WO2011105825A2 - 프리온 질병의 치료 및 예방에 효과를 갖는 레스베라트롤 - Google Patents

프리온 질병의 치료 및 예방에 효과를 갖는 레스베라트롤 Download PDF

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WO2011105825A2
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박상열
서재숙
정재교
문명희
이유진
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전북대학교산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system

Definitions

  • the present invention relates to resveratrol having an effect on the treatment and prevention of prion diseases, and more particularly to a composition for treating and preventing prion diseases containing resveratrol as an active ingredient.
  • Prion is a disease infector of a totally different kind from existing pathogens such as bacteria, viruses, fungi, and parasites. It is much smaller than a normal virus and has the characteristic of causing infectious diseases without genetic material nucleic acid. Infection with animals, including humans, can lead to degenerative neuropathy by the death of nerve cells in the form of sponge-like fears in the brain.
  • PrP C normal prion protein
  • PrP Sc modified prion protein
  • PrP Sc tends to aggregate with each other, and it is estimated that these aggregates of PrP Sc cause infectious diseases of transmissible spongiform encephalopathy (TSE).
  • PrP C consists of three helices ( ⁇ helix) and two screens ( ⁇ sheets). PrP C is converted to PrP Sc through a mechanism unknown to date. PrP Sc has more folding screens than PrP C. Evidence that this conversion process actually occurs is that TSE does not occur when PrP Sc is externally injected into mice without PrP C.
  • PrP Sc Rather than PrP Sc alone promoting the conversion of PrP C alone, it is suggested that more than one chaperone protein plays a major role. Unlike PrP C , PrP Sc aggregates with each other and becomes insoluble and is not completely degraded by proteinase K. Although PrP Sc is completely different from PrP C in conformation, the immune system of the living body does not recognize PrP Sc as an external substance.
  • Normal prion proteins are glycoproteins present in the cell membrane, and most of them are expressed in the brain. Although they are not well known in vivo, they are known to have cell growth and partial signaling functions. In all TSE diseases, the mechanism of invention induces the death of nerve cells, causing lesions such as sponge-like cavities in the brain, leading to damage to the brain, but to date these lesions are due to the sole action of PrP Sc . It is not known whether some normal prion proteins are involved.
  • Modified prion protein causes progressive neuropathy in various mammals, with a mortality rate of 100%.
  • Human CJD, bovine BSE, sheep scrapie, deer CWD, and mink TME are known as representative prion diseases. In general, the disease spreads homogeneously but causes more problems when it has spread to heterogeneity. The most representative example is the human vCJD which has developed from bovine BSE.
  • Resveratrol is a type of polyphenol that is a phytoalexin produced by plants under stress, such as fungi or pests. It is found in many plants, including grapes, peanuts, audi, raspberries and cranberries. Resveratrol is known to have anti-cancer and potent antioxidant activity. In addition, it has antiviral, neuroprotective, anti-inflammatory, anti-aging and life-long effects, which makes resveratrol anti-inflammatory, anti-cancer, antiviral, diabetes and heart. Several possibilities have been suggested for the treatment of diseases.
  • resveratrol has an effect on inhibiting neurodegeneration of Alzheimer's disease, Parkinson's disease or amyotrophic lateral sclerosis. This effect has been shown to protect neurons by reducing the acetylation of p53 and PGC-1alpha.
  • the application and effect of resveratrol on prion disease has not been reported yet.
  • the main object of the present invention is to provide a composition for the treatment and prevention of prion disease containing resveratrol (resveratrol) having the advantage of effectively protecting neurons as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition and animal feed additive composition using the composition.
  • the present invention provides a composition for the treatment and prevention of prion diseases containing resveratrol (trans-3,4 ', 5-trihydroxystilbene) as an active ingredient.
  • the resveratrol can be extracted from seed plants such as ginkgo biloba, conifers, etc., and may be chemically synthesized [Farina A. Ferranti C. Marra C., An improved synthesis of resveratrol, Nat. Prod. Res. 2006, 20 (3): 247-52.
  • the resveratrol of the present invention is characterized by increasing the expression and activity of Stutuin 1 (SIRT1) of neurons.
  • SIRT1 Sirtuin 1 of neurons is a NAD-dependent histone deacetylase, which regulates gene transcription through deacetylation of proteins.
  • Substrates of SIRT1 include p53, NF-kB, FOXO 3 and Ku70 proteins, and regulate their activity to increase resistance to oxidative stress and to inhibit cell aging and cell death. It is also known to be involved in endocrine signaling and glucose homeostasis.
  • resveratrol according to the present invention increased the expression and activity of SIRT1 than normal cells, the activity was further increased as the concentration of resveratrol treated.
  • SIRT1 with increased activity inhibited the expression of proteins that induce apoptosis of cells by inducing deacetylation of proteins, thereby inhibiting cytotoxicity and killing.
  • the resveratrol is characterized in that to reduce the cytotoxicity of the prion protein (PrP) to neurons.
  • Prion is a disease infection factor of a completely different kind from the existing pathogens (bacteria, viruses, fungi, parasites), which is much smaller than a normal virus, and is characterized by causing infectious diseases without nucleic acid, a genetic material. Infection with animals, including humans, can lead to prion disease by causing sponge-like fears to kill nerve cells in the brain. Therefore, it is believed that prion diseases can be prevented when the neurons are protected from the prions to inhibit cell death.
  • resveratrol according to the present invention effectively protected neurons from cytotoxicity induced by prion proteins by treating the resveratrol of the present invention, as confirmed in the Examples of the present invention.
  • the present invention provides a composition for the treatment and prevention of prion diseases containing the gene of Sirtuin 1 (SIRT1) or its expression protein as an active ingredient.
  • SIRT1 Sirtuin 1
  • the Stutuin 1 gene of the present invention is characterized in that it is inserted into a recombinant viral vector.
  • the recombinant viral vector is characterized by having a cleavage map of FIG.
  • the recombinant adenovirus of the present invention was prepared in a gateway system using a destination vector (pAd / CMV / V5-DEST vector, invitrogen) (Example 10).
  • the prion disease of the present invention includes any neurological disease related to apoptosis of nerve cells due to prion protein, but is preferably Creutzfeldt-Jakob disease, Kuru disease, Ger of human Gerstmann-Strsyndrome, fatal familial insomnia or bovine spongiform encephalopathy or bovine spongiform encephalopathy or sheep scrapie or deer's chronic wasting disease or mink TME (transmissible mink encephalopathy) is characterized in that.
  • composition for treating and preventing the prion disease of the present invention may be prepared by a method known in the pharmaceutical field, in which case it includes a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the extract of the present invention as an active ingredient.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, phosphorus calcium, alginate, gelatin, silicic acid Calcium, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils, and the like. It is not.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by being formulated using a pharmaceutically acceptable carrier or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. It can be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in oil or medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets, capsules or injections, and may further comprise dispersants or stabilizers. They may be parenterally administered (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally.
  • Appropriate dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be appropriately determined by such factors as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, health condition, degree of disease symptom, food, time of administration, method of administration and response to reaction. It may be selected, preferably 0.01 to 100 mg per day of adult can be administered.
  • the present invention provides a feed additive composition for preventing prion disease containing resveratrol as an active ingredient.
  • resveratrol of the present invention effectively protects nerve cells from prion proteins as described above, when the feed additive composition containing the resveratrol is used as an animal feed, the resveratrol can treat and prevent prion diseases that may occur in animals. It is believed to be.
  • the present invention produces a composition by extracting and separating resveratrol, and when the composition is treated to neurons, the effect of increasing the expression and activity of Sirtuin 1 (SIRT1) and effectively protecting neurons from cytotoxicity have.
  • SIRT1 Sirtuin 1
  • the present invention is used in the pharmaceutical composition and animal feed additive composition using the composition.
  • FIG. 1 shows the results of observing SH-SY5Y cells treated with PrP (106-126) under an optical microscope
  • FIG. 2 shows the results of measuring cell viability of SH-SY5Y cells treated with PrP (106-126).
  • Figure 3 shows the results of observing the SK-N-SH and HT-22 cells treated with PrP (106-126) with an optical microscope
  • Figure 4 is SK-N-SH treated with PrP (106-126) and The result of measuring the cell viability of HT-22 cells is shown.
  • FIG. 5 shows the results of observing SH-SY5Y cells treated with PrP (106-126) or resveratrol under an optical microscope
  • FIG. 6 shows cell viability of SH-SY5Y cells treated with PrP (106-126) or resveratrol. The result of the measurement is shown.
  • Figure 7 shows the results of immunofluorescence of SH-SY5Y cells treated with PrP (106-126) or resveratrol
  • Figure 8 measures the LDH release characteristics of SH-SY5Y cells treated with PrP (106-126) or resveratrol One result is shown.
  • Figure 9 shows the results of measuring the SIRT1 deacetylase activity of resveratrol or Sirtinol-treated SH-SY5Y cells and shows the Western blot results of the SIRT1 protein.
  • Figure 10 shows the results of measuring the SIRT1 deacetylase activity of SH-SY5Y cells treated with PrP (106-126) or resveratrol and Western blot results of the SIRT1 protein.
  • FIG. 11 shows the results of observing SH-SY5Y cells treated with resveratrol, Sirtinol or PrP (106-126) under an optical microscope
  • FIG. 12 shows the cell viability of SH-SY5Y cells treated as described above.
  • Figure 13 shows the results of immunofluorescence of SH-SY5Y cells treated with resveratrol, Sirtinol or PrP (106-126)
  • Figure 14 shows the DNA fragmentation results of SH-SY5Y cells treated as described above.
  • Figure 15 shows the results of immunofluorescence of SIRT1 of SH-SY5Y cells treated with resveratrol, Sirtinol or PrP (106-126)
  • Figure 16 shows the measurement of SIRT1 deacetylase activity of SH-SY5Y cells treated as described above The results are shown.
  • Figure 17 shows the mRNA expression measurement results of the SIRT1 gene of SH-SY5Y cells treated as described above
  • Figure 18 shows the results of measurement of SIRT1 protein expression of SH-SY5Y cells treated as described above.
  • Figure 19 shows the results of fluorescence microscopic observation of the expression level of acetyl-p53 of resveratrol, Sirtinol or PrP (106-126) -treated SH-SY5Y cells
  • Figure 20 shows the SH-SY5Y cells treated as described above Western blot results of p53, p65 protein are shown.
  • FIG. 21 shows Western blot results of proteins related to apoptosis of SH-SY5Y cells treated as described above
  • FIG. 22 shows expression of PrP c protein of SH-SY5Y cells treated as described above. One result is shown.
