HRP20040784A2 - Compositions and methods for modulating connexin hemichannels - Google Patents

Description

Popis srodnih patentnih prijava

Predložena prijava traži pravo prvenstva prema U.S. privremenoj patentnoj prijavi rednog broja 60/352,717 koja je podnesena 20. siječnja 2002.g. čiji sadržaj je ovdje uvršten kao literatura.

Područje izuma

Predloženi izum se odnosi općenito na sastave i postupke za modulaciju koneksinskih polukanala. Izum se također odnosi na korisna pretraživanja za dokazivanje takovih spojeva.

Pozadina izuma

Priznato je da su pukotinski spojevi važne strukture plazma membrane koje pomažu stanicama u komunikaciji s njihovom okolinom.

Na primjer, misli se da većina pukotinskih spojeva pomaže prolasku malih molekula i iona između međusobno spojenih stanica. Vjeruje se da takovo kretanje ima jake učinke na mnoge aspekte fiziologije stanice. Vjeruje se da plazma membrane susjednih stanica uključuju polukanale, "koneksone", nastale od multimernih proteina nazvanih "koneksini" koji pomažu stvaranju pukotinskih spojeva. K tome, polukanali imaju neovisnu ulogu u izmjeni spojeva male molekulske mase između stanične citoplazme i periplazmičnog ili ekstracelularnog prostora. Vidi općenito Bennett, M. et al. (1991) Neuron 6: 305; Kumar, N. i Gilula, N.B. (1996) Cell 84: 381; i Quist, A.P. et al. (2000) J. Cell Biol- 148: 1063 i tamo citiranu literaturu.

Posebno, bilo je izvještaja da su mnogi pukotinski spojevi specijalizirana područja stanične membrane s grozdovima gušće pakiranih kanala. Misli se da takovi kanali pukotinskih spojeva izravno povezuju citoplazmične odjeljke dviju susjednih stanica.

Priznato je da su kanali pukotinskih spojeva sastavljeni od dva polukanala (koneksona) dobivena od dviju susjednih stanica. Svaki konekson (polukanal) je bio opisan kao da se sastoji od šest proteina nazvanih koneksini. Misli se da svaki koneksin dijeli četiri trans-membranske domene, dvije ekstracelularne petlje i citoplazmičnu petlju. Misli se da se provođenje električnih impulsa odvija kroz pukotinske spojeve, čime se olakšava normalnu srčanu provodljivost i ritam. Vidi općenito P.A. Guerrero, R.B. et al. J Clin Invest 1997, 99 1991; D.L. Lerner, K.A. et al., Circulation 1999, 99 1508; S. Kirchhoff, E. et al. Curr Biol 1998, 8 295.

Misli se da se razdioba većine srčanih koneksina značajno mijenja po cijelom organu. Opisano je da izo-oblik C×43 glavni ventrikularni tip, dok je C×40 najobilniji izo-oblik u atriju i u konduktivnom sistemu.

Ima izvještaja o jakim vezama između koneksinskih nenormalija i bolesti srca. Vidi A.C. de Carvalho, et al., J Cardiovasc Electrophvsiol 1994, 5 686; R.R. Kaprielian, et al., Circulation 1998, 97 651; N.S. Peters, et al., Circulation 1993, 88 864; i J.E. Saffitz, R.B. et al., Cardiovasc Res 1999, 42 309.

Podrazumijeva se da su nenormalna ekspresija, distribucija i regulacija pukotinskih spojeva uključene u aritmije. Za antiaritmijske peptide, koje su opisali Larsen, B. et al. u PCT/DK 01/00127 (WO 01/62775), objavljeno je da povećavaju međustaničnu komunikaciju pukotinskih spojeva (e. gap junction intercellular communication, GJIC) u tkivu kralježnice.

Posebno su bili opisani proteini pukotinskih spojeva u sisavcima kodirani s koneksinskom (C×) porodicom gena. Vidi Bruzzone, R. et al. (1996) Eur. J Biochem. 238:1. Porodica C× uključuje C×26, 30, 31, 32, 37, 40, 43, 45, 46 i 50. Kanali pukotinskih spojeva su također pronađeni u nekralježnjacima, u kojima su proteini koji tvore kanal nazvani "ineksini".

Podrazumijeva se da se većina koneksina može fosforilirati, osim C×26 proteina. C×43 protein se naširoko ekspresionira u tkivima. Ima izvještaja da fosforilacija C×43 proteina utječe na unutarstaničnu komunikaciju preko pukotinskih spojeva (GJIC). Na primjer, priznato je da C×43 preusmjerava promet, i da fosforilacija djeluje nepovoljno na prolaze. Vidi Darrow, B.J., et al. (1995), Circ Res 76: 381.

Na primjer, Saffitz i njegovi suradnici su primjenom mjerenja vodljivosti pokazali da tijekom ishemije dolazi do porasta defosforilacije koneksinskog serina u roku od 15 minuta. Vidi sliku 1 (koja prikazuje C×43 transmembranski protein sisavca s nekoliko identificiranih mjesta fosforilacije).

Fosforilacija i topivost koneksina su privukle zanimanje istraživača. Posebno, nađeno je da se C×43 fosforilira u mioepitelnim stanicama mliječnih žlijezda štakora. Vidi Wang, Y., et al. (1995). J Biol Chem 270, 26581; i Yamanaka, I., et al. (1997), Eur J stanica Biol 72: 166.

Kako je spomenuto, misli se da su kanali pukotinskih spojeva naročite pore koje povezuju citoplazmu susjednih stanica. Polukanali komuniciraju s ekstracelularnom okolinom. Postoje izvještaji da metabolička inhibicija stanica srca može aktivirati ulaznu stazu koja može biti građena od koneksinskih polukanala. Smatra se da metabolička inhibicija otvara polukanale i povećava gubitak kalija i uzrokuje dotok protona, natrija i kalcija, čime se oštećuje srčano tkivo. Vidi Kondo et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 32: 1859-72/ 2000; Li et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 33: 2145-55, 2001).

Vjeruje se da električna nepovezanost na pukotinskim spojevima tijekom akutne miokardijalne ishemije doprinosi nenormalnostima provodljivosti i aritmijama ponovnog ulaska. (e. reentrant arrhytmias). Povećanje količina intracelularnih Ca i H+ i akumulacija amfipatskih lipidnih metabolita tijekom ishemije potiče nepovezivanje. I drugi mehanizmi također mogu imati ulogu. Na primjer, objavljeno je da je nepovezanost uzrokovana s akutnom ishemijom povezana s promjenama u fosforilaciji koneksina 43 (C×43). Objavljeni su rezultati koji se slažu s brzom, reverzibilnom C×43 defosforilacijom, koja ima ulogu u miokardijalnoj nepovezanosti i aritmogenezi tijekom akutne ishemije. Vidi Beardslee MA et al., Circ Res. 2000; 87: 656 i tamo citiranu literaturu.

Zanimanje je privukla struktura i funkcija polukanala. Na primjer, mikroskopsko proučavanje atomskih sila (e. atomic force microscopy, AEM), pokus vezanja fluorescentne boje i laserske konfokusne slike imunofluorescencije navode na zaključak da su polukanali uključeni u modulaciju volumena stanice ovisnu o ekstracelularnom kalciju. Kako je objavljeno, promjene volumena stanica bile su ovisne o tome je li se ili nije ekspresionirao koneksin 43. Objavljeno je da se promjene mogu spriječiti s blokerima pukotinskih spojeva (npr. oleamidi i beta-glicirhetinska kiselina) ili se ponovno vraćaju na normalu s povratkom ektracelularnog kalcija. Naslućivalo se je da ne-pukotinski polukanali reguliraju volumen stanice kao reakciju na promjenu ekstracelularnog fiziološkog kalcija u inače izo-osmotskoj situaciji. Vidi gore Quist, A.P. et al.

Pretpostavljalo se je da otvoreni polukanali, posebno tijekom ishemije ili metaboličkog stresa, mogu dovesti do toga da stanica uzima Ca2+, protone i akumulira amfipatske lipidne metabolite u stanicama, koji uzrokuju oticanje stanica, oštećenje stanica ili apoptozu. Vidi Beardslee et al., gore i Quist et al., gore.

Postoje izvještaji da se C×43 fosforilira u položajima Tyr247 (Y247), Tyr265 (Y265) i vjerojatno u drugim položajima aktiviranjem Src proteina in vitro. Bilo je objavljeno da je značajno što je intercelularna komunikacija pukotinskih spojeva (GJIC) otporna na prekid s fosforilacijom posredovanom sa v-Src. Priznaje se da je važna fosforilacija C×43 na Y247 i Y265. Vidi Lin R. et al., (2001) J Cell Biol 154 (4): 815. Vidi također sliku 1.

Vidi također Larsen, B. D et al. u PCT prijavi s naslovom New Medical Uses of Intracellular Communication Facilitating compounds (Nova medicinska upotreba spojeva koji olakšavaju intracelularnu komunikaciju), koja je podnesena 22. februara 2002 kao PCT/US 02/05773 (WO 02/077017) i u kojoj je opisano mnoštvo spojeva koji moduliraju GJIC.

Poželjni su spojevi koji moduliraju funkciju polukanala. Povoljni spojevi bi pomogli otvaranje ili zatvaranje polukanala. Posebno bi bio poželjan postupak molekularnog pretraživanja za identifikaciju takovih spojeva.

Kratki opis izuma

Izum se općenito bavi sa spojevima i postupcima u kojima se oni koriste za modulaciju funkcije polukanala. Posebno, ovi spojevi moduliraju fosforilaciju polukanala. Dodatni spojevi izuma moduliraju funkciju polukanala i u nekim slučajevima također pogađaju komunikaciju preko pukotinskog spoja (GJIC) npr. otvaranjem ili zatvaranjem kanala pukotinskog spoja. Također su data korisna pretraživanja za detekciju i karakterizaciju takovih spojeva.

Izum ima mnogo korisnih primjena koje uključuju davanje terapija za liječenje ili prevenciju raznih stanja posredovanih s neprikladnom funkcijom polukanala.

Postoji hitna potreba za identifikacijom spojeva koji moduliraju (porast ili opadanje) funkcije polukanala. S "funkcijom polukanala" misli se na otvaranje ili zatvaranje koneksinskih polukanala tako da oni pojačavaju ili smanjuju prolaz molekula ili iona kroz polukanal. S pojmom "funkcije pukotinskog spoja" misli se na otvaranje ili zatvaranje s pukotinskim spojevima u smislu povećanja ili smanjenja prolaza molekula ili iona kroz pukotinski spoj.

Spojevi prema izumu kojima se daje prednost moduliraju fosforilaciju polukanala i, tipično također pomažu otvaranje ili zatvaranje polukanala. Funkcija polukanala i funkcija pukotinskog spoja može se brzo detektirati i prema potrebi kvantificirati s jednim ili više standardnih pokusa koji su ovdje opisani.

Pobliže, spojevi koji moduliraju polukanal moduliraju (povećavaju ili smanjuju) fosforilaciju prepoznatog koneksina. Prednosna mjesta fosforilacije ili defosforilacije uključuju jedan ili više tirozinskih, serinskih ili treoninskih ostataka na koneksinu.

Kao što će dolje biti opisano, pronađeno je da modulacija fosforilacije na jednom ili više tih ostataka pogađa funkciju polukanala, posebno otvaranjem i zatvaranjem polukanala. Tako, dakle, i kao što je dolje opisano, cilj izuma je osigurati pretraživanje prilagođeno praćenju stanja fosforilacije koneksina kao sredstva za detekciju i prema potrebi karakterizaciju spojeva koji mogu modulirati funkciju polukanala.

Na primjer, određeni spojevi prema izumu mogu fosforilirati najmanje jedan tirozinski ostatak koneksina. U toj izvedbi, fosforilacija koneksina potpomaže zatvaranje polukanala.

Drugi prikladni spojevi koji moduliraju polukanale smanjuju fosforilaciju (defosforilacija) najmanje jednog serinskog ostatka koneksina. U tom slučaju, defosforilacija serina potpomaže otvaranje polukanala. Također, drugi spojevi u opsegu svrhe izuma pojačavaju fosforilaciju najmanje jednog treoninskog ostatka koneksina, čime se tipično potpomaže zatvaranje polukanala. K tome, prikladni spojevi izuma olakšavaju barem jedno od slijedećeg: porast ili opadanje fosforilacije serina, porast ili opadanje fosforilacije tirozina, i porast ili opadanje fosforilacije treonina u koneksinu. Ponajprije, jedna ili više modifikacija amino kiseline pomaže u dokazivom otvaranju ili zatvaranju polukanala.

S tim u skladu, u jednom aspektu izum osigurava postupak za modulaciju funkcije polukanala ponajprije zatvaranjem polukanala. U jednoj izvedbi, postupak uključuje zatvaranje polukanal u stanici, tkivu ili organu, ponajprije izloženom stresu, koji uključuje dodir stanice, tkiva ili organa pod stresom s terapeutski učinkovitom količinom najmanje jednog spoja kojeg prikazuju donje formule I ili II. Prednosni dodir prema izvedbi ovog postupka dovoljan je za zatvaranje polukanala prije, tijekom ili nakon izlaganja stresu u usporedbi s odgovarajućom kontrolom. Primjeri takovog stresa uključuju jednu ili više metaboličkih inhibicija, oduzimanje kisika, spuštanje pH vrijednosti ili povećavanje ekstracelularnih kalijevih iona, kako je dolje opisano.

U još posebnijoj izvedbi, postupak nadalje uključuje praćenje fosforilacije prepoznatog koneksina, ponajprije koneksina 43 (C×43). Tipično, postupkom se dokazuje i pokazuje svaki porast ili opadanje C×43 fosforilacije na najmanje jednom njegovom tirozinskom, serinskom i treoninskom ostatku, ponajprije porast fosforilacije na najmanje jednom tirozinu i treoninu. U toj izvedbi, postupak također uključuje zatvaranje polukanala, i prema potrebi, otvaranje ili zatvaranje kanala pukotinskog spoja u usporedbi s prikladnom kontrolom.

Izum osigurava i druge postupke za modulaciju funkcija polukanala. U jednoj izvedbi, postupak uključuje praćenje fosforilacije prepoznatog koneksina, ponajprije C×43, čime se dokazuje svaki porast ili opadanje C×43 fosforilacije na najmanje jednom njegovom tirozinskom, serinskom i treoninskom ostatku, ponajprije opadanje fosforilacije jednog ili više tih ostataka, kao što je serinski, u suporedbi s kontrolom. Prema ovom primjeru izuma, postupak uključuje otvaranje polukanala u stanici, tkivu ili organu izloženom stresu i on uključuje dovođenje stanice, tkiva ili organa pod stresom u dodir s terapeutski učinkovitom količinom najmanje jednog od spojeva koje dolje prikazuju formule I ili II. Prednosni dodir je dovoljan za otvaranje polukanala, i, prema potrebi, otvaranje ili zatvaranje kanala pukotinskog spoja u usporedbi s prikladnom kontrolom.

Postoji potreba za pretraživanjem s kojim se takovi spojevi koji moduliraju polukanale mogu pobliže dokazati i karakterizirati. Imati takovo sredstvo za pretraživanje je prvi važan korak prema identifikaciji i karakterizaciji područja novih spojeva koji moduliraju polukanale, npr. in vitro ispitivanjem kandidata za te spojeve u usporedbi s kontrolom, da se dokaže sposobnost u zatvaranju polukanala, na primjer za najmanje 5% više od kontrolnog spoja. Spojevi identificirani takovim pretraživanjem, uključiv spojeve koje prikazuju donje formule I ili II, mogu se upotrijebiti u terapijama koje pospješuju homestazu stanice, tkiva i organa, na primjer, sprečavanjem, smanjenjem ili zaštitom od gubitka staničnih komponenata u ekstracelularnom okruženju.

S tim u skladu, predloženi izum također osigurava specifične in vitro postupke za pretraživanje spojeva kandidata koji imaju sposobnost modulacije funkcije polukanala. Tipično, postupak uključuje dodir odgovarajućih stanica, tkiva ili organa s najmanje jednim spojem kojeg prikazuju donje formule I ili II. Ponajprije, dodir se vrši pod uvjetima pod kojima se može provesti modulaciju fosforilacije prepoznatog koneksina, ponajprije koneksina 43 (C×43) i dokazivanje promjene C×43 fosforilacije u usporedbi s prikladnom kontrolom. Također, ponajprije, promjena fosforilacije se vrši da se dokaže spoj koji može modulirati polukanal. Prema potrebi, takovi spojevi, dokazani postupkom pretraživanja, mogu otvoriti ili zatvoriti kanale pukotinskog spoja u skladu s pokusima koji su ovdje opisani.

Po svakoj gornjoj metodi, povoljne promjene fosforilacije prema izumu pojavljuju se gotovo u cijelosti na ili blizu intracelularnog C-kraja koneksina. Još povoljnija mjesta fosforilacije i defosforilacije za C×43 su prikazana na slici 1. S pojmom "C-kraj koneksina" misli se na područje koje se proteže otprilike od amino-kiselinskih ostataka 240 do 281, kako je prikazano na slici 1.

Posebno, pokus in vitro pretraživanja prema izumu za dokazivanje fosforilacije koneksina uključuje jedan ili više stupnjeva određenih za praćenje funkcije polukanala, funkcije pukotinskog spoja (ili obojeg). Takav pokus općenito uključuje najmanje jedan, a ponajprije sve slijedeće korake:

1) uzgoj populacije stanica, tkiva ili organa kao što su one koje su uzete od srca ili mišića,

2) izlaganje stresu stanice, tkiva ili organa ponajprije oduzimanjem kisika ili metaboličkom inhibicijom,

3) dodavanje poznatog spoja ili spoja kandidata za modulaciju polukanala, kao što je su spojevi koje prikazuju donje formule I ili II,

4) utvrđivanje promjena u fosforilaciji koneksina (ponajprije C×43) u usporedbi s prikladnom kontrolom; i

5) prema potrebi, mjerenje promjene koja je pokazala da spoj koji modulira funkciju polukanala i prema potrebi funkciju pukotinskog spoja.

Ovim pokusom može se učinkovito izmjeriti sposobnost spoja koji modulira polukanal u smislu porasta ili opadanja fosforilacije najmanje jednog serinskog, tirozinskog i treoninskog ostatka prednosnog C×43 proteina. Usporedba prema "standardnom pokusu fosforilacije koneksina in vitro" ili sličan izraz ovdje se odnosi na gornji protokol od stupnja 1) do stupnja 5). Pokus se može provesti gotovo s bilo kojom populacijom primarnih, sekundarnih ili imortaliziranih stanica, kao što su stanice uzete od srca ili mišića.

Gornji standardni pokus in vitro je općenito prilagodljiv. Na primjer, stupnjevi 1)- 5) mogu se provesti skoro bilo kojim redoslijedom pod uvjetom da se dobiju željeni rezultati pretraživanja. Tako se u jednoj izvedbi pokusa spoj kandidat može dodati u stupnju 1), stupnju 2) (ili u obadva stupnja) umjesto isključivo nakon stupnja 2).

Predloženi izum osigurava i druge postupke za pretraživanje spojeva kandidata u pogledu njihove sposobnosti da moduliraju funkciju polukanala. U jednoj izvedbi, postupak uključuje dodir prikladne stanice, tkiva ili organa s najmanje jednim spojem odabranim iz skupine koju prikazuju donje formule I ili II. Tipično, U prisutnosti spoja prati se svaki dokazivi utrošak reportera kojeg troše stanice, tkivo ili organ i uspoređuje se s prikladnom kontrolom. Povoljno je da dokazivi reporteri imaju veličinu molekule koja prolazi kroz otvoren polukanal. Tako, ako je u pokusu polukanal otvoren, dolaziv reporter ulazi u stanicu, tkivo ili organ. Međutim, ako je polukanal zatvoren, dokazivom reporteru je spriječen prolaz kroz polukanal. Dodir se dešava ponajprije pod uvjetima pod kojima se može provesti dokazivanja svake promjene utroška dokazivog reportera s usporedbom prema prikladnoj kontroli.

Prema izumu, polukanal je "zatvoren" ako je najmanje jedan tirozinski ostatak u C-terminalnom području koneksina, ponajprije C×43 fosforiliran, ponajprije barem tirozin na položaju 247 ili položaju 265, još bolje obadva, što se dokazuje, na primjer, standardnim in vitro pokusom fosforilacije koneksina. S pojmom "zatvoren" podrazumijeva se također da je najmanje jedan treoninski ostatak u C-terminalnom području koneksina fosforiliran, koji ostatak se može fosforilirati sam ili zajedon s fosforilacijom tirozina. Polukanal je "otvoren" ako je najmanje jedan serinski ostatak u C-terminalnom području koneksina defosforiliran. Dodatni povoljni tirozinski, treoninski i serinski ostaci su prikazani na slici 1 kao mjesta kinaze.

Pobliže, pokus pretraživanja in vitro za dokazivanje prolaza dokazivog reportera kroz polukanal uključuje jedan ili više slijedećih stupnjeva:

1) uzgoj populacije stanica, tkiva ili organa kao što su one uzete od srca ili mišića,

2) izlaganje stresu stanica, tkiva ili organa ponajprije oduzimanjem kisika ili metaboličkom inhibicijom, kao što je dodavanje derivata glukoze,

3) dodavanje poznatog spoja ili spoja kandidata za modulaciju polukanala, kao što su oni koje prikazuju donje formule I i II,

4) dodavanje dokazivog reportera, kao što je fluorescentan, kemiluminiscentan, ili fosforescentan spoj kao što je fluorescentna boja, kao kalcein i srodni spojevi,

5) dokazivanje promjene utroška dokazivog reportera u stanicama, tkivu ili organu u usporedbi prema prikladnoj kontroli; i

6) prema potrebi, mjerenje promjena koje dokazuju da spoj modulira funkciju polukanala.

