합물이 항부정맥성 펩타이드 수용체의 아고니스트인 방법.
제 52항 내지 55항에 있어서, 상기 화합물이 다이머, 트라이머, 테트라머를 포함하는 레즈베라트롤 및 그의 유도체 중에서 선택되는 방법.
제 56항에 있어서, 상기 화합물이 트랜스-레즈베라트롤(트랜스-3,5,4'-트리히드록시스틸벤)인 방법.
제 52항 내지 54항에 있어서, 상기 화합물이 이르소글라딘 또는 (6-(2,5-디클로로페닐)-2,4-디아미노-1,3,5-트리아진) 및 그의 유도체 중에서 선택되는 방법.
제 52항 내지 54항에 있어서, 상기 화합물이 아포르피노이드 알칼로이드 (aporphinoid alkaloids), 바람직하게는 볼딘 (boldine) 및 타스핀 (taspine) 및 그의 유도체 중에서 선택되는 방법.
칼슘 클로라이드 부정맥 마우스 모델에서의 효과에 의해 측정되는 바와 같이세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 병든 조직 중 저하된 GJIC에 의해 특징지어지는 질병을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 여기서 상기 화합물인 다음 일반식 I의 화합물, 식 I의 펩타이드 서열의 레트로형, 모든 D 형, 또는 레트로 올(all)-D 형, 및 그들의 염 및 아미드 중에서 선택되는 방법:

식 중, 아미노산 잔기들은 D- 및/또는 L-형이고, N*에 N-말단을 갖고 C*에 C-말단을 가지며, 점선에 의하여 보여지는 바와 같은 N*와 C* 사이 또는 점선 U에 의하여 보여지는 바와 같은 R_d와 C* 사이의 공유결합에 의하여 임의적으로 고리형일 수 있으며; 상기 N*와 C* 사이의 점선은 존재시 결합 U가 배제되고, 임의적 공유 결합을 나타내며, 상기 결합이 존재하지 않으면 N*이 수소 원자에 결합하며; R_d와 C* 사이의 임의적 공유결합 U가 존재하면 R7은 부재하며, R7의 존재는 결합 U를 배제하고; 여기서

X는 아미노 말단 N8에 결합할 수 있는 포토프로브와 같은 N-말단 부분, 또는 아세트산, 프로피온산, 부티르산 및 베헤닉산과 같은 다른 지방산과 같은 C(2-22)알킬 카르복시산으로부터 유래된 아실기를 나타내며, 임의적으로 히드록시, 할로겐, C(1-6) 알킬, 니트로 및 시아노로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나; X는 수소를 나타내고;

R₇는 N*와 C* 사이에 결합이 결여되면 OH, NH₂, NHNH₂, NHR₈또는 OR₈을 나타내고 N*와 C* 사이에 결합이 존재하면 R₇은 부재하며;

R₈은 직쇄 또는 측쇄 C(1-6) 알킬기, 아릴기 또는 아르아릴기를 나타내며;

R_a는 Hyp 또는 Pro 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_b는 Hyp 또는 Pro 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_c는 Gly, Sar 아미노산 사이드 체인, 임의적으로 방향족 링 내에서 하나 이상의 히드록시, 할로겐, 니트로, 시아노, 아지도, 아미노, 벤조일 또는 저급 알콕시 또는 티오알콕시기로 치환된 방향족 아미노산 측쇄를 나타내고;

R_d는 Ala, Gly, Glu, Asp, Dab, Dapa, Lys, Asn, Gln, Orn, Thr, Ser 또는 Cys 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_e는 Ala 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_f는 Ala, Sar 또는 Gly 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_gL-4Hyp 측쇄 또는 식 Z 또는 Za 부분을 제외한 모든 아미노산 측쇄를 나타내고;

R_h는 Ala 아미노산 측쇄를 나타내거나, R_g는 식 Z 또는 Za 부분을 나타내고;

R_i는 Gly 아미노산 측쇄를 나타내거나 R_i는 임의적으로 방향족 링 내에서 하나 이상의 히드록시, 할로겐, 니트로, 시아노, 아지도, 아미노, 벤조일 또는 저급 알콕시 또는 티오알콕시기로 치환된 방향족 아미노산 측쇄를 나타내며;

R_j는 Asn, Gln, Asp, Glu, Cys 또는 Tyr 아미노산 측쇄를 나타내고;

각각의 j, k, l, m, n, p 및 q는 독립적으로 0 또는 1임.
제 60항에 있어서, 질병이 본 명세서에 기재된 질병이나 증상, 바람직하게는 기도 상피의 염증, 폐포 조직의 질환, 상처, 발기부전, 방광 뇨실금, 달팽이관 질환에 의한 난청, 내막성 병변, 당뇨성 망막증 및 당뇨성 신경증, 신경성 통증, 중추신경계의 허혈, 척추 손상, 치주질환을 비롯한 치아조직의 손상, 신장 질환, 아만성 및 만성 염증, 암 및 골수 이식 또는 줄기 세포 이식 실패인 방법.
제 52항 내지 61항에 있어서, 화합물이 다음 식으로 표시되는 화합물 및 그의 염:

식 중,

R1은 H 또는 아세틸 (Ac)

R2는 아미노산 G, Y, D-Y, F 및 D-F 중 어느 하나의 측쇄,

R3은 O 또는 H

R4는 여하한 아미노산 측쇄

R5는 O 또는 H

R6는 CH₂, (CH₂)₂, (CH₂)₃및 (CH₂)₄와 같은 C(1-4)알킬기

R7은 O 또는 H

R8은 O 또는 H

R9는 아미노산 G, Y, D-Y, F 및 D-F 중 어느 하나의 측쇄,

R10은 OH 또는 NH₂

S, T, U, V 및 Z는 다음과 같이 정의되는 정수임:

S: 0, 1 또는 2

T: 0, 1 또는 2

U: 0 또는 1

V: 0 또는 1

Z: 0 또는 1, 또는

다음 식을 갖는 화합물 및 그의 염:

R1-X1-X2-X3-R2

(VIII)

식 중,

X1은 0, Ala, Gly, β-Ala, Tyr, D-Tyr, Asp, HAA

X2는 0; Ala-Gly-T4c-Pro; Ala-Sar-Hyp-Pro; Ala-6 고리-; Ala-Asn; D-Asn-D-Ala; D-Asn; yAbu; Gly, Ala; D-Ala; β-Ala; Pamh; Asn; 또는 HAA;

X3은 Tyr; D-Tyr; Gly, Pamb, 또는 Phe; 이고

R1은 H 또는 Ac이며, 단, X1과 X2는 두가지 모두 0은 아님:

인 방법.
제 52항 내지 61항에 있어서, 표준 안정성 분석법으로 측정시 화합물의 반감기가 50분을 초과하고, 바람직하게는 5시간을 초과하는 방법.
제 52항 내지 61항에 있어서, 표준 안정성 분석법으로 측정시 화합물의 반감기가 5시간을 초과하는 방법.
세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 기도 상피 염증의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 기도 상피 염증의 치료방법.
두부 손상 및 허혈, 파킨슨 병을 비롯한 신경퇴행성 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환, 프리온 질병, 및 뇌종양을 비롯한 뇌의 염증성 응답을 촉발시키는 손상을 치료하는 방법으로서, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 방법.
발작에 의해 일어나는 반응성 신경교증을 치료하는 방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
신경교 신생물의 발달을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
척수의 축색절단술과 관련된 뉴런성 및 근육성 증상의 치료방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
당뇨성 망막증의 치료방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
예컨대 동맥경화증과 같이 망막에 있어서의 맥관 이상을 치료하는 방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
모세관의 스프라우팅을 제공하는데 효과적인, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 허혈 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 허혈의 치료방법.
경동맥에서의 풍선 카테테르 손상 후 맥관 치유 프로세스를 촉진시키기 위한 방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 발기부전 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 발기부전의 치료방법.
세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 절박 요실금 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을포함하는 절박 요실금의 치료방법.
세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상처 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 상처의 치료방법.
이뮤노글로불린의 합성을 국부적으로 증가시킴으로써 아만성 또는 만성 염증을 치료하는 방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 말초 신경병증 및 신경병성 통증의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 말초 신경병증 및 신경병성 통증의 치료방법.
세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 후천성 또는 연령 의존성 청각 상실 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 후천성 또는 연령 의존성 청각 상실의 예방 또는 치료방법.
혈액암 및 화학요법 처치 후에서와 같은 조혈 조직의 능력 감퇴를 치료하는 방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
중금속 중독, 비-감염성 염증 또는 미생물 감염에 기인하는 신장의 간극 결합 커뮤니케이션의 조절장애를 특징으로 하는 질병을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
뇌하수체 전엽 분비선으로부터의 부적절한 호르몬 분비를 치료하는 방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
치아의 발육부진을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
피부 노화, 셀룰라이트 및 주름을 완화시키기 위한 방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
상처 치유의 장애 및 피부 노화와 같은, 간극 결합의 언커플링과 연관이 있는 담배 관련 질병을 치료하는 방법으로서, 세포간 커뮤니케이션을 촉진시키는 본 명세서에 기재된 화합물들 중 적어도 하나의 치료적 유효량을, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제 52항 내지 85항에 있어서, 투여되는 화합물이 제 52항 내지 62 중 어느 한 항에 기재된 화합물인 방법.
제 52항 내지 86항에 있어서, 투여되는 화합물이 다음의 화합물:

및 그의 염 중 적어도 하나인 방법.
제 52항 내지 86항에 있어서, 상기 화합물이 레스베라트롤 및 그의 이성체 및 폴리머 중에서 선택되는 방법.
제 52항 내지 86항에 있어서, 상기 화합물이 아포르피노이드 알칼로이드, 바람직하게는 볼딘 및 타스핀 및 그의 유도체 중에서 선택되는 방법.
식 I 내지 VIII의 화합물, 식 2 내지 12의 화합물, 및 표 1 및 표 8의 화합물 또는 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하여 이루어지는 약학적 조성물.
전술한 항에 있어서, 장용 타블렛인 조성물.
제 89항에 있어서, 주사용 제제인 조성물.