  • FIG. 23 shows the results of observing SH-SY5Y cells treated with recombinant adenovirus or PrP (106-126) under an optical microscope
  • FIG. 24 shows cell viability and LDH activity of SH-SY5Y cells treated as described above. The measurement results are shown.
  • FIG. 25 shows TUNEL assay results of SH-SY5Y cells treated with recombinant adenovirus or PrP (106-126)
  • FIG. 26 shows Western blot results of SIRT1 protein of SH-SY5Y cells treated with resveratrol or recombinant adenovirus. And the results of measuring SIRT1 activity.
  • FIG. 27 shows a map of recombinant adenovirus vectors expressing SIRT1.
  • Human neuroblastoma cell lines (SH-SY5Y and SK-N-SH) and mouse neuroblastoma cell lines (HT-22) used in the present invention were obtained from the American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA.
  • the cell lines were treated with 37 ° C., 5% CO using medium essential medium (MEM) (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) medium supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum) and 0.1 mg / ml gentamycin. Incubated in a wet condition incubator with 2 conditions.
  • MEM medium essential medium
  • FBS fetal bovine serum
  • PrP (106-126) (amino acid sequence (SEQ ID NO: 1)) used in the present invention: Lys-Thr-Asn-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala- Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly) and scrambled PrP (106-126) (amino acid sequence (SEQ ID NO: 2): Asn-Gly-Ala-Lys-Ala-Leu-Met-Gly- Gly-His-Gly-Ala-Thr-Lys-Val-Met-Val-Gly-Ala-Ala-Ala) was synthesized from Peptron (Peptron, Seoul, Korea).
  • the PrP (106-126) is a peptide having an amino acid sequence of 106 to 126 present in the normal prion protein, and the PrP protein having the sequence has the characteristics of modified prion, thereby causing the pathogenesis of PrP Sc (modified prion protein). It is used a lot to study. In addition, PrP (106-126) has been reported to cause fibril accumulation in neurons and direct neuronal death [Marella M. and Chabry J. Neurons and astrocytes respond to prion infection by inducing microglia recruitment. J. Neurosci . 2004. 24, 620627.
  • the synthesized peptides were dissolved in sterile DMSO at a concentration of 12.5 mM, stored at -80 ° C, and then used in experiments.
  • crystal violet staining method was used [Chaudhari et al. 2009]. First, the cells were stained with a staining solution (0.5% crystal violet in 30% ethanol and 3% formaldehyde) for 10 minutes at room temperature, and then washed four times with distilled water. Then, the stained cells were lysed with 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution, and the absorbance was measured at 550 nm. Cell viability (%) was calculated by comparison with the dye intensity control.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the lactate dehydrogenase (LDH) release assay is a colorimetric method for measuring cell necrosis. When cells are cultured, the necrotic cells release LDH into the medium, and colorless tetrazolium salt is added to the released LDH to reduce colored formazan. Form.
  • Cytotoxicity in the present invention was evaluated by analyzing the LDH present in the supernatant using the LDH Cytotoxicity Detection Kit (Takara Bio Inc., Tokyo, Japan) according to the manufacturer's protocol. LDH activity was measured by measuring absorbance at 490 nm.
  • TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick and labeling
  • the TUNEL assay is a method for detecting, quantifying, and viewing apoptotic cells in cell tissues under a microscope.
  • the TUNEL assay can observe apoptosis in individual cells while maintaining the structure of the cell tissues.
  • the principle of TUNEL staining is based on the fact that apoptotic cells undergo biochemical degradation of DNA in the cell nucleus.
  • the labeled UTP uridine triphsophate
  • TUNEL analysis of the present invention was analyzed by measuring the degree of apoptosis of the cytoplasm using an in situ ApoBrdU DNA fragmentation assay kit (BioVision, Mountain View, CA, USA) according to the manufacturer's protocol.
  • cell pellets were dispersed in 0.5 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 10% (v / v) NP-40, 20 mM EDTA and 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS). Then, it was immersed in 500 ⁇ g / ml of proteinase K for 4 hours at 65 °C. Thereafter, DNA was sequentially extracted with phenol / chloroform (1: 1, v / v), and precipitated with ethanol at ⁇ 20 ° C. for 12 hours. The purified DNA was electrophoresed with a 1.5% agarose gel, followed by EtBr (ethidium bromide) staining and infrared transillumination.
  • EtBr ethidium bromide
  • the unattached antibody is then removed by washing with PBS and the cells are removed for 2 hours at room temperature with an anti-rabbit IgG antibody (4 ⁇ g / ml) labeled with Alexa Fluor 546 (for anti-SIRT1 and anti-acetyl p53). Reacted. Finally, the cells were fixed with DakoCytomation fluorescent medium and confirmed by fluorescence microscopy.
  • Equal amounts of protein lysate were fractionated on 10-15% SDS-polyacrylamide gel and then electrophoresed to nitrocellulose membrane. Immunoreactivity was examined through the continuous reaction of horseradish peroxidase (HRP) -bound secondary antibodies and ECL reagents.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Antibodies used for immunoblotting include SIRT1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), p53 (Santa Cruz Biotechnology), acetyl p53 (Epitomics Inc., Burlingame, CA, USA), p65 (Santa Cruz Biotechnology), acetyl p65 (Cell Signaling Technology , Beverly, MA, USA), Bcl-xL (Santa Cruz Biotechnology), p21 (Santa Cruz Biotechnology), phospho-p38 (Cell Signaling Technology), cleaved caspase-3 (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA), PrP C (Sigma, St. Louis, MO, USA) and ⁇ -actin (Santa Cruz Biotechnology) were used.
  • RNA from the cells was extracted using the Easy-spin TM total RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea). Subsequently, the synthesis of cDNA was performed according to the protocol of TaKaRa Prime Script TM 1 st strand cDNA synthesis kit (Takara Bio Inc., Tokyo, Japan). To perform quantitative PCR, SYBR green and 1 ⁇ l gene primer were added to a total of 20 ⁇ l reaction solution. The primers used are shown below.
  • Recombinant adenoviruses expressing SIRT1 are described by Choonbuk National University, Jeonju, Jeonbuk, Korea (Lee et al., Overexpression of SIRT1 protects pancreatic beta-cells against cytokine toxicity by suppressing the nuclear factor). -kappaB signaling pathway. Diabetes. 2009. 58 , received from the service 344-351), lacZ-bearing adenovirus (Ad-lacZ) were used as a control group.
  • Recombinant adenovirus of the present invention was prepared in a gateway system using a destination vector (pAd / CMV / V5-DEST vector, invitrogen).
  • a destination vector pAd / CMV / V5-DEST vector, invitrogen.
  • the mouse SIRT1 cDNA was cloned into the Kpn I and Xhol I sites of PENTR 2B (Invitrogen), and then the SIRT1 cDNA insert was transferred to pAd / CMV / V5-DEST vector (Invitrogen) using LR Clonase (Invitrogen). Thereafter, PacI (Promega, Madison, Wis.) Was treated to linearize the plasmid to prepare the recombinant adenovirus vector of FIG. 27.
  • PacI Promega, Madison, Wis.
  • an inverted terminal repeat is for integration of adenovirus as an inverted terminal repeat
  • P CMV is a P CMV promoter
  • T7 is a T7 promoter.
  • V5 is an epitope
  • TK pA is a thymidine kinase polyadenylation sequence for efficient transcription termination and polyadenylation of mRNA
  • wt Ad5 ( ⁇ E3) is a human adenovirus type 5 sequence.
  • the prepared recombinant adenovirus vector was transfected into a human embryonic kidney (HEK) cell line (HEK-293) using lipofectamine 2000.
  • the HEK-293 cells were cultured in RPMI 1640 (including 10% FBS) for 1-2 weeks. The medium was changed every 2 days during the incubation period. Then, the recombinant adenovirus was amplified in a human embryonic kidney (HEK) cell line (HEK-293), and then purified using the Vivapure AdenoPACK kit (Sartorius AG, Goettingen, Germany) according to the manufacturer's protocol.
  • PrP (106-126) -treated SH-SY5Y cells were observed with an optical microscope ( ⁇ 200), and cell viability was measured. Cell viability was measured using the method of Example 3, and the relative cell viability was expressed as a percentage of the survival rate of cells treated with PrP (106-126) based on the survival rate of control cells (no cells treated with nothing). Measured.
  • PrP (106-126) induces cell death of neurons, and the cytotoxicity worsens as the treatment concentration and treatment time increase.
  • * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01 indicates a significant difference between the control and experimental groups, and # P ⁇ 0.05, ## P ⁇ 0.01 indicates the difference between PrP (106-126) and scrambled PrP treated cells. Significant differences.
  • Example 1 the SK-N-SH and HT-22 cells cultured in Example 1 were treated with PrP (106-126) synthesized in Example 2 by concentration (0, 100, 200, 400 ⁇ M) for 24 hours. Incubated for According to the above conditions, SK-N-SH and HT-22 cells treated with PrP (106-126) were observed with an optical microscope ( ⁇ 200), and cell viability was measured. Cell viability measurements are as shown above. Each result is shown in FIG. 3 and FIG.
  • TUNEL assay was performed as in Example 5. The measurement result is shown in FIG.
  • LDH release activity in the cell culture of each of the cells observed in FIG. 7 was measured.
  • the LDH release characteristics were performed by the method of Example 4. The measurement results are shown in FIG. 8.
  • the SH-SY5Y cells cultured in Example 1 were treated with SIRT1 inhibitor Sirtinol (10 ⁇ M) or without treatment, and resveratrol was treated by concentration (0, 0.5, 1, 2 ⁇ M) for 24 hours. Then, the activity of the cytoplasmic SIRT1 deacetylase extracted from each cell was measured, and the expression of SIRT1 was confirmed by Western blot.
  • the activity of the SIRT1 deacetylase was performed by the method of Example 11, Western blot was performed by the method of Example 8.
  • the expression level of SIRT1 was normalized by the relative ratio with ⁇ -actin. Each measurement result is shown in FIG. 9.
  • SIRT1 activity increases.
  • the SIRT1 inhibitor Sirtinol when the SIRT1 inhibitor Sirtinol is treated, the expression of SIRT1 is suppressed, which indicates that the activity of SIRT1 is lower than that of the control group (normal cells without any treatment).
  • * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01 indicates a significant difference between the control and experimental groups, and # P ⁇ 0.05 indicates a significant difference between cells treated with resveratrol only and cells treated with both sirtinol and resveratrol. .