S ovim pokusom može se učinkovito izmjeriti sposobnost spoja kandidata za otvaranje ili zatvaranje polukanala u stanicama, tkivu ili organu, i tu promjenu se odmah može dokazati pomoću mikroskopa tako da se dokazivi reporter učini vidljivim. Usporedba prema "standardom pokusu in vitro utroška" ili srodan izraz odnosi se na gornji protokol sa stupnjevima 1) do 6). Pokus se može provesti gotovo sa svakom populacijom primarnih, sekundarnih ili imortaliziranih stanica, kao što su stanice uzete od srca ili mišića. Drugi prihvatljivi reporteri uključuju prikladne radioaktivne spojeve, koji također imaju veličinu koja im omogućuje prolaz kroz polukanal. Posebni spojevi uključuju one koji su obilježeni s jednim ili više slijedećih radionuklida: 3H, 35S, i 14C.

Važno je da standardni pokus in vitro utroška, koji je gore opisan, općenito nije vezan na bilo koji redoslijed stupnjeva ako se postižu željeni rezultati pokusa. Tako se u skladu s postupkom u jednoj izvedbi, najmanje jedan spoj kandidat i dokaziv reporter iz stupnja 3) i 4) dodaju se pojedinačno ili zajedno prije stupnja 2) . U tora primjeru pokusa, stanice, tkivo ili organ se izlažu stresu u prisutnosti spoja i dokazivog reportera. Alternativno, dokaziv reporter se može "utovariti" u stanice u stupnju 1) da se dokažu spojevi koji mogu otvoriti polukanale.

Izumom su, nadalje, dati postupci za pretraživanje jednog ili više spojeva kandidata koji mogu modulirati funkciju polukanala. U jednoj izvedbi, postupak uključuje dodir stanica, tkiva ili organa s najmanje jednim spojem odabranim između onih koje prikazuju donje formule I ili II. Tipično, stanice, tkivo ili organ se opterete s dokazivim reporterom do mjerljivog volumena. Povoljni dokazivi reporteri za upotrebu u pokusu imaju veličinu molekule koja je prikladna za prolaz kroz otvoren polukanal. Dodir se dešava ponajprije pod uvjetima koji dovode do dokazivanja svake promjene volumena stanice, tkiva ili organa, zabilježene s dokazivim reporterom i usporedbom s prikladnom kontrolom. Ponajprije, stanice, tkivo ili organ se izlažu stresu i spoj kandidat zatvara polukanal tako da se volumen stanice održava ili opada polaganije kad se usporedi s prikladnom kontrolom.

Poseban pokus in vitro pretraživanja za utvrđivanje promjena volumena stanice uključuje jedan ili više slijedećih stupnjeva:

1) uzgoj populacije stanica, tkiva ili organa, kao što su one dobivene od srca ili mišića,

2) opterećenje stanica, tkiva ili organa s dokazivim reporterom, kao što je fluorescentan, kemiluminiscentan ili fosforescentan spoj, kao što je boja, kao kalcein ili srodan spoj,

3) utvrđivanje volumena stanice, tkiva ili organa određivanjem i brojčanim utvrđivanjem signala iz dokazivog reportera,

4) dodavanje poznatog spoja koji modulira polukanal ili spoja kandidata za modulaciju polukanala, kao što su spojevi koje prikazuju donje formule I ili II,

5) izlaganje stanica, tkiva ili organa stresu, ponajprije oduzimanjem kisika ili metaboličkom inhibicijom, kao što je dodavanje derivata glukoze,

6) utvrđivanje promjene volumena stanice u usporedbi s prikladnom kontrolom; i

7) prema potrebi, mjerenje promjene kao dokaza da taj spoj modulira funkciju polukanala i prema potrebi funkciju pukotinskog spoja.

Pokusom se može učinkovito izmjeriti sposobnost spoja kandidata da modulira polukanal u smislu da on otvora ili zatvara polukanale u stanicama, tkivu ili organu praćenjem promjena volumena stanica pod mikroskopom. Ovdje se navođenje "standardnog pokusa in vitro volumena stanice" ili sličnog izraza odnosi na gornji protokol sa stupnjevima 1) do 7). Pokus se može provesti gotovo sa svakom populacijom primarnih ili sekundarnih stanice dobivenih od srca ili mišića, kao što su kardiomiociti i srodne stanice ili tkivo.

Standardni pokus in vitro volumena stanica nije vezan na neki poseban redoslijed stupnjeva sve dok se postižu željeni rezultati pokusa. Tako se u jednoj izvedbi spoj kandidat iz stupnja 4) dodaje nakon izlaganja stanica stresu u stupnju 3) za praćenje sposobnosti spoja da zatvori polukanale u stanicama koje su već bile izložene stresu, što se vidi, na primjer, po manjoj brzini opadanja volumena. Tako se u jednoj izvedbi pokusa promjenu brzine opadanja ili porasta volumena stanica prati u okviru prethodno određenog vremenskog perioda. Međutim, u drugoj izvedbi, promjenu volumena stanica može se pratiti samo u određenom trenutku, npr. u trenutku između pribl. 1 i 120 minuta nakon izlaganja stanica, tkiva ili organa stresu.

Kako je gore spomenuto, pokusi in vitro prema izumu su prilagodljivi i oni se mogu prilagoditi svrsi primjene željenog pretraživanja. Na primjer, poseban spoj koji je kandidat za modulaciju polukanala, kao što su oni koje prikazuju donje formule I ili II, može se upotrijebiti kao jedino aktivno sredstvo ili u kombinaciji s drugim sredstvima koja uključuju druge spojeve koji se žele ispitati. U mnogim, ali ne u svim slučajevima, pokusi in vitro provede se s usporedbom prema prikladnom kontrolnom pokusu koji obično uključuje iste ili tijesno slične uvjete ispitivanja kao u gornjim stupnjevima, ali bez dodavanja spoja koji se želi ispitati u medij za kulturu. U tim slučajevima, spoj koji je kandidat za modulaciju polukanala može se identificirati tako da on pokazuje najmanje 2% veću aktivnost u pokusu u usporedbi s kontrolom, još bolje najmanje najmanje približno 5% veću aktivnost u usporedbi s kontrolnim pokusom, i čak još bolje najmanje približno 10% ili veću aktivnost, npr. približno 20% do približno 40% u usporedbi s kontrolnim pokusom.

Kao što je spomenuto, posebni spojevi koji moduliraju polukanale djeluju također i na kanale pukotinskog spoja. Na primjer, određeni spojevi mogu pomoći zatvaranje polukanala i pomoći u otvaranju kanala pukotinskog spoja.

Međutim, drugi spojevi mogu pomoći otvaranje polukanala, dok pomažu u zatvaranju kanala pukotinskog spoja. Također, drugi spojevi mogu otvoriti oboje, polukanale i pukotinske spojeve, dok drugi mogu zatvoriti pukotinske spojeve i polukanale.

S tim u skladu, izum također osigurava postupak za povećavanje intracelularne komunikacije preko pukotinskog spoja (GJIC) u stanici, tkivu ili organu. U jednoj izvedba, postupak uključuje davanje terapeutski učinkovite količine najmanje jednog spoja odabranog između onih koje prikazuju dolje opisane formule I ili II. Ponajprije, dodir je dovoljan za porast GJIC u stanici, tkivu ili organu u usporedbi s prikladnom kontrolom.

Također su osigurane kombinacije pokusa in vitro sa spojevima koji su odabrani zbog sposobnosti da moduliraju polukanale i pukotinske spojeve. U jednoj izvedbi, kombinira se najmanje jedan standardni pokus in vitro fosforilacije koneksina, standardni pokus in vitro utroška i standardni in vitro pokus volumena stanica s jednim ili više pokusa GJIC kako su ga opisali Larsen, B. et al. u PCT prijavi pod naslovom Novel Antiarrhythmic Peptides, koja je podnesena 22 februara 2001 g. kao PCT/DK 01/00127 (WO 01/62775) ili kako su opisali Larsen, B. et al. u drugoj PCT prijavi pod naslovom New Medical Uses of Intracellular Communication Facilitating compounds, koja je podnesena 22. februara 2002 kao PCT/US 02/05773 (WO 02/077017). Primjeri takovih prikladnih GJIC pokusa uključuju one u kojima se mjeri vodljivost stanica pomoću steznog flastera, mjerenjem kalcijevog vala i pokus prijenosa boje. Sadržaji prijava PCT/DK 01/00127 (W0 01/62775) i PCT/US 02/05773 (W0 02/077017) su ovdje stoga uvršteni kao literatura.

Naveden kao primjer, a ne kao ograničenje, standardni pokus in vitro fosforilacije koneksina primijenjen je za izbor jednog ili više spojeva koji moguliraju polukanale. Jedan ili više spojeva može se uzastopce dalje pretražiti u pokusu sa steznim flasterom na kardiomiocita, kako je opisan u prijavi PCT/US 02/05773 (WO 02/077017). Spojevi koji pokazuju prikladnu aktivnost u obadva pokusa bit će sposobni za modulaciju polukanala i pukotinskih spojeva.

Izum nadalje osigurava in vivo ispitivanje spojeva kandidata za modulaciju polukanala za pomoć u detekciji i prema potrebi količinskom utvrđivanju terapeutske sposobnosti za modulaciju srčane aritmije. Kao što je spomenuto/ vjeruje se da se većinu srčanih aritmija može spriječiti, ublažiti ili izliječiti upotrebom jednog ili kombinacije spojeva ovog izuma. Model ispitivanja in vivo, kojem se daje prednost, koji se ovdje navodi kao "standardni pokus in vitro aritmije miša" ili sličan izraz, opisan je u PCT/DK 01/00127 (WO 01/62775) kao također i u PCT/US 02/05773 (WO 02/077017). U pokusu, određeni spojevi prema izumu na poželjan način produljuju vrijeme do uspostavljanja izazvanog atrijalnog ventrikularnog (AV) blokiranja za najmanje približno 20% (rezultat iz najmanje 2 pokusa). Drugi spojevi u pokusu pokazuju produljenje do uspostavljanja inducirane AV blokade od najmanje približno 60% ili više puta toliko (rezultat od najmanje 3 pokusa) . Šire rečeno, pokus uključuje davanje jednog ili više spojeva odgovarajućem mišu, koji je ranije dobio injekciju kalcijevog klorida, čime je uzrokovana aritmija, i utvrđivanje vremena uspostavljanja aritmije (ponajprije 2. stupnja AV blokade) u usporedbi s prikladnom kontrolom.

Značajno je da se upotrebom formata višestruke detekcije (tj. kombinacije najmanje jednog standardnog pokusa in vitro i pokusa in vivo aritmije, kako je ovdje opisano) mogu učinkovito provesti višestruke analize, čime se povećava točnost i vjerojatnost identifikacije spoja koji modulira polukanal (kao što su spojevi koje prikazuju formule I i II, na primjer) s dobrim terapeutskim sposobnostima. Ta značajka izuma je posebno korisna ako se ispituje veliki broj spojeva. Na primjer, mogu se ispitati neki ili gotovo svi spojevi formule I ili II. Alternativno, ili dodatno, prikladni spojevi se mogu proizvesti standardnim postupcima sinteze, koji uključuju kombinirane vrste kemijskih manipulacija i zatim se mogu ispitati prema izumu.

U izvedbama u kojima se provode višestruki oblici detekcije, važno je napomenuti, da za značajno in vitro i in vivo djelovanje, kako je utvrđeno ovdje opisanim pokusom, nije potreban oblik spoja koji modulira polukanal. To jest, određeni spojevi koji su ovdje opisani pokazuju dobro djelovanje u najmanje jednom standardnom pokusu in vitro koji je ovdje opisan, ali ne pokazuju značajno djelovanje u standardnom pokusu in vivo aritmije. Alternativno, određeni drugi spojevi pokazuju značajno djelovanje u in vivo pokusu aritmije, ali ne pokazuje dobro djelovanje u jednom ili više standardnih pokusa in vitro. Međutim, prednost se daje spoju koji modulira polukanal i koji pokazuje dobro djelovanje u najmanje jednom pokusu in vitro i in vivo opisanom u ovoj prijavi.

Spojevi koji pokazuju dobro djelovanje u standardnom pokusu in vivo aritmije ponekad se nazivaju "antiaritmijski spojevi" ili sličnim nazivom, čime se označava njihovu sposobnost produljenja vremena aritmije u pokusu.

U više pojedinosti će se dolje opisati kako se spojevi izuma mogu upotrijebiti za sprečavanje ili za liječenje širokog spektra medicinskih stanja koja su povezana ili za koje se sumnja da su povezani s neželjenim ili nenormalnim prolazom molekula i/ili iona kroz stanične membrane. Na primjer, gotovo sve medicinske indikacije koje su opisane u PCT/DK 01/00127 (WO 01/62775) i PCT/US 02/05773 (WO 02/077017) mogu se opisati na taj način. Ovdje su opisane neke od spomenutih medicinskih indikacija. Medicinske indikacije se mogu spriječiti, ublažiti ili izliječiti upotrebom jednog spoja ili kombinacije spojeva opisanih u predloženoj prijavi, a posebno onih koji pokazuju dobro djelovanje u najmanje jednom in vitro i in vivo pokusu koji su ovdje dati.

Dodatne spojeve koji su prikladni za ispitivanje i upotrebu prema predloženom izumu opisali su Larsen, B. D et al. u PCT/US 02/05773 (WO 02/077017).

U drugom aspektu, izum osigurava postupak za prevenciju ili liječenje tkiva ili organa u sisavcu koji su izloženi stresu. U jednoj izvedbi, postupak uključuje davanje terapeutski učinkovite količine najmanje jednog spoja odabranog između spojeva koje prikazuju gornje formule I i II. Ponajprije, dodir je dovoljan za prevenciju ili za liječenje tkiva ili organa izloženog stresu.

Izum također osigurava postupak za liječenje opeklina prema kojem se pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje daje terapeutski učinkovitu količinu spoja koji blokira otvaranje koneksinskog polukanala.

Također je dat postupak za liječenje tromboze. U jednoj izvedbi, postupak uključuje davanje pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje terapeutski učinkovite količine spoja koji blokira otvaranje koneksinskog polukanala.

U drugom aspektu, izum također osigurava postupak za liječenje respiratorne i metaboličke acidoze. U jednoj izvedbi, postupak uključuje davanje pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje terapeutski učinkovite količine spoja koji blokira otvaranje koneksinskog polukanala.

Izum također osigurava postupak za liječenje fokalne aritmije. U jednom primjeru, postupak uključuje davanje pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje terapeutski učinkovite količine spoja koji blokira otvaranje koneksinskog polukanala.

Izumom je nadalje dat postupak za liječenje i prevenciju ozljeda stanica i tkiva koje su posljedica povećane količine glukoze u krvi. U jednoj izvedbi, postupak uključuje davanje pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje terapeutski učinkovite količine spoja koji blokira otvaranje koneksinskog polukanala.

Izum također daje postupak za liječenje kronične atrijalne fibrilacije. U jednoj izvedbi, postupak uključuje davanje pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje terapeutski učinkovite količine spoja koji blokira otvaranje koneksinskog polukanala.

Također je osiguran postupak za liječenje epilepsije. Postupak obično uključuje davanje pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje terapeutski učinkovite količine spoja koji potiče otvaranje koneksinskog polukanala.

Dat je nadalje postupak za citoprotekciju tkiva ili organa sisavca kojem je potrebno takovo liječenje, pri čemu postupak uključuje davanje terapeutski učinkovite količine najmanje jednog spoja odabranog između spojeva koje prikazuju formule I ili II.

Izum također osigurava postupak za prevenciju ili liječenje reperfuzijekih ozljeda sisavca, pri čemu taj postupak uključuje davanje terapeutski učinkovite količine najmanje jednog spoja odabranog između spojeva koje prikazuju formule I ili II.

U svakoj od gornjih terapeutskih metoda, spoj prema izumu ima dobro anti-aritmijsko djelovanje dokazano standardnim pokusom in vitro aritmije na mišu (tj. rezultat najmanje 2). Takovi spojevi se ovdje ponekad navode kao "antiaritmijski" spojevi ili pod sličnim nazivom.

Daljnje primjene i prednosti predloženog izuma vidjet će se iz slijedećeg opisa i primjera. Drugi aspekti izuma su također dolje opisani.

Kratki opis slika

Slika 1 prikazuje mjesto fosforilacije na koneksinu (C×43) (Hossain MZ et al. (Science's stke 2000; str. 1-5). Kao što se vidi, citosolična domena C×43 transmembranskog proteina ima nekoliko mogućih serinskih i tirozinskih mjesta fosforilacije.

Slika 2 predstavlja dijagram koji pokazuje metabolički stres uzrokovan odstranjivanjem glukoze. Kao što se može vidjeti iz dijagrama, davanje spoja 1 umanjuje stres, što pokazuje opadanje usporavanja relativne vodljivosti.

Slike 3A-B prikazuju imunoblotove detekcije fosforilacije tirozina u koneksinu 43 (C×43). Slika 3A pokazuje rezultate davanja spoja 1. Slika 3B pokazuje rezultate davanja spoja 1 i spoja 2.

Slike 4A-B prikazuju imunoblotove detekcije fosforilacije tirozina (8A) i fosforilacije serina (8B) u Cx43.

Slika 5 prikazuje grafički učinak 10 nM spoja 1 na ishemijom uzrokovan utrošak kalceina u uzgajanim kardiomiocitima.

Slika 6A prikazuje crtež oblika ELISA pokusa kojem se daje prednost.

Slika 6B prikazuje grafički ELISA rezultate fosforiliziranog C×43 na Tyr-P u stanicama HeLa.

Slika 6C prikazuje grafički rezultate ELISA fosforiliranog C×43 na Tyr-P u stanicama CHO.

Slike 7A-C prikazuju fotomikrografije utroška boje u uzgajanim kardiomiocitima. Slika 7A: kardiomiociti pod optičkim mikroskopom; slika 7B: fluorescencija pod kontroliranim uvjetima (isto kao stanice na slici 7A); slika 7C: fluorescencija nakon 30 minuta metaboličke inhibicije.

Slika 8 prikazuje dijagram smanjenja utroška kalceina, uzrokovanog stresom, u ovisnosti o dozi spoja 1.

Slike 9A-B prikazuju dijagrame učinka spoja 1 na bubrenje stanica uzrokovano stresom. Slika 9A: relativan volumen tijekom metaboličke inhibicije u prisutnosti ili u odsutnosti spoja 1 (0,1 nM). Slika 9B prikazuje kontrolne podatke.

Slika 10 prikazuje grafički učinak spoja 1 (0,1 nM) na bubrenje stanica uzrokovano stresom.

Slika 11 prikazuje dijagram smanjenja omjera težine srca prema težini tijela nakon davanja spoja 1 štakorima podvrgnutih miokardijalnom infarktu.

Slika 12 prikazuje dijagram smanjenja veličine infarkta kod štakora nakon davanja spoja 1.

Slika 13 prikazuje dijagram poboljšanja kardijalne funkcije nakon davanja spoja 1 štakorima podvrgnutih miokardijalnom infarktu.

Opis izuma u pojedinostima

Kako je gore spomenuto, izum osigurava spojeve i postupke njihove upotrebe za modulaciju funkcije polukanala. Pobliže, spojevi moduliraju fosforilaciju polukanala čime potpomažu otvaranje ili zatvaranje polukanala. Također su data korisna pretraživanja za dokazivanje i karakterizaciju takovih spojeva, pri čemu pretraživanja uključuju in vitro pokuse, in vivo pokuse ili njihovu kombinaciju. Nadalje, osigurani su terapeutski postupci koji se mogu primijeniti za liječenje ili prevenciju uvjeta pogođenih nepravilnom funkcijom polukanala.

Cilj izuma je pokazati najprije da se na stanicu, tkivo i organ izložen stresu može štetno djelovati zatvaranjem i otvaranjem polukanala. Bez namjere da se to povezuje s teorijom, vjeruje se da metabolički stres, kao što je oduzimanje kisika tijekom ishemije, oduzimanje glukoze, nepovezivanje oksidativne fosforilacije uzrokovane s HCN, ili nepovezivanje ciklusa limunske kiseline, može doprinijeti nepovezivanju intercelularne komunikacije preko pukotinskih spojeva (GJIC). Vjeruje se, nadalje, da to se to nepovezivanje podudara s modulacijom fosforilacije koneksina, pobliže s defosforilacijom koneksin-tirozinskih ostataka i/ili koneksin-serinskih ostataka i/ili treoninskih ostataka u kanalu pukotinskog spoja. Vjeruje se, na primjer, da tijekom atrijalne fibrilacije, atrijalne stanice imaju povećanu metaboličku potrebu zbog visoke frekvencije ritma. Misli se da to dovodi do laktatne acidoze, otvaranja polukanala i nepovezivanja pukotinskih spojeva.

Cilj ovog izuma je također osigurati postupke za modulaciju funkcije polukanala i, prema potrebi, intercelularnu komunikaciju pukotinskog spoja (GJIC) koji postupci uključuju dodir stanice, tkiva ili organa s terapeutski učinkovitom količinom jednog spoja ili kombinacije spojeva koji imaju takovo djelovanje. Spojeve kojima se daje prednost opisali su B. Larsen et al. u PCT/DK 01/00127 (WO 01/62775) i PCT/US 02/05773 (WO 02/077017).

Spojevi kojima se daje još veću prednost za upotrebu prema predloženom izumu uključuju one koje prikazuje slijedeća formula I:

[image]

u kojoj

R1 predstavlja H ili acetil (Ac),

R2 predstavlja bočni lanac jedne od amino kiselina G, Y, D-Y, F i D-F,

R3 predstavlja bilo koji aminokiselinski bočni lanac,

R4 predstavlja bočni lanac jedne od amino kiselina G, Y, D-Y, F i D-F,

R5 predstavlja OH ili NH2 i

a, S, T, P i Q su međusobno neovisni cijeli brojevi 0 ili 1;

i njihove soli.

Još specifičniji spojevi uključuju one koji imaju slijedeću formulu II:

R1-X1-X2-X3-R2 II

u kojoj

X1 je 0, Ala, Gly, B-Ala, Tyr, D-Tyr, Asp,

X2 je 0; Ala-Gly-T4c-Pro; Ala-Sar-Hyp-Pro; Ala-Asn; D-Asn-D-Ala; D-Asn; Gly, Ala; D-Ala; B-Ala; Asn; ili

X3 je Tyr; D-Tyr; Gly, ili Phe; i

R1 je H ili Ac, pod uvjetom da X1 i X2 nisu istovremeno 0;

R2 je OH ili NH2, i njihove soli.