  • the SIRT1 activity of cells treated with PrP (106-126) only in SH-SY5Y cells was lower than normal cells (control).
  • the cells treated with resveratrol alone showed increased SIRT1 activity than normal cells (control)
  • the cells treated with both resveratrol and PrP (106-126) increased SIRT1 activity than normal cells (control).
  • SH-SY5Y cells cultured in Example 1 were treated with or without 1 ⁇ M of resveratrol and treated or untreated with 10 ⁇ M of sirtinol for 12 hours, followed by 200 ⁇ M PrP (106-126). Was exposed for 24 hours. Thereafter, the cells were observed under an optical microscope ( ⁇ 200), and cell viability was measured. Cell viability was measured using the method of Example 3, and the relative cell viability was measured by expressing the survival rate of the experimental cells as a percentage based on the survival rate of the control cells (no cells treated with nothing). The measurement results are shown in FIGS. 11 and 12, respectively.
  • Resveratrol cells can be seen to protect the cells from PrP (106-126) to reduce the number of cells hardly occur.
  • the treatment of resveratrol and sirtinol showed no cell protection effect by resveratrol and necrosis occurred in the cells, which inhibited the activity of resveratrol by sirtinol, thereby preventing the cells from PrP (106-126). It can be interpreted as not protected.
  • DNA fragmentation assay was performed by the method of Example 6. The analysis results are shown in FIG. 14.
  • SH-SY5Y cells cultured in Example 1 were treated with or without 1 ⁇ M of resveratrol and treated or untreated with 10 ⁇ M of sirtinol for 12 hours, followed by 200 ⁇ M PrP (106-126). Was exposed for 24 hours. Thereafter, each of the treated cells was immunostained with SIRT1 antibody, followed by immunofluorescence, and nuclear proteins were separated from the cells to measure SIRT1 deacetylase activity. The immunofluorescence test was performed by the method of Example 7, and SIRT1 deacetylase activity was performed by the method of Example 11. Measurement results are shown in FIGS. 15 and 16, respectively.
  • the cells exposed to PrP 106-126 after treatment with resveratrol showed that SIRT1 antibody staining of normal cells (control group) was performed. However, it was found that SIRT1 antibody staining did not work well in cells treated with PrP (106-126) only and cells treated with sirtinol.
  • the cells exposed to PrP (106-126) after treatment with resveratrol showed a similar activity to that of normal cells, whereas the cells treated only with PrP (106-126) were treated with SIRT1 activity.
  • the cells treated with sirtinol inhibited much of SIRT1 activity compared with normal cells.
  • the mRNA expression of the SIRT1 gene was confirmed to be more than doubled than that of the normal cells (control). MRAN expression was similar to that of normal cells.
  • the cells exposed to PrP (106-126) after treatment with resveratrol showed the highest expression of SIRT1 protein, and the expression of SIRT1 protein in cells treated with sirtinol compared to the cells. It can be seen that the amount is reduced. Therefore, although resveratrol of the present invention increases the SIRT1 activity and expression of neurons, sirtinol is thought to inhibit the activity and expression of SIRT1 by consequently inhibiting the activity of resveratrol.
  • SH-SY5Y cells cultured in Example 1 were treated with or without 1 ⁇ M of resveratrol and treated or untreated with 10 ⁇ M of sirtinol for 12 hours, followed by 200 ⁇ M PrP (106-126). Was exposed for 24 hours. Thereafter, the cells treated as described above were immunostained with acetyl-p53 antibody, and then the expression of acetyl-p53 was observed by performing immunofluorescence (Example 7). In addition, the expression of deacetylated proteins (p53, p65) by SIRT1 was measured using Western blot (Example 8). The expression level of the proteins was normalized by the relative ratio with ⁇ -actin. The measurement results are shown in FIGS. 19 and 20, respectively.
  • Example 8 After treating the SH-SY5Y cells cultured in Example 1 under the same conditions as above, Bcl-xL, p21, phospho-p38 and cleaved caspase-3 of SH-SY5Y cells through Western blot (Example 8). The expression of PrP c protein of SH-SY5Y cells was observed. The expression level of the proteins was normalized by the relative ratio with ⁇ -actin. The measurement results are shown in FIGS. 21 and 22, respectively.
  • the cells exposed to PrP (106-126) after treatment with resveratrol showed increased expression of Bcl-xL, and the expression of p21, phospho-p38 and cleaved caspase-3 was suppressed. Can be seen. It is believed that the treatment of resveratrol increased the expression of proteins that inhibit apoptosis of cells and inhibited the expression of proteins that induce apoptosis of cells. However, in cells treated with PrP (106-126) alone and in cells treated with sirtinol, cytotoxicity was induced, leading to increased expression of proteins that induce apoptosis. As shown in FIG.
  • PrP C expression was increased in cells treated with PrP (106-126), but there was no change in cells exposed to PrP (106-126) after pretreatment with resveratrol. have. Therefore, PrP C may not be involved in the mechanism of action of resveratrol, which inhibits neuronal cell death of PrP (106-126).
  • Example 1 SH-SY5Y cells cultured in Example 1 were infected with the recombinant adenovirus (Ad-LacZ or Ad-SIRT1) prepared in Example 11 for 48 hours, followed by 200 ⁇ M PrP (106-126) for 24 hours. During or without treatment. Then, each cell was observed with an optical microscope ( ⁇ 200). In addition, the cell viability and LDH release characteristics of the cells were measured. Cell viability was measured using the method of Example 3, and the relative cell viability was measured by expressing the survival rate of the treated cells as a percentage based on the survival rate of control cells (no cells treated with nothing). LDH release characteristics were performed by the method of Example 4. Measurement results are shown in FIGS. 23, 24 (A) and (B), respectively.
  • the cells were killed by PrP (106-126), whereas the cells treated with Ad-SIRT1-WT were PrP (106-126). It can be confirmed that the cells are protected from apoptosis.
  • the survival rate of cells treated with PrP (106-126) alone was reduced by 50% or more compared to normal cells (control) without any treatment, but PrP (106) in cells treated with Ad-SIRT1-WT. -126), the cell viability was maintained above 70%.
  • the LDH release of the cells was significantly increased by PrP (106-126) treatment, whereas the LDH release of Ad-SIRT1-WT treated cells was similar to that of normal cells (control).
  • the treated SH-SY5Y cells were treated with recombinant adenovirus and PrP (106-126) in the same manner as described above, and then TUNEL assay was performed as in Example 5. The measurement results are shown in FIG. 25.
  • SH-SY5Y cells treated with PrP (106-126) after infection with Ad-LacZ can be seen that DNA of the cell nuclei is degraded and stained green (TUNEL positive).
  • SH-SY5Y cells treated with PrP (106-126) were found to have almost no green staining and the cells were protected by overexpressed SIRT1. It was also observed in all cells that the nuclei of the cells were stained with propidium iodide (PI).
  • the SH-SY5Y cells cultured in Example 1 were treated with or without 1 ⁇ M resveratrol for 24 hours, or infected for 48 hours with the recombinant adenovirus (Ad-LacZ or Ad-SIRT1) prepared in Example 10.
  • Ad-LacZ or Ad-SIRT1 prepared in Example 10.
  • I was. Since the expression of SIRT1 protein of the treated SH-SY5Y cells was observed, and the nuclear protein was isolated from the SH-SY5Y cells to measure the SIRT1 deacetylase activity. Protein expression was measured using Western blot, and the expression level of the proteins was normalized by the relative ratio with ⁇ -actin. SIRT1 deacetylase activity was performed by the method of Example 11 above. The measurement result is shown in FIG.
  • the expression of SIRT1 protein was overexpressed in the resveratrol treated cells and the Ad-SIRT1-WT treated cells compared to the normal cells (control), and the activity of SIRT1 was more than that of normal cells.
  • * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01 indicates a significant difference between the control and experimental groups, and # P ⁇ 0.05 indicates a significant difference between cells infected with Ad-LacZ and cells infected with Ad-SIRT1. It is present.
  • the resveratrol of the present invention protects neurons from PrP (106-126), and increases the activity of SIRT1, thereby inhibiting apoptosis of cells, thereby preventing prion diseases involving PrP protein (prion protein). It is thought to be effective for treatment.
  • resveratrol can be isolated and extracted, and the resveratrol has an effect of protecting nerve cells.
  • the composition containing the resveratrol of the present invention as an active ingredient can be put into practical use as a drug that can be easily applied to the human body as a composition for preventing and treating prion diseases, and can be developed as a feed additive that can be easily applied to livestock animals.

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Abstract

본 발명은 프리온 질병의 치료 및 예방에 효과를 갖는 레스베라트롤에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 레스베라트롤(resveratrol)을 유효성분으로 함유하는 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 레스베라트롤은 신경세포를 보호하는 효과를 갖으며, 본 발명의 레스베라트롤을 신경세포에 처리하는 경우 신경세포의 서투인1(Sirtuin 1)의 발현 및 활성을 증가시켰으며, 프리온의 세포독성으로부터 신경세포를 보호함으로써 세포의 아팝토시스(apoptosis)를 억제시켰다. 따라서 본 발명의 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 조성물은 프리온 질병 예방 및 치료용 조성물로써 인체로의 적용이 용이한 의약품으로써 실용화할 수 있으며, 축산동물로의 적용이 용이한 사료첨가제로써 개발 가능하다.

Description

프리온 질병의 치료 및 예방에 효과를 갖는 레스베라트롤
본 발명은 프리온 질병의 치료 및 예방에 효과를 갖는 레스베라트롤에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 레스베라트롤(resveratrol)을 유효성분으로 함유하는 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.
프리온(Prion)은 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 기생충과 같은 기존의 병원체와는 전혀 다른 종류의 질병 감염인자로서, 보통의 바이러스보다 훨씬 작고, 유전물질인 핵산 없이 감염성 질환을 일으키는 특징을 가진다. 사람을 포함해 동물에 감염되면 뇌에 스펀지 형태의 공포형성으로 신경세포의 사멸을 일으켜 퇴행성 신경질환을 유발한다.
프리온 질병은 현재까지도 정확한 발생기전이 밝혀져 있지 않으며, 많은 과학자들은 프리온 질환의 발생이 정상적인 프리온 단백질(PrPC)과 연관이 있을 것으로 추정하고 있다. 특정 상황에서 PrPC가 비정상적인 형태를 취하는데, 이를 변형 프리온 단백질(PrPSc)이라고 한다. PrPSc는 PrPC와 달리 서로 응집하는 경향이 있고, 이러한 PrPSc의 응집체가 전염성 해면상 뇌증(Transmissible spongiform encephalopathy; TSE)의 전염성을 일으킨다고 추정하고 있다. PrPC는 3 개의 나선구조(α helix)와 2 개의 병풍구조(β sheet)로 이루어져 있다. PrPC는 현재까지 잘 알려지지 않은 기전을 통해 PrPSc로 전환된다. PrPSc는 PrPC보다 병풍구조가 더 많다. 이러한 전환과정이 실제로 일어난다는 증거는, PrPC가 존재하지 않은 쥐에 PrPSc를 외부에서 주입하더라도 TSE가 발생하지 않는다는 것이다. PrPSc가 PrPC의 전환을 단독으로 촉진한다기보다는, 1 개 이상의 chaperone 단백질이 주요한 역할을 할 것으로 추전된다. PrPC와 달리 PrPSc는 서로 응집하여 비수용성(insoluble)이 되고 단백분해효소 K(proteinase K)에 의해 완전 분해되지 않게 된다. PrPSc는 PrPC와 입체구조가 전혀 다름에도 불구 하고, 생체의 면역시스템은 PrPSc를 외부물질로 인식하지 못하고 있다.
정상적인 프리온 단백질은 세포막에 존재하는 당단백질로써 주로 대부분이 뇌에서 발현되어지며, 생체내 기능에 대해서는 많이 밝혀져 있지는 않으나, 세포성장 및 부분적인 신호전달 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. 모든 TSE 질병에 있어서, 발명 기전은 신경세포의 사멸을 유도함으로써 뇌에 스폰지양 공동과 같은 병변을 일으켜, 뇌의 손상을 야기하는 것으로 알려져 있으나, 현재까지도 이러한 병변들이 PrPSc의 단독 작용에 의한 것인지 정상적인 프리온 단백질도 일부 관여를 하는지는 밝혀지지 않았다.
변형 프리온 단백질(PrPSc)은 다양한 포유류에서 진행성 신경질환을 일으키며, 그 치사율은 100 %에 이른다. 인간의 CJD, 소의 BSE, 양의 Scrapie, 사슴의 CWD, 밍크의 TME 등이 대표적인 프리온 질병으로 알려져 있다. 일반적으로 이 질병은 동종내에서 전파되지만 이종으로 전이되었을 때 더 큰 문제를 야기한다. 가장 대표적인 예로서 소의 BSE로부터 전이되어 발병한 인간의 vCJD를 들을 수 있다.
현재 이러한 프리온 질병에 대한 예방 및 치료제는 실용화되지 않았다. 퀴나크린, 퀴놀린, RNA 앱타머 및 항 PrP 항체 등의 물질들이 항프리온 효과를 보이고 있지만, 세포 및 동물실험단계에 머물러 있고, 만족할만한 성과를 얻지 못하고 있는 실정이다. 따라서 프리온 질병의 예방 및 치료제의 연구 개발은 해결해야할 과제도 많지만, 무한한 개발 가능성을 가지고있다.
한편, 레스베라트롤(resveratrol)은 식물이 곰팡이나 해충 같은 스트레스를 받을 때 생산하는 파이토알렉신(phytoalexin)으로서 폴리페놀의 일종이다. 포도, 땅콩, 오디, 라스베리, 크렌베리 등의 베리류 등을 포함한 많은 식물에서 발견된다. 레스베라트롤은 항암 및 강력한 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 이외에도 항바이러스, 신경보호작용, 항염증작용, 항노화 및 수명연장 효과 등이 있고, 이로 인해 레스베라트롤은 항염, 항암, 항바이러스제재, 당뇨병 및 심장 질병 치료제 등의 여러 가능성이 제시되고 있다.
최근 레스베라트롤이 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease) 또는 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis)의 신경퇴행과정(neurodegeneration)을 억제하는 효과가 있다는 연구 논문이 보고되고 있다. 이러한 효과는 p53과 PGC-1alpha의 아세틸화(acetylation)를 감소시켜 신경세포를 보호하는 것으로 보여진다. 그러나 아직까지 프리온 질병에 대한 레스베라트롤의 적용 및 효과는 연구 보고되지 않은 상황이다.
*이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 레스베라트롤을 추출 및 분리하여 조성물을 제조하고, 상기 조성물을 신경세포에 처리하는 경우, Sirtuin 1(SIRT1)의 발현 및 활성을 증가시키고, 세포독성으로부터 신경세포를 효과적으로 보호할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 신경세포를 효과적으로 보호하는 장점을 갖는 레스베라트롤(resveratrol)을 유효성분으로 함유하는 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 약학적 조성물 및 동물의 사료첨가제 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 레스베라트롤(resveratrol, trans-3,4',5-trihydroxystilbene)을 유효성분으로 함유하는 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 레스베라트롤은 은행나무, 침엽수와 같은 종자식물 등으로부터 추출할 수 있으며, 화학적으로 합성할 수도 있다 [Farina A. Ferranti C. Marra C., An improved synthesis of resveratrol, Nat. Prod. Res. 2006, 20(3): 247-52].
본 발명의 상기 레스베라트롤은 신경세포의 서투인1(Sirtuin 1; SIRT1)의 발현 및 활성을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
신경 세포의 서투인1(Sirtuin 1; SIRT1)은 NAD-의존성 히스톤 탈아세틸화제(histone deacetylase)로써, 단백질의 탈아세틸화(deacetylation)를 통한 유전자 전사를 조절한다. SIRT1의 기질로는 p53, NF-kB, FOXO 3 및 Ku70 단백질 등이 있으며, 이들의 활성을 조절하여 산화적 스트레스에 대한 저항성을 높이고, 세포 노화 및 세포 사멸을 억제한다. 또한 내분비 신호전달 및 포도당 항상성 조절과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.
구체적으로 본 발명에 따른 레스베라트롤은 본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, SIRT1의 발현 및 활성을 정상세포보다 증가시켰으며, 레스베라트롤을 처리한 농도가 증가할수록 활성이 더욱 증가하였다. 또한 활성이 증가된 SIRT1은 단백질의 탈아세틸화를 유도하여 세포의 아팝토시스(apoptosis)를 유발하는 단백질들의 발현을 억제시켰으며, 그로 인해 세포 독성 및 사멸이 억제되었다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 레스베라트롤은 신경세포에 대한 프리온 단백질(prion protein; PrP)의 세포독성을 완화시키는 것을 특징으로 한다.
프리온(prion)은 기존의 병원체(박테리아, 바이러스, 곰팡이, 기생충)와는 전혀 다른 종류의 질병 감염인자로서, 보통의 바이러스보다 훨씬 작고, 유전물질인 핵산 없이 감염성 질환을 일으키는 특징을 갖는다. 사람을 포함해 동물에 감염되면 뇌에 스펀지양 공포형성으로 신경세포의 사멸을 일으켜 프리온 질병을 유발한다. 따라서 상기 프리온 으로부터 신경세포를 보호하여 세포사멸을 억제시킬 시, 프리온 질병을 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
구체적으로 본 발명에 따른 레스베라트롤은 본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 레스베라트롤을 처리함으로써 프리온 단백질에 의해 유도되는 세포독성으로부터 신경세포를 효과적으로 보호하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서투인 1(Sirtuin 1; SIRT1)의 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 서투인 1(Sirtuin 1) 유전자는 재조합 바이러스 벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 재조합 바이러스 벡터는 도 27의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 destination 벡터(pAd/CMV/V5-DEST vector, invitrogen)를 이용하여, Gateway system으로 제조하였다(실시예 10).
본 발명의 상기 프리온 질병은 프리온 단백질로 인한 신경세포의 아팝토시스와 관련된 어떤 신경질환도 포함하나, 바람직하게는 인간의 크로이츠펠트-야코프병(Creutzfeldt-Jakob disease), 쿠루병(Kuru disease), 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병(Gerstmann-Strsyndrome), 치명적 가족성 불면증(fatal familial insomnia) 또는 소의 BSE(bovine spongiform encephalopathy) 또는 양의 스크래피(scrapie) 또는 사슴의 CWD(chronic wasting disease) 또는 밍크의 TME(transmissible mink encephalopathy)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물이 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서의 본 발명의 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인살 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 주사제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 이들은 비경구 투여(예컨대, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 건강상태, 질병 증상의 정도, 음식, 투여시간, 투여방법 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 당 0.01 ~ 100 mg이 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 레스베라트롤(resveratrol)을 유효성분으로 함유하는 프리온 질병 예방용 사료첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명의 레스베라트롤은 상기에 기재된 것과 같이, 프리온 단백질로부터 신경세포를 효과적으로 보호하므로, 상기 레스베라트롤을 함유하는 사료첨가제 조성물을 동물의 사료로 적용할 경우, 동물에서 발생할 수 있는 프리온 질병을 치료 및 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
본 발명은 레스베라트롤을 추출 및 분리하여 조성물을 제조하고, 상기 조성물을 신경세포에 처리하는 경우, Sirtuin 1(SIRT1)의 발현 및 활성을 증가시키고, 세포독성으로부터 신경세포를 효과적으로 보호할 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 이용한 약학적 조성물 및 동물의 사료 첨가제 조성물에 사용된다.