Pobliže, spojevi prikazani s gornjim formulama I ili II uključuju slijedeće spojeve:

G-(DBF)-Y-NH2, H-GA-Sar-Hyp-PY-NH2, H-GAG-T4c-PY-NH2/ Gly-Ala-Asn-Tyr, D-Tyr-D-Asn-D-Ala-Gly,

D-Tyr-D-Asn-Gly, Gly-Gly-Tyr, Gly-Ala-Tyr, D-Tyr-D-Ala-Gly/ Gly-D-Asn-Tyr, Gly-pAla-Tyr, pAla-Ala-Tyr,

Gly-pAla-Phe, Gly-Asn-Phe, Asn-Tyr, Ac-Gly-Tyr, Ac-Ala-Tyr, (reducirani Gly) -Gly-Tyr (H2N-CH2-CH2-NH-CH2-C (O) -Tyr) ,

[image]

[image]

i njihove soli.

K tome, dodatne spojeve kandidate prema izumu karakterizira oralna biološka raspoloživost koja je veća od približno 5%, izmjerena pokusom prihvatljive oralne biološke raspoloživosti. Općenito, pokusi kojima se daje prednost uključuju intraduodenalno davanje komponenata kandidata odgovarajućem pokusnom subjektu. Zatim se može dokazati i ponajprije utvrditi količinski raspoloživost spojeva u biološkom uzorku, ponajprije u uzorku krvi.

Daljnji spojevi kandidati kojima se daje prednost zadovoljavaju Lipinskijev propis od 5. U primjeni, on definira biološku raspoloživost. Prema tom propisu, manje od zadovoljavajuće apsorpcije je vjerojatnije ako jedna ili više slijedećih značajki karakterizira dotičan spoj kandidat: 1) više od 5 H-veza donora (izraženo kao zbroj OH i NH) , 2) molekulska masa iznad 500, 3) Log P je iznad 5, 4) više od 10 H-veza akceptora (izraženo kao zbroj N i 0) , i 5) dva parametra izvan područja su izbjegnuta u više izvedbi izuma.

Također, daljnji prednosni spojevi prema izumu su relativno postojani u krvnoj plazmi. Prihvatljiv pokus uključuje dodir željenog spoja kandidata s plazmom (na primjer serum glodavca, zeca ili primata), inkubaciju spoja s plazmom, i zatim dokazivanje i ponajprije brojčano utvrđivanje stabilnosti tog spoja tijekom vremena. Povoljni izvori plazme su štakori, psi, mačke, miševi, svinje, goveda i ljudi. Povoljan pokus, koji se ponekad naziva "standardni pokus postojanosti u plazmi", opisan je u PCT prijavi PCT/US 02/05773 (WO 02/077017). Tipične spojeve, koji pokazuju dobro djelovanje u pokusu, karkaterizira C-terminalna amidacija ili esterifikacija, upotreba D-amino kiselina i derivata prirodnih amino kiselina, N-terminalne modifikacije i cikličke strukture. Jedna modifikacija ili kombinacija takovih modifikacija može pojačati postojanost uz održavanje osnovnog biološkog djelovanja.

Posebno povoljni spojevi koji moduliraju polukanale za upotrebu prema predloženom izumu uključuju: Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (spoj 1); Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2 (spoj 2); i njihove soli.

Povoljni spojevi koji moduliraju polukanale pokazuju značajno djelovanje u jednom ili u kombinaciji standardnih in vitro i in vivo pokusa koji su ovdje opisani. Takovi spojevi također imaju sposobnost zatvaranja ili otvaranja polukanala i, prema potrebi, modulacije GJIC. Ponajprije, prikladan spoj pojačava ili smanjuje fosforilaciju koneksina 43 (C×43) utvrđenu standardnim pokusom in vitro fosforilacije koneksina. Pobliže, pokus praćenja fosforilacije i/ili defosforilacije jednog ili više tirozinskih, serinskih i treoninskih aminokiselinskih ostataka prikazan je na slici 1. Posebno povoljan pokus odvija se kako slijedi.

1) Uzgoj populacije pd pribl. 10 stanice u mediju kao što je konfluent ili polu-konfluent kardiomiocita štakora ili stanica H9c2,

2) izlaganje stanica stresu njihovim ispiranjem i zatim njihov uzgoj u mediju niskog sadržaja glukoze približno jedan sat ili manje,

3) dodavanje spoja 1 u medij do koncentracije od približno 0,1 do približno 200 nM na približno 10 minuta do osam sati,

4) liza stanice i zatim dokazivanje promjene fosforilacije tirozina, serina i/ili treonina u C×43 u usporedbi s prikladnom kontrolom; i

5) mjerenje promjene fosforilacije kao dokaza da taj spoj modulira funkciju polukanala.

U jednoj izvedbi postupka, stupanj detekcije 4) uključuje, nadalje, ispitivanje spoja kandidata u imunološkom pokusu ili u pokusu koji se temelji na razvrstavanju stanica. U slučaju da se primjenjuje imunološki pokus, on obično uključuje dodir stanica sa spojem kandidatom pod uvjetima koji su dovoljni za porast ili opadanje fosforilacije koneksina. Postupak ponajprije dalje uključuje proizvodnju lizata stanica; i detekciju porasta ili opadanja fosforilacije koneksima u staničnom lizatu. Taj porast ili opadanje se uzima kao daljnji dokaz da spoj modulira polukanal.

Imunološki pokusi, čijoj primjeni se daje prednost za ovaj postupak, opisani su i uključuju pokus imuno-precipitacije, pokus hvatanja antitijela, pokuse s dva antitijela u sendviču, pokuse hvatanja antigena, radioimunološke pokuse (RIA) i slično. Za raspravu o više standardnih imunoloških metoda, čiji opis je ovdje uvršten kao literatura, vidi općenito E. Harlow i D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Ausubel et al. (1989) u Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York.

Imunološki pokus kojem se daje prednost je ELISA. Tako u jednoj izvedbi gornji postupak nadalje uključuje najmanje jedan, a ponajprije sve slijedeće stupnjeve:

a) prevlačenje krute podloge s prvim antitijelom koje specifično veže koneksin, ponajprije koneksin 43 (C×43),

b) dodir staničnog lizata s krutom podlogom pod uvjetima za dobivanje kompleksa vezanja između prvog antitijela i koneksina,

c) dodir kompleksa vezanja prvog antitijela i koneksina s drugim antitijelom, pri čemu se dodir vrši pod uvjetima dovoljnim za tvorbu specifičnog kompleksa vezanja između drugog antitijela i bilo kojeg fosforiliranog koneksina u kompleksu vezanja prvog antitijela i koneksina,

d) dodir kompleksa vezanja prvog antitijela, koneksina i drugog antitijela s trećim antitijelom koje veže drugo antitijelo i koje je dokazivo obilježeno; i

e) dokazivanje prisutnosti trećeg, dokazivo obilježenog, antitijela na krutoj podlozi, kao daljnjeg dokaza spoja.

U jednoj izvedba metode, treće antitijelo postupka je dokazivo obilježeno s najmanje jednim sredstvom iz skupine koju čine biotin, FITC, TRITC, radioaktivan jod ili peroksidaza. U drugoj izvedbi, drugo antitijelo je anti-fosfotirozino antitijelo. Također u drugoj izvedbi, drugo antitijelo je anti-fosfoserinsko antitijelo. U nekim slučajevima, detekcija dokazivo obilježenog trećeg antitijela se vrši radioaktivnim ili gama scintilacijskim zbrajanjem.

U drugoj izvedbi u imunološkom postupku se za dokazivanje primjenjuje radioimunološki pokus (RIA). Ponajprije, takav RIA pokus uključuje najmanje jedan, a ponajprije sve slijedeće stupnjeve:

a) dokazivo obilježavanje stanica prije priprave staničnog lizata, pri čemu se obilježavanje vrši pod uvjetima provodijivim za obilježen fosforilirani koneksin, ponajprije koneksin 43 (C×43),

b) dodir staničnog lizata s antitijelom koje tvori specifičan kompleks vezanja s koneksinom,

c) odvajanje kompleksa vezanja od dokazivog obilježenog staničnog lizata; i

d) utvrđivanje obilježenog i fosforiliranog koneksina kao daljnjeg dokaza spoja koji modulira pukotinski spoj.

U jednoj izvedbi metode, antitijelo je anti-koneksinsko antitijelo. U drugoj izvedba, stupanj detekcije uključuje dalje provedbu pokusa Western imunoblota. RIA postupak je kompatibilan s velikim područjem dokazivih sredstava za obilježavanje, međutim za mnoge aplikacije prednost se daje davanju radioaktivnog anorganskog fosfora. Antitijela koja se upotrebljavaju u gornjem postupku prema izumu, koja uključuju anti-fosfotirozinska, anti-fosfoserinska i anti-C×43 antitijela su komercijalno dostupna iz raznih izvora, kao što je American Type Culture Collection (ATCC); Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; Zymed Lab, Inc. iz Kalifornije; i Amersham Biosciences, U.K.

Spojevi koji moduliraju polukanale, kojima se daje prednost i koji su identificirani gornjim standardnim in vitro ispitivanjem, pokazuju dobro svojstvo u smislu modulacije fosforilacije C×43, posebno na jednom ili više tirozinskih, serinskih i treoninskih ostataka prikazanih na slici 1. Još bolji od tih spojeva pokazuju najmanje 5%-tnu promjenu takove fosforilacije (mjerene kao porast opadanja u prisutnosti jednog ili više fosfotirozina, fosfoserina i/ili fosfotreonina na C×43), ponajprije najmanje približno 10%, još bolje najmanje približno 50%-tnu promjenu u usporedbi sa stanicama izloženim stresu u kojima je spoj prisutan koncentracijom između približno 0,1 nM do približno 200 nM.

Vidi donje primjere 2-5, posebno primjer standardnog pokusa in vitro fosforlacije koneksina.

Kao što je rečeno, izum također karakterizira standardni pokus in vitro utroška koji se može primijeniti za dokazivanje i prema potrebi za karakterizaciju spojeva koji moduliraju polukanal. Pokus se može primijeniti sam ili u kombinaciji sa standardnim pokusom in vitro fosforilacije koneksina. Posebna izvedba standardnog in vitro pokusa utroška je opisana kako slijedi.

1) Uzgoj u mediju populacije od pribl. 10 konfluenta ventrikularnih miocita štakora,

2) izlaganje stresu stanica zamjenom medija s medijem niskog sadržaja glukoze na manje od približno 2 sata, ponajprije približno 30 minuta,

3) dodavanje spoja 1 u medij do koncentracije od približno 0,1 pM do 100 nM,

4) dodavanje kalceinske boje u medij do koncentracije od približno 10 do približno 500 mikromola na manje od približno 2 sata, ponajprije na približno 30 minuta,

5) utvrđivanje promjene utroška kalceina u stanicama; i

6) mjerenje promjene koja je dokazuje da spoj modulira funkciju polukanala.

Stupanj detekcije promjene utroška kalceina može se provesti jednim postupkom ili s kombinacijom standardnih postupaka koji uključuju pretraživanje pod optičkim mikroskopom za fluoresciju i/ili srodne metode pretraživanja stanica. Vidi primjer 6 kao poseban primjer standardnog pokusa utroška in vitro.

Povoljni spojevi dokazani pomoću gornjeg standardnog pokusa utroška in vitro pokazuju najmanje približno 5%-tno opadanje vezanja boje (zatvaranje polukanala stanica) u usporedbi sa stanicama izloženim stresu, ponajprije najmanje približno 20%-tno opadanje, i još bolje, ponajprije najmanje približno 50%-tno opadanje u prisutnosti između pribl. 0,1 pM do 100 nM ispitnog spoja.

Kako je također već spomenuto, izum osigurava pokus određivanja volumena stanica in vitro, koji se može provesti sam ili u kombinaciji s jednim ili obadva standardna pokusa, in vitro fosforilacije koneksima i standardnog pokusa utroška in vitro. Posebna izvedba standardnog pokusa volumena stanica in vitro odvija se kako slijedi.

1) Uzgoj u mediju populacije konfluenta od približno 105 ventrikularnih miocita štakora,

2) opterećenje stanica s između od približno 0,5 do približno 100 mikromolova kalceina AM, ponajprije približno 5 mikromolova na manje od približno 2 sata, a ponajprije na približno 15 minuta,

3) određivanje voluma stanica utvrđivanjem, a ponajprije količinskim utvrđivanjem signala kalceina-AM,

4) dodavanje spoja 1 u medij do koncentracije od pribl. 0,01 nM do pribl. 100 nM,

5) izlaganje stanica stresu uzgojem u mediju niskog sadržaja glukoze,

6) određivanje promjene volumena stanica u usporedbi prema prikladnoj kontroli; i

7) mjerenje promjene koja je indikativna za spoj koji modulira funkciju polukanala.

Stupanj detekcije promjene volumena stanica može se provesti jednim postupkom ili kombinacijom standardnih postupaka koji uključuju lasersku konfokusnu mikroskopiju i/ili srodne metode pretraživanja stanica. Primjer 7 daje poseban primjer standardnog pokusa in vitro za određivanje volumena stanica.

Povoljni spojevi utvrđeni gornjim standardnim pokusom određivanja volumena stanica in vitro pokazuju najmanje približno 5%-tno opadanje volumena stanice (zatvaranje polukanala) u usporedbi sa stanicama izloženim stresu, ponajprije najmanje približno 20%-tno opadanje, i još povoljnije najmanje približno 50%-tno opadanje u prisutnosti između pribl. 0,01 nM do 100 nM ispitnog spoja.

Spojevi odabrani prema ovom pokusu inhibiraju protok osmolita kroz polukanale i pomažu održavanje normalnog volumena stanica tijekom uvjeta koji uzrokuju bubrenje. Važno je da je bubrenje stanica povezano s pogoršanjem perfuzije u organe okružene s fibroznom kapsulom (npr. srce, bubrezi, mišić kostura) ili kosti (mozak, spinalni kord} i zbog toga se spojevi koji imaju svojstva blokiranja polukanala mogu upotrijebiti za liječenje bolesti povezanih s bubrenjem stanica.

Prikladni kontrolni pokusi se općenito pripravljaju za primjenu u posebnom obliku pokusa. Na primjer, većina kontrolnih pokusa uključuje podvrgavanje ispitnog uzorka (npr. populacije uzgojenih kardiomiocita štakora) uvjetima bez stresa, kao što je inkubacija u mediju. Tipično umjesto spoja (spojeva) koji se želi ispitati, za pokus se paralelno ili odvojeno dodaje vodu, pufer, otopinu soli s fosfatnim puferom ili slično. Zatim se željeni pokus provodi u skladu s predloženim metodama. Specifični primjeri prikladnih kontrola dati su u dijelu s primjerima.

Provedba izuma kompatibilna je sa širokim spektrom konvencionalnih pokusa detekcije. Takovi pokusi se mogu provesti ručno, poluručno ili automatiziranom obliku, ako je potrebno. Za primjene u kojima su potrebna brza pretraživanja ili strategije pretraživanja u velikom opsegu, izum je dodatno kompatibilan sa standardnim metodologijama pretraživanja "visokog učinka" i/ili "ultra visokog učinka". Primjeri takovih postupaka uključuju imunološke pokuse i pokuse pretraživanja stanica kao što su ovdje opisani pokusi.

Kako je spomenuto, predloženi izum je kompatibilan sa širokim spektrom strategija ispitivanja. Tako se u nekim izvedbama daljnje ispitivanja spojeva kandidata provodi in vivo da se ispita i da se ponajprije potvrdi djelovanje u smislu modifikacije polukanala. Na primjer, jedan postupak ili kombinacija standardnih postupaka in vitro koji su ovdje opisani mogu se primijeniti za daljnje ispitivanje spojeva u pogledu djelovanja u smislu modifikacije polukanala po standardnom modelu in vivo aritmije. Standardni pokus in vivo aritmije miša, koji je dolje opisan u primjeru 1, opisali su B. Larsen et al. u PCT/DK 01/00127 (WO 01/62775) i PCT/US 02/05773 (WO 02/077017).

Spojevi kandidati identificirani s jednim ili s više postupaka prema izumu imaju mnogo važnih primjena, uključiv upotrebu uzoraka za identifikaciju pukotinskih spojeva i posebno polukanala u području stanica, tkiva i organa. Također, takovi spojevi se mogu upotrijebiti kao uzorci za detekciju pukotinskih spojeva i polukanala u raznim razvojnim i bolesnim stanjima, i kao uzorci za detekciju struktura s drugačijim ugljikohidratnim skupinama i/ili drugačijeg oblika fosforilacije. Takovi spojevi se mogu, nadalje, upotrijebiti kao komponente krute podloge za čišćenje komponenata pukotinskih spojeva u skladu sa standardnim kromatografskim postupcima.

Spojevi odabrani pomoću in vitro i/ili in vivo ispitivanja, koja su ovdje opisana, mogu se upotrijebiti kao lijekovi za prevenciju ili za liječenje stanja pogođenih s povećanim otvaranjem polukanala (povećana permeabilnost stanične membrane prema ekstracelularnim odjeljcima), npr. rane, kao što su opekline, tromboza, respiratorne i metaboličke acidoze, oticanje tkiva, npr. zbog bakterijskih otrova ili otrova iz okoline, i fokalnih aritmija. Drugi lijekovi izuma mogu se upotrijebiti za zaštitu stanica od naglih promjena volumena. Takove promjene se mogu olakšati s jednim faktorom ili s kombinacijom faktora koji uključuju prekomjernu toplinu, ishemiju, toksine, upalu, edeme, poremećaje elektrolita, povećane količine glukoze i dijabetičke kasne komplikacije. Također je moguće liječenje kronične atrijalne fibrilacije povezane s povećanom fosforilacijom serina. Dodatno, ovi spojevi se mogu upotrijebiti kao lijekovi za prevenciju, liječenje, ublažavanje ili smanjenje ozbiljnosti slijedećih stanja. Vidi također patentne prijave PCT/DK 01/00127 (WO 01/62775) i PCT/US 02/05773 (WO 02/077017).

Terapeutski postupci izuma općenito obuhvaćaju davanje terapeutski učinkovite količine jednog spoja ili kombinacije ovdje opisanih spojeva koji moduliraju polukanal subjektu kojem je potrebno takovo liječenje, kao što je sisavac, a posebno primat kao što je čovjek. Postupci liječenja prema izumu također obuhvaćaju davanje učinkovite količine spoja formule I ili II, kako su gore definirani, subjektu, posebno sisavcu kao što je čovjek kojem je potrebno takovo liječenje za ovdje opisane indikacije.

Tipični subjekti uključuju sisavce koji pate od jednog ili više poremećaja koji su ovdje navedeni i koji uključuju stanja koja su opisana ovdje dolje u dolomcima A-R.

A. Nervno tkivo

Dobro je poznato da su mikroglije glavni imunosni efektor središnjeg nervnog sistema (CNS) i da se one aktiviraju kao reakcija na široki raspon ozljeda koje uzrokuju upalne reakcije mozga, a koje uključuju ozljedu glave i ishemiju, neurodegenerativne bolesti, autoimunosne bolesti, infekcijske bolesti, bolesti koje uzrokuju prioni i tumori mozga. Aktivirane mikroglije migriraju u područje ozlijeđenog CNS-a, gdje se one umnažaju i postupno odstranjuju komadiće stanica. Eugenin et al. su pokazali da mikroglije mogu međusobno komunicirati preko pukotinskih spojeva koje uzrokuju upalni citokini (Eugenin, E A, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, sv. 98, 4190-4195, 2001). To je bilo pokazano u slijedećim pokusima.

Na ozljedama od moždanih uboda, mikroglije se progresivno akumuliraju tijekom nekoliko dana i nastali agregati, koji često pokazuju C×43 imunosno djelovanje na graničnim površinama između stanica. U primarnoj kulturi, mikroglije su pokazale niske količine C×43 utvrđene pomoću Western blota, difuzno intracelularno C×43 imunosno djelovanje, i nisku pojavu vezanja boje. Liječenje s imunostimulantom bakterijskim lipopolisaharidom (LPS) ili sa citokinom interferonom gama (INF gama) ili s tumorskim nekroznim faktorom alfa (TNF-alfa), jednom nije povećalo pojavu vezanja boje. Međutim, mikroglije liječene s INF gama zajedno s LPS-om pokazalo je dramatičan porast vezanja boje koji je bio spriječen istovremenom aplikacijom anti-TNF-alfa antitijela, iz čega se može zaključiti o oslobađanju i autokrinom djelovanju TNF-alfa. Liječenje s INF-gama zajedno s TNF-alfa također značajno povećava pojavu vezanja boje i količine C×43 s translokacijom C×43 za dodire stanica-stanica. S citokinom uzrokovano vezanje boje bilo je reversibilno inhibirano s 18-glicir-retinskom kiselinom, blokerom pukotinskog spoja. Uzgajane mišje mikroglije također su ekspresionirale C×43 i razvile su vezanje boje nakon liječenja s citokinima, ali mikroglije iz miševa s nedostatkom homozignog C×43 nisu razvile značajno vezanje boje nakon liječenje s INF-gama zajedno s LPS-om ili s INF-gama zajedno s TNF-alfa.

Prisilna ekspresija proteina pukotinskog spoja, koneksina, omogućuje da stanične linije s manjkom pukotinskog spoja šire intercelularne valove kalcija. Cotrina et al. su pokazali da se izlučivanje ATP-a iz slabo povezanih staničnih linija, C6 glioma, HeLa i U373 glioblastoma, pojačava s ekspresijom koneksina 5- do 15-struko. Ta opažanja dokazuju da signalizacija stanica-stanica, koja je povezana s ekspresijom koneksina, proizlazi iz pojačanog oslobađanja ATP-a posredovanog kroz koneksinske polukanale (Cotrina ML et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 Dec 22; 95(26): 15735-40; Cotrina et al.: J Neurosci 2000 Apr 15; 20(8): 2835-44). Osim toga, tijekom uvjeta metaboličkog stresa (npr. ishemija), s polukanalom posredovano oslobađanje ATP-a iz astrocita može loše djelovati na susjedne neurone i uzrokovati porast intracelularnog kalcija, koji, sa svoje strane, može dovesti do apoptoze i smrti neurona.

Na primjer, zbog fosforilacije C×43 tirozina sa spojem 1 i spojem 2, davanje ovih spojeva potpomaže zatvaranje polukanala i olakšava intercelularnu komunikaciju mikroglija i time pojačava ili ubrzava procese "ozdravljenja" u gore spomenutim bolestima (upalne reakcije mozga koje uključuju ozljede glave i ishemiju, neuro-degenerativne bolesti, autoimunosne bolesti, infekcijske bolesti, bolesti uzrokovane prionima i tumori mozga). Osim toga, za očekivati je da će zatvaranje polukanala spriječiti oslobađanje ATP-a i time smanjiti širenje primarne ozljede.

B. Plućno tkivo: stanice alveola

Intercelularna komunikacija alveola preko pukotinskih spojeva između stanica alveola je važna za napredovanje transporta iona, prijenos mehaničko-kemijskih signala, za regulaciju rasta stanica i izlučivanje površinski aktivnog faktora (Ashino Y, et al. (Am J Physiol Lung Mol Physiol 2000; 279: L5-L13)). In vivo oporavak nakon akutne i kronične upalne ozljede područja alveola u plućima uključuje stvaranje fibronektina kao dijela ekstracelularne matrice (Charash WE, et al. (Am RevRespir Dis 1993; 148: 467-476) i Torikata C, et al. (Lab Invest 1985; 52: 399-408)). Proučavanja uzgojenih epitelnih stanice alveola pokazala su povećan broj pukotinskih spojeva istovremeno s porastom koncentracije ekstracelularnog fibronektina (Alford AI, Rannels DE. (Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001; 280; L680-L688)). In vivo proučavanja na životinjama nakon ozbiljne upale pluća uzrokovane s dušikovim dioksidom pokazala su smanjen broj pukotinskih spojeva u tkivu alveola i u stijenkama terminalnih bronhiola, u alveolnim cjevčicama i u peribronhijalnim alveolama. Ti nalazi su bili ovisni o dozi. Međutim, s prethodnim liječenjem s taurinom, taj nestanak pukotinskih spojeva je bio spriječen zajedno s manje izraženim upalnim reakcijama. Slični nalazi su dobiveni nakon ozračivanja pluća štakora nakon liječenja s kemoterapeutskim spojem bleomicinom.

Tako se održavanje komunikacije preko pukotinskih spojeva u tkivu pluća čini važnim za sprečavanje plućne fibroze i za smanjenje količine koneksina kao reakcije na upalne procese na razne toksične poticaje, kao što je udisanje plina, destruktivnih tvari iz zraka i ozračivanje. Prethodno liječenje sa spojem prema izumu koji fosforilira C×43 tirozinske ostatke i olakšava zatvaranje polukanala i/ili otvaranje pukotinskog spoja ili komunikacije preko pukotinskog spoja može se pokazati potrebnim prije terapeutskog ozračivanja u slučaju da se izlažu pluća, npr. kod raka pluća, liječenja raka dojke, tiroide i raka ezofagusa.

Liječenje sa spojem koji olakšava ili koji posreduje zatvaranje polukanala i/ili otvaranje pukotinskog spoja spriječit će daljnje pogoršavanje funkcije pluća kod emfizsema, azbestoze, silikoze, plućne fibroze, pneumonitisa, plućne fibroze uzrokovane s lijekovima i kod pacijenata izloženih plinovima otrovnim za pluća, kao što je dušikov dioksid. Liječenje se pridodaje konvencionalnom liječenju takovih stanja. Spoj se može dati oralno, parenteralno, nazalno ili plućnom inhalacijom.

C. Glatki mišić

1. Vaskularni sistem

Intercelularna komunikacija kroz kanale pukotinskih spojeva ima temeljnu ulogu u regulaciji i modulaciji tonusa vaskularnih miocita u cijelom sistemu (Christ GJ, et al. Cire Res. 1996; 79: 631 - 646)). Druga važna uloga komunikacije kroz pukotinske spojeve je rasprostiranje hiperpolarizacije među stanicama glatkih mišića uključenih u reakciju vaskularne relaksacije (Benny JL, et al. Physiol Heart Circ Physiol 1994; 266: H1465-72)).

Specijalne funkcije endotela zahtjevaju intercelularnu komunikaciju kroz pukotinske spojeve između endotelnih stanica unutar monosloja i između endotela i drugih stanica koje su prisutne u stijenci krvne žile. Komunikacija između tih različitih tipova stanica putem pukotinskih spojeva u koronarnim kapi1arama kao i u svira drugim krvnim žilama bila je dokumentirana u nekoliko studija. Također su bili pokazani i dokazi o uključenosti u adaptivnu arteriogenezu (Cai W-J, et al. J Mol Cell Cardiol 2001; 33:957-67), Wang H-Z, et al., Am J Physiol Cell Physiol. 2001; 281: C75-SS), Schuster A, et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001; 280: HI 088-96)).

U različitim vaskularnim patofiziološkim stanjima u kojima je prekinut endotelni monosloj, kao kod hiper-holestrolnih lezija uzrokovanih posebnim režimom prehrane, komunikacija putem pukotinskog spoja je smanjena u vaskularnim glatkim mišićima (Polacek D, et al., J Vaše Res 1997; 34: 19-30). Ozljedu na endotelnom celularnom sloju vidi se tijekom venske staze i kod razvoja tromboflebitisa. Kwak BR, et al., Molec Biol Cell 2001; 12: 831-845 su jasno pokazali da komunikacija puteni pukotinskog spoja služi za koordinaciju migracije stanica tijekom oporavka endotela i ona je također važna za izbijanje kapilara tijekom angiogeneze.

Liječenje sa spojevima izuma koji olakšavaju zatvaranje polukanala i/ili komunikaciju putem pukotinskog spoja poboljšati će pogoršanu intercelularnu komunikaciju u pogođenom vaskularnom području i bit će posebno korisno tijekom ishemije organa, npr. kod privremene klaudijacije i miokardijalnog infarkta.

Međutim, nakon ozljede balona karotide štakora s kateterom, proces vaskularnog ozdravljenja je karakteriziran s povećanom komunikacijom putem pukotinskog spoja (Yeh HI, et al. Arterioscle Thromb Vase Biol 1997; 17:3174-84). Prikladan spoj prema izumu dat će se prije intervencije na balonu, a ponajprije kao dodatna terapija uz liječenje tog stanja s konvencionalnim lijekom. Davanje spoja vrši se ponajprije parenteralno. Učinak se može ispitati na uzorku tkiva prije ozljede balona s kateterom i u različito vrijeme nakon toga. Brže ozdravljenje površine endotela može se vidjeti pomoću običnog mikroskopa. Također se može pronaći i poboljšanje komunikacije putem pukotinskog spoja. Vidi također Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997; 17: 3174- 84).

2. Erektilna disfunkcija

U Corpus cavernosum sincitijalna celularna mreža se uspostavlja preko pukotinskih spojeva i ona je kritična za erektilnu funkciju i osigurava da korporalne i arterijske glatke mišićne stanice penisa reagiraju na ujednačen i koordinirani način (Christ GJ. (Int J Impot Res. 2000; 12 suppl. 4:S15-25), Melman A, Christ JC. (Urolog Clin North America, 2001; 28:217-31)). Poremećena erektilna funkcija se vidi kod dijabetesa, arterioskleroze, raznih neuroloških bolesti i kod mnogih kroničnih bolesti. Iz proučavanja dijabetesa, inverzna korelacija između jačanja živaca i intercelularnog povezivanja ukazuje na moguću funkcionalnu plastičnost korporalnog okruženja, iako nije utvrđena funkcionalna intercelularna komunikacija preko pukotinskog spoja.

Liječenje sa spojem koji olakšava zatvaranje polukanala i/ili otvaranje pukotinskog spoja poboljšat će komunikaciju preko pukotinskog spoja i time će normalizirati složenu koordinaciju između stanica glatkih mišića u corpus cavernosum-u i u krvnim žilama.

In vivo farmakološko ispitivanje erektilne funkcije spojeva može se ispitati 10 tjedana nakon dijabetesa uzrokovanog sa streptozotocinom (35 mg/kg i. p.) na štakorima (starim 8 tjedana) kako su opisali Rehman J, et al. (Am J Physiol 1997; 272: H1960-71). Refleksi penisa i intrakavernog tlaka su mjereni tijekom lokalnog i sistemskog davanja različitih doza različitih spojeva koji moduliraju polukanale s mjerama i tehnikama koje je opisala ista skupina istraživača. Mogao se je vidjeti porast u refleksa penisa i intrakavernog tlaka od 25% ili viši.

Liječenje erektilne disfunkcije može se provesti davanjem lokalno u tijelo penisa, supkutanom injekcijom ili oralno. Liječenje može biti monoterapija ili dodatno uz konvencionalno liječenje tog stanja.

3. Inkontinencija

Glatke mišiće u mokraćnom mjehuru karakteriziraju fazne kontrakcije i pokazivanje spontanih faznih kontrakcija. Međutim mjehur u zdravom stanju može sadržavati nekoliko stotina mililitara urina, a da ne pokazuje povećan intravezikalan pritisak. Suprotno normalnom mjehuru, nestabilan mjehur razvija spontani porast intravezikalnog pritiska povezanog s potrebom inkontinencije (Turner WH, Brading AF. (Pharmacol Therap. 1997; 75: 77-110). U usporedbi s gastrointestinalnim glatkim mišićem, glatki mišić mjehura ne stvara spontano koordinirane kontrakcije (Stevens RJ, et al. (Am J Physiol. 199; 2777: C448-60), Hashitani H, et al. (J Physiol. 2001; 530: 273-86)). U novije vrijeme su dokazana obadva načina komunikacije, odnosno električna i morfološka komunikacija preko pukotinskih spojeva između stanica glatkog mišića u mjehuru (Hashitani H. et al., (J. Physiol, 2001; 530: 273-86), Wang H-Z, et al., (Urology, 2001; Suppl. 6A: 111). Važnost tih pukotinskih spojeva je pokazana pomoću specifične inhibicije komunikacije. Valovi spontane pobude glatkog mišića mjehura šire se kroz pukotinske spojeve.

Nekontrolirana potreba za inkontinencijom regulirat će se toga liječenjem sa spojevima koji zatvaraju polukanal ili koji otvaraju pukotinski spoj. Aplikacija se može provesti parenteralno, oralno ili u mokraćni mjehur. Lijek se daje ponajprije kao dodatak uz liječenje s lijekovima predviđenim za normalizaciju kontrakcija mišića mokraćnog mjehura.

Mioepitelne stanice, kao što su one prisutne u supmandibularnim kanalima žlijezda, u ureteru, u žučnim kanalima, kanalima pankreasa i u suznim kanalima, povezane su preko pukotinskih spojeva i intercelularna komunikacija je bitna za sinhromizaciju funkcije kontrakcije mioepitelnih stanica (Taugner R, Schiller A. (Cell Tissue Res. 1980; 206: 65-72). Poremećena kontraktilnost tih kanala može se normalizirati liječenjem sa spojevima koji zatvaraju polukanale ili sa spojevima koji otvaraju pukotinski spoj, koji se daju parenteralno ili oralno.

D. Zacjeljivanje

Profilaktički učinak liječenja sa sredstvom koje zatvara polukanal ili sa sredstvom koje otvara pukotinski spoj, kao što su spoj 1 i spoj 2, može se ispitati pokusom opisanim u eksperimentalnom dijelu, a koji su opisali Yeh HI, et al. (Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997; 17:3174-84). Spoj 1 ili spoj 2 može se dati prije intervencije u balonu primjenom doziranja u rasponu od 10-11 do 10-8 ovisno o biološkoj kinetici spoja, utvrđenoj npr. pomoću gore opisanog modela aritmije izazvane s kalcijevim kloridom. Uzorak tkiva se može uzeti prije i u različito vrijeme nakon ozljede balona s kateterom. Brže zacjeljivanje površine endotela vidi se s konvencionalnim mikroskopom. Spoj se može dati npr. parenteralno.

Napredovanje zacjeljivanja u nizu preklapanja faza započinje s hemostazom (koagulacija). Druga faza procesa zacjeljivanja je kaskada upalnih reakcija kad se mikrofagi akumuliraju na mjestu ozljede i započinje stvaranje granulacijskog tkiva koje između ostalih komponenata uključuje fibroblaste i limfocite. Epitelne stanice tada započinju migraciju s ruba ozljede prema pokrivenom području. Kapilarno izbacivanje od normalnog tkiva u ranu je također uključeno da se osigura dotok nutrijenata, kisika i različitih stanica. Sve stanice i kapilarne stanice endotela imaju živu intercelularnu komunikaciju preko pukotinskih spojeva (Abdullah KM, et al. (Endocrine. 1999; 10:35-41). Područja s niskim dotokom kisika i/ili s visokom koncentracijom slobodnih radikala, koja se često vide u ozljedama s nekrotičnim tkivom, kod dijabetesa, kod arterioskleroze, u kirurškim ranama, edemima, infekcijama, opeklinama i kod venske insuficijencije, snizuju komunikaciju putem pukotinskih spojeva (Nagy JI, et al., Cell Growth Diff. 1996; 7:745-51)).

Liječenje sa spojevima koji zatvaraju polukanale ili sa spojevima koji otvaraju pukotinske spojeve osigurava maksimalnu komunikaciju putem pukotinskog spoja između različitih stanica za koju se smatra da ima važnu ulogu u složenom procesu oporavka i stoga oni unapređuju zacjeljivanje ozljede. Spoj se daje lokalno, površinski, sistemski ili oralno.

E. Dijabetska retinopatija

Dijabetska retinopatija može se dijagnosticirati vrlo rano nakon pojave bolesti identifikacijom promjena u brzini protoka krvi (Bursell S-V., et al. (Curr Eye Res. 1992; 11: 287-95), pucanje krvno-retinalne pregrade (Cunha-Vaz JG, et al. (Br J Ophthalmol. 1975; 59: 649-56), Do Carmo A, et al. (Exp Eye Res. 1998; 67: 569-75)) i/ili gubitkom samokontrole (Kohner EM, Patel V, Rassam SMB, (Diabetes 1995; 44: 603-607)). Koristeći transport obaju tragača i tehnike flastera dvostrukog stezanja stanica, Oku H, et al. (Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42: 1915-1920) su pokazali ekstenzivno povezivanje stanice sa stanicom. Zatvaranje staza pukotinskih spojeva prekida multicelularnu organizaciju retinalnih kapilara i doprinosi diabetskoj disfunkciji retinalnih krvnih žila. Zhou ZY, et al. (Neuroscience, 2001; 102: 959-67) su nadalje pokazali da je reaktivan kisik uključen u nepovezivanje retinalnog pukotinskog spoja i u ponovno povezivanje kad se dovede glutation.

Sredstva koja zatvaraju polukanal kod dijabetske retinopatije mogu se proučavati in vitro pomoću modela dijabetesa štakora uzrokovanog sa streptozotocinom, kako je gore opisano. Svježe izolirane retinalne kapilare (Sakagami K, et al., J Physiol (Lond). 1999; 521: 637-50) se prenesu na pokrovno staklo, kako su opisali Oku H, et al. (Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42: 1915-1920). Na ovom pripravku intercelularnu komunikaciju između stanica u stijenci krvne žile mjeri se pomoću boje ili pomoću tragača. Mogu se ispitati različite koncentracije u rasponu od 10-10-10-7 M spojeva izuma, mogu se ispitati npr. spoj 1 ili spoj 2 koji otvara pukotinski spoj i kod dijabetske retine vidi se značajan porast intercelularne komunikacije u usporedbi s osnovnom vrijednošću. Slično poboljšanje vidi se u usporedbi s kontrolom (zdrave životinje). Liječenje može biti sistemsko, lokalno ili oralno. Terapiju se ponajprije pridodaje konvencionalnom antidijabetskom liječenju.

Ne samo za dijabetsku retinopatiju, već također i za druge vaskularne nenormalnosti u retini, kao na primjer arteriosklerozu, bit će korisno povećano zatvaranje polukanala ili poboljšanje komunikacije putem pukotinskog spoja liječenjem sa spojem koji potpomaže fosforilaciju Cx tirozina. Spoj se daje parenteralno.

F. Kardijalni poremećaji

1. Atrijalno-ventrikularna (AV) blokada

Intercelularna komunikacije u kardijalnom av čvoru se održava preko pukotinskih spojeva. Smanjena funkcija dovodi do opadanja provodljivosti i može dovesti do potpune a-v blokade.

AV blokada se vidi kod akutnog miokardijalnog infarkta, kod ishemijskih bolesti srca, kod intoksikacije s digitalisom, kod intoksikacije s blokerom kalcijevog kanala i spoj koji zatvara polukanal će poboljšati av provodijivost. Davanje spoja koji zatvara polukanal treba biti parenteralno ili oralno.

2. Atrijalna fibrilacija

Nao et al. 2001 su pronašli opadanje serinske fosforilacije koneksina 40 u miokardijalnim stanicama pacijenata koji su patili od kronične atrijalne fibrilacije (AF). Poznato je, da je opadanje serinske fosforilacije koneksina povezano s nepovezivanjem stanica, što može dovesti do AF. Ako je to stanje kronične AF također karakterizirano i s opadanjem tirozinske fosforilacije koneksina, tada liječenje sa spojem kao što je spoj 1 ili 2 ovdje može povećati tirozinsku fosforilaciju, zatvaranje polukanala, otvaranje kanala pukotinskih spojeva i odstranjivanje uzroka za AF.

3. ishemijske/reperfuzijske ozljede

Tijekom regionalne ishemije, srce je izloženo metaboličkom stresu koji uzrokuje bubrenje stanica, što sa svoje strane povećava pritisak tkiva i smanjuje perfuziju u graničnu zonu ishemije tkiva. Vjeruje se da smanjenje perfuzije u graničnu zonu ishemije doprinosi postupnom širenju infarkta, što je povezano s daljnjim pogoršanjem kardijane funkcije. Kao što je prikazano u primjerima 7 i 8, spoj 1 sprečava bubrenje stanica tijekom ishemije, smanjuje veličinu infarkta i sprečava pogoršavanje kardijalne funkcije nakon miokardijalnog infarkta.

Osim toga, koronarna perfuzija se ponovno stabilizira kod pacijenata s miokardijalnim infarktom davanjem trombolitičnog sredstva ili perkutanom transluminalnom koronarnom angioplastijom (PTCA). Iako je uspostavljanje protoka krvi preduvjet za miokardijalno spašavanje, sama reperfuzija može dovesti do dodatne ozljede tkiva nakon one koja je nastala zbog same ishemije - to je poznato kao "reperfuzijska ozljeda". Mehanizmi koji se preporučaju, a koji doprinose reperfuzijskoj ozljedi su mnogi, i oni uključuju preopterećenje s radikalima bez kisika, miokardijalnu ozljedu posredstvom neutrofila, intracelularno preopterećenje s kalcijem i promjene u osmotskom okruženju (Wang et al., Cardiovasc Res. 2002 Jul; 55(1) : 25-37, Review).

Prepoznato je da se osmolarnost tjelesnih tekućina strogo kontrolira tako da većina stanica ne doživljava iskustvo promjena osmotskog tlaka pod normalnim uvjetima, već se osmotske promjene mogu pojaviti u patološkim stanjima kao što je ishemija, septički šok i dijabetska koma. Prva posljedica promjene osmolarnosti je nagla promjena volumena stanice. Ako se osmolarnost oko stanice smanjuje, stanica bubri, a ako se povećava, stanica se skuplja. Da bi se promjene osmolarnosti podnijele, stanice su razvile mehanizam regulacije volumena koji se pokreće s izazivanjem osmotskog tlaka za normalizacijom volumena stanice i održavanjem normalne funkcije. U srcu, osmotski stres se susreće tijekom perioda miokardijalne ishemiije kad se metaboliti, kao što je laktat, akumuliraju intracelularno i do određenog stupnja ekstracelularno, i uzorkuju bubrenje stanice. To bubrenje može dalje pogoršati reperfuziju kad se hiperosmotski ekstracelularni milje zamijenji s krvi normalnog osmotskog tlaka i to čak može uzrokovati pucanje membrane kardijalne stanice (Wright AR, Rees SA.: Pharmacol Ther. 1998 Oct; 80(1): 89-121. Review). Stoga se vjeruje da spojevi odabrani prema predloženom izumu mogu spriječiti miokardijalno oštećenje tijekom reperfuzije, npr. pomoću mehanizma koji je sličan učinku opisanom u primjeru 7 (slika 9A).

K tome, objavljeno je da tijekom općenito korištenog PTCA postupka, aterosklerotični plak puca, što uzrokuje mikroembolizaciju u mikrocirkulaciji distalno od mjesta PTCA postupka, što je povezano s ubrzanim napredovanjem otkazivanja srca i povećanom smrtnošću, Henriques JP et al.: Eur Heart J 2002 Jul; 23(14): 1112-7). Kako se vidi u primjerima 7 i 8, spoj 1 sprečava bubrenje stanica tijekom ishemije, smanjuje veličinu infarkta i sprečava pogoršavanje kardijalne funkcije nakon miokardijalnog infarkta i ta svojstva spojeva smanjuju ozljede tijekom reperfuzije.

S tim u skladu, izum osigurava postupak citoprotekcije tkiva ili organa sisavca kojem je potrebno takovo liječenje. U jednoj izvedbi, postupak uključuje davanje terapuetske količine najmanje jednog spoja odabranog između spojeva koje prikazuju formule I i II. S izrazom "citoprotekcije" misli se na smanjenje, sprečavanje ili na ublažavanje simptoma povezanih s neželjenim bubrenjem stanica. Posebna tkiva i organi kojima koristi taj postupak uključuju one koji su zatvoreni ili su drugačije pogođeni s fibroznom kapsulom, kao što je srce ili burezi. Također su uključena i tkiva povezana s kostima kao što je mozak, kičmena moždina i koštana srž.