도 1는 PrP(106-126)을 처리한 SH-SY5Y 세포를 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타내며, 도 2는 PrP(106-126)을 처리한 SH-SY5Y 세포의 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸다. 도 3는 PrP(106-126)을 처리한 SK-N-SH 및 HT-22 세포를 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타내며, 도 4는 PrP(106-126)을 처리한 SK-N-SH 및 HT-22 세포의 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 PrP(106-126) 또는 레스베라트롤을 처리한 SH-SY5Y 세포를 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타내며, 도 6는 PrP(106-126) 또는 레스베라트롤을 처리한 SH-SY5Y 세포의 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸다. 도 7는 PrP(106-126) 또는 레스베라트롤을 처리한 SH-SY5Y 세포의 면역형광검사 결과를 나타내며, 도 8는 PrP(106-126) 또는 레스베라트롤을 처리한 SH-SY5Y 세포의 LDH 방출 특성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 레스베라트롤 또는 Sirtinol을 처리한 SH-SY5Y 세포의 SIRT1 deacetylase 활성을 측정한 결과 및 SIRT1 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다. 도 10는 PrP(106-126) 또는 레스베라트롤을 처리한 SH-SY5Y 세포의 SIRT1 deacetylase 활성을 측정한 결과 및 SIRT1 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 11는 레스베라트롤, Sirtinol 또는 PrP(106-126)을 처리한 SH-SY5Y 세포를 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이며, 도 12는 상기와 같이 처리된 SH-SY5Y 세포의 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸다. 도 13는 레스베라트롤, Sirtinol 또는 PrP(106-126)을 처리한 SH-SY5Y 세포의 면역형광검사 결과를 나타내며, 도 14는 상기와 같이 처리된 SH-SY5Y 세포의 DNA fragmentation 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 레스베라트롤, Sirtinol 또는 PrP(106-126)을 처리한 SH-SY5Y 세포의 SIRT1의 면역형광검사 결과를 나타낸 것이며, 도 16는 상기와 같이 처리된 SH-SY5Y 세포의 SIRT1 deacetylase 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 17는 상기와 같이 처리된 SH-SY5Y 세포의 SIRT1 유전자의 mRNA 발현 측정 결과를 나타낸 것이며, 도 18는 상기와 같이 처리된 SH-SY5Y 세포의 SIRT1 단백질 발현의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 레스베라트롤, Sirtinol 또는 PrP(106-126)이 처리된 SH-SY5Y 세포의 acetyl-p53의 발현 정도를 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이며, 도 20는 상기와 같이 처리된 SH-SY5Y 세포의 p53, p65 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다. 도 21는 상기와 같이 처리된 SH-SY5Y 세포의 아팝토시스(apoptosis)와 관련된 단백질들의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이며, 도 22는 상기와 같이 처리된 SH-SY5Y 세포의 PrPc 단백질의 발현을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 23는 재조합 아데노바이러스 또는 PrP(106-126)이 처리된 SH-SY5Y 세포를 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이며, 도 24는 상기와 같이 처리된 SH-SY5Y 세포의 세포 생존율 및 LDH 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 25는 재조합 아데노바이러스 또는 PrP(106-126)이 처리된 SH-SY5Y 세포의 TUNEL assay 결과를 나타낸 것이며, 도 26는 레스베라트롤 또는 재조합 아데노바이러스가 처리된 SH-SY5Y 세포의 SIRT1 단백질의 웨스턴 블롯 결과 및 SIRT1 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 27는 SIRT1을 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 맵을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 세포 배양
본 발명에 사용된 인간 신경아세포종(neuroblastoma) 세포주(SH-SY5Y 및 SK-N-SH) 및 마우스 신경아세포종 세포주(HT-22)는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)로부터 얻었다. 상기 세포주들을 10 % FBS(fetal bovine serum) 및 0.1 mg/ml 겐타마이신(gentamycin)이 첨가된 MEM(minimum essential medium)(Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO2 조건의 습식 인큐베이터(humidified incubator)에서 배양시켰다.
실시예 2. 프리온 단백질 펩타이드(PrP(106-126))의 합성
본 발명에 사용된 PrP(106-126)(아미노산 서열(서열번호 1): Lys-Thr-Asn-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly) 및 재배열된(scrambled) PrP(106-126)(아미노산 서열(서열번호 2): Asn-Gly-Ala-Lys-Ala-Leu-Met-Gly-Gly-His-Gly-Ala-Thr-Lys-Val-Met-Val-Gly-Ala-Ala-Ala)은 펩트론(Peptron, Seoul, Korea)으로부터 합성된 것을 이용하였다.
상기 PrP(106-126)은 정상 프리온 단백질에 존재하는 106 ~ 126 아미노산 서열을 가진 펩타이드로써, 상기 서열을 갖는 PrP 단백질은 변형 프리온의 특성을 가지고 있어 PrPSc(변형 프리온 단백질)의 병인(pathogenesis)을 연구하기 위해 많이 사용되고 있다. 또한 PrP(106-126)은 신경세포에서 근모 축적(fibril accumulation)을 일으키고 직접적인 신경세포 사멸을 유도한다는 연구결과가 보고되고 있다 [Marella M. and Chabry J. Neurons and astrocytes respond to prion infection by inducing microglia recruitment. J. Neurosci. 2004. 24, 620627].
상기 합성된 펩타이드들을 12.5 mM 농도로 무균(sterile) DMSO에 녹인 후, -80 ℃에 보관하였으며, 이후 실험에 사용하였다.
실시예 3. 세포 생존율(cell viability) 측정
세포 생존율(cell viability)을 측정하기 위해, crystal violet staining 방법을 이용하였다 [Chaudhari et al. 2009]. 먼저 세포를 염색 용액(0.5 % crystal violet in 30 % ethanol and 3 % formaldehyde)으로 상온에서 10 분 동안 염색시킨 후, 증류수로 4 차례 세척하였다. 이후, 염색된 세포를 1 % SDS(sodium dodecyl sulfate) 용액으로 용해시키고, 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(%)은 대조군인 dye intensity와 비교하여 계산하였다.
실시예 4. LDH(lactate dehydrogenase) assay
LDH(lactate dehydrogenase) release assay는 세포 괴사율을 측정할 수 있는 colorimetric 방법으로, 세포배양시 괴사된 세포는 LDH를 배지로 방출하는데 이때 방출된 LDH에 colorless tetrazolium salt를 넣으면 환원된 형태의 colored formazan을 형성한다.
본 발명에서 세포독성은 LDH Cytotoxicity Detection Kit(Takara Bio Inc., Tokyo, Japan)를 제조사의 프로토콜에 따라 이용하여 상층액에 존재하는 LDH를 분석함으로써 평가하였다. 490 nm에서 흡광도를 측정하여 LDH 활성을 측정하였다.
실시예 5. TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick and labeling) assay
TUNEL assay는 세포의 조직 내에서의 apoptotic cell을 검출하고 정량화해서 현미경으로 볼 수 있도록 하는 방법으로서, 세포 조직의 구조를 유지하면서 개개의 세포에서 일어나는 아팝토시스(apoptosis)를 관찰할 수 있다. TUNEL 염색의 원리는 apoptotic cell이 생화학적으로 세포 핵 안의 DNA가 분해되는 과정을 거친다는 점을 착안한 것으로, 이때 노출되는 3'-OH 기에 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase) 효소를 이용하여 DIG(digoxigenin)이 라벨링된 UTP(uridine triphsophate)를 DNA 조각에 붙인 후 anti-digoxigenin-phosphatase를 붙여 DAB를 이용하여 발색시킨다.
본 발명의 TUNEL 분석은 in situ ApoBrdU DNA fragmentation assay kit(BioVision, Mountain View, CA, USA)를 제조사의 프로토콜에 따라 이용하여 세포질의 아팝토시스(apoptosis) 정도를 측정함으로써 분석하였다.
실시예 6. DNA fragmentation assay
아팝토시스(apoptosis)의 특징 중 하나인 DNA의 단편화를 관찰하기 위해, DNA fragmentation assay를 수행하였다.
먼저, 세포 펠렛(pellets)을 10 %(v/v) NP-40, 20 mM EDTA 및 0.5 % SDS(sodium dodecyl sulfate)가 함유된 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)의 0.5 ml에 분산시킨 후, 65 ℃에서 4 시간 동안 500 μg/ml의 단백분해효소 K(proteinase K)로 침지시켰다. 이후, 페놀/클로로포름(phenol/chloroform)(1:1, v/v)으로 DNA를 순차적으로 추출시키고, -20 ℃에서 12 시간 동안 에탄올로 침전시켰다. 정제된 DNA를 1.5 % 아가로스 겔(agarose gel)로 전기영동 시킨 후, EtBr(ethidium bromide) 염색 및 적외선 투시(ultraviolet transillumination)로 형상화하였다.
실시예 7. 면역형광검사(immunofluorescence)
세포를 24-웰 플레이트(24-well plate) 안에서 glass coverslip위에 배양시켰다. 배양된 세포들을 PBS(phosphate buffer saline)로 세척한 후, cold acetone으로 90 초 동안 고정시켰다. 다시 세포를 PBS로 세척한 후, 5 % FBS(fetal bovine serum)가 포함된 TBS(Tris buffer saline)에 트윈(tween)을 첨가한 TBST로 세포를 블록(block)시켰다. 이후, anti-SIRT1(2 μg/ml) 및 anti-acetyl p53(2 μg/ml) 단일클론항체(monoclonal antibodies)로 상온(20 ℃)에서 48 시간 동안 반응시켰다. 이후, 부착되지 않은 항체를 PBS로 세척하여 제거하고, 세포를 Alexa Fluor 546(for anti-SIRT1 and anti-acetyl p53)이 라벨링된 anti-rabbit IgG 항체(4 μg/ml)로 상온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 세포를 DakoCytomation fluorescent medium으로 고정시킨 후, 형광 현미경(fluorescence microscopy)을 통해 확인하였다.
실시예 8. 웨스턴 블롯(Western blots)
세포를 용해버퍼(25 mM HEPES; pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT 및 protease inhibitor mixture)로 용해시켰다. 이후, 단백질을 10 ~ 15 % SDS gel에 전기영동으로 분획한 후, 이뮤노블롯팅(immunoblotting)을 수행하였다 [Seo, J. S., Seol, J. W., Moon, M. H., Jeong, J. K., Lee, Y. J. and Park, S. Y. Hypoxia protects neuronal cells from human prion protein fragment-induced apoptosis. J. Neurochem. 112, 715-722]. 단백질 용해물의 Equal amounts를 10 ~ 15 % SDS-polyacrylamide gel위에 분획시킨 후, 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 전기영동으로 전이시켰다. Immunoreactivity는 HRP(horseradish peroxidase)-결합된 이차 항체(secondary antibodies) 및 ECL reagents의 연속적인 반응을 통해 검사하였다.
이뮤노블롯팅(immunoblotting)에 사용된 항체는 SIRT1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), p53 (Santa Cruz Biotechnology), acetyl p53 (Epitomics Inc., Burlingame, CA, USA), p65 (Santa Cruz Biotechnology), acetyl p65 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), Bcl-xL (Santa Cruz Biotechnology), p21 (Santa Cruz Biotechnology), phospho-p38 (Cell Signaling Technology), cleaved caspase-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), PrPC(Sigma, St. Louis, MO, USA) 및 β-actin (Santa Cruz Biotechnology)을 사용하였다.
실시예 9. qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)
세포로부터 총 RNA의 분리는 Easy-spin™ total RNA extraction kit(iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 추출하였다. 이후, cDNA의 합성은 TaKaRa Prime Script™ 1st strand cDNA synthesis kit(Takara Bio Inc., Tokyo, Japan)의 프로토콜에 따라 수행하였다. Quantitative PCR을 수행하기 위해, 총 20 μl 반응액에 SYBR green과 1μl의 유전자 프라이머를 첨가하였다. 상기 사용된 프라이머는 하기에 나타내었다.
[표 1. 프라이머]
iTaq SYBR green supermix(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)의 모든 반응은 CFX96 real-time PCR detection system(Bio-Rad Laboratories)에서 수행되었다.
실시예 10. 재조합 아데노바이러스(recombinant adenoviruses)의 제조
SIRT1을 발현하는 재조합 아데노바이러스(Ad-SIRT1)는 전북대학교 박병현 교수님(Chonbuk National University, Jeonju, Jeonbuk, Korea)(Lee et al., Overexpression of SIRT1 protects pancreatic beta-cells against cytokine toxicity by suppressing the nuclear factor-kappaB signaling pathway. Diabetes. 2009. 58, 344-351)으로부터 제공받았으며, lacZ-bearing 아데노바이러스(Ad-lacZ)는 대조군으로써 사용하였다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 destination 벡터(pAd/CMV/V5-DEST vector, invitrogen)를 이용하여, Gateway system으로 제조하였다. 먼저, 마우스 SIRT1 cDNA를 PENTR 2B(Invitrogen)의 KpnⅠ과 XholⅠ 사이트에 클로닝시킨 후, SIRT1 cDNA insert를 pAd/CMV/V5-DEST 벡터(Invitrogen)에 LR Clonase(Invitrogen)를 이용하여 전이시켰다. 이후 PacⅠ(Promega, Madison, WI)을 처리하여 플라스미드를 선형화시켜 도 27의 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하였다. 도 27에서 ITR(inverted terminal repeat)은 반전말단반복부로써 아데노바이러스의 융합(integration)을 위한 것이며, PCMV는 PCMV 프로모터, T7은 T7 프로모터이다. 그리고 V5는 항원결정기(V5 epitope)이고, TK pA는 mRNA의 효율적인 전사종료(transcription termination) 및 폴리아데닐화(polyadenylation)를 위한 TK(thymidine kinase) polyadenylation 서열이며, wt Ad5(△E3)는 human adenovirus type 5 sequence이다.
상기 제조된 재조합 아데노바이러스 벡터를 lipofectamine 2000을 이용하여 HEK(human embryonic kidney) 세포주(HEK-293)에 형질감염시켰다. 상기 HEK-293 세포를 RPMI 1640(10 % FBS 포함)에 1 ~ 2 주 동안 배양시켰다. 배양기간 동안 2 day 마다 배지를 교체해주었다. 이후, 상기 재조합 아데노바이러스는 HEK(human embryonic kidney) 세포주(HEK-293)에 증폭시킨 후, Vivapure AdenoPACK kit(Sartorius AG, Goettingen, Germany)를 제조사의 프로토콜에 따라 이용하여 정제하였다.
실시예 11. SIRT1 Deacetylase Activity assay
세포질 SIRT1의 deacetylase 활성을 측정하기 위해, 핵 단백질들을 Nuclear/Cytosol Fractionation kit(BioVision, Mountain View, CA, USA)를 이용하여 SH-SY5Y 세포로부터 분리하였으며, SIRT1의 deacetylase 활성은 SIRT1 fluorometric assay kit(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA)의 프로토콜에 따라 정량하였다. 이후, 형광 강도(fluorescence intensities)를 형광 측정기(microplate fluorometer)(excitation wavelength = 360 nm, emission wavelength = 450 nm)로 측정하였다. 이때 SIRT1 deacetylase 활성의 형광 강도는 세포 시료에서 측정된 단백질 수준으로 표준화하였다.
실시예 12. 통계학적 평가
수행한 실험의 모든 데이터는 means±SD(standard deviations)로 나타내었으며, Student's t-test 및 SAS statistical package의 ANOVA Duncan test를 이용하여 비교하였다. 이후 결과들을 *P < 0.05 또는 **P < 0.01의 값과 # P < 0.05, ## P < 0.01의 값에 대해 유의하다고 고려하였다.
실험예 1. PrP(prion protein) 처리에 따른 세포 사멸 및 세포 생존율 변화
상기 실시예 1에서 배양한 SH-SY5Y 세포에 상기 실시예 2에서 합성한 PrP(106-126) 또는 재배열된(scrambled) PrP(106-126)를 농도별(0, 100, 200, 400 μM, 이때 24 시간 동안 배양) 또는 시간별(0, 12, 24, 36 시간, 이때 200 μM의 PrP(106-126) 처리)로 처리한 후 배양하였다. 상기 각 조건에 따라 PrP(106-126)가 처리된 SH-SY5Y 세포를 광학현미경(×200)으로 관찰하였으며, 세포 생존율(cell viability)을 측정하였다. 세포 생존율은 상기 실시예 3의 방법을 이용하여 측정하였으며, 대조군 세포(아무것도 처리하지 않은 정상세포)의 생존율을 기준으로 PrP(106-126)를 처리한 세포의 생존율을 백분율로 나타내어 상대적 세포 생존율을 측정하였다. 각 결과는 도 1와 도 2에 나타내었다.
도 1에 보이는 바와 같이, 처리된 PrP(106-126)의 농도가 증가할수록 SH-SY5Y 세포수가 감소됨을 확인할 수 있다. 이는 PrP(106-126)가 신경세포의 세포독성을 일으켜 나타나는 것으로 사료된다. 도 2에 나타낸 것과 같이, PrP(106-126) 또는 재배열된(scrambled) PrP(106-126)를 조건별로 처리한 후 세포 생존율을 측정한 결과, PrP(106-126)을 처리한 농도가 증가할수록, 처리 시간이 증가할수록 세로 증식률이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다. 반면, 재배열된 PrP(106-126)를 처리한 경우, 처리 농도 및 처리 시간에 따라 세포 생존율에 큰 변화가 없었다. 따라서 PrP(106-126)은 신경세포의 세포 사멸을 유도하는 것을 알 수 있으며, 처리 농도 및 처리 시간이 증가할수록 세포 독성이 악화됨을 알 수 있다. *P < 0.05, **P < 0.01는 대조군과 실험군 사이의 유의한 차이가 있음을 나타내며, # P < 0.05, ## P < 0.01는 PrP(106-126) 및 scrambled PrP를 처리한 세포 사이의 유의한 차이를 나타낸다.
또한 상기 실시예 1에서 배양한 SK-N-SH 및 HT-22 세포에 상기 실시예 2에서 합성한 PrP(106-126)을 농도별(0, 100, 200, 400 μM)로 처리하여 24 시간 동안 배양시켰다. 상기 각 조건에 따라 PrP(106-126)가 처리된 SK-N-SH 및 HT-22 세포를 광학 현미경(×200)으로 관찰하였으며, 세포 생존율을 측정하였다. 세포 생존율 측정은 상기에 나타낸 것과 같다. 각 결과는 도 3와 도 4에 나타내었다.
도 3에 보이는 바와 같이, 처리된 PrP(106-126)의 농도가 증가할수록 SK-N-SH 및 HT-22 세포의 수가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 또한 도 4에 나타낸 것과 같이, PrP(106-126)을 처리한 농도가 높을수록 세로 증식률이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다. 따라서 PrP(106-126)은 인간의 신경세포뿐만 아니라 마우스의 신경세포의 세포 사멸을 유도하는 것을 알 수 있으며, 처리 농도가 증가할수록 세포 독성이 악화됨을 확인할 수 있다.
실험예 2. 레스베라트롤(resveratrol) 처리에 따른 신경세포의 보호 효과
상기 실시예 1에서 배양한 SH-SY5Y 세포에 레스베라트롤(resveratrol)( Sigma, St. Louis, MO, USA)을 농도별(0, 0.5, 1, 2 μM, 이때 12 시간 동안 배양) 또는 처리시간별(0, 6, 12, 24 시간, 이때 1 μM의 레스베라트롤 처리)로 처리한 후, 200 μM PrP(106-126)에 24 시간 동안 노출시켰다. 상기 각 조건에 따라 PrP(106-126)가 처리된 SH-SY5Y 세포를 광학 현미경(×200)으로 관찰하였으며, 세포 생존율을 측정하였다. 세포 생존율은 상기 실시예 3의 방법을 이용하여 측정하였으며, 대조군 세포(아무것도 처리하지 않은 세포)의 생존율을 기준으로 레스베라트롤을 처리한 세포의 생존율을 백분율로 나타내어 상대적 세포 생존율을 측정하였다. 각 결과는 도 5와 도 6에 나타내었다.
도 5에 보이는 바와 같이, 레스베라트롤(resveratrol)을 처리하지 않고 PrP(106-126)만 처리한 SH-SY5Y 세포에서는 세포수가 많이 감소한 반면, 레스베라트롤을 처리한 SH-SY5Y 세포에서는 처리시간이 증가할수록 세포가 PrP(106-126)로부터 보호됨을 확인할 수 있다. 또한 도 6에 나타낸 것과 같이, 레스베라트롤의 처리시간 및 처리농도가 증가할수록 세포 생존율이 약 80 % 로 유지됨을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 레스베라트롤이 PrP(106-126)로부터 신경세포를 보호하는 것으로 사료된다. *P < 0.05, **P < 0.01는 대조군과 실험군 사이의 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
또한 레스베라트롤을 처리 또는 무처리한 SH-SY5Y 세포를 200 μM PrP(106-126)에 24 시간 동안 노출시킨 후, 상기 실시예 5와 같이 TUNEL assay를 수행하였다. 측정 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 보이는 바와 같이, 레스베라트롤(resveratrol)을 처리하지 않고 PrP(106-126)만 처리한 SH-SY5Y 세포는 세포핵의 DNA가 분해되어 녹색으로 염색(TUNEL positive)된 것을 볼 수 있다. 그러나 레스베라트롤을 처리하고 PrP(106-126)를 노출시킨 세포의 경우, 녹색 염색이 거의 발견되지 않으며 레스베라트롤에 의해 세포가 보호됨을 확인할 수 있다. 또한 모든 세포들에서 세포의 핵이 PI(propium iodide)로 염색되었음이 관찰되었다.