U jednoj izvedbi, postupak nadalje uključuje izlaganje tkiva ili organa sisavca ishemijskim uvjetima kao što su ovdje opisani. Primjer je srce pod infarktom (srčani napad) kad je ishemija povezana sa slabim bubrenjem miokardijalnih stanica. U jednoj izvedbi, takovo bubrenje se može smanjiti ili izbjeći davanjem sisavcu najmanje jednog od slijedećih spojeva: Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (spoj 1) i Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2 (spoj 2).

Kako je opisano, postupak prevencije ili liječenja reperfuzijskih ozljeda sisavaca također je osiguran s izumom. U jednoj izvedbi, postupak uključuje davanje terapuetski učinkovite količine najmanje jednog spoja odabranog iz skupine koju čine spojevi koje prikazuju formule I i II. U još specifičnijoj izvedbi, postupak nadalje uključuje srce sisavca pod uvjetima infarkta. Po toj metodi poželjno je uspostaviti koronarnu perfuziju, tipično što je moguće brže. U nekim izvedbama, postupak nadalje uključuje davanje trombolitičnog sredstva (npr. aktivator plasminogena tkiva ("TPA")) ili provedbu koronarne angioplastije da se olakša koronarnu perfuziju u srcu pod infarktom. U jednoj izvedbi, spoj je najmanje jedan od slijedećih: Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (spoj 1) i Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2 (spoj 2).

G. Imunologija: dozrijevanje stanica

Interakcije stanica-stanica imaju presudnu važnost za dozrijevanje i aktiviranje limfocita. Široka napetost molekula membrane osigurava intercelularnu adheziju i omogućuje signalizaciju stanica-stanica tijekom migracije i aktivacije stanica u imunosnom sistemu. Cirkulacijski humani T, B i NK limfociti ekspresioniraju C×43 i aktivni pukotinski spojevi između stanica su dokazani primjenom postupaka s obojenjem, kako je ranije opisano. Također je dokazano da opadanje intercelularnog povezivanja preko pukotinskog spoja značajno smanuje izlučivanje IgM, IgG i IgA, što pokazuje da je intercelularna signalizacija preko pukotinskih spojeva važna komponenta mehanizma na kojem se temelji metabolička suradnja u imunosnom sistemu (Oviedo-Orta E, et al., (Immunology. 2000; 99: 578-90), Oviedo-Orta E, et al. (FASEB. 2001; 15: 768-774)).

Kod supkronične ili kronične upale, lokalni porast sinteze imunglobulina je poželjan neovisno o etiologiji. Tijekom upale tkivo je često različito od normalnog zdravog tkiva i niski napon kisika uzrokuje pucanje intercelularne komunikacije putem pukotinskog spoja. Važnost niskog kisika za pucanje GJIC bilo je dokazano u nekoliko različitih sistema stanica, iz čega se može zaključiti da je napon kisika univerzalni regulator za GJIC. Spomenuto pucanje posljedica je promijenjene tirozinske i/ili serinske i/ili treoninske fosforilacije koneksina u kanalu pukotinskog spoja i davanje spoja izuma, kao što je spoj 1 ili 2 prema izumu suprotstavit će se tom djelovanju, zatvoriti polukanale i ponovno uspostaviti GJIC.

H. Poboljšavanje GJIC

Postoje načelno dva načina za održavanje GJIC i to držanje otvorenog kanala pukotinskog spoja ili olakšavanjem ograđivanja polukanala. Kod liječenja ili prevencije bolesnih stanja karakteriziranih s prisutnošću ishemijskih uvjeta, preporučaju se i povoljna su obadva načina.

U primarnim kulturama neonatalnih ventrikularnih kardiomiocita štakora, oduzimanje kisika i glukoze dovodi do opadanja stimulacije fosfinositola (PI) uzrokovane s noradrenalinom čak za pribl. 50% od razine pod normalnim uvjetima atmosfere i prehrane. Pokazalo se je da spoj 1, koji modificira pukotinski spoj, normalizira tu pogoršanu stimulaciju PI uzrokovanu s noradrenalinom tijekom oduzimanja kisika i glukoze ponovnim podizanjem PI na pribl. 90% od normalne razine. Osim toga, pokazalo se je da spoj 1 ne mijenja razinu PI promjene uzrokovanu s noradrenalinom tijekom normalnih uvjeta atmosfere i prehrane (Meier, E i Beck, M M: 2001 International Gap Juncition Conference, Aug 4-9, 2001, Hawaii, USA, sažetak br. 132). Također, u kulturana uzgajanih humanih osteoblasta i u staničnim linijama osteosarkoma osteoblastičnih štakora, hipoksija smanjuje intracelularno širenje kalcijevog vala, što je izmjereno kao prijenos boje nakon injekcije Lucifer žutog. To opadanje se može potpuno preokrenuti liječenjem sa spojem 1 (Teilmann, S C, et al.: 2001 International Gap Juncition Conference, Aug 4-9, 2001, Hawaii, USA, sažetak br. 176).

Zbog celularne nepovezanosti tijekom upale, na primjer, spoj koji zatvara polukanale i otvara pukotinske spojeve poboljšat će sintezu imunoglobulina tijekom upale.

I. Periferna neuropatija i neuropatska bol

Objavljeno je da periferna neuropatija i bol, koje se susreću kod dijabetesa, tijekom dijalize, kod ciroze jetre i u mnogo drugih okolnosti, uključuju kako somatske, tako također i autonomne živce. Točan mehanizam periferne ozljede živca pod raznim uvjetima se još istražuje, ali destrukcija živčanih završetaka, opadanje provodljivosti, demijelinacija i povećana upalna reakcija su već bile opisane. Općenito, pod raznim uvjetima u postavljenim pokusima bio je opažen porast slobodnih radikala, porast dušičnog oksida, stres kisika i nedostatak sredstva za vezanje slobodnih radikala i zabilježeno je smanjenje komunikacije putem pukotinskih spojeva (Pitre DA, et al. (Neurosci Lett. 2001; 303: 67-71), Bolanos JP, Medina JM. (J Neurochem. 1996; 66: 2019-9), Low PA, Nickander, KK. (Diabetes, 1991; 40: 873-7), Levy D, et al. (Neurosci Lett. 1999; 260: 207-9), Bruzzone R, Ressot C. J Eur Neurosci. 1997; 9: 1-6)). Stoga, dakle, spojevi izuma koji potpomažu zatvaranje polukanala fosforilacijom koneksina polukanala bit će korisni za liječenje periferne neuropatije. Davanje će biti parenteralno.

J. Slab sluh

Zna se da su šumovi uzrokovani gubitkom sluha, presbikuza, povezani s proizvodnjom slobodnih radikala usmjerenih za inhibiciju povezivanja preko pukotinskih spojeva između Hensenovih stanica i Deitersovih stanica iz Corti's-ovih organa u pužnici (Todt I, et al. (J Membrane Biol. 2001; 181: 107-114), Blasits S, et al. (Phlugers Arch. 2000; 440: 710-12), Lagostena L, et al. (J Physiol. 2001; 531:693-707)). Komunikacija putem pukotinskog spoja između tih nosećih stanica pužnice osigurava važnu homeostazu za senzorske stanice i time normalno neuronsko djelovanje vanjskih stanica uha (Johnstone BM, et al. (J Physiol 1989; 408: 77-92)). Ta je komunikacija prekinuta tijekom oksidacijskog stresa (Todt I, et al., (J Membeane Biol. 2001; 181: 107-114). Stečen ili starošću uzrokovan gubitak sluha spriječit će se liječenjem sa spojem koji povećava fosforilaciju tirozinskih ostataka u koneksinskim polukanalima (zatvaranje polukanala) i održavanjem komunikacije pukotinskog spoja u nosećim stanicama. Odgovarajući spoj izuma može se dati parenteralno.

Melanociti u području tamnih stanica vestibularnih organa su komunikacijski otežani preko pukotinskog spoja i mogu imati ulogu u prenošenju materijala između endolimfe i perilirafe i također mogu biti važni za održavanje homeostaze mikrookruženja u unutarnjem uhu (Masuda M, et al. (Anat Rec. 2001; 262; 137-146)). Endolimfni edem je povezan s raznim kliničkim stanjima koja karakterizira vrtoglavica i oslabljen sluh.

Opadanje sposobnosti komunikacije pukotinskog spoja može biti važno za regulaciju transmembranskog transporta nekoliko tvari koje se izvorno izlučuju ili cijede preko specifičnih tipova transportera.

K. Anemija ovisna o starosti i transplantacija koštane srži

Postojanje funkciolanih pukotinskih spojeva između hematopojetskih progenitorskih stanica i stroma stanica hematopojetskog mikrookruženja bilo je mnogo godina dvojbeno, međutim sada su studije potvrdile postojanje komunikacije humanih pukotinskih spojeva (Rosendaal M, et al., Tissue Cell, 1991; 23: 457-470), Dilrig J, et al. (Brit J Haematol. 2000; 111: 416-25)). Također se je pokazalo da je komunikacije dvosmjerna, što podržava hipotezu da stroma stanice kontroliraju proliferaciju hematopojetskih progenitorskih stanica, ali i to da se također njihovo funkcionalno stanje može regulirati s nerazvijenim hematopojetskim stanicama (Gupta P, et al. (Blood. 1998; 91: 3724-3733)).

U starosti funkcionalnost hematopojetskog tkiva opada i kod starijih ljudi se često susreće anemiju. Smanjena sposobnost hematopojetskog tkiva se također vidi kod hematoloških malignancija i nakon liječenja s kemoterapeutskim sredstvima. Za sprečavanje pancitopenije koristi se transplantaciju koštane srži od darovatelja.

Učinak spoja izuma koji potpomaže zatvaranje polukanala i/ili olakšava komunikaciju putem pukotinskog spoja proučavan je na prethodno obrađenim štakorima izloženim visokoj dozi ciklofosfamida. U tim životinjama koštana srž je prestala proizvoditi zrele hematopojetske stanice. Broj retikulocita u različitim vremenskim intervalima nakon ciklofosfamida značajno je viši u životinjama koje su prethodno primile spoj 1 za fosforilaciju koneksinskog tirozina s dozom od pribl. 100 μl 10-10 M do pribl. 10-0 M spoja 1 u usporedbi sa životinjama koje nisu bile prethodno obrađene na isti način. Davanje odgovarajućih spojeva izuma je parenteralno.

L. Hipofunkcija hipofize i hipotalamusa

Hormoni prednje hipofize pokazuju promjenu ritma izlučivanja unutar minuta, sati, dana i sezona. Dio živčanog sistema koji je odgovoran za većinu 24-satnog ritma lokaliziran je prema paru struktura u hipotalamusu i poznat je kao suprahijasmatska jezgra. U tom središtu ovaj biološki sat je svojstven za pojedinačne stanice. Međutim koordinirano električno djelovanje prema susjednim stanicama posredovano je preko komunikacije putem pukotinskih spojeva (Colwell CS, (J Neurobiol. 2000; 43: 379-88)). Budući da također i prednjoj hipofizi nedostaje izravna inervacija, komunikacija stanica-stanica posredovana s pukotinskim spojem unutar žlijezde mora biti nužna za pravilnu koordinaciju stanica-stanica i sinhronizaciju potrebnu da se na vrijeme osigura pravilno izlučivanje hormona (Vitale ML et al., (Biol Reporo. 2001; 64: 625-633)). Guerineau NC et al. (J Biol Chem. 1998; 273: 10389-95) su zaključili da su spontano aktivne endokrine stanice pojedinačne jedinice ili su složene u sinhronizirani sklop povezan s pukotinskim spojem potpuno raširen kroz prednju hipofizu. Sinhronost između stanica, koje se mogu spontano pobuditi, može pomoći oblikovanju načina bazalne sekrecije. U prednjoj hipofizi sintetiziraju se hormon rasta, prolaktin, adrenokortikalni hormon, tiroidni hormon i gonadotropinski hormon pod kontrolom hormona koji stimulira hipotalamus. Jedan od mehanizama u narušavanju te složene hipotalamus-hipofiza-endokrine žlijezde unutar jedne od osi je stoga također povezan sa smanjenjem komunikacije putem pukotinskih spojeva. Bolesti su dijabetes insipidus, hipogonadotropni hipogonadizam, miješani edem, adrenokortikoidna hipofunkcija i patuljast rast. Liječenje s prikladnim spojem izuma, ponajprije sa spojem koji otvara pukotinski spoj, može poboljšati simptome.

Također neuroni u suprahijazmatičnoj jezgri hipofize su ovisni o optimalnoj komunikaciji pukotinskog spoja. U gore spomenutoj osi otvarač pukotinskog spoja s načinom djelovanja u tom području bit će također koristan za pacijente s poremećenim ritnom cirkadijana (Shinohara K. et al., (Neurosci Lett. 2000; 286: 107-10).

M. Renovaskularna hipertenzija i nefrotoksičnost

Bubrežni i pukotinski spojevi koji su specifični za endotel su obimno prekinuti u bubrezima nađenim u glomerulama, tubulusu i vaskulaturi uključiv intra-glomerularne kapilare i juksaglomerularne arteriole (Haefliger J-A, et al. (Kidney Int. 2001; 60:190-201)). U toj studiji autori su dokazali prisutnost pukotinskih spojeva koji povezuju stanice arteriola koje vode prema središtu i koje izlučuju renin. Uloga pukotinskih spojeva može doprinijeti detekciji i propagaciji signala svojstvenih krvi, kao što su oni koje uzrokuje povećan krvni tlak. Unutar bubrega, takovi signali se moraju pretvoriti u autokrine, parakrine i endokrine stimulacije s endotelnim stanica aferentnih arteriola i prenijeti u stanice koje izlučuju renin. Komunikacija preko pukotinskih spojeva ima stoga važnu ulogu u stvaranju međusobno spojenog jukstaglomerularnog aparata. Brzo otvaranje za tijesne prolaze kanala pukotinskih spojeva uključuje dalje brzu reakciju na lokalne vaskularne promjene osiguravajući trajnu povratnu vezu potrebnu za spajanje glomerularne i tubularne funkcije, kao također i izlučivanja renina prema fiziološkim potrebama. Bolesti koje karakterizira pogoršana renalna komunikacija putem pukotinskog spoja mogu se korisno liječiti sa spojem izuma, ponajprije sa specifičnim otvaračem pukotinskog spoja koji se može dati oralno ili parenteralno.

Teški metali su nefrotoksični i oni uzrokuju renalne ozljede. Dokazano je da toksični metali kadmij (Fukumoto M, et al. (Life Sciences. 2001; 69: 247-54)) kao i živa (Yoshida M, et al. (Arch Toxicol. 1998; 72: 192-96)) u primarnim staničnim kulturama proksimalnog tubulusa odvajaju pukotinske spojeve i obje skupine autora navode na zaključak da je renalna disfunkcija povezana sa smanjenom intercelularnom komunikacijom. Liječenje otrovanja s teškim metalima sa spojem koji fosforilira koneksinski tirozin smanjit će oštećenje tkiva i spriječiti napredovanje propadanja tkiva.

In vitro ispitivanje se može provesti u staničnim kulturama stanica tubulusa i mogu se istražiti spojevi (spoj 1 ili spoj 2 koncentracije pribl. 10-10 – 10-7 M) koji sprečavaju odvajanje pukotinskog spoja kad se on izloži teškim metalima. Komunikacija pukotinskog spoja se može ispitati postupkom s Luciferovom boju kako je ranije opisan.

Nakon sistemskog davanja teških metala pokusnim životinjama (štakori) renalnu funkciju se izmjeri upotrebom 3H-inzulina kao markera bistrine za brzinu glomerularne filtracije, sa 14C obilježenog tetraetilamonija kao markera bistrine za protok renalne plazme i litija kao markera za proksimalnu tubularnu funkciju (Petersen JS, et al., J. Pharmacol. Esp. Ther. 1991, 258: 1-7) prije i nakon različitog vremena kronične obrade s teškim metalima. Kronično liječenje sa specifičnim spojem izum, kao što je spoj 1, započinje kad se uspostavi renalna funkcija, a značajno poboljšanje parametara renalne funkcije (brzina glomerularne filtracije i krvni tlak) vidi se nakon liječenja. Odgovarajući spoj izuma daje se parenteralno.

Ne-infekcijska upala kao i infekcije s različitim mikrobima uzrokuju značajne nespecifične kronične promjene renalne funkcije koje također karakterizira smanjena brzina glomerularne filtracije, opadanje izlučivanja elektrolita i vode i promjene krvnog tlaka. Neki od tih simptoma se također dobro liječe sa specifičnim spojem koji forforilira koneksinski tirozin i simptomi nestaju.

N. Razvoj i oblikovanje zubi

Murakami S i Muramatsu T (Anat Embrvol. 2001; 203: 367-374) su potvrdili ranije studije da komunikacija putem pukotinskog spoja postoji između odontoblasta i da se celularno djelovanje koordinira preko tih intercelularnih mostova (Iguchi Y, et al. (Arch Oral Biol. 1984; 29: 489-497)), ali u njihovoj novijoj studiji oni također pokazuju da su te komunikacije putem pukotinskih spojeva prisutne tijekom ranog razvoja zubi (pre-odontoblast) kao također i u odontoblastima u mladosti i u starim odontoblastima. Stanice pulpe koje se nalaze ispod odotoblasta također imaju pukotinske spojeve. To otkriće pokazuje da je intercelularna komunikacija putem pukotinskog spoja važna kako tijekom razvoja zubi, tako također i tijekom života kad se zubi oblikuju ili rastu.

Liječenje sa spojem izuma koji fosforilira koneksin, kao što je spoj 2, koji se može ispitati in vitro u pogledu učinka na intercelularnu komunikaciju odontoblasta pokusom koji je uglavnom sličan ovdje opisanom pokusu sa osteoblastima, normalizirat će poremećen razvoj zubi. Liječenje također olakšava oblikovanje zubi i čini ih otpornijim prema karijesu.

O. Hranidbene stanice

Lumelsky et al (2001) su proizveli stanice koje ekspresiniraju inzulin i druge pankreasne endokrine hormone iz mišjih embrionih hranidbenih stanica. See Nadya Lumelsky et al. u Differentiation of Enabryonic Stem cells to Insulin-Secreting Structures Similar to Pancreatic Islets. Science, 292, 1389-1394, 2001). Stanice se same slažu tako da tvore trodimenzionalne grozdove slične topologije kao kod normalnih pankreasnih otočića, gdje su tipovi pankreasnih stanica usko povezani s neuronima. Glukoza izaziva oslobađanje inzulina iz tih grozdova mehanizmom koji je sličan onom koji se koristi in vivo. Kad se ubrizgaju u dijabetične miševe, stanice koje proizvode inzulin se brzo podvrgavaju vaskularizaciji i zadržavaju grozdastu organizaciju sličnu otočićima. U kliničkom smislu, taj sistem embrionih hranidbenih stanica omogućuje simultano stvaranje i slaganje tipova otočića stanica koje izlučuju inzulin i drugih tipova otočića stanica za koje se zna da imaju važnu ulogu u regulaciji izlučivanja inzulina u funkcionalne strukturne jedinice. Te jedinice mogu osigurati materijal za optimiranje proizvodnje inzulina i za analizu fine kontrole homeostaze glukoze. Embrione hranidbene stanice su idealne za te studije, jer se genetička sredstva mogu upotrijebiti za definiranje molekularne osnove razvoja i funkcije otočića. Mogućnost za terapiju na osnovi stanice je naravno privlačan cilj za aplikacije koje uključuju humane i ne-humane embrione hranidbenih i embrione razvojne stanice. Odraslo tkivo također biti koristan izvor funkcionalnih pankreasnih stanica. Različiti sistemi koji su ovdje opisani mogu osigurati izvor funkcionalnih pankreasnih otočića za liječenje dijabetesa. To je prvo izvješće koje pokazuje da se nekoliko tipova stanica endokrinog pankreasa može proizvesti iz embrionih hranidbenih stanica in vitro. Iako pankreasni otočići dobiveni iz lesa mogu funkcinirati u jetri nakon usađivanja, i dalje ostaje problem koji treba riješiti, a to je odbacivanja tkiva i dostupnost. Jasno je da inženjering embrionih hranidbenih stanica za proizvodnju bogatog izvora imunokompatibilnog tkiva za presađivanje predstavlja rastuće obećanje za savladavanje ovog i drugih problema povezanih s dijabetesom. Miokardijalni infarkt dovodi do gubitka tkiva i pogoršavanja kardijalne funkcije. Preostali miociti ne mogu ponovno konstituirati nekrotično tkivo, i srce nakon infarkta s vremenom slabi. Ozljeda ciljnog organa se osjeća preko udaljenih hranidbenih stanicama, koje migriraju na mjesto oštećenja i podvrgavaju se promijenjenoj diferencijaciji; taj događaj potiče strukturan i funkcionalan oporavak. Taj visok stupanj platičnosti hranidbenih stanica je potaknuo Orlic-a et al. (Nature 410, 701-705 (2001)) da ispitaju da li se mrtav miokardij može oporaviti transplancijom stanica koštane srži miša s infarktom. Oni su odvojili linije negativnih (Lin-) stanica koštane srži iz transgenih miševa koji ekspresioniraju pojačani zeleni fluorescentni protein sa stanicama aktiviranim za fluorescenciju razvrstavanjem na osnovi ekspresije c-kita. Kratko nakon koronarne ligacije, stanice Lin-c-kitPOS su ubrizgane u graničnu kontrahiranu stijenku infarkta. Pronašli su novo oblikovani miokardij zauzet 68% od dijela pogođenog infarktom ventrikule 9 dana nakon transplantacije stanica koštane srži. Razvijeno tkivo sadržavalo je strukture koje proliferiraju miocite i krvne žile. Njihove studije pokazuju da lokalno isporučene stanice koštane srži mogu proizvesti de novo miokardij, ublažavajući ishod bolesti koronarne arterije.

Za karakterizaciju daljnjih svojstava ovih miocita, oni su odredili ekspresiju koneksina 43. Taj protein je odgovoran za intercelularne veze i električno povezivanje stvaranjem kanala plazma membrane između miocita; koneksin 43 se vidi u staničnoj citoplazmi i na površini tijesno poravnatih stanica koje se diferenciraju. Ti su rezultati bili u skladu s očekivanom funkcionalnom kompetencijom fenotipa mišića srca.

Budući da funkcionalne stanice nastaju iz embrionih hranidbenih stanica, i budući da se koneksini stvarno ekspresioniraju u tim stanicama u srčanom tkivu pod infarktom, vjeruje se da će to biti slučaj i za druge stanice diferencirane od embrionih hranidbenih stanica. Budući da koneksini imaju glavnu ulogu u funkciji tih tkiva (koja uključuju pankreasne beta stanice i mišićne stanice srca), spojevi izuma kao što je spoj 1 i spoj 2 koji povećavaju fosforilaciju koneksinskog tirozina i zatvaranje polukanala (što za posljedicu ima također povećanu komunikaciju pukotinskog spoja) oni povećavaju proliferaciju embrionih hranidbenih stanica u funkcionalne stanice u organima u koje se ugrade hranidbene stanice.

Predmet izuma je stoga osigurati spojeve koji fosforiliraju koneksinski tirozin, kao što je spoj 1 i spoj 2, za stimulaciju prijelaza hranidbenih stanica u funkcionalne stanice u transplantiranim organima, kao što je pankreas za liječenje dijabetesa melitusa, srca za liječenje srčanog infarkta, i bazalnih ganglija mozga za liječenje Parkinsonove bolesti.

Općenito se vjeruje da će ovi spojevi ubrzati difencijaciju hranidbenih stanica, što može ubrzati procese izlječenja svih organa kao što je srce, mozak, koža, kosti, pankreas, jetra i drugi unutrašnji organi. Pokusi se mogu provesti primjenom općih sistema pokusa s infarktom miokarda kako su gore opisali Orlić et al, s davanjem spoja 1 i spoj 2, na primjer, ponavljajući tijekom procesa proliferacije. Vjeruje se da će ti pokusi pokazati porast ekspresije koneksina 43 sa spojem 1 i spojem 2 ili brže procese regeneracije.

P. Rak

1. Napredovanje tumora

Tijekom geneze tumora, prekid fiziološke interakcije normalnih stanica s njihovim susjednim stanicama i gubitak značajki diferencijacije su opća karakteristike napredovanja tumora. Vjeruje se da promjena komunikacije pukotinskog spoja spada među najranije promjene tijekom tumorogeneze stanice (Wolburg H, Rohlmann A. Int Rev Citol. 1995; 157: 315-73), Klaunig JE, Ruch RJ. 1990; 135-46)).

Kyung-Sun Kang, et al. (Cancer Letters 166 (2001) 147-153) su pokazali da prethodna i ko-inkubacija epitelnih stanica jetre štakora obrađenih s GeO2 u TPA poništava podregulaciju GJIC-a s TPA, što navodi na zaključak da se tvar koja uspostavlja inhibiciju GJIC-a može upotrijebiti za prevenciju ili inhibiciju napredovanja tumora. Suzuki J, Na H-K, et al. (Nutrition and Cancer, vol 3 6, br. 1, str. 122-8) su pokazali da dodatak hrani lambda-karaginana inhibira GJIC u epitelnim stanicama jetre štakora, slično kao kod dobro dokumentiranog promotora tumora forbol estera (TPA), i stoga može imati ulogu u karcinogenezi kao sredstvo za napredovanje tumora. Stoga, dakle, spojevi predloženog izuma mogu se upotrijebiti za prevenciju ili za liječenje raka uzrokovanog sa sredstvom koje potiče tumor, kao što je TPA i lambda-karaginan.

2. Otpornost prema osjetljivosti na lijekove

Povećana komunikacija pukotinskog spoja poboljšava mikrookruženje tumora. See Chen et al.: Chem Biol Interact 1998 Apr 24; 111-112: 263-75.

3. Metastaze

Gubitak intercelularne komunikacije pukotinskog spoja povezan je s visokom mogućnošću za metastaze u svim vrstama raka s mogućnostima metastaziranja (Saunders MM, et al.Calicel-Res. 2001; 61:1765-1767), Nicolson GI, et al. Proc. Natl Acad Sci USA. 1988; 85: 473-6)). Prevencija metastaziranja uspostavlja se liječenjem sa spojem koji fosforilira koneksinski tirozin, što pomaže očuvanju komunikacije pukotinskog spoja u tumorima. Liječenje se pridodaje uz konvencionalnu kemoterapiju.

Vjeruje se da davanje terapeutski učinkovite količine jednog spoja ili kombinacije spojeva izuma (npr. spoj 1 ili spoj 2) može spriječiti ili izliječiti rak.

Q. Različite stanice

Pukotinski spojevi također imaju važnu ulogu u intercelularnoj komunikaciji, proliferaciji i diferencijaciji stanica želučane sluznice. Sredstvo koje otvara pukotinski spoj stimulirat će regenerativne procese nakon izazvane ozljede (Endo K, et al. (J Gastroenterol Hepatol. 1995; 10: 589-94)).

Cito-arhitektura stanica meniskusa ovisi djelomično o komunikaciji pukotinskog spoja. Fibrokartilažni dio meniskusa kao i fibrokartilažna struktura tetiva ovisi o intercelularnoj komunikaciji. Tijekom ozljede sredstvo koje otvara pukotinski spoj poboljšat će brzinu oporavka.

R. Epilepsija

Može biti poželjno liječiti bolesno stanje kao što je epilepsija, koju karakterizira nenormalno visok GJIC, sa sredstvom koje otvara polukanal, ponajprije kao dodatna terapija da se omogući vezanje lijeka ili malih regulatorskih molekula koje služe za odvajanje kanala pukotinskog spoja.

Cilj predloženog izuma je osigurati postupke za liječenje ili prevenciju jedne ili više medicinskih indikacija ili stanja koja su ovdje opisana. Tipično, ali ne isključivo, takovi postupci će uključiti davanje najmanje jednog od gornjih spojeva, ponajprije jednog te istog spoja, količinom koja je dovoljna za liječenje, prevenciju ili smanjenje ozbiljnosti indikacije ili stanja.

Spojevi kojima se daje prednost odabrani su pomoću jednog ili više ovdje opisanih pokusa in vitro i in vivo. Posebno, strategije davanje, što je očigledno stručnjaku za ovo područje, mijenjaju se ovisno npr. o spolu, težini, općim zdravstvenim i specifičnim indikacijama ili o stanju koje se želi liječiti ili prevenirati. Kao što je spomenuto, spojevi koji su ovdje opisani mogu se upotrijebiti samo kao aktivno sredstvo postupkom prema izumu. Alternativno, oni se mogu primijeniti kao "dodatne" terapije kao što su one u kojima se ovi spojevi upotrebljavaju zajedno s propisanim konvencionalnim postupkom liječenja. Indikacije ili stanja koja će se liječiti ili prevenirati u skladu s izumom i kojima se daje prednost općenito su povezana s pogoršanjem celularne komunikacije ili s pogoršanom funkcijom pukotinskog spoja. Pobliže, specifične indikacije i stanja, na koja se odnosi izum, su gore spomenuta.

Za postupke liječenja u skladu s izumom može se upotrijebiti jedan ili više ovdje opisanih spojeva kao jedino aktivno sredstvo. Ponajprije se upotrebljava jedan od spojeva. Po želji, takovi spojevi se mogu upotrijebiti profilaktički, tj. za sprečavanje ili za smanjenje ozbiljnosti posebne indikacije ili stanja. Alternativno, spojevi se mogu upotrijebiti zajedno s poznatim terapeutskim pristupom. Kao što je prikazano u izvedbama liječenja od ozračivanja, općenito se daje prednost postupku liječenja koji se "pridodaje" tj. koji se primjenjuje zajedno s poznatom terapijom za liječenje tog stanja. Takovi "dodatni" postupci liječenja prema izumu mogu se provesti istovremeno s potrebnom poznatom terapijom ili u različito vrijeme. Prihvaćeni terapeutski pristupi za razne bolesti i medicinske uvjete su bili opisani. Vidi, općenito, na primjer, Harrison's Principles of Internal Medicine (1991) 12 izd., McGraw-Hill, Inc. i The Pharmacological Basis of Therapeutics (1996), Goodman, Louis S. 9. izd. Pergammon Press, što je ovdje uvršteno kao literatura.

Koncentracija jednog ili više spojeva za liječenje u terapeutskom sastavu mijenja se ovisno o brojnim faktorima koji uključuju doziranje spoja koji će se dati za modulaciju polukanala, kemijska svojstva (npr. hidrofobnost) upotrijebljenog sastava, i predviđen način i put davanja. Općenito jedan ili više spojeva koji moduliraju polukanal mogu se pripraviti u vodenoj fiziološkoj otopini pufera koja sadrži približno 0,1 do 10% masa/volumen spoja za parenteralno davanje.

Jasno je da će se stvarne povoljne količine aktivnih spojeva upotrijebljenih za datu terapiju mijenjati npr. prema specifičnom upotrijebljenom spoju, posebno o formuliranom sastavu, o načinu davanja i o karakteristikama subjekta, npr. o vrsti, spolu, težini, općem zdravlju i starosti subjekta. Optimalne brzine davanja za dati protokol davanja stručnjak može lako utvrditi pomoću uobičajenih pokusa za utvrđivanje doziranja, koji se provode uz uvažavanje prethodnih smjernica. Prikladna područja doziranja mogu uključiti od približno 1 μg/kg do približno 100 mg/kg tjelesne težine dnevno ("terapeutski učinkovita količina").

Terapeutski spojevi izuma su prikladni za davanje u protoniranom i u obliku topivom u vodi, tj. kao farmaceutski prihvatljiva sol, obično kiselinska adicijska sol, kao što je anorganska kiselinska adicijska sol, npr. hidrokloridna, sulfatna ili fosfatna sol, ili kao organska kiselinska adicijska sol, kao što je acetatna, maleatna, fumaratna, tartaratna ili citratna sol. Farmaceutski prihvatljive soli terapeutskih spojeva izuma također mogu uključiti metalne soli, posebno soli alkalijskih metala, kao što je natrijeva sol ili kalijeva sol; soli zemno alkalijskih metala kao što je magnezijeva ili kalcijeva sol; amonijeve soli kao amonijeva ili tetrametilamonijeva sol; ili aminokiselinske adicijske soli kao što je sol lizina, glicina ili fenilalanina. K tome, prikladne soli su dolje navedene.

Posebno, spojevi prema izumu koji moduliraju polukanal upotrebljavaju se u obliku farmaceutski prihvatljive sol, alkil estera, amida, alkilamida, dialkilamida ili hidrazida nastalog sa C-terminalnom karboksilnom kiselinskom funkcionalnom skupinom linearnog spoja ili sa slobodnom karboksilnom kiselinskom funkcionalnom skupinom, ako je ona prisutna u cikličkom spoji. Amidi i niži alkil amidi linearnih spojeva spadaju među spojeve izuma kojima se daje prednost. Soli uključuju farmaceutski prihvatljive soli, kao što su kiselinske adicijske soli i bazične soli. Primjeri kiselinskih adicijskih soli su već bili opisani i oni uključuju hidrokloridne soli, natrijeve soli, kalcijeve soli, kalijeve soli, itd. Primjeri bazičnih soli su soli u kojima je kation odabran između alkalijskih metala, kao što je natrij i kalij, zemno alkalijskih metala, kao što je kalcij, i amonijevih iona +N(R3)3(R4), gdje R3 i R4 neovisno označavaju prema potrebi supstituirani C1-6-alkil, prema potrebi supstituirani C2-6-alkenil, prema potrebi supstituirani aril, ili prema potrebi supstituirani hetero-aril. Drugi primjeri farmaceutski prihvatljivih soli jesu npr. one soli koje su opisane u Remington's Pharmaceutical Sciences 17. izd. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 i novija izdanja, te u Encyclopedia of Pharmaceutical Technology.

U terapeutskim postupcima izuma, spoj za liječenje se može dati subjektu na više načina. Na primjer, spoj koji modulira polukanal, odabran pomoću jednog ili više datih pokusa in vitro i/ili in vivo, može se dati profilaktički za sprečavanje pojave ili za smanjenje ozbiljnosti ciljanog stanja. Alternativno, spoj se može dati tijekom ciljanog stanja.

Spoj za liječenje može se dati subjektu sam ili u kombinaciji s jednim ili više terapeutskih sredstava, kao farmaceutski sastav u mješavini s uobičajenim pomoćnim sredstvima, tj. farmaceutski prihvatljivim organskim ili anorganskim nosećim tvarima koje su prikladne za parenteralnu, enteralnu ili intranazalnu aplikaciju, koje ne reagiraju štetno s aktivnim spojevima i koje nisu štetne za pacijenta. Prikladni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na vodu, otpine soli, alkohol, biljna ulja, polietilen glikole, želatinu, laktozu, amilozu, magnezijev stearat, talk, silicijevu kiselinu, viskozan parafin, mirisno ulje, monogliceride i digliceride masnih kiselina, petroetralne estere masnih kiselina, hidroksimetil-celulozu, polivinilpirolidon, itd. Farmaceutski pripravci se mogu sterilizirati i po želji pomiješati s pomoćnim sredstvima, kao što su npr. lubrikanti, konzervansi, stabilizatori, sredstva za kvašenje, emulgatori, soli za mijenjanje osmotskog tlaka, puferi, bojila, začini i/ili aromatske tvari i slično, koje ne reagiraju štetno s aktivnim spojevima.

Takovi sastavi se mogu proizvesti za parenteralno davanje, posebno u obliku tekućih otopina ili suspenzija; za oralno davanje, posebno u obliku tableta ili kapsula; intranazalno, posebno u obliku pudera, nazalnih kapljica ili aerosola; vaginalno; površinski npr. u obliku kreme; rektano npr. kao čepići; itd.

Farmaceutska sredstva mogu se dati uobičajeno u obliku jediničnog doziranja i mogu se proizvesti bilo kojim dobro poznatim postupkom u farmaceutskoj struci, npr. kako je opisano u Remingtora's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. , Easton, Pa., 1980). Formulacije za parenteralno davanje mogu sadržavati uobičajena pomoćna sredstva kao što je sterilna voda ili otopina soli, polialkilen glikole kao što je polietilen glikol, ulja biljnog porijekla, hidrogenirane naftalene i slično. Posebno, biološki kompatibilan, biološki razgradijiv laktidni polimer, laktid/glikolidni kopolimer, ili polioksietilen-polioksi-propilenski kopolimeri mogu biti korisna pomoćna sredstva za kontrolu oslobađanja određenih spojeva prema izumu koji moduliraju polukanal.

Drugi mogući korisni parenteralni sistemi za isporuku uključuju etilen-vinil acetatne kopolimerne čestice, osmotske pumpe, infuzijske sisteme koji se mogu ugraditi i liposome. Formulacije za inhalacijsko davanje kao pomoćna sredstva sadrže, na primjer, laktozu, ili to mogu biti vodene otopine koje sadrže, na primjer, polioksietilen-9-lauril eter, glikoholate i deoksiholate, ili uljne otopine za davanje u obliku nazalnih kapljica, ili u obliku gela za intranazalnu aplikaciju. Formulacije za parenteralno davanje mogu također uključiti glikoholate za bukalno davanje, metoksisalicilate za rektalno davanje, ili limunsku kiselinu za vaginalno davanje. Drugi sistemi isporuke donose terapeutsko sredstvo (sredstva) izravno na mjesto kirurškog zahvata, npr. nakon angioplastije balona, spoj koji modulira polukanal može se dati pomoću stenta.

Kratice i formule

U opisu i u patentnim zahtjevima koriste se kodovi od tri slova za prirodne amino kiseline, kao također i općenito prihvaćeni troslovni kodovi za druge a-amino kiseline, kao što je sarkozin (Sar), a-amino-izo-butanska kiselina (Aib), naftilalanin (Nal) uključiv 1-naftilalanin (INal) i 2-naftilalanin (2Nal), fenilglicin Phg, 2,4-di-aminobutanska kiselina (Dab), 2,3-diaminopropanska kiselina (Dapa) i hidroksiprolin (Hyp). Ako nije navedeno ništa drugo, tada Hyp predstavlja 4-hidroksiprolin. Prirodne ili esencijalne amino kiseline su aminokiselinski konstituenti proteina. Aromatske amino kiseline su Phe, Tyr, Trp, INal, 2Nal i His. Ako L ili D oblici nisu posebno označeni, podrazumijeva se da dotična amino kiselina ima prirodni L oblik, vidi Pure & Appl. Chem. Vol. 56(5), str. 595-624 (1984). Ako nije navedeno ništa posebno, podrazumijeva se da C-terminalna amino kiselina spoja izuma postoji kao slobodna karboksilna kiselina, a to se može također označiti i kao "-OH". C-terminalna amino kiselina spoja izuma može se prikazati kao ona koja ima terminalnu funkcionalnu skupinu "-OH/NH2", što znači da postoje dva oblika spoja kojima se daje prednost: slobodna karboksilna kiselina i amidatni derivat.

Ako nije navedeno drugačije, koriste se slijedeće specifične definicije: ASAL se odnosi na 4-azido-saliciloilni radikal; AB se odnosi na 4-azidobenzoilni radikal; Fmoc se odnosi na 9-fluorenilmetiloksikarbonilni radikal; Ac se odnosi na acetilni radikal. Ako nije navedeno drugačije, u predloženom opisu se koriste slijedeće definicije: Acm se odnosi na acetamidometilni radikal; T4c se odnosi na radikal L-tiazolidin-4-karboksilne kiseline; Pc se odnosi na radikal L-pipekolinske kiseline; DNP se odnosi na dinitrofenil; DBF je definiran kao 2-aminoetil-6-dibenzofuranpropionska kiselina; Acm se odnosi na acetamidometil; i Sar se odnosi na sarkozinilni radikal; funkcionalna skupina DNP je hapten (djelomični antigen) za prepoznavanje antitijela, i spojevi izuma koji sadrže skupinu DNP mogu se upotrijebiti povoljno kao istraživački alati.

Za dodatne informacije vidi također PCT/DK 01/00127 (WO 01/62775) i PCT/US 02/05773 (WO 02/077017).

Svi citirani dokumenti ovdje su uvršteni kao literatura. Slijedeći primjeri služe za prikaz izuma.

Usporedbeni primjer 1

Standardni pokus in vivo aritmije na mišu

Antiaritmijski učinci mogu se ispitati provedbom modela aritmije na mišu izazvane s kalcijem.

Ukratko, antiaritmijski učinci spojeva mogu se ispitati modelom in vivo aritmije izazvane s kalcijem u skladu s postupkom koji su opisali J.J. Lynch, R.G. et al. u J Cardiovasc. Pharmacol. 1981, 3 49-60. Miševi (25-30 g) su anestetizirani s neuroleptičnom kombinacijom anestetika (Hypnorm® (fentanil citrat 0,315 mg/ml i fuanizon 10 mg/ml) + midazolam (5 mg/ml)). Komercijalne otopine Hypnorma i midazolama se razrijede 1:1 u destiliranoj vodi i jedan dio razrijeđenog Hypnorma se pomiješa s jednim dijelom razrijeđenog midazolama.

Anestezija je izazvana pomoću s.c. date doze od 0,05-0,075 nl/10 grama miša. U repnu venu je umetnuta i.v. kamila. Olovo II ECG signal je bilježen kontinuirano pomoću elektrode za ECG od nehrđajućeg čelika postavljene na desnom prednjem limbu i na lijevom stražnjem limbu. Osnovna elektroda je stavljena na desni stražnji limb. Signal je pojačan (× 5.000-10.000) i filtriran (0,1-150 Hz) preko modula Hugo Sachs Electronic modela 689 ECG.

Analogan signal je digitaliziran preko ploče za skupljanje podataka od 12 bitova (Data Translation model DT321) i uzorci su uzeti pri 1000 Hz pomoću programa Notocord HEM 3.1 za Windows NT. Nakon perioda ekvilibracije od 10 minuta, u repnu venu je ubrizgan ispitni uzorak lijeka. Miševi koji su prethodno primili vehikl, ispitani su kao mjera kontrolne razine u neliječenim životinjama. Ubrizgani volumen je bio 100 μl u svim pokusima. Infuzija CaCl2 (30 mg/ml, 0,1 ml/min ≈ 100 mg/kg/min (kalcijev klorid-2-hidrat, Riedel-de Haen, Njemačka)) je započeta 3 minute nakon i. v. datog lijeka ili vehikla. Vremenski period do uspostavljanja 2. stupnja AV-bloka utvrđen je kao vrijeme od početka infuzije CaCl2 do pojave prvog slučaja aritmije. Slučaj 2. stupnja AV-bloka je definiran kao privremeni pad AV provodljivosti karakteriziran s P valom bez konkomitantnog QRS kompleksa.

Reakcije su izražene u usporedbi s vremenom do pojave 2. stupnja AV-bloka kod miševa koji su primili vehikl. Zbrojen je maksimalan učinak svake ispitane tvari.

Posebniji postupci za utvrđivanje spojeva kandidata s dobrim djelovanjem u smislu modifikacije pukotinskog spoja uključuju nadalje odabir spojeva kandidata koji produljuju vrijeme do uspostavljanja izazvanog atrijalnog ventrikularnog (AV) blokiranja za najmanje približno 20% (rezultat najmanje 2) u standardnom pokusu in vivo aritmije na miševima. Spojevi kojima se daje prednost pokazuju u pokusu produljenje vremena do uspostavljanja izazvanog AV blokiranja (rezultat najmanje 3) od najmanje približno 60%. Slijedeći primjeri daju funkcionalan pokus koji pokazuje sposobnost spoja 1 da otvora kanale pukotinskog spoja i zatvara polukanale u neonatalnim kardiomiocitima štakora. Tako se, dakle, može dobiti različitu regulaciju GJIC-a fosforilacijom tirozina polukanala i kanala pukotinskog spoja.