이후, 상기 도 7에서 관찰한 각 세포들의 세포 배양액 내의 LDH 방출 활성을 측정하였다. 상기 LDH 방출 특성은 실시예 4의 방법으로 수행하였다. 측정 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 것과 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 PrP(106-126)만을 처리한 세포의 LDH 방출이 유의적으로 증가하는 반면, 레스베라트롤을 처리한 세포의 경우 LDH 방출이 감소한 것으로 보아 레스베라트롤이 PrP(106-126)로부터 세포를 보호하는 것을 알 수 있다. *P < 0.05는 대조군과 실험군 사이의 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
실험예 3. 레스베라트롤 처리에 따른 SIRT1의 활성
상기 실시예 1에서 배양한 SH-SY5Y 세포에 SIRT1 억제제인 Sirtinol을 처리(10 μM) 또는 무처리하고, 레스베라트롤(resveratrol)을 24 시간 동안 농도별(0, 0.5, 1, 2 μM)로 처리한 후, 상기 각 세포에서 추출한 세포질의 SIRT1 deacetylase의 활성을 측정하였으며, 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 SIRT1의 발현을 확인하였다. 상기 SIRT1 deacetylase의 활성은 실시예 11의 방법으로 수행하였으며, 웨스턴 블롯은 실시예 8의 방법으로 수행하였다. SIRT1의 발현 정도는 β-actin과의 상대적 비율로 표준화 하였다. 상기 각각의 측정 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 것과 같이, SH-SY5Y 세포에 레스베라트롤(resveratrol)을 처리한 농도가 증가할수록 SIRT1 활성이 증가함을 확인할 수 있다. 그러나 SIRT1 억제제인 Sirtinol을 처리하는 경우, SIRT1의 발현이 억제되어 SIRT1의 활성이 대조군(아무것도 처리하지 않은 정상세포)보다도 감소함을 확인할 수 있다. *P < 0.05, **P < 0.01는 대조군과 실험군 사이의 유의한 차이가 있음을 나타내며, # P < 0.05는 레스베라트롤만을 처리한 세포와 sirtinol 및 레스베라트롤을 모두 처리한 세포 사이의 유의한 차이를 나타낸다.
또한 상기 실시예 1에서 배양한 SH-SY5Y 세포에 1 μM의 레스베라트롤(resveratrol)을 12 시간 동안 처리 또는 무처리하고, 200 μM PrP(106-126)을 24 시간 동안 처리 또는 무처리한 후, 상기 각 세포에서 추출한 세포질의 SIRT1 deacetylase의 활성을 측정하였으며, 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 SIRT1의 발현을 확인하였다. 상기 각각의 측정 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 것과 같이, SH-SY5Y 세포에 PrP(106-126)만을 처리한 세포의 SIRT1 활성이 정상세포(대조군)보다 감소하였다. 그러나 레스베라트롤만을 처리한 세포는 SIRT1 활성이 정상세포(대조군)보다 증가하였으며, 레스베라트롤 및 PrP(106-126)을 모두 처리한 세포에서도 SIRT1의 활성이 정상세포(대조군)보다 증가함을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 본 발명의 레스베라트롤에 의해 SIRT1의 발현이 촉진됨을 나타내며, 레스베라트롤이 PrP(106-126)로부터 세포를 보호함을 알 수 있다.
실험예 4. SIRT1 억제제의 처리에 따른 레스베라트롤(resveratrol)의 신경세 포 보호 효과 억제
상기 실시예 1에서 배양한 SH-SY5Y 세포에 1 μM의 레스베라트롤(resveratrol)을 처리 또는 무처리 및 10 μM의 sirtinol을 처리 또는 무처리하여 12 시간 동안 배양한 후, 200 μM PrP(106-126)에 24 시간 동안 노출시켰다. 이후, 상기 각 세포들을 광학 현미경(×200)으로 관찰하였으며, 세포 생존율을 측정하였다. 세포 생존율은 상기 실시예 3의 방법을 이용하여 측정하였으며, 대조군 세포(아무것도 처리하지 않은 정상세포)의 생존율을 기준으로 실험군 세포들의 생존율을 백분율로 나타내어 상대적 세포 생존율을 측정하였다. 측정 결과는 각각 도 11와 도 12에 나타내었다.
도 11 및 도 12에 나타낸 것과 같이, PrP(106-126)만을 처리한 세포와 PrP(106-126) 및 sirtinol을 처리한 세포의 경우 대조군에 비해 세포수가 많이 감소하였음을 확인할 수 있으며, 레스베라트롤(resveratrol)을 처리한 세포의 경우 PrP(106-126)로부터 세포를 보호하여 세포수의 감소가 거의 일어나지 않음을 볼 수 있다. 그러나 레스베라트롤(resveratrol) 및 sirtinol을 처리하는 경우 레스베라트롤에 의한 세포 보호효과가 나타나지 않고 세포에 괴사가 일어난 것을 관찰할 수 있는데, 이는 sirtinol에 의해 레스베라트롤의 활성이 억제되어 PrP(106-126)로부터 세포를 보호하지 못한 것으로 해석할 수 있다.
또한 상기의 조건과 동일하게 처리한 SH-SY5Y 세포를 상기 실시예 5와 같이 TUNEL assay를 수행하였다. 측정 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 보이는 바와 같이, PrP(106-126)만을 처리한 세포와 sirtinol을 처리한 세포에서는 세포핵의 DNA가 분해되어 녹색으로 염색(TUNEL positive)된 것을 볼 수 있다. 그러나 레스베라트롤 전처리 후 PrP(106-126)를 노출시킨 세포의 경우, 레스베라트롤에 의해 세포가 보호되어 녹색 염색이 발견되지 않았다. 또한 모든 세포들에서 세포의 핵이 PI(propium iodide)로 염색되었음이 관찰되었다.
이후, 상기 도 13에서 관찰한 세포들로부터 DNA를 분리하여 DNA fragmentation을 분석하였다. Apoptotic cell의 특징으로 DAN 단편화가 관찰되므로, 상기 분석을 통해 세포의 아팝토시스(apoptosis) 정도를 관찰할 수 있다. DNA fragmentation assay는 상기 실시예 6의 방법으로 수행하였다. 분석 결과는 도 14에 나타내었다.
도 14에 보이는 바와 같이, 전기영동 결과, PrP(106-126)만을 처리한 세포와 sirtinol을 처리한 세포에서 DNA 단편이 많이 생성되었음을 관찰할 수 있다. 반면, 레스베라트롤을 처리한 후 PrP(106-126)에 노출시킨 세포에서는 DNA 단편이 정상세포(대조군)와 유사한 정도로 생성되었다. 이러한 결과는 PrP(106-126)이 세포 독성을 유도하여 세포가 괴사에 이르도록 하며, sirtinol은 레스베라트롤의 활성을 억제시켜 세포보호 효과를 차단시키는 결과에 의한 것이다. 이때 사용된 마커(marker)는 100 bp DNA 래더(ladder)이다.
실험예 5. SIRT1 억제제의 처리에 따른 SIRT1 활성 및 발현 억제
상기 실시예 1에서 배양한 SH-SY5Y 세포에 1 μM의 레스베라트롤(resveratrol)을 처리 또는 무처리 및 10 μM의 sirtinol을 처리 또는 무처리하여 12 시간 동안 배양한 후, 200 μM PrP(106-126)에 24 시간 동안 노출시켰다. 이후, 상기 처리된 각 세포들을 SIRT1 항체로 면역염색(immunostain) 한 후, 면역형광검사를 수행하였으며, 또한 상기 세포들로부터 핵 단백질들을 분리하여 SIRT1 deacetylase 활성을 측정하였다. 상기 면역형광검사는 실시예 7의 방법으로 수행하였으며, SIRT1 deacetylase 활성은 실시예 11의 방법으로 수행하였다. 측정 결과는 각각 도 15와 도 16에 나타내었다.
도 15에 보이는 바와 같이, 레스베라트롤을 처리한 후 PrP(106-126)에 노출시킨 세포의 경우 정상세포(대조군) 정도의 SIRT1 항체 염색이 이루어 졌음을 확인할 수 있다. 그러나 PrP(106-126)만을 처리한 세포와 sirtinol을 처리한 세포에서는 SIRT1 항체 염색이 잘 이루어지지 않았음을 알 수 있다. 또한 도 16에 나타낸 것과 같이, SIRT1 활성이 레스베라트롤을 처리한 후 PrP(106-126)에 노출시킨 세포의 경우 정상세포와 유사한 정도의 활성을 나타내는 반면, PrP(106-126)만을 처리한 세포와 sirtinol을 처리한 세포는 SIRT1의 활성이 정상세포와 비교해서 많이 억제되었다. 이러한 결과는 본 발명의 레스베라트롤에 의해 SIRT1의 활성이 증가됨을 나타내며, 레스베라트롤이 PrP(106-126)로부터 세포를 보호하여 SIRT1의 발현이 억제되지 않았음을 의미한다. 그러나 sirtinol의 처리는 레스베라트롤의 활성을 억제시켜 레스베라트롤에 의해 증가된 SIRT1의 활성을 억제시킨다. *P < 0.05는 대조군과 실험군 사이의 유의한 차이가 있음을 나타내며, # P < 0.05는 레스베라트롤을 처리한 세포와 sirtinol 및 레스베라트롤을 모두 전처리한 세포 사이의 유의한 차이를 나타낸다.
또한 상기의 조건과 동일하게 처리된 SH-SY5Y 세포에서 SIRT1 유전자의 mRNA 및 SIRT1 단백질의 발현을 측정하였다. 상기 유전자의 mRNA 발현 수준은 qRT-PCR(실시예 9)을 이용하여 측정하였으며, mRNA 발현양은 β-actin과의 상대적 비율로 표준화 하였다. 단백질 발현 수준은 웨스턴 블롯(실시예 8)을 이용하여 확인하였다. 상기 유전자 및 단백질 발현 결과는 각각 도 17와 도 18에 나타내었다.
도 17에 나타낸 것과 같이, 레스베라트롤을 처리한 후 PrP(106-126)에 노출시킨 세포의 경우 SIRT1 유전자의 mRNA 발현이 정상세포(대조군)보다 2배 이상 증가되었음을 확인할 수 있으며, 그 이외의 세포들은 정상세포와 유사한 수준의 mRAN 발현을 나타내었다. 또한 도 18에 나타낸 것과 같이, 레스베라트롤을 처리한 후 PrP(106-126)에 노출시킨 세포의 경우 SIRT1 단백질이 가장 많이 발현됨을 확인할 수 있으며, sirtinol을 처리한 세포에서는 상기 세포에 비해 SIRT1 단백질의 발현양이 감소함을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명의 레스베라트롤은 신경세포의 SIRT1 활성 및 발현을 증가시키지만, sirtinol은 이러한 레스베라트롤의 활성을 억제시켜 결과적으로 SIRT1의 활성 및 발현을 억제시키는 것으로 사료된다.