Primjer 1

Antiaritmijski spojevi

Spojevi upotrijebljeni prema izumu uključuju Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (spoj 1) i Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2 (spoj 2) . Spojevi su sintetizirani prema standardnom postupku sinteze na krutoj fazi kako je opisano u WO 01/62775. Daljnji primjer spojeva koji se mogu upotrijebiti prema izumu su trans-resveratrol i CAPE (fenetil ester kafeinske kiseline).

Metode za pripravu spojeva su već bile opisane. Vidi npr. patentne prijave PCT/DK 01/00127 (WO 01/62775) i PCT/US 02/05773 (WO 02/077017).

Primjer 2

Analiza metaboličkog stresa izazvanog odstranjivanjem glukoze

Kardijalne aritmije se mogu uzrokovati poremećajem stvaranja i poremećajem provodijivosti akcijskog potentijala. Širenje akcijskog potencijala od stanice do stanice posredovano je s intercelularnim pukotinskim spojevima. Ti pukotinski spojevi se sastoje od kanala, koji su građeni od naročitih proteina koji se zovu koneksini. Postoji nekoliko linija dokaza koji pokazuju da smanjena ekspresija i/ili poremećena razdioba koneksina može pogoršati širenje normalnog impulsa i stoga može biti aritmogeno. Jedan primjer su promjene koje se vide tijekom i nakon ishemije. Vjeruje se, uglavnom, da tijekom akutne ishemije nepovezivanje stanica uzrokuje intracelularno zakiseljavanje, porast intracelularnog Ca2+, smanjenje intracelularnog ATP-a i povišene koncentracije acil-karnitina dugačkog lanca i masnih kiselina [1,2]. Nakon akutne faze ishemije, dolazi do njihovog ponovnog oblikovanja, pri čemu je promijenjena arhitektura površine pogođene infarktom i granica njezine zone. To ponovno oblikovanje je povezano s površinama poremećenog koneksina i razvoja krugova ponovnog ulaznog potencijala, za koje se vjeruju da djeluju kao aritmogeni supstrati [3]. In vivo i in vitro studije su pokazale da skupina antiaritmijskih peptida može usporiti i inhibiarti uspostavljanje aritmije, a kasnije studije su pokazale da ti peptidi povećavaju električno povezivanje između stanica [2].

A. Metode

1. Kultura stanica

Ukratko, srca iz 20 neonatnih štakora (starosti 1-2 dana) su izvađena aseptično. Ventrikule su izolirane i izrezane na 4-6 komadića, koji su probavljeni s tripsinom i DNA-zom u nekoliko stupnjeva u Hanksovoj otopini puferiranoj sa solima. Stanice su zatim centrifugirane i ponovno suspendirane u MEM s 5 % FCS. Za odstranjivanje ne-mišićnih stanica suspenzija je prethodno držana u Petrijevim zdjelicama 30 minuta pri 37°C. Stanice u suspenziji su zatim posađene na pokrovna stakalca prevučena s kolagenom. Gustoća sadnje je podešena tako da se dobiju konfluentne kulture.

2. Elektrofiziologija

Pokrovna stakalca s konfluentnim kardiomiocitima su montirana u otvorenu komoru na držaču invertnog mikroskopa i superfuzionira s Dulbeccovom fosfatno puferiranom otopinom soli (PBS) gravitacijski tjeranog protoka pri 1 ml/min, 37°C. Otopina (PBS) sadrži (u mM) : Na+ 152, K+ 4,2, Cl- 141,5, PO43- 9,5, Ca2+ 0,9, Mg2+ 0,5, pH 7,4. Pipete stisnute s flasterom su povučene od 1,5 mm staklenih kapilara (GC150F-15, Harvard Apparatus) na nosač za mikroelektrode Sutter Flaming-Brown P-87 i polirane s vatrom na otpor od 4-6 MW. Pipete su napunjene s otopinom koja je slična intracelularnoj otopini i koja je sadržavala u mM; K+ 150, Na+ 15, Cl- 5, glukonat" 150,2, EGTA 5, HEPES 5, Ca2+ 2 mM, Mg2+ 1/6, pH 7,2.

Postav stisnut s flasterom sastojao se je od sinkroniziranog diskontinuiranog pojačala (SEC-05LX, NPI electronics) i podaci su digitalizirani pomoću INT-10 sučelja (NPI electronics) i ploče PC1200 za skupljanje podataka (National Instruments) . Signali struje i napona su filtrirani za niski prolaz pri 1 kHz pomoću unutarnjih filtera pojačala i digitalizirani su pri 10 kHz.

Stanica je prinesena s elektrodom pomoću mikromanipulatora PatchMan 5173 (Eppendorf). Kad je dobiven dodir sa stanicom (koji se vidi po iznenadnom porastu ulaznog otpora) priključeno je odsisavanje dok se nije uspostavila konfiguracija Giga čepa. Zatim je priključen kratki impuls odsisavanja do pucanja membrane pod pipetom. Zatim je pojačalo postavljeno na stezaljku sa strujom nula za praćenje napona membrane.

Za pomicanje kulture upotrijebljen je mali razmak (1 cm) od bipolarne platinske elektrode. Kašnjenje između umjetnog stimulansa i pojave akcijskog potencijala u pokrpanoj stanica je tada mjera brzine provodljivosti.

Stanice su prane s kontrolnom otopina s 0,1 g/l BSA sve dok je uspostavljen postojan osnovni razmak između stimulansa i aktivacije (SAI). Zatim je otopina za ispiranje zamijenjena na 15 minuta s otopinom bez glukoze i zatim je poticaj vršen 20 minuta sa spojem 1 (10 M) . Paralelno s tim provedeni su kontrolni pokusi na sličnoj vremenskoj ljestvici bez dodatka spoja 1. Podaci su izraženi kao postotak promjene u odnosu na osnovnu vrijednost prije odstranjivanja glukoze iz medija.

B. Rezultati

Kako se vidi na slici 2, metabolički stres izazvan odstranjivanjem glukoze uzrokovao je blagi porast razmaka između stimulacije i aktivacije, što navodi na zaključak da odstranjivanje glukoze usporava brzinu provodljivosti. Suprotno tome, superfuzija sa spojem 1 koncentracije 10 nM smanjuje razmak između stimulacije i aktivacije, tj. spoj 1 povećava brzinu provodljivosti u uzgajanim primarnim kardiomiocitima. Ti podaci pokazuju da spoj 1 povećava povezivanje stanice sa stanicom u kardiomiocitima.

Literatura:

[1] Carmeliet, E. Cardiac ionic currents and acute ischemia: from kanals to arrhythmias, Physiol Rev., 1999, 79: 917-1017.

[2] Dhein, S. Cardiac gap jutictions. Physiology, regulation, pathophysiology and pharmacology, Karger, Basel, 1998.

[3] Peters, N. S. and Wit, A. L. Miocardial architecture and ventricular arrhytmogenesis, Circulation, 1998, 97: 1746-1754.

Primjer 3

Imunoprecipitacija i analiza fosforiliranog koneksina

Spojevi upotrijebljeni u ovom primjeru proizvedeni su pomoću standardne kemije na krutoj fazi Fmoc. Vidi ranije primjere. Identifikacija je izvršena pomoću masene spektrometrije, a čistoća je utvrđena pomoću RP-HPLC. In situ vezanje i proučavanja na životinjama pokazala su da se slijedeći peptid (spoj 1) veže na receptor u nano-molarnom području. Početna proučavanja sa spojem 1 u 1 nM, 10 nM, 50 nM i 100 nM će pokazati hoće li se provoditi proučavanja sa slijedećim peptidima, spojem 3 (H-GAG-4-Hyp-PY-NH2) i spojem 4 (H-GNY-NH2).

Ove studije će također odrediti hoće li se provesti studije koje uključuju specifične inhibitore kinaze.

Stanice H9c2 su posađene u zdjelice s 24 jamice gustoćom od 7.900 stanica/cm (-15.000 stanica/jamici) i rasle su 3 dana u MEM-u nadopunjenom s 10% fetalnog telećeg seruma (FCS) i 1000 jedinica penicilina/1000 μg streptomicina (pen/strep) u atmosferi od 5% CO2 100% vlage pri 37°C.

Obilježene stanice su inkubirane u puferu za ližu Triton X-100 (~5*107 stanica/ml) 1 sat pri 4°C. Lizat je centrifugiran 30 minuta pri 20.000 g. Supernatant je prethodno očišćen dodatkom 10 ul Sepharose na 200 (il supernatanta. Prethodno očišćenom supernatantu je zatim dodano 0,5-1 μg fosfo-tirozinskih ili fosfo-serinskih antitijela (Sigma) i inkubiran je 1,5 sata pri 4°C u orbitnoj mućkalici. Kompleks antitijela je zatim uhvaćen inkubacijom 1,5 sata s 50 ul 1:1 kaše proteina G Sepharose. Na kraju je kompleks temeljito ispran s 0,1% (masa/volumen) Tritona X-100, 50 mM Tris, pH 7,4, 300 raM NaCl i 5 mM EDTA.

Kompleksi su stavljeni na 12%-tni gel SDS i upijeni na PVDF membrani. Membrana je blokirana najmanje 2 sata s 0,1% Tween 20, 50 mM Tris, pH 7,4, 300 mM NaCl, 5% suhog mlijeka (TBST). Zatim je membrana inkubirana 1,5 sata pri sobnoj temperaturi zajedno s antitijelima (2ymed) koja su specifična za koneksin 43 i razvijena je s ECL+ (Amersham).

Slike 3A-B pokazuju imuno tragove upijanja u kojima je upotrijebljeno antitijelo anti-fosfotirozin.

Fragment C×43 fosforilacije je prikazan kao funkcija koncentracije spoja 1 (3A-B) i spoja 2 (3B).

Slike 4A-B pokazuju imuno tragove upijanja u kojima je upotrijebljeno antitijelo anti-fosfoserin (4A) ili antitijelo anti-fosfotirozin (4B).

Primjer 4

Učinak peptida, spoja 1, na djelovanje polukanala u konfluentnim kardijalnim miocitima

1. Kultura stanica

Ukratko, srca iz 20 neonatnih štakora (starosti 1-2 dana) su izvađena aseptično. Ventrikule su izolirane i izrezane na 4-6 komadića, koji su probavljeni s tripsinom i DNA-zom u nekoliko stupnjeva u Hanksovoj otopini puferiranoj sa solima. Stanice su zatim centrifugirane i ponovno suspendirane u MEM s 5% FCS. Za odstranjivanje ne-mišićnih stanica suspenzija je prethodno držana u Petrijevim zdjelicama 30 minuta pri 37°C. Stanice u suspenziji su zatim posađene na pokrovna stakalca prevučena s kolagenom.

2. Vezanje boje

Pokrovna stakalca s kardiomiocitima su inkubirana 30 minuta s kontrolnom otopinom (PBS) koja je sadržavala u mM: Na+ 152, K+ 4,2, Cl- 141,5, PO43- 9,5, Ca2+ 0,9, Mg2+ 0,5, glukoza 6, pH 7,4, ili otopinu koja oponaša ishemiju (ozljeda) (kao kontrola sadrži samo K+ 8,2, bez glukoze, 10 mM deoksi-glukoze, pH 6,5), i obje su otopine sadržavale 200 μM kalceina. Zatim su stanice ispirane 10 minuta s kontrolnom otopinom.

Pokrovna stakalca su montirana u otvorenu komoru na nosaču invertnog mikroskopa. Nasumice je odabrano deset polja i iz svakog polja su odabrane tri stanice pod konvencionalnim svjetlosnim mikroskopom. Zatim su stanice pobuđene sa svjetlom od 48 0 nm i pri 510 nm je izmjerena emisije fluorescencije, pri čemu je intenzitet emisije mjera za vezanje boje.

Učinak spoja 1 na vezanje boje bio je istražen pod dva uvjeta:

Pokus 1

U ovom nizu pokusa stanice su inkubirane 30 minuta s kontrolnom otopinom s kalceinom i ispirane 10 minuta bez boje. Paralelni pokus je proveden tako da je peptid dodan tijekom 30 minuta inkubacije.

Pokus 2

Kao pokus 1 samo što je umjesto kontrolne otopine ovaj pokus proveden s otopinom za ozljedu.

3. Rezultati

Pokusi u kojima je primijenjeno vezanje kalceina u uzgajanim kardiomiocitima iz neonatnih štakora pokazali su da je vezanje boje za 38% više nego u kontrolnim stanicama kad su stanice bile izložene metaboličkom stresu (u obliku niskog pH, povećan ekstracelularni K+ i deoksiglukoza 5-10 mM).

Ovaj učinak se može značajno smanjiti sve do 5% ako se stanice ko-inkubiraju sa spojem 1 (10 nM, P<0,017 u paralanom t pokusu u usporedbi sa stanicama izloženim samo deoksiglukozi, n=6). Ovi rezultati pokazuju da se povećanu permeabilnost membrane s koneksinskim polukanalima, koja se vidi nakon metaboličkog stresa, može inhibirati sa spojem 1. Moguće je da će taj učinak biti koristan za funkciju i preživljavanje stanice. Nadalje, pokusi fosforilacije na uzgajanim H9c2 kardiomiocitima su pokazali da spoj 1 posreduje tirozinsku fosforilaciju koneksina 43. Osim toga, kardiomiociti izloženi 4 h spoju 1 koncentracije 0,1, 10, 50 i 100 nM povećavaju fosforilaciju koneksin 43 tirozina. Za fosforilaciju tirozina je objavljeno da ona posreduje prekidanje intercelularne komunikacije pukotinskog spoja i moglo bi se lako objasniti opadanje permeabilnosti membrane koju se vidi u pokusima s kalceinom. U nekim pokusima nađeno je da spoj 1 smanjuje Ser-fosforilaciju.

Slika 5 pokazuje učinak 10 nM spoja 1 na vezanje kalceina izazvano ishemijom u uzgajanim kardiomiocitima.

Primjer 5

ELISA pokus bočno specifične fosforilacije koneksina

Razvijen je pokus ELISA sendvič koji omogućuje mjerenje fosforilacije koneksina specifične za mjesto u uzorku tkiva, kao također i u kulturama stanica u formatu s većim brojem jamica (24-96 jamica). Jamice su prevučene s antitijelom (antitijelo za hvatanje) prema dotičnom tipu koneksina. Zatim su ekstrakti stanica ili tkiva reagirali s pločicama prevučenim s antitijelom za hvatanje pri 4°C o/n. Uhvaćeni koneksini koji su se fosforilirali detektirani su s antitijelom usmjerenim prema specifičnim mjestima fosforilacije i konjugirani su s biotinom, FITC, TRITC ili s peroksidazom.

Količinu antitijela vezanog na specifično mjesto fosforilacije može se mjeriti alternativno s radioaktivno obilježenim antitijelom ili s antitijelom konjugiranim na enzim i koje je usmjereno prema vrstama IgG-a detekcijskog antitijela.

Načelo je bilo pokazano upotrebom mišjeg antiC×43 kao antitijela za hvatanje, zečjeg anti-Tyr-P (mjesto tirozinske fosforilacije) kao detekcijskog antitijela i anti-zečji IgG obilježenog sa I ili s HRP (konjska crvenkasta peroksidaza) za mjerenje količine vezanog anti-Tyr-P.

Načelo se može također pokazati upotrebom zečjeg antiC×43 (5 μg/ml; kat. br. 710700, Zymed Lab. Inc., Kalifornija, SAA) kao antitijela za hvatanje, monoklonskog mišjeg anti-fosfotirozina (50 (ig/ml; kat. br. P-3300, klon pt66, Sigma, MO, SAA.) kao detekcijskog antitijela i anti-mišjeg cijelog antitijela obilježenog sa I (ovčji anti-mišji Ig, kat. br. IM 131, Amersham Biosciences, Wales, UK) ili peroksidaze (majmunski anti-miš Ig; kat. br. 715-035-151) za mjerenje količine vezanog anti-fosfotirozina.

Slika 6A pokazuje shematski format detekcije ELISA kojem se daje prednost.

Slike 6B i 6C prikazuju rezultate ovog primjera.

Ovaj primjer i rasprava pružaju dokaz da metabolički stres otvara koneksinske polukanale u kardijalnim stanicama, i da se to otvaranje može spriječiti inkubacijom sa spojem 1. Osim toga, primjeri 2-5 pokazuju da spoj 1 zatvara polukanale tijekom metaboličkog stresa. U skladu s inhibitorskim učinkom spoja 1 na vezanje kalceina s polukanalima, tj. zatvaranjem polukanala, primjeri također pokazuju da spoj 1 pomaže u moduliranju stanja tirozinske fosforilacije koneksina 43. Za spoj 1 se zna da on otvara pukotinske spojeve, vidi WO 01/62775 i poznato je da inhibicija defosforilacije koneksina sprečava zatvaranje kanala pukotinskog spoja. Stoga se vjeruje da su ovdje dati spojevi za koje se može pokazati da su korisni za otvaranje pukotinskog spoja ili da moduliraju učinak spoja 1, tj. svi antiaritmijski peptidi opisani u WO 01/62775 i poznati peptidi, kao što su AAP, AAP10, HP5 i slično, mogu se upotrijebiti u predloženom izumu kao modulatori otvaranja ili zatvaranja polukanala. Također se vjeruje da spoj 1 održava ili povećava tirozinsku fosforilaciju na C×43, čime on modulira funkciju polukanala.

Primjer 6

Vezanje boje u kardiomiocitima

1. Postupci.

Ventrikularni miociti su izolirani iz neonatnih štakora probavom s tripsinom i stavljeni su na pokrovna stakalca prevučena s kolagenom. Nakon četiri dana miociti su oblikovali konfluent i sinhronizirano su prekrili slojeve stanica. Za mjerenje vezanja boje, stanice su inkubirane 30 minuta pri sobnoj temperaturi u puferu koji je sadržavao 200 μM kalceina. Zatim su pokrovna stakalca temeljito isprana s kontrolnim puferom i montirana u otvorenu komoru kupelji i stanice su superfuzionirane s kontrolnim puferom (sobna temp.). Stanice su pobuđene sa svjetlom od 480 mn pomoću ksenonove žarulje i monokromatora. Slike fluorescencije, emitirane pri 510 nm, su snimljene s hladnom CCD kamerom (Sensicam). Kontrola pobude i prikupljanje slika kontrolirano je pomoću Imaging workbench (Axon).

Pod svjetlosnim mikroskopom tri su područja stavljena u sliku iznad kardiomiocita.

Zatim je izmjeren prosječan intenzitet fluorescencije i postupak je ponavljan sve dok nije izmjereno 30 područja na 10 slika. Prosjek tih mjerenja je uzet kao vrijednost za date uvjete pokusa, to jest n=1. U svakom nizu izvršena je jedna kontrolna inkubacija i sve vrijednosti pokusa su date u usporedbi s tora vrijednošću.

Otopine: Kontrolni pufer (u mM) : NaCl 136, KCl 4, MgCl2 0,8, CaCl2 1,8 HEPES 5, MES 5, glukoza 6, pH 7,3. Pufer za stre (u mM) : NaCl 136, KCl 8, MgCl2 0,8, CaCl2 1,8, HEPES 5, MES 5, deoksi-glukoza 10, pH 6,2.

2. Rezultati.

Inkubacija stanica s kalceinom pod kontroliranim uvjetima dala je isto fluorescentno obojenje, koje je imalo uglavnom posebnu lokalnu narav (vidi slike 7A-C, pločica B). Povrh uzgajanih miocita često su se našle nabrane stanice koje su se odmah obojile s tripan plavim. Te stanice su se jako obojile s kalceinom i stalno se je moralo paziti da se područje mjerenja ne stavi preko tih stanica. Kad su stanice bile izložene metaboličkoj inhibiciji, u citosolu je opažen oblik promjene obojenja i difuzno obojenje (slika 7C). Prosječan intenzitet tijekom stresa bio je za 36,2±4,18% viši u usporedbi s kontrolom (n = 5, P<0,001 u paralelnom t testu).

Nalazi u kardijalnim i drugim tipovima stanica potvrđuju također da metabolička inhibicija aktivira vezanje fluorescentnih boja, vjerojatno preko koneksinskih polukanala. Mi pretpostavljamo da jedan mehanizam, s kojim AAP porodica peptida može izraziti svoje pozitivne učinke na kardijalno tkivo, može biti prekidanje aktivacije polukanala, čime se poboljšava celularnu homeostazu. Da bi se to istražilo, stanice su izložene stresu u prisutnosti ZP123 koncentracija između 0,1 pM i 10 nM. Rezultati su prikazani na slici 8, gdje svaka točka podataka predstavalja 5 pokusa. Kao što se može vidjeti, ZP123 smanjuje vezanje kalceina ovisno o dozi. Pomoću sigmoidne funkcija utvrđeno je da ED50 iznosi 3,3±5,3 pM s Hillovim koeficijentom od 2,5±1,0. Prosječni intenzitet tijekom maksimalne inhibicije sa spojem 1 bio je za 6,9±1,7% iznad kontrole.

Primjer 7

Mjerenja volumena u kardiomiocitima

1. Metode.

Ventrikularni miociti su izolirani iz neonatnih štakora probavom s tripsinom i stavljeni su na pokrovne umetke prevučene s kolagenom. Nakon četiri dana miociti su oblikovali konfluent i sinhronizirano su prekrili slojeve stanica. Za mjerenje volumena stanica, stanice su stavljene 15 minuta pri 37°C s kalcein-AM-om (5 μM u kontrolnom puferu) i pokrovna stakalca su montirana u otvorenu komoru kupelji. Slijedeći pokusi su provedeni pri sobnoj temperaturi. Pomoću Leica laserskog konfokusnog mikroskopa, optički presjek je izvršen svakih 20 sekundi tijekom trajanja pokusa.

Optički presjeci su analizirani pomoću Metamorph-a (Universal Imaging). Površina stanica je određena kao površina piksela s intenzitetom fluorescencije većim od vrijednosti praga odabranog za minimalizaciju osnovnih izazvanih dotoka. Podaci su prikazani kao relativni volumeni dijeljenjem svake vrijednosti s prosječnom površinom pod kontroliranim uvjetima (posljednje mjerenje prije metaboličkog stresa).