실험예 6. SIRT1의 p53 단백질의 탈아세틸화에 의한 관련 단백질들의 발현 억제 및 활성
상기 실시예 1에서 배양한 SH-SY5Y 세포에 1 μM의 레스베라트롤(resveratrol)을 처리 또는 무처리 및 10 μM의 sirtinol을 처리 또는 무처리하여 12 시간 동안 배양한 후, 200 μM PrP(106-126)에 24 시간 동안 노출시켰다. 이후, 상기와 같이 처리된 각 세포들을 acetyl-p53 항체로 면역염색 한 후, 세포의 acetyl-p53의 발현을 면역형광검사(실시예 7)를 수행하여 관찰하였다. 또한 SIRT1에 의해 탈아세틸화(deacetylation)된 단백질들(p53, p65)의 발현을 웨스턴 블롯(실시예 8)을 이용하여 측정하였다. 단백질들의 발현 정도는 β-actin과의 상대적 비율로 표준화 하였다. 측정 결과는 각각 도 19와 도 20에 나타내었다.
도 19에 보이는 바와 같이, 레스베라트롤을 처리한 후 PrP(106-126)에 노출시킨 세포의 경우 acetyl-p53의 발현이 억제되었음을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 레스베라트롤에 의해 활성이 증가된 SIRT1에 의해 acetyl-p53이 탈아세틸화 되어 나타난 것으로 사료된다. 그러나 sirtinol을 처리한 세포의 경우 sirtinol에의해 레스베라트롤의 활성이 억제되어 결과적으로, SIRT1의 활성 및 발현 억제로 SIRT1에 의한 탈아세틸화가 잘 일어나지 않은 결과를 보여준다. 또한 도 20에 나타낸 것과 같이, 레스베라트롤을 처리한 후 PrP(106-126)에 노출시킨 세포의 경우 acetyl-p53 및 acetyl-p65의 발현이 다른 조건의 세포들에 비해 억제되었음을 확인할 수 있으며, 탈아세틸화된 p53 및 p65의 발현이 증가되었음을 알 수 있다.
또한 상기 실시예 1에서 배양한 SH-SY5Y 세포에 상기와 동일한 조건으로 처리한 후, 웨스턴 블롯(실시예 8)을 통해 SH-SY5Y 세포의 Bcl-xL, p21, phospho-p38 및 cleaved caspase-3의 발현을 관찰하였으며, 또한 상기 조건의 처리에 따른 SH-SY5Y 세포의 PrPc 단백질의 발현을 관찰하였다. 단백질들의 발현 정도는 β-actin과의 상대적 비율로 표준화하였다. 측정 결과는 각각 도 21와 도 22에 나타내었다.
도 21에 보이는 바와 같이, 레스베라트롤을 처리한 후 PrP(106-126)에 노출시킨 세포의 경우 Bcl-xL의 발현이 증가됨을 볼 수 있으며, p21, phospho-p38 및 cleaved caspase-3의 발현이 억제됨을 볼 수 있다. 이는 레스베라트롤의 처리가 세포의 아팝토시스(apoptosis)를 억제하는 단백질의 발현을 증가시키고, 세포의 아팝토시스를 유도하는 단백질들의 발현을 억제시킨 것으로 사료된다. 그러나 PrP(106-126)만을 처리한 세포와 sirtinol을 처리한 세포에서는 세포독성이 야기되어 세포사멸을 유도하는 단백질들의 발현이 증가되었다. 또한 도 22에 보이는 바와 같이, PrP(106-126)을 처리한 세포에서 PrPC의 발현이 증가하지만, 레스베라트롤의 전처리를 한 후 PrP(106-126)을 노출시킨 세포에서는 변화가 없음을 볼 수 있다. 따라서 PrP(106-126)의 신경세포 사멸을 억제하는 레스베라트롤의 작용 기전에는 PrPC가 관여하지 않는 것으로 사료된다.
실험예 7. SIRT1의 과발현에 따른 신경세포의 아팝토시스(apoptosis) 억제
상기 실시예 1에서 배양한 SH-SY5Y 세포를 상기 실시예 11에서 제조한 재조합 아데노바이러스(Ad-LacZ 또는 Ad-SIRT1)로 48 시간 동안 감염시킨 후, 200 μM PrP(106-126)을 24 시간 동안 처리 또는 무처리 하였다. 이후, 각 세포들을 광학현미경(×200)으로 관찰하였다. 또한 상기 세포들의 세포 생존율 및 LDH 방출 특성을 측정하였다. 세포 생존율은 상기 실시예 3의 방법을 이용하여 측정하였으며, 대조군 세포(아무것도 처리하지 않은 정상세포)의 생존율을 기준으로 처리된 실험군 세포들의 생존율을 백분율로 나타내어 상대적 세포 생존율을 측정하였다. LDH 방출 특성은 실시예 4의 방법으로 수행하였다. 측정 결과는 각각 도 23, 도 24의 (A), (B)에 나타내었다.
도 23에 보이는 바와 같이, Ad-LacZ를 감염시킨 세포에서는 PrP(106-126)에 의해 세포가 많이 사멸된 것을 볼 수 있으며, 반면 Ad-SIRT1-WT를 처리한 세포는 PrP(106-126)로부터 세포가 보호되어 세포사멸이 억제되었음을 확인할 수 있다. 또한 도 24에 나타낸 것과 같이, PrP(106-126)만을 처리한 세포의 생존율이 아무것도 처리하지 않은 정상세포(대조군)에 비해 50 % 이상 감소되었으나, Ad-SIRT1-WT 처리한 세포에서는 PrP(106-126)를 처리하여도 세포 생존율이 70 % 이상 유지되었다. 그리고 PrP(106-126) 처리에 의해 세포의 LDH 방출이 유의적으로 증가된 반면, Ad-SIRT1-WT 처리한 세포는 정상세포(대조군)와 유사한 수준으로 LDH 방출이 감소하였다. 따라서 Ad-SIRT1-WT 처리에 의해 PrP(106-126)로부터 세포가 보호되었음을 알 수 있다. # P < 0.05는 PrP(106-126)만을 처리한 세포와 PrP(106-126)를 처리하기 전에 Ad-SIRT1로 감염시킨 세포 사이의 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
또한 배양한 SH-SY5Y 세포에 상기와 동일하게 재조합 아데노바이러스와 PrP(106-126)을 처리한 후, 상기 실시예 5와 같이 TUNEL assay를 수행하였다. 측정 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25에 보이는 바와 같이, Ad-LacZ를 감염시킨 후, PrP(106-126)을 처리한 SH-SY5Y 세포는 세포핵의 DNA가 분해되어 녹색으로 염색(TUNEL positive)된 것을 볼 수 있다. 그러나 Ad-SIRT1-WT를 감염시킨 후, PrP(106-126)을 처리한 SH-SY5Y 세포는 녹색 염색이 거의 발견되지 않고 과발현된 SIRT1에 의해 세포가 보호됨을 확인할 수 있다. 또한 모든 세포들에서 세포의 핵이 PI(propidium iodide)로 염색되었음이 관찰되었다.
또한 상기 실시예 1에서 배양한 SH-SY5Y 세포에 1 μM 레스베라트롤을 24 시간 동안 처리 또는 무처리 하거나, 상기 실시예 10에서 제조한 재조합 아데노바이러스(Ad-LacZ 또는 Ad-SIRT1)로 48 시간 동안 감염시켰다. 이후 상기 처리된 SH-SY5Y 세포의 SIRT1 단백질의 발현을 관찰하였으며, 또한 상기 SH-SY5Y 세포에서 핵 단백질을 분리하여 SIRT1 deacetylase 활성을 측정하였다. 단백질 발현은 웨스턴 블롯(western blot)을 이용하여 측정하였으며, 단백질들의 발현 정도는 β-actin과의 상대적 비율로 표준화 하였다. SIRT1 deacetylase 활성은 상기 실시예 11의 방법으로 수행하였다. 측정 결과는 도 26에 나타내었다.
도 26에 나탄낸 것과 같이, 레스베라트롤을 처리한 세포와 Ad-SIRT1-WT을 처리한 세포에서 SIRT1 단백질의 발현이 정상세포(대조군)에 비해 과발현 됨을 확인할 수 있으며, 또한 SIRT1의 활성도 정상세포보다 더 증가함을 확인할 수 있다. *P < 0.05, **P < 0.01는 대조군과 실험군 사이의 유의한 차이가 있음을 나타내며, # P < 0.05는 Ad-LacZ로 감염시킨 세포와 Ad-SIRT1로 감염시킨 세포 사이의 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
따라서 본 발명의 레스베라트롤은 신경세포를 PrP(106-126)로부터 보호하고, SIRT1의 활성을 증가시켜 세포의 아팝토시스(apoptosis)를 억제함으로 PrP 단백질(prion protein)이 관여하는 프리온 질병을 예방 및 치료하는데 효과적일 것으로 사료된다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 레스베라트롤을 분리 및 추출할 수 있으며, 상기 레스베라트롤은 신경세포를 보호하는 효과를 갖는다.
상기 실험예에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 레스베라트롤을 신경세포에 처리하는 경우, 신경세포의 서투인(Sirtuin 1)의 발현 및 활성을 증가시켰으며, 프리온의 세포독성으로부터 신경세포를 보호함으로써 세포의 아팝토시스(apoptosis)를 억제시켰다. 따라서 본 발명의 레스베라트롤을 유효성분으로 함유하는 조성물은 프리온 질병 예방 및 치료용 조성물로써 인체로의 적용이 용이한 의약품으로써 실용화할 수 있으며, 축산동물로의 적용이 용이한 사료첨가제로써 개발 가능하다.

Claims (8)

  1. 레스베라트롤(resveratrol)을 유효성분으로 함유하는 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 레스베라트롤(resveratrol)은 신경세포의 서투인1(Sirtuin 1)의 발현 및 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 레스베라트롤(resveratrol)은 신경세포에 대한 프리온 단백질(prion protein)의 세포독성을 완화시키는 것을 특징으로 하는 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물.
  4. 서투인1(Sirtuin 1)의 유전자 또는 그 발현 단백질을 유효성분으로 함유하는 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 서투인1(Sirtuin 1) 유전자는 재조합 바이러스 벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 도 9의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물.
  7. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 프리온 질병은 인간의 크로이츠펠트-야코프병(Creutzfeldt-Jakob disease), 쿠루병(Kuru disease), 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병(Gerstmann-Strsyndrome), 치명적 가족성 불면증(fatal familial insomnia) 또는 소의 BSE(bovine spongiform encephalopathy) 또는 양의 스크래피(scrapie) 또는 사슴의 CWD(chronic wasting disease) 또는 밍크의 TME(transmissible mink encephalopathy)인 것을 특징으로 하는 프리온 질병 치료 및 예방용 조성물.
  8. 레스베라트롤(resveratrol)을 유효성분으로 함유하는 프리온 질병 예방용 사료첨가제 조성물.
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