Otopine: Kontrolni pufer (u mM) : NaCl 136, KCl 4, MgCl2 0/8/ CaCl2 1,8, HEPES 5, MES 5, glukoza 6, pH 7,3. Pufer za stres (u mM) : NaCl 136, KC1 8, MgCl2 0,8, CaCl2 1,8, HEPES 5, MES 5, deoksi-glukoza 10, pH 6,2.

2. Rezultati.

Pod kontroliranim uvjetima, stanice su u prosjeku sklone da s vremenom blago smanje njihov volumen (slika 9B pokazuje prosječne podatke iz 5 pokusa). Kad se stanice pobude s metaboličkom inhibicijom, smanjenje volumena je reverzno neto povećanju (popunjeni kvadrati na slici 9A). U prosjeku relativan volumen je bio 1,06±0,02 (posljednjih pet minuta stresa, n=5), dok je volumen kontrolnih stanica u tom periodu bio 0,94±0,04.

Mjerenja vezanja boje u miocitima su pokazala da spoj 1 inhibira otvorene koneksinske polukanale. Vjeruje se da polukanali mogu doprinijeti opaženom bubrenju. Da bi se to ispitalo, spoj 1 (0,1 nM) je bio uključen u medij za stres i promatran je volumen. Podaci iz šest pokusa su prikazani na slici 9A (otvoreni kvadrati) i kao što se može vidjeti, bubrenje izazvano stresom bilo je spriječeno. Prosječan relativan volumen tijekom stresa u prisutnosti spoja 1 bio je 0,9310,05.

Kad su se usporedili podaci iz kontrole, stresa i stresa zajedno sa spojem 1 pomoću jednosmjernog ANOVA, dokazane su značajne razlike (vidi sliku 10), Post. hoc. ispitivanje (LSD) pokazuje da je stres bio značajno različit od kontrole (P<0,05) i od stresa zajedno sa spojem 1 (P<0,05), dok kontrola nije bila različita od stresa zajedno sa spojem 1 (P>0,76).

Primjer 8

Smanjenje veličine infarkta nakon miokardijalnog infarkta štakora

1. Metode

Mužjaci Lewis štakora (300-350 g; M & B, LI. Skendsved, Denmark) su anestezirani s neuroleptičnom kombinacijom anestetika (Hypnorm® (fentanil citrat 0,315 mg/ml i fluanizon 10 mg/ml) + midazolam (5 mg/ml)). Komercijalna otopina midazolama je razrijeđena 1:2 u destiliranoj vodi. Tri dijela razrijeđenog midazolama je pomiješano s jednim dijelom Hypnorma®. Anestezija je izazvana s.c. davanjem 0,2 ml te otopine na 100 grama težine štakora. Kad se je uspostavila kirurška anestezija, umetnuta je endotrahejna cjevčica i životinja je priključena na umjetno disanje pomoću Harvard ventilatora za glodavce, koji je bio namješten za održavanje arterijskog pH pri 7,3-7,5 tijekom operacije.

Spoj 1 je dat pomoću osmotske minipumpe (Alzet model 2ML4) koja je umetnuta u intraperitonealno (i. p.) gnijezdo neposredno prije izazivanja miokardijalnog infarkta. Pumpa je napunjena s vehiklora (izotonična otopina soli) ili sa spojem 1 i prije operacije je držana je 24 sata pri 37°C. Da bi se osiguralo da se terapeutsku koncentraciju u plazmi dobije već u vrijeme infarkta, punjenje s dozom spoja 1 dato je s.c. prije povezivanja LAD-a. Sa s.c. punjenjem doze, stanje stalne količine u plazmi dosegnuto je već nakon 3 minute.

Nakon datog s.c. punjenja doze spoja 1 i nakon i.p. umetanja osmotske minipumpe, izvršena je lijeva torakotomija i lijeva prednja umrtvijena arterija je spojena pomoću 6-0 svilenog konca. Toraks je zatvoren u slojevima i negativan tlak je izazvan u pleuralnom gnijezdu da se naborana pluća izravnaju. Tako operirane životinje su podvrgnute istom postupku bez priključenja LAD. Nakon operacije, životinje su se oporavljale u toploj komori pri 30°C s 50% kisika do slijedećeg jutra. Da se spriječi dehidraciju tijekom perioda oporavka, štakorima je dato 5 ml 5% glukoze s.c. Neposredno nakon završetka operacije dato je još 5 ml 5% glukoze u 4 p.m. Za popuštanje postoperacijske boli, štakori su dobivali buprenorfin (20 Hg/100 g s.c. b.i.d.) i meloksikam (0,1 mg/100 g s.c. jednom dnevno) tijekom tri dana nakon miokardijalnog infarkta. U ovoj studiji štakorima je infuzijom data doza za miokardijalni infarkt (MI) namještena tako da se dobiju koncentracije u plazmi od 0 [vehikl = izotonična otopina soli], 1,7±0,4 nM [doza 1], 5,7±0,4 [doza 2], ili 93,7112,3 nM [doza 3]. Koncentracije spoja 1 u plazmi izmjerene su pomoću masene spektrometrije nakon ekstrakcije krute faze. Upotrijebljene doze su prikazane dolje u tablici I:

Tablica I

[image]

Tri tjedna nakon spajanja LAD, štakori su anestezirani s i. p. injekcijom pentobarbitala (50 mg/kg). Životinje su stavljene na toplu deku da se održi tjelesnu temperaturu pri 37°C. Izvršena je traheotomija i štakorima je dato da udišu kisik pomoću Harvardovog ventilatora za glodavce. Ventilator je namješten za održavanje arterijskog pH pri 7,35-7,45. Kateteri PE50 su stavljeni u femoralnu venu i arteriju za i.v. davanje, odnosno za mjerenja arterijskog tlaka. Nakon umetanja femoralnog i.v. katetera, životinje su paralizirane s i.v. datim pankuronijem, 1 mg/kg. Anestezija i respiratorna paraliza je održavana trajnom i.v. infuzijom pentobarbitala (2,5 mg/kg/h) i pankuronija (1 mg/kg/h) isporučenog u izotoničnoj otopini soli (50 μl/min). U lijevu ventrikulu preko desne karotidne arterije umetnuta je tajgonska cjevčica za određivanje lijevog ventrikularnog krajnjeg dijastoličkog tlaka. Nakon zapisivanja lijevog ventrikularnog krajnjeg dijastoličkog tlaka (LVEDP) , srca su izvađena iz tijela rezanjem vena i arterija nekoliko mm od srca. Srca su oprezno isprana zbog krvi s izotoničnom otopinom soli, izvagana i stavljena u 4%-tan, neutralno puferiran formalin.

Nakon fiksiranja velike krvne žile su odrezane blizu srca. Nakon toga srca su izrezana na paralelne odreske debljine 1,5 mm pomoću naprave koja se sastoji od paralelnih reznih noževa na razmaku od 1,5 mm. Odresci su bili okomiti prema uzdužnoj osi srca.

Odresci su stavljeni u dvije histološke kapsule, tako da je prvi odrezak stavljen nasumice u jednu kapsulu, a drugi u drugu, treći u prvu kapsulu i tako dalje. Nakon postavljanja, odresci su odrezani na manje odreske debljine 4 μm koji su obojeni s hematoksilin-eozinom i s Masson-trikromom.

Pomoću mikroskopa s nosačem koji se može pomicati u prethodno određenim koracima, odresci obojeni s Masson-trikromom su ispitani i izračunat je broj točaka fibroznog tkiva (plavo obojeni u Masson-trikromu) i normalnog tkiva.

Mikroskop je bio spojen s video kamerom i slika se je mogla vidjeti na ekranu. Upotrijebljeni sistem morfometrije bio je Čast 2 tvrtke Olympus, Danska. Veličina infarkta je izračunata kao % fibroznog tkiva u srcu.

2. Rezultati

Kako je prikazano na slici 11, omjer težine srca prema težini tijela se je smanjio s dvije najviše doze spoja 1 iz čega se može zaključiti da ovaj spoj smanjuje hipertrofične posljedice (tj. ponovno modeliranje) miokardijalnog infarkta.

Kako se vidi na slici 12, liječenje sa spojem 1 kroz tri tjedna smanjilo je veličinu infarkta za 20-50% u usporedbi s veličinom infarkta kod štakora koji su bili podvrgnuti miokardijalnom infarktu, ali su bili liječeni s vehiklom. To pokazuje da spoj 1 ima citoprotektivno djelovanje tijekom miokardijalne ishemije.

U skladu s onim što je bilo gore opisano, ovi podaci pokazuju da spoj 1 smanjuje veličinu miokardijalnog infarkta mehanizmom koji uključuje sprečavanje bubrenja stanice.

Stoga, dakle, prevencija bubrenja stanice može spriječiti stlačivanje okolnog zdravog tkiva i zbog toga može spriječiti kompresiju mikrocirkulacije u okolnom zdravom tkivu. Zbog toga se u ovoj prijavi zahtjeva da ovo načelo može spriječiti posljedice bilo koje ishemijske lezije u bilo kojem organu, ponajprije, ali ne ograničavajući se samo na organe sa zatvorenom fibroznom kapsulom (npr. srce, bubreg) ili organa okruženih s kosti {npr. mozak, kičmena moždina, koštana srž).

Kako se vidi na slici 13, štakori podvrgnuti miokardijalnom infarktu koji su liječeni tri tjedna s dozom spoja 1 imali su poboljšanu kardijalnu funkciju s manjim dotokom krvi u lijevu ventrikulu, što je dokazano s manjim lijevim ventrikularnim krajnjim dijastoličkim tlakom. Ovi podaci pokazuju da spoj 1 sprečava pogoršanje kardijalne funkcije nakon miokardijalnog infarkta.

Svi ovdje spomenuti citati uvršteni su kao literatura. Izum je ovdje opisan pomoću izvedbi kojima se daje prednost, međutim, nakon razmatranja ovog opisa, stručnjak može ocijeniti da se mogu učiniti modifikacije i poboljšanja u opsegu duha i smisla izuma.

Claims (45)

1. Postupak za zatvaranje polukanala u stanici, tkivu ili organu izloženim stresu, naznačen time, da on uključuje dodir stanice, tkiva ili organa pod stresom s terapeutski učinkovitom količinom najmanje jednog spoja odabranog iz skupine spojeva koje prikazuju formule I i II, pri čemu je dodir dovoljan za zatvaranje polukanala u stanici, tkivu ili organu pod stresom.

2. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, da on nadalje uključuje fosforilaciju tirozinskog ostatka koneksina 43 (C× 43) i zatvaranje polukanala.

3. Postupak za otvaranje polukanala u stanici, tkivu ili organu, naznačen time, da on uključuje dodir stanice, tkiva ili organa s terapeutski učinkovitom količinom najmanje jednog spoja odabranog iz skupine spojeva koje prikazuju formule I i II, pri čemu je dodir dovoljan za otvaranje polukanala u stanici, tkivu ili organu.

4. Postupak prema zahtjevu 3, naznačen time, da on nadalje uključuje defosforilaciju serinskog ostatka koneksina 43 (C× 43) i otvaranje polukanala.

5. Postupak za prevencije ili za liječenja tkiva ili organa pod stresom u sisavcu, naznačen time, da on uključuje davanje terapeutski učinkovite količine najmanje jednog spoja odabranog iz skupine spojeva koje prikazuju formule I i II, kako su gore opisane, pri čemu je dodir dovoljan da zaštiti ili izliječi stres u tkivu ili u organu.

6. Postupak prema zahtjevu 5, naznačen time, da on nadalje uključuje fosforilaciju tirozinskog ostatka koneksina 43 (C× 43) i zatvaranje polukanala.

7. Postupak za povećavanje intracelularne komunikacije pukotinskog spoja (GJIC) u stanici, tkivu ili organu, naznačen time, da on uključuje davanje terapeutski učinkovite količine najmanje jednog spoja odabranog iz skupine spojeva koje prikazuju formule I i II, pri čemu je dodir dovoljan da se poveća GJIC u stanici, tkivu ili organu.

8. Postupak za liječenje opeklina, naznačen time, da se pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje daje terapeutski učinkovitu količinu spoja formule I ili II koji blokira otvaranje koneksinskog polukanala.

9. Postupak za liječenje tromboze, naznačen time, da se pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje daje terapeutski učinkovitu količinu spoja formule I ili II koji blokira otvaranje koneksinskog polukanala.

10. Postupak za liječenje respiratorne i metaboličke acidoze, naznačen time, da se pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje daje terapeutski učinkovitu količinu spoja formule I ili II koji blokira otvaranje koneksinskog polukanala.

11. Postupak za liječenje fokusne aritmije, naznačen time, da se pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje daje terapeutski učinkovitu količinu spoja formule I ili II koji blokira otvaranje koneksinskog polukanala.

12. Postupak za liječenje i sprečavanje oštećenja stanice i tkiva kao posljedice povišenog sadržaja glukoze u krvi, naznačen time, da se pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje daje terapeutski učinkovitu količinu spoja formule I ili II koji blokira otvaranje koneksinskog polukanala.

13. Postupak za liječenje kronične atrijalne fibrilacije, naznačen time, da se pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje daje terapeutski učinkovitu količinu spoja formule I ili II koji blokira otvaranje koneksinskog polukanala.

14. Postupak za liječenje epilepsije, naznačen time, da se pacijentu kojem je potrebno takovo liječenje daje terapeutski učinkovitu količinu spoja formule I ili II koji potiče otvaranje koneksinskog polukanala.

15. Postupak za pretraživanje spojeva koji su kandidati za moduliranje funkcije polukanala, naznačen time, da on uključuje dodir stanice s najmanje jednim spojem odabranim iz skupine koju čine antiaritmijski peptidi i spojevi koje prikazuju formule I i II, pri čemu se dodir vrši pod uvjetima pod kojima se može provesti modulaciju fosforilacije koneksina 43 (C×43); i dokazivanje promjene C×43 fosforilacije, pri čemu se promjena fosforilacije smatra dokazom da spoj mogulira polukanal.

16. Postupak prema zahtjevu 15, naznačen time, da stupanj ispitivanja uključuje, nadalje, ispitivanje spoja kandidata pokusom na osnovi imunološkog razvrstavanja ili razvrstavanja prema stanici.

17. Postupak prema zahtjevu 16, naznačen time, da imunološki pokus uključuje dodir stanice sa spojem kandidatom pod uvjetima koji su dovoljni za porast ili za opadanje fosforilacije na C×43, čime se dobije lizat stanica; i dokazivanje povećane ili smanjene C×43 fosforilacije u staničnom lizatu kao dokaza da spoj modulira polukanal.

18. Postupak prema zahtjevima 16-17, naznačen time, da imunološki pokus je pokus ELISA.

19. Postupak prema zahtjevu 18, naznačen time, da ELISA postupak, nadalje, uključuje: a) prevlačenje krute podloga s prvim antitijelom koje specifično veže koneksin, b) dodir staničnog lizata s krutom podlogom pod uvjetima pod kojima se može provesti stvaranje kompleksa vezanja između prvog antitijela i koneksina, c) dodir kompleksa vezanja prvog antitijela i koneksina s drugim antitijelom, pri čemu se taj dodir dešava pod uvjetima koji su dovoljni za stvaranje specifičnog kompleksa vezanja između drugog antitijela i bilo kojeg fosforiliranog koneksina u prvom antitijelu s kompleksom vezanja koneksina, d) dodir kompleksa vezanja prvog antitijela i koneksina s drugim antitijelom s dokazivim obilježenim trećim antitijelom koje veže drugo antitijelo; i e) dokazivanje prisutnosti trećeg dokazivog obilježenog antitijela na krutoj podlozi kao daljnjeg dokaza spoja.

20. Postupak prema zahtjevu 19, naznačen time, da treće antitijelo je dokazivo obilježeno s najmanje jednim sredstvom iz niza koji čine biotin, FITC, TRITC, radioaktivan jod i peroksidaza.

21. Postupak prema zahtjevima 19-20, naznačen time, da drugo antitijelo je anti-fosfotirozinsko antitijelo.

22. Postupak prema zahtjevima 19-21, naznačen time, da drugo antitijelo je anti-fosfoserinsko antitijelo.

23. Postupak prema zahtjevima 19-22, naznačen time, da se dokazivo obilježeno treće antitijelo može dokazati radioscintilacijskim zbrajanjem.

24. Postupak prema zahtjevu 16, naznačen time, da imunološki postupak je radioimunosni pokus (RIA).

25. Postupak prema zahtjevu 24, naznačen time, da imunološki postupak je RIA pokus i taj postupak, nadalje, uključuje: a) dokazivo obilježavanje stanica prije proizvodnje staničnog lizata, pri čemu se obilježavanje vrši pod uvjetima za provođenje obilježavanja fosforiliranog koneksina, b) dodir staničnog lizata s antitijelom koje tvori specifičan kompleks vezanja s koneksinom, c) odvajanje kompleksa vezanja od dokazivo obilježenog staničnog lizata; i d) dokazivanje obilježenog i fosforiliranog koneksina kao daljnjeg dokaza spoja koji modulira pukotinski spoj.

26. Postupak prema zahtjevu 25, naznačen time, da antitijelo je anti-koneksinsko antitijelo.

27. Postupak prema zahtjevima 25-26, naznačen time, da stupanj detekcije uključuje, nadalje, provedbu pokusa Western imuno blota.

28. Postupak prema zahtjevima 25-27, naznačen time, da za dokazivo obilježavanje služi radioaktivan fosfor.

29. Postupak prema zahtjevima 15-29, naznačen time, da se postupak provodi u formatu visokog učinka pretraživanja ili ultra visokog učinka pretraživanja.

30. Postupak prema zahtjevima 1-30, naznačen time, da spoj olakšava fosforilaciju intracelularnog C-terminalnog područja C×43.

31. Postupak prema zahtjevima 1-30, naznačen time, da spoj olakšava defosforilaciju C-terminalnog područja C×43.

32. Postupak prema zahtjevu 31, naznačen time, da je mjesto fosforilacije tirozinski ostatak.

33. Postupak prema zahtjevu 32, naznačen time, da je mjesto defosforilacije serinski ostatak.

34. Postupak za pretraživanje spojeva kandidata koji moduliraju funkciju polukanala, naznačen time, da on uključuje: 1) uzgoj populacije stanica, tkiva ili organa kao što su one uzete od srca ili mišića, 2) izlaganje stanica, tkiva ili organa stresu ponajprije oduzimanjem kisika ili metaboličkom inhibicijom, kao što je dodavanje derivata glukoze, 3) dodavanje poznatog spoja ili spoja kandidata za modulaciju polukanala, kao što su oni koje prikazuju donje formule I i II, 4) dodavanje dokazivog reportera kao što je fluorescentan, kemiluminiscentan, ili fosforescentan spoj, kao što je fluorescentna boja kalcein i srodni spojevi, 5) dokazivanje promjene utroška dokazivog reportera u stanicama, tkivu ili organu u usporedbi prema prikladnoj kontroli; i 6) prema potrebi mjerenje promjena koje dokazuju da spoj modulira funkciju polukanala.

35. Postupak za pretraživanje spojeva kandidata koji moduliraju funkciju polukanala, naznačen time, da on uključuje: 1) uzgoj populacije stanica, tkiva ili organa, kao što su one dobivene od srca ili mišića, 2) opterećenje stanica, tkiva ili organa s dokazivim reporterom kao što je fluorescentan, kemiluminiscentan ili fosforescentan spoj, kao što je boja kalcein ili srodan spoj, 3) utvrđivanje volumena stanice, tkiva ili organa određivanjem i brojčanim utvrđivanjem signala iz dokazivog reportera, 4) dodavanje poznatog spoja koji modulira polukanal ili spoja kandidata za modulaciju polukanala, kao što su spojevi koje prikazuju donje formule I ili II, 5) izlaganje stresu stanica, tkiva ili organa ponajprije oduzimanjem kisika ili metaboličkom inhibicijom, kao što je dodavanje derivata glukoze, 6) utvrđivanje promjene volumena stanice u usporedbi s prikladnom kontrolom; i 7) prema potrebi mjerenje te promjene kao dokaza da taj spoj modulira funkciju polukanala i prema potrebi funkciju pukotinskog spoja.

36. Postupak za citoprotekciju tkiva ili organa sisavca kojem je potrebno takovo liječenje, naznačen time, da on uključuje davanje terapuetski učinkovite količine najmanje jednog spoja odabranog iz skupine koju čine spojevi prikazani s formulama I ili II.

37. Postupak prema zahtjevu 37, naznačen time, da on nadalje uključuje izlaganje tkiva ili organa sisavca ishemijskim uvjetima.

38. Postupak prema zahtjevu 38, naznačen time, da je organ koji se želi citoprotektirati povezan s fibroznom kapsulom ili s kosti.

39. Postupak prema zahtjevu 39, naznačen time, da je organ srce, bubreg, mozak, kičmena moždina ili koštana srž.

40. Postupak prema zahtjevu 40, naznačen time, da je srce bilo izloženo infarktu i da je ishemija povezana s miokardijalnim bubrenjem stanica.

41. Postupak prema zahtjevu 41, naznačen time, da je to spoj Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (spoj 1) ili (Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2) spoj 2.

42. Postupak za prevenciju ili liječenje reperfuzijske ozljede u sisavcu, naznačen time, da on uključuje davanje terapeutski učinkovite količine najmanje jednog spoja odabranog između spojeva koje prikazuju formule I ili II.

43. Postupak prema zahtjevu 43, naznačen time, da on nadalje uključuje izlaganje srca sisavca uvjetima infarkta i uvođenje koronarne perfuzije.

44. Postupak prema zahtjevu 44, naznačen time, da on nadalje uključuje davanje trombolitičnog sredstva ili provedbu koronarne angioplastije da se olakša koronarnu perfuziju u srce pogođeno infarktom.

45. Postupak prema zahtjevu 45, naznačen time, da je to spoj Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2 (spoj 1) ili (Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2) (spoj 